CN114525253B

CN114525253B - 一种脂多糖诱导的外泌体及其应用

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Publication number: CN114525253B
Application number: CN202210229840.XA
Authority: CN
Inventors: 李伊楠; 孙涛; 刘慧娟; 陈财鸿; 张恒; 汉京霞
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2022-03-09
Filing date: 2022-03-09
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2042-03-09
Also published as: CN114525253A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种脂多糖诱导的外泌体及其在制备脓毒症治疗药物中的应用。所述外泌体为LPS诱导黑色素瘤细胞分泌产生的外泌体iExo，经检测iExo能够通过靶向内皮细胞，抑制炎症导致的内皮通透性异常增加，抑制黏附分子和趋化因子的表达，从而维持内皮细胞屏障稳态。另外，iExo还可以通过靶向巨噬细胞，抑制NF‑κB信号通路的激活，抑制炎症因子的分泌，抑制巨噬细胞M1样极化，促进M2样极化，抑制炎症反应，缓解临床症状，可作为治疗脓毒症的新手段，对于进一步认识外泌体在脓毒症疾病发生发展以及开发治疗脓毒症类似炎症因子风暴相关疾病的新方法具有重要的临床意义。

Description

一种脂多糖诱导的外泌体及其应用

技术领域：

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种脂多糖(LPS)诱导的外泌体及其在制备脓毒症治疗药物中的应用。

背景技术：

脓毒症是一种由于急性微生物感染引起的先天免疫系统活化所导致的系统性炎性综合征。其主要特征在于感染后炎症和凝血途径的广泛激活，进而发展为多器官功能障碍综合征，感染性休克和死亡。目前的数据表明，在全世界范围每年有4890万例脓毒症病例，其中有1100万人面临着死亡。脓毒症病理进程中，通常通过Toll样受体(TLR)的过度激活来启动和驱动炎症性免疫失调，其识别病原体相关的分子模式(PAMP)或损伤相关的分子模式(DAMP)，激活细胞内转录因子NF-κB，诱导炎性细胞因子(例如，干扰素-α(IFN-α)，白细胞介素-6(IL-6)，IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等)，促凝剂和黏附分子的生成及释放引发“炎症因子风暴”，同时激活炎症和凝血，最终诱导内皮，上皮和免疫细胞不可逆转的损伤而发生器官衰竭。

外泌体是一种直径为30-150nm的小囊泡，广泛存在于所有体液和组织中，包含着丰富的蛋白质、DNA、RNA、氨基酸和代谢物，并且可以转移至受体细胞，在免疫系统调节和细胞间通讯等方面发挥着重要的作用。外泌体的形态在电镜下呈双凹碟型或杯状，受细胞微环境和固有生物学等影响，外泌体具备异质性，并主要体现在它们的大小、内容物、细胞来源和对受体细胞的功能影响等多方面。

目前临床治疗脓毒症的主要策略包括早期液体复苏、抗生素治疗、血管活性物质、机械辅助通气等方法，但脓毒症发作凶险、病死率高、预后差尚且无特殊有效的治疗方案。随着对脓毒症发作机制的深入研究，以期能够尽早研发出安全且有效的治疗药物。外泌体由天然脂质双层构成，其中掺入了许多易于与细胞膜相互作用的粘附蛋白，而且具有异质性。作为人造药物，它们比人工纳米粒子具有更低的免疫原性，并且与复杂的体内环境相容性更高，另外，由于它们绕过补体激活和与凝血因子的相互作用，能够有效延长在血液中的循环半衰期，同时它们的双层膜结构保护了它们包裹的内容物，在机体系统注射后不易被降解。因此，诱导型外泌体的发展可能是治疗未分层领域疾病(如癌症，炎症性疾病和慢性疾病)的另一种充满希望的选择。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种LPS诱导的外泌体及其制备方法和应用，为脓毒症的治疗提供新的方向和思路。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明提供的技术方案之一，是一种LPS诱导的外泌体，所述外泌体为LPS诱导黑色素瘤细胞分泌产生的外泌体；

进一步地，所述黑色素瘤细胞为黑色素瘤细胞B16-F10。

本发明提供的技术方案之二，是上述LPS诱导的外泌体的制备方法，具体如下：

将黑色素瘤细胞复苏培养后，加入LPS至终浓度在0.1-2μg/mL范围内，静置于33℃、5％CO₂培养箱继续培养细胞24-32h后，收集细胞培养上清，提取诱导的功能性外泌体(iExo)；

进一步地，黑色素瘤细胞复苏培养采用的培养基为含10％FBS的DMEM或1640培养基；

进一步地，通过超速离心提取外泌体；

更进一步地，超速离心提取的具体方法为：收集细胞培养上清，离心机4℃预冷，300×g，10min，弃去沉淀的细胞，保留上清；2000×g，10min，弃去沉淀的残留死细胞，保留上清；10000×g，30min离心，除去沉淀的细胞碎片，上清用0.22μm滤膜过滤；收集至超速离心管中，每管液体需保证至少达到3/4离心管体积，设置超速离心机4℃预冷，100000×g，30min离心沉淀为外泌体，小心分离上清，内含细胞因子，保留沉淀；加入PBS至超速离心管3/4体积，重悬外泌体，100000×g超速离心30min弃上清得外泌体；取PBS重悬外泌体，分装冻存于-80℃备用。

本发明提供的技术方案之三，是包含上述外泌体的试剂或药物；

进一步地，所述的试剂或药物包括但不限于注射剂、胶囊剂、片剂、粉末剂、软膏剂或喷雾剂等形式；

进一步地，所述外泌体为上述试剂或药物中的唯一活性成分。

本发明提供的技术方案之四，是上述外泌体在制备脓毒症治疗药物中的应用；

进一步地，上述外泌体或包含所述外泌体的试剂/药物，能够抑制内皮细胞分泌黏附分子和趋化因子。

进一步地，上述外泌体或包含所述外泌体的试剂/药物，具有靶向内皮细胞，稳定内皮屏障的作用。

进一步地，上述外泌体或包含所述外泌体的试剂/药物，能够调节巨噬细胞中TLR4-myd88-NF-κB信号通路。

进一步地，上述外泌体或包含所述外泌体的试剂/药物，能够调控巨噬细胞中NF-κB的核移位。

进一步地，上述外泌体或包含所述外泌体的试剂/药物，能够抑制巨噬细胞M1极化，促进M2极化。

进一步地，上述外泌体或包含所述外泌体的试剂/药物，具有靶向巨噬细胞，调节免疫稳态的作用。

进一步地，上述外泌体或包含所述外泌体的试剂/药物，能够抑制促炎细胞因子IL-6，IL-8和TNF-α的分泌。

进一步地，上述外泌体或包含所述外泌体的试剂/药物，对脓毒症发展过程中的多器官功能障碍具有保护作用。

本发明的有益效果如下：

本发明通过LPS模拟脓毒症体内环境，诱导黑色素瘤细胞激活自身防御机制，得到诱导型外泌体(iExo)。经检测iExo能够通过靶向内皮细胞，抑制炎症导致的内皮通透性异常增加，抑制黏附分子和趋化因子的表达，从而维持内皮细胞屏障稳态。另外，iExo还可以通过靶向巨噬细胞，抑制NF-κB信号通路的激活，抑制炎症因子的分泌，抑制巨噬细胞M1样极化，促进M2样极化，抑制炎症反应，缓解临床症状，可作为治疗脓毒症的新手段，对于进一步认识外泌体在脓毒症疾病发生发展以及开发治疗脓毒症类似炎症因子风暴相关疾病的新方法具有重要的临床意义。

附图说明：

图1为黑色素瘤细胞(B16-F10)外泌体的诱导、提取和鉴定示意图

其中，图1A为从体外培养的B16-F10细胞中纯化正常外泌体(nExo)和LPS诱导的外泌体(iExo)的示意图。

图1B为不同浓度LPS刺激B16-F10细胞后细胞内膜活性的荧光成像图，标尺为5μm。

图1C为外泌体蛋白标志物表达验证(CD63和CD81)。

图1D为nExo(上)和iExo(下)的透射电子显微镜(TEM)图像，标尺为50nm。

图2为iExo保护炎症环境下内皮细胞的屏障功能

其中，图2A为不同外泌体处理后炎症环境中HUVEC的细胞活力。

图2B为在炎症血清刺激下，PBS、nExo和iExo处理的HUVEC细胞内皮通透性。

图2C为PBS、nExo和iExo处理对炎症血清刺激下HUVEC细胞中粘附分子表达的影响。通过用特异性抗体进行免疫印迹检测HUVEC细胞中的ICAM-1和MCP-1蛋白水平(左图为免疫印迹图，右图为柱状定量图)。

图2D为在炎症血清刺激下，PBS、nExo和iExo处理的HUVEC分泌的IL-6(左)和IL-8(右)水平。

图3为iExo对巨噬细胞的免疫调节作用

其中，图3A为在LPS刺激下，nExo和iExo处理对RAW264.3细胞中TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的影响，通过特异性抗体的免疫印迹检测(左图为免疫印迹图，右图为柱状定量图，右图中各组柱状从左至右依次为RAW264.3组，PBS组，nExo组，iExo组)。

图3B为nExo和iExo处理对LPS刺激下RAW264.3细胞M1和M2极化的影响。通过用特异性抗体进行免疫印迹检测Arg-1和iNOS水平(左图为免疫印迹图，右图为柱状定量图，右图中各组柱状从左至右依次为RAW264.3组，PBS组，nExo组，iExo组)。

图3C为在LPS刺激下，PBS、nExo和iExo处理的RAW264.3细胞中的IL-6(左)和TNF-α(右)水平。

图3D为通过流式细胞术分析M1(F4/80+/CD86+)和M2(F4/80+/CD206+)RAW264.3巨噬细胞。

图4为iExo对抗脓毒症的体内实验验证

其中，图4A为PBS、nExo和iExo治疗的CLP诱导败血症小鼠的存活率。

图4B和4C为来自不同治疗组的CLP诱导的脓毒症小鼠的腹水和腹腔视图。

图4D为来自CLP诱导的脓毒症小鼠的肝脏、肾脏和肺组织的代表性H&E染色切片。

具体实施方法：

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中获得。

在本发明中，nExo代表B16-F10细胞正常分泌的外泌体。iExo代表LPS诱导B16-F10细胞分泌的外泌体。

本发明所使用的LPS购自sigma，货号：L3129。

实施例1：黑色素瘤细胞(B16-F10)外泌体的诱导、提取和鉴定

1、LPS诱导细胞产生功能性外泌体(流程如图1A)

为避免外源性外泌体带来的影响，通过超速离心除去血清中的外泌体。超速离心专用管预先用35％乙醇浸泡12h灭菌，敞盖置于超净工作台中挥发干燥待用。将胎牛血清分装置于无菌超速离心管中，配平，超速离心机4℃，120000×g，离心12h，贴底白色沉淀即为血清中外泌体。在超净工作台中小心保留上清，可用0.22μm滤膜过滤避免引入菌种污染。后续实验所有需要提取外泌体的细胞培养过程均使用无外泌体血清配制完全培养基。

待B16-F10在含10％FBS的DMEM培养基中复苏培养至细胞生长状态良好，细胞密度为30％时，加入LPS至终浓度分别为0.25，0.5，1μg/mL，静置于33℃、5％CO₂培养箱继续培养细胞48h后，收集细胞培养上清，通过超速离心法提取诱导的功能性外泌体(iExo)。对照组加入与LPS相同体积PBS，维持相同条件培养48h收集细胞上清，通过超速离心法提取普通外泌体(nExo)。

2、超速离心法提取外泌体

收集细胞培养上清于50mL离心管中，离心机4℃预冷，300×g，10min，弃去沉淀的细胞，保留上清；2000×g，10min，弃去沉淀的残留死细胞，保留上清；10000×g，30min离心，除去沉淀的细胞碎片，上清用0.22μm滤膜过滤；收集至超速离心管中，每管液体需保证至少达到3/4离心管体积，配平，设置超速离心机4℃预冷，100000×g，30min离心沉淀为外泌体，小心分离上清，内含细胞因子，保留沉淀；加入PBS至超速离心管3/4体积，重悬外泌体，100000×g超速离心30min弃上清。取50μL PBS重悬外泌体，分装冻存于-80℃备用。

3、不同浓度LPS刺激B16-F10细胞后细胞内膜活性的荧光成像

待B16-F10复苏培养至细胞生长状态良好，细胞密度为30％，消化细胞后1mLPBS重悬，加入5μL的DiI染料后轻轻混匀，33℃培养箱静置15min对细胞膜系统进染色。离心机设置800rpm离心5min，弃上清，加入1mL PBS清洗染料浮色，再次以800rpm离心5min，弃上清。重悬细胞加入新的培养基中，加入LPS至终浓度分别为0，0.25，0.5，1μg/mL，拍摄24h记录细胞状态与荧光信号，如图1B所示，随着LPS浓度的提高，细胞内指示细胞膜的DiI荧光信号增强，可见LPS以剂量依赖的方式激活黑色素瘤细胞(B16-F10)的内膜系统。图1B中Ph(明场，可观察细胞形态)；Endomembrane(DiI荧光，可观察内膜系统，越亮代表越活跃)；Merge(上述两者叠加)。

4、外泌体的鉴定

以步骤2提取的外泌体，采用western blot检测外泌体表面标志物，比如CD63和CD81，如图1C所示，在nExo和iExo中均能检测到阳性表达。另外，还采用电子透射显微镜的方法观察收集得到的外泌体，如图1D所示，分离得到的nExo和iExo均具有外泌体典型的杯状结构，直径在30-150nm范围内。

实施例2-4中使用的nExo和iExo均为本实施例制备所得的，其中iExo为本实施例LPS终浓度为1μg/mL时制备所得。以下实施例在添加时以PBS重悬外泌体的形式添加，用量均为经过蛋白浓度换算后的外泌体实际质量，如实施例2步骤1中添加0.1μg的iExo，是指iExo本身的实际质量为0.1μg。

实施例2：iExo保护炎症环境下内皮细胞的屏障功能。

1、CCK-8法检测HUVEC的细胞活性

通过炎症小鼠的血清刺激HUVEC模拟脓毒症体内炎症环境，再使用nExo或iExo进行保护，之后采取CCK-8法检测HUVEC的细胞活性。具体如下：

在96孔板中加100μLHUVEC细胞悬液，放在细胞培养箱中培养6-8h等待贴壁。在此基础上设置4个不同的实验组：

对照组：不做特殊处理正常培养的HUVEC细胞；

模型组：每孔100μLHUVEC细胞悬液中加入5μL炎症血清+10μL的PBS；

模型+nExo组：每孔100μLHUVEC细胞悬液中加入5μL炎症血清+0.1μg的nExo；

模型+iExo组：每孔100μLHUVEC细胞悬液中加入5μL炎症血清+0.1μg的iExo；

继续培养24h，小心弃培养基，注意不要碰触培养板底部。每孔加入100μL新培养基及10μL CCK8溶液，增设一组无细胞仅培养基+CCK8溶液组为空白组，放回培养箱培养1-4h。用酶标仪在450nm处测量吸光度并计算细胞活力。

结果显示：炎症血清损伤内皮细胞活性，而iExo能够对HUVEC起保护作用，且效果优于nExo(图2A)。

2、FITC-dextran Transwell测定血管通透性

炎症介质可损伤内皮细胞并增加屏障通透性，血管通透性变化在脓毒症中起核心作用，我们通过FITC-dextran Transwell测定法测定血管通透性，具体如下：

各取250μL浓度为1×10⁵个细胞/mL的HUVEC细胞加入到0.4mm孔径的transwell小室上，之后设置4个不同的实验组：

对照组：不做特殊处理正常培养的HUVEC；

模型组：每孔250μL的HUVEC细胞中加入12.5μL炎症血清刺激+25μL PBS；

模型+nExo组：每孔250μL的HUVEC细胞中加入12.5μL炎症血清刺激+0.25μg nExo；

模型+iExo组：每孔250μL的HUVEC细胞中加入12.5μL炎症血清刺激+0.25μg iExo；

将上述实验组进行细胞培养12h后，加入250μg的FITC-葡聚糖并在33℃下孵育2小时，自下室收集100μL样品，用微孔板荧光分光光度计在520nm处检测荧光评估内皮细胞的通透性。

结果显示：iExo可以逆转由炎症因子引起的通透性增加，而nExo不具备此效果(图2B)。

3、Western blot验证ICAM-1和MCP-1的表达水平

内皮细胞受炎症激活，炎症细胞粘附、迁移及趋化能力增强，这对脓毒症的恶性发展非常重要，通过western blot实验对细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达水平进行验证。各取5mL浓度为1×10⁵个细胞/mL的HUVEC细胞加入培养皿中，放在细胞培养箱中培养6-8h等待贴壁。在此基础上设置不同的实验组：

对照组：不做特殊处理正常培养的HUVEC；

模型组：每5mL的HUVEC细胞中加入0.25mL炎症血清刺激+0.1mL PBS；

模型+nExo组：每5mL的HUVEC细胞中加入+0.25mL炎症血清刺激+5μg nExo；

模型+iExo组：每5mL的HUVEC细胞中加入0.25mL炎症血清刺激+5μg iExo；

培养细胞24h后，收集细胞，通过western blot实验对细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达水平进行了验证。

结果显示：iExo治疗能够显著抑制ICAM-1和MCP-1的表达，效果优于nExo(图2C)。

4、ELISA实验检测炎症因子水平

各取100μL浓度为1×10⁵个细胞/mL的HUVEC细胞加入96孔板中，放在细胞培养箱中培养6-8h等待贴壁。在此基础上设置不同的实验组：

对照组：不做特殊处理正常培养的HUVEC细胞；

模型组：100μL的HUVEC细胞加入5μL炎症血清刺激+10μL PBS；

模型+nExo组：100μL的HUVEC细胞加入5μL炎症血清刺激+0.1μg nExo；

模型+iExo组：100μL的HUVEC细胞加入5μL炎症血清刺激+0.1μg iExo；

细胞培养24h后收集细胞上清，通过ELISA实验检测炎症因子水平。

结果显示：经过炎症血清处理的HUVEC细胞分泌的炎症细胞因子IL-6和IL-8显著高于对照组。与模型组相比，iExo处理能够抑制IL-6和IL-8的分泌，而不经LPS诱导的nExo作用效果不如iExo显著(图2D)。

图2各图中，横轴HUVEC即为对照组，PBS即为模型组，nExo即为模型+nExo组，iExo即为模型+iExo组。

实施例3：iExo对巨噬细胞的免疫调节作用

1、Western blot验证TLR4，Myd88和NF-κB的表达水平

Toll样受体4/髓样分化一级反应蛋白88/核因子κB(TLR4/MyD88/NF-κB)轴是脓毒症中的经典途径。首先，基于LPS激活TLR4后与Myd88发生互作进一步激活NF-κB从而促进后续的炎症因子的转录和表达的经典通路进行验证。

各取5mL浓度为1×10⁵个细胞/mL的RAW264.3细胞加入培养皿中，放在细胞培养箱中培养6-8h等待贴壁。在此基础上设置不同的实验组：

对照组：不做特殊处理正常培养的RAW264.3细胞；

模型组：5mL的RAW264.3细胞加入5μg LPS+0.1mL PBS；

模型+nExo组：5mL的RAW264.3细胞加入5μg LPS+5μg nExo；

模型+iExo组：5mL的RAW264.3细胞加入5μg LPS+5μg iExo。

培养细胞24h后，收集细胞通过western blot实验对TLR4，Myd88和NF-κB的表达水平进行了验证。

结果显示：iExo能对TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活展现抑制作用，在使用iExo治疗后LPS对TLR4、Myd88、NF-κB在蛋白翻译水平的表达激活被同步抑制(图3A)。

2、Western blot分析M1型的标志物iNOS和M2型的标志物Arg-1

在某些炎症性疾病中，巨噬细胞通过经典激活途径被诱导成为M1型后，会促进炎症的进展，而通过代替激活途径被诱导成为M2亚型后，则具有抗炎作用。

同样取本实施例步骤1收集的细胞，通过western blot实验对M1型的标志物iNOS和M2型的标志物Arg-1进行分析。

结果显示：LPS刺激组以及LPS刺激后nExo治疗组表达更多的M1极化相关蛋白iNOS，而LPS刺激后接受iExo治疗组表达更多的M2极化相关蛋白Arg-1(图3B)。

3、流式细胞术检测巨噬细胞M1和M2型的标志物CD206和CD86

同样取本实施例步骤1收集的细胞于离心管中，将细胞与APC-CD206和PacificBlue-CD86抗体在4℃条件下共孵育45min，通过流式细胞术对巨噬细胞M1和M2型的标志物CD206和CD86进行检测。

结果显示：LPS处理组(模型组)与对照组相比，M1型巨噬细胞显著增加。iExo通过促进巨噬细胞M2极化，抑制M1极化平衡免疫功能(图3D)。

4、ELISA实验分析炎症因子水平

各取100μL浓度为1×10⁵个细胞/mL的RAW264.3细胞加入96孔板中，放在细胞培养箱中培养6-8h等待贴壁。在此基础上设置不同的实验组：

对照组：不做特殊处理正常培养的RAW264.3细胞；

模型组：100μL的RAW264.3细胞中加入0.1μg LPS+10μL PBS；

模型+nExo组：100μL的RAW264.3细胞中加入0.1μg LPS+0.1μg nExo；

模型+iExo组：100μL的RAW264.3细胞中加入0.1μg LPS+0.1μg iExo。

培养24h后收集细胞上清，通过ELISA实验分析炎症因子水平。

结果显示：iExo处理能够抑制巨噬细胞RAW264.3中LPS引起的炎症细胞因子IL-6和TNF-α的增加，效果较nExo更优越(图3C)。

图3各图中，横轴RAW264.3即为对照组，PBS即为模型组，nExo即为模型+nExo组，iExo即为模型+iExo组。

实施例4：iExo对抗脓毒症的体内实验验证

通过盲肠结扎穿孔(CLP)建立小鼠脓毒症模型，具体如下：将小鼠随机分组后麻醉，将其腹部毛发剃掉，并用手术刀切开1.5-2厘米的皮肤。使用4-0缝合线结扎盲肠。用镊子将盲肠内容物轻轻推至远端，用21G针穿刺盲肠。随后，从穿刺孔中挤出少量粪便。然后将盲肠放回腹部并用6-0缝合线闭合切口。至此完成CLP小鼠脓毒症模型鼠的构建。对照组打开腹部后不做其他操作，重新缝合。设置如下实验组：

对照组：打开腹部后不做其他操作，重新缝合；

PBS组：给CLP模型鼠每24小时腹腔注射一次200μL的PBS；

nExo组：给CLP模型鼠每24小时腹腔注射一次50μg的nExo；

iExo组：给CLP模型鼠每24小时腹腔注射一次50μg的iExo。

术后保证适宜的环境和充足的饮食饮水，观察小鼠的生存状态，结果如图4A所示，与模型组(PBS组)相比，iExo处理组小鼠生存率(66.63％)显著提高，而nExo组(33.33％)与模型组(PBS组，16.63％)无显著差异。

CLP模型建立3天时为高危期，对小鼠实施统一处死后观察记录腹腔内损伤情况，腹腔注入1mL生理盐水冲洗并抽回收集于玻璃试管，如图4B和4C所示，模型组(PBS组)和nExo治疗组小鼠肠道肿胀淤血见化脓性炎症，腹腔内产生大量血性浑浊积液。而iExo治疗组有效抑制了肠道化脓性病变，无明显腹腔积液。

采集肝、肺、肾固定于10％福尔马林，包埋切片后进行HE染色，将苏木素滴在载玻片负载的组织上，等待五分钟左右，快速水洗3-5秒。在组织切片上滴加伊红染色10-30秒，用增色液冲洗1-2次，滤纸吸干或等待自然晾干。滴加中性树脂小心封片。如图4D所示，组织切片可观察到模型组(PBS组)和nExo治疗组肾区多见弥散性出血、肾小球肿胀、肾小管细胞损伤等；肺泡壁增厚、炎性细胞浸润及肺气肿；肝组织切片可见肝细胞肿胀，胞浆疏松，炎性细胞浸润、偶见点状坏死。而iExo治疗组各器官都得到了一定程度的保护。

基于上述结果，发明人发现经LPS诱导后黑色素瘤细胞(B16-F10)产生的外泌体iExo能够靶向内皮细胞和巨噬细胞，调节免疫功能，抑制炎症反应，提高脓毒症生存率。这提示了通过模拟环境刺激仿生细胞行为为类似脓毒症的炎症因子风暴相关疾病的治疗提供了新赛道。

图4个图中，sham和control均代表对照组。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种外泌体在制备脓毒症治疗药物中的应用，其特征在于，所述外泌体为LPS诱导黑色素瘤细胞分泌产生的外泌体；

所述黑色素瘤细胞为黑色素瘤细胞B16-F10；

所述外泌体的制备方法如下：将黑色素瘤细胞复苏培养后，加入LPS至终浓度0.1-2μg/mL，静置于37℃、5％CO₂培养箱继续培养细胞24-72h后，收集细胞培养上清，提取外泌体。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在在于，黑色素瘤细胞复苏培养采用的培养基为含10％FBS的DMEM或1640培养基；通过超速离心提取外泌体。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物能够维持内皮细胞屏障稳态。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物能够对巨噬细胞进行免疫调节。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物能够抑制内皮细胞分泌黏附分子和趋化因子；

或调节巨噬细胞中TLR4-myd88-NF-κB信号通路；

或调控巨噬细胞中NF-κB的核移位；

或抑制巨噬细胞M1极化，促进M2极化；

或抑制促炎细胞因子IL-6，IL-8和TNF-α的分泌。