CN111450123B - H.hathewayi或牛磺酸作为制备预防和治疗颅内动脉瘤形成及破裂药物的应用 - Google Patents
H.hathewayi或牛磺酸作为制备预防和治疗颅内动脉瘤形成及破裂药物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种H.hathewayi或牛磺酸作为制备预防和治疗颅内动脉瘤形成及破裂药物的应用。本发明公开了通过补充H.hathewayi促进了血浆牛磺酸水平的增加，最终降低了颅内动脉瘤形成和破裂发生。直接补充牛磺酸亦可降低颅内动脉瘤形成和破裂发生。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及预防和治疗颅内动脉瘤形成及破裂的药物应用， 具体涉及Hungatella hathewayi(H.hathewayi)及牛磺酸在制备预防和治疗颅内 动脉瘤形成及破裂药物中的应用。
背景技术
颅内动脉瘤是严重危害人类健康的主要疾病之一，是人类猝死的主要病因。 颅内动脉瘤在全世界人群发病率约3.2％。出血年龄多为40-70岁。中国的社区 调查表明中国成年人非破裂颅内动脉瘤患病率高达7％。颅内动脉瘤是一种极为 凶险的脑血管疾病，大部分的珠网膜下腔出血是由于动脉瘤破裂造成的。在美 国，每年因为颅内动脉瘤破裂造成的蛛网膜下腔出血的患者在每10万人中就有 10.8-28人，其中的三分之二能引起患者死亡或者神经功能缺失，且该病最常发 生于中年患者，对患者、家庭、社会造成沉重的压力。
颅内动脉瘤的病因主要有感染、炎症、动脉粥样硬化、血流动力学以及遗 传因素等，其有继续生长、破裂，保持稳定及自发闭塞等几种转归，其中又以 破裂最为凶险，它是导致颅内动脉瘤出现高致死率和致残率的元凶，但影响颅 内动脉瘤发生发展及破裂的分子机制至今仍不清楚。而流行病学的研究发现颅 内动脉瘤的破裂风险与年龄、吸烟、高血压、高血脂等因素有关。大量研究证 据同时表明动脉瘤的发生、发展可能与血管壁损伤、炎症反应、内膜增生、中 层肌细胞及弹力纤维、胶原纤维等血管细胞外基质的逐步消失以及动脉硬化斑 块形成等诸多病理生理学因素有关，所有这些因素中每个环节都会影响动脉瘤 的转归。
对于破裂的颅内动脉瘤，必须进行血管内治疗或外科手术治疗已有共识， 但对于非破裂颅内动脉瘤的治疗目前存在争议，即便对具有破裂风险的颅内动 脉瘤进行了血管内治疗或外科手术治疗，仍存在较大的出血风险及并发症。因 此，加强对非破裂颅内动脉瘤的临床与基础研究，识别颅内动脉瘤危险因素， 解析发病机制并寻找新的干预措施十分重要。
颅内动脉瘤是环境因素与遗传因素共同作用的结果。目前大量证据表明， 肠道菌群作为一种重要的媒介，代谢人体摄入的各类物质，产生小分子代谢物 如TMAO、炎症因子等对复杂性疾病产生重要作用。到目前为止，人颅内动脉 瘤的发生是否与肠道菌群相关？如相关是否可能以此为突破口寻找新的干预措 施？这些都是亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供可用于制备预防和治疗颅内动 脉瘤形成及破裂药物的应用。
为了实现上述目的，本发明提供Hungatella hathewayi(H.hathewayi)或牛 磺酸作为制备预防和治疗颅内动脉瘤形成及破裂药物的应用。
本发明还提供H.hathewayi或牛磺酸在制备预防和治疗颅内动脉瘤形成及 破裂过程中抑制炎症反应的药物的应用。
本发明还提供另提供H.hathewayi或牛磺酸在制备抑制基质金属蛋白酶活 化及血管壁细胞外基质降解的药物的应用。
本发明还提供另提供H.hathewayi或牛磺酸在制备抑制血管平滑肌细胞凋 亡的药物的应用。
其中，所述药物还包括药学上可接受的载体。
优选地，所述药学可接受的载体包括稀释剂、赋形剂、崩解剂、填充剂、 粘合剂、润滑剂、矫味剂、表面活化剂、稳定剂中的任何一种或多种组合。
其中，所述药物的剂型为注射剂、针剂、片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶 囊剂中的任一种。
本发明是以H.hathewayi及牛磺酸来治疗预防和治疗颅内动脉瘤形成及破 裂。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种H.Hathewayi或牛磺酸作为制备预防和治疗颅内动脉瘤形 成及破裂的药物的应用，还可应用于预防和治疗颅内动脉瘤形成及破裂过程中 抑制炎症反应，抑制基质金属蛋白酶活化及血管壁细胞外基质降解及抑制血管 平滑肌细胞凋亡。通过补充H.Hathewayi促进了血浆牛磺酸水平的增加，最终 降低了颅内动脉瘤形成和破裂发生，直接补充牛磺酸亦可降低颅内动脉瘤形成 和破裂发生。
附图说明
图1为颅内动脉瘤宏基因组人群研究技术路线概要图。
图2为颅内动脉瘤患者相较于对照的肠道微生物种水平改变分析图。
图3A和图3B为颅内动脉瘤患者肠道微生物功能注释特征图。
图4A为小鼠颅内动脉瘤模型移植对照粪便和颅内动脉瘤患者粪便后比较 图。
图4B为小鼠颅内动脉瘤模型21天后颅内动脉瘤的发生率和破裂率统计图。
图4C为小鼠颅内动脉瘤模型后的生存曲线图。
图5为本发明所用RNA建库及转录组测序流程图。
图6为本发明所用转录组测序数据分析流程图。
图7A为不同差异基因数量的韦恩图。
图7B为移植对照或颅内动脉瘤患者粪便后小鼠造模第5天的聚类图。
图7C为1039个差异基因的GO功能注释图。
图7D为1039个差异基因的KEGG功能注释图。
图8A为小鼠颅内动脉瘤模型后给予不同粪便的颅内动脉瘤照片和HE染色 图。
图8B为小鼠颅内动脉瘤模型21天后颅内动脉瘤的发生率和破裂率统计图。
图8C为小鼠颅内动脉瘤模型后的生存曲线图。
图8D为通过尾套法测量不同处理组小鼠血压的统计图。
图8E为F4/80阳性巨噬细胞与CD31阳性脑血管的代表性照片图(上方)， Ly6G阳性中性粒细胞与α-SMA阳性脑血管的代表性照片图(下方)。
图8F为图8E中F4/80阳性巨噬细胞与CD31阳性脑血管的统计数据图。
图8G为图8E中Ly6G阳性中性粒细胞与α-SMA阳性脑血管的统计数据图。
图8H为ELISA检测的小鼠血浆IL-6水平统计图。
图8I为ELISA检测的小鼠血浆TNF-α水平统计图。
图8J为不同组别脑血管MMP-9的明胶酶谱代表性照片图。
图8K为图8J中不同组别脑血管MMP-9的明胶酶谱统计图。
图8L为脑血管collagen IV基因的定量PCR统计图。
图8M为脑血管laminin基因的定量PCR统计图。
图8N为α-SMA阳性脑血管上的凋亡细胞代表性照片图。
图8O为图8N中α-SMA阳性脑血管上的凋亡细胞的统计图。
图9A为给予L-组氨酸(L-histidine)对移植病人粪便的小鼠颅内动脉瘤模 型21天后颅内动脉瘤的发生率和破裂率统计图。
图9B为图9A小鼠颅内动脉瘤模型后的生存曲线图。
图9C为给予亚油酸对移植病人粪便的小鼠颅内动脉瘤模型21天后颅内动 脉瘤的发生率和破裂率统计图。
图9D为图9C小鼠颅内动脉瘤模型后的生存曲线图。
图10A为10个有差异的氨基酸和脂肪酸与14个颅内动脉瘤相关的肠道菌 种的Spearman相关性热图。
图10B为H.Hathewayi在两个人群(n＝100和n＝40)、粪便移植的供体(n＝2)， 接受粪便移植的小鼠的统计图。
图11A为采用定量PCR检测不同组粪便中H.Hathewayi的含量图。
图11B为高压液相色谱定量检测不同组血浆牛磺酸浓度结果图。
图11C为小鼠颅内动脉瘤模型后粪便给三组小鼠的代表性颅内动脉瘤照片 图。
图11D为小鼠颅内动脉瘤模型21天后颅内动脉瘤的发生率和破裂率统计 图。
图11E为小鼠颅内动脉瘤模型后的生存曲线图。
图11F为F4/80阳性巨噬细胞与CD31阳性脑血管的代表性照片图。
图11G为图11F的F4/80阳性巨噬细胞与CD31阳性脑血管的统计图。
图11H为ELISA检测的小鼠血浆IL-6水平统计图。
图11I为脑血管collagen IV基因和laminin基因的定量PCR统计图。
图11J为不同组别脑血管MMP-9的明胶酶谱代表性照片图。
图11K为图11J的不同组别脑血管MMP-9的明胶酶谱的统计图。
图11L为α-SMA阳性脑血管上的凋亡细胞代表性照片图。
图11M为图11L的α-SMA阳性脑血管上的凋亡细胞统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件实施。
Clostridium hathewayi是一类2001年才被正式鉴定并命名的严格厌氧菌， 并于2014年被正式更名为Hungatella hathewayi(H.hathewayi)。该细菌目前 已知在正常人群及小鼠的肠道系统中均有定植，并且参与丁酸盐、乙醇、二氧 化碳等代谢产物的合成与降解。由于该细菌为较新被鉴定出的菌种，目前对该 菌的功能研究还十分有限。目前在已知的与肠道菌群紊乱密切相关的疾病如糖 尿病、高血压、动脉粥样硬化症中，均未发现该细菌可能对上述疾病存在保护 或致病作用。
牛磺酸(Taurine)是动物体内一种结构简单的含硫氨基酸，化学名称为2- 氨基乙磺酸，分子式为HO3S-CH2-CH2-NH2，分子量为125，无臭略酸，其稀 溶液呈中性，对热稳定，在人和动物胆汁中与胆酸结合，以结合形式存在；而 在脑、卵巢、心脏、肝、乳汁、松果、垂体、视网膜、肾上腺等组织中，以游 离形式存在，总量12-18g，但不参与蛋白质的合成。牛磺酸生物安全性高，已 广泛应用于医药、食品添加剂、荧光增白剂、有机合成等领域，也可用作生化 试剂、湿润剂、pH缓冲剂等。牛磺酸是人体的条件必需氨基酸，对胎儿、婴 儿神经系统的发育有重要作用。此外其在维持正常生殖功能、提高糖代谢、防 治缺铁性贫血等方面均发挥了明确的保护作用，但其在维持血管结构及功能尤 其是脑血管方面的研究还十分有限。目前尚没有直接证据表明其与颅内动脉瘤 发病之间的关系。
实施例1：通过宏基因组学测序方法揭示颅内动脉瘤患者相较于对照人群 的肠道微生物物种水平改变
1.材料和仪器
本实施例应用Illumina HiSeq X Ten测序平台对收集得到的人类肠道微生物DNA样本进行测序，进而对测序数据进行生物学物种注释、物种定量及相关生 物信息学分析。
2.方法
2.1于2016年-2018年先后于北京天坛医院、河北省沧州市中心医院纳入非 破裂颅内动脉瘤疾病患者及相应临床参数匹配的对照人群各100例(第一人 群)，收集其粪便样本及血浆样本。本研究继而于2017年-2018年先后于北京 天坛医院、中国人民解放军总医院、清华大学医院纳入非破裂颅内动脉瘤疾病 患者及相应临床参数匹配的对照人群各40例(第二人群)，收集其粪便样本及 血浆样本。本研究通过中国医学科学院临床研究伦理委员会审批(伦理编号 2016-732)，所有纳入研究的人群均已填写知情同意书。
表1第一人群临床特征
表2第二人群临床特征
2.2颅内动脉瘤患者肠道宏基因组分析技术路线，如图1所示。
收集颅内动脉瘤及对照人群的粪便样本，提取粪便微生物DNA。进而在 IlluminaHiSeq X Ten测序平台对微生物DNA样本进行测序。进而对测序raw data进行组装、与已知数据库进行比对，进行基因预测及物种定量。
3.结果
为了探究颅内动脉瘤患者肠道菌群变化，对280例人类粪便样本(第一人 群颅内动脉瘤患者及正常对照组各100例；第二人群颅内动脉瘤患者及正常对 照组各40例)进行了宏基因组测序研究。对于每个样本而言，高质量序列读长 被组装起来用于基因预测、生物学分类及功能注释。
为了评价颅内动脉瘤肠道菌群的物种特征，用MetaPhlAn2法进行了物种水 平注释及定量分析。物种水平的α-diversity在两组间仍然没有差异。
如图2所示，为颅内动脉瘤患者相较于对照的肠道微生物种水平改变。深 浅条柱分别代表对照(control)和颅内动脉瘤患者(UIA)物种水平的丰度值， *表示P<0.05。第一人群样本对照与颅内动脉瘤组各n＝100，第二人群样本两 组各n＝40，统计学检验为双尾Wilcoxon rank-sum检验。所有的箱线图中，箱 体图表示第一和第三四分位数之间的四分位数范围(IQRs)，箱体图中的线表示 中位数。细须代表第一或第三四分位数1.5×IQR内的最低值或最高值。从图2 可以看出，在第一人群中，47个物种的丰度在两组间存在显著差异，这其中38 个物种在颅内动脉瘤组富集。一群属于Bacteroides属的物种例如B.thetaiotaomicron,B.massiliensis,B.nordii,B.intestinalis和B.cellulosilyticus在颅 内动脉瘤组显著富集。Odoribacter splanchnicus是一类被报道丰度与红肉摄取正 相关分布、与蔬菜和水平摄取负相关分布的物种，其在本研究中也在颅内动脉 瘤组富集。此外，发现一群Clostridium属的物种包括C.bartlettii,C.nexile和 C.bolteae在颅内动脉瘤组显著富集。然而，C.hathewayi(在2014年被正式更 名为Hungatella hathewayi)却是唯一一个在颅内动脉瘤肠道中丰度降低的 Clostridium属成员。在47个差异物种中，有8个物种(17.0％)在第二人群中 依然存在显著差异。
从图2可以看出，上述8个物种的丰度改变是颅内动脉瘤患者肠道菌群的 最特征性改变，并且很可能参与到了颅内动脉瘤的疾病进程中。
实施例2：通过人群肠道宏基因组学及血浆代谢组学探索颅内动脉瘤患者 肠道微生物功能改变及与血浆代谢产物的关联
1.材料和仪器
本实施例应用UPLC-MS/MS系统对人群血浆代谢产物(氨基酸及游离脂肪 酸)进行靶向代谢组学检测。
123种氨基代谢物标准品购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司 (Sigma-Aldrich，美国)、北京百灵威科技有限公司(J&K，中国；TRC，加 拿大)。硼酸、N-乙基马来酰亚胺(NEM)、4-叔丁基笨硫酚(tBBT)、二甲 基亚砜(DMSO)、5-氨基异喹啉(5AIQ)、N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、 抗坏血酸(Vc)、乙二胺四乙酸(EDTA)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)均购 于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-Aldrich，美国)，分析纯的 三水合磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)、二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)和 甲醇购于国药集团化学试剂有限公司(SCRC，中国)，HPLC纯级的甲酸、乙 腈和甲醇购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Thermo Fisher，美国)。
磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)由0.1M K2HPO4·3H2O和NaH2PO4·2H2O、10mM 抗坏血酸和10mM EDTA配制而成。硼酸缓冲溶液(pH＝8.8)由0.2M硼酸、20mM TCEP和1mM抗坏血酸配制而成。
5-氨基异喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(5-AIQC)由5AIQ和DSC 在乙腈溶液中自行合成。
HPLC纯级的甲酸和乙腈购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Thermo Fisher，美国)，23种游离脂肪酸标准品、内标C17:0(表1)和其余试剂均购 于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-Aldrich，美国)。
准确量取样品10μL，加入10μL含有内标的甲醇溶液(C17:0，200ng/ml)， 5μL BHT，100μL超纯水，250μL甲醇，12.5μL 1N HCl，750μL异辛烷后， 涡旋60s，离心(4℃，3000rpm，60s)，收集上清液，重复两次合并上清，挥 干，依次加入20μL 4:1MeCN/DMF(N,N-二甲基甲酰胺)冷溶液、20μL EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)冷溶液(640mM水溶液)、10μL HoBt (1-羟基苯并三氮唑)溶液(20mM溶解在99:1MeCN/DMF)和30μL AMPP (N-(4-aminomethylphenyl)pyridinium)乙腈溶液(20mM)，60℃反应30分钟， 用0.22μm滤膜过滤，UPLC-MS/MS待测。
2.方法
2.1氨基酸检测
UPLC-MS/MS系统是安捷伦1290UPLC串联安捷伦6470三重四级杆质谱 仪(Agilent,USA)。进样量为1μL，色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18 column (2.1×100mm，1.8μm，Agilent,USA)，柱温是50℃。流动相A是超纯水，流 动相B是含有0.1％HCOOH的甲醇。洗脱梯度设置为：第0分钟～2分钟，1％B； 第2分钟～4分钟，1％B升至3.8％B；第4分钟～7.3分钟，3.8％B升至14％B； 第7.3分钟～10.7分钟，14％B升至22％B；第10.7分钟～14.7分钟，22％B升 至24％B；第14.7分钟～16分钟，24％B升至30％B；第16分钟～16.3分钟，30％B升至60％B；第16.3分钟～17.3分钟，60％B升至70％B；第17.3分钟 ～17.31分钟，70％B升至95％B；第17.31分钟～20分钟，95％B。流速为 0.5mL/min，采用正离子模式(ESI+)的多反应监测(MRM)方法，离子源条 件：干燥气流量10L/min，干燥气温度315℃，雾化器压力50psi,鞘气温度 350℃，鞘气流量10L/min，喷嘴电压500V，毛细管电压4000V。数据采集和分 析都使用Mass Hunter软件(Agilent,USA)。谱图导入Mass Hunter软件后， 与标准品(表1)比对保留时间和MRM离子对来定性，使用外标法定量。
2.2游离脂肪酸检测
UPLC-MS/MS系统是安捷伦1290UPLC串联安捷伦6470三重四级杆质谱 仪(Agilent,USA)。进样量为1μL，色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18 column (2.1×100mm，1.8μm，Agilent,USA)，柱温是40℃。流动相A是含有0.1％ HCOOH的超纯水，流动相B是含有0.1％HCOOH的乙腈。洗脱梯度设置为： 第0分钟～12分钟，70％A降至5％A；第12.01分钟到13分钟，5％A和95％ B冲洗色谱柱。流速为0.5ml/min，采用正离子模式(ESI+)的多反应监测(MRM) 方法，离子源条件：干燥气流量10L/min，干燥气温度350℃，雾化器压力20psi, 鞘气温度350℃，鞘气流量10L/min，毛细管电压4000V。数据采集和分析都使 用Mass Hunter软件(Agilent,USA)。谱图导入Mass Hunter软件后，与标准 品比对保留时间和MRM离子对来定性，使用内标法定量。
3.结果
进一步应用HUMAnN2对颅内动脉瘤肠道微生物进行物种水平的功能注 释。鉴定出46条在两组间具有丰度差异的微生物代谢通路，如图3A所示，颅 内动脉瘤患者(UIA)与对照(control)间具有显著的丰度差异的功能通路 (n＝100)。深浅条柱分别代表对照和颅内动脉瘤患者物种水平的丰度值。在这 些代谢通路中，存在许多与氨基酸代谢和脂肪酸代谢相关的通路。具体来讲， 颅内动脉瘤患者肠道微生物功能与不饱和脂肪酸的生物合成密切相关。此外， 包括苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸及蛋氨酸在内的多种氨基酸的生物合成则在正常对照组肠道微生物功能中显著富集。其余富集的差异代谢通路主要与糖代谢 和核苷酸代谢相关。
另外，基于差异MLGs应用KEGG数据库对两组间的差异菌种进行了功能 注释。鉴定出25个在两组间具有显著差异的KEGG通路。值得一提的是，不 饱和脂肪酸生物合成、氨基酸(蛋氨酸、色氨酸、丙酮酸和异亮氨酸)代谢及 糖酵解是用HUMAnN2和KEGG法均富集出的差异代谢通路。在这当中，异亮 氨酸生物合成及蛋氨酸生物合成在正常对照组显著富集，该结果提示两组肠道 菌群合成支链氨基酸和芳香族氨基酸的能力存在显著差异。这一发现与肥胖患 者及肥胖小鼠肠道宏基因组的研究结果类似。总体来讲，虽然以上功能注释结果均为预测，但该结果明确提示了颅内动脉瘤肠道菌群的紊乱很可能通过氨基 酸和脂肪酸代谢的改变影响人体生理功能。
进一步通过靶向代谢组学对第一人群的60名受试者(30名颅内动脉瘤患 者和30名正常对照人群)血浆中的氨基酸及脂肪酸水平进行了定量检测。总体 来讲，7种脂肪酸和12种氨基酸在两组血浆中存在显著差异。进一步探究了是 否以上19种代谢物与47种差异肠道菌种存在相关性，如图3B所示，19个有 差异的氨基酸和脂肪酸与47个颅内动脉瘤相关的肠道菌种的Spearman相关性 热图，+表示P<0.05，*表示P<0.01。相关系数|r|<0.4的不予展示。通过 Spearman’s相关计算了代谢物与肠道菌种之间的丰度相关性，并将聚类分析结果以热图形式展现。结果显示苯丙胺酸在颅内动脉瘤患者血浆中丰度升高。此 外，循环血中氨基酸(牛磺酸、亚牛磺酸、L-组氨酸及瓜氨酸)水平在颅内动 脉瘤患者中显著降低，且以上氨基酸与肠道中显著改变的菌种具有较强相关性。 虽然循环血中脂肪酸(硬脂酸、软脂酸、月桂酸、油酸和亚油酸)水平在两组 间也存在显著差异，但以上脂肪酸与改变的肠道菌的相关性较差。总体来讲， 虽然血浆中代谢物的改变是否完全归咎于肠道菌群紊乱还尚无定论，但结果强 烈提示肠道菌群的改变能够调节血浆氨基酸和脂肪酸水平，进而可能促进了颅 内动脉瘤疾病的发生发展。
实施例3：通过粪便移植实验证实颅内动脉瘤患者粪便较正常人群粪便更 易造成小鼠颅内动脉瘤的形成与破裂
1.材料和仪器
表-3制备和评价小鼠颅内动脉瘤模型所需材料和仪器
2.方法
2.1供体粪便获取
于2017年-2018年在中国人民解放军总医院、清华大学医院收集颅内动脉 瘤患者及正常对照人群粪便各2例，用于小鼠粪便移植实验。供体临床信息如 下：
表4供体临床特征
2.2实验动物
该实验设计符合医学实验动物管理实施细则，经过动物实验伦理委员会批 准，按照动物实验指南实施。10周龄C57BL/6雄性小鼠购于南京大学模式动物 研究所。小鼠饲养于SPF级屏障环境IVC设施中。
2.3实验分组
第一组：移植正常人群粪便+颅内动脉瘤模型(Control+FMT)(n＝20)
第二组：移植颅内动脉瘤患者粪便+颅内动脉瘤模型(UIA+FMT)(n＝20)
2.4小鼠肠道内杀菌
将广谱抗生素鸡尾酒配方(1g/L氨苄青霉素(ampicillin),1g/L甲硝唑(metronidazole),1g/L新霉素(neomycin),and 0.5g/L万古霉素(vancomycin)) 溶于水中，喂养小鼠14天，将小鼠肠道内绝大多数微生物杀灭。
2.5小鼠人源粪便移植方案
将供体人源新鲜粪便200mg溶于10ml生理盐水中，震荡3分钟后于4℃离 心3分钟，取上清约2ml粪便提取液备用。在小鼠杀菌完成后，通过灌胃方法 将100μl粪便提取液灌入小鼠体内，于2天后再次重复上述操作。
2.6小鼠颅内动脉瘤模型建立
通过脑立体定位仪及微量注射泵将Elastase注射入小鼠右侧脑基底池。进 而将小鼠给予3％异氟烷诱导麻醉满意后，俯卧位将小鼠固定。背部脱毛消毒后 剪一0.5mm小口，用弯镊沿皮下向尾侧行钝性分离，将ALEZT 2006微渗透泵 (1000ng/kg BW/min AngII)植入小鼠背部皮下。用5-0线缝合皮肤后放回IVC 中继续饲养。
3.结果
为了进一步探究是否肠道菌群的变化直接导致了颅内动脉瘤的进展，进行 了小鼠粪便移植实验。先用4种广谱抗生素进行了小鼠固有肠道菌群的杀灭。 进而将颅内动脉瘤患者和正常对照人群的粪便提取液移植给小鼠。人类捐赠者 的粪便及接受移植后小鼠粪便均进行了宏基因组测序。符合预期的是，PCoA分 析显示2例正常对照捐赠者与100例正常对照人群肠道物种水平菌群特征相类 似；2例动脉瘤捐赠者与100例动脉瘤人群肠道物种水平菌群特征相类似。进 而，应用SourceTracker软件对受体小鼠与供体人类的肠道菌群相似度进行了定 量评价。结果显示接受正常对照移植的受体小鼠肠道菌群有61.5％来源于正常 对照供体人类；而接受颅内动脉瘤患者移植的受体小鼠肠道菌群有53.8％来源于颅内动脉瘤供体人类。
用MetaPhlAn2对移植完不同组别粪便的小鼠肠道菌群进行了物种水平的 注释及定量。在14个两组间有显著丰度差异的物种中，5个物种(H.hathewayi, O.splanchnicus,A.putredinis,B.ntestinalis和B.nordii)在颅内动脉瘤患者和正 常对照人群之间同样存在显著差异。
接下来，将移植完不同人类粪便的小鼠进行了构建颅内动脉瘤模型的手术。 在手术操作期间没有小鼠意外死亡。
如图4A所示，为小鼠颅内动脉瘤模型后分别移植对照粪便(Con-FMT) 或颅内动脉瘤患者粪便(UIA-FMT)后，颅内动脉瘤的代表性照片(左侧，箭 头所指为动脉瘤瘤体，比例尺＝1mm)，脑血管动脉的HE染色照片(右侧，比 例尺＝100微米)。如图4B所示为小鼠颅内动脉瘤模型21天后颅内动脉瘤的发 生率和破裂率(n＝20)。如图4C所示为小鼠颅内动脉瘤模型后的生存曲线， 其中，对照粪便移植组n＝9，颅内动脉瘤移植组n＝17，使用Mantel-Cox检验。
从图4A至图4C可以看出，与移植完正常对照粪便的小鼠相比，移植动脉 瘤患者粪便的小鼠颅内动脉瘤的总体发生率显著增加。此外，Kaplan-Meier分 析提示两组之间无症状生存曲线亦存在显著差异。以上结果提示，颅内动脉瘤 患者的肠道菌能够直接加剧宿主颅内动脉瘤的形成和破裂。
实施例4：通过转录组测序阐明颅内动脉瘤患者粪便移植造成小鼠颅内动 脉瘤形成及破裂率增加的机制
1.材料和仪器
表5小鼠脑Willis环血管分离、抽提总RNA及转录组测序材料和仪器
| 名称 | 公司 | 规格型号 |
| 组织匀浆仪 | 杜恩思 | 小鼠专用 |
| 离心机 | Thermo | Fresco17 |
| 总RNA提取试剂盒 | 凯杰 | RNeasy Kit 50 |
| 建库测序仪 | Illumina | Hiseq2500 |
| 分光光度仪 | 凯奥 | K5500 |
| RNA检测试剂盒 | 安捷伦 | 2100RNA Nano 6000 |
| 生理盐水 | 石家庄四药 | 500mL |
| PBS | GE | 500mL |
2.方法
2.1小鼠脑Willis环血管抽提总RNA
2.1.1用350μL RLT裂解液充分溶解沉淀。
2.1.2将液体移入1.5mL收集管(总RNA提取试剂盒中提供)，12000rpm 离心3min。
2.1.3取上清移入一新的1.5mL收集管(切勿将沉淀吸出)，加入等体积70％ 乙醇(用RNA专用无水乙醇和RNase free水。用枪头迅速混匀，不要离心。
2.1.4迅速移出700μL混合物到Rneasy收集柱(总RNA提取试剂盒中提供) 中，盖上盖子，4℃12000rpm离心15秒，倒掉收集管中液体。
2.1.5向柱子中加入350μL的Buffer RW1，小心盖上盖子，4℃12000rpm离 心15秒，倒掉收集管内的液体。
2.1.6配置DNase 1mix：10μL DNase 1(第一次用时需用RNase free水配置) +70μL Buffer RDD，颠倒混匀后低速简单离心。
2.1.7将80μL DNase 1mix直接加入柱子中的膜上，常温静置15min。
2.1.8向柱子中加入350μL的Buffer RW1，小心盖上盖子，4℃12000rpm离 心15秒，倒掉收集管内的液体。
2.1.8向柱子中加入500μL Buffer RPE小心盖上盖子，4℃12000rpm离心15 秒，倒掉收集管内的液体。
2.1.9向柱子中加入500μL Buffer RPE小心盖上盖子，4℃12000rpm离心 2min。
2.1.10将收集管连同收集到的液体一起扔掉，将柱子移入到一个新的2mL 收集管内，盖上盖子，全速离心1min。
2.1.11将柱子移入到一个新的1.5mL收集管内(提供的)，向柱子中加入 30-50μL的Rnase-free water(铺满全膜)，小心盖上盖子，静置一分钟后， 4℃12000rpm离心1min，洗脱RNA。
2.1.12用Nano drop进行RNA定量，用Rnase-free water调零后测量，小鼠 完整大脑约90ug/mL，总量约4ug左右。A260/280尽量控制在1.8-2.0之间。
2.2RNA建库及转录组测序
RNA建库及转录组测序流程图如图5所示。
2.3转录组测序数据分析
转录组测序数据分析流程图如图6所示。
3.结果
如图7A所示为不同差异基因数量的韦恩图，上圆内的为单纯移植颅内动 脉瘤粪便组(UIA-FMT-sham)比移植颅内动脉瘤粪便+小鼠模型组 (UIA-FMT-model)，下圆内的为单纯移对照粪便组(Con-FMT-sham)比移植 对照粪便+小鼠模型组(Con-FMT-model)。为了进一步了解肠道菌群紊乱导致 颅内动脉瘤形成及破裂的可能机制，对受体小鼠的脑血管进行转录组测序。总 共1212个基因在两组小鼠脑血管中表达显著不同，其中850个基因在动脉瘤受 体小鼠中显著上调，362个基因在正常对照受体小鼠中显著上调。将这些差异 基因与另外一个人类颅内动脉瘤转录组数据(GSE26969)进行了交叉比对，发现 两转录组数据中存在相当可观的交集基因。这一结果提示肠道菌群失调所导致 的小鼠脑血管转录谱改变具有与人类颅内动脉瘤相似的表达谱变化特征。如图 7B所示为移植对照或颅内动脉瘤患者粪便后小鼠造模第5天的聚类图，其中， 不同处理组差异基因的转录本聚类热图(右侧)，橘红色的色块表示表达量大 于所有样本的平均值，蓝色表示小于平均值，系统树图展示出转录本的聚类情 况(左侧)。单纯移植粪便组的n＝10，移植粪便+小鼠模型组的n＝5。此外，对 这些差异基因进行了Gene Ontology富集分析以便鉴定这些基因所发挥的生物学功能。如图7C所示为1039个差异基因的GO功能注释图，其中，从上到下 按q-value由小到大排序。结果提示这些差异基因主要与炎症过程、细胞黏附、 氧化应激和细胞外基质重塑相关，而上述生物学功能恰恰是已知的颅内动脉瘤 形成及破裂的最重要机制。如图7D所示为1039个差异基因的KEGG功能注释 图，其中，从上到下按q-value由小到大排序。KEGG通路分析提示这些差异基 因富集到了与颅内动脉瘤密切相关的信号通路，比如凋亡和许多炎症相关通路。 从图7A至图7D可以看出，转录组测序结果提示颅内动脉瘤患者肠道微生物失调导致了小鼠脑血管基因转录谱的显著变化，引起了血管炎症反应、血管细胞 外基质重塑和细胞凋亡的产生。
实施例5：补充牛磺酸显著降低小鼠颅内动脉瘤的形成和破裂
1.材料和仪器
制备和评价小鼠颅内动脉瘤模型所需材料和仪器见表3。
表6牛磺酸、L-组氨酸及亚油酸购买信息
| 名称 | 公司 | 规格型号 |
| 牛磺酸 | Sigma | 10g |
| L-组氨酸 | Sigma | 5g |
| 亚油酸 | Sigma | 1g |
2.方法
制备和评价小鼠颅内动脉瘤的方法已于实施例3中详细描述。小鼠血浆靶 向代谢组学检测方法已于实施例2中详细描述。
2.1实验分组
第一组：移植正常人群粪便+颅内动脉瘤模型(Control+FMT+Vehicle) (n＝20)
第二组：移植颅内动脉瘤患者粪便+颅内动脉瘤模型(UIA+FMT+Vehicle) (n＝20)
第三组：移植颅内动脉瘤患者粪便+颅内动脉瘤模型+牛磺酸 (UIA+FMT+Taurine)(n＝20)
2.2牛磺酸等干预
在小鼠杀菌及粪便移植1周后，通过灌胃方式给予小鼠牛磺酸(150mg/ 天)或L-组氨酸(500mg/天)或亚油酸(20mg/天)处理，直至小鼠在造模后 出现神经症状或直至造模后第21天。
3.结果
为了明确粪便移植后小鼠血浆代谢产物的改变及其与肠道菌群的相关性， 对移植后小鼠进行了血浆代谢组学检测。发现2个脂肪酸及8个氨基酸在两组 小鼠血浆中存在显著差异。具体来讲，在改变的代谢物中，牛磺酸、L-组氨酸 和亚油酸在两组人群血浆中也存在同样的变化—即在颅内动脉瘤疾病状态下显 著降低。基于此，进一步探究了给予小鼠分别外源性补充上述三种代谢物能否 降低颅内动脉瘤的形成及破裂。
如图8A所示为小鼠颅内动脉瘤模型后给予不同粪便的HE染色图，其中， 给予对照粪便+对照(Con-FMT+Vehicle)、颅内动脉瘤患者粪便+对照 (UIA-FMT+Vehicle)或颅内动脉瘤患者粪便+牛磺酸(UIA-FMT+Taurine)三 组小鼠的代表性颅内动脉瘤照片(上方，箭头表示瘤体，比例尺＝1mm)以及脑 动脉血管的HE染色(下方，比例尺＝100微米)。如图8B所示为小鼠颅内动 脉瘤模型21天后颅内动脉瘤的发生率和破裂率(n＝20)。如图8C所示为小鼠颅内动脉瘤模型后的生存曲线(Con-FMT+Vehicle组n＝9，UIA-FMT+Vehicle 组n＝18，UIA-FMT+Taurine组n＝9，Mantel-Cox检验)。如图8D所示为通过 尾套法测量不同处理组小鼠血压的统计图(Con-FMT+Vehicle组n＝9， UIA-FMT+Vehicle组n＝18，UIA-FMT+Taurine组n＝9，单因素方差分析与 Bonferroni后检验)。
从图8A至图8C可以看出，与单纯移植动脉瘤患者粪便的小鼠相比，在移 植后外源性补充牛磺酸能够显著降低颅内动脉瘤总体发生率。Kaplan-Meier分 析进一步证实了补充牛磺酸确实降低了颅内动脉瘤的破裂风险。值得注意的是， 从图8D可以看出各组之间的差异不显著，说明补充牛磺酸并没有显著降低小 鼠血压，从而提示牛磺酸的保护作用并非依靠调节血压来实现。
颅内动脉瘤是公认的与炎症反应密切相关的疾病。如图8E所示为F4/80阳 性巨噬细胞与CD31阳性脑血管的代表性照片图(上方)，Ly6G阳性中性粒细 胞与α-SMA阳性脑血管的代表性照片图(下方)，比例尺＝50微米。如图8F 和图8G分别为图8E所示的F4/80阳性巨噬细胞与CD31阳性脑血管、及Ly6G 阳性中性粒细胞与α-SMA阳性脑血管的统计数据图，n＝5，单因素方差分析与 Bonferroni后检验。
从图8E至图8G可以看出，移植颅内动脉瘤患者粪便的小鼠给予动脉瘤造 模后血管周围巨噬细胞及中性粒细胞的浸润显著增加。
如图8H和图8I所示为ELISA检测的小鼠血浆IL-6和TNF-α水平统计图， n＝5，单因素方差分析与Bonferroni后检验。从图8H和图8I可以看出，血浆细 胞因子IL-6及TNF-α的含量也显著提升。该结果提示肠道紊乱确能引起脑血管 炎症反应的发生。值得注意的是，给予牛磺酸补充后血管炎症反应显著减轻。 以往报道表明脑血管中的炎症过程能够导致基质金属蛋白酶MMP系统活化， 进而引起细胞外基质降解及平滑肌细胞凋亡。如图8J和图8K所示为不同组别 脑血管MMP-9的明胶酶谱代表性照片图及统计图(n＝6，单因素方差分析与 Bonferroni后检验)。确证了脑血管MMP-9活性在移植颅内动脉瘤患者粪便的 小鼠中显著提高。
如图8L和图8M所示为脑血管collagen IV基因和laminin的定量PCR统计 图(n＝5，student未配对双尾t检验或Mann-Whitney U检验)。从图8L和图 8M可以看出，对维持脑血管结构至关重要的collagen IV和laminin的mRNA 水平在移植颅内动脉瘤患者粪便的小鼠中显著降低。至关重要的是，在补充牛 磺酸后无论是MMP-9活性还是细胞外基质重塑均得到显著抑制。
如图8N和图8O所示，为α-SMA阳性脑血管上的凋亡细胞代表性照片及 统计图，比例尺＝50微米。其中n＝5，单因素方差分析与Bonferroni后检验。从 图8N和图8O可以看出，TUNEL-阳性的凋亡脑血管平滑肌细胞数目及脑血管 壁变薄程度均在补充牛磺酸后得到改善。
然而，如图9A至图9D所示为给予L-组氨酸(L-histidine)和亚油酸(linoleicacid)对移植病人粪便的小鼠颅内动脉瘤模型21天后颅内动脉瘤的发生率和破 裂率及生存曲线，其中，图9A为给予颅内动脉瘤患者粪便+对照 (UIA-FMT+Vehicle)或颅内动脉瘤患者粪便+L-组氨酸(UIA-FMT+L-histidine) 两组小鼠颅内动脉瘤模型21天后颅内动脉瘤的发生率和破裂率(n＝20)，图 9B为图9A的小鼠颅内动脉瘤模型后的生存曲线(UIA-FMT+Vehicle组n-16， UIA-FMT+L-histidine组n＝16，Mantel-Cox检验)；图9C为给予颅内动脉瘤患 者粪便+对照(UIA-FMT+Vehicle)或颅内动脉瘤患者粪便+亚油酸 (UIA-FMT+linoleic)两组小鼠颅内动脉瘤模型21天后颅内动脉瘤的发生率和 破裂率(n＝20)，图9D为图9C的小鼠颅内动脉瘤模型后的生存曲线 (UIA-FMT+Vehicle组n-15，UIA-FMT+linoleic组n＝16，Mantel-Cox检验)。 从图9A至图9D可以看出，采用同样方法补充L-组氨酸和亚油酸缺并没有观察 到任何保护效果。以上结果充分说明补充牛磺酸通过减轻炎症反应、减少细胞 外基质重塑、维持脑血管结构完整性最终降低了颅内动脉瘤的形成率和破裂率。
实施例6：补充H.hathewayi显著降低小鼠颅内动脉瘤的形成和破裂
1.材料和仪器
制备和评价小鼠颅内动脉瘤模型所需材料和仪器见表3。
表6H.hathewayi购买信息
| 名称 | 公司 | 规格型号 |
| H.hathewayi | Leibniz-Institut DSMZ GmbH | DSM-13479 |
| PYG medium | Leibniz-Institut DSMZ GmbH | 104b |
2.方法
制备和评价小鼠颅内动脉瘤的方法已于实施例3中详细描述。
2.1实验分组
第一组：移植正常人群粪便+颅内动脉瘤模型(Control+FMT+Vehicle) (n＝20)
第二组：移植颅内动脉瘤患者粪便+颅内动脉瘤模型(UIA+FMT+Vehicle) (n＝20)
第三组：移植颅内动脉瘤患者粪便+颅内动脉瘤模型+hathewayi (UIA+FMT+hathewayi)(n＝20)
2.2H.hathewayi干预
在小鼠杀菌及粪便移植1周后，通过灌胃方式给予小鼠H.hathewayi (1X109CFU/小鼠)100μl处理，每周3次灌胃。在灌胃21天后造颅内动脉瘤 模型，灌胃一直持续到小鼠出现神经症状或造模后第21天。
3.结果
为了进一步明确哪些肠道微生物与血浆牛磺酸水平相关，通过Spearman’s 相关性分析对粪便移植后两组小鼠差异肠道菌种和差异血浆代谢物进行了关联 性研究。如图10A所示，10个有差异的氨基酸和脂肪酸与14个颅内动脉瘤相 关的肠道菌种的Spearman相关性热图，+表示P<0.05，*表示P<0.01。相关 系数|r|<0.4的不予展示(n＝10)。从图10A可以看出，有5个菌种的丰度与牛 磺酸含量存在正相关关系，1个菌种的丰度与牛磺酸含量存在负相关关系。在 这6个与牛磺酸密切相关的菌种中，H.hathewayi是唯一一个在颅内动脉瘤人群 研究中也与牛磺酸存在相关性的菌种。
如图10B所示为H.Hathewayi在两个人群(n＝100和n＝40)、粪便移植的 供体(n＝2)，接受粪便移植的小鼠(Con-FMT，n＝10；UIA-FMT，n＝10)统 计图。采用双尾Wilcoxon秩和检验，其中，在所有方框图中，方框表示第一和 第三四分位数之间的四分位数范围(IQRs)，方框内的线表示中位数；细须表示 第一或第三四分位数1.5×IQ R内的最低或最高值。
从图10B可以看出，H.hathewayi在两个人群、粪便移植人类供体、移植 受体小鼠中的改变趋势是相同的—即在颅内动脉瘤疾病状态下丰度显著降低。 据此，为了最终阐明H.hathewayi是否与血浆牛磺酸水平的变化及颅内动脉瘤 疾病发生存在因果关系，在小鼠粪便移植后给予H.hathewayi灌胃处理。 Real-time PCR分析提示1×109CFU的H.hathewayi喂养能够明显改善由于移 植动脉瘤粪便导致的H.hathewayi水平降低。
如图11A所示为采用定量PCR检测不同组粪便中H.Hathewayi的含量图 (n＝5，单因素方差分析与Bonferroni后检验)。如图11B所示为高压液相色谱 定量检测不同组血浆牛磺酸浓度(n＝10，单因素方差分析与Bonferroni后检验)。 从图11A和图11B可以看出，H.hathewayi的补充同样能够显著恢复血浆牛磺 酸水平。
如图11C所示为小鼠颅内动脉瘤模型后粪便给予对照粪便+对照 (Con-FMT+Vehicle)、颅内动脉瘤患者粪便+对照(UIA-FMT+Vehicle)或颅 内动脉瘤患者粪便+H.Hathewayi(UIA-FMT+H.Hathewayi)三组小鼠的代表性 颅内动脉瘤照片(箭头表示瘤体，比例尺＝1mm)。如图11D所示为小鼠颅内 动脉瘤模型21天后颅内动脉瘤的发生率和破裂率(n＝20)。如图11E所示为小 鼠颅内动脉瘤模型后的生存曲线(Con-FMT+Vehicle组n＝10，UIA-FMT+Vehicle 组n-18，UIA-FMT+H.Hathewayi组n＝9，Mantel-Cox检验)。从图11C至图11E可以看出，在给予颅内动脉瘤造模手术后，与单纯移植动脉瘤患者粪便的 小鼠相比，H.hathewayi的补充能够显著降低颅内动脉瘤总体发生率。
Kaplan-Meier分析进一步证实了补充H.hathewayi确实降低了颅内动脉瘤的破裂风险。
如图11F和图11G所示为F4/80阳性巨噬细胞与CD31阳性脑血管的代表 性照片及统计数据图，比例尺＝50微米，n＝5，单因素方差分析与Bonferroni后 检验。如图11H所示为ELISA检测的小鼠血浆IL-6水平统计图，n＝5，单因素 方差分析与Bonferroni后检验。如图11I所示为脑血管collagen IV基因和laminin 基因的定量PCR统计图(n＝5，student未配对双尾t检验或Mann-Whitney U检 验。如图11J和图11K所示为不同组别脑血管MMP-9的明胶酶谱代表性照片 与统计图(n＝6，单因素方差分析与Bonferroni后检验)。如图11L和图11M 所示为α-SMA阳性脑血管上的凋亡细胞代表性照片及统计图，比例尺＝50微米， n＝5，单因素方差分析与Bonferroni后检验。
从图11F至图11M可以看出，脑血管炎症反应、细胞外基质重塑及MMP-9 活性均在给予H.hathewayi补充后得到充分抑制。同样地，TUNEL-阳性的凋亡 脑血管平滑肌细胞数目也在补充H.hathewayi后得到改善。以上结果充分说明， H.hathewayi参与了牛磺酸的合成，促进了血浆牛磺酸水平的增加，最终降低了 颅内动脉瘤形成和破裂发生。
从上述实施例可以看出，颅内动脉瘤患者及移植完颅内动脉瘤患者粪便的 小鼠肠道H.hathewayi丰度显著降低，进而导致牛磺酸合成受阻，血浆牛磺酸 水平降低。补充H.hathewayi促进了血浆牛磺酸水平的增加，最终降低了颅内 动脉瘤形成和破裂发生。这说明H.hathewayi降低是导致颅内动脉瘤的始动因 素，牛磺酸的降低是引起脑血管病变破裂的直接因素，补充H.hathewayi可从 源头阻断颅内动脉瘤形成和破裂，直接补充牛磺酸亦可降低颅内动脉瘤形成和 破裂发生。由于H.hathewayi可以在体内定植，因此补充H.hathewayi可以维持 较长时间的血浆牛磺酸水平，而直接补充牛磺酸随着牛磺酸的代谢需要定期进 行补充。
Claims (4)
1.H.hathewayi或牛磺酸作为制备预防颅内动脉瘤形成及破裂药物的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药学可接受的载体包括稀释剂、赋形剂、崩解剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、表面活化剂、稳定剂中的任何一种或多种组合。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、针剂、片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂中的任一种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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