CN103260612A - MeCP2相关性病症的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用胱胺、半胱胺或其盐或使用钙调磷酸酶抑制剂来治疗MeCP2相关性病症例如Rett综合征。

Description

MeCP2相关性病症的治疗

发明领域

本发明涉及可用于治疗与MeCP2表达缺陷相关的神经发育性和/或神经性病症的化合物。

发明背景

甲基-CpG结合蛋白2（MeCP2）基因编码一种能够结合甲基化的DNA并调控靶基因转录的蛋白。MeCP2的缺陷或过表达在人类中引起严重的神经发育性和/或神经性疾病。

存在几种形式的与MeCP2表达缺陷相关的神经发育性和/或神经性病症。Rett综合征、自闭症、广泛性发育障碍、非综合征型智力发育迟缓、特发性新生儿脑病和特发性大脑性麻痹是这样的病症的典型实例。

Rett综合征是一种X染色体连锁的显性病症，几乎专门影响女性。通常，受影响的女孩可能表现得发育正常，直至出生后6至18个月之间的某个时间点，此时发育进程可能停止或开始后退。她们失去有目的的手部使用和任何获得性语言技能（接受性和表达性两者），颅生长减缓，并发生重复性手部移动。还可能出现其他特点例如共济失调、步态失调、癫痫、呼吸律失常（呼吸暂停或呼吸过度）和自闭行为。她们也遭受躯体生长减少和消瘦。在该快速恶化期之后，患者变得稳定，然后可能恢复一些技能。通常可以存活到成年期。目前的估测表明，超过90%的Rett综合征病例由MECP2基因中的突变引起。在每12,500位活到12岁的女性中约诊断到1例Rett综合征。

自闭症是一种复杂的发育性失能，其通常在生命的前三年中出现。它是影响大脑功能的神经性病症的结果。已发现它在男孩中比在女孩中发病率高4倍。通常，自闭儿童和成人在语言性和非语言性交流、社会互动和娱乐或游戏活动方面有困难。由于不能像大多数儿童那样从自然环境学习，自闭儿童通常对其周围的世界或人表现出很少的兴趣。尽管某些患有自闭症的儿童发育正常并甚至获得高级技能，但大多数自闭症儿童表现出广范围的行为问题。自闭症影响人理解他人、与他人交流和相处的方式。自闭症最初被认为主要是精神病症。然而，进一步的调查显示，遗传和环境因素与自闭症的发病机理相关。

广泛性发育障碍（PDD）是一个涵盖性术语，其描述了由可能具有各种潜在遗传或环境/生物学病因的脑发育异常或由基因-环境相互作用所引起的神经发育性病症的特征。PDD通常在儿童发育中引起多种基本功能、包括社会化和交流的发育延迟。PDD可能早在婴儿期就表现出来，并通常到3岁时变得明显。PDD的症状可以包括交流问题例如难以使用和理解语言，难以与人、物体和事件相处，很少玩玩具和其他物体，难以适应日常或熟悉的环境的变化，以及重复性身体移动或行为模式。患有PDD的儿童在能力、智力和行为方面有广泛差异。一些儿童完全不说话，其他儿童能够说出有限的短语或会话，还有些儿童具有相对正常的语言发育。

智力发育迟缓由智能水平（IQ）低于70、在两种或以上适应性技能领域明显受限和从儿童期（被定义为18岁或以下）起出现病症来定义。在约三分之二的智力发育迟缓病例中发现遗传性病因。参与神经元分化和突触可塑性、突触囊泡循环和基因表达调控的生物学过程，被认为是智力发育迟缓的重要原因。大多数患者具有非综合征形式的这种病症，其特征为不存在相关的形态、放射学和代谢特点。

特发性新生儿脑病是由未知病因引起的一种产科脑病形式。脑病不是指单一疾病，而是指大脑整体机能病症的特征群。脑病的标志是智力状态改变。取决于脑病的类型和严重性，常见的神经性症状是散失认知功能、微妙的人格变化、不能集中、无精打采和意识降低。其他神经性征兆可以包括肌阵挛（肌肉或肌肉群的非自主颤搐）、扑翼性震颤（肌紧张的突然丧失，其快速恢复）、眼球震颤（快速非自主的眼运动）、震颤、癫痫、辗转不安（严重感染特征性的焦躁不安地找东西）和呼吸异常例如Cheyne-Stokes呼吸（潮气量周期性的消长变化）、深吸气性呼吸和高碳酸血后呼吸暂停。

特发性大脑性麻痹涵盖了由未知病因引起的一类非进行性和非传染性运动病症，其主要在身体运动的各个方面引起人类发育的物理性失能。大脑性麻痹由发育中的大脑的运动控制中心的损伤引起，并可以在妊娠期间、分娩或出生后直至约3岁期间发生。产生的运动和姿势的限制引起活动限制，并通常伴有知觉、深度知觉和其他基于视力的感觉问题、交流能力和有时甚至认知的扰乱；有时，一种形式的大脑性麻痹可能伴有癫痫。大脑性麻痹，不论何种类型，通常伴有作为潜在病因的结果而产生的次级肌肉骨骼问题。

在与MeCP2相关的许多类型的神经发育性和/或神经性病症中，都没有已知的治愈方法。药物被用于处理某些行为问题；用于患有神经发育性和/或神经性病症的儿童的疗法，通常根据儿童的具体需要来特制。

MeCP2对于正常大脑发育来说是必不可少的，其表达的改变在人类中引起严重的认知、运动和自主功能病症。MeCP2缺陷导致轴突和树突过程的数量减少以及树突棘密度的降低（Armstrong,D.D.(2002)Rett综合征的神经病理学（Neuropathology of Rett syndrome.）Ment.Retard.Dev.Disabil.Res.Rev.,8,72-76和Belichenko,P.V.,Wright,E.E.,Belichenko,N.P.,Masliah,E.,Li,H.H.,Mobley,W.C.,Francke,U.(2009)在Rett综合征的Mecp2突变小鼠模型中树突和轴突形态的普遍变化：神经元网络破坏的证据（Widespread changes in dendritic and axonalmorphology in Mecp2-mutant mouse models of Rett syndrome:evidencefor disruption of neuronal networks.）J Comp.Neurol.,514,240-258）。树突和轴突的普遍异常似乎参与MeCP2相关性病症。

几份专利和申请公开了各种治疗MeCP2相关性病症的治疗性化合物。例如，WO 2008/122087描述了能够改善受损的微管动力学的药剂，EP 1 559 447描述了使用埃博霉素类，通过诱导微管蛋白聚合成微管来治疗自闭症，US 6,709,817描述了使用一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古柳菌素A，通过提高微管蛋白乙酰化来补偿囊泡运输并治疗MeCP2相关性病症。专利申请WO 2008/060375描述了通过提高脑中的BDNF水平来治疗智力发育迟缓。

脑源性神经营养因子（Bdnf）是MeCP2的靶之一。在MeCP2缺陷型小鼠中发现Bdnf mRNA和蛋白质水平的显著降低（Chang,Q.,Khare,G.,Dani,V.,Nelson,S.,Jaenisch,R.(2006)MeCP2突变小鼠的疾病进程受到BDNF表达水平的影响（The disease progression of MeCP2mutant mice isaffected by the level of BDNF expression.）Neuron.49,341-348）。Bdnf作用于中枢和外周神经系统中的神经元，支持现存神经元的存活并引起新神经元的生长和分化（Acheson,A.,Conover,J.C.,Fandl,J.P.,DeChiara,T.M.,Russell,M.,Thadani,A.,Squinto,S.P.,Yancopoulos,G.D.,Lindsay,R.M.(1995)成年感觉神经元中的BDNF自分泌回路阻止细胞死亡（ABDNF autocrine loop in adult sensory neurons prevents cell death.）Nature.,6521,450–4533）。此外，Bdnf在遍及整个大脑的轴突和树突分化和成熟中发挥关键作用（Huang,E.J.,Reichardt,L.F.(2001).神经营养蛋白：在神经元发育和功能中的作用（Neurotrophins:roles in neuronaldevelopment and function.）Annu.Rev.Neurosci.24,677–736）。Chalour等，2007显示，Bdnf也参与在患有由MeCP2功能病症引起的神经性疾病例如Rett综合征的患者中均受到严重影响的认知、运动和自主功能的调控（Chahrour,M.和Zoghbi,H.Y.(2007)Rett综合征的故事：从诊所到神经生物学（The story of Rett syndrome:from clinic to neurobiology.）Neuron.56,422-437和Greenberg,M.E.,Xu,B.,Lu,B.,Hempstead,B.L.(2009)BDNF合成和释放的生物学的新见解：与CNS功能的关联（Newinsights in the biology of BDNF synthesis and release:implications in CNSfunction.）J.Neurosci.29,12764-12767）。

在现有技术中，Sun等，2006假设Bdnf的异常表达是在MeCP2不存在的情况下发生的一般性神经功能病症的原因（Sun,Y.E.,Wu,H.(2006)Rett综合征中BDNF的起伏（The ups and downs of BDNF in Rettsyndrome.）Neuron.49,321-3）。Chang等，2006发现，Bdnf的过表达能够改善在MeCP2缺陷型小鼠体内观察到的功能缺损（Chang,Q.,Khare,G.,Dani,V.,Nelson,S.,Jaenisch,R.(2006)MeCP2突变小鼠的疾病进程受到BDNF表达水平的影响（The disease progression of MeCP2mutant mice is affected by the level of BDNF expression.）Neuron.49,341-348）。这些数据表面，Bdnf可能在由MeCP2功能病症引起的神经学表型的出现中发挥关键作用。然而，脑中MeCP2的改变的水平与BDNF之间的联系仍不清楚。

发明简述

本发明的目的是提供用于治疗MeCP2相关性病症的新方法。

本发明是基于MeCP2蛋白在轴突BDNF和APP（淀粉样蛋白前体）运输的调控中发挥新作用这一认识。更准确来说，本发明显示，MeCP2缺陷引起BDNF和APP囊泡沿着轴突的速度丧失。

在这些研究发现的基础上，本发明人提出了使用被称为囊泡运输调节物的药物分子，通过发挥钙调磷酸酶抑制剂的作用来修改整个神经元的囊泡运输。

本发明提供了提高大脑BDNF水平以局部提供更多BDNF囊泡并恢复轴突BDNF运输的化合物。

根据第一方面，本发明涉及使用胱胺或半胱胺或其盐来治疗MeCP2相关性病症。

在优选实施方式中，所述胱胺或半胱胺被用于治疗选自Rett综合征、自闭症、广泛性发育障碍、非综合征型智力发育迟缓、特发性新生儿脑病和特发性大脑性麻痹的MeCP2相关性病症。

优选情况下，所述MeCP2相关性病症是Rett综合征。

所述胱胺或半胱胺可以单独或与另一种药学活性化合物组合使用。

根据第一方面，本发明涉及使用钙调磷酸酶抑制剂在人类患者中治疗MeCP2相关性病症。

在优选实施方式中，所述钙调磷酸酶抑制剂是大环内酯类物质。

在优选实施方式中，所述钙调磷酸酶抑制剂选自钙调磷酸酶抑制蛋白（calcipressin）类（也称为钙调磷酸酶调节物（RCAN）蛋白）、他克莫司和他克莫司类似物、环孢霉素A和环孢霉素A类似物、LxPV蛋白、2,6-二芳基取代的嘧啶衍生物和FK506结合蛋白。

在更优选实施方式中，所述钙调磷酸酶抑制剂选自钙调磷酸酶抑制蛋白1、钙调磷酸酶抑制蛋白2、钙调磷酸酶抑制蛋白3（也称为RCAN1、2和3）、他克莫司（也称为FK506或藤霉素）、子囊霉素、西罗莫司、吡美莫司、环孢霉素A、伏环孢素(voclosporine)（也称为ISA247）、LxPVc1、LxPVc2、LxPVc3、6-(3,4-二氯苯基)-4-(N,N-二甲基氨基乙基硫代)-2-苯基嘧啶（也称为CN585）和FK506结合蛋白8（也称为FKNP8）。

在另一种优选实施方式中，所述钙调磷酸酶抑制剂是他克莫司。

在优选实施方式中，所述钙调磷酸酶抑制剂是环孢霉素A。

本发明的钙调磷酸酶抑制剂被用于治疗选自Rett综合征、自闭症、广泛性发育障碍、非综合征型智力发育迟缓、特发性新生儿脑病和特发性大脑性麻痹的MeCP2相关性病症。

在优选实施方式中，所述MeCP2相关性病症是Rett综合征。

所述钙调磷酸酶抑制剂可以单独或与另一种药学活性化合物组合使用。

还描述了钙调磷酸酶抑制剂或胱胺、半胱胺或其盐的用途，用于制造治疗MeCP2相关性病症例如Rett综合征的药物。还公开了用于治疗MeCP2相关性病症的方法，所述方法包括向需要的患者给药治疗有效量的钙调磷酸酶抑制剂或胱胺、半胱胺或其盐。

图例说明

图1.该图描述了在Mecp2缺陷的大脑中参与Bdnf运输的几种基因的表达严重降低。

参与Bdnf运输的基因的实时定量PCR分析，在从P55野生型（Wt，对于前脑来说n=4；对于脑桥或延髓来说n=5）和Mecp2缺陷型小鼠（Ko，对于前脑来说n=4；对于脑桥或延髓来说n=5）的前脑分离的mRNA上进行。Bdnf、Hap1、Htt、Sgk1、Dctn1、Dync1h1和Ahi1都是参与Bdnf的囊泡运输的机械复合物的部件。它们的转录本在Mecp2缺陷的脑中都被显著下调。主要的Bdnf受体TrkB和参与囊泡融合和再利用的Syt1的表达不受缺乏Mecp2的影响。所有值都被表示为对同一样品中的Gapdh归一化后的相对mRNA水平，并被表示为野生型水平的百分率。*表示统计学显著的差异（p<0.05）。

图2.该图示出了在Mecp2缺陷型小鼠的整个脑中Hap1和Htt的出生后表达降低。

在小鼠脑的三个区域中亨廷顿蛋白结合蛋白1（Hap1）和亨廷顿蛋白（Htt）mRNA的定量：前脑、脑桥和延髓。在野生型（Wt，每个年龄n=4）和Mecp2缺陷型小鼠（Ko，每个年龄n=4）中，在P30和P55时执行定量。在P30时，没有观察到解调控。在P55时，在三个所测试的脑区域中Hap1和Htt的表达显著减少。所有值都被表示为对同一样品中的Gapdh归一化后的相对mRNA水平，并被表示为野生型水平的百分率。*表示统计学显著的差异（p<0.05）。

图3.该图描述了Bdnf蛋白在Mecp2缺陷型小鼠的纹状体和皮层之间的重新分配是异常的。

Bdnf蛋白存在于纹状体中并从皮层顺行运输。我们对两个区域（A中的圆圈）中的染色水平进行了免疫定量，并计算了纹状体与皮层之间的比率（B）。在Mecp2缺陷的脑中，纹状体Bdnf为皮层Bdnf的45%，而在野生型脑中该值为75%。这表明Bdnf的轴突运输的缺陷。*表示统计学显著的差异（p<0.05）。

图4.该图示出了Bdnf的顺行和反行囊泡运输受到Mecp2水平的影响。

将大鼠皮层神经元培养物用Bdnf-cherry、Mecp2表达载体或空载体和si-Mecp2或si-对照进行电穿孔，并在玻璃盖片（cover-sleep）上铺板。在体外三天后，在四种条件下通过视频显微术分析Bdnf动力学，对顺行和反行速度进行定量并以微米/分钟（μm/min）为单位表示。*表示统计学显著的差异（p<0.05）。

图5.该图示出了App基因表达和App荧光强度不受Mecp2水平的影响。

本发明人解剖了Mecp2缺陷型小鼠的前脑并与野生型小鼠进行比较。他们首先通过实时PCR定量了App mRNA的水平并且没有发现任何显著变化，其次他们在相同区域进行了免疫染色，并且也没有发现任何显著变化。

图6.该图示出了App的顺行和反行囊泡运输受到Mecp2水平的影响。

将大鼠皮层神经元培养物用Bdnf-cherry并另外用空载体和si-Mecp2或si-对照进行电穿孔，并在玻璃盖片（cover-sleep）上铺板。在体外三天后，在四种条件下通过视频显微术分析App动力学，对顺行和反行速度进行定量并以微米/分钟（μm/min）为单位表示。*表示统计学显著的差异（p<0.05）。

图7A.该图示出了用半胱胺长期治疗延长了Mecp2缺陷型小鼠的寿命。

在用水（介质，KO VEH）或半胱胺（KO CYST）治疗的动物中评估了Mecp2缺陷型小鼠的存活。本发明人发现，半胱胺口服治疗明显延长了Mecp2缺陷型小鼠的寿命（介质组：65±2.2天；半胱胺组：74.8±5.2天；p<0.05，Kaplan-Meir对数秩检验）。对于介质治疗的Mecp2缺陷型小鼠来说n=42，对于半胱胺治疗的Mecp2缺陷型小鼠来说n=17。

图7B.和7C.这些图示出了口服半胱胺治疗对Mecp2缺陷型小鼠的运动性能的影响。该图显示了在介质组和半胱胺治疗的动物（对于半胱胺KO CYST来说n=10，对于介质KO VEH来说n=10）中的行为性能。图7B：在用半胱胺治疗的Mecp2缺陷型小鼠中，从P75起小鼠在15分钟时间段中在开放场地中移动的总距离在统计学上增加。图7C：用半胱胺治疗的Mecp2缺陷型小鼠的速度从P65起显著增加（*p<0.05）。

发明详述

本发明人显示，在MeCP2缺陷型动物中，参与Bdnf运输的许多转录本一致地解调控。此外，本发明人发现，在MeCP2缺陷型动物中，Bdnf运输的两种关键贡献因子（亨廷顿蛋白和亨廷顿蛋白结合蛋白1）的蛋白水平显著降低。此外，他们观察到在MeCP2缺陷的轴突中，含有Bdnf的囊泡的速度改变，并且该表型可以通过MeCP2表达来挽救。

这些数据表明，恢复BDNF运输可用于治疗MeCP2相关性病症。现在，本发明人提供了两种恢复BDNF运输的方式：第一种通过使用胱胺和/或半胱胺，经HSJ1b和转谷氨酰胺酶来提高BDNF水平，第二种通过使用钙调磷酸酶抑制剂来改变整个神经元中的囊泡运输。

根据本发明，MeCP2相关性病症的治疗可以包括给药治疗有效量的胱胺和/或半胱胺和/或治疗有效量的钙调磷酸酶抑制剂。

神经发育性和/或神经性病症

在本发明的上下文中，“对象”或“患者”是指患有与MeCP2相关的神经发育性和/或神经性病症的哺乳动物、特别是人类，不论其年龄或性别如何。具体来说，该术语包括驯养和常见实验室哺乳动物，例如非人类灵长类动物、猫科动物、犬科动物、马科动物、猪科动物、牛科动物、山羊、绵羊、兔、大鼠和小鼠。优选情况下，待治疗的患者是人类，包括儿童或青少年。

在本发明的上下文中，“MeCP2相关性病症”是指由MeCP2表达缺陷、异常或畸变和/或MeCP2基因突变缺陷、异常或畸变所引起的神经性和/或神经发育性病症。这样的病症的实例包括但不限于Rett综合征、自闭症、广泛性发育障碍、非综合征型智力发育迟缓、特发性新生儿脑病和特发性大脑性麻痹。

胱胺和半胱胺化合物

在本发明的上下文中，“胱胺”是指具有下式的有机二硫化物

可以使用其任何可药用盐，特别是二盐酸盐。

在本发明的上下文中，“半胱胺”是指具有下式的化学化合物

可以使用其任何可药用盐，特别是盐酸盐。

钙调磷酸酶抑制剂

在本发明的上下文中，“钙调磷酸酶抑制剂”是指具有钙调磷酸酶抑制活性的化合物。钙调磷酸酶是参与细胞内信号传导的钙/钙调蛋白调控的蛋白质磷酸酶。优选情况下，本发明的钙调磷酸酶抑制剂是大环内酯类物质。本发明的钙调磷酸酶抑制剂可以选自钙调磷酸酶抑制蛋白类（也称为钙调磷酸酶调节物（RCAN）蛋白）、他克莫司和他克莫司类似物、环孢霉素A和环孢霉素A类似物、LxPV蛋白、2,6-二芳基取代的嘧啶衍生物和FK506结合蛋白。例如，本发明的钙调磷酸酶抑制剂可以是钙调磷酸酶抑制蛋白1、钙调磷酸酶抑制蛋白2、钙调磷酸酶抑制蛋白3（也称为RCAN1、2和3）、他克莫司（也称为FK506或藤霉素）、子囊霉素、西罗莫司、吡美莫司、环孢霉素A、伏环孢素（也称为ISA247）、LxPVc1、LxPVc2、LxPVc3、6-(3,4-二氯苯基)-4-(N,N-二甲基氨基乙基硫代)-2-苯基嘧啶（也称为CN585）和FK506结合蛋白8（也称为FKNP8）。

在本发明的上下文中，“大环内酯类物质”是指其活性源自于大环内酯环的存在的一类药物。大环内酯环是大的大环状内酯环，其上可以附连一个或多个脱氧糖，通常为二脱氧甲基已糖和去氧糖胺。所述内酯环通常为14、15或16员环。

剂量

在本发明的上下文中，“治疗有效量”是指足以产生所需结果的剂量。一般来说，所需结果是BDNF或APP运输和/或可利用性的增加和/或恢复。药剂的治疗有效量不必然需要治愈病症，而是将改善病症或治疗以防止病症发作。当然，构成“治疗有效量”的量将随着化合物、病症及其严重性、待治疗患者的年龄而变，其可以由本技术领域的普通专业人员根据其自身的知识和本公开来常规地确定。

例如，钙调磷酸酶抑制剂或胱胺或半胱胺的治疗有效量可以为约0.01mg/Kg/剂至约100mg/Kg/剂。优选情况下，治疗有效量可以为约0.01mg/Kg/剂至约25mg/Kg/剂。更优选情况下，治疗有效量可以为约0.01mg/Kg/剂至约10mg/Kg/剂。最优选情况下，治疗有效量可以为约0.01mg/Kg/剂至约5mg/Kg/剂。因此，本文中所描述的每个剂量单位（例如片剂、胶囊、粉剂、注射剂、栓剂、满茶匙等）所包含的活性成分的治疗有效量，对于例如平均体重为70Kg的对象来说，可以为约1mg/天至约7000mg/天。

在本发明的上下文中，“增加BDNF运输”或“恢复BDNF运输”是指增加脑中BDNF的运输和/或可利用性的任何方法/过程。这包括但不限于给药起到钙调磷酸酶抑制剂作用的囊泡运输调节剂和/或给药胱胺和/或半胱胺。

药物组合物

对于本发明的用途来说，可以通过本技术领域中已知的方法来配制钙调磷酸酶抑制剂、胱胺和半胱胺。用于口服、直肠、肠胃外或局部施用的组合物，可以制备成片剂、胶囊、颗粒剂、栓剂、植入物、无菌水性或油性可注射溶液、悬液或乳液、气溶胶、软膏、霜剂或凝胶、缓释制剂或缓释植入物的形式。钙调磷酸酶抑制剂、胱胺和半胱胺也可以通过可植入给药系统或通过灌注来给药。

给药途径

本发明的钙调磷酸酶抑制剂、胱胺和半胱胺或其药物组合物可以通过任何惯常给药途径来给药，所述给药途径包括但不限于口、肺部、腹膜内（ip）、静脉内（iv）、肌肉内（im）、皮下（sc）、透皮、颊、鼻、舌下、眼、直肠和阴道途径。此外，直接向神经系统的给药可以包括但不限于通过经带有或不带有泵装置的颅内或脊椎内针头或导管递送的大脑内、脑室内、侧脑室内、鞘内、脑池内、脊柱内或脊柱周给药途径。对于本技术领域的专业人员来说，显然能够提供本文所述治疗效果的任何给药剂量或频率，都适合用于本发明。

此外，可以使用标准制药方法来控制作用的持续时间。这些在本技术领域中是公知的，包括控制释放制剂，并可以包括适当的大分子例如聚合物、聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白。

下面的实施例对本发明进行示例说明，但不限制其范围。

实施例

材料和方法

动物

实验在Sprague dawley大鼠和RTT的B6.129P2(C)-MeCP2tm1-1Bird小鼠模型（Guy,J.,Hendrich,B.,Holmes,M.,Martin,J.E.,Bird,A.(2001)小鼠Mecp2无效突变引起模拟Rett综合征的神经学症状（Amouse Mecp2-null mutation causes neurological symptoms that mimic Rettsyndrome.）Nat.Genet.27,322-326）上执行。小鼠从Jackson Laboratory获得，并维持在C57BL/6背景上。大鼠从法国Charles River Laboratories获得。实验程序遵照欧洲实验室动物护理和使用准则（理事会指令86/6009/EEC）来执行。对于小鼠实验来说，通过将杂合敲除雌性与C57BL/6雄性进行杂交，产生半合子突变雄性（MeCP2^-/y）。基因分型通过常规PCR技术，按照Jackson Laboratory流程并如以前所述来进行（Viemari,J.C.,Roux,J.C.,Tryba,A.K.,Saywell,V.,Burnet,H.,

F.,Zanella,S.,Bévengut,M.,Barthelemy-Requin,M.,Herzing,L.B.,Moncla,A.,Mancini,J.,Ramirez,J.M.,Villard,L.,Hilaire,G.(2005)Mecp2缺陷在小鼠中破坏去甲肾上腺素和呼吸系统（Mecp2deficiency disruptsnorepinephrine and respiratory systems in mice.）J.Neurosci.25,11521-11530)。

细胞培养（转染siRNA、表达载体）和视频显微术

剖开E17大鼠胚胎的皮层并按照以前所述分离（Saudou,F.,Finkbeiner,S.,Devys,D.,Greenberg,M.E.(1998)亨廷顿蛋白在核中起作用以诱导凋亡，但是死亡不与核内包含体的形成相关（Huntingtin actsin the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with theformation of intranuclear inclusions.）Cell.95,55-66）。将皮层神经元用大鼠神经元

试剂盒，按照制造商的手册（Amaxa,Biosystem,

Germany）进行电穿孔，并铺于聚L-赖氨酸包被的盖片（cover-sleep）（Sigma上。使用的质粒：pcDNA3空载体（Invitrogen），Bdnf-mCherry，其来自G.Banker（Oregon Health and Science University,Portland,Oregon）的善意馈赠，MeCP2表达载体，其来自N.Landsberger（University of Busto Arsizio）的善意馈赠，GFP（Amaxa,Biosystem,

Germany）。所使用的SiRNA：大鼠MeCP2（Sigma），混杂RNA对照（Eurogentec）。将神经元培养物保持在增补有B27和Glutamax（GIBCO）的Neurobasal培养基中。在体外3天后，将神经元用于Bdnf运动测定和/或免疫荧光染色。对于运动测定来说，使用以前详细描述的成像系统进行活视频显微术（Gauthier,L.R.,Charrin,B.C.,Borrell-Pagès,M.,Dompierre,J.P.,Rangone,H.,Cordelières,F.P.,De Mey,J.,MacDonald,M.E.,Lessmann,V.,Humbert,S.,Saudou,F.(2004)亨廷顿蛋白通过增强BDNF沿着微管的囊泡运输来控制神经元的神经营养支持和存活（Huntingtin controls neurotrophic support and survival ofneurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.）Cell.118,127-138）。将细胞在固定于Ludin仓室中的盖玻片上生长。显微镜和仓室保持在37℃。使用与压电装置（PI）偶联的100X PlanApo N.A.1.4油浸物镜，以0.3μm的Z轴步级获取5-7张图像的堆栈。使用设置为2X2面元的Micromax相机（Ropper Scientific），使用50至150ms的曝光时间（频率为1个栈/s），以流模式收集图像。使用光学系统的PSF，通过自动分批去卷积对所有栈进行处理。投影、动画和分析使用ImageJ软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/,NIH,USA）产生。动力学特征通过使用特殊插件（F.P.Cordelières,IC,http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html）追踪GFP囊泡在细胞中的位置随时间的变化来描述。在追踪期间，使用囊泡中心的笛卡尔坐标来计算动力学参数（速度，方向性）。

对于免疫染色来说，将细胞用PFA 4%固定并使用标准流程进行处理。所使用的抗体：MeCP2（upstate），微管蛋白克隆6-11B-1（Sigma），乙酰微管蛋白（Sigma）。与AlexaFluor-488和AlexaFluor-555偶联的抗小鼠和抗兔第二抗体购自Molecular Probes（Invitrogen）。图像使用LeicaSP5共聚焦显微术获取，染色强度使用ImageJ软件通过测量平均核强度来分析（http://rsb.info.nih.gov/ij/,NIH,USA）。

微阵列流程和分析

通过颈脱位法处死P55野生型（n=3）和MeCP2缺陷型（n=3）小鼠。将延髓剖出并立即置于-80℃。将冷冻的延髓置于液氮中的2ml管中，并使用potter通过粉化将组织匀浆。使用TRIzol试剂（Invitrogen），按照制造商的说明书提取总RNA。将RNA样品用1μg RNA 0.5单位的不含RNase的DNase I（Qiagen）在37℃下处理30min，然后在65℃下进行5min的酶失活。RNA的质量和纯度在Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies,Palo Alto,CA）上，按照制造商的说明书并使用Agilent 2100生物分析仪软件进行分析。

从来自于野生型和MeCP2缺陷型脑干的每种合并物的500ng总RNA，分别在Cy3或Cy5 dCTP存在下制备第一链cDNA，并将其与小鼠的60-mer寡核苷酸微阵列（Agilent小鼠发育寡核苷酸微阵列2x22K）杂交。将Cy5-CTP标记的MeCP2缺陷型靶与Cy3-CTP标记的野生型靶进行比较的杂交，使用Agilent基因表达杂交试剂盒（G4121A），按照制造商的说明书来进行。简单来说，将500ng处理过的样品cRNA与500ng对照cRNA混合，并将该溶液进行片段化（60℃下30min），然后在旋转炉中与阵列杂交（65℃，17h，10RPM）。拆开载片，按照制造商的清洗缓冲液试剂盒说明书在溶液I和II中清洗，并用G2505B型Agilent DNA微阵列扫描仪（Agilent Technologies）扫描。使用LOWESS算法执行归一化，并使用染料归一化的信号计算对数比率。具有比阴性对照特点的背景高出小于或大于2SD的参比值的特点，被视为缺失值。我们只考虑在两个独立实验（对于每个实验来说，n=3Ko和n=3Wt）中恒定解调控的基因，其中对于每个流程使用染料交换。按照以前的描述进行方差分析（ANOVA）和平行样平均（Carter,M.G.,Hamatani,T.,Sharov,A.A.,Carmack,C.E.,Qian,Y.,Aiba,K.,Ko,N.T.,Dudekula,D.B.,Brzoska,P.M.,Hwang,S.S.,Ko,M.S.(2003)。被优化用于小鼠干细胞和早期发育表达情况分析的原位合成的新微阵列（In situ-synthesized novelmicroarray optimized for mouse stem cell and early developmentalexpression profiling.）Genome.Res.13,1011-1021），并且对于微阵列的显著性分析来说，在原始数据上使用t-检验算法和Benjamin-Hochberg校正。

RNA提取和RNA定量

从来自于P55和P30日龄小鼠的延髓、脑桥和中脑-后脑样品提取总RNA。将样品收集在液氮中的2ml管中，并使用potter通过粉化将组织匀浆。使用TRIzol试剂（Invitrogen），按照制造商的说明书提取总RNA。将RNA样品用1μg RNA0.5Kunitz的不含RNase的DNase I（Qiagen）在37℃下处理30min，然后在65℃下进行5min的酶失活。使用1μg RNA1个单位的Dnase I（Roche）在37℃处理30min，然后在75℃下酶失活5min，来研究脑桥RNA样品的质量和纯度特点。500ng总RNA的反转录，在含有12.5ng de dN6、40U的Rnase抑制剂（Promega）、10mM dNTP和200U的Superscript II反转录酶（Invitrogen）的22μl Superscript反应缓冲液中进行。对于定量PCR反应来说，我们使用LightCycler480系统（Roche），并且我们选择了SYBR Green IMaster试剂盒（Roche）。每种反应使用2μl cDNA（对于第一链反应来说1/2稀释）和200nM每种引物执行三份平行样。首先，我们决定使用实时PCR来证实在微阵列方案中被鉴定为解调控的12个基因是否解调控。我们还使用一对特异性引物转录本来定量参与Bdnf轴突运输的主要基因的mRNA表达。作为内部对照，在实时定量PCR中，使用一对特异性针对Gapdh的引物，在相同条件下测量Gapdh。Ct值是信号变得高于背景噪音时的阈值循环，其随着在扩增的指数期中测定的阈值而变。为了归一化我们的结果并定量不同目标基因的表达，本发明人使用deltaCt（ΔCt）方法来比较目标基因与内部对照之间的Ct。ΔCt=目标基因的Ct–Gapdh的Ct。

免疫染色和免疫定量

将成年（P55）雄性小鼠用致死性戊巴比妥注射（100mg kg-1i.p.）麻醉并进行心脏灌注（冷盐水1min，然后用含有4%多聚甲醛的0.1MPBS灌注10min）。将脑后固定5h，并在含有20%蔗糖的PBS中放置过夜，在-80℃下冷冻。使用低温恒温器（Microm,France）切出脑的冠状切片（20μm），并将每5张连续切片为一组连续排列在载片上。将切片通透化（0.15% TritonX-100），用7%正常血清（兔）阻断，并与第一抗体在含有3.5%血清、0.15%Triton X-100的PBS中在4℃温育过夜。清洗切片，将其与第二抗体在含有3.5%正常血清、0.15% TritonX-100的PBS中温育，并重新清洗。然后将载片固定在prolong抗淬灭试剂（Thermo Electron）中。Hap1用相应的亲和纯化的小鼠单克隆抗体（1：500，BD bioscience H89720）探测。Htt用亲和纯化的小鼠抗体（1：1000，Euromedex HU-4C8-As）探测。使用山羊抗兔alexa 546（1：400）（Molecular Probes,Eugene Oregon）作为第二抗体。使用装备有CoolSNAP相机（Princeton,Trenton,NJ,USA）的Leica DMR显微镜（Leica Microsystems,Wetzlar,Germany）对免疫标记的载片进行数字化和记录。为了对Htt或Hap1蛋白进行免疫定量，尽管这种方法不提供绝对值，但我们仍非常小心地比较了野生型与MeCP2^-/y组织之间的染色强度。我们在同一天解剖了不同组织，并且所有后面的步骤如固定、冷冻、切片、染色和最后的图片扫描，都使用相同的条件、溶液、时间对来自于两个组的样品交替进行。为了避免光强度的任何改变，在单一天开始时扫描的第一张切片，在结束时再次扫描。对相机响应的线性度进行检查，并且我们仔细地选择了荧光强度的最低与最高水平之间的范围，以便永远不会达到饱和。将所有照片灰度转换。染色的密度测定分析（光亮度）使用来自于国立卫生研究院（National Institutes of Health）的ImageJ软件（http://rsb.info.nih.gov）来进行。光密度被计算为OD=log10(255/光亮度)。

蛋白质分离和western印迹分析

通过超声法提取组织，然后在含有20mM Tris-HCl（pH=7.5）、150mM NaCl、2mM EGTA、0.1%Triton X-100和完整蛋白酶抑制剂片剂（Roche）的裂解缓冲液中分离蛋白质。蛋白质浓度通过BCA（二喹啉甲酸）法来测定。在96℃5min的变性步骤后，将蛋白质（20μg）在8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并通过以100V进行1h的液体电转印（Bio-Rad）转移到PVDF膜（Amersham Pharmacia Biotech）上。通过将膜与5%脱脂奶粉在含有0.1%Tween的TBS中在室温下预温育1h，来获得非特异性结合。将用于Hap1(1/5000小鼠抗体，BD BioscienceH89720)、Htt抗体（1/5000，小鼠Euromedex HU-4C8-As）或GAPDH（1/5000，Millipore）的第一抗体在相同溶液中稀释，并在4℃下温育过夜。在将膜用含有5%脱脂奶粉和0.1% Tween的TBS大量清洗后，与适合的过氧化物酶偶联的抗体在室温下温育2h。使用增强化学发光试剂盒（Supersignal West Femto,Pierce）检测结合的过氧化物酶偶联的抗体。通过相机将薄膜数字化，并使用来自于NIH的ImageJ软件在16位图像上进行信号定量。

Mecp2缺陷型小鼠的体内半胱胺治疗

从P30起，动物在其饮用水中接受半胱胺治疗（225mg/kg/天）（Sigma-Aldrich；St-Quentin,France）。每两天对小鼠称重，更新半胱胺溶液并检查治疗消耗。向饮用水添加半胱胺不显著影响水的消耗（对于未治疗和治疗的Mecp2缺陷型小鼠来说分别为4.1±0.2和4.2±0.1ml/天）。研究了79只Mecp2缺陷型小鼠（寿命研究，半胱胺治疗组n=17，未治疗组n=42；运动评估，半胱胺治疗组n=10，未治疗组n=10）。小鼠由对其基因型不知情的研究人员指派到每个实验组中。开放场地活动在由透明塑胶制成的活动场（38x30cm）中测量。测试时间段持续15min，并使用Ethovision2.3.19追踪系统（Noldus Information Technology）记录数据。记录了速度（cm/s）和移动的总距离（cm）。在Ethovision上的速度计算使用设定了最小移动距离（0.6cm）的输入过滤器来获得，以使短于该值的移动不被计算在内。

统计分析

使用Statview软件（SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA）进行统计分析。数据被表示成平均值±SEM。

实施例1

MeCP2缺陷型小鼠延髓中的转录情况分析显示出参与Bdnf运输的许多基因的异常表达。

本发明人使用DNA微阵列，分析了有症状的P55 MeCP2缺陷型（Ko）（n=6）和野生型小鼠（Wt）（n=6）的延髓中的mRNA表达模式。每种样品独立地进行杂交，并使用染料交换。他们发现了在所有MeCP2缺陷型样品中解调控的12个基因（表1）。为了证实微阵列的发现，他们使用新的MeCP2缺陷型延髓样品（n=3），利用实时定量PCR来测量转录本水平。证实了12个基因中的10个基因的表达，在所有测试的MeCP2缺陷型小鼠的延髓中被解调控。这10个基因包括已知在Bdnf的神经元运输中发挥积极作用的两个基因，其编码亨廷顿蛋白结合蛋白1（Hap1）和血清/糖皮质激素调控的激酶1（Sgk1）。实时PCR实验发现，Hap1 mRNA减少35%，Sgk1 mRNA减少55%。Hap1能够与亨廷顿蛋白（Htt）形成复合物，并且这种相互作用直接参与Bdnf运输（Gauthier,L.R.,Charrin,B.C.,Borrell-Pagès,M.,Dompierre,J.P.,Rangone,H.,Cordelières,F.P.,De Mey,J.,MacDonald,M.E.,Lessmann,V.,Humbert,S.,Saudou,F.(2004)亨廷顿蛋白通过增强BDNF沿着微管的囊泡运输来控制神经元的神经营养支持和存活（Huntingtin controlsneurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesiculartransport along microtubules.）Cell.118,127-138）。Sgk1已知使Htt磷酸化并调节Htt功能（Rangone,H.,Poizat,G.,Troncoso,J.,Ross,C.A.,MacDonald,M.E.,Saudou,F.,Humbert,S.(2004)血清和糖皮质激素诱导的激酶SGK通过使亨廷顿蛋白的421位丝氨酸磷酸化来抑制突变的亨廷顿蛋白诱导的毒性（The serum-and glucocorticoid-induced kinaseSGK inhibits mutant Huntingtin-induced toxicity by phosphorylating serine421of Huntingtin.）Eur.J.Neurosci.19,273-279）。本发明人还发现1型肌醇1,4,5-三磷酸受体（Itpr1）的解调控，该基因通过与含有Hap1和Htt蛋白的复合物的物理相互作用而参与通用轴突运输过程的调控（Tang,T.S.,Tu,H.,Chan,E.Y.,Maximov,A.,Wang,Z.,Wellington,C.L.,Hayden,M.R.,Bezprozvanny,I.(2003)亨廷顿蛋白和亨廷顿蛋白结合蛋白1影响由1型肌醇-(1,4,5)三磷酸受体介导的神经元钙信号传导（Huntingtin and huntingtin-associated protein1influence neuronalcalcium signaling mediated by inositol-(1,4,5)triphosphate receptor type1.）Neuron.39,227-239）。尽管在MeCP2缺陷型小鼠的延髓中Hap1和Sgk1两者的表达降低，但Itpr1 mRNA水平提高一倍以上（+109%）。表1.在MeCP2缺陷型小鼠的延髓中解调控的基因

实施例2

参与Bdnf运输的基因在MeCP2缺陷型小鼠的整个脑中的低表达。

为了确定对延髓进行分析而做出的发现是否能够扩展至MeCP2缺陷型脑的其他区域，本发明人对新样品进行试验，以观察Hap1、Sgk1和Itpr1转录本在P55时的脑的不同区域中是否异常表达。在解剖出的脑区域上使用实时定量PCR，他们发现Hap1在MeCP2缺陷型小鼠的延髓（-47%，n=5）以及脑桥（-42%，n=4）和前脑（-45%，n=4）中被显著下调（图1）。本发明人已证实，Sgk1在延髓中下调（-50%，n=5），并观察到在脑桥中的下调（-37%，n=5）。并发现它在前脑中显著上调（+44%，n=4）。他们还证实，Itpr1在延髓（+110%，n=5）、脑桥（+150%，n=5）和前脑（+220%，n=4）中上调。他们测量了MeCP2缺陷型小鼠脑中的Bdnf mRNA水平。他们发现，Bdnf在MeCP2缺陷型小鼠的延髓（-48%，n=5）以及脑桥（-53%，n=5）和前脑（-51%，n=4）中低表达。本发明人将表达分析扩展到已知参与Bdnf的神经元运输的其他基因：亨廷顿蛋白（Htt）、动力蛋白激活蛋白1（Dctn1）、胞质动力蛋白1重链1（Dync1h1）和abelson辅助整合位点1（Ahi1）。为了进行该分析，他们使用了来自于前脑区域的样品，这是由于已知它们含有最高水平的这些基因（Chan,E.Y.,Nasir,J.,Gutekunst,C.A.,Coleman,S.,Maclean,A.,Maas,A.,Metzler,M.,Gertsenstein,M.,Ross,C.A.,Nagy,A.,Hayden,M.R.(2002)亨廷顿蛋白结合蛋白-1（Hap1）的定点破坏引起由进食行为压低而造成的出生后死亡（Targeted disruption ofHuntingtin-associated protein-1(Hap1)results in postnatal death due todepressed feeding behavior.）Hum Mol Genet.11,945-959和Dragatsis,I.,Zeitlin,S.,Dietrich,P.(2004)避过出生后早期致死的亨廷顿蛋白结合蛋白1（Hap1）突变小鼠是神经解剖学正常和可育的，但表现出生长迟缓（Huntingtin-associated protein1(Hap1)mutant mice bypassing the earlypostnatal lethality are neuroanatomically normal and fertile but displaygrowth retardation.）Hum Mol Genet.13,3115-3125）。他们发现，在MeCP2缺陷型脑中，Htt（-76%，n=4）、Dctn1（-63%，n=4）、Dync1h1（-73%，n=4）和Ahi1（-65%，n=4）的mRNA水平极大降低。

实施例3

缺少MeCP2引起整个脑中Htt和Hap1的出生后逐渐低表达。

MeCP2缺陷型小鼠是正常的，直至1月龄时它们开始逐渐发生运动和认知功能病症（Guy,J.,Hendrich,B.,Holmes,M.,Martin,J.E.,Bird,A.(2001)小鼠Mecp2无效突变引起模拟Rett综合征的神经学症状（Amouse Mecp2-null mutation causes neurological symptoms that mimic Rettsyndrome.）Nat.Genet.27,322-326）。本发明人假定，在MeCP2缺陷型小鼠中观察到的进行性神经功能病症可能由Hap1和Htt表达的出生后进行性改变所引起，所述表达的进行性改变反过来诱导了Bdnf运输的进行性改变和相关的神经学异常。他们使用了在出现第一种表型表现之前的P30时收集的新的MeCP2缺陷型脑样品（在实验和对照组两者中n=4）。使用实时定量PCR，他们测量了延髓、脑桥和前脑中的Hap1和Htt mRNA水平，并发现在MeCP2缺陷型动物中，在P30时Hap1和Htt的表达不受影响（图2）。在P55时进行的相同实验（n=4）发现在所有三个区域中Htt和Hap1的表达显著降低，表明了表型表现的出生后发展（图2）。

实施例4

在MeCP2缺陷型脑中Htt和Hap1蛋白的水平降低

为了确定在MeCP2缺陷型脑中测量到的异常mRNA水平是否伴有异常的蛋白质水平，本发明人使用免疫组织荧光来定量新的脑样品（n=4）中的Htt和Hap1蛋白，并且染色显示出在MeCP2缺陷型脑的不同部分中两种蛋白质的水平非常低。免疫定量在出于两种蛋白质特别丰富的原因而仔细选择的几个脑区域中进行（Fujinaga,R.,Kawano,J.,Matsuzaki,Y.,Kamei,K.,Yanai,A.,Sheng,Z.,Tanaka,M.,Nakahama,K.,Nagano,M.,Shinoda,K.(2004)亨廷顿蛋白结合蛋白1-mRNA在雄性小鼠脑中的神经解剖学分布（Neuroanatomical distribution ofHuntingtin-associated protein1-mRNA in the male mouse brain.）J.Comp.Neurol.478,88-109和Kotliarova,S.,Jana,N.R.,Sakamoto,N.,Kurosawa,M.,Miyazaki,H.,Nekooki,M.,Doi,H.,Machida,Y.,Wong,H.K.,Suzuki,T.,Uchikawa,C.,Kotliarov,Y.,Uchida,K.,Nagao,Y.,Nagaoka,U.,Tamaoka,A.,Oyanagi,K.,Oyama,F.,Nukina,N.(2005)在具有膨大的聚谷氨酰胺-EGFP荧光聚集体的亨廷顿病转基因小鼠中下丘脑神经肽类的降低的表达（Decreased expression of hypothalamic neuropeptides inHuntington disease transgenic mice with expanded polyglutamine-EGFPfluorescent aggregates.）J.Neurochem.93,641-653和Sheng,G.,Chang,G.Q.,Lin,J.Y.,Yu,Z.X.,Fang,Z.H.,Rong,J.,Lipton,S.A.,Li,S.H.,Tong,G.,Leibowitz,S.F.,Li,X.J.(2006)下丘脑的亨廷顿蛋白结合蛋白1作为进食行为的调节物（Hypothalamic Huntingtin-associated protein 1 as amediator of feeding behavior.）Nat.Med.12,526-533）。发现Hap1蛋白的水平在下丘脑（-37%）、位于延髓中的孤束核（-53%）、中脑腹侧区（-35%）和蓝斑核与脑桥（-27%）中显著降低。Htt蛋白水平在下丘脑（-32%）和海马（-56%）中显著降低。为了证实这些结果，本发明人对来自于其他MeCP2缺陷型（n=3）和野生型（n=4）小鼠的目标脑区域进行了显微解剖，并提取总蛋白以进行western印迹分析。Western印迹结果的定量显示，在MeCP2缺陷型小鼠的中脑腹侧区中Hap1a（-76%）和Hap1b同工型（-77%）的水平低。尽管Hap1b同工型明显存在降低的趋势（-76%），但由于高的个体间变化性，他们在下丘脑中未能发现统计学显著的差异。在皮层中，Hap1a同工型减少51%。一个出人意料的发现是在MeCP2缺陷型小鼠的皮层中完全不存在Hap1b同工型。在皮层（-68%）、腹侧中脑多巴胺能区域（-55%）和脑桥（-42%）中，报告了Htt蛋白水平的降低。这些结果表明，MeCP2缺陷引起整个小鼠脑中Htt和Hap1蛋白水平的总体降低。

实施例5

MeCP2缺陷型小鼠中纹状体与皮层之间的异常Bdnf蛋白分布

在MeCP2缺陷型小鼠的脑中发现Bdnf运输的改变之后，本发明人继续进行研究，以原位确定MeCP2缺陷型小鼠的脑中Bdnf运输是否改变。已确定，Bdnf在纹状体神经元的成熟和代谢中发挥关键作用，即使在纹状体细胞中事实上不存在Bdnf mRNA（Altar,C.A.,Cai,N.,Bliven,T.,Juhasz,M.,Conner,J.M.,Acheson,A.L.,Lindsay,R.M.,Wiegand,S.J.(1997)脑源性神经营养因子的顺行运输及其在脑中的作用（Anterogradetransport of brain-derived neurotrophic factor and its role in the brain.）Nature.,389,856-60和Altar,C.A.,DiStefano,P.S.(1998)通过顺行运输的神经营养蛋白运输（Neurotrophin trafficking by anterograde transport.）Trends Neurosci.21,433-437）。Bdnf蛋白在纹状体外翻译，并通过顺行机制主动运输到脑的该区域中。因此，他们对翻译位点（皮层）和靶位点（纹状体）的Bdnf染色进行定量，并发现在不存在MeCP2的情况下，在皮层（-30%）和纹状体（-44%）中Bdnf染色水平降低。在野生型动物中，纹状体Bdnf占皮层中Bdnf的71%。在MeCP2缺陷型动物中，纹状体Bdnf占皮层Bdnf的45%，表明当不存在MeCP2时体内Bdnf的运输被改变（(图3B)。

实施例6

MeCP2沉默改变Bdnf囊泡速度

使用大鼠进行实验以确定MeCP2的修饰是否在体内改变Bdnf运输。本发明人在低表达或过表达MeCP2的大鼠皮层神经元中监测Bdnf-cherry的动力学。将大鼠皮层神经元用失活性MeCP2 siRNA、混杂对照RNA、表达MeCP2的载体或空载体进行电穿孔。在培养3天后，通过免疫荧光评估MeCP2水平，并对MeCP2信号的核强度进行定量。他们通过快速视频显微术平行地分析了MeCP2沉默和过表达对含有Bdnf-cherry的囊泡的动力学的影响。正如预期，MeCP2 siRNA的转染引起MeCP2水平降低（-33.1%）。更有趣的是，MeCP2沉默引起含有Bdnf-cherry的囊泡的顺行（-20.6%）和反行（-17.9%）速度两者的降低（图4）。表达MeCP2的载体的转染单独地只引起含有Bdnf-cherry的囊泡的顺行速度的降低（-21.4%）（图4）。为了证实siRNA方法的特异性，本发明人在挽救实验中共转染了MeCP2 siRNA和表达MeCP2的载体，并发现在转染了表达MeCP2蛋白的质粒后，含有Bdnf-cherry的囊泡的速度完全恢复至对照水平（图4）。为了观察Bdnf运输的改变是否可以由微管稳定化作用的改变引起，他们将微管用微管蛋白和乙酰化微管蛋白染色并观察它们的结构体系。当MeCP2水平改变时，他们不能显示出对微管组织的任何影响。此外，他们不能发现MeCP2的低表达或过表达改变被转染神经元的总体形态，正如由与细胞质GFP共同电穿孔所显示的。

实施例7

MeCP2沉默改变App囊泡速度

本发明人使用含有淀粉样前体蛋白（App）-YFP的囊泡重复了实施例6的体内运输实验。他们显示App不是Mecp2的直接靶，因为他们没有在mRNA水平和蛋白质水平上发现任何解调控（图5）。此外，App运输强烈依赖于Htt/Hap1（McGuireet等，2006J.Biol.Chem.281；Colin,E.等，2008EMBO J.27）。他们的结果清楚地显示出由Mecp2的沉默造成的体内App运输的解调控（图6）。

实施例8

FK506（他克莫司）和/或胱胺的体内给药

将FK506和/或胱胺每日且长期提供给MeCP2缺陷型小鼠。在不同发育阶段执行运动和呼吸评估，以便确定是否存在任何改善。

半胱胺治疗在Mecp2缺陷型小鼠中改善寿命和运动缺损：

本发明人发现，半胱胺口服治疗显著延长了Mecp2缺陷型小鼠的寿命（介质组：65±2.2天；半胱胺组：74.8±5.2天；p<0.05，Kaplan-Meir对数秩检验）（图7A）。因此，本发明人使用开放场地评估了这种治疗对运动的影响（图7B-C）。在Mecp2缺陷型小鼠中，半胱胺治疗显著改善了运动，正如由移动的总距离和速度两者的统计学改进（特别是在较晚阶段中）所显示的。半胱胺治疗与安慰剂组相比有力地延迟运动症状的恶化，而所述安慰剂组表现出这些症状的渐进但明显的增加。因此，对于总距离（P55：+3%，P65：+40%；P75：+128%，P85：+485%，p<0.05）和速度（P55：+18%，P65：+33%；P75：+65%，P85：+74%，p<0.05）两者来说，半胱胺治疗组与安慰剂组之间的差异渐进增加，但在较晚阶段特别明显。这些结果表明，半胱胺的长期给药能够提高Mecp2缺陷型小鼠在评估自主运动行为的范式中的表现。

Claims (13)

1.胱胺或半胱胺或其盐，其用于治疗患者的MECP2相关性病症。

2.权利要求1的用于治疗MECP2相关性病症的胱胺或半胱胺，其中所述MECP2相关性病症选自Rett综合征、自闭症、广泛性发育障碍、非综合征型智力发育迟缓、特发性新生儿脑病和特发性大脑性麻痹。

3.权利要求2的用于治疗MECP2相关性病症的胱胺或半胱胺，其中所述MECP2相关性病症是Rett综合征。

4.权利要求1至3任一项的用于治疗MECP2相关性病症的胱胺或半胱胺，其与另一种药学活性化合物组合使用。

5.一种钙调磷酸酶抑制剂，其用于治疗人类患者的MECP2相关性病症。

6.权利要求5的用于治疗MECP2相关性病症的钙调磷酸酶抑制剂，其是大环内酯类物质。

7.权利要求5或6的用于治疗MECP2相关性病症的钙调磷酸酶抑制剂，其选自钙调磷酸酶抑制蛋白类、他克莫司和他克莫司类似物、环孢霉素A和环孢霉素A类似物、LxPV蛋白、2,6-二芳基取代的嘧啶衍生物和FK506结合蛋白。

8.权利要求7的用于治疗MECP2相关性病症的钙调磷酸酶抑制剂，其选自钙调磷酸酶抑制蛋白1、钙调磷酸酶抑制蛋白2、钙调磷酸酶抑制蛋白3、他克莫司、子囊霉素、西罗莫司、吡美莫司、环孢霉素A、伏环孢素、LxPVc1、LxPVc2、LxPVc3、6-(3,4-二氯苯基)-4-(N,N-二甲基氨基乙基硫代)-2-苯基嘧啶和FK506结合蛋白8。

9.权利要求8的用于治疗MECP2相关性病症的钙调磷酸酶抑制剂，其是他克莫司。

10.权利要求8的用于治疗MECP2相关性病症的钙调磷酸酶抑制剂，其是环孢霉素A。

11.权利要求5至9任一项的用于治疗MECP2相关性病症的钙调磷酸酶抑制剂，其中所述MECP2相关性病症选自Rett综合征、自闭症、广泛性发育障碍、非综合征型智力发育迟缓、特发性新生儿脑病和特发性大脑性麻痹。

12.权利要求11的用于治疗MECP2相关性病症的钙调磷酸酶抑制剂，其中所述MECP2相关性病症是Rett综合征。

13.权利要求5至12任一项的用于治疗MECP2相关性病症的钙调磷酸酶抑制剂，其与另一种药学活性化合物组合使用。

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