CN102481271A - 利用表观代谢转变剂、多维细胞内分子或环境影响剂治疗代谢障碍的方法 - Google Patents

利用表观代谢转变剂、多维细胞内分子或环境影响剂治疗代谢障碍的方法 Download PDF

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Abstract

描述了使用表观代谢转变剂、多维细胞内分子或环境影响剂治疗人的代谢障碍的方法和制剂。

Description

利用表观代谢转变剂、多维细胞内分子或环境影响剂治疗代谢障碍的方法
相关申请：
本申请要求2009年5月11日提交的标题为“Methods forTreatment of Oncological Disorders Using an EpimetabolicShifter(Coenzyme Q10)”的第61/177,241号美国临时申请(律师代理申请案编号(Attorney Docket No.)：117732-00601)、2009年5月11日提交的标题为“Methods for Treatment of Oncological Disorders UsingEpimetabolic Shifters，Multidimensional Intracellular Molecules orEnvironmental Influencers”第61/177,243号美国临时申请(律师代理申请案编号：117732-00701)、2009年5月11日提交的标题为“Methodsfor the Diagnosis of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters，Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”的第61/177,244号美国临时申请(律师代理申请案编号：117732-00801)、2009年5月11日提交的标题为“Methods for Treatmentof Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters，MultidimensionalIntracellular Molecules or Environmental Influencers”的第61/177,245号美国临时申请(律师代理申请案编号：117732-00901)和2009年5月11日提交的标题为“Methods for the Diagnosis of Metabolic DisordersUsing Epimetabolic Shifters，Multidimensional Intracellular Molecules orEnvironmental Influencers”的第61/177,246号美国临时申请(律师代理申请案编号：117732-01001)的优先权。上述申请的每一个的全部内容通过引用并入本文。
发明背景：
本发明涉及代谢障碍例如糖尿病和肥胖症的治疗、预防和减轻。
随着餐后血糖水平升高，胰岛素分泌并且刺激周围组织(骨骼肌和脂肪)的细胞以活跃地从血液吸收葡萄糖作用为能量来源。作为失调的胰岛素分泌或作用的结果—葡萄糖动态平衡的丧失通常导致代谢障碍例如糖尿病，其可被肥胖症共触发或进一步加重。因为这些状况通常是致命的，因此需要恢复足够的葡萄糖从血流清除的策略。
虽然糖尿病可继发于引起胰腺的大范围损伤的任何状态(例如，胰腺炎、肿瘤、某些药物例如皮质类固醇或喷他脒的施用、铁超负荷(例如，血色沉著病)、获得性或遗传性内分泌病以及手术切除)，但糖尿病的最常见形式通常从胰岛素信号转导系统的原发性障碍产生。存在两个主要的糖尿病类型，即I型糖尿病(也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM))和2型糖尿病(也称为不依赖于胰岛素的或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM))，其共有共同的长期并发症，尽管它们具有不同的致病机制。
占据约10％的全部原发性糖尿病(primary diabetes)病例的I型糖尿病是特征在于胰腺的产生胰岛素的β细胞的大范围破坏的器官性自身免疫性疾病。所造成的胰岛素产量的减少不可必然地导致葡萄糖代谢的失调。虽然胰岛素的施用为患有该病症的患者提供了显著的益处，但胰岛素的短血清半衰期是维持血糖量正常的主要障碍。可选择的处理是胰岛移植，但该策略一直与有限的成功率联系在一起。
影响更大比例的群体的2型糖尿病的特征在于胰岛素分泌的失调和/或周围组织对胰岛素的减小的反应，即胰岛素抵抗。虽然2型糖尿病的发病机制仍然还不清楚，但流行病学研究表明该形式的糖尿病因多个遗传缺陷或多态性的集合而引起，每一个遗传缺陷或多态性贡献了其自已的易感性风险并且被环境因子(包括超重、饮食、不活动、药物和过度饮酒)改变。虽然用于2型糖尿病的管理的各种治疗性治疗是可获得的，但它们与各种使人虚弱的副作用相关。因此，通常建议经诊断患有2型糖尿病或处于患有2型糖尿病的风险中的患者采取更健康的生活方式，包括体重减轻、饮食的改变、锻炼和适度饮酒。然而，这样的生活方式的改变不足以逆转由糖尿病引起的血管和器官损伤。
辅酶Q10，在本文中也称为CoQ10、Q10、泛醌或泛癸利酮，是大众营养补充剂并且以胶囊形式见于在营养品店(nutritional store)、保健食品店、药房等中，如通过泛醇(CoQ10的还原形式)的抗氧化性质帮助保护免疫系统的维生素样补充剂。CoQ10是本领域公认的并且进一步描述于第WO 2005/069916号国际公布，将该国际公布的完整公开内容通过引用并入本文。
CoQ10经发现遍布人体的大部分组织和其他哺乳动物的组织。CoQ10在人中的组织分布和氧化还原状态已由Bhagavan和Bhagavan(2006Free Radical Research 40(5)：445-453)。在综述论文中进行了综述。作者报导“作为一般法则，具有高能需要或代谢活性的组织例如心脏、肾、肝和肌肉包含相对高的浓度的CoQ10”。作者还报导“[a]组织中的大部分CoQ10以还原形式如氢醌或泛醇(uniquinol)存在，除了脑和肺例外”，这“似乎是这两个组织中增加的氧化性应激的反映”。具体地，Bhagavan报导在心脏、肾、肝、肌肉、肠和血液(血浆)中，分别约61％、75％、95％、65％、95％和96％的CoQ10以还原形式存在。类似地，Ruiz-Jiminez等人(2007J.Chroma A，1175，242-248)报导，当估量人血浆的Q10和Q10的还原形式(Q10H2)时，大部分(90％)所述分子以还原形式被发现。
CoQ10是极亲脂的并且多半是不溶于水的。CoQ10是极亲脂的并且多半是不溶于水的。由于其在水中的不溶性、脂质中有限的溶解性和相对大的分子量，因此口服施用的CoQ10的吸收效率很低。Bhagavan和Chopra报导“在一项利用大鼠的研究中，报导了只有约2-3％的口服施用的CoQ10被吸收”。Bhagavan和Chopra还报导“大鼠研究的数据表明在肠的吸收过程中和之后CoQ10被还原成泛醇”。
鉴于目前可获得用于治疗糖尿病的策略是欠佳的，因此存在对更有效并且不伴随此类使人虚弱的副作用的治疗的迫切需要。
发明概要：
本发明部分基于发现：线粒体功能障碍与多种疾病(包括代谢疾病(例如糖尿病和肥胖症))相关，并且某些内源分子例如CoQ10掌控着此类代谢疾病的成功诊断、治疗和预防。本发明也部分基于发现：此类关键的内源分子通过直接影响氧化磷酸化在维持正常线粒体功能中起着重要作用，以及恢复或促进更加标准化的线粒体氧化磷酸化可有效地治疗或预防代谢疾病的进展。本发明还基于发现：一类环境影响剂(例如，CoQ10)可在代谢疾病的患病细胞中选择性引发朝向更加标准化的线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变。此类环境影响剂能够调节以代表治疗终点的方式调节用作代谢障碍(例如糖尿病)的关键指标的细胞内靶。
本发明还至少部分基于发现：对细胞施用内源辅酶Q10(在本文中也称为CoQ10或Q10)导致细胞凋亡反应。优选在癌细胞中诱导细胞凋亡反应。观察到线粒体Q10水平的时间和剂量反应，其中在48小时后，细胞线粒体中Q10的水平增加至6倍。本发明还基于令人惊讶和意外的发现：Q10以提供的氧化形式(促氧化剂)维持并且不以任何显著的量转化成Q10H2的还原(抗氧化剂)形式。本发明基于进一步发现：大量蛋白质和mRNA水平在利用Q10处理的细胞中受到调节。发现此类被调节的蛋白质簇集在几种细胞途径中，包括细胞凋亡、癌症生物学和细胞生长、糖酵解和代谢、分子运输和细胞信号转导。
本文中描述的申请者的数据已对Q10的作用机制提供了见解。具体地，然而不希望受理论束缚，申请人的发现表明Q10诱导至细胞微环境的代谢转移。已知许多疾病与改变的代谢状态相关。例如，已知差异代谢在癌细胞中发生(Warurg效应)，其中大多数癌细胞主要通过糖酵解，然后细胞溶胶中通过乳酸发酵而非在线粒体中通过氧化磷酸化(丙酮酸盐的氧化)产生能量。在另一个实例中，代谢障碍例如糖尿病和肥胖症与改变的葡萄糖代谢相关。
因此，本发明在第一方面提供了用于治疗哺乳动物的CoQ10反应性障碍、减轻其症状、抑制其进展或预防其的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的包含至少一种环境影响剂(env-influencer)的药物组合物，其中所述环境影响剂在哺乳动物的患病细胞中选择性引朝向在正常生理条件下在哺乳动物的正常细胞中观察到的糖酵解和线粒体氧化磷酸化的水平的细胞代谢能转变。
在一个实施方案中，CoQ10反应性障碍是代谢障碍。
本发明在另一个方面提供了用于治疗哺乳动物的代谢障碍、减轻其症状、抑制其进展或预防其的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的包含至少一种环境影响剂(env-influencer)的药物组合物，其中所述环境影响剂在哺乳动物的患病细胞中选择性引朝向在标准化的线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能转变。
在一个实施方案中，环境影响剂在哺乳动物的正常细胞中基本上不引发朝向线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能转变。
在一个实施方案中，哺乳动物为人(或非人哺乳动物)。
在一个实施方案中，所述代谢障碍对利用辅酶Q10或其代谢产物或其类似物的治疗易起反应或敏感。
在一个实施方案中，代谢障碍的特征在于导致改变的基因调控和/或蛋白质间相互作用的失调的线粒体氧化磷酸化功能，所述失调促成或原因性地导致代谢疾病。
在一个实施方案中，所述环境影响剂包括：(a)苯醌或至少一种促进苯醌环的生物合成的分子，和(b)至少一种促进类异戊二烯单元的合成和/或类异戊二烯单元至苯醌环的连接的分子。
在一个实施方案中，所述至少一种促进苯醌环的生物合成的分子包括：L-苯丙氨酸、DL-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-酪氨酸、D L-酪氨酸、D-酪氨酸、4-羟基-苯丙酮酸酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯(香草扁桃酸酯或VMA)、香草酸、吡哆素或泛醇。
在一个实施方案中，所述至少一种促进类异戊二烯单元的合成和/或类异戊二烯单元至苯醌环的连接的分子包括：乙酸苯酯、4-羟基-苯甲酸酯、甲羟戊酸、乙酰甘氨酸、乙酰-CoA或法呢基。
在一个实施方案中，所述环境影响剂包括(a)L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和4-羟基苯丙酮酸酯的一种或多种；和，(b)4-羟基苯甲酸酯、乙酸苯酯和苯醌的一种或多种。
在一个实施方案中，所述环境影响剂：(a)抑制Bcl-2表达和/或促进半胱天冬酶-3表达；和/或，(b)抑制细胞增殖。
在一个实施方案中，所述环境影响剂为多维细胞内分子(MIM)。在一个实施方案中，所述MIM选自：α酮戊二酸盐/α酮戊二酸、苹果酸盐/苹果酸、琥珀酸盐/琥珀酸、葡糖胺、腺苷、腺苷二磷酸、葡糖苷酸/葡糖醛酸、烟酸、烟酸二核苷酸、丙氨酸/苯丙氨酸、吡哆素、硫胺或黄素腺嘌呤二核苷酸。在一个实施方案中，所述多维细胞内分子选自乙酰Co-A、棕榈酰Co-A、L-肉毒碱和氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸)。
在一个实施方案中，所述环境影响剂是表观代谢转变剂(epi-shifter)。在一个实施方案中，所述表观代谢转变剂选自：转醛醇酶、转酮醇酶、琥珀酰CoA合酶、丙酮酸羧化酶或核黄素。在一个实施方案中，所述表观代谢转变剂选自辅酶Q10、维生素D3和细胞外基质成分。在一个实施方案中，所述表观代谢转变剂为辅酶Q10。在一个实施方案中，所述细胞外基质成分选自纤连蛋白；免疫调节剂(例如，TNFα或白细胞介素)、血管生成因子；和细胞凋亡因子。
在一个实施方案中，治疗一群人，群体的至少25％具有对于被治疗的障碍具有治疗性的全身性环境影响剂水平。在其他实施方案中，治疗一群人，并且群体的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多具有对于被治疗的障碍具有治疗性的全身性辅酶Q10水平。应当理解，具有这些值的任一个值作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如，10％至25％、15％至35％、25％至50％、35％至60％、40％至70％、50％至75％、60％至85％或70％至90％。
在一个实施方案中，待治疗的代谢障碍不是通常通过局部施用治疗的障碍，预期以治疗有效水平全身性递送活性剂来进行治疗。
在一个实施方案中，待治疗的人的组织中的环境影响剂的浓度与代表健康或正常状态的人组织的对照标准的环境影响剂的浓度不同。
在一个实施方案中，给人施用的环境影响剂的形式与在人的全身性循环中发现的主要形式不同。在一个实施方案中，所述环境影响剂以氧化形式给人施用。
在一个实施方案中，所述足以治疗人的代谢障碍的量上调或下调线粒体氧化磷酸化。
在一个实施方案中，所述足以治疗人的代谢障碍的量调节葡萄糖的无氧使用和/或乳酸盐生物合成。
本发明在一个方面提供了用于治疗或预防人的代谢障碍的方法，包括以足以治疗或预防所述代谢障碍的量给人施用环境影响剂，其中以使所述环境影响剂在治疗过程中维持其氧化形式的方式施用所述环境影响剂，从而治疗或预防代谢障碍。
在一个实施方案中，给人施用的环境影响剂的形式与在人的全身性循环中发现的主要形式不同。
本发明在另一个方面提供了用于治疗或预防人的代谢障碍的方法，包括选择患有代谢障碍的人受试者；和给所述人施用治疗有效量的能够增加线粒体氧化磷酸化和任选地阻断葡萄糖的无氧使用的环境影响剂，从而治疗或预防所述代谢障碍。
本发明在另一个方面提供了用于在需要治疗代谢障碍的哺乳动物的患病细胞中选择性地增加线粒体氧化磷酸化的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的包含至少一种环境影响剂的药物组合物，从而在所述哺乳动物的患病细胞中选择性增加线粒体氧化磷酸化。
在本发明的方法的一个实施方案中，所述方法还包括上调选自表2-4和表6-28以及表63-68中所列的具有正倍数改变的分子的一个或多个基因的表达；和/或下调选自表2-4和表6-28以及表63-68的具有负倍数变化的分子的一个或多个基因的表达，从而治疗或预防所述代谢障碍。在一个实施方案中，所述方法还包括调节一个或多个基因的表达，所述基因选自HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-羟基苯甲酸酯、中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C和钙调蛋白激酶II。
在本发明的方法的一个实施方案中，所述治疗通过环境影响剂与选自表2-4和6-28以及63-68中所列的分子的分子的相互作用发生。在一个实施方案中，所述治疗通过环境影响剂与蛋白的相互作用发生，所述蛋白选自HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-羟基苯甲酸酯、中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C和钙调蛋白激酶II。在一个实施方案中，所述治疗通过环境影响剂与HNF4α的相互作用发生。在一个实施方案中，所述治疗通过环境影响剂与转醛醇酶的相互作用发生。
在本发明的方法的一个实施方案中，所述代谢障碍选自糖尿病、肥胖症、糖尿病前期、代谢综合征以及代谢障碍的任何关键因素。
在一个实施方案中，所述代谢障碍是糖尿病，并且所述环境影响剂影响β细胞功能、胰岛素代谢和/或胰高血糖素沉积(deposition)。
在一个实施方案中，所述代谢障碍是肥胖症，并且所述环境影响剂影响线粒体中的β细胞氧化、脂肪细胞大小的减小和/或皮质醇水平的控制。
在一个实施方案中，所述代谢障碍是心血管疾病，并且所述环境影响剂影响血管中膜的平滑肌细胞增殖的减少、脂质过氧化作用、凝血烷-ax2合成、TNFα、IL-1B、血小板聚集、一氧化氮(NO)产量的减少、斑块沉积(plaque deposition)和/或标准化的血糖控制(glycemiccontrol)。
在一个实施方案中，代谢障碍的关键因素包括空腹葡萄糖受损、葡萄糖耐量受损、增加的腰围、增加的内脏脂肪含量、增加的空腹血浆葡萄糖、增加的空腹血浆甘油三酯、降低的空腹高密度脂蛋白水平、增加的血压、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、心血管疾病、动脉硬化、冠状动脉病、周围血管疾病、脑血管病、充血性心力衰竭、升高的血浆去甲肾上腺素、升高的心血管相关炎症因子、促成血管内皮功能障碍的升高的血浆因子、高脂蛋白血症、动脉硬化或动脉粥样硬化、摄食过度、高血糖症、高脂血症和血压升高或高血压、升高的血浆餐后甘油三酯或游离脂肪酸水平、增强的细胞氧化性应激或其血浆指标、增加的循环高凝状态(circulating hypercoagulative state)、肝脏脂肪变性(hetaptic steatosis)、肝脏脂肪变性、肾病(包括肾衰竭和肾功能不全)。
在本发明的方法的一个实施方案中，所述方法还包括施用另外的治疗剂例如糖尿病治疗剂、糖尿病并发症治疗剂、抗高血脂药、降压药或抗高血压药、抗肥胖药、利尿药、化学治疗剂、免疫治疗剂、免疫抑制剂等。在一个实施方案中，所述代谢障碍选自糖尿病、肥胖症、糖尿病前期、代谢综合征和代谢障碍的任何关键因素。在一个实施方案中，代谢障碍的关键因素选自空腹葡萄糖受损、葡萄糖耐量受损、增加的腰围、增加的内脏脂肪含量、增加的空腹血浆葡萄糖、增加的空腹血浆甘油三酯、降低的空腹高密度脂蛋白水平、增加的血压、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、心血管疾病、动脉硬化、冠状动脉病、周围血管疾病、脑血管病、充血性心力衰竭、升高的血浆去甲肾上腺素、升高的心血管相关炎症因子、促成血管内皮功能障碍的升高的血浆因子、高脂蛋白血症、动脉硬化或动脉粥样硬化、摄食过度、高血糖症、高脂血症和血压升高或高血压、升高的血浆餐后甘油三酯或游离脂肪酸水平、增强的细胞氧化性应激或其血浆指标、增加的循环高凝状态、肝脏脂肪变性、肝脏脂肪变性、肾病(包括肾衰竭和肾功能不全)。
在本发明的方法的一个实施方案中，所述方法还包括施用另外的治疗剂例如糖尿病治疗剂、糖尿病并发症治疗剂、抗高血脂药、降压药或抗高血压药、抗肥胖药、利尿药、化学治疗剂、免疫治疗剂、免疫抑制剂等。
本发明在另一个方面提供鉴定在治疗代谢障碍中是有效的试剂的方法，所述方法包括选择环境影响剂；鉴定能够转变细胞的代谢状态的环境影响剂；和确定所述环境影响剂在治疗代谢障碍中是否有效；从而鉴定在治疗代谢障碍中是有效的试剂。
在一个实施方案中，通过测量mRNA表达、蛋白质表达、脂质或代谢产物浓度、生物能分子的水平、细胞能量、线粒体功能和线粒体数量的任一个或多个的改变，环境影响剂被鉴定为能够转变细胞的代谢状态。
在一个实施方案中，在治疗代谢障碍中是有效的环境影响剂能够降低患者的葡萄糖水平或脂质水平。
本发明在另一个方面提供了鉴定多维细胞内分子的方法，包括将将细胞与内源分子接触；监控所述内源分子对细胞微环境特征的作用；和鉴定诱导对细胞微环境特征的改变的内源分子；从而鉴定多维细胞内分子。
在一个实施方案中，所述方法还包括比较所述内源分子对患病细胞和正常对照细胞的细胞微环境特征的作用；和鉴定差异诱导患病细胞相对于正常对照细胞的细胞微环境特征的改变的内源分子，从而鉴定MIM。
在一个实施方案中，通过测量选自mRNA、蛋白质、脂质和代谢产物的细胞分子的水平或活性的变化监控对细胞微环境特征的作用。
本发明在另一个方面提供了鉴定表观代谢转变剂的方法，包括比较两种或更多种细胞或组织的分子特征谱，其中两种或更多种细胞或组织展示差异疾病状态；从分子特征谱鉴定对于其水平的变化与疾病状态相关的分子；将所述分子引入细胞；和评估分子转变细胞的代谢状态的能力，其中能够转变细胞的代谢状态的分子被鉴定为表观代谢转变剂。
在一个实施方案中，所述分子特征选自代谢特征谱、脂质特征谱、蛋白质特征谱或RNA特征谱。
在一个实施方案中，所述分子不负面影响正常细胞的健康或生长。
本发明在另一个方面提供了包含根据本发明的方法的任一方法鉴定的试剂的组合物。本发明在相关方面还提供了包括本发明的组合物的试剂盒。
本发明在另一个方面提供了降低患者的葡萄糖水平的方法，包括给所述患者施用有效量的本发明的组合物。本发明在相关方面提供了降低患者的脂质水平的方法，包括给所述患者施用有效量的本发明的组合物。
附图简述：
图1：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的SK-MEL-28对24小时的Q10处理的敏感性。
图2：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的SKBR3对24小时的Q10处理的敏感性。
图3：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的PaCa2对24小时的Q10处理的敏感性。
图4：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的PC-3对24小时的Q10处理的敏感性。
图5：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的HepG2对24小时的Q10处理的敏感性。
图6：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的MCF-7对24小时的Q10处理的敏感性。
图7：在利用Q10处理24小时后凋亡细胞的测量，如通过Apostrand ELISA法测量的。
图8：2-D凝胶电泳的示例性凝胶分析。标记被切取用于鉴定的点。
图9：通过2-D凝胶电泳鉴定的在SK-MEL-28细胞中受Q10调节的蛋白质之间的相互作用的网络。
图10：从Verhoeven等人(Am.J.Hum.Genet.200168(5)：1086-1092)改进的戊糖磷酸途径。
图11：SK-MEL-28细胞的富集线粒体的材料的2-D凝胶。标记要切取的并且通过质谱表征鉴定的点。
图12：在向培养基中外源加入100μM Q10后存在于线粒体中的Q10的相对量的比较曲线。
图13：描绘已知过程的细胞凋亡途径。
图14：Bcl-xl的Western印迹分析。
图15：利用波形蛋白抗体显示的SK-MEL-28样品组的Western印迹分析。
图16：利用5种靶向氧化磷酸化复合物的抗体(MitoSciences#MS601)评估的来自许多细胞系的细胞裂解的Western印迹分析。
图17：F1-α水平的Western印迹比较。
图18：针对C-III-Core 2的Q10反应的Western印迹比较。
图19：针对C-II-30的Q10反应的Western印迹比较。
图20：针对C-IV-COX II的Q10反应的Western印迹比较。
图21：针对C-I-20(ND6)的Q10反应的Western印迹比较。
图22：针对5种线粒体蛋白质的多种细胞类型的Western印迹分析。
图23：针对复合物V蛋白C-V-α的Q10反应的Western印迹比较。
图24：针对C-III-Core 1的Q10反应的Western印迹比较。
图25：针对孔蛋白(VDAC1)的Q10反应的Western印迹比较。
图26：针对亲环蛋白(Cyclophilin)的Q10反应的Western印迹比较。
图27：针对细胞色素C的Q10反应的Western印迹比较。
图28：插入螺旋10开放构象中的HNF4α(1M7W.pdb)的脂质结合通道的Q10(球)的理论模型。
图29：在含氧量正常和含氧量低的条件下，HDFa细胞在多种葡萄糖条件下的OCR。
图30：在含氧量正常和含氧量低的条件下，HASMC细胞在多种葡萄糖条件下的OCR。
图31：在31510和应激因子不存在和存在的情况下MCF-7胰腺癌细胞中的OCR值。
图32：在31510和应激因子不存在和存在的情况下PaCa-2胰腺癌细胞中的OCR值。
发明详述：
I.定义
如本文中所使用的，下列术语的每一个具有在该部分中与其相关的意义。
冠词“一种(a)”和“一个(an)”在本文中是指一个或超过一个(即至至少一个)所述冠词的语法宾语。例如，“一个元素”意指一个元素或超过一个元素。
术语“包括”在本文中用于意指短词“包括但不限于”，并且可与所述短语互换使用。
除非本文中明确地另外指出，否则术语“或”在本文中意指术语“和/或”，并且可与所述术语互换使用。
术语“例如”在本文中用于意指术语“例如但不限于”，并且可与所述术语互换使用。
待通过本发明的方法治疗的“患者”或“受试者”可意指人或非人动物，优选哺乳动物。
“治疗有效量”意指当给患者施用以治疗疾病时足以对所述疾病实现这样的治疗的化合物的量。当为了预防疾病施用时，所述量足以避免或延迟疾病的发作。“治疗有效量”将视所述化合物、疾病和其严重性以及待治疗的患者的年龄、体重等而变化。
“预防”或“防止”是指获得疾病或障碍的风险(即，引起尚未在可遭受或易患疾病但仍未经历或展示疾病的症状的患者中发生的疾病的至少一个临床症状)的降低。
术语“预防性”或“治疗性”治疗是指给受试者施用一种或多种受试组合物。如果其在不期望的病状(例如，宿主动物的疾病或其他不期望的状态)的临床表现之前施用，则治疗是预防性的，即，其保护宿主免于发生不期望的病状，然而如果在不期望的病状表现之后施用，则治疗是治疗性的(即，其由此旨在减轻、改善或维持既有的不期望的病状或副作用)。
术语“治疗效应”是指由药理活性物质引起的动物，特别是哺乳动物的，更特别是人中的局部或全身性效应。所述术语因此意指意欲用于诊断、治疗、缓和、治疗或预防疾病或用于促进动物或人的期望的身体或心理发展和状态的任何物质。短语“治疗有效量”意指以适用于任何治疗的合理效益风险比产生一定的期望的局部或全身性效应的此种物质的量。在某些实施方案中，化合物的治疗有效量将取决于其治疗指数、溶解度等。例如，可以以足以产生适用于此类治疗的合理效益风险比的量施用通过本发明的方法发现的某些化合物。
“患者”是指任何动物(例如，人)，包括马、狗、猫、猪、山羊、兔、仓鼠、猴、豚鼠、大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、绵羊、牛、鱼和鸟。
“代谢途径”是指酶介导的反应的顺序，所述反应将一种化合物转化成另一种化合物并且为细胞功能提供中间产物和能量。代谢途径可以是线性的或环状的。
“代谢状态”是指如通过多个化学和生物学指标测量的在给定时间点上的特定细胞、多细胞或组织环境的分子含量，它们与健康或疾病的状态相关。
术语“微阵列”是指在基质例如纸、尼龙膜或其他类型的膜、滤纸、芯片、载玻片或任何其他适当的固体载体上合成的不同多核苷酸、寡核苷酸、多肽(例如，抗体)或肽的阵列。
术语“障碍”和“疾病”被包含地使用并且是指与身体的任何部分、器官或系统(或其任何组合)的正常结构或功能的任何偏差。具体的疾病表现在特征性症状和体征(包括生物、化学和物理变化)，并且通常与多个其他因素(包括但不限于人口统计、环境、职业、遗传和医疗史因素)相关。可通过多种方法定量某些特征性体征、症状和相关因素以产生重要诊断信息。
术语“表达”在本文中用于表示籍以从DNA产生多肽的过程。所述过程包括基因至mRNA的转录和该mRNA至多肽的翻译。取决于其所应用的背景，“表达”可以指RNA、蛋白质或两者的产生。
术语“基因的表达水平”或“基因表达水平”是指细胞中mRNA以及前mRNA新生转录物、转录物加工中间体、成熟mRNA和降解物的水平或由所述基因编码的蛋白质的水平。
术语“调节”是指反应的上调(即，激活或刺激)、下调(即，抑制或遏抑)，或者两者的组合或分开的两者。“调节剂”是起调节作用的化合物或分子，并且可以是例如激动剂、拮抗剂、活化剂、刺激剂、遏抑剂或抑制剂。
本文中所使用的术语“辅酶生物合成途径的中间产物”表征了在酪氨酸和乙酰-CoA至泛醌的化学/生物转化之间形成的那些化合物。辅酶生物合成途径的中间产物包括3-六异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯、3-六异戊二烯基-4，5-二羟基苯甲酸酯、3-六异戊二烯基-4-羟基-5-甲氧基苯甲酸酯、2-六异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-六异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-六异戊二烯基-3-甲基-5-羟基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯、2-八异戊二烯基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-5-羟基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-十异戊二烯基-3-甲基-5-羟基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-十异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-十异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-十异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、3-十异戊二烯基-4-羟基-5-甲氧基苯甲酸酯、3-十异戊二烯基-4，5-二羟基苯甲酸酯、3-十异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯、4-羟基苯丙酮酸酯、4-羟基苯基乳酸酯、4-羟基-苯甲酸酯、4-羟基苯乙烯和六异戊二烯二磷酸酯。
如本文中所使用的，短语“葡萄糖的无氧使用”或“无氧糖酵解”是指细胞通过糖酵解，然后在细胞溶胶中进行乳酸发酵来产生能量。例如，许多癌细胞通过无氧糖酵解产生能量。
如本文中所使用的，短语“有氧糖酵解”或“线粒体氧化磷酸化”是指细胞通过糖酵解，然后在线粒体中进行丙酮酸盐的氧化来产生能量。
如本文中所使用的，短语“能够阻断糖酵解的无氧使用和增加线粒体氧化磷酸化”是指环境影响剂(例如，表观代谢转变剂)诱导细胞的代谢状态从无氧糖酵解至有氧糖酵解或线粒体氧化磷酸化的转变或变化的能力。
现将更详细地参考本发明的优选实施方案。虽然结合优选实施方案描述本发明，但应理解其无意将本发明限定于此类优选实施方案。相反地，其意欲覆盖选择、变化和等同物，这可包括在通过所附权利要求定义的本发明的精神和范围内。
II.环境影响剂
本发明提供了通过施用环境影响剂治疗代谢障碍的方法。“环境影响剂”(Env-influence)为以允许人的疾病环境改变、重建回或维持正常或健康环境(从而导致正常状态)的有益方式影响或调节人的疾病环境。环境影响剂包括如下定义的多维细胞内分子(MIM)和表观代谢转变剂(Epi-shifter)。
1.多维细胞内分子(MIM)
术语“多维细胞内分子(MIM)”是由身体天然产生的和/或存在于人的至少一个细胞中的内源分子的分离形式或合成产生的形式。MIM的特征在于1个或多个、2个或更多个、3个或更多个或全部下列功能。MIM能够进入细胞，进入细胞细胞包括完全或部分进入细胞，只要所述分子的生物活性部分完全进入细胞即可。MIM能够在细胞内诱导信号转导和/或基因表达机制。MIM是多维的，因为所述分子具有治疗和载体例如药物递送作用。MIM也是多维的，因为所述分子在疾病状态中以一种方式作用并且在正常状态中以不同方式作用。例如，在CoQ-10的情况中，在VEGF存在的情况下给黑素瘤细胞施用CoQ-10导致降低的Bcl2水平，这反过来导致减小的黑素瘤细胞的致癌潜能。相反地，在正常成纤维细胞中，CoQ-10和VEFG的共施用对Bcl2的水平无作用。优选，MIM选择性作用于疾病状态的细胞，并且在正常状态的(匹配)细胞中基本上没有作用。优选，MIM选择性地使疾病状态的细胞在表型、代谢状态、基因型、mRNA/蛋白质表达水平等上与正常状态的(匹配)细胞更接近。
在一个实施方案中，MIM也是表观代谢转变剂。在另一个实施方案中，MIM不是表观代谢转变剂。本领域技术人员应理解，本发明的MIM也意欲包括两种或更多种内源分子的混合物，其中所述混合物的特征在于一种或多种上述功能。混合物中的内源分子以以使混合物用作MIM的比率存在。
MIM可以是基于脂质或基于非脂质的分子。MIM的实例包括但不限于CoQ10、乙酰Co-A、棕榈酰Co-A、L-肉毒碱、氨基酸例如酪氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸。在一个实施方案中，MIM为小分子。在本发明的一个实施方案中，MIM不是CoQ10。MIM可由本领域技术人员使用本文中详细描述的任何测定常规地鉴定。
在某些实施方案中，MIM包括维生素B家族中的化合物或包含维生素B家族中的化合物的核苷、单核苷酸或二核苷酸。维生素B家族中的化合物包括例如硫胺素(维生素B1)、尼克酸(也称为烟酸或维生素B3)或吡哆素(维生素B6)以及维生素原例如泛醇(维生素原B5)。在某些实施方案中，MIM选自硫胺素、尼克酸和吡哆素。包含维生素B家族的化合物的核苷、单核苷酸或二核苷酸包括例如包含腺嘌呤或尼克酸(烟酸)分子的核苷、单核苷酸或二核苷酸。在某些实施方案中，MIM选自腺苷、腺苷二磷酸(ADP)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD，其包含部分维生素B2和ADP)和烟酸二核苷酸。
在其他实施方案中，MIM包括氨基酸。氨基酸的实例包括例如酪氨酸(例如，L-酪氨酸)、半胱氨酸、苯丙氨酸(例如，L-苯丙氨酸)和丙氨酸。在某些实施方案中，氨基酸是苯丙氨酸或丙氨酸。在某些实施方案中，MIM包括氨基酸衍生物例如4-羟基苯丙酮酸酯或乙酰甘氨酸。
在某些实施方案中，MIM是葡萄糖类似物，例如，其中一个-OH或-CH2OH取代基已被-COOH、-COO-或-NH2取代基取代的葡萄糖分子。葡萄糖类似物的实例包括葡糖胺、葡糖醛酸、葡糖苷酸和葡糖醛酸酯。
在某些实施方案中，MIM选自式(I)的化合物：
其中
n为0或1的整数；
R1、R2、R3和R4，当存在时，各自独立地选自氢和羟基或者R1和R2与它们所连接的碳一起形成羰基(C＝O)基团；
W为-COOH或-N(CH3)3 +；和
X为氢、负电荷或碱金属阳离子例如Na+或。
应理解，当n为0时，CHR3基与W取代基连接。
在某些实施方案中，W为-N(CH3)3 +。在某些实施方案中，所述MIM是肉毒碱例如L-肉毒碱。
在某些实施方案中，所述MIM为二羧酸。在某些实施方案中，W为-COOH。在某些实施方案中，R3为氢。在某些实施方案中，n为0。在某些实施方案中，R1和R2各自独立地是氢。在某些实施方案中，W为-COOH，R3为氢，n为0并且R1和R2各自独立地是氢。在某些实施方案中，n为1。在某些实施方案中，R1和R2与它们所连接的碳一起形成羰基(C＝O)基团。在某些实施方案中，R4为氢。在某些实施方案中，R4为羟基。在某些实施方案中，W为-COOH，R3为氢，n为1并且R1和R2与它们所连接的碳一起形成羰基(C＝O)基团。
在某些实施方案中，所述MIM是克雷布斯循环(Krebs Cycle)的中间产物，过量的MIM驱动克雷布斯循环朝向产生性氧化磷酸化。为MIM的示例性克雷布斯循环中间产物包括琥珀酸或琥珀酸盐、苹果酸或苹果酸盐以及α-酮戊二酸或α-酮戊二酸盐。
在某些实施方案中，所述MIM是CoQ10的结构单元，其具有下列结构：
Figure BPA00001497288600211
因此，CoQ10的结构单元包括但不限于苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸酯、乙酸苯酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯、香草酸、4-羟基苯甲酸酯、甲羟戊酸、法呢基、2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌以及其相应的酸或离子。在某些实施方案中，所述MIM选自苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸酯、乙酸苯酯和4-羟基苯甲酸酯。
(i)鉴定MIM的方法
本发明提供了用于鉴定MIM的方法。用于鉴定MIM的方法通常包括向细胞外源加入内源分子和评估该内源分子提供的对细胞的效应，例如，细胞微环境特征谱。以细胞mRNA、蛋白质、脂质和/或代谢水平的一个或多个评估对细胞的效应以鉴定细胞微环境特征谱的改变。在一个实施方案中，所述细胞是例如体外培养的细胞。在一个实施方案中，所述细胞存在于生物中。可以以单个浓度将所述内源分子加入细胞或可以以一系列浓度将其加入细胞。在一个实施方案中，将所述内源分子加入细胞以便细胞中内源分子的水平与对照未处理细胞中所述内源分子的水平相比较升高(例如，升高至1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或更高)。
可进一步评估诱导细胞的变化(如通过例如形态学、生理学和/或组成(例如，mRNA、蛋白质、脂质、代谢产物)的任一项或多项的改变所检测的)的分子以确定诱导的对细胞微环境特征谱的改变在患病细胞状态与正常细胞状态之间是否不同。可评估多种组织来源、细胞类型或疾病状态的细胞(例如，细胞培养系)以进行比较评价。例如，可将诱导的癌细胞的细胞微环境特征谱的变化与对非癌细胞或正常细胞诱导的变化相比较。被观察到诱导细胞的微环境特征谱的变化(例如，诱导细胞的形态学、生理学和/或组成例如mRNA、蛋白质、脂质或代谢产物的变化)和/或差异(例如，优选地)诱导相对于正常细胞患病细胞的微环境特征谱的变化的内源分子被鉴定为MIM。
本发明的MIM可以为基于脂质的MIM或基于非脂质的MIM。用于鉴定基于脂质的MIM的方法包括基于上述细胞的方法，其中向细胞中外源加入基于脂质的内源分子。在优选实施方案中，向细胞中加入基于脂质的内源分子，以便细胞中基于脂质的内源分子的水平升高。在一个实施方案中，基于脂质的内源分子的水平与未处理的对照细胞中的水平相比较增加至1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或更高。基于脂质的分子的配制和至细胞的递送视所测试的每一种分子的性质而定，但许多方法在本领域内是已知的。基于脂质的分子的配制和递送的实例包括但不限于利用共溶剂、载体分子、脂质体、分散体、悬浮剂、纳米颗粒分散体、乳化例如水包油或油包水乳剂、多相乳剂例如水包油-油包水乳剂、聚合物捕获和封装的增溶作用。基于脂质的MIM至细胞的递送可通过提取细胞脂质和利用本领域内已知的常规方法例如质谱法定量MIM来确认。
用于鉴定基于非脂质的MIM的方法包括上述基于细胞的方法，其中将基于非脂质的内源分子加入细胞。在优选实施方案中，将基于非脂质的内源分子加入内源细胞以便细胞中基于非脂质的内源分子的水平升高。在一个实施方案中，基于非脂质的内源分子的水平与未处理的对照细胞中的水平相比较升高至1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或更高。基于非脂质的分子的配制和至细胞的递送取决于每一种测试的分子的性质，但许多方法本领域内是已知的。基于非脂质的分子的配制和递送模式的实例包括但不限于利用共溶剂、载体分子的增溶作用、主动运输、聚合物捕获或吸附、聚合物接枝(polymergrafting)、脂质体封装和利用靶向递送系统的配制。基于非脂质的MIM至细胞的递送可通过提取细胞内容物和利用本领域内已知的常规方法例如质谱法定量MIM来确认。
2.表观代谢转变剂(Epi-shifter)
如本文中所使用的，“表观代谢转变剂”(epi-shifter)是调节从健康(或正常)状态至疾病状态以及反之亦然的代谢转变，从而维持或重建人的组织、器官、系统和/或宿主健康的分子(内源或外源的)。表观代谢转变剂能够实现组织微环境的标准化。例如，表观代谢转变剂包括当加入细胞或从细胞去除时能够影响细胞的微环境(例如，代谢状态)的任何分子。本领域技术人员应理解本发明的表观代谢转变剂也意在包括两种或更多种分子的混合物，其中所述混合物的特征在于上述功能的一个或多个功能。混合物中的分子以使混合物用作表观代谢转变剂的比率存在。表观代谢转变剂的实例包括但不限于coQ-10；维生素D3；ECM成分例如纤连蛋白；免疫调节剂例如TNFa或白细胞介素例如IL-5、IL-12、IL-23的任一个；血管生成因子；和细胞凋亡因子。
在某些实施方案中，所述表观代谢转变剂为酶，例如直接参与催化克雷布斯循环中的一个或多个反应或产生克雷布斯循环中间产物的酶，其的过量驱动克雷布斯循环。在某些实施方案中，所述酶为戊糖磷酸途径的非氧化相的酶，例如转醛醇酶或转酮醇酶。在其他实施方案中，所述酶为促进克雷布斯循环的组分酶或酶复合物例如合酶或连接酶。示例性酶包括琥珀酰CoA合酶(克雷布斯循环)或丙酮酸羧化酶(催化丙酮酸的可逆羧化以形成草酰乙酸盐(OAA)(克雷布斯循环的中间产物)的连接酶)。
在某些实施方案中，所述表观代谢转变剂为CoQ10的结构单元。CoQ10的结构单元包括但不限于苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸酯、乙酸苯酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯、香草酸、4-羟基苯甲酸酯、甲羟戊酸、法呢基、2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌以及其相应的酸或离子。在某些实施方案中，所述表观代谢转变剂选自苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸酯、乙酸苯酯和4-羟基苯甲酸酯。
在某些实施方案中，所述表观代谢转变剂是维生素B家族中的化合物。维生素B家族中的化合物包括例如核黄素(维生素B2)或其类似物。表观代谢转变剂也包括可在体内被代谢成任何内源MIM例如本文中描述的MIM的任何类似物或前体药物。
在一个实施方案中，所述表观代谢转变剂也是MIM。在一个实施方案中，所述表观代谢转变剂不是CoQ10。表观代谢转变剂可由本领域技术人员使用本文中详细描述的任何测定法来常规地鉴定。
(i)鉴定表观代谢转变剂的方法
表观代谢转变剂(epi-shifter)是能够调节细胞的代谢状态，例如诱导健康(或正常)状态至疾病状态的代谢转变和反之亦然，从而能够在人中维持或建立细胞、组织、器官、系统和/或宿主健康的分子。本发明的表观代谢转变剂从而在患病状态的诊断评估中具有效用。本发明的表观代谢转变剂还在治疗应用中具有效用，其中表观代谢转变剂的应用或施用(或利用其他治疗性分子调节表观代谢转变剂)实现了组织微环境和疾病状态的正常化。
表观代谢转变剂的鉴定通常包括建立展示差异疾病状态、进展或侵袭性的一组细胞或组织的代谢产物、脂质、蛋白质或RNA的分子特征谱(以单个特征谱或组合形式存在)。根据特征谱对于其水平的变化(例如，升高的或下降的水平)与疾病状态、进展或侵袭性相关的分子被鉴定为潜在的表观代谢转变剂。
在一个实施方案中，表观代谢转变剂也为MIM。可通过使用本领域内已知的许多常规技术和通过使用本文中描述的任何方法评估潜在的表观代谢转变剂在外源加入细胞后进入细胞的能力。例如，潜在的表观代谢转变剂至细胞内的进入可通过提取细胞内容物和通过本领域内已知的常规方法例如质谱法定量潜在的表观代谢转变剂来确认。能够进入细胞的潜在的表观代谢转变剂从而被鉴定为MIM。
为了鉴定表观代谢转变剂，随后评估潜在的表观代谢转变剂转变细胞的代谢状态的能力。通过将潜在的表观代谢转变剂引入(例如，外源加入)细胞，然后监控细胞中如下的一项或多项：基因表达的变化(例如，mRNA或蛋白质表达的变化)、脂质或代谢产物水平的浓度变化、生物能分子水平的变化、细胞能量的变化和/或线粒体功能或数量的变化。能够转变细胞微环境的代谢状态的潜在的表观代谢转变剂可由本领域技术人员利用本文中详细描述的任何测定法来常规鉴定。还评估了潜在的表观代谢转变剂将患病细胞的代谢状态向正常健康状态转变的能力(或相反地，将正常细胞的代谢状态向患病细胞转变的能力)。能够将患病细胞的代谢状态向正常健康状态转变(或将健康正常细胞的代谢状态向患病状态转变)的潜在的表观代谢转变剂从而被鉴定为表观代谢转变剂。在优选实施方案中，所述表观代谢转变剂对正常细胞的健康和/或生长没有负面影响。
本发明的表观代谢转变剂包括但不限于小分子代谢产物、基于脂质的分子以及蛋白质和RNA。为了在小分子内源代谢产物的种类中鉴定表观代谢转变剂，建立展示差异疾病状态、进展或侵袭性的一组细胞或组织的脂质特征谱。通过从细胞或组织提取代谢产物，然后使用本领域技术人员已知的常规方法(包括液相色谱偶联质谱法或气相色谱偶联质谱法)鉴定和定量代谢产物测定每一种细胞或组织的代谢产物特征谱。对于其水平的改变(例如，升高或降低的水平)与疾病状态、进展或侵袭性相关的代谢产物被鉴定为潜在的表观代谢转变剂。
为了在基于内源性脂质的分子的种类中鉴定表观代谢转变剂，建立展示差异疾病状态、进展或侵袭性的一组细胞或组织的脂质特征谱。通过使用脂质提取法，然后使用对于本领域技术人员来说是已知的常规方法(包括例如，液相色谱偶联质谱法或气相色谱偶联质谱法)鉴定和定量脂质来测定每一种细胞或组织的脂质特征谱。对于其水平的改变(例如，大量或痕量水平的升高或降低)与疾病状态、进展或侵袭性相关的脂质被鉴定为潜在的表观代谢转变剂。
为了在蛋白质和RNA的种类中鉴定表观代谢转变剂，建立展示差异疾病状态、进展或侵袭性的一组细胞或组织的基因表达特征谱。利用标准蛋白质组学、mRNA阵列或基因组阵列方法，例如本文中详细描述的方法在mRNA和/或蛋白质水平上测定每一种细胞或组织的表达特征谱。对于其表达的改变(例如在mRNA或蛋白质水平上表达的增加或减少)与疾病状态、进展或侵袭性相关的基因被鉴定为潜在的表观代谢转变剂。
一旦建立上述分子的特征谱(例如，对于可溶性代谢产物、基于脂质的分子、蛋白质、RNA或组合物的其他生物学种类)，就可进行细胞和生物化学途径分析以阐明细胞环境中已鉴定的潜在的表观代谢转变剂之间的已知联系。通过这样的细胞和/或生物化学途径分析获得的该信息可用于分类所述途径和潜在的表观代谢转变剂。
可由本领域技术人员使用本领域内已知或本文中详细描述的许多测定法来评估和确认表观代谢转变剂调节疾病状态的效用。可通过表观代谢转变剂至细胞或至生物体的直接外源递送来评估表观代谢转变剂调节疾病状态的效用。可选地可通过直接调节表观代谢转变剂(例如，表观代谢转变剂的水平或活性)的分子的产生来评估表观代谢转变剂调节疾病状态的效用。还可通过经由调控位于与所述表观代谢转变剂相同的途径中的其他分子例如基因(例如，以RNA或蛋白质水平被调控的)间接调节表观代谢转变剂(例如，表观代谢转变剂的水平或活性)的分子的产生来评估表观代谢转变剂调节疾病状态的效用。，
本文中描述的表观代谢法促进存在于细胞微环境中并且其水平通过基于遗传学、mRNA或蛋白质的机制来感知和控制的内源分子的鉴定。正常细胞中发现的受本发明的表观代谢转变剂触发的调控反应途径可在失调的(misregulated)或患病的细胞环境中提供治疗价值。此外，本文中描述的表观代谢途径鉴定了可提供用于临床患者选择、疾病诊断试剂盒的诊断指示或作为预后指标的表观代谢转变剂。
在某些实施方案中，本文中公开的MIM和表观代谢转变剂不包括常规用作食品补充剂的MIM和表观代谢转变剂。在某些实施方案中，本文中公开的此类MIM和/或表观代谢转变剂为药物级的。在某些实施方案中，药物级的MIM和/或表观代谢转变剂具有约95％至约100％的纯度并且包括95％与100％之间的所有值。在某些实施方案中，MIM和/或表观代谢转变剂之间的纯度为95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.9或100％。在某些实施方案中，MIM和/或表观代谢转变剂不含或基本上不含内毒素。在其他实施方案中，MIM和/或表观代谢转变剂不含或基本上不含外源蛋白质材料。在某些实施方案中，MIM和/或表观代谢转变剂为CoQ10。
III.用于鉴定MIM/表观代谢转变剂的测定法
用于分离和鉴定目的分子和化合物的本发明的技术和方法包括但不限于：液相色谱法(LC)、高压液相色谱法(HPLC)、质量光谱法(MS)、气相色谱法(GC)、液相色谱/质谱法(LC-MS)、气相色谱/质谱法(GC-MS)、核磁共振(NMR)、磁共振成像(MRI)、傅里叶变换红外法(Fourier Transform InfraRed)(FT-IR)和电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry)(ICP-MS)。还应理解，质谱技术包括但不限于扇形磁场和双聚焦仪、传输四极子仪(transmission quadrapole instrument)、四极离子阱仪(quadrupoleion-trap instrument)、飞行时间仪(time-of-flight instrument)(TOF)、傅里叶变换离子回旋共振仪(Fourier transform ion cyclotron resonanceinstrument)(FT-MS)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的使用。
生物能分子水平的定量：
环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)可利用候选表观代谢转变剂所施用至的细胞的细胞生物能分子水平(例如，ATP、丙酮酸盐、ADP、NADH、NAD、NADPH、NADP、乙酰CoA、FADH2)的变化来鉴定。生物能分子水平的示例性测定使用基于比色、荧光和/或生物发光的方法。下面提供此类测定法的实例。
利用本领域内已知的许多测定法和系统测量细胞内的ATP水平。例如，在一个系统中，从裂解的细胞释放的细胞质ATP与萤光素和荧光素酶反应以产生光。利用生物发光计测量该生物发光，并且可计算裂解细胞的细胞内ATP浓度(EnzyLightTM ATP Assay试剂盒(EATP-100)，BioAssay Systems，Hayward，CA)。在另一个系统中，例如，通过生物发光计算ATP和其脱磷酸化形式；在计算ATP水平后，将ADP转化成ATP，随后使用相同的荧光素酶系统(ApoSENSORTM ADP/ATP Ratio Assay试剂盒，BioVision Inc.，Mountain View，CA)进行检测和计算。
丙酮酸盐是细胞代谢途径中的重要中间产物。取决于细胞的代谢状态，丙酮酸盐可通过糖异生作用转化成碳水化合物，通过乙酰CoA转化成脂肪酸或被代谢，或转化成丙酮酸或乙醇。因此丙酮酸盐水平的检测提供了细胞样品的代谢活性和状态的量度。例如，一种检测丙酮酸盐的测定法使用比色法和荧光法检测不同范围内的丙酮酸盐浓度(EnzyChromTM Pyruvate Assay试剂盒(Cat#EPYR-100)，BioAssaySystems，Hayward，CA)。
环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)可影响由细胞的线粒体进行的氧化磷酸化的过程，该过程牵涉生物能分子在细胞中的产生和维持。除了直接检测细胞培养物和样品中细胞能的变化的测定法(下文中描述的)外，存在检测和定量化合物对细胞中线粒体的分离酶和复合物的效应的测定。例如，MT-OXC MitoToxTM CompleteOXPHOS活性测定法(MitoSciences Inc.，Eugene，OR)可检测和定量直接用于从线粒体提取的复合物I至V的化合物的效应。用于检测和定量对单个线粒体复合物例如NADH脱氢酶(复合物I)、细胞色素c氧化酶(复合物IV)和ATP合酶(复合物V)的效应的测定法也是可获得的(MitoSciences Inc.，Eugene，OR)。
细胞能量的测量：
环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)还可通过细胞能量的的变化来鉴定。一个测量细胞能量的实例是分子氧的消耗和/或细胞培养的培养基的pH的变化的实时测量。例如，潜在的表观代谢转变剂调节细胞的代谢状态的能力可使用例如XF24分析仪(Seahorse，Inc.)来进行分析。该技术允许实时检测细胞单层的氧和pH的变化以估计细胞微环境的生物能。XF24分析仪测量和比较氧消耗(OCR)的速率(其为有氧代谢的量度)和细胞外酸化(ECAR)(其为糖酵解的量度)，两者都为细胞能量的至关重要的指示剂。
氧化磷酸化和线粒体功能的测量
氧化磷酸化是籍以通过营养化合物的氧化产生ATP的过程，该过程在真核生物中通过嵌入线粒体的膜中的蛋白质复合物进行。作为大多数生物的细胞中ATP的主要来源，氧化磷酸化活性的变化可强有力地改变细胞内的代谢和能量平衡。在本发明的某些实施方案中，可通过它们对氧化磷酸化的效应来检测和/或鉴定环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。在某些实施方案中，可通过它们对氧化磷酸化的特定方面(包括但不限于电子传递链和ATP合酶)的效应来检测和/或鉴定环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。
进行牵涉氧化磷酸化的过程的线粒体的嵌入膜的蛋白质复合物执行特殊任务并且被编号为I、II、III和IV。这些复合物与跨内膜ATP合酶(也称为复合物V)一起是参与氧化磷酸化过程的至关重要的实体。除了可检查环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)对线粒体总体功能和具体地氧化磷酸化过程的效应的测定法外，可用于检查表观代谢转变剂对与其他复合物分离的单个复合物的效应的测定是可获得的。
复合物I，也称为NADH-辅酶Q氧化还原酶类或NADH脱氢酶是电子传递链中的第一蛋白质。在某些实施方案中，可检测和定量表观代谢转变剂对NAD+的产生的效应。例如，可在96孔板中从样品免疫捕获复合物；NADH至NAD+的氧化与染料分子的还原同时发生，所述染料分子在450nm具有增加的吸光度(复合物I酶活性微量板测定试剂盒，MitoSciences Inc.，Eugene，OR)。
复合物IV，也称为细胞色素c氧化酶(COX)，是电子传递链中的最后一个蛋白质。在某些实施方案中，可检测和定量表观代谢转变剂对细胞色素c的氧化和通过复合物IV进行的氧至水的还原的效应。例如，可在微孔板中免疫捕获COX，利用比色测定法(复合物I酶活性微量板测定试剂盒，MitoSciences Inc.，Eugene，OR)测量COX的氧化。
氧化磷酸化过程中的末端酶为ATP合酶(复合物V)，其使用通过其他复合物产生的质子梯度为从ADP合成ATP提供动力。在某些实施方案中，可检测和定量表观代谢转变剂对ATP合酶的活性的影响。例如，可对已被免疫捕获在微量板孔中的ATP合酶测量ATP合酶的活性和样品中ATP合酶的量。所述酶还可在某些条件下用作ATP酶，从而在该测定中对于ATP合酶活性，通过检测NADH至NAD+的同时氧化测量来测量ATP被还原成ADP的速率。使用针对ATP酶的标记的抗体(ATP合酶双重(活性+数量)微量板测定试剂盒，MitoSciencesInc.，Eugene，OR)计算ATP的量。用于氧化磷酸化的另外的测定包括测试对复合物II和III的活性的影响的测定法。例如，MT-OXCMitoToxTM Complete OXPHOS系统(MitoSciences Inc.，Eugene，OR)可用于评估化合物对复合物II和III以及复合物I、IV和V的效应，以提供关于化合物对整个氧化磷酸化系统的效应的数据。
如上所述，可使用探针就氧耗量和细胞培养基的pH的变化进行完整细胞样品的实时观察。细胞能量的这些测定提供了线粒体功能和潜在的环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)对样品的细胞内的线粒体的活性的影响的全面纵览。
环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)还可影响线粒体透性转变(MPT)，其中线粒体膜因线粒体透性转变孔(MPTP)的形成而经历通透性的增加的现象。线粒体通透性的增加可导致线粒体肿胀，不能进行氧化磷酸化和ATP产生并且导致细胞死亡。MPT可参与细胞凋亡的诱导。(参见，例如，Halestrap，A.P.，Biochem.Soc.Trans.34：232-237(2006)和Lena，A.等人Journal of Translational Med.7：13-26(2009)，通过引用将其整体并入本文)。
在某些实施方案中，测量环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)对MPT和MPTP的形成、中止和/或效应的作用的检测和定量。例如，测定法可通过使用专门的染料分子(钙黄绿素)检测MPT，所述MPT位于线粒体的内膜和其他细胞溶胶区室中。另一种分子CoCl2的施用用于猝灭细胞溶胶中的钙黄绿素染料的荧光。然而CoCl2不能进入线粒体的内部，从而除非MPT已发生并且CoCl2可通过MPTP进入线粒体的内部，否则线粒体中的钙黄绿素荧光不被猝灭。线粒体特异性荧光的消失表示MPT已发生。流式细胞术可用于评估细胞和细胞器荧光(MitoProbeTM Transition Pore Assay试剂盒，MolecularProbes，Eugene，OR)。其他测定法利用荧光显微镜评估实验结果(Image-iTTM LIVE线粒体Transition Pore Assay试剂盒，MolecularProbes，Eugene，OR)。
细胞增殖和炎症的测量
在本发明的某些实施方案中，可通过它们对与细胞增殖和/或炎症相关的分子的产生或活性鉴定和评估环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。此类分子包括但不限于细胞因子、生长因子、激素、细胞外基质的成分、趋化因子、神经肽类、神经递质、神经营养素和参与细胞信号转导的其他分子，以及细胞内分子例如参与信号转导的细胞内分子。
血管内皮生长因子(VEGF)是具有有效的血管生成、形成血管和促有丝分裂性质的生长因子。VEGF刺激内皮通透性和肿胀，并且VEGF活性牵涉许多疾病和障碍，包括类风湿性关节炎、转移癌、年龄相关性黄斑退化症和糖尿病视网膜病变。
在本发明的某些实施方案中，可通过其对VEGF的产生的效应来鉴定和表征环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。例如，维持在低氧条件或模拟酸中毒的条件中的细胞可展示增加的VEGF产生。可使用ELISA或其他基于抗体的测定法，利用可获得的抗VEGF抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)测定分泌至培养中的VEGF。在本发明的某些实施方案中，可基于其对细胞对VEGF的反应性的效应和/或基于其对VEGF受体的表达或活性的效应鉴定和/或表征表观代谢转变剂。
健康免疫系统功能以及自身免疫性疾病中所牵涉的肿瘤坏死因子(TNF)是炎症和免疫系统活化的至关重要的介体。在本发明的某些实施方案中，表观代谢转变剂可通过其对TNF的产生或活性的效应来鉴定和表征。例如，可通过ELISA和本领域内已知的其他基于抗体的测定法来定量由培养细胞产生的并且分泌至培养基中的TNF。此外，在某些实施方案中，可通过其对TNF的受体的表达的效应来鉴定和表征环境影响剂(Human TNF RI Duoset，R&D Systems，Minneapolis，MN)。
细胞外基质(ECM)的成分在细胞和组织的结构中和在信号转导过程中起着重要作用。例如，潜在的转化生长因子β结合蛋白为在ECM中产生转化生长因子β(TGFβ)的储库的ECM成分。基质结合的TGFβ随后可在基质重塑过程中被释放并且可对附近的细胞发挥生长因子效应(Dallas，S.Methods in Mol.Biol.139：231-243(2000))。
在某些实施方案中，可通过其对ECM的培养细胞产生的作用鉴定或表征环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。研究者已开发了可籍以研究和定量ECM的细胞产生以及ECM的组成的技术。例如，可通过将在温育之前将细胞包埋在水凝胶中来评估ECM的细胞合成。在细胞收获和水凝胶降解后对由细胞产生的ECM进行生物化学和其他分析(Strehin，I.和Elisseeff，J.Methods in Mol.Bio.522：349-362(2009))。
在某些实施方案中，可鉴定或表征环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)对生物体中ECM或其成分之一的产生、状态或缺乏的效应。已开发了用于产生条件敲除(KO)小鼠的技术，所述技术允许只在不连续类型的细胞中或在发育的某些阶段上敲除特定ECM基因(Brancaccio，M.等人Methods in Mol Bio.522：15-50(2009))。从而可在特定组织中或在发育的特定阶段上评估表观代谢转变剂或潜在的表观代谢转变剂的应用或施用对特定ECM成分的活性或不存在的效应。
质膜完整性和细胞死亡的测量
可通过细胞样品的质膜完整性的变化和/或通过经历细胞凋亡、坏死或显示增加的或减少的细胞死亡概率的细胞变化的细胞数量或百分比的变化鉴定环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。
用于乳酸脱氢酶(LDH)的测定法可提供细胞状态和损伤水平的测量。LDH是稳定的和相对丰富的细胞质酶。当质膜失去物理完整性时，LDH逸出至细胞外区室。更高浓度的LDH与更高水平的质膜损伤和细胞死亡相关。LDH测定法的实例包括使用比色系统检测和定量样品中的LDH水平的测定法，其中四唑盐的还原形式通过LDH酶(QuantiChromTM Lactate Dehydrogenase试剂盒(DLDH-100)，BioAssay Systems，Hayward，CA；LDH Cytotoxicity Detection试剂盒，Clontech，Mountain View，CA)的活性产生。
细胞凋亡是可具有多种不同起始事件的程序化细胞死亡的过程。许多测定法可检测经历细胞凋亡的速度和/或数量的变化。一种用于检测和定量细胞凋亡的测定法是半胱天冬酶(capase)测定法。半胱天冬酶是在细胞凋亡过程中通过蛋白水解切割激活的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。检测激活的半胱天冬酶的测定法的实例包括(OncoImmunin，Inc.，Gaithersburg，MD)和半胱天冬酶3/7测定系统(Promega Corp.，Madison，WI)。可检测比较样品中细胞凋亡和经历细胞凋亡的细胞的百分比或数量的变化的另外的测定法包括TUNEL/DNA片段化测定。此类测定检测在细胞凋亡的执行阶段由核酸酶产生的180至200个碱基对的DNA片段。示例性TUNEL/DNA片段化测定包括In Situ Cell Death Detection试剂盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)和DeadEndTM比色及荧光TUNEL系统(Promega Corp.，Madison，WI)。
某些细胞凋亡测定法检测和定量与细胞凋亡和/或非细胞凋亡状态相关的蛋白质。例如，MultiTox-Fluor Multiplex细胞毒性测定法(Promega Corp.，Madison，WI)利用单一底物荧光系统检测和定量特异于活细胞和死亡细胞的蛋白酶，从而提供细胞或组织样品中活细胞对已经历细胞凋亡的细胞的比率。
可获得用于检测和定量细胞凋亡的另外的测定法包括检测细胞通透性的测定法(例如，APOPercentageTM APOPTOSIS测定，Biocolor，UK)和用于钙磷脂结合蛋白V的测定法(例如，Annexin V-BiotinApoptosis Detection试剂盒，BioVision Inc.，Mountain View，CA)。
IV.代谢障碍的治疗
在某些实施方案中，本发明的化合物例如本文中描述的环境影响剂例如MIM或表观代谢转变剂，可用于治疗有此需要的受试者的辅酶Q10反应性状态。术语“辅酶Q10反应性状态”或“CoQ10反应性状态”包括可通过施用辅酶Q10治疗、预防或改善的疾病、障碍、状态和/或病状。不希望受任何特定理论束缚，并且如本文中进一步描述的，CoQ10被认为至少部分地通过诱导对细胞微环境的代谢转变，例如朝向正常状态细胞中的氧化磷酸化的类型和/或水平的转变来起作用。因此，在某些实施方案中，CoQ10反应性状态是由细胞微环境的改变的代谢引起的状态。在一个实施方案中，CoQ10反应性状态是代谢障碍。辅酶Q10反应性状态包括例如代谢障碍例如肥胖症、糖尿病、糖尿病前期(pre-diabete)、代谢综合征、饱满感和内分泌异常。辅酶Q10反应性状态还包括本文中描述的其他代谢障碍。
在某些实施方案中，本发明的化合物例如本文中描述的MIM或表观代谢转变剂与辅酶Q10共有共同的活性。如本文中所使用的，短语“与辅酶Q10共有共同的活性”是指化合物展示与辅酶Q10的相同或相似的至少一部分的活性的化合物。在某些实施方案中，本发明的化合物展示25％或更多的辅酶Q10的活性。在某些实施方案中，本发明的化合物展示达到并且包括约130％的辅酶Q10的活性。在某些实施方案中，本发明的化合物展示约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％或130％的辅酶Q10的活性。应理解，该段落中所列的每一个值可用术语“约”修饰。此外，应理解由该段落中的任何两个值确定的任何范围意被认为包括在本发明中。例如，在某些实施方案中，本发明的化合物展示约50％至约100％的辅酶Q10的活性。在某些实施方案中，辅酶Q10和本发明的化合物所共有的活性是诱导细胞代谢的转变的能力。在某些实施方案中，CoQ10和本发明的化合物所共的活性利用OCR(耗氧率)和/或ECAR(细胞外酸化率)来测量。
本发明提供了用于治疗哺乳动物的CoQ10反应性障碍、减轻其症状、抑制其进展或预防其的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的包含至少一种环境影响剂(env-influencer)的药物组合物，其中所述环境影响剂在哺乳动物的患病细胞中选择性引发朝向在正常生理条件下在哺乳动物的正常细胞中观察到的糖酵解和线粒体氧化磷酸化的水平的细胞代谢能量转变。
本发明还提供了用于治疗哺乳动物的代谢障碍、减轻其症状、抑制其进展或预防其的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的包含至少一种环境影响剂(env-influencer)的药物组合物，其中所述环境影响剂在哺乳动物的患病细胞中选择性引发朝向标准化的线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变。
本发明还提供了用于在需要治疗代谢障碍的哺乳动物的患病细胞中选择性增加线粒体氧化磷酸化的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的包含至少一种环境影响剂的药物组合物，从而在所述哺乳动物的患病细胞中选择性增加线粒体氧化磷酸化。
本发明还提供了治疗或预防人的代谢障碍的方法，包括以足以治疗或预防代谢障碍的量给有此需要的人施用环境影响剂，从而治疗或预防所述代谢障碍。
本发明还提供了治疗或预防人的代谢障碍的方法，包括选择患有代谢障碍的人受试者，给所述人施用治疗有效量的能够阻断葡萄糖的无氧使用并且增加线粒体氧化磷酸化的环境影响剂，从而治疗或预防所述代谢障碍。
本发明还提供了用于治疗或预防人的代谢障碍的方法，包括以足以治疗或预防代谢障碍的量给所述人施用环境影响剂(env-influencer)，其中以使所述环境影响剂在治疗过程中维持其氧化形式的方式施用所述环境影响剂，从而治疗或预防所述代谢疾病。
所谓的“代谢障碍”是指因患者的代谢改变而引起的任何病理状况。此类障碍包括与异常全身葡萄糖、脂质和/或蛋白质代谢相关的代谢以及从其产生的病理后果。代谢障碍包括因葡萄糖动态平衡的改变而引起的代谢障碍，导致例如高血糖症。根据本发明，葡萄糖水平的改变通常是葡萄糖水平相对于健康个体的该水平增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％。代谢障碍可有害地影响细胞功能例如细胞增殖、生长、分化或迁移、动态平衡的细胞调控、细胞间或细胞内通讯；组织功能，例如肝功能、肌肉功能或脂肪细胞功能；生物体的全身性反应，例如激素反应(例如，胰岛素反应)。代谢障碍包括但不限于肥胖症、糖尿病(在本文中也称为糖尿病(diabetes mellitus))(例如，I型糖尿病、II型糖尿病、MODY和妊娠糖尿病)、糖尿病前期、代谢综合征、饱满感和内分泌异常，例如随年龄增长的内分泌异常。代谢障碍的其他实例包括但不限于摄食过度、食欲过盛、三甘油酯贮存病、巴-比二氏综合征、劳伦斯-穆综合征(Lawrence-Moon syndrome)、普-拉-威综合征(Prader-Labhart-Willi syndrome)、卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayresyndrome)、厌食症、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症和恶病质(cachexia)。在某些实施方案中，代谢障碍是辅酶Q10反应性状态。
″治疗、减轻或预防代谢障碍″是指在其已发生之前或之后缓解这样的病症。与等同的未治疗的对照相比较，这样的缓和或预防的程度为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或100％，如通过任何标准技术测量的。糖尿病是一组异质代谢疾病，其导致血液中葡萄糖的慢性升高(高血糖症)。糖尿病的特征在于导致葡萄糖调节丧失的胰岛破坏或功能障碍。两个主要类型的糖尿病为I型(也称为“胰岛素依赖性糖尿病”(″IDDM″)或″青少年型糖尿病″)和II型(也称为″非胰岛素依赖的″(″NIDDM″)或″成年型糖尿病″)糖尿病。
“I型糖尿病”是指因自身免疫介导的胰腺β细胞的破坏(伴随胰岛素产生的丧失，这导致高血糖症)而引起的状态。I型糖尿病需要胰岛素补偿疗法来确保存活。虽然药物例如可注射胰岛素和口服降糖药允许糖尿病患者活得更长，但糖尿病仍然是位于心脏病和癌症之后的第三大杀手。然而，这些药物对血糖水平的控制不足以防止在高与低血糖水平之间摆动，从而导致对肾、眼和血管的损伤。来自糖尿病控制与并发症试验(DCCT)的数据显示与由每天一次或二次胰岛素注射组成的常规疗法相比较，血糖的强化控制明显延迟糖尿病的并发症，例如网膜病变、肾病和神经病。DCCT的强化治疗包括每天3次或更多次的多次胰岛素注射或通过外部泵进行的胰岛素皮下持续输注(CSII)。胰岛素泵是进行皮下每日多次注射(MDI)以用于胰岛素的接近生理更换的多种可选择的方法之一。
″2型糖尿病″是指其中患者具有大于125mg/dl(6.94mmol/L)的空腹血糖或血清葡萄糖浓度的状态。II型糖尿病的特征在于：在高于正常水平的血浆胰岛素存在的情况下的高血糖症(高胰岛素血症)，其代表90％以上的全部病例并且最常见地在40岁以上的超重成年人中发生。II型糖尿病的进展与不断升高的血糖浓度相关，伴随着葡萄糖诱导的胰岛素分泌率的相对下降。在II型糖尿病中，控制碳水化合物代谢的组织过程据认为具有减小的对胰岛素的敏感性，从而不因胰岛素产生的缺乏而因减小的对血液中增加的葡萄糖水平的敏感性并且不能通过产生胰岛素来作出反应而发生。可选择地，糖尿病可因介导胰岛素对其靶细胞的作用的分子机制的各种缺陷(例如在它们的细胞表面上缺乏胰岛素受体)而引起。II型糖尿病的治疗从而往往不需要施用胰岛素但可基于饮食和生活方式的改变，通过利用口服降糖药例如磺酰脲的治疗来增强。
″糖尿病前期″是指其中患者易发生2型糖尿病的状态。糖尿病前期将葡萄糖耐量受损的定义扩展至包括具有在gtoreq.100mg/dL的高正常范围内的空腹血糖(Meigs等人，Diabetes 2003 52：1475-1484)和空腹高胰岛素血症(升高的血浆胰岛素浓度)的个体。
″肥胖症″是指其中患者具有等于或大于30kg/m2的BMI的状态。″内脏型肥胖(visceral obesity)″是指男性患者中为1.0以及女性患者中为0.8的腰臀比。在另一个方面，内脏型肥胖定义了胰岛素抵抗和糖尿病前期的发展的风险。
″超重″是指具有大于25kg/m2但小于30kg/m2的BMI的患者。″重量增长″是指与行为习惯或成瘾例如进食过量或暴食、戒烟相关的体重增加或与生物学(生命)改变相关的体重增加，例如与男性的年龄增长和女性的绝经相关的体重增长或妊娠后体重增长。
“代谢综合征”(MS)，也称为综合征X，是指影响身体的其他途径和系统的代谢障碍。最初，代谢综合征被定义为一组代谢障碍(包括肥胖症、胰岛素抵抗、高血压和血脂异常(主要为高甘油三酯血症))，所述代谢障碍协同作用，从而促成心血管疾病。最近(2001)，全美胆固醇教育计划(NCEP)已将“代谢综合征”分类为满足下列5个标准的任何3个：至少110mg/dl的空腹葡萄糖水平、至少150mg/dl的血浆甘油三酯水平(高甘油三酯血症)、男性中低于40mg/dl或女性中低于50mg/dl的HDL胆固醇、至少130/85mm Hg的血压(高血压)和向心性肥胖，向心性肥胖被定义为超过40英寸(对于男性而言)和超过35英寸(对于女性而言)的腹部腰围。目前，存在如下3个其他国际承认的关于代谢障碍综合征的定义：1)世界卫生组织2)美国心脏协会/美国心肺血液研究所(AHA/NHLBI)和3)国际糖尿病联合会(IDF)。WHO、AHA/NHLBI和IDF对代谢综合征的定义与NECP的定义非常相似并且全都使用相同的代谢参数来定义综合征，但WHO还包括胰岛素空腹胰岛素水平的评估(Moebus S等人，CardiovascularDiabetology，6：1-10，2007；Athyros V G等人，Int.J.Cardiology，117：204-210，2007)。然而在这些不同定义之间被分类为具有综合征所需的这些代谢参数的阈值的细微差异可导致特定受试者被分类为具有或不具有根据这些不同定义的综合征的不同分类。同样地，因MS而产生的心血管疾病(CVD)的流行率可根据所使用的定义而变化。(Moebus S等人，Cardiovascular Diabetology，6：1-10，2007；Athyros V G等人，Int.J.Cardiology，117：204-210，2007)。美国糖尿病协会估计每5个超重的人中有1个患有代谢综合征。
在其他方面，代谢障碍由公认的同义词描述，其包括但不限于综合征X、胰岛素抵抗综合征、胰岛素抵抗高血压、代谢高血压综合征、代谢障碍综合征。代谢综合征的组成部分包括但不限于葡萄糖耐受不良、葡萄糖耐量受损、空腹血清葡萄糖受损(impaired fasting serumglucose)、空腹血糖受损(impaired fasting blood glucose)、高胰岛素血症、糖尿病前期、肥胖症、内脏型肥胖、高甘油三酯血症、升高的游离脂肪酸类血清浓度、升高的C反应蛋白血清浓度、升高的脂蛋白(a)血清浓度、升高的高半胱氨酸血清浓度、升高的小而密度低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇血清浓度、升高的脂蛋白脂蛋白相关磷脂酶(A2)血清浓度、减小的高密度脂蛋白(HDL)-胆固醇血清浓度、减小的HDL(2b)-胆固醇血清浓度、减小的脂联素血清浓度和白蛋白尿(参见：Pershadsingh HA.Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma：therapeutic target for diseases beyond diabetes：quo vadis？Expert OpinInvestig Drugs.(2004)13：215-28，和本文中引用的参考文献)。
上述代谢障碍的″关键因素(element)″包括但不限于空腹葡萄糖受损或葡萄糖耐量受损、增加的腰围、增加的内脏脂肪含量、增加的空腹血浆葡萄糖、增加的空腹血浆甘油三酯、降低的空腹高密度脂蛋白水平、增加的血压、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、心血管疾病(或其组成部分例如动脉硬化、冠状动脉病、周围血管疾病或脑血管病)、充血性心力衰竭、升高的血浆去甲肾上腺素、升高的心血管相关炎症因子、促成血管内皮功能障碍的升高的血浆因子、高脂蛋白血症、动脉硬化或动脉粥样硬化、摄食过度、高血糖症、高脂血症和血压升高或高血压、升高的餐后血浆甘油三酯或游离脂肪酸水平、增强的细胞氧化性应激或其血浆指标、增加的循环高凝状态(circulatinghypercoagulative state)、肝脏脂肪变性(hetaptic steatosis)、肝脏脂肪变性、肾病(包括肾衰竭和肾功能不全)。
″胰岛素抵抗″是指其中需要超过对葡萄糖负荷的正常反应的循环胰岛素水平来维持血常正常状态(Ford等人，JAMA.2002，287：356-9)。胰岛素抵抗和具有胰岛素抵抗的患者对治疗的反应可通过评估胰岛素抵抗的稳态模式评估法(HOMA-IR)评分(胰岛素抵抗的一种可靠指标)(Katsuki等人，Diabetes Care 2001，24：362-5)来进行定量。利用稳态模式评估法(HOMA)-IR评分对胰岛素抵抗的估计可由Galvin等人，Diabet Med 1992，9：921-8中公开的公式计算，其中HOMA-IR＝[空腹血清胰岛素(.μ.U/mL)]X.[空腹血浆葡萄糖(mmol/L)/22.5]。
″高胰岛素血症″被定义为其中具有胰岛素抵抗、血糖正常或不正常的受试者的空腹或餐后血清或血浆胰岛素浓度高于不具有胰岛素抵抗、具有小于1.0(对于男性而言)或小于0.8(对于女性而言)的腰臀比的消瘦个体的正常浓度的状态。
术语″葡萄糖耐量受损″(IGT)用于描述当给予葡萄糖耐量测试时血糖水平具有落在正常与血糖过多之间的个人。这样的个人处于发生糖尿病的更高风险中，尽管不认为他们患有糖尿病。例如，葡萄糖耐量受损是指其中患者的空腹血糖或空腹血清葡萄糖浓度高于110mg/dl但低于126mg/dl(7.00mmol/L)，或者餐后2小时血糖或血清葡萄糖浓度高于140mg/dl(7.78mmol/L)但低于200mg/dl(11.11mmol/L)的状态。
“高血糖症”的状态(高血糖)是其中血糖水平太高的状态。通常当血糖水平升至180mg/dl以上时高血糖症发生。高血糖症的症状包括尿频、过度口渴和在更长的时间跨度上体重减轻。
“低血糖症”的病症(低血糖)是其中血糖水平太低的状态。通常，当血糖水平下降至低于70mg/dl时，低血糖症发生。低血糖症的状态包括心情易变、四肢麻木(特别是在手和手臂中)、意识错乱、颤抖或眩晕。由于当对于可获得的葡萄糖的量存在过量的胰岛素时该状态发生，因此其有时称为胰岛素反应。
(i)代谢障碍的诊断
本发明的方法和组合物对于治疗已被诊断患有或处于患代谢障碍例如糖尿病的风险中的任何患者是有用的。其中代谢障碍(例如糖尿病或肥胖症)的发生将被阻止的患者可以已接受这样的诊断或可以未接受这样的诊断。本领域技术人员应理解，本发明的患者可以已经历标准测试或可以因一个或多个风险因子的存在而已被鉴定(在未检查的情况下)为处于高风险中的患者。
可使用本领域内已知的任何标准方法例如本文中描述的方法进行代谢障碍的诊断。用于诊断糖尿病的方法描述于例如美国专利No.6,537,806(通过引用并入本文)中。可使用例如测量葡萄糖和酮水平(脂肪分解的产物)的尿检验(尿液分析)；测量血液中的葡萄糖水平的测试法；葡萄糖耐量测试(glucose tolerance tests)；和检测从哺乳动物收集的生物样品(例如，血液、血清或尿)中代谢障碍的分子标志特征(例如，在糖尿病的情况下血红蛋白Alc(HbAlc)水平)的测定法诊断和监测糖尿病。
正在进行代谢障碍治疗的患者是医生已将其诊断为具有这样的病症的患者。可通过任何适当的方法例如本文中公开的方法进行诊断。其中糖尿病或肥胖症的发展被阻止的患者可以已接受或可以未接受这样的诊断。本领域技术人员应理解本发明的患者可以已经历标准测试或可以因一个或多个风险因子(例如家族史、肥胖症特别是种族性(例如，非洲裔美国人和西班牙裔美国人)、妊娠糖尿病或分娩重量超过9磅的婴儿、高血压、具有易患肥胖症或糖尿病的病理状态、高胆固醇血液水平、分子标志的存在(例如，自身抗体的存在)和年龄(45岁以上))的存在而已被鉴定(在未检查的情况下)为处于高风险中的患者。当它们的重量超过对于它们的身高来说是理想的最大重量20％(25％，在女性中)或更多时，个体被认为是肥胖的。超重超过100磅的成人被认为是病态肥胖的。肥胖症也被定义为身体质量指数(BMI)超过30kg/m2。
如果随机血浆葡萄糖测试(在一天的任何时间进行的)显示200mg/dL或更高的值，如果空腹血浆葡萄糖测试显示126mg/dL或更高的值(8小时后)，或如果口服葡萄糖耐量试验(OGTT)在于个人已消费含有75克溶解于水中的葡萄糖的饮料后2小时采集的血液样品显示200mg/dL或更高的血浆葡萄糖值，那么患者可被诊断为处于发生糖尿病的风险中或被诊断为患有糖尿病。OGTT测量3小时的时期内每隔一段时间的血浆葡萄糖。理想地，已根据本发明进行治疗的糖尿病患者的血浆葡萄糖水平范围在160至60mg/dL，150至70mg/dL，140至70mg/dL，135至80mg/dL，优选120至180mg/dL内。
任选地，可应用评估先前2和3个月中平均血糖水平的血红蛋白Alc(HbAlc)测试。不具有糖尿病的人通常具有范围在4％至6％之间的HbAlc值。HbAlc每增加1％，血糖水平就增加约30mg/dL并且并发症的风险增加。优选，根据本发明治疗的患者的HbAlc值下降至低于9％，低于7％，低于6％和最优选下降至约5％。因此，正在进行治疗的患者的HbAlc水平相对治疗前的该水平优选低10％、20％、30％、40％、50％或更多。
通常基于在OGTT过程中测量的血浆葡萄糖水平来诊断妊娠糖尿病。由于葡萄糖水平在妊娠过程中通常更低，因此对于妊娠中的糖尿病的诊断的阈值比在妊娠之前相同患者中的更低。如果女性具有两个达到或超过下列数字的任一个的血浆葡萄糖读数，那么她具有妊娠糖尿病：95mg/dL的空腹血浆葡萄糖水平、180mg/dL的1小时水平、155mg/dL的2小时水平或140mg/dL的3小时水平。
酮测试还可用于诊断I型糖尿病。由于当胰岛素不足时酮在血液中积累，因此它们最终在尿中积累。高水平的血酮可导致称为酮酸中毒(ketoacidosis)的严重病症。
根据美国糖尿病协会的指导，由于被诊断为2型糖尿病，个体必需具有高于或等于126mg/dl的空腹血浆葡萄糖水平或高于或等于200mg/dl的2小时口服葡萄糖耐受量试验(OGTT)血浆葡萄糖值(Diabetes Care，26：S5-S20，2003)。
称为糖尿病前期的相关病症被定义为具有高于100mg/dl但低于126mg/dl或者高于140mg/dl但低于200mg/dl的2小时OGTT血浆葡萄糖水平。越来越多的证据表明糖尿病前期状态可以是发生心血管疾病的风险因子(Diabetes Care 26：2910-2914，2003)。糖尿病前期，也称为葡萄糖耐量受损或空腹血糖受损(impaired fasting glucose)是发生2型糖尿病、心血管疾病和死亡的主要风险因子。许多焦点已集中在发展通过有效地治疗糖尿病前期来预防2型糖尿病的发展的治疗干预(Pharmacotherapy，24：362-71，2004)。
肥胖症(通常定义为约大于30kg/m2的人体质量指数)通常与多种病理学状态例如高胰岛素血症、胰岛素抵抗、糖尿病、高血压和血脂异常相关。此类病症的每一个促成了心血管疾病的风险。
与胰岛素抵抗、高血压和血脂异常一起，肥胖症被认为是一起协同作用，从而促成心血管疾病的代谢综合征的组成部分(也称为综合征X)。最近，全美胆固醇教育计划已将代谢综合征分类为满足下列5个标准中的3个：至少110mg/dl的空腹葡萄糖水平、至少150mg/dl的血浆甘油三酯水平(高甘油三酯血症)、男性中低于40mg/dl或女性中低于50mg/dl的HDL胆固醇、至少130/85mm Hg的血压(高血压)和向心性肥胖，向心性肥胖被定义为超过40英寸(对于男性而言)和超过35英寸(对于女性而言)的腹部腰围。
(ii)评估代谢障碍的治疗功效
本领域技术人员认识到，上述测试的任一个或本领域内已知的任何其他测试的使用可用于监测本发明的治疗性治疗的功效。由于血红蛋白Alc(HbAlc)水平的测量是在先前2或3个月中平均血糖的指征，因此该测试可用于监测患者对糖尿病治疗的反应。
本发明的治疗方法在降低患者的葡萄糖水平或脂质水平中是有效的。″降低葡萄糖水平″意指相对于未处理的对照，降低葡萄糖的水平至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。理想地，这样的葡萄糖水平降低至血糖正常的水平，即150至60mg/dL，140至70mg/dL，130至70mg/dL，125至80mg/dL，优选120至80mg/dL。葡萄糖水平的这样的降低可通过增加与葡萄糖从血液的清除相关的生物活性的任一个来获得。因此，具有降低葡萄糖水平的能力的试剂可增加胰岛素产量、分泌或作用。胰岛素作用可以例如通过增加周围组织对葡萄糖的吸收和/或通过减少肝葡萄糖产量来增强。可选择地，本发明的试剂可减少碳水化合物从肠的吸收，改变葡萄糖转运蛋白活性(例如，通过增加GLUT4表达、内在活性或迁移)，增加胰岛素敏感组织的量(例如，通过增加肌细胞或或脂肪细胞分化)或改变脂肪细胞或肌细胞的基因转录(例如，来自代谢途径基因的脂肪细胞表达的因子的分泌改变)。理想地，本发明的试剂增强一个以上的与葡萄糖的清除相关的活性。″降低脂质水平″意指与未处理的对照相比较，降低脂质的水平至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。
″改变胰岛素的信号转导途径以便降低葡萄糖水平″意指改变(通过增加或减小)参与胰岛素信号转导的活性的任一个活性，以便总体结果是葡萄糖从血浆的清除增加。例如，本发明的环境影响剂改变胰岛素信号转导途径，从而引起胰岛素的产量、分泌或作用的增加、葡萄糖被周围组织吸收的增加、肝葡萄糖产量的减少或碳水化合物从肠吸收的减少。
环境影响剂例如表观代谢转变剂的降低葡萄糖水平，从而治疗代谢障碍的能力可使用本领域内已知的标准测定法来评估。例如，可应用鉴定增加葡萄糖吸收的基于细胞的筛选测定法。具体地，可将细胞培养物中的分化的脂肪细胞用于评估表观代谢转变剂在胰岛素刺激时增加葡萄糖吸收的能力，如通过放射标记的葡萄糖检测的。在另一个示例性测定中，使用胰岛素作为正对照，通过条件永生化来源于非糖尿病受试者的细胞所获得的人肌细胞可用于筛查试剂对糖原合成的作用。在治疗之前，对细胞进行血清饥饿，随后在含有放射标志的葡萄糖的无血清培养基中用表观代谢转变剂或对照温育，进行2小时的时间段，之后，测量糖原的合成。示例性测定法进一步描述于实施例中。
V.代谢障碍的治疗靶
本发明提供了用于鉴定代谢障碍的治疗靶的方法。本发明还提供了通过此类方法鉴定的治疗靶。治疗靶的鉴定通常包括对一组细胞或细胞系外源施用环境影响剂或候选环境影响剂，和随后评估与对照未处理的细胞相比较对处理的细胞诱导的变化。被监控的诱导的细胞变化包括但不限于对形态学、生理学或组成的改变，例如细胞的RNA、蛋白质、脂质或代谢产物的水平。作为利用候选环境影响剂的治疗的结果的诱导的细胞变化可通过使用本文中描述的任何测定法来监控。例如，可利用实时PCR阵列评估基因表达在mRNA水平上的变化，而基因表达在蛋白质水平上的变化可通过使用抗体微阵列和2-D凝胶电泳来监控。随后使用途径分析(Ingenuity IPA软件)以及通过回顾已知文献从系统生物学角度评估被鉴定为受候选环境影响剂调节(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上)的基因。接着将被鉴定为潜在治疗靶的基因经历验证测定法例如Western印迹分析、siRNA敲低或重组蛋白质的产生和表征方法。随后将筛选测定法用于鉴定靶的调节剂。治疗靶的调节剂用作代谢障碍的新型治疗剂。可使用本文中详细描述的筛选测定法或通过使用本领域技术人员已知的常规方法常规地鉴定治疗靶的调节剂。
在本文中被鉴定为被MIM/表观代谢转变剂，CoQ10调节的(例如，在mRNA或蛋白质水平上被上调或下调的)基因是本发明的药物靶。本发明的药物靶包括但不限于随后列于本文中的表2-4和6-28以及63-68中的基因。基于本文中由申请人描述的实验的结果，受Q10调节的至关重要的蛋白质与包括转录因子、细胞凋亡反应、戊糖磷酸途径、生物合成途径、氧化性应激(促氧化剂)、膜改变和氧化磷酸化代谢的不同途径或分子组相关或可被分类不同途径或分子组。基于本文中提供的结合，如下概述受CoQ10调节的至关重要的蛋白质。受CoQ10调节的并且为转录因子的至关重要的蛋白质为HNF4α。受CoQ10调控并且与细胞凋亡反应相关的至关重要的蛋白质包括Bcl-xl、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA和cMyc。受CoQ10调控并且与戊糖磷酸途径相关的至关重要的蛋白质为转醛醇酶1。受CoQ10调控并且与生物合成途径相关的至关重要的蛋白质包括COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶和4-羟基苯甲酸酯。受CoQ10调控并且与氧化性应激(促氧化剂)相关的至关重要的蛋白质包括中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A和超氧化物歧化酶2(线粒体)。受CoQ10调控并且与氧化磷酸化代谢相关的至关重要的蛋白质包括细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III和复合物IV。受CoQ10直接或间接调控的其他至关重要的蛋白质包括Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C、钙调蛋白激酶II。
因此，在本发明的一个实施方案中，药物靶可包括HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-羟基苯甲酸酯、中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C、钙调蛋白激酶II。在优选实施方案中，药物靶可包括HNF4A、转醛醇酶、NM23和BSCv。在一个实施方案中，所述药物靶为TNF4A。在一个实施方案中，药物靶是转醛醇酶。在一个实施方案中，所述药物靶为NM23。在一个实施方案中，所述药物靶为BSCv。下面描述用于鉴定已鉴定的药物靶的调节剂的筛选测定法。
VI.筛选测定法
本发明还提供了用于鉴定调节剂即调节本发明的已鉴定的治疗靶的表达和/或活性的候选或测试化合物或试剂(例如，蛋白质、肽、肽模拟物、类肽、小分子或其他药物)的方法(在本文中也称为“筛选测定法”)。此类测定法通常包括本发明的治疗靶与一种或多种测定成分之间的反应。其他成分可以是测试化合物本身或测试化合物与本发明的标记物的天然结合伴侣的组合。通过测定法例如本文中描述的测定法鉴定的化合物可以例如对于治疗或预防代谢障碍是有用的。
用于本发明的筛选测定法的测试化合物可从任何可获得的来源(包括天然和/或合成化合物的系统文库)获得。还可在本领域内已知的组合文库法中利用许多方法的任何方法获得测试化合物，所述组合文库法包括：生物文库；类肽文库(具有肽的功能性但具有抗酶促降解然而仍保持生物活性的新型非肽主链的分子的文库)；参见，例如，Zuckermann等人，1994，J.Med.Chem.37：2678-85)；空间可寻址的平行固相或液相文库；需要重叠合(deconvolution)的合成文库法；′一珠一化合物′文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。生物学文库和类肽文库法限定于肽文库，然而所述其他4个方法适用于化合物的肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam，1997，Anticancer DrugDes.12：145)。
用于分子文库的合成的方法的实例可见于本领域中，例如见于：DeWitt等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Zuckermann等人(1994)。J.Med.Chem.37：2678；Cho等人(1993)Science 261：1303；Carrell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061中；和Gallop等人(1994)J.Med.Chem.37：1233中。
化合物的文库存在于溶液中(例如，Houghten，1992，Biotechniques13：412-421)或珠粒(Lam，1991，Nature 354：82-84)、芯片(Fodor，1993，Nature 364：555-556)、细菌和/或孢子(Ladner，USP 5,223,409)、质粒(Cull等人，1992，Proc Natl Acad Sci USA 89：1865-1869)上或噬菌体上(Scott和Smith，1990，Science 249：386-390；Devlin，1990，Science249：404-406；Cwirla等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382；Felici，1991，J.Mol.Biol.222：301-310；Ladner，同上)。
本发明的筛选方法包括将细胞与测试化合物接触和测定所述测试化合物调节本发明的治疗靶在细胞中的表达和/或活性的能力。本发明的治疗靶的表达和/或活性可如本文中所描述的进行测定。本发明的治疗靶的表达和/或活性还可利用使用本领域技术人员已知的常规方法来测定。在一个实施方案中，基于其增加本发明的治疗靶的表达和/或活性的能力筛选化合物。在一个实施方案中，基于其增加选自表2-4和6-28以及63-68中所列的蛋白质的治疗靶的表达和/或活性的能力选择化合物，其中所述治疗靶被CoQ10上调(例如，展示正倍数改变)。在一个实施方案中，基于其减少本发明的治疗靶的表达和/或活性的能力选择化合物。在一个实施方案中，基于其减少选自表2-4和6-28以及63-68中所列的蛋白质的治疗靶的表达和/或活性的能力选择化合物，其中所述治疗靶被CoQ10下调(例如，展示负倍数改变)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于筛选为本发明的治疗靶或其生物活性部分的底物的候选或测试化合物的测定法。在另一个实施方案中，本发明提供了用于筛选结合本发明的治疗靶或其生物活性部分的候选或测试化合物的测定法。测定测试化合物直接结合治疗靶的能力可以例如通过将所述化合物与放射性同位素或酶促标记偶联(以便化合物与药物靶的结合可通过检测复合物中标记的标记化合物来测定)来实现。例如，可直接或间接地用131I、125I、35S、14C或3H标记化合物(例如，标记底物)，并且通过射电辐射(radioemission)的直接计数或通过闪烁计数检测放射性同位素。可选择地，可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶酶促标记测定成分，并且通过测定适当的底物至产物的转化来检测所述酶促标记。
本发明还涉及通过上述筛选测定法鉴定的新型试剂。因此，进一步在适当的动物模型中使用本文中描述的鉴定的试剂在本发明的范围内。例如，可将能够调节本文中描述的鉴定的本发明的标记的表达和/或活性的试剂用于动物模型以测定利用这样的试剂进行的治疗的功效、毒性或副作用。可选地，可将本文中描述的鉴定的试剂用于动物模型以确定这样的试剂的作用机制。此外，本发明涉及通过上述筛选测定法鉴定的新型试剂用于上述治疗的用途。
VII.药物组合物和药物施用
可将本发明的环境影响剂整合入适合用于给受试者施用的药物组合物中。通常，所述药物组合物包含本发明的环境影响剂和药学上可接受的载体。如本文中所使用的，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等的一种或多种以及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可接受的载体还可包含少量辅助物质例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，所述辅助物质增强环境影响剂的贮存期(shelf life)或功效。
本发明的组合物可以以多种形式存在。此类形式包括例如液体、半固体和固体剂型例如液体溶液(例如，可注射和不溶性溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、乳膏剂、洗剂、软膏剂或糊剂、适合用于给眼、耳或鼻施用的滴剂、脂质体和栓剂。优选形式取决于所需的施用模式和治疗应用。
可通过本领域内已知的多种方法施用本发明的环境影响剂。对于许多治疗应用，优选施用途径/模式是皮肤注射、静脉内注射或输注。正如本领域技术人员所理解的，施用的途径和/或模式可取决于所需结果而变化。在某些实施方案中，可用将保护化合物避免快速释放的载体制备所述活性化合物，例如控制释放制剂，包括埋植剂、皮肤贴剂和微型胶囊化的递送系统。可使用生物可降解的、生物相容性聚合物例如乙烯-醋酸乙烯聚合物、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯类和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利或通常对于本领域技术人员来说是已知的。参见，例如，Sustained和Controlled ReleaseDrug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1978。在一个实施方案中，施用模式是胃肠外途径(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个实施方案中，通过静脉内输注或注射施用环境影响剂。在另一个实施方案中，通过肌内或皮下注射施用环境影响剂。在优选实施方案中，局部施用环境影响剂。
治疗组合物通常在制造和贮存条件下必须是无菌且稳定的。可将组合物配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。可通过将活性化合物(即，环境影响剂)以所需量与上文中列举的成分之一或组合一起掺入适当的溶剂中，根据需要然后过滤灭菌来制备无菌可注射液。通常，通过将活性化合物掺入包含基本分散介质和来自上文中列举的成分的所需其他成分的媒介物来制备分散体。在用于制备无菌可注射液的无菌冻干粉剂的情况下，优选制备方法是真空干燥法和喷雾干燥法，所述干燥法产生活性成分加来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外所需成分的粉剂。溶液的适当流动性可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，通过维持所需颗粒大小(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持。可注射组合物的延长的吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸酯和明胶来产生。
技术和制剂通常可见于雷明顿药物科学(Remmington′sPharmaceutical Sciences)，Meade Publishing Co.，Easton，Pa。对于全身性施用，注射是优选的，包括肌内、静脉内、腹膜内和皮下注射。为了进行注射，可将本发明的化合物配制于液体溶液中，优选生理上相容的缓冲液例如Hank′s液或林格氏液中。此外，可以以固体形式配制化合物，在临用前将其重新溶解或悬浮。也包括冻干形式。
为了口服施用，所述药物组合物可采取例如片剂或胶囊剂的形式，所述片剂或胶囊剂可通过常规方法利用药学上可接受的赋形剂例如粘合剂(例如，预胶化玉蜀黍淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)或湿润剂(例如，月桂基硫酸钠)制备。可利用本领域内公知的方法包被片剂。用于口服施用的液体制剂可采取例如溶液、糖浆剂或悬浮剂的形式，或它们可以以干燥产品(在使用前用水或其他适当的媒介物构建)形式提供。此类液体制剂可通过常规方法利用药学上可接受的添加剂例如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆剂、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如，ationd油、油酯、乙醇或分级分离的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯丙酸或山梨酸)来制备。必要时所述制剂还可包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
可适当地配制用于口服施用的制剂以提供活性化合物的控制释放。为了颊部给药，所述组合物可采取以常规方式配制的片剂或锭剂形式。为了通过吸入施用，可以通过使用适当的喷射剂例如二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当的气体，以气雾喷雾呈递的形式从加压包装或雾化器方便地递送根据本发明使用的化合物。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门以递送按计量的量来确定单位剂量。可配制例如用于吸入器或吹入器的明胶的胶囊和药筒(cartridge)，其包含化合物和适当的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
可配制化合物以用于通过注射，例如通过单次快速静脉注射(bolus injection)或连续输注进行胃肠外施用。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如，存在于加入了防腐剂的安瓿中或多剂量容器中。所述组合物可采取这样的形式如油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可包含配方剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选择，所述活性成分可以以粉剂形式存在，在使用前利用适当的媒介物例如无菌无热原水构建。
还可将组合物配制在直肠组合物例如栓剂或保留灌肠剂(例如包含常规栓剂基质，例如可可脂或其他甘油酯)中。
除了先前描述的制剂外，还可将所述化合物配制为贮库制剂。这样的长效制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此，例如，可用适当的聚合物或疏水物质(例如以可接受的油中的乳液形式)或离子交换树脂(或以微溶的衍生物形式例如以微溶的盐形式)配制所述化合物。
全身性施用也可以是透粘膜或经皮肤方式。为了进行透粘膜或经皮肤施用，将适合于待穿过的屏障的穿透剂用于制剂。此类穿透剂在本领域内通常是已知的，包括例如用于透粘膜施用的胆汁盐和夫西地酸衍生物，此外可使用去垢剂来促进渗透。透粘膜施用可以通过鼻腔喷雾或使用栓剂进行。为了进行局部施用，将本发明的化合物配制在如本领域内通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶或软膏剂中。可局部使用洗涤液以治疗损伤或炎症，从而加速愈合。
如果需要，可将组合物置于可包含一个或多个含有所述活性剂的单位剂型的包装或分配器装置中。所述包装可以例如包含金属或塑料箔例如泡罩包装。包装和分配器装置可附带施用说明书。
对于包括核酸的施用的治疗，可配制本发明的化合物以用于多种施用模式包括全身性和局部或局域施用。技术和配制通常可见于雷明顿药物科学，Meade Publishing Co.，Easton，Pa中。为了全身性施用，注射是优选的，包括肌内、静脉内、腹膜内、结内和皮下施用。为了进行注射，可将本发明的化合物配制于液体溶液，优选生理上相容的缓冲液例如例如Hank′s液或林格氏液中。此外，可以以固体形式配制组合物，在临用时将其再溶解或悬浮。还包括冻干形式。
在一个实施方案中，局部施用包含环境影响剂的组合物。优选以药物制剂的形式提供活性成分即环境影响剂。对于局部施用，活性成分可在终产品中包含按制剂的重量计算约0.001％至约20％w/w的制剂，虽然其可包含多至30％w/w，优选约1％至约20％w/w的制剂。本发明的局部制剂由此包含活性剂与一种或多种可接受的载体以及任选地任何其他治疗成分。载体在与制剂的其他成分相容的意义上应当是“可接受的”并且对其受者是无害的。
在治疗展示目的障碍的患者中，施用治疗有效量的试剂例如此类试剂。治疗有效剂量是指导致患者的症状的改善或存活的延长的化合物的量。
此类化合物的毒性和治疗功效可在细胞培养物或实验动物中利用例如用于测定LD50(对于50％的群体致死的剂量)和ED50(对于50％的群体治疗上有效的剂量)的标准制药方法(pharmaceutical procedure)来测定。毒效应与治疗效应之间的剂量比为治疗指数并且其可表示为比率LD50/ED50。展示大治疗指数的化合物是优选的。获自此类细胞培养测定和动物研究的数据可用于配制多种用于人的剂量。此类化合物的剂量优选在循环浓度的范围内，包括几乎不具有或不具有毒性的ED50。取决于使用的剂量形式和使用的施用途径，剂量可在该范围内变化。
对于本发明的方法中所使用的任何化合物，可根据细胞培养测定初步估计治疗有效量。例如，可在动物模型中配制剂量以获得包含如在细胞培养中测定的IC50的循环血浆浓度范围。这样的信息可用于更精确地确定在人中有用的剂量。可以例如利用HPLC测量血浆中的水平。
可根据患者的状况由个别医生选择确切的制剂、施用途径和剂量。(参见例如Fingl等人，在The Pharmacological Basis ofTherapeutics，1975，Ch.1 p.1中)。应当指出，主治医生知道如何和何时因毒性或因器官功能障碍而结束、中止或调整施用。相反地，如果临床反应不充分(排除毒性)，主治医生也知道如何毒性将治疗调整至更高的水平。在目标肿瘤障碍治疗中施用的剂量的量可视待治疗的状况的严重度和施用途径而变化。可以例如部分地利用标准预后评估方法来评估状况的严重度。此外，剂量和可能的给药频率也可根据个别患者的年龄、体重和反应而变化。与上面论述的程序相当的程序也可用于兽医学
取决于将治疗的具体状况，可配制此类试剂和全身性或局部施用此类试剂。用于配制和施用的技术可见于雷明顿药物科学，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1990)中。适当的途径可包括口服、经直肠、经皮肤、经阴道、经粘膜或经肠施用；胃肠外递送，包括肌内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射，仅举几例。
可以以任何适当的制剂给受试者施用上述组合物。除了利用环境影响剂例如CoQ10的局部制剂治疗代谢障碍外，在本发明的其他方面，可利用其他方法递送环境影响剂例如CoQ10。例如，可配制用于胃肠外递送例如用于皮下、静脉内、肌内或瘤内注射的环境影响剂例如CoQ10。可使用通过充满组合物的装置递送例如脂质体递送或扩散的其他方法。可以以单次快速浓注、多次注射或通过连续输注(例如，静脉内或通过腹膜透析)施用组合物。为了进行胃肠外施用，优选以无菌无热原形式配制组合物。还可通过将组合物简单地加入其中包含细胞的液体来给细胞体外施用本发明的组合物(例如，以诱导体外培养物中癌细胞的细胞凋亡)。
取决于将治疗的具体疾患，可配制此类试剂以及全身性或局部施用此类试剂。用于配制和施用的技术可见于雷明顿药物科学，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1990)中。适当的途径可包括口服、经直肠、经皮肤、经阴道、经粘膜或经肠施用；胃肠外递送，包括肌内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射，仅举几例。
为了进行注射，可将本发明的试剂配制于水溶液中，优选生理上相容的缓冲液例如Hanks′s液、林格氏液或生理盐水缓冲液中。为了进行这样的透粘膜施用，将适合于待穿过的屏障碍的穿透剂用于制剂中。此类穿透剂在本领域内通常是已知的。
药学上可接受的载体用于将本文中公开的用于实施本发明的化合物配制成适合于全身性施用的药剂(dosage)的用途在本发明的范围内。通过适当选择载体和适当的生产实践，可胃肠外例如通过静脉内施用本发明的组合物，特别地配制为溶液的那些组合物。可利用本领域内公知的药学上可接受的载体将化合物配制成适合用于口服施用的药剂。此类载体使得能够将本发明的化合物配制为片剂、丸剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆体、混悬剂等以用于待治疗的患者口服摄入。
意欲细胞内施用的试剂可使用本领域技术人员公知的技术来施用。例如，可将此类试剂封装在脂质体内，随后如下所述进行施用。脂质体是具有水性内部的球状脂双层。可将在脂质体形成时存在于水溶液中的所有分子掺入水性内部。脂质体内容物被保护免受外部微环境的破坏并且，因为脂质体与细胞膜融合，从而所述内容物被有效地递送进入细胞的细胞质。此外，由于它们的疏水性，可直接细胞内递送小有机分子。
适合用于本发明的药物组合物包括其中以有效地获得其期望的目的的量包含活性成分的组合物。特别地根据本文中提供的详细公开内容，有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内。除了活性成分外，此类药物组合物可包含含有赋形剂和辅助剂的适当的药学上可接受的载体，所述赋形剂和辅助剂促进活性化合物加工成可药用的制剂。经配制用于口服施用的制剂可以以片剂、糖丸、胶囊剂或溶液的形式存在。本发明的药物组合物可以以本身已知的方式例如通过常规混合、溶解、制粒、制备糖丸、悬浮(levitating)、乳化、封装、捕获或冻干法来制备。
适合用于局部施用的制剂包括适合用于穿过皮肤至需要治疗的位置的液体或半液体制剂，例如搽剂、洗剂、乳膏剂或糊剂以及适合给眼、耳或鼻施用的滴剂。根据本发明的滴剂可包含无菌水性或油性溶液或悬浮液并且可通过将活性成分溶解在杀菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其他适当的防腐剂的适当水溶液(优选包含表面活性剂)中来制备。随后可澄清所得的溶液，过滤灭菌，利用无菌技术转移至容器中。适合用于包含在滴剂中的杀菌剂和杀真菌剂的实例为硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和醋酸氯己定(0.01％)。用于制备油性溶液的适当溶剂包括甘油、稀醇和丙二醇。
根据本发明的洗剂包括适合用于皮肤或眼睛的洗剂。洗眼剂可包含任选地含有杀菌剂的无菌水溶液并且可通过与用于制备滴剂的方法相似的方法制备。用于皮肤的洗剂或搽剂还可包含促进干燥和使皮肤凉爽的试剂，例如醇或丙酮，和/或增湿剂例如甘油或油例如蓖麻油或花生油。
根据本发明的乳膏剂、软膏剂或糊剂是用于外敷的活性成分的半固体制剂。可通过借助于适当的机器，将以细末或粉末形式存在的活性成分单独地或于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液中与油脂性或非油脂性基质混合来制备它们。所述基质可包含烃类例如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂；胶浆剂；天然来源的油例如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或与醇例如丙二醇或大粒凝胶一起的脂肪酸例如硬脂酸或油酸。所述制剂可包含任何适当的表面活性剂例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂例如脱水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。还可包括悬浮剂例如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料例如二氧化硅硅酸盐(silicaceous silicas)和其他成分例如羊毛脂。
胃肠外施用的药物制剂包括以水溶性形式存在的活性化合物的水溶液。此外，可将活性化合物的悬浮液制备为适当的油状注射悬浮液。适当的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油或合成脂肪酸酯类例如油酸乙酯或甘油三酯类，或脂质体。水性注射悬浮液可包含增加悬浮液的粘度的物质例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可包含适当的稳定剂或增加化合物的稳定性以允许制备高浓缩液的试剂。
可通过将活性化合物与固体赋形剂组合，任选地研磨所得的混合物，和需要时在加入适当的辅助物质后，加工颗粒的混合物以获得片剂或锭剂核心来获得用于口服施用的药物制剂。适当的赋形剂具体地为填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。
提供具有适当包衣的糖丸核心。为此，可使用浓缩糖溶液，其可任选地包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、卡波普和/或二氧化钛、漆溶液(lacquer solution)和适当的有机溶液或溶剂混合物。可将染料或色素加入片剂或糖丸包衣以标识或表征活性化合物剂剂量的不同组成。
可口服施用的药物制剂包括由明胶制备的推入配合(push-fit)胶囊以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨醇制备的软密封胶囊。推入配合胶囊可包含与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可将活性化合物溶解或悬浮于适当的液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可加入稳定剂。
如果需要，组合物可包含缓冲系统。选择缓冲系统以在所需的范围内维持或缓冲组合物的pH。如本文中所使用的术语“缓冲系统”或“缓冲剂”是这样的溶质试剂，所述试剂，当存在于水溶液中时，当向其中加入酸或碱时稳定该溶液抵抗pH(或氢离子浓度或活性)的较大变化。溶质试剂或因此而负责在上文中指定的范围内的起始缓冲pH值的pH的抵抗或变化的试剂是公知的。虽然存在不计其数的适当缓冲剂，但磷酸钾一水合物是优选缓冲剂。
药物组合物的终pH值可在生理相容性范围内变化。必要时，终pH值是不刺激人皮肤并且优选以便促进活性化合物即CoQ10的经皮肤运输的pH值。不违反该限制，可选择pH以提高CoQ10化合物的稳定性和需要时调节稠度。在一个实施方案中，优选pH值为约3.0至约7.4，更优选约3.0至约6.5，最优选约3.5至约6.0。
对于优选局部递送媒介物，组合物的其余成分是水，其必需是纯化的，例如，去离子水。此类递送媒介组合物包含在超过约50％至约95％(基于组合物的总重量)的范围的水。然而，水存在的具体量不是至关重要的，可调整其含量以获得其他成分的所需粘度(通常约50cps至约10,000cps)和/或浓度。局部递送媒介物优选具有至少约30厘泊的粘度。
其他已知的经皮肤的透皮吸收促进剂还可用于促进CoQ10的递送。实例为亚砜类例如二甲基亚砜(DMSO)等；环酰胺例如1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮(Azone.TM.，Nelson Research，Inc.的注册商标)等；酰胺例如N，N-二甲基乙酰胺(DMA)N，N-二乙基甲苯酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基辛酰胺、N，N-二甲基十二酰胺等；吡咯烷酮衍生物例如N-甲基-2-吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、2-吡咯烷酮-5-羧酸、N-(2-羟乙基)-2-吡咯烷酮或其脂肪酸酯、1-月桂基-4-甲氧基羰基-2-吡咯烷酮、N-牛脂烷基吡咯烷酮等；多元醇例如丙二醇、乙二醇、聚乙二醇、双丙二醇、甘油、已三醇等；线性和支链脂肪酸例如油酸、亚油酸、月桂酸、缬草酸、庚酸、己酸、肉豆蔻酸、异戊酸、新戊酸、三甲基己酸、异硬脂酸等；醇类例如乙醇、丙醇、丁醇、辛醇、油醇、硬脂醇、亚油醇等；阴离子表面活性剂例如月桂酸钠、十二烷基硫酸钠等；阳离子表面活性剂例如苯扎氯铵、十二烷基三甲基氯化铵、溴化十六烷基三甲铵等；非离子表面活性剂例如丙氧基化聚氧乙烯醚、例如，泊洛沙姆231、泊洛沙姆182、泊洛沙姆184等、乙氧基化脂肪酸、例如，Tween 20、Myjr 45等，脱水山梨糖醇衍生物例如，Tween 40、Tween 60、Tween 80、Span 60等、乙氧基化醇，例如，聚氧乙烯(4)月桂基醚(Brij 30)、聚氧乙烯(2)油醇醚(Brij 93)等、卵磷脂和卵磷脂衍生物等；萜类例如D-柠檬烯、α-蒎烯、β-蒈烯、α-松油醇、葛缕醇、香芹酮、薄荷酮、氧化柠檬烯、α-蒎烷氧化物、桉叶油等。还适合作为透皮吸收促进剂的是有机酸和酯例如水杨酸、水杨酸甲酯、柠檬酸、琥珀酸等。
在一个实施方案中，本发明提供了CoQ10组合物和制备所述组合物的方法。优选，所述组合物包含至少约1％至约25％CoQ10w/w。CoQ 10可以泛癸利酮(UBIDECARENONE)(USP)形式从Asahi KaseiN&P(Hokkaido，Japan)获得。CoQ10还可以粉剂形式的KanekaQ10(USP UBIDECARENONE)(Pasadena，Texas，USA)从Kaneka Q10获得。本文中举例说明的方法中使用的CoQ10具有下列特征：残留溶剂满足USP 467要求；水含量低于0.0％、低于0.05％或低于0.2％；炽灼残渣为0.0％，低于0.05％或低于0.2％；重金属含量低于0.002％或低于0.001％；98-100％或99.9％或99.5％的纯度。在下列实施例部分提供了制备组合物的方法。
在本发明的某些实施方案中，提供了通过给人局部施用辅酶Q10(以便治疗或预防发生)来治疗或预防人的代谢障碍的方法，其中给所述人施用局部剂量的局部媒介物中的辅酶Q10，其中以约0.01至约0.5毫克的辅酶Q10/平方厘米的皮肤的范围给靶组织施用辅酶Q10。在一个实施方案中，以约0.09至约0.15mg CoQ10/平方厘米的皮肤的范围给靶组织施用辅酶Q10。在多个实施方案中，以约0.001至约5.0、约0.005至约1.0、约0.005至约0.5、约0.01至约0.5、约0.025至约0.5、约0.05至约0.4、约0.05至约0.30、约0.10至约0.25或约0.10至0.20mg CoQ10/平方厘米的皮肤的范围给靶组织施用辅酶Q10。在其他实施方案中，以约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5mgCoQ10/平方厘米的皮肤的剂量给靶组织施用辅酶Q10。在一个实施方案中，以约0.12mg CoQ10/平方厘米的皮肤的剂量给靶组织施用辅酶Q10。应当理解，具有这些值的任一个作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如，约0.03至约0.12，约0.05至约0.15，约0.1至约0.20或约0.32至约0.49mg CoQ10/平方厘米的皮肤。
在本发明的另一个实施方案中，以0.5至10毫克的CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量以CoQ10乳膏的形式施用辅酶Q10，其中所述CoQ10乳膏包含1至5％的辅酶Q10。在一个实施方案中，所述CoQ10乳膏包含约3％的辅酶Q10。在其他实施方案中，所述CoQ10乳膏包含约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％的辅酶Q10。在多个实施方案中，以约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10毫克的CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量施用所述CoQ10乳膏。应当理解，以这些值的任一个作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如，约0.5至约5.0，约1.5至2.5或约2.5至5.5mg CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤。
在另一个实施方案中，以3至5毫克CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量以CoQ10乳膏的形式施用所述辅酶Q10，其中所述CoQ10乳膏包含1至5％的辅酶Q10。在一个实施方案中，所述CoQ10乳膏包含约3％的辅酶Q10。在其他实施方案中，所述CoQ10乳膏包含约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％的辅酶Q10。在多个实施方案中，以约3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0毫克CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量施用所述CoQ10乳膏。应当理解，以这些值的任一个作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如，约3.0至约4.0，约3.3至5.3或约4.5至4.9mg CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤。
本发明的某些方面提供了用于通过给人局部施用辅酶Q10(以便治疗或预防发生)来治疗或预防代谢障碍的方法，其中每24小时1次或多次局部施用所述辅酶Q10，进行6周或更长时间。
本发明的某些方面提供了用于制备辅酶Q10乳膏3％的方法，所述方法包括制备A、B、C、D及E相和组合所有相以便形成3％CoQ10乳膏的水包油乳剂的步骤。
在某些实施方案中，A相成分包含4.00％w/w的烷基C12-15苯甲酸盐NF、2.00％w/w的鲸蜡醇NF、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯/PEG-100和1.5％w/w的硬脂醇，而B相成分包括5.00％w/w的二甘醇单乙醚NF、2.00％w/w的甘油USP、1.50％w/w的丙二醇USP、0.475％w/w的苯氧乙醇NF、16.725％w/w的纯化水USP和40.00％w/w的卡波姆分散体2％，C相成分包括0.50％w/w的乳酸USP、2.00％w/w的乳酸钠溶液USP、1.30％w/w的三乙醇胺NF和2.50％w/w的纯化水USP。此外，在这些实施方案中，D相成分包括1.00％w/w的二氧化钛USP，而E相成分包括15％w/w的CoQ10 21％浓缩物。
本文中所使用的术语“三乙醇胺”是指三乙醇胺(Trolamine)NF、三乙醇胺、TEAlan
Figure BPA00001497288600631
TEAlan 99％、三乙醇胺99％、三乙醇胺NF或三乙醇胺99％NF。这些术语在本文中可互换使用。
在某些其他实施方案中，A相成分包括4.00％w/w的辛酸/癸酸甘油三酯、2.00％w/w的鲸蜡醇NF、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯/PEG-100和1.5％w/w的硬脂醇，而B相成分包括5.00％w/w的二甘醇单乙醚NF、2.00％w/w的甘油USP、1.50％w/w的丙二醇USP、0.475％w/w的苯氧乙醇NF、16.725％w/w的纯化水USP和40.00％w/w的卡波姆分散体2％，C相成分包括0.50％w/w的乳酸USP、2.00％w/w的乳酸钠溶液USP、1.30％w/w的三乙醇胺NF和2.50％w/w的纯化水USP。此外在这些实施方案中，D相成分包括1.00％w/w的二氧化钛USP，而E相成分包括15％w/w的CoQ10 21％浓缩物。
在本发明的某些实施方案中，提供了用于制备辅酶Q10乳膏3％的方法，所述方法包括步骤：(1)向适当的容器中加入A相成分并且在水浴中加热至70-80℃；(2)向适当的容器中加入B相成分(不包括卡波姆分散体)并且形成混合B相；(3)将E相成分加入适当的容器并且利用水浴在50-60℃下熔化以形成熔化的E相；(4)向搅拌罐中加入卡波姆分散体，同时加热至70-80℃；(5)向搅拌罐中加入混合物B相同时将温度维持在70-80℃；(6)向搅拌罐中加入C相成分同时将温度维持在70-80℃；(7)向搅拌罐中加入D相成分，随后继续混合和均匀化搅拌罐的内容物；然后(8)停止均匀化并且将搅拌罐的内容物冷却至50-60℃；随后(9)中止混合，向搅拌罐中加入熔化的E相以形成分散体；(10)随后重新开始混合直至分散体变得光滑和均匀；随后(11)将搅拌罐的内容物冷却至45-50℃。
在本发明的某些其他实施方案中，提供了包含CoQ10乳膏3％的药物组合物。所述乳膏包含具有4.00％w/w组合物的C12-15烷基苯甲酸盐、2.00％w/w组合物的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100的A相；具有2.00％w/w的甘油、1.5％w/w的丙二醇、5.000％w/w的乙氧基二甘醇、0.475％w/w的苯氧乙醇、40.00％w/w的卡波姆分散体、16.725％w/w的纯化水的B相；具有1.300％w/w的三乙醇胺、0.500％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液和2.5％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有1.5000％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。在某些实施方案中，卡波姆分散体包括水、苯氧乙醇、丙二醇和卡波姆940。
在本发明的某些实施方案中，提供了包含CoQ10乳膏3％的药物组合物。所述乳膏包含具有具有4.00％w/w组合物的辛酸/癸酸甘油三酯、2.00％w/w组合物的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100的A相；具有2.00％w/w的甘油、1.5％w/w的丙二醇、5.0％w/w的乙氧基二甘醇、0.475％w/w的苯氧乙醇、40.00％w/w的卡波姆分散体、16.725％w/w的纯化水的B相；具有1.300％w/w的三乙醇胺、0.500％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液、2.5％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有15.000％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。在某些实施方案中，卡波姆分散体包括水、苯氧乙醇、丙二醇和卡波姆940。
在本发明的某些其他实施方案中，提供了包含1.5％的CoQ10乳膏的药物组合物。所述乳膏包括具有5.000％w/w的C12-15烷基苯甲酸盐、2.000％w/w的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.500％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100硬脂酸酯的A相；具有2.000％w/w的甘油、1.750％w/w的丙烯、5.000％w/w的乙氧基二甘醇、0.463％w/w的苯氧乙醇、50％w/w的卡波姆分散体和11.377％w/w的纯化水的B相；具有1.3％w/w的三乙醇胺、0.400％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液和4.210％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有1.500％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。
在本发明的某些其他实施方中，提供了包含1.5％的CoQ10乳膏的药物组合物。所述乳膏包含具有5.000％w/w的辛酸/癸酸甘油三酯、2.000％w/w的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.500％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100硬脂酸酯的A相；具有2.000％w/w的甘油、1.750％w/w的丙烯、5.000％w/w的乙氧基二甘醇、0.463％w/w的苯氧乙醇、50％w/w的卡波姆分散体和11.377％w/w的纯水的B相；具有1.3％w/w的三乙醇胺、0.400％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液和4.210％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有1.500％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。在某些实施方案中，卡波姆分散体包含水、苯氧乙醇和丙二醇。
1.联合治疗
在某些实施方案中，本发明的环境影响剂和/或其药物组合物可用于使用至少一种其他治疗剂的联合治疗，所述其他治疗剂可以是不同的环境影响剂和/或其药物组合物。所述环境影响剂和/或其药物组合物和其他治疗剂可累加地或更优选协同地作用。在一个实施方案中，将环境影响剂和/或其药物组合物与另一种治疗剂的施用同时施用。在另一个实施方案中，在施用另一种治疗剂之前或之后，施用化合物和/或其药物组合物。
可与本发明的环境影响剂一起使用的治疗剂的实例包括但不限于糖尿病治疗剂、糖尿病并发症治疗剂、抗高血脂药、降压药或抗高血压药、抗肥胖药、利尿药、化学治疗剂、免疫治疗剂、免疫抑制剂等。
用于治疗糖尿病的试剂的实例包括胰岛素制剂(例如，从牛或猪的胰腺提取的动物胰岛素制剂；使用微生物或方法通过基因工程合成的人胰岛素制剂)、胰岛素敏感性增强剂、其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物(例如，吡格列酮、曲格列酮、罗格列酮、萘格列酮(netoglitazone)、巴格列酮(balaglitazone)、来格列酮(rivoglitazone)、替格列扎(tesaglitazar)、法格立他扎、CLX-0921、R-483、NIP-221、NIP-223、DRF-2189、GW-7282TAK-559、T-131、RG-12525、LY-510929、LY-519818、BMS-298585、DRF-2725、GW-1536、GI-262570、KRP-297、TZD18(Merck)、DRF-2655等)、α-糖苷酶抑制剂(例如，伏格列波糖、阿卡波糖、米格列醇、乙格列酯等)、双胍类(例如，苯乙双胍、二甲双胍、丁福明等)或磺脲类(例如，甲苯磺丁脲、格列本脲、格列齐特、氯磺丙脲、妥拉磺脲、醋酸己脲、格列吡脲、格列美脲等)以及其他促进胰岛素分泌的试剂(例如，瑞格列奈、色那列奈、那格列奈、米格列奈、GLP-1等)、香树素激活剂(例如，普兰林肽等)、磷酸酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如，钒酸等)等。
用于治疗糖尿病并发症的试剂的实例包括但不限于醛糖还原酶抑制剂(例如，托瑞司他、依帕司他、折那司他、唑泊司他、米那司他、法地司他(fidareatat)、SK-860、CT-112等)、神经营养因子(例如，NGF，NT-3，BDNF等)、PKC抑制剂(例如，LY-333531等)、晚期糖基化终末产物(AGE)抑制剂(例如，ALT946、匹马吉定、吡哆胺(pyradoxamine)、苯甲酰甲基噻唑溴(phenacylthiazoliumbromide)(ALT766)等)、活性氧猝灭剂(active oxygen quenchingagent)(例如，硫辛酸或其衍生物，生物黄酮类包括黄酮类、异黄酮类、二氢黄酮(flavonones)、原花青素、花青素、碧萝芷(pycnogenol)、叶黄素、番茄红素、维生素E、辅酶Q等)、脑血管扩张剂(例如，泰必利、美西律等)。
抗高血脂剂包括例如基于他汀类的化合物，其为胆固醇合成抑制剂(例如，普伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、罗舒伐他汀(rosuvastatin)等)、角鲨烯合成酶抑制剂或具有降甘油三酯效应的贝特类化合物(fibrate compound)(例如，非诺贝特、吉非罗齐(gemfibrozil)、苯扎贝特、氯贝特(clofibrate)、安妥明丙醇二酯(sinfibrate)、克利贝特等)。
降压药包括例如血管紧张素转化酶抑制剂(例如，卡托普利、依那普利、地拉普利、贝那普利、西拉普利、依那普利、依那普利拉(enalaprilat)、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、群多普利等)或血管紧张素II拮抗剂(例如，氯沙坦、坎地沙坦西酯、奥美沙坦酯、依普罗沙坦、缬沙坦、替米沙坦、厄贝沙坦、他索沙坦、泊米沙坦、利匹沙坦，福拉沙坦等)。
抗肥胖药包括例如中心抗肥胖症(central antiobesity agent)(例如，右芬氟拉明、芬氟拉明、芬特明(phentermine)、西布曲明、安非拉酮、右旋苯丙胺(dexamphetamine)、马吲哚、苯丙醇胺、氯苄雷司等)、胃肠脂肪酶抑制剂(例如，奥利司他等)、β-3激活剂(例如，CL-316243、SR-58611-A、UL-TG-307、SB-226552、AJ-9677、BMS-196085等)、基于肽的食欲抑制剂(peptide-based appetite-suppressing agent)(例如，瘦素、CNTF等)、胆囊收缩素激动剂(例如，林替曲特、FPL-15849等)等。
利尿药包括例如黄嘌呤衍生物(例如，可可碱水杨酸钠、可可碱水杨酸钙等)、噻嗪类制剂(例如，乙噻嗪、环戊噻嗪、三氯噻嗪、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、bentylhydrochlorothiazide、戊氟噻嗪、泊利噻嗪、甲氯噻嗪等)、抗醛固酮制剂(例如，螺内酯、氨苯蝶啶等)、脱羧酶抑制剂(例如，乙酰唑胺等)、氯苯磺酰胺制剂(例如，氯噻酮、美夫西特、吲达帕胺等)、阿佐塞米、异山梨醇(isosorbide)、依他尼酸、吡咯他尼、布美他尼、呋塞米等。
化学治疗剂包括例如烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺等)，代谢拮抗剂(例如，甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶等)、抗癌抗生素(例如，丝裂霉素、阿霉素(adriamycin)等)、植物来源的抗癌剂(例如，长春新碱、长春地辛、泰素等)，顺铂、卡铂、依托泊苷等。在这些物质当中，5-氟尿嘧啶衍生物例如氟铁龙和neofurtulon是优选的。
免疫治疗剂包括例如微生物或细菌成分(例如，胞壁酰二肽(muramyl dipeptide derivative)、溶链菌制剂(picibanil)等)、具有免疫增强活性的多糖(例如，香菇多糖、裂裥多糖(sizofilan)、云芝多糖K等)、通过基因工程技术获得的细胞因子(例如，干扰素、白细胞介素(IL)等)、集落刺激因子(例如，粒细胞集落刺激因子、促血红细胞生长素(erythropoetin)等)等，在这些物质当中，最优选的是IL-1、IL-2、IL-12等。
免疫抑制剂包括例如钙依赖磷酸酶/亲免蛋白(immunophilin)调节剂例如环孢菌素(山地明(Sandimmune)、金格福(Gengraf)、Neoral)、他克莫司(Prograf，FK506)、ASM 981、西罗莫司(RAPA、雷帕霉素、雷帕鸣(Rapamune))或其衍生物SDZ-RAD、糖皮质激素类(泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松等)、嘌呤合成抑制剂(麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)、MMF、CellCept(R)、硫唑嘌呤、环磷酰胺)、白细胞介素拮抗剂(巴利昔单抗、达利珠单抗(daclizumab)、脱氧精胍菌素(deoxyspergualin))、淋巴细胞消耗剂例如抗胸腺细胞球蛋白(Thymoglobuli、抗淋巴细胞球蛋白(Lymphoglobuline))、抗CD3抗体(OKT3)等。
此外，还可将已在动物模型或在临床阶段确立其恶病质改善效应的试剂例如环加氧酶抑制剂(例如，吲哚美辛等)[Cancer Research，第49卷，第5935-5939页，1989]、孕酮衍生物(例如，醋酸甲地孕酮)[Journal of Clinical Oncology，第12卷，第213-225页，1994]、糖甾类(例如，地塞米松等)、基于甲氧氯普胺的试剂、基于四氢大麻酚的试剂、促进脂质代谢的试剂(例如，二十碳五烯酸等)[British Journal ofCancer，第68卷，第314-318页，1993]、生长激素、IGF-1、抗TNF-α的抗体拮抗剂、LIF、IL-6和制癌蛋白M与根据本发明的化合物协同使用。
本发明通过下列实施例进一步举例说明，所述实施例不应当解释为限制。在整个本申请中引用的所有参考资料和公布的专利和专利申请的内容通过引用并入本文。
发明实施例
现概述本发明，通过参考下列实施例其将变得更容易理解，所述实施例仅用于本发明的某些方面和实施方案的举例说明，而无意限制本发明，因为本领域技术人员能够根据上文中的教导和下列实施例认识到，可使用其他测定法、细胞类型、试剂、构建体或数据分析法(全都无限制)而不背离所述的本发明的范围。
本申请中任何地方参考的任何专利、专利申请、专利公布或科学论文的内容通过引用整体并入本文。
在适当的情况下及除非另有所指，否则本发明的实施将使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、病毒学、重组DNA和免疫学的常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力范围内。此类技术描述于文献中。参见，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，由Sambrook和Russell(Cold SpringHarbor Laboratory Press：2001)编著；论文，Methods InEnzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Using Antibodies，第2版，由Harlow和Lane编著，Cold Spring Harbor Press，New York，1999；Current Protocols in Cell Biology，由Bonifacino，Dasso，Lippincott-Schwartz，Harford和Yamada编著，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1999；以及PCR Protocols，由Bartlett等人编著，Humana Press，2003。
实施例1：CoQ10被鉴定为MIM
为了将CoQ10评估为潜在MIM，向一组细胞系(包括癌细胞系和正常对照细胞系)中外源加入以氧化形式存在的CoQ10，然后评估诱导的组中每一个细胞系的细胞微环境特征谱的变化。评估细胞形态学/生理学以及细胞组成(包括mRNA和蛋白质水平)的变化，并且比较患病细胞相对于正常细胞的所述变化。这些实验的结果将CoQ10，特别是CoQ10的氧化形式鉴定为MIM。在第一组实验中，通过检查细胞对CoQ10的敏感性和细胞凋亡反应来评估细胞形态学/生理学的变化。用不同水平的辅酶Q10处理一组皮肤细胞系，包括对照细胞系(解质细胞和黑素细胞的原代培养物)和几个皮肤癌细胞系(SK-MEL-28，非转移性皮肤黑素瘤；SK-MEL-2，转移性皮肤黑素瘤；或SCC，鳞状细胞癌；PaCa2，胰腺癌细胞系；或HEP-G2，肝癌细胞系)。这些实验的结果显示癌细胞系展示了与对照细胞系相比较改变的剂量依赖性反应，只在癌细胞中诱导了细胞凋亡和细胞死亡。示例性实验详细地描述于下面的实施例3中。
然后使用测定评估用CoQ10处理后的细胞的组成的变化。使用实时PCR阵列法在mRNA水平上分析基因表达的变化。在下面的实施例6和9-13中详细描述了示例性实验。在互补实验中，通过使用抗体微阵列法、双向凝胶电泳，然后使用质谱表征法进行的蛋白质鉴定，以及通过western印迹分析法来在蛋白质水平上分析基因表达的变化。示例性实验分别在下面详细地描述于实施例4、7和8中。这些测定的结果显示在被检查的细胞系中mRNA和蛋白质水平上的基因表达的变化因CoQ10的氧化形式的加入而被诱导。发现被CoQ10处理调节的基因集簇在几个细胞途径中，包括细胞凋亡、癌生物学和细胞生长、糖酵解和代谢、分子运输和细胞信号转导。
进行实验以确认CoQ10进入细胞并且测定存在于细胞中的CoQ10的水平和形式。具体地，通过分析来自用CoQ10处理的细胞的富集线粒体的制剂来测定存在于线粒体中的辅酶Q10的水平以及CoQ10的形式(即氧化的或还原的)。对于外源Q10的添加，存在于线粒体中的辅酶Q10的水平被确认以时间和剂量依赖性的方式增加。在令人惊讶和意外的结果中，CoQ10经确定主要以氧化形式存在于线粒体中。此外，通过使用2-D凝胶电泳和利用质谱表征的蛋白质鉴定来分析来自富集线粒体的样品的蛋白质的水平的变化。这些实验的结果显示在检查的时间过程中线粒体中的CoQ10的氧化形式的水平与许多细胞变化相关，如由与代谢和细胞凋亡途径相关的特定蛋白质的mRNA和蛋白质水平的调节所证明的。示例性实验详细地描述于下面实施例5中。
由本申请人描述的结果将内源分子CoQ10，具体地CoQ10的氧化形式鉴定为MIM。例如，所述结果将CoQ10鉴定为MIM，因为观察到CoQ10在mRNA和蛋白质水平上都诱导基因表达的变化。所述结果将CoQ10鉴定为具有多维特征，因为CoQ10诱导了疾病状态(例如，癌症)相对于正常(例如，非癌)状态的细胞形态学/生理学和细胞组成(例如，mRNA和蛋白质水平上的基因表达的差异变化)的差异变化。此外，所述结果将CoQ10鉴定为具有多维特征，因为CoQ10能够进入细胞，从而展示治疗和载体效应。
实施例2：用于鉴定代谢障碍的疾病相关进程和生物标志的方法
根据其中用目的分子处理细胞系的基于细胞的测定，利用mRNA阵列、蛋白质抗体阵列和2D凝胶电泳评估处理的细胞对未处理的细胞的差异。利用途径分析(Ingenuity IPA软件)和已知文献的综述从系统生物学角度评估受MIM或表观代谢转变剂调节的通过比较样品分析鉴定的蛋白质。将被鉴定为潜在治疗剂或生物标记靶的蛋白质经历确认测定例如Western印迹分析、siRNA敲低或重组蛋白质产生和表达法。
用于实施例3-8的材料和方法
辅酶Q10原液
如下制备500μM辅酶Q10(5％异丙醇于细胞生长培养基中)。每一次都新配制10mL 500μM辅酶Q10原液。分子量：863.34
(0.0005mol/L)(0.010L)(863.34g/mol)＝0.004317g
为了制备10mL 500μM原液，称取4.32mg辅酶Q10置于15mLfalcon管中，加入500μL异丙醇。在50-60℃水浴中温热溶液，同时涡旋以完全溶解。向该溶液中加入9.5mL培养基(在其中培养细胞的相同培养基)。
细胞培养
细胞获自美国典型培养物保藏中心或Gibco。将细胞培养在补充有5％胎牛血清、0.25ug/mL两性霉素，100ug/mL链霉素和100UmL-1青霉素的DMEM/F-12培养基中。将细胞在37℃下维持在95％空气和5％CO2的大气中。
辅酶Q10处理和总蛋白质分离
在接触Q10之前使细胞生长至85％的汇合。利用Q10将补充的培养基条件化至50和100微摩尔浓度。以一式三份用对照、50μM Q10和100μM Q10处理培养瓶。在4、8、12和24小时后从处理的培养瓶和对照培养瓶分离蛋白质。为了分离蛋白质，用5mL pH为7.4的冰冷PBS洗涤细胞3次。随后将细胞刮入3mL PBS中，通过离心沉淀，重悬浮于pH 7.4的裂解缓冲液(80mM TRIS-HCl，1％SDS，具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中。使用BCA法定量蛋白质浓度。
细胞系
繁殖下面所列的细胞系，建立每一个细胞系的细胞库。大规模产生用于不同测定的细胞，收获材料以进行分析。一般而言，当不需要细胞特异性培养基来维持细胞系时，用于细胞生长的培养基是具有5％血清的DMEMF-12。在破裂之前通常使细胞生长至75-80％汇合(清楚的间隔)，将其用于细胞测定，进行标准操作方法。建立用于实验的下列细胞系：
SK-MEL-28(非转移性皮肤黑素瘤)
SK-MEL-2(转移性皮肤黑素瘤)
HEKa(角质细胞，皮肤对照)
HEMa(黑素细胞，皮肤对照)
nFIB(新生成纤维细胞)
HEP-G2(肝癌)[SBH细胞系]
SkBr-3(Her2过表达的乳腺癌)
MCF-7(乳腺癌，p53突变)
PC-3(前列腺癌)[SBH细胞系]
SkBr-3(人乳腺腺癌)
NCI-ES-0808
SCC(鳞状细胞癌)
PaCa-2
NIH-3T3
细胞培养：
细胞获自美国典型培养物保藏中心或Gibco。将细胞培养在补充有5％胎牛血清、0.25ug/mL两性霉素、100ug/mL链霉素和100UmL-1青霉素的DMEM/F-12培养基中。将细胞在37℃下维持在95％空气和5％CO2的大气中。
在具有Glutamax(Invitrogen，Carlsbad CA)的补充有5％FBS、两性霉素和青霉素/链霉素的DMEM/F12中培养和维持皮肤恶性黑素瘤SK-MEL28细胞。将细胞于37℃、5％CO2下进行培养。另外的细胞系和生长条件的细节概述于下表中。
表1.就对Q10的敏感性分析的细胞系
Figure BPA00001497288600741
SKMEL28细胞的Q10治疗：
用100μM Q1或对照媒介物处理SK-MEL28细胞。如下配制Q10。在15mL加帽的试管中，转移4.32mg Q10(由Cytotech提供)，随后通过加入500μL异丙醇将其溶解。将所得的溶液在65℃水浴中加温，以高速涡旋。通过加入平衡的细胞培养基将Q10/异丙醇溶液变成10mL的体积。随后涡旋原液以确保Q10的最大溶解度。稀释原液(2mL原液用8mL培养基)以获得100μM Q10的终浓度。对于对照媒介物，将9.5mL的培养基加入500μL的异丙醇。用8mL培养基进一步稀释对照原液(2mL的原液)。在处理开始后第6、16、24、48或72小时收获细胞。
SCC细胞的Q10处理：
利用100μM Q10(如上所述制备的)处理SCC细胞6小时或24小时。对照细胞是未处理的细胞。在处理后不同的时间点收获和沉淀细胞，快速冷冻沉淀，于-80℃下贮存直至如下所述在XTAL下分离RNA。
RNA分离：
按照制造商的说明书利用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia CA)在不同的处理时间上裂解细胞以进行RNA分离。通过测量260nm处的光密度定量RNA。
第一链合成：
按照制造商的说明书利用RT2First Strand Synthesis试剂盒(SABiosciences.，Frederick MD)从1μg总RNA合成第一链cDNA。
实时PCR：
用水稀释来自第一链合成的产物，将其与SYBR green mastermix(SABiosciences.，Frederick MD)混合，加载至PCR阵列上。在Biorad CFX96上于PCR阵列(细胞凋亡阵列、糖尿病阵列、氧化性应激和抗氧化剂防御阵列和热激蛋白阵列)(SABiosciences，FrederickMD)上进行实时PCR。
利用用于细胞凋亡的连接蛋白测定法测定细胞系对辅酶Q10的 敏感性：
在24小时的辅酶Q10处理后定量早期和晚期细胞凋亡中的细胞的百分比。早期和晚期细胞凋亡用作理解不同癌细胞系对辅酶Q10的敏感性的差异的标志。所测试的不同细胞系为PaCa2、HepG2、PC-3、SKBr3、MCF-7和SK-MEL28。使细胞在96孔板中粘着过夜。用对照媒介物、50μM Q10或100μM辅酶Q10处理这些细胞。24小时后，在PCA96流式细胞仪(Guava Technologies，Hayward，CA)上估计凋亡细胞的存在。此外，用4μM星状孢子素处理一些细胞2小时作为细胞凋亡的阳性对照。首先用PBS洗涤细胞，然后用50μLAccumax(Innovative Cell Technologies，San Diego，CA)在室温下解离细胞。通过加入含有1％Pluronic F-68(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的培养基终止解离。随后向每一个孔中加入100μL连接蛋白试剂(Guava Technologies，Hayward，CA)。在于黑暗中温育20分钟后，在低结合板中进行测定以使细胞对底物的再附着减少至最低程度。连接蛋白试剂包含两种染料。检测细胞外表面上的磷脂酰丝氨酸的膜联蛋白-V-PE；早期凋亡细胞的特征。第二染料7-AAD只渗透晚期凋亡细胞，然而被从活(健康)和早期凋亡细胞排出。使用Cytosoft 2.5.7软件(Guava Technologies，Hayward，CA)测定4个细胞群体：活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和碎片的百分比。
免疫印迹分析
通过免疫印迹分析测定每样品约50μg的蛋白质。在有对照的情况下，以一式三份进行所有处理。将蛋白质在12％TRIS-HCl凝胶上进行分离，通过电泳转移至硝酸纤维素膜上，使用5％牛奶和TBST溶液进行封闭，然后用一抗温育。将一抗在4℃下于5％BSA和TBST溶液中温育过夜。将二抗在4℃下温育1小时。所有抗体购自CellSignaling Technology。除β肌动蛋白以1∶5000的比率使用外，以1∶1000的比率使用抗体。使印迹显影，利用基于NIH Java的密度计分析软件Image J定量结果。还探测所有印迹，并且针对它们各自的β肌动蛋白的表达进行标准化。
双向电泳
在等电聚焦(IEF)之前，将样品溶解在40mM Tris、7M脲、2M硫脲和1％C7两性离子去污剂中，用三丁基膦还原，用10mM丙烯酰胺在室温下烷基化90分钟。之后，利用至少3倍体积的重悬浮缓冲液(由7M脲，2M硫脲和2％CHAPS组成)使样品通过10-kDa截断值的Amicon Ultra装置以减少样品的电导率。将100微克蛋白质在11-cm pH 3至10，pH 4至7或pH 6至11的固定pH梯度胶条(GE，Amersham，USA)上经历IEF至100,000伏小时。在IEF后，将固定pH梯度胶条于6M脲、2％SDS、50mM Tris-醋酸盐缓冲液、pH 7.0和0.01％溴酚蓝中进行平衡，然后在8至16％Tris-HCl Precast凝胶、1mm(Bio-Rad，USA)上经历SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。以一式三份进行凝胶电泳。将它们固定，于SYPRO Ruby，80mL/凝胶(Invitrogen，USA)中染色，在Fuji FLA-5100激光扫描仪上成像或转移至PVDF膜上。
获得对照样品的其他信息以通过使用方法测试蛋白质鉴定的效用，所述方法利用dPC(Protein Forest Inc.)选择性pI分级分离，然后对dPC plug进行胰蛋白酶降解，利用质谱法进行鉴定和半定量(Nanomate或LC/LTQ/MS)。利用对照样品进行的dPC分析证明了其在鉴定一大亚组蛋白质中的效用。将在研究过程中产生的物质归档以便将来需要出现时它们可用作来源。
2D凝胶成像分析：
使用Progenesis Discovery和Pro(Nonlinear Dynamics Inc.，Newcastle upon Tyne，UK)进行所有凝胶成像的分析。在点检测、匹配、本底扣除、标准化和滤过后，输出SYPRO Ruby凝胶图像的数据。在Progenesis Discovery中使用学生t检验进行组之间的成对比较以鉴定其表达被显著改变的点(p＞0.05)。
抗体阵列：
利用抗体微阵列(Panorama XP725抗体阵列，Sigma)筛选700多种蛋白质抗体以评估Q10处理的细胞(SK-MEL-28，SCC)中蛋白质浓度水平的变化。当蛋白质被点在载玻片上的相应抗体结合时，蛋白质在细胞提取物中的表达获得检测。在结合之前，将用于荧光可视化和定量分析的荧光染料直接标记蛋白质。将所述阵列用于比较两个样品(测试样品对参照样品)的蛋白质表达特征谱，每一个样品用不同的CyDye(Cy3或Cy5)标记，将两个样品以相同的蛋白质浓度同时用于阵列上。随后在相应于样品的染料标记的波长上分别记录每一个样品的荧光信号强度，然后比较所述荧光信号强度。
高剂量的辅酶Q10在培养的SKMEL-28细胞中调节细胞凋亡、糖尿病和氧化性应激途径中牵涉的基因的表达。
实验内容：SKMEL-28细胞(ATCC目录号HTB-72)是培养在含有Glutamax(Invitrogen Cat#10565-042)的补充有5％FBS、青霉素、链霉素和两性霉素的DMEM-F12中的非转移性皮肤黑素瘤细胞，利用媒介物或100uM辅酶Q10处理，进行不同的时间量。使用实时PCR阵列(细胞凋亡目录号PAHS-12，糖尿病目录号PAHS-023和氧化性应邀目录号PAHS-065)(SABiosciences，Frederick，MD)定量辅酶Q10处理后基因表达的任何变化。
通过将4.32mg溶解在500ul异丙醇中来制备500uM辅酶Q10的原液浓度，随后通过加入培养基将其进一步稀释。交替涡旋和加热至65℃，溶解辅酶Q10。用培养基将2mL原液稀释至10mL以获得含有100uM Q10的培养基，将其用于处理细胞。利用相似的方案(除不加入辅酶Q10外)平行制备媒介物。
将SKMEL-28细胞以1×105个细胞/孔的密度涂铺在6孔板中。24小时后，当细胞已附着并且处于50％汇合时，加入所述媒介物或100uM Q10。在Q10处理后第16、24、48或72小时收获细胞，而媒介物处理的细胞在24小时后收获。按照制造商的说明书，利用RNeasyMini试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia CA Cat#74104)试剂盒，使用离心柱(spin column)和柱上DNA酶处理(on-column DNase treatment)在不同的处理时间上裂解细胞以进行RNA分离。通过测量RNA 260nm处的吸光度定量RNA。
按照制造商的推荐，利用具有基因组DNA消除步骤的RT2FirstStrand Synthesis试剂盒(SABiosciences.，Frederick MD Cat#C-03)，将0.4-1ug总RNA用作模板，通过第一链cDNA合成来进行实时PCR。用水稀释来自第一链合成的产物，将其与SYBR green mastermix(SABiosciences.，Frederick MD Cat#PA-010-12)混合，加载至PCR阵列上，所述阵列包含用于共同途径中关联的84个不同基因、用于标准化的5个管家基因、逆转录和PCR对照的引物测定。在BioradCfx96上进行实时PCR。利用热启动激活酶来起始扩增，然后进行40个循环(每个循环：95℃-15秒变性步骤和60℃-1分钟退火和延伸步骤)，然后进行解链曲线程序。在excel电子表格中组织Ct值，来自PCR热循环仪的所有处理组的输出，将其加载至可在http://www.Sabiosciences.Com/pcr/arrayanalysis.php上获得的比较分析软件。
富集线粒体的样品的纯化：
实验内容：通过洗涤和刮取从T160培养瓶收获用100μM Q10处理24或48小时的SKMEL-28，NCI-ES0808和NIH-3T3细胞连同在t＝0时收获的细胞。将细胞离心，沉淀，快速冷冻并且于-80℃下贮存直至分离线粒体。将细胞解冻，重悬浮并且于杜恩斯匀浆器中进行破碎。将匀浆离心，使用由用于培养细胞的线粒体分离试剂盒(MitoSciences，Eugene OR，Cat#MS852)推荐的试剂和方案分离线粒体。将线粒体级分等分并且于-80℃贮存。
辅酶Q10和泛醇-10定量法：
基于最近公布的方法(Ruiz-Jimenez，2007，J.Chromatogr.A，1175，242-248)通过使用在阳离子模式中利用电喷射离子化(ESI)的LC-MS/MS执行用于同时测定辅酶Q10(Q10)和还原形式泛醇-10(Q10H2)的方法。Q10和Q10H2的高选择性鉴定和灵敏性定量连同其他选择的脂质的鉴定是可能的。将来自用100μM Q10处理的SK-MEL-28的富集线粒体的样品的等分经历常规预处理，所述预处理基于蛋白质沉淀(100μL于300μL的1-丙醇中超声处理的压紧细胞)、液体-液体提取(向上清液中加入100μL水并且用200μL正己烷提取X3)、蒸发混合的己烷提取物至干燥和于50μL的95∶5甲醇/己烷(v/v)中重建。在利用Prism RP 1X 100mm、5μM粒度的柱子的WatersQuattro II三重四极杆质谱仪上(Keystone Scientific)通过LC-MS/MS进行分析。以50μL/分钟的流速用4mM的20％异丙醇80％甲醇中的甲酸铵进行等度洗脱。每一个样品注射10μL。使用m/z882.7＞197.00(Q10H2)和m/z 880.80＞197.00(Q10)的跃迁(transition)，利用为40的锥孔电压和为30的碰撞能量进行MRM分析。
实施例3：细胞系对CoQ10的敏感性
在24小时的施用后，通过使用包含两种染料7AAD和膜联蛋白-V-PE的组合的试剂(连接蛋白试剂)测试许多细胞系对Q10的敏感性。7AAD染料经透性化细胞膜进入细胞；主要是处于细胞凋亡后期的那些细胞。膜联蛋白-V-PE是结合在早期凋亡细胞的质膜的外表面上表达的磷脂酰丝氨酸的染料。因此连接蛋白试剂可在流式细胞仪中用于区分不同凋亡细胞群体。
在24小时的Q10施用后，对于50μM Q10和100μM Q10，PaCa2细胞都显示早期和晚期凋亡细胞(5-10％的门控细胞)的增加。对于50μM和100μM Q10，PC-3细胞也显示早期和晚期凋亡群体的增加，虽然当与PaCa2细胞比较时，增加较少。对于50μM和100μM Q10，MCF-7和SK-MEL28细胞只显示早期凋亡群体的增加。HepG2细胞也对50μM Q10处理敏感，其中在晚期细胞凋亡和早期细胞凋亡阶段存在约20％的门控群体的增加。SKBr3是对于50μM和100μM Q10处理未显示早期和晚期细胞凋亡的任何显著增加的唯一测试的细胞系。结果描述于图1-6中。
为了提供Q10处理引起HepG2肝癌细胞的细胞凋亡反应的其他信息，使用测量单链DNA的基于ApoStrandTM ELISA的方法评估第二细胞凋亡测定。ApoStrandTM ELISA基于凋亡细胞中DNA对甲酰胺变性的敏感性和利用针对单链DNA(ssDNA)的单克隆抗体对变性DNA的检测。利用50和100μM Q10对肝癌细胞系HepG2的处理导致可检测的细胞凋亡，分别具有17％和32％的剂量反应(图7)。这些结果与Q10诱导来自其他组织的其他癌细胞系(例如，SCC、SKMEL-28、MCF-7和PC-3)的细胞凋亡的观察相符。
实施例4：利用Q10处理的细胞的蛋白质组学分析
使用蛋白质组学方法分析利用Q10处理的样品的细胞沉淀。裂解和处理细胞沉淀以用于2-D凝胶和Western印迹分析。利用Q10处理3个细胞类型(SKMEL-28、SCC和nFib)，将其经历利用2-D凝胶电脉进行的蛋白质组学表征。
利用Q10处理的SKMEL-28细胞的蛋白质组学分析
利用Western印迹和2-D凝胶电泳处理和评估的第一实验组是皮肤癌细胞系SKMEL-28。该实验组包括在第3、6、12和24小时用0、50或100μM Q10处理的SK-MEL-28细胞。
将一组Q10处理的SK-MEL-28样品经历2-D凝胶电泳(图8)并且进行分析以鉴定相对于对照样品蛋白质水平的变化。进行跨全部24块凝胶的943个点的比较分析，将对照样品与全部处理的样品相比较。分析包括鉴定因增加、减少或翻译后修饰而在时间过程中产生的点变化。
分析发现32个统计上显著的差异点变化。根据该分析，切取20个非冗余点并且通过胰蛋白酶消化和质谱表征进行蛋白质鉴定。利用Mascot和MSRAT软件分析针对蛋白质数据库搜索已表征的肽以鉴定蛋白(表2)。
表2.SKMEL-28细胞中经鉴定具有对Q10处理的差异反应的蛋白质
Figure BPA00001497288600831
Figure BPA00001497288600841
本实验的重要发现是转醛醇酶1的减少，这支持Q10通过改变癌细胞内的代谢状态起作用的假定。转醛醇酶1是戊糖磷酸途径(也称为单磷酸己糖支路)中的酶。转醛醇酶(EC：2.2.1.2)催化三碳酮醇单位从7-磷酸景天庚酮糖至甘油醛3-磷酸酯的可逆转移以形成赤鲜糖-4-磷酸和果糖-6-磷酸。该酶与转酮醇酶一起提供了糖酵解与戊糖磷酸途径之间的联系。这与核苷酸和NADPH合成，促进生物合成反应的还原当量的产生和还原环境的维持。
最近的出版物(Basta，P.等人August 2008，Cancer DetectPrevention，32，200-208)提供了转醛醇酶的遗传多态性的证据并且将其与头颈部鳞状细胞癌相联系。另一个相关出版物(Qian，Y.等人May2008，Biochem J，415，123-134)将转醛醇酶缺乏鉴定为线粒体动态平衡、Ca2+流动和细胞凋亡的调节剂。
根据这些初始结果，就已知的关系分析通过2-D凝胶电泳鉴定为在SK-MEL-28中受Q10调节的其他蛋白质(图9)。此类蛋白质的功能评估显示存在参与14-3-3-介导的信号转导的一组蛋白(PDCP6IP，YWHAZ和VIM)以及与许多过程[细胞周期；戊糖磷酸途径(TALDO1)；神经酰胺信号转导(CTSD)；氨酰-tRNA生物合成(GARS)和线粒体蛋白质输入(TOM22)]关联的个别蛋白质。
用Q10处理的SCC细胞的蛋白质组学分析
也制备了另一种皮肤癌细胞系鳞状细胞癌(SCC)，利用2-D凝胶电脉进行分析，作为先前SK-MEL-28分析的随访实验。在收获之前用100μM Q10处理SCC细胞，进行6小时或24小时。也收获未处理的对照细胞。裂解细胞沉淀，将样品经历2-D电泳(以一式三份)。在比较研究中分析600多个蛋白质点，将对照样品与6小时和24小时的处理相比较。
根据2-D电泳凝胶的比较分析评估前25个统计学上显著的差异点变化。根据该评估，切取12个点，通过胰蛋白酶消化和质谱表征进行鉴定(结果概述于下面表3中)。
表3.SCC细胞中在第6和24小时被鉴定为对100μM Q10处理具有差异反应的蛋白质
Figure BPA00001497288600851
Figure BPA00001497288600861
转醛醇酶1：如先前在用Q10处理的SKMEL-28细胞中观察到的，酶转醛醇酶1被调节，水平下降。这提供了先前对Q10与转醛醇酶(和从而细胞的代谢状态)的改变之间的联系的观察的独立验证。
转醛醇酶是戊糖磷酸途径的非氧化相中的酶(图10)。戊糖磷酸途径在用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原型NADH)的产生，用于还原生物合成的细胞的代谢状态中和为ATP，DNA和RNA的必需成分的核糖的形成中是至关重要的。转醛醇酶还使戊糖磷酸途径与糖酵解发生关联。糖酵解是癌细胞籍以获得细胞存活所必需的能量的代谢途径，因为氧化磷酸化的线粒体过程未被利用。Q10是氧化磷酸化和线粒体ATP产生所需的必需辅酶因子。
BSCv：Spot 23是称为BSCv的来自染色体20的新型人蛋白质。BSCv蛋白也称为脂肪细胞质膜相关蛋白(基因名称：APMAP或C20orf3)并且被预测为与蛋白质的异胡豆苷合酶家族具有序列相似性的单向II型膜蛋白。Q10处理引起该蛋白质的水平降低。该蛋白质未得到充分表征，其与异胡豆苷合酶的同源性也未获得确认。有趣地，该蛋白与在脂肪细胞分化中的作用相关(Albrektsen等人，2001)。人网膜脂肪组织的最近蛋白质组学研究将BSCv鉴定为对于病态肥胖妇女的多囊卵巢综合征(PCOS)具有差异表达的9种蛋白质之一(Corton，2008Hum.Reprod.23：651-661)。作为对Q10反应的细胞表面蛋白质，抗BSCv抗体可用作生物标志。基于目前的结果和可获得的文献，BSCv可在癌症和糖尿病中具有潜在作用。
NM23A：非转移细胞1，蛋白质(NM23A，也称为NME1)被认为是转移抑制剂。该基因(NME1)因其在高转移性细胞中降低的mRNA转录水平而被鉴定。所述蛋白具有作为二磷酸核苷激酶(NDK)的活性并且以由′A′(由该基因编码)和′B′(由NME2编码)同种型组成的六聚体存在。已在侵袭性神经母细胞瘤中鉴定了该基因的突变。NDK活性维持不同三磷酸核苷的浓度之间的平衡，例如，当将柠檬酸(克雷布斯)循环中产生的GTP转化成ATP时。NDK复合通过与STRAP相互作用而与p53关联。值得注意的是，STRAP与HNF4A关联。因此，NM23A是参与对于细胞控制和疾病治疗重要的途径的潜在蛋白。
Rho GDP解离抑制因子(GDI)α：GDI通过抑制调节GDP从它们解离和随后GTP与它们的结合来调节Rho蛋白的GDP/GTP交换反应。所述蛋白在癌细胞中被上调。
实施例5：线粒体富集分析
几条证据线索表明对线粒体蛋白质和癌症生物学的作用以及Q10反应的更近一步评估是理所当然的。首先，Q10在用于正常细胞的能量产生的线粒体氧化磷酸化过程中具有必不可少的作用。然而，癌细胞中发生的代谢转变是通过可选择的糖酵解途径进行的能量产生，该途径不需要Q10。其次，细胞的细胞凋亡反应需要线粒体蛋白质存在。Q10已被确定为刺激癌细胞的细胞凋亡(Bcl-2家族蛋白质，细胞色素c)。最后，新型线粒体蛋白质被鉴定为受Q10处理调节，如通过线粒体输入受体蛋白TOM22的蛋白质水平举例说明的(参见本文中描述的实验)。
富集线粒体的样品的产生
用100μM Q10或模拟媒介物处理皮肤癌SKMEL-28细胞6、19或48小时。通过洗涤和刮取从T160培养瓶(每一个时间点4个)收获用细胞。通过离心，沉淀收集细胞，快速冷冻沉淀并且于-80℃下贮存。重悬浮细胞，使用2mL杜恩斯匀浆器破碎细胞。试剂和方法获自用于培养细胞的线粒体分离试剂盒(MitoSciences，Eugene OR，Cat#MS852)。将所得的线粒体样品分成75μL的等分(4-5个等分/样品)并且于-80℃下贮存。
从用Q10处理的SK-MEL-28细胞分离的富集线粒体的样品的蛋 白质组学分析
对来自用100μM Q10处理6、19和48小时的SK-MEL-28的富集线粒体的样品的两个等分(连同相应的模拟媒介物对照)的溶解的蛋白质进行2-D凝胶电泳。将样品经历2-D电泳(以一式三份)。在比较研究中分析525个蛋白质点，将对照样品与其他时间点样品相比较(图11)。
9个统计学上显著的差异点变化选自2-D电泳凝胶的比较分析。从这些凝胶切取9个点，通过胰蛋白酶消化和质谱表征进行鉴定。
表4.SKMEL-28线粒体中经鉴定对Q10处理具有差异反应的蛋白质
Figure BPA00001497288600891
酰基CoA硫酯酶7：酰基CoA硫酯酶7(ACOT7)是催化脂酰CoA水解成游离脂肪酸和CoA的酶家族的成员。从而该酶在脂质代谢和细胞信号转导中具有作用。ACOT7偏受具有8-16个碳原子(C8-C16)的脂肪酸链的长链酰基CoA底物。ACOT7的确切细胞功能还不完全清楚。该基因的转录被固醇调控元件结合蛋白2激活，从而表明在胆固醇代谢中的功能。
该实施例的结果表明ACOT7潜在地直接或间接参与Q10的代谢。因此，靶向ACOT7可促进Q10的细胞内水平的调节，从而影响细胞Q10的效应。
丙酮酸激酶：丙酮酸激酶是参与糖酵解的最后一步的酶。其催化磷酸基团从磷酸烯醇丙酮酸(PEP)至ADP的转移，从而产生一个分子的丙酮酸盐和一个分子的ATP。
Figure BPA00001497288600901
所述蛋白质假定为PKM2的蛋白质，2型同种型，因为该蛋白是从富集线粒体的SK-MEL-28样品被鉴定的。众所周知该同种型参与肿瘤细胞形成和调控。
线粒体中Q10水平的定量
基于最近公布的方法(Ruiz-Jimenez，2007，J.Chromatogr.A，1175，242-248)通过使用在阳性模式中利用电喷射离子化(ESI)的LC-MS-MS执行用于同时测定辅酶Q10(Q10)和还原形式泛醇-10(Q10H2)的方法。Q10和Q10H2的高选择性鉴定和灵敏性定量连同其他选择的脂质的鉴定是可能的。将来自用100μM Q10处理的SK-MEL-28的富集线粒体的样品的等分经历常规预处理，所述预处理基于蛋白质沉淀、液体-液体提取、蒸发至干燥和利用95∶5甲醇/己烷(v/v)的重建。
在该分析中，定量Q10、Q10H2和Q9(表5)。相关分子Q9的水平较低，并且接近检测的水平。未处理的样品的水平相对恒定，6小时Q10处理的样品具有该相同的水平。为了控制总材料的样本方差，也测量胆固醇的水平以确认差异并非因样本容量误差而导致。当针对通过蛋白质提取相同线粒体制剂的其他等分获得的总蛋白质的值校正Q10水平时，相对比率是相当的。因此，在第19小时获得Q10水平的显著增加(约3倍)，在第48小时时间点甚至获得更大的增加(约6倍)(图12)。
表5.存在于来自用100μM的培养基中的Q10处理的SK-MEL-28细胞的富集线粒体的样品中的Q10的水平的HPLC-MS定量结果
Figure BPA00001497288600911
来自该研究的令人惊讶的结果是发现Q10以氧化形式提供给细胞。对于48小时的样品，也测量还原形式Q10H2，并且发现其以显著更低的量(CoQ10H2的0.28ng/样品相对于CoQ10的46.63ng/样品)存在。在Q10处理48小时的样品中存在Q10H2的水平的总体增加(3倍)，虽然所述水平接近假定的测定检测限。有趣地，氧化形式(Q10)可用作生物系统中的促氧化剂。根据文献，当估量人血浆的Q10和Q10H2时，发现大部分(90％)分子以可用作抗氧化剂的还原形式Q10H2存在(Ruiz-Jimenez，2007，J.ChromaA，1175，242-248)。
因此，这些结果确认和定量了在向培养基中外源加入Q10后，Q10的水平在线粒体中增加。令人惊讶和意外的发现是Q10以提供的氧化形式(促氧化剂)维持并且不以任何显著的量转化成还原(抗氧化剂)形式Q10H2。
实施例6：实时PCR阵列
实验1：细胞凋亡阵列
如在上文实施例3中所述，癌细胞与Q10的接触诱导此类细胞的一部分因细胞凋亡过程而死亡。为了鉴定参与Q10反应的蛋白质，应用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)法来鉴定参与细胞凋亡的靶向途径阵列的基因/蛋白质的mRNA水平的变化。
通过将PCR阵列用作筛选工具，从而可评估可潜在地为Q10在细胞内的生物学作用模式提供见解的一系列分子靶。使用实时PCR定量评估mRNA水平的变化以估量包含80个途径特异性靶的预先选择的亚组中的miRNA水平。
为了解释mRNA结果，鉴定和评估在它们的mRNA转录中改变2倍水平的基因。产生mRNA的基因转录的水平只提供表达的蛋白质的水平的潜在变化的大致估计。本领域技术人员应理解，每一种mRNA可具有不同的被降解的速率或其不能被有效翻译，从而导致不同量的蛋白质。
用50um Q10处理SkBr-3细胞24小时
RT-PCR的测定法用于测量总共84个细胞凋亡途径相关蛋白的mRNA水平变化。对使用Q10处理的(24小时)SkBr3进行的利用实时PCR细胞凋亡分析的实验将下列mRNA鉴定为受到影响：Bcl2，Bcl2L1，Bcl2L11，Birc6，Bax，Xiap，Hprt1，Apaf1，Ab11，Braf。这些结果再次提供了癌细胞对Q10处理的细胞凋亡反应的支持证据。
表6A
Figure BPA00001497288600921
Figure BPA00001497288600931
来自3个通过SK-MEL-28细胞进行的独立实验的一致的结果概述于下面表6B中。同样地，许多基因在SCC细胞中受100μM Q10处理调节。在SCC细胞中显示被调节的细胞凋亡阵列中的基因描述于表7中。我们发现在SK-MEL-28细胞和SCC细胞中许多基因在第6小时都被调节。24小时时，所述调节减弱。在SK-MEL-28细胞和SCC细胞中都显示被调节的基因描述于表8中。
表6B.当利用细胞凋亡测定法分析时，SK-MEL-28细胞中被100μM Q10处理调节的基因.
Figure BPA00001497288600932
Figure BPA00001497288600941
Figure BPA00001497288600951
表7.当利用细胞凋亡阵列分析时SCC细胞中被100μM Q10处理调节的基因
Figure BPA00001497288600971
表8.SK-MEL-28和SCC细胞中利用100μM Q10处理调控的细胞凋亡阵列的基因
  符号   描述
  BCL2   B-细胞CLL/淋巴瘤2
  BCL2L1   BCL2-样1(Bcl-xl)
  BIRC3   含杆状病毒IAP重复的3
  FADD   Fas(TNFRSF6)相关死亡结构域
  GADD45A   生长停止和DNA-损伤-诱导的，α
  TNFRSF21   肿瘤坏死因子受体超家族，成员21
  CD27   CD27分子
  TNFRSF9   肿瘤坏死因子受体超家族，成员9
  TNFSF10   肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员10
  TP73   肿瘤蛋白p73
  TRAF2   TNF受体相关因子2
有趣地，改变的mRNA水平显示一系列细胞凋亡蛋白质的显著上调，Bcl-xl是上调最高的蛋白质之一。在SK-MEL-28细胞的蛋白质阵列实验中也观察到该结果。
Bcl-xl是线粒体中的跨膜分子(Bcl-xl表示“基细胞淋巴瘤-加大型”)。其参与FAS-L的信号转导途径并且是作为蛋白质的Bcl-2家族的成员的几种抗细胞凋亡蛋白之一。其牵涉癌细胞的存活。然而，已知人Bcl-x mRNA的选择性剪接可导致至少两种不同的Bcl-x mRNA种类Bcl-xL和Bcl-xS。主要的蛋白质产物(233个氨基酸)是更大的Bcl-x mRNA，Bcl-xL，其在生长因子撤除时抑制细胞死亡(Boise等人，1993.Cell 74，597-608)。在另一方面，Bcl-xS抑制Bcl-2抑制细胞死亡的能力并且使细胞对细胞凋亡细胞死亡易感。所利用的使用的测定法不能区分Bcl-x的哪个同种型被上调。在这些研究中被CoQ10上调的Bcl-x同种型可利用本领域内已知的常规方法例如，通过使用估计两种mRNA剪接同种型的比率(Bcl-xL对Bcl-sL)的RT-PCR法来确定。
根据细胞凋亡相关蛋白的观察，观察到多个促细胞凋亡和抗细胞凋亡因子在BCL-2家族中或与这些因子相互作用调节表达水平(BCL2L11、BNIP2、BAG1、HRK、BAK1、BCL2、BCL2L1)。此类蛋白质控制线粒体外膜的透化。
对于半胱天冬酶-9的上调(16小时)观察到与先前对于半胱天冬酶3/7蛋白观察到的细胞凋亡一致的细胞凋亡反应的早期标志。应激信号转导途径的诱导引起细胞色素c从线粒体释放以及apaf-1(凋亡体)的激活，这反过来将半胱天冬酶-9的酶原切割成活性形式。一旦被启动，半胱天冬酶-9持续切割半胱天冬酶原-3和半胱天冬酶原-7以触发另外的细胞凋亡途径。
也存在与待调节的蛋白质的肿瘤坏死因子家族的一致联系。
还指出了肿瘤蛋白p73的强下调。通常见于人中的许多肿瘤(包括乳腺癌和卵巢癌)的分析显示p73的高表达(当与相应区域中的正常组织相比较时)。最近的发现表明牵涉哺乳动物细胞的细胞周期调控和DNA合成的转录因子(即：E2F-1)在体内的失调过表达诱导p73的表达。暗示着p73可能是癌蛋白质，但其可牵涉相关p53蛋白的不同机制。显示细胞凋亡途径的描绘的示意图提供于图13中。
SKMEL-28细胞
根据细胞凋亡相关蛋白质的调查，观察到多个促细胞凋亡因子和抗细胞凋亡因子存在于BCL-2家族中，或与此类因子的相互作用调节表达水平(BCL2L11、BNIP2、BAG1、HRK、BAK1、BCL2、BCL2L1)。此类蛋白质控制线粒体外膜的透化。
随着半胱天冬酶-9的上调(16小时)，观察到细胞凋亡反应的早期标志，其与先前观察到的通过半胱天冬酶3/7蛋白产生的细胞凋亡相符。应激信号转导途径的诱导引起细胞色素c从线粒体释放和apaf-1(凋亡体)的激活，这反过来将半胱天冬酶-9的酶原切割成活性形式。一旦启始，半胱天冬酶-9继续切割半胱天冬酶原-3和半胱天冬酶原-7以触发其他细胞凋亡途径。
表9.通过聚焦在细胞凋亡途径上的RT-PCR阵列评估的用100μM A10处理的SKMEL-28细胞的mRNA水平的变化
Figure BPA00001497288600991
Figure BPA00001497288601001
被调节的蛋白质与肿瘤坏死因子受体家族存在的恒定联系。
也注意到肿瘤蛋白p73的强下调。通常在人中发现的许多肿瘤(包括乳腺癌和卵巢癌)的分析显示p73的高表达(当与相应区域中的正常组织比较时)。最近的发现表明参与哺乳动物细胞的细胞周期调控和DNA合成的转录因子(即：E2F-1)在体内的失调过表达诱导p73的表达。暗示着p73可能是癌蛋白质，但可牵涉相关p53蛋白作用的不同机制。
实验2：使用氧化性应激和抗氧化剂防御阵列的实时PCR阵列
为了鉴定参与Q10反应的蛋白质，应用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)法鉴定参与氧化性应激和抗氧化剂防御的靶向途径阵列的基因/蛋白质的mRNA水平的变化。
下表10列出了在用100μM Q10处理的SK-MEL28细胞中被调节的基因。只给出了在两个独立实验中被调节的那些基因的结果。虽然在第6小时看到显著量的基因调节，但在第48小时才看到RNA水平的最显著变化。
表10.如氧化性应激和抗氧化剂防御阵列中看到的SK-MEL-28细胞中被 100μM Q10处理调节的基因
Figure BPA00001497288601011
Figure BPA00001497288601021
Figure BPA00001497288601031
Figure BPA00001497288601041
嗜中性粒细胞胞质因子2(NCF2，65kDa，慢性肉芽肿病，常染色体2)是最先诱导的mRNA之一(在第6小时观察到的)。随后在第16小时时间点和以后，嗜中性粒细胞胞质因子1(NCF1)(慢性肉芽肿病，常染色体1)在初始迟滞期后以极高水平被诱导。
嗜中性粒细胞胞质因子2是通常见于中性粒细胞的称为NADPH氧化酶的多蛋白复合物的细胞溶胶亚基。该氧化酶骤然产生大量被递送至嗜中性粒细胞吞噬体的腔中的过氧化物。
NADPH氧化酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-氧化酶)是膜结合酶复合物。其可见于质膜以及吞噬体膜中。其由6个亚基组成。这些亚基是：
Rho鸟苷三磷酸酶(GTP酶)，通常Rac1或Rac2(Rac表示Rho相关C3肉毒毒素底物)
●5个″phox″单位。(Phox表示噬菌细菌氧化酶.)
○P91-PHOX(包含血红素)
○p22phox
○p40phox
○p47phox(NCF1)
○p67phox(NCF2)
应指出，另一种NADPH氧化酶水平不改变。所述酶是NOX5，其是产生过氧化物并且以Ca(2+)-依赖性方式用作H+通道的新型NADPH氧化酶。
此外，磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸-依赖性RAC交换剂1(PREX1)也被上调。该蛋白用作小GTP结合蛋白(RAC)的RHO家族的鸟嘌呤核苷酸交换因子。已显示其结合RAC1并且通过将结合的GDP与游离GTP交换来激活RAC1。主要在细胞质中发现的所述编码的蛋白质被磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸和异三聚体G蛋白的β-γ亚基激活。
第二主要早期诱导的蛋白质是一氧化氮合酶2A(可诱导的，肝细胞)(NOS2A)。一氧化氮是在几个过程(包括神经传递以及抗微生物和抗肿瘤活性)中用作生物介体的自由基。该基因编码在肝中表达并且可由脂多糖和某些细胞因子的组合诱导的一氧化氮合酶。
超氧化物歧化酶2(线粒体(SOD2))是铁/锰超氧化物歧化酶家族的成员。其编码形成同四聚体并且每亚基结合一个锰离子的线粒体蛋白。该蛋白结合氧化磷酸化的过氧化物副产品并且将它们转化成过氧化氢和二价氧。该基因的突变与特发性心肌病(IDC)、过早衰老、散发型运动神经元病和癌症相关。
下调的蛋白质的实例是叉头框M1(FOXM1)，已知其在细胞周期进展中起着至关重要的作用，在所述周期中内源FOXM1表达在S和G2/M期达到峰值。最近的研究已显示FOXM1调节一大批G2/M-特异性基因例如Plk1、细胞周期蛋白B2、Nek2和CENPF的表达，并且在染色体分离和基因组稳定性的维持中起着重要作用。FOXM1基因现被称为人原癌基因。FOXM1的异常上调牵涉基底细胞癌(BCC)的肿瘤发生。随后在大部分人实体癌(包括肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、子宫颈癌、结肠癌、胰腺癌和脑癌)中发现FOXM1上调。利用BCC和Q10的其他研究可估计FOXM1水平。
SKMEL-28细胞
使用SKMEL-28细胞进行其他实验。在不同的时间点，利用实时PCR法(RT-PCR)将存在于用100μM Q10处理的细胞中的mRNA水平与未处理的细胞中的水平相比较。PCR阵列(SABiosciences)是在96孔板上进行的用于途径或疾病聚焦的基因经及适当的RNA质量控制的一组最优化的实时PCR引物测定法。所述PCR阵列利用实时PCR的灵敏性和微阵列的多个基因表征能力来进行基因表达分析。
表11.氧化性应激和抗氧化剂防御PCR阵列中评估的mRNA水平的列表和分类。在利用100μM Q10对SKMEL-28细胞处理6小时后，mRNA水平的最大变化通过突显蛋白质编码(增加的-粗体；减少的-下划线标示；或无变化-灰色)来标示。
Figure BPA00001497288601071
表12.SKMEL-28的100μM处理的时程评估。利用RT-PCR法监控mRNA水平变化并且评估氧化性应激和抗氧化剂防御蛋白
Figure BPA00001497288601072
Figure BPA00001497288601081
嗜中性粒细胞胞质因子2(NCF2，65kDa，慢性肉芽肿病，常染色体2)是最先诱导的mRNA(在第6小时观察到的)之一。随后在第16小时时间点和以后，嗜中性粒细胞胞质因子1(NCF1)(慢性肉芽肿病，常染色体1)在初始迟滞期后以极高水平被诱导。
嗜中性粒细胞胞质因子2是通常见于中性粒细胞的称为NADPH氧化酶的多蛋白复合物的细胞溶胶亚基。该氧化酶骤然产生大量被递送至嗜中性粒细胞吞噬体的腔中的过氧化物。NADPH氧化酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-氧化酶)是膜结合酶复合物。其可见于质膜以及吞噬体膜中。其由6个亚基组成。这些亚基是：
●Rho鸟苷三磷酸酶(GTP酶)，通常地Rac1或Rac2(Rac表示Rho相关C3肉毒毒素底物)
●5个“phox”(吞噬细胞氧化酶)亚基.
P91-PHOX(包含血红素)
p22phox
p40phox
p47phox(NCF1)
p67phox(NCF2)
应指出，另一种NADPH氧化酶水平不改变。所述酶是NOX5，其是产生过氧化物并且以Ca(2+)-依赖性方式用作H+通道的新型NADPH氧化酶。
此外，磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸-依赖性RAC交换剂1(PREX1)也被上调。该蛋白用作小GTP结合蛋白(RAC)的RHO家族的鸟嘌呤核苷酸交换因子。已显示其结合RAC1并且通过将结合的GDP与游离GTP交换来激活RAC1。主要在细胞质中发现的所述编码的蛋白质被磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸和异三聚体G蛋白的β-γ亚基激活。
第二主要早期诱导的蛋白质是一氧化氮合酶2A(可诱导的，肝细胞)(NOS2A)。一氧化氮是在几个过程(包括神经传递以及抗微生物和抗肿瘤活性)中用作生物介体的自由基。该基因编码在肝中表达并且可由脂多糖和某些细胞因子的组合诱导的一氧化氮合酶。
下调的蛋白质的实例是FOXM1，已知其在细胞周期进展中起着至关重要的作用，在所述周期中内源FOXM1表达在S和G2/M期达到峰值。最近的研究已显示FOXM1调节一大批G2/M-特异性基因例如Plk1、细胞周期蛋白B2、Nek2和CENPF的表达，并且在染色体分离和基因组稳定性的维持中起着重要作用。FOXM1基因现被称为人原癌基因。FOXM1的异常上调牵涉基底细胞癌(BCC)的肿瘤发生。随后在大部分人实体癌(包括肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、子宫颈癌、结肠癌、胰腺癌和脑癌)中发现FOXM1上调。
实验3：使用热激阵列的实时PCR阵列
运行SCC细胞的热激阵列并且被调节的基因的数据概述于下面表13中。
表13.SCC细胞中来自被100μM Q10处理调节的热激蛋白的基因
Figure BPA00001497288601101
Figure BPA00001497288601111
实施例4：使用糖尿病阵列的实时PCR阵列
进行本实施例中描述的实验以测试总体假说：Q10可影响多个基因并且改变细胞的代谢状态。利用针对一组参与糖尿病和相关途径的靶蛋白的RT-PCR评估用100μM Q10处理的SKMEL-28细胞的mRNA。该实验的结果显示参与糖酵解途径和胰岛素加工的几种蛋白质在它们的mRNA表达水平上被改变(概述于表14中)。
表14.用100μM Q10处理16小时的SKMEL-28细胞的主要mRNA水平的变化
Figure BPA00001497288601112
Figure BPA00001497288601121
该初步实验的结果显示多种胰岛素相关蛋白的mRNA水平在两个方向上都被调节。所述结果表明Q10可影响糖尿病的治疗和/或评估。
接下来进行其他实验以确认从用Q10处理的SK-MEL-28细胞获得的上述结果。SK-MEL-28细胞中的许多基因早在Q10处理后6小时被调节。然而，该初始调节在16和24小时时变得不太明显。在大约48小时时，我们发现糖尿病阵列中的许多基因再次被强烈调节。与两个或更多个独立实验一致的结果概述于下面表15中。SCC细胞似乎在Q10处理后第6和24小时显示某些基因的调节。来自SCC细胞的这些结果概述于表16中，而在SK-MEL-28细胞和SCC细胞中都被调节的基因概述于表17中。
表15.当通过糖尿病阵列分析时SK-MEL-28细胞中被100μM Q10处理调节的基因
Figure BPA00001497288601131
表16.当通过糖尿病阵列分析时SCC细胞中被100μM Q10调节的基因
Figure BPA00001497288601151
表17.对于SK-MEL-28和SCC细胞被100μM Q10处理调节的来自糖尿病阵列的基因.
  符号  描述
  G6PD  6-磷酸葡糖脱氢酶
  ICAM1  细胞间粘附分子1(CD54)，人鼻病毒受体
  PIK3CD  磷酸肌醇-3-激酶，催化的，δ多肽
  SREBF1  固醇调节元件结合转录因子1
  TNF  肿瘤坏死因子(TNF超超家族，成员2)
  TNFRSF1A  肿瘤坏死因子受体超家族，成员1A
  VEGFA  血管内皮生长因子A
多种胰岛素相关蛋白的mRNA水平在两个方向上都被调节。Q10影响细胞代谢的调节，从而影响代谢失调疾病例如糖尿病。下面进一步论述显著被调节的两个患者。
促分裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)：促分裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)是MAP激酶家族的成员。MAP激酶用作多个生物化学信号的整合点，并且参与许多细胞过程例如增殖、分化、转录调控和发育。该实验的结果显示MAPK14被显著下调。
肝细胞核因子4，α(HNF4A)：HNF4(肝细胞核因子4)主要在肝、肠、肾和胰腺β细胞中表达的细胞核受体蛋白质，其对于肝发育是至关重要的。在人中，存在分别由两个分开的基因HNF4A和HNF4G编码的NHF4的两个同种型α和γ。(参见，例如，Chartier FL，BossuJP，Laudet V，Fruchart JC，Laine B(1994)。″Cloning and sequencing ofcDNAs encoding the human hepatocyte nuclear factor 4indicate thepresence of two isoforms in human liver″.Gene 147(2)：269-72.)。
HNF4最初被分类为孤儿受体。然而，后来发现HNF4因持续结合多种脂肪酸而具有组成型活性。(参见，例如，Sladek F(2002)。″Desperately seeking...something″.Mol Cell 10(2)：219-221和JumpDB，Botolin D，Wang Y，Xu J，Christian B，Demeure O(2005)。″Fattyacid regulation of hepatic gene transcription″.J Nutr 135(11))。HNF4的配体结合结构域，与其他细胞核受体一样，采用规范的α螺旋夹心折叠(参见，例如，Wisely GB，MillerAB，Davis RG，Thornquest AD Jr，Johnson R，Spitzer T，Sefler A，Shearer B，Moore JT，Miller AB，Willson TM，Williams SP(2002)。″Hepatocyte nuclear factor 4is atranscriptional factor that constitutively binds fatty acids″.Structure10(9)：1225-34和Dhe-Paganon S，Duda K，Iwamoto M，Chi YI，Shoelson SE(2002)。″Crystal structure of the HNF4αligand bindingdomain in complex with endogenous fatty acid ligand″.J Biol Chem277(41)：37973-6)以及与辅激活因子蛋白相互作用(参见，例如，DudaK，Chi YI，Shoelson SE(2004)。″Structural basis for HNF-4alphaactivation by ligand and coactivator binding″.J Biol Chem 279(22)：23311-6)。
HNF4-α基因的突变与青春晚期糖尿病(MODY)关联。(参见，例如，Fajans SS，Bell GI，Polonsky KS(2001)。″Molecular mechanisms andclinical pathophysiology of maturity-onset diabetes of the young″.N EnglJ Med 345(13)：971-80.)
肝细胞核因子4(HNF4)是已知在肝细胞和胰腺细胞中调节许多基因的组织特异性转录因子。虽然HNF4在肾的某些部分中高度表达，但关于其在该区域中的作用和关于HNF4调节的基因在肾细胞中的作用知之甚少。HNF4的丰度和活性在肾细胞癌(RCC)中频繁减少，这表明某些肿瘤在肾细胞中抑制HNF4的功能。有趣地，已显示许多受HNF4调节的基因在RCC微阵列研究中失调。这些基因(ACY1、WT1、SELENBP1、COBL、EFHD1、AGXT2L1、ALDH5A1、THEM2、ABCB1、FLJ14146、CSPG2、TRIM9和HEY1)是当HNF4在RCC中减少时其活性被改变的基因的良好候选者。
在HNF4α的配体结合结构域的结构中(1M7W.pdb；Dhe-Paganon(2002)JBC，277，37973)；观察到从大肠杆菌(E.coli)产物共纯化的小的脂质。晶体包含括蛋白质的两个构象，其中长的螺旋10和短螺旋12具有可选择的构象。当检查脂质结合区域时，有趣地观察到存在2个出口区域(exits region)。一个出口区域具有小的脂质头基，应当注意，几个口袋区与该出口共定位。可假定Q10特异性结合该转录因子。当Q10被塑造到该脂质结合隧道中时，Q10环正好适合该表面口袋(图28)。已知的功能缺失突变(E276Q)可具有使残基排布在该表面口袋的内表面的潜能，从而对假定的Q10结合具有负面影响。
此外，通过该Q10结合模型，疏水性尾可延伸至内腔外部，随后可与延伸的螺旋10相互作用。因此，该相互作用可潜在地改变螺旋10/12组的构象。然后这可改变转录因子活性的激活/失活平衡。
实施例7：抗体微阵列分析
通过利用抗体微阵列法就Q10的存在评估蛋白质浓度。微阵列包含700多种蛋白质的抗体，采集许多蛋白质类型和潜在的途径标志作为样品。
利用抗体阵列(Panorama XP725抗体阵列，Sigma)和处理了6或24个小时的SK-MEL-28进行评估用Q10处理的细胞中蛋白质浓度水平的变化的初步实验。收获细胞，提取细胞以获得可溶性蛋白质上清液。用荧光染料(分别地Cy3和Cy5)各自标记来自每一个样品(以1mg/mL的浓度)的蛋白质(总共约1mg)的两部分。从蛋白质除去过量染料，将材料用于微阵列温育。为了比较两个时间点的样品，混合等量的蛋白质，每一个样品具有不同的标记类型(例如，将用Cy3标记的3小时提取物与用Cy5标记的24小时提取物混合)。在与微阵列芯片温育(按照制造商推荐的方案)后，洗涤芯片，进行干燥。利用荧光激光扫描仪扫描微阵列以测量Cy3和Cy5染料的相对荧光强度。
表18.在用50μM Q10处理24小时后在SK-MEL-28细胞中具有升高的水平的蛋白质
Figure BPA00001497288601191
表19.在用50μM Q10处理24小时后在SK-MEL-28细胞中具有升高的水平的蛋白质
Figure BPA00001497288601192
Figure BPA00001497288601201
为了确认先前观察到的细胞凋亡蛋白质，和将评估扩展至更大量的促细胞凋亡和抗细胞凋亡蛋白质，选择能够筛选潜在包括的蛋白质的广泛家族的两个测定法。
首先，利用抗体微阵列(Panorama XP725抗体阵列，Sigma)筛选700多种蛋白质抗体以评估用50μM Q10处理24小时的SK-MEL-28细胞中蛋白质浓度水平上的变化。
根据对使用Q10(24小时)的SKMEL-28的抗体阵列实验，下列是一些具有改变的水平的已鉴定的蛋白质：Bcl-xl、Bmf、BTK、BLK、cJun(pSer63)、连接蛋白32、PUMA bbc3、BID、Par4、cCbl。该初步研究的主要结论是预期的促细胞凋亡蛋白质被改变。
用于SK-MEL-28的抗体微阵列
利用抗体微阵列(Panorama XP725抗体阵列，Sigma)筛选700多种蛋白质抗体以评估用50μM Q10处理24小时的SK-MEL-28细胞中蛋白质浓度水平上的变化。
表20.用50μM Q10处理的SKMEL-28中蛋白质水平的变化
根据对利用Q10(24小时)的SKMEL-28进行的抗体阵列实验，下列是具有改变的水平的已鉴定的蛋白质中的一些蛋白质：Bcl-xl、Bmf、BTK、BLK、cJun(pSer63)、连接蛋白32、PUMA bbc3、BID、Par4、cCbl。这些数据确认了促细胞凋亡蛋白的水平在与升高的水平的外源加入的Q10一起温育后被改变。
Bcl-xl(“基细胞淋巴瘤-加大型”)是线粒体中的跨膜分子。其参与FAS-L的信号转导途径并且是作为蛋白质的Bcl-2家族的成员的几种抗细胞凋亡蛋白之一。其牵涉癌细胞的存活。然而，已知人Bcl-xmRNA的选择性剪接可导致至少两种不同的Bcl-x mRNA种类Bcl-xL和Bcl-xS。主要的蛋白质产物(233个氨基酸)是更大的Bcl-x mRNA，Bcl-xL，其在生长因子撤除进抑制细胞死亡(Boise等人，1993.Cell74，597-608)。在另一方面，Bcl-xS抑制Bcl-2抑制细胞死亡的能力并且使细胞对细胞凋亡细胞死亡易感。
表21.在用100μM Q10处理24小时后在SCC细胞中具有升高的水平的蛋白质
Figure BPA00001497288601212
Figure BPA00001497288601221
Figure BPA00001497288601231
表22.在用100μM Q10处理24小时后在SCC细胞中具有降低的水平的蛋白质
  名称   比率
  AP1   0.68
  中心体蛋白(Centrin)   0.55
  CUGBP1   0.67
  Cystatin A   0.69
  细胞角蛋白CK5   0.60
  纤连蛋白   0.63
  gParvin   0.70
  独立生长因子1   0.63
  神经生长因子b   0.60
  半胱天冬酶原8   0.72
  Rab7   0.62
  Rab9   0.73
  苏氨酸蛋白磷酸酶1gl   0.71
  丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶2ABg   0.73
  SKM1   0.70
  SLIPR MAGI3   0.67
  膜收缩蛋白a和b   0.70
  Spred2   0.66
  TRF1   0.74
实施例8：Western印迹分析
对皮肤癌细胞系SKMEL-28进行利用Western印迹和2-D凝胶电泳进行处理和评估的第一实验。该实验设置包括在第3、6、12和24小时用50或100μM Q10处理的SK-MEL-28细胞。
利用针对Bcl-xL的抗体(图14)、波形蛋白的抗体(图15、线粒体氧化磷酸化功能的一系列抗体(图16-21)以及针对一系列与线粒体膜完整性相关的抗体(图22-27)的Western印迹分析评估多种细胞类型。这些实验的结果显示几种检查的蛋白质作为利用Q10的细胞处理的结果被上调或下调。
实施例9：通过用100uM Q10处理胰腺癌细胞(PaCa2)被鉴定为在mRNA水平上受调节的糖尿病相关基因
在处理后不同的时间上对利用100uM Q10处理的样品进行糖尿病测定。基本上如上所述进行实验。经发现当Q10处理时被调节的不同基因概述于下面表23中。所述结果显示下列基因被Q10处理调节：ABCC8、ACLY、ADRB3、CCL5、CEACAM1、CEBRA、FOXG1、FOXP3、G6PD、GLP1R、GPD1、HNF4A、ICAM1、IGFBP5、INPPL1、IRS2、MAPK14、ME1、NFKB1、PARP1、PIK3C2B、PIK3CD、PPARGC1B、PRKAG2、PTPN1、PYGL、SLC2A4、SNAP25、HNF1B、TNRFSF1A、TRIB3、VAPA、VEGFA、IL4R和IL6。
表23：其表达被100μM Q10调节的来自糖尿病阵列的基因和它们在细胞中的可能功能
上调(灰色)和下调(白色)
  基因名称   基因功能
  ADRB   cAMP信号转导，G蛋白信号转导
  CCL5   CCR5的天然配体并且被TNF调节
  CEACAM1   抗细胞调亡，血管生成的正调节
  GLPR1   增加胰岛素和减少胰腺分泌胰高血糖素
  GPD1   碳水化合物代谢，NADH氧化
  ICAM1   被阿托伐他汀调节，加工某些半胱天冬酶.
MAPK14 DNA损伤检查点，血管生成，葡萄糖代谢过程
  PARP1   DNA修复，调节TP53，NOS2A，NFKB，端粒维持
  PIK3C2B   磷酸肌醇介导的信号转导，调节AKT和AKT1
  PIK3CD   激酶
  PYGL   碳水化合物代谢，调节糖原和糖原合成
  SLC2A4   调节葡萄糖并且被INS和胰岛素调节
  SNAP25   胰岛素分泌、神经递质摄入的调节
  CEBPA   糖皮质激素受体信号转导，VDR/RXR激活
  FOXP3   调节IL4，IL2.
  G6PD   戊糖磷酸途径，谷胱甘肽代谢
  IGFBP5   细胞生长的调节，被IGF1调节
  INPPL1   调节Akt和糖原
  IRS2   IGF-1信号转导
  ME1   调节苹果酸并且受T3调节.
  NFKB1   调节IL6和TNF.
  PPARGC1B   受MAPK14调节
  PRKAG2   脂肪酸，胆固醇生物合成
  PTPN1   脱磷酸JAK2和EGF受体激酶.
  VEGFA   激酶，血管生成
  IL4R   被TP73上调，结合IRS1和IRS2
  HNF1B   HNF4A
  TNFRSF1A   促细胞凋亡
  TRIB3   调节AKT1和NFkB的负调节剂
  VAPA   调节NFkB，小囊泡运输
实施例10：通过利用100μM Q10处理胰腺癌细胞(PaCa2)被鉴定为在mRNA水平上被调节的血管生成相关基因
在处理后不同的时间上对利用100uM Q10处理的样品进行血管生成测定。基本上如上所述进行实验。经发现当Q10处理时被调节的不同基因概述于下面表24中。所述结果显示下列基因被Q10处理调节：AKT1、ANGPTL4、ANGPEP、CCL2、CDH4、CXCL1、EDG1、EFNA3、EFNB2、EGF、FGF1、ID3、IL1B、IL8、KDR、NRP1、PECAM1、PROK2、SERPINF1、SPHK1、STAB1、TGFB1、VEGFA和VEGFB。
表24：其表达被100μM Q10调节的来自血管生成阵列的基因和它们在细胞中的可能功能的列表
上调(灰色)和下调(白色)
Figure BPA00001497288601261
实施例11：通过用100μM Q10处理胰腺癌细胞(PaCa2)被鉴定为在mRNA水平上被调节的细胞凋亡相关基因
在处理后不同的时间上对利用100uM Q10处理的样品进行细胞凋亡测定。基本上如上所述进行实验。经发现当Q10处理时被调节的不同基因概述于下面表25中。所述结果显示下列基因被Q10处理调节：ABL1、AKT1、Bcl2L1、BclAF1、CASP1、CASP2、CASP6、CIDEA、FADD、LTA、TNF、TNFSF10A和TNFSF10。
表25：其表达被100μM Q10调节的来自细胞凋亡阵列的基因和它们在细胞中的可能功能的列表
上调(灰色)和下调(白色)
Figure BPA00001497288601272
Figure BPA00001497288601281
实施例12：关于肝癌(HepG2)细胞的PCR糖尿病阵列
利用媒介物处理HepG2(肝癌)细胞进行24小时或利用100μMQ10处理所述细胞进行不同的时间。按照用于PaCa2细胞的方法(上文中，实施例9-11)以1×105个细胞/孔起始处理。然而，从这些样品提取的RNA的总量低于预期。通常使用1μg的总RNA(通过260nm处的测量测定的)进行逆转录。每逆转录可使用的最大体积为8μL。由于RNA浓度较低，所以使用0.44μg的RNA进行利用媒介物和来自16小时和48小时的Q10处理的样品的RT-PCR阵列分析。所述阵列提供了利用100μM Q10处理进行的HepG2基因调节的趋势和模式的初步分析，如下面表26中概述的。所述结果显示基因PPARGC1A、PRKAA1和SNAP25中的每一个在处理后第16小时被下调(分别约1/20、1/6和1/5)。在处理后第48小时，PPARGC1A和PRKAA1已标准化或被略微上调，然而SNAP25被下调约1/2。
表26：当用100μM Q10处理HepG2细胞时在糖尿病阵列中被调节的基因的列表
Figure BPA00001497288601282
实施例13：关于肝癌(HEPG2)细胞的PCR血管生成阵列
利用媒介物处理HepG2(肝癌)细胞进行24小时或利用100μMQ10处理所述细胞进行不同的时间。按照用于PaCa2细胞的方法(上文中实施例9-11)以1×105个细胞/孔起始处理。然而，从这些样品提取的RNA的总量低于预期。通常使用1μg的总RNA(通过在260nm处的测量测定的)进行逆转录。每逆转录可使用的最大体积为8μL。由于RNA浓度较低，所以使用0.44μg的RNA进行利用媒介物和来自16小时和48小时的Q10处理的样品的RT-PCR阵列分析。所述阵列提供了利用100μM Q10处理进行的HepG2基因调节的趋势和模式的初步分析，如下面表27中概述的。经发现在Q10处理时被调节的不同基因概述于下面表27中。所述结果显示基因ANGPTL3、ANGPTL4、CXCL1、CXCL3、CXCL5、ENG、MMP2和TIMP3中的每一个在处理后第16小时被上调(分别达到对照的约5.5、3、3、3.2、3、3、1和6.5倍、6倍和5倍)。在Q10处理后第16小时ID3被下调至对照的约1/5。在处理后第48小时，ANGPTL3、CXCL1、CXCL3、ENG和TIMP3仍然被上调(分别达到对照的约3.5、1.5、3.175、2和3倍)，然而ANGPTL4、CXCL5、ID3和MMP2分别被下调至对照的约1/1、1/1、1/2和1/18。
表27：当用100μM Q10处理HepG2细胞时在血管生成阵列中被调节的基因的列表
Figure BPA00001497288601292
Figure BPA00001497288601301
已知参与血管生成的过程的蛋白质是所述RT-PCR阵列中的成分。血管生成是癌细胞籍以变成恶性的至关重要的过程。此类蛋白质中的一些也牵涉糖尿病。
ANGPTL3和ANGPTL4：涉及ANGPTL3的文献将该蛋白与脂质代谢的调节相联系。具体地，文献(Li，C.Curr Opin Lipidol.2006Apr；17(2)：152-6)教导血管生成素和血管生成素-样蛋白共有相似的结构域结构。ANGPTL3和4是抑制脂蛋白脂酶活性的该超家族的仅有的两个成员。然而，ANGPTL3和4在多个水平上被差异调节，表明体内非冗余功能。ANGPTL3和4被蛋白水解加工成两个半部分并且被细胞核受体差异调节。ANGPTL4的转基因过表达以及ANGPTL3或4的敲除证明这两个蛋白质在脂蛋白代谢中起着必不可少的作用：肝来源的ANGPTL3主要在进食状态中抑制脂蛋白脂酶活性，而ANGPTL4在进食和禁食状态中起着重要作用。此外，ANGPTL4调节脂蛋白来源的脂肪酸的组织特异性递送。从而取决于其表达位置，ANGPTL4是脂蛋白脂酶的内分泌或自分泌/旁分泌抑制剂。
脂蛋白脂酶是将脂蛋白中的脂质例如乳糜微粒和极低密度脂蛋白(VLDL)中发现的脂质水解成3个游离脂肪酸和1个甘油分子的酶。给定的组织中的脂蛋白脂酶的活性是吸收甘油三酯来源的脂肪酸的限速步骤。脂肪酸分配中的不平衡具有重大代谢后果。已显示高脂肪饮食引起LPL的组织特异性过表达，这牵涉组织特异性胰岛素抗性和作为结果2型糖尿病的发展。
本实施例的结果表明Q10调节参与脂质代谢的蛋白质，从而使得ANGPTL3/ANGPTL4和它们的相关途径的研究理所当然。例如，ANGPTL3/ANGPTL4被认为在下列途径中起着重要作用：Akt、胆固醇、脂肪酸、HDL-胆固醇、HNF1A、ITGA5、ITGA5、ITGAV、ITG83、L-三碘甲腺原氨酸(trilodothynonine)、LIPG、LPL、Mapk、Nrth、NR1H3、PPARD、PTK2、RXRA、三酰甘油和9-顺-视黄酸。
实施例14：关于肝癌(HEPG2)细胞的PCR细胞凋亡阵列
如上所述对用100uM Q10处理16和48小时的样品进行细胞凋亡测定。然而，通过选择FAM而非SYBR作为荧光基团来进行48小时的测定。FAM和SYBR在相同波长上发荧光。
发现当Q10处理时被调节的不同基因概述于下表28中。所述结果显示在Q10处理后第16小时CASP9被上调，约为对照的61倍，而BAG1和TNFRSF1A在处理后第16小时被分别下调至对照的约1/6和1/4。在处理后第48小时，CASP9、BAG1和TNFRSF1A被分别上调至对照的约55、1和1倍。
表28：当用100μM Q10处理HepG2细胞时在凋亡阵列中被调节的基因的列表
Figure BPA00001497288601321
实施例15：评估表观代谢转变剂治疗肿代谢碍的能力
为了确定所选择的表观代谢转变剂例如CoQ10是否能够治疗代谢障碍例如糖尿病，应用监测体外胰岛素刺激的葡萄糖吸收的增加的基于细胞的测定。具体地，将分化的小鼠脂细胞用于鉴定具有当胰岛素刺激时增加葡萄糖吸收的能力的试剂，如通过放射标记的葡萄糖的闪烁计数检测的(使用例如，Perkin Elmer 1450Microbeta JET读数计)。如下进行此类测定。
材料和方法
Prees培养基
如下制备完全培养基，也称为″Prees″培养基。用L-谷氨酰胺、青霉素-G和链霉素(青霉素/链霉素)补充达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，然后加热灭活胎牛血清(FBS)(在65℃下加热灭活30分钟)。因为血清可影响细胞的生长、附着和分化，因此在使用之前首先测试任何新批次的血清。在培养箱(5％CO2)中平衡培养基直至pH在适当的范围内(约7)，如通过指示剂染料的红/橙色所指示的。如果培养基变成粉红(表示高pH)，则我们弃去培养基，因为碱性条件可影响细胞并且使分化培养基-1(DM1)和分化培养基-2(DM2)中使用的胰岛素变性。
分化培养基
通过用10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、IBMX(375μM)、胰岛素(120nM)和地塞米松(188nM)补充DMEM来制备分化培养基-1(DM1)。通过用10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素和胰岛素(120nM)补充DMEM来制备分化培养基-2(DM2)。
凝胶化板的制备
如下凝胶化细胞培养板。对明胶(1％w/v于蒸馏水中)进行高压灭菌，然后在室温下贮存。用明胶溶液均一地覆盖每一个细胞培养孔的底部，确保没有气泡形成。除去该溶液，留下一层明胶薄膜。使这些板在组织培养通风厨中干燥。然后用PBS洗涤板，之后向细胞培养孔中加入0.5％的戊二醛溶液(戊二醛，于蒸馏水中)。10分钟后，用含有青霉素-链霉素的DMEM洗涤孔2次。每一个洗涤步骤应当持续约5分钟。
细胞培养
约每2-3天或当达到约60％的汇合时分离3T3-L1脂肪前体细胞。过度汇合可影响此类细胞分化成脂肪细胞的能力。
其他试剂
向DPBS混合物中加入D-(+)-葡萄糖(″冷″葡萄糖，未放射性标记的)至10mM的终浓度。
每一次(在使用的1至2个小时内)新鲜制备裂解缓冲液，碱(例如，终浓度为0.5N的氢氧化钠)和去垢剂(例如，被稀释至0.1％w/v终浓度的十二烷基硫酸钠(SDS))的混合物。使用前，将裂解缓冲液温热至超过室温的温度，进行约30分钟，以避免缓冲液的沉淀。
葡萄糖吸收的测定
将脂肪前体细胞3T3-L1以约以约5000个细胞/孔的密度铺板(于黑色NUNC 96孔板中)。此类细胞在两个分开的步骤中分化成脂肪细胞。最初，将细胞培养在分化培养基-1(DM1)(脂肪细胞分化的第1天)中进行2至3天的时间段。DM1阻止增殖并且诱导脂肪细胞特异性基因表达。然后将细胞培养在分化培养基-2(DM2)中进行3至4天，之后用新鲜DM2更换培养基。在分化的第9-15天进行葡萄糖吸收测定。
在实验前2天(在分化的第7-13天)，除去DM2并且用新鲜Prees培养基替代。在该时间加入候选化合物，使进行约48小时的温育时期。在实验的当天，在DPBS，硫酸镁(0.8mM)和Hepes(10mM)中，在约pH.7下对细胞(现于分化的第9至15天)进行血清饥饿，进行3小时。在该温育时间段后，向脂肪细胞加入含有胰岛素(10nM)的新鲜DPBS。将不具有任何胰岛素的新鲜DPBS置于用作阴性对照的细胞上。在于37℃下进行25分钟的温育时间段后，在室温下向培养基中加入放射性葡萄糖(用14C标记的，以0.04mM的终浓度，每孔约0.26μCi 14C-葡萄糖)，进行15分钟的时间段。然后除去培养基，充分清洗细胞，裂解细胞。裂解后，细胞形成小而混浊团块，从孔底部分脱离。向每一个孔中加入10％冰醋酸以中和裂解反应。随后向孔中加入闪烁液，通过使用MicroBeta板读数器测量每一个孔中的放射性的量来测定葡萄糖的掺入。
通过使用上述实验方案，表观代谢转变剂被鉴定为能够治疗代谢障碍例如糖尿病，此时表观代谢转变剂在体外增强、增加或促进胰岛素刺激的葡萄糖吸收。
实施例16：与代谢障碍相关的MIM的鉴定
为了将候选分子(例如，环境影响剂)评估为潜在的MIM，向一组细胞系外源地加入选择的候选MIM，所述小组由患病(癌症)细胞系和正常对照细胞系组成，并且评估组中每一个细胞系的诱导的细胞微环境特征谱的变化。评估和比较患病细胞相对于正常细胞的细胞形态学、生理学和/或细胞组成(包括例如mRNA和蛋白质水平)的变化。
通过检查细胞对候选MIM的敏感性和细胞凋亡反应来评估细胞形态学/生理学的变化。如实施例3中详细描述的进行这些实验。简而言之，用不同浓度的候选MIM处理由至少一种对照细胞系和至少一种癌细胞系组成的一组细胞系。通过在不同的时间上和在一系列应用的浓度上监控细胞存活率来评估细胞系对潜在的MIM的敏感性。通过使用例如与流式细胞术方法组合的连接蛋白试剂来评估细胞对潜在的MIM的细胞凋亡反应。连接蛋白试剂包含两种染料7AAD和膜联蛋白-V-PE的组合，并且允许定量处于早期和晚期细胞凋亡的细胞群体。可利用例如ApostrandTM ELISA法，使用测量单链DNA的另外的细胞凋亡测定法。评估和比较患病细胞系和对照细胞系的敏感性和细胞凋亡反应。显示差异细胞毒性和/或差异地诱导患病细胞相对于正常细胞的细胞凋亡反应的分子被鉴定为MIM。
评估利用候选MIM处理后细胞的组成的变化。使用实时PCR阵列法分析基因表达在mRNA水平上的变化。如实施例6和9-13中详细描述的进行这些实验。简而言之，向一个或多个细胞系(包括例如患病细胞和正常对照细胞系)外源地加入候选MIM，在处理后不同时间上从细胞提取mRNA。通过使用靶向途径阵列(包括例如特异于细胞凋亡、氧化性应激和抗氧化防御、血管生成、热激或糖尿病的阵列)来评估参与特定途径的基因的mRNA的水平。鉴定和评估了在它们的mRNA转录上改变2倍水平或更高水平的基因。诱导细胞的mRNA水平的变化和/或诱导患病细胞相对于正常细胞的一种或多种mRNA的水平的差异变化的分子被鉴定为MIM。
在互补实验中，通过使用抗体微阵列法、双向凝胶电泳，然后使用质谱表征进行的蛋白质鉴定以及利用western印迹分析法来分析基因表达在蛋白质水平上的变化。分别如实施例7、4和8中所述进行这些实验。简而言之，向一个或多个细胞系外源地加入候选MIM，所述细胞系包括例如患病细胞和正常对照细胞系，在处理后不同时间点例如6小时或24小时从细胞提取可溶性蛋白质。由候选MIM诱导的蛋白质水平的变化通过使用包含700多种蛋白质的抗体的抗体微阵列，获取许多蛋白质种类的样品和潜在的途径标志来评估。可通过使用与质谱法偶联的双向(2-D)凝胶电泳进行其他互补蛋白质组学分析。向一个或多个细胞系外源地加入候选MIM，所述细胞系包括例如患病细胞和正常对照细胞系，裂解细胞沉淀，将其经历2-D凝胶电泳。分析凝胶以鉴定处理的样品相对于对照未处理的样品的蛋白质水平的变化。分析凝胶以鉴定在处理的时间过程中因升高的水平、降低的水平或翻译后修饰而引起的点变化。切取显示统计上显著的变化的点，利用胰蛋白酶消化和质谱表征对其进行蛋白质鉴定。利用例如Mascot和MSRAT软件分析针对蛋白质数据库搜索表征的肽，以鉴定所述蛋白质。除了上述2-D凝胶分析和抗体微阵列实验外，还可通过Western印迹分析评估由候选MIM诱导的特定蛋白质的水平的潜在变化。在所有蛋白质组学实验中，鉴定和评估了在不同细胞系中具有升高或下降的水平的蛋白质。诱导细胞的蛋白质水平的变化和/或诱导患病细胞相对于正常细胞的一种或多种蛋白质的水平的差异变化的分子被鉴定为MIM。
将从上述实验发现的被利用候选MIM的处理调节的基因经历细胞和生物化学途径分析，从而可将其分类至不同的细胞途径中，包括例如细胞凋亡、癌症生长学和细胞生长、糖酵解和代谢、分子运输和细胞信号转导。
进行实验以确认候选MIM进入细胞，以确定候选MIM是否定位在细胞内，以及测定存在细胞中的候选MIM的水平和形式。例如如实施例5中详细描述的，进行这些实验。例如，为了测定存在于线粒体中的候选MIM的水平和形式，制备和分析来自用候选MIM处理的细胞的富集线粒体的制剂。从而可确认存在于线料体中的候选MIM的水平在添加外源候选MIM后以时间和剂量依赖性的方式增加。此外，通过使用2-D凝胶电泳分析来自富集线粒体的样品的蛋白质水平的变化，并且利用质谱表征进行蛋白质鉴定，如上文中对于总细胞蛋白质样品所描述的。将经发现进入细胞并且以升高的水平存在于例如线粒体中的候选MIM鉴定为MIM。可使在时间过程中被检查的细胞中或例如特别地线粒体中的候选MIM的水平与如通过例如特定蛋白质的mRNA和蛋白质水平的调节所证明的其他观察到的细胞变化发生关系。
将被观察到诱导细胞组成的变化，例如在mRNA或蛋白质水平上诱导基因表达的变化的候选MIM鉴定为MIM。将被观察到相对于正常状态在疾病状态(例如，糖尿病或肥胖症)中诱导细胞形态学、生理学或细胞组成的差异变化(例如，mRNA或蛋白质水平上的基因表达的差异变化)的候选MIM鉴定为MIM和特别地具有多维特征。经发现能够进入细胞的候选MIM被鉴定为MIM和特别地具有多维特征，因为所述候选MIM从而除了治疗效应外还展示载体效应。
实施例17：CoQ10被鉴定为与代谢障碍相关的表观代谢转变剂
利用不同水平的辅酶Q10处理一组皮肤细胞系，其由对照细胞系(例如，角质细胞和黑素细胞的原代培养物)和几种皮肤癌细胞系(例如，SK-MEL-28，非转移性皮肤黑素瘤；SK-MEL-2，转移性皮肤黑素瘤；或SCC，鳞状细胞癌；PaCa2，胰腺癌细胞系；或HEP-G2，肝癌细胞系)组成。当与对照细胞系相比较时，癌细胞系显示和改变剂量依赖性反应，只在癌细胞中诱导细胞凋亡和细胞死亡。详细的示例性实验示于例如本文中的实施例3中。
应用测定法评估利用CoQ10处理后的上文中鉴定的细胞的mRNA和蛋白质水平组成的变化。使用特异于细胞凋亡、氧化性应激和抗氧化剂、血管生成和糖尿病的每一个的实时PCR微阵列分析mRNA表达的变化。使用抗体微阵列分析和western印迹分析法分析蛋白质表达的变化。这些实验的结果显示mRNA和蛋白质水平上的基因表达的变化因辅酶Q10的添加而在细胞系中发生。观察到已知与细胞代谢过程相关或参与其中的许多基因作为利用CoQ10处理的结果而被调节。例如，发现细胞核受体蛋白HNF4A的表达在Q10处理后在细胞中被上调。转醛醇酶1(TAL)的表达在用Q10处理的细胞中也被调节。TAL平衡NADPH和活性氧中间体的水平，从而调节线粒体跨膜电位，所述跨膜电位是ATP合成和细胞存活的关键检查点。针对与代谢障碍的特别相关性，已知与例如糖尿病相关的许多基因被鉴定为受Q10调节。详细的示例性实验示于例如本文中的实施例4、6、7、8和9中。
Q10是线粒体中用于能量产生的氧化磷酸化过程的必需辅因子。通过分析来自用CoQ10处理的细胞的富集线粒体的制剂来测定存在于线粒体中的辅酶Q10的水平以及CoQ10的形式。存在于线粒体中的辅酶Q10的水平经确定在添加外源Q10后以时间和剂量依赖性方式增加。时间过程与如在与代谢和细胞凋亡途径相关的特定蛋白质的mRNA和蛋白质水平的调节中观察到的许多细胞变化相关。详细的示例性实验示于例如本文中的实施例5中。
本文中描述的结果将内源分子CoQ10鉴定为表观代谢转变剂。具体地，所述结果将CoQ10鉴定为诱导细胞中代谢状态的转变和线粒体功能的部分恢复。这些结论基于本文中描述的数据的下列解释和本领域内的现有知识。
已知Q10在线粒体内膜中合成，被主动运输至其中，富集在其中和用于其中。还已知Q10是线粒体中用于能量产生的氧化磷酸化过程的必需辅因子。然而，大多数癌细胞主要通过糖酵解，然后在细胞溶胶中进行乳酸发醇(而非如大多数正常细胞一样在线粒体中通过丙酮酸的氧化)来产生能量。氧化磷酸化包括电子传递复合物和细胞色素c。细胞凋亡包括线粒体的破裂，促细胞凋亡因子对线粒体内膜的透化。通过利用不同的代谢能量合成途径，癌细胞能够缓解对细胞的异常情况的正常细胞凋亡反应。然而不希望受理论束缚，本申请人提出Q10通过上调氧化磷酸化途径的蛋白质，从而使线粒体功能转换回可识别致癌缺陷和触发细胞凋亡的状态来起作用。因此，Q10通过转变细胞的代谢状态发挥表观代谢转变剂的作用。
实施例18：与代谢障碍相关的表观代谢转变剂的鉴定
利用不同水平的候选表观代谢转变剂处理一组皮肤细胞系，其由对照细胞系(例如，角质细胞和黑素细胞的原代培养物)和癌细胞系(例如，SK-MEL-28，非转移性皮肤黑素瘤；SK-MEL-2，转移性皮肤黑素瘤；或SCC，鳞状细胞癌；PaCa2，胰腺癌细胞系；或HEP-G2，肝癌细胞系)组成。通过检查细胞对候选表观代谢转变剂的敏感性和细胞凋亡反应来评估细胞形态学/生理学的变化。如实施例3中详细描述的进行这些实验。简而言之，通过在不同时间上和在一系列应用的浓度上监控细胞存活率来评估细胞系对候选表观代谢转变剂的敏感性。通过使用例如与流式细胞术方法组合的连接蛋白试剂来评估细胞对候选表观代谢转变剂的细胞凋亡反应。连接蛋白试剂包含两种染料7AAD和膜联蛋白-V-PE的组合，并且允许定量处于早期和晚期细胞凋亡的细胞群体。可利用例如ApostrandTM ELISA法，使用测量单链DNA的另外的细胞凋亡测定法。评估和比较患病细胞系和对照细胞系的敏感性和细胞凋亡反应。基于相对于正常或对照细胞它们优先或选择性抑制在癌细胞中的细胞生长的能力评估候选表观代谢转变剂。还基于相对于正常或对照细胞它们优先或选择性诱导癌细胞中的细胞凋亡的能力评估候选表观代谢转变剂。
应用测定法评估利用候选表观代谢转变剂处理后的上文中鉴定的细胞的mRNA和蛋白质水平组成的变化。使用实时PCR微阵列分析mRNA水平的变化。如实施例6和9-13中详细描述的进行这些实验。简而言之，在处理后不同时间上从细胞提取mRNA。通过使用靶向途径阵列(包括特异于细胞凋亡、氧化性应激和抗氧化防御、血管生成、热激或糖尿病的阵列)评估参与特定途径的基因的mRNA的水平。鉴定和评估了在它们的mRNA转录上被改变2倍水平或更高水平的基因。
使用抗体微阵列分析、与质谱表征偶联的2-D凝胶电泳分析和western印迹分析法分析蛋白质表达的变化。分别如实施例7、4和8中详细描述的进行这些实验。简而言之，在利用候选表观代谢转变剂处理后不同的时间上例如6小时或24小时，从细胞提取可溶性蛋白质。由候选表观代谢转变剂诱导的蛋白质水平的变化通过使用包含700多种蛋白质的抗体的抗体微阵列，获取许多蛋白质种类样品和潜在的途径标志来评估。通过使用偶联质谱技术的双向(2-D)凝胶电泳进行进一步的互补蛋白质组学分析。向细胞系中外源加入候选表观代谢转变剂，裂解细胞沉淀，将其经历2-D凝胶电泳。分析凝胶以鉴定经处理的样品相对于对照未处理的样品的蛋白质水平的变化。分析凝胶以鉴定因升高的水平、降低的水平或翻译后修饰而在处理的时间过程中引起的点变化。切取显示统计上显著的变化的点，利用胰蛋白酶消化和质谱表征对其进行蛋白质鉴定。利用例如Mascot和MSRAT软件分析针对蛋白质数据库搜索表征的肽，以鉴定所述蛋白质。除了上述2-D凝胶分析和抗体微阵列实验外，还可通过Western印迹分析评估由候选MIM诱导的特定蛋白质的水平的潜在变化。在所有蛋白质组学实验中，鉴定和评估了在不同细胞系中具有升高或下降的水平的蛋白质。
基于细胞系中因候选表观代谢转变剂的添加而诱导的基因表达在mRNA和/或蛋白质水平上的变化评估所述候选表观代谢转变剂。具体地，基于它们调节已知与细胞代谢过程相关或参与其中的基因的能力评估候选表观代谢转变剂。基于它们调节已知与例如糖尿病或肥胖症相关的基因的能力评估候选表观代谢转变剂，特别是与代谢障碍的相关性。
使用本领域技术人员已知的常规方法测定候选表观代谢转变剂的水平以及候选表观代谢转变剂存在于细胞中的形式或具体的细胞定位。例如，通过分析来自用候选表观代谢转变剂处理的细胞的富集线粒体的制剂来测定线粒体中候选表观代谢转变剂随时间过去和在一系列剂量上的水平。可比较线粒体中候选表观代谢转变剂的水平和使该水平与观察到其他细胞变化例如，与代谢和细胞凋亡途径相关的特定蛋白质的mRNA和蛋白质水平的调节发生关系。
将基于获自上述实验的结果观察到诱导细胞的代谢状态的转变的候选表观代谢转变剂鉴定为表观代谢转变剂。例如，展示在细胞中增强、增进或增加胰岛素刺激的葡萄糖吸收的候选表观代谢转变剂被鉴定为表观代谢转变剂。
实施例19：维生素D3被鉴定为表观代谢转变剂
维生素D3或1α，25-二羟基维生素D3(也称为骨化三醇)是通过两步酶促法从维生素D合成的维生素D代谢产物。维生素D3与其遍在细胞核维生素D受体(VDR)相互作用以调节一系列参与钙和磷酸体内平衡以及细胞分裂和分化的基因的转录。已报导维生素D3在许多模型系统(包括鳞状细胞癌、前列腺腺癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌)中具有抗癌效应(综述于Deeb等人2007 Nature Reviews Cancer7：684-700)。
维生素D3的抗癌效应据报导牵涉多个机制，包括在细胞周期的G1期生长停止、细胞凋亡、肿瘤细胞分化、生长因子介导的细胞存活信号的中断和血管生成和细胞粘附的抑制(综述于Deeb等人2007Nature Reviews Cancer 7：684-700中)。例如，具体地在细胞凋亡方面，已报导维生素D3通过调节细胞凋亡的至关重要的介体，例如抑制抗细胞凋亡、促存活蛋白BCL2和BCL-XL的表达或诱导促细胞凋亡蛋白(例如，BAX、BAK和BAD)的表达来诱导细胞凋亡(Deeb等人2007)。在其他实例中，具体地在血管生成方面，已报导维生素D3抑制某些肿瘤来源的内皮细胞的增殖和抑制诱导肿瘤的血管生成的血管内皮生长因子(VEGF)的表达(综述于Masuda和Jones，2006 Mol.Cancer Ther.5(4)：797-8070中)。在另一个实例中，具体地在细胞周期停滞方面，已报导维生素D3诱导细胞周期依赖性激酶抑制剂p21WAFI/CIPI的基因表达和诱导细胞周期依赖性激酶抑制剂p27KIPI蛋白的合成和/或稳定，所述两者对于G1阻滞的诱导是至关重要的。(Deeb等人2007)。
基于上述观察，维生素D3被鉴定为表观代谢转变剂，即归因于其转变细胞的代谢状态。维生素D3是归因于其诱导细胞的细胞凋亡的能力，特别地基于其在患病的(癌症)细胞相对于正常细胞中差异性抑制细胞生长和诱导细胞凋亡反应(例如，差异性调节参与相对于正常细胞的癌细胞的细胞凋亡的蛋白质例如BCL-2、BCL-XL和BAX的表达)的能力的表观代谢转变剂。
实施例20：用辅酶Q10处理的细胞的Western分析
在过去50年中，已产生了大量牵涉影响特定过程的内源/外源因素(如恶性转化的根本原因)的信息。临床和基础文献提供提供了DNA结构和功能的变化在癌症的起始和进展中起重要作用的证据，从而将癌症确定为遗传性疾病(Wooster，2010；Haiman，2010)。在1920年代初期，参与表征肿瘤发生的病因学中的基本变化的Otto Warburg和其他研究人员描述了两个主要观察(a)细胞在氧存在的情况下在ATP的产生中运输和利用葡萄糖进行能量生产的能力—也称为Warburg效应和(b)线粒体结构和功能的改变—包括电子传递的改变导致线粒体ATP产生的减少。过去数年中已看到研究细胞生物能学在癌症病因学中的中心作用(即，将癌症视为代谢疾病)的复兴。
历史上，虽然曾经认为基因的突变是导致基因表达的改变的原因，但不断积累的文献支持表观遗传学过程在影响支持癌发生的基因表达中起着至关重要的作用。这被大多数基因的突变很低并且不能解释在癌细胞中发现的许多(一系列)突变的观察所证明。表观遗传学改变受组蛋白尾部的甲基化和修饰调控，两个变化都与细胞的能量(营养物)状态具有内在联系，因为它们需要辅因子例如组蛋白乙酰化所需的乙酰CoA的可获得性(文献)。乙酰CoA的生物合成依赖于糖酵解和克雷布斯循环，从而直接使细胞内能量状态与基因表达和活性的调控相关联。
在正常细胞中，线粒体氧化磷酸化产生足够的ATP来满足维持正常生理活性和细胞存活的能量需要。线粒体能量产生的结果是活性氧(ROS)的产生，其的异常产生导致线粒体的损害(文献)。已良好地确定由线粒体引起的慢性ROS产生导致基因突变的累进积累，牵涉癌发生的病因学的现象。已有人提出癌细胞减少线粒体呼吸以使ROS产生减少至最低限度，并且转换至糖酵解以维持能量产生。因此，能量产生从氧化磷酸化至糖酵解的渐进转变是细胞维持能量产生以维持生理功能所必需的并且可与正常细胞表型向癌细胞表型的进展相关。与线粒体基因组成的累进改变(突变)协同的细胞能量(生物能)特征谱的渐进转变改变了细胞代谢组(metabolome)。因线粒体磷酸化至糖酵解转换而导致的整个细胞的代谢组特征谱的变化相应于异常生物能学诱导的代谢组特征谱并且是支持癌发生的根本原因。使用内源分子诱发朝向与细胞生物能状态相关的非癌正常线粒体氧化磷酸化的状态的细胞代谢组转变的靶向干预代表了癌症治疗的治疗终点。
作为引起表观代谢转变的MIM的辅酶Q10
本文中提供的数据显示利用辅酶Q10对正常和癌细胞的治疗与调节糖酵解—线粒体氧化性应激连续谱(continuum)内的至关重要的生物化学终端的蛋白质的表达的变化相关。描述通过western印迹分析和耗氧率评估蛋白质表达的数据的组合显示在正常细胞中，在暴露于辅酶Q10后不存在正常的糖酵解和线粒体呼吸速率的显著改变。因此，正常细胞例如HDFa(正常人成体成纤维细胞)、HASMC(正常人主动脉平滑肌细胞)、nFib(正常成纤维细胞)和HeKa(正常人角质细胞)中蛋白质的表达和线粒体呼吸速率的值可被认为是基线生理状态的代表。癌细胞系例如HepG2(肝癌)、PaCa-2(胰腺癌)、MCF7(乳腺癌)、SK-MEL(黑素瘤)和SCC-25(鳞状细胞癌)中蛋白质表达和线粒体呼吸速率的任何偏差代表了因疾病(在该情况下癌症)的起始/进展而产生的改变。实验证据支持癌细胞暴露于辅酶Q10与代表正常细胞的细胞病理生理学重组(reorganization)相关的假说。具体地，本文中提供的数据显示癌细胞的辅酶Q10暴露与负责诱导细胞结构的全局性重组的糖酵解途径和线粒体氧化磷酸化至正常细胞中观察到的所述途径的转变相关。
在正常细胞中，糖酵解输出的终点与线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)连接，即通过糖酵解途径从葡萄糖产生的丙醇酸盐进入克雷布斯循环(也称为三羧酸循环、TCA或柠檬酸循环)以产生还原当量来支持用于ATP产生的线粒体OXPHOS。因此，在正常细胞中，参与糖酵解的基因产物的表达和功能方向被引向丙酮酸盐的充足产生和其至克雷布斯循环的进入。癌细胞中参与糖酵解和克雷布斯循环途径的至关重要的蛋白质的表达和功能失调导致伴随线粒体功能的显著降低的增强的糖酵解。癌细胞对辅酶Q10(一种选择性影响线粒体呼吸链的内源分子)的暴露改变(正常化)糖酵解和克雷布斯循环途径的蛋白质的表达以促进生物能学转变，以便使能量产生(即，ATP产生)恢复至线粒体。
实验方法
Western印迹实验1
用于本实验的细胞是HDFa和MCF-7细胞，以2个不同浓度50μM和100μM的辅酶Q10处理或不处理所述细胞，在24小时的处理后收获所述细胞。将完整细胞沉淀一次一个地重悬浮于1mL C7缓冲液中并且转移至标记的15mL管中。随后在冷室中在冰上使用6个声波脉冲(设置在#14)对样品进行超声处理。超声处理后将样品短暂离心至2500g，将样品转移至2mL管中。使用保持在50mL样品管中的泡沫验证每一个样品的pH(pH应当为9.0)。
通过加入10ul 1M丙烯酰胺，25ul三丁基膦并且在间歇性混合的条件下温育90分钟对每一个样品进行样品的烷基化和还原。在温育后，加入10ul 1M DTT，将试管在20℃下以20,000g离心10分钟，将上清液转移至标记的Amicon Ultra离心过滤器(具有10k截断值)(Millipore catalog#UFC 801024)。将样品以2500g离心15分钟，间隔2次。使用电导仪测量单独的Chap以及样品的电导率。如果样品的电导率很高，则加入1ml chap用于缓冲液更换，以2500g再次离心直至体积减少至250ul。当电导率为200或更少时，以5分钟的间隔以2500g离心样品直至上清液的体积为150-100ul。将样品上清液转移至eppendorf管中，使用BSA作为标准进行Bradford测定。
按照上述标准方案处理样品，利用Bradford测定法测定每一个样品的蛋白质量。如下所示利用Lamelli上样染料(Loading dye)(LDS)和MilliQ水制备等同于10ug蛋白质的样品体积，在4-12％Bis-TrisNovex NuPAGE凝胶(Invitrogen，cat#NP0323Box)上进行电泳。
使用NOVEX Xcell Surelock系统在200V下利用1X MOPS缓冲液进行凝胶电泳，进行50分钟。随后使用NOVEX Xcell Surelock湿转移方案(wet transfer protocol)在30V下转移凝胶，进行1小时。用来自Invitrogen的Simply Blue Safestain(LC6065)对印迹染色。
HDFa和MCF-7样品的IDH1和ATP柠檬酸裂解酶水平
在转移后，将每一个印迹置于2张Whatman滤纸之间，干燥15-20分钟。在干燥后，使用HB铅笔给印迹标明日期、样品类型以及印迹或印迹2。用铅笔勾勒出分子量标记的轮廓，单线代表蓝色，双线表示有色的标记。用甲醇活化印迹，进行5秒，用水洗涤5分钟，用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，15分钟；2次，每次5分钟)。通过在振荡的条件下，利用含有5％BSA的TBST中的IDH1的一抗(Cell Signaling#3997)(以1∶1000稀释的)在4℃下温育过夜来探测印迹1，利用以1∶1000稀释的5％BSA中的ATP柠檬酸裂解酶的兔多克隆抗体(Cell Signaling#4332)探测印迹2。在利用一抗过夜温育后，利用TBS-T洗涤印迹3次(1次，15分钟；2次，5分钟)，然后在室温下于轨道倾斜振荡器上利用二抗(抗兔；1∶10,000稀释度)温育1小时来探测该印迹。在用二抗温育1小时后，用TBS-T(1次，15分钟；2次，每次5分钟)洗涤印迹3次，随后利用ECF试剂温育5分钟，然后利用5100Fuji激光扫描仪(以25uM的分辨率，16bit，绿色激光，于400V和500V下)扫描各个印迹。
HDFa和MCF-7样品的肌动蛋白水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描2个印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在振荡的条件下用以1∶5000稀释的5％BSA中的肌动蛋白的抗体(Sigma catalog#A5316，克隆AC-74)在室温下探测1小时。在用肌动蛋白的一抗温育1小时后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗小鼠；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
Western印迹实验2
本实验中所使用的细胞为SKMEL28、SCC-25、nFib和Heka细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在3、6和/或24小时的处理后收获所述细胞。处理样品，如上所述将其在4-12％Bis-Tris Novex NuPAGE凝胶上进行电泳。基本上如上所述进行凝胶电泳，转移和染色。
4个细胞系的IDH1的水平
转移后，使印迹干燥15-20分钟，用甲醇活化5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST进行15分钟。用5％的TBS-T中的封闭试剂在室温下封闭印迹1小时，随后用TBS-T(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)洗涤3次。随后在振荡的条件下，通过在4℃下温育过夜，用具有5％BSA的TBST中的IDH1的一抗(Cell Signaling#3997)(以1∶1000稀释)探测该印迹。在用IDH1的一抗过夜温育后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在室温下用二抗(抗兔；1∶10,000的稀释度)探测，进行1小时。在与二抗温育1小时后，用TBS-T(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)洗涤印迹3次，然后与ECF试剂一起温育，进行5分钟，随后用5100Fuji激光扫描仪(以25uM的分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
4个不同细胞系的ATP柠檬酸裂解酶水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离异柠檬酸脱氢酶印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)。然后在振荡的条件下用以1∶5000稀释的5％BSA中的ATP柠檬酸裂解酶的兔多克隆抗体(Cell Signaling#4332)在4℃下探测该印迹，进行过夜。在用ATP柠檬酸裂解酶的一抗温育过夜后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗兔；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
4个不同细胞系的肌动蛋白水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离ATP柠檬酸裂解酶。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在振荡的条件下用以1∶5000稀释的5％BSA中的肌动蛋白的抗体(Sigma catalog#A5316，克隆AC-74)在室温下探测1小时。在用肌动蛋白的一抗温育1小时后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗小鼠；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
Western印迹实验3
本实验中所使用的细胞为HepG2、HASMC和PACA2细胞，用或不用2个不同浓度(50μm或100μm)的辅酶Q10处理所述细胞，在48小时的处理后收获所述细胞。在本实验(western印迹实验3)中和在下面描述的所有实验(即，western印迹实验4至9)中，用5mM葡萄糖(“5G”)或22mM葡萄糖(“22G”)额外地处理所述细胞。如上所述处理来源于所述细胞的样品，在4-12％Bis-Tris Novex NuPAGE凝胶上进行电泳。基本上如上所述进行凝胶电泳，转移和染色。
HASMC相对PACA2和HepG2的IDH1、ATP柠檬酸裂解酶和肌动蛋白水平
基本上如上所述，通过用IDH1、ATP柠檬酸裂解酶和肌动蛋白的一抗探测印迹来测定IDH1、ATP柠檬酸裂解酶的水平和肌动蛋白水平。
Western印迹实验4
本实验中所使用的细胞为HepG2细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在24或48小时的处理后收获所述细胞。处理样品，如上所述将其在4-12％Bis-Tris NovexNuPAGE凝胶上进行电泳。基本上如上所述进行凝胶电泳，转移和染色。
HepG2细胞的乳酸脱氢酶水平
转移后，使印迹干燥15-20分钟，用甲醇活化5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST进行15分钟。用5％的TBS-T中的封闭试剂在室温下封闭印迹1小时，随后用TBS-T(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)洗涤3次，在振荡的条件下，通过在4℃下温育过夜，用5％BSA中的乳酸脱氢酶的一抗(abcam ab2101；多克隆)(以1∶1000稀释的)探测该印迹。在用乳酸脱氢酶的一抗过夜温育后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，次5分钟)，然后在室温下用二抗(兔抗山羊；1∶10,000的稀释度)探测，进行1小时。在与二抗温育1小时后，用TBS-T(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)洗涤印迹3次，然后与ECF试剂一起温育，进行5分钟，随后用5100Fuji激光扫描仪(以25uM的分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
HepG2细胞的丙酮酸激酶肌肉形式(PKM2)的水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离乳酸脱氢酶印迹。在激光扫描仪中扫描2个印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，在振荡的条件下用以1∶500稀释的5％BSA中的丙酮酸激酶的兔多克隆抗体(NOVUS BIOLOGICALS catalog#H00005315-D01P)在4℃下探测该印迹，进行过夜。在用丙酮酸激酶M2的一抗温育过夜后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗兔；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
HepG2细胞的丙酮酸脱氢酶β水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离丙酮酸脱激酶印迹。在激光扫描仪中扫描2个印迹以检查完全剥离。在确保抗体和ECF试剂的剥离已完成后，用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，在振荡的条件下用5％BSA中的丙酮酸脱氢酶的抗体(ABNOVA catalog#H00005162-M03)(以1∶500稀释的)在4℃下探测该印迹，进行过夜。在用丙酮酸脱氢酶的一抗温育过夜后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗小鼠；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
HepG2细胞的肌动蛋白水平
基本上如上所述剥离丙酮酸脱氢酶印迹，随后探测肌动蛋白。
Western印迹实验5
本实验中所使用的细胞为MIAPACA2(PACA2)细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在24或48小时的处理后收获所述细胞。处理PACA2样品，并且基本上如上所述进行凝胶电泳，转移，染色和扫描。
PaCa2细胞的乳酸脱氢酶(LDH)和丙酮酸脱氢酶(PDH)水平
基本上如上所述，通过用LDH和PDH的一抗成功地探测印迹来测定LDH和PDH的水平。
PaCa2细胞的半胱天冬酶3水平.
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离印迹。在激光扫描仪中扫描2个印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在振荡的条件下用5％BSA中的半胱天冬酶3的抗体(Santacruz Biotechnology#sc7272)(以1∶200稀释的)在4℃探测过夜。在用半胱天冬酶3的一抗温育过夜后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗小鼠；1∶10,000稀释)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
Western印迹实验6
用于本Western印迹实验的细胞是用或未用辅酶Q10IV制剂处理的并且在24小时的处理后收获的PC-3、HepG2、MCF-7、HDFa和PACA2。基本上如上所述，处理样品，转移，染色和扫描。
不同细胞类型中的半胱天冬酶3和肌动蛋白水平
基本上如上所述的，通过用半胱天冬酶3和肌动蛋白的一抗成功地探测印迹来测定半胱天冬酶3和肌动蛋白的水平。
Western印迹实验7
本实验中所使用的细胞为人主动脉平滑肌(HASMC)细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在24或48小时的处理后收获所述细胞。处理HASMC样品，并且基本上如上所述进行凝胶电泳，转移，染色和扫描。
用于肌动蛋白的实验方案：
基本上如上所述的，通过用肌动蛋白的一抗成功地探测印迹来测定肌动蛋白的水平。
用于Hif1α、半胱天冬酶3和PDHB的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离肌动蛋白印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的Hif1α、半胱天冬酶3或PDHB的一抗(以1∶200)在4℃下温育过夜来进行探测。将Hif 1α的一抗(Abcam ab2185；抗兔)以1∶500稀释于5％BSA中。将半胱天冬酶3的一抗(Santacruz sc7272；抗兔)以1∶200稀释于5％BSA中。将丙酮酸脱氢酶β的一抗(PDHB)(Novus BiologicalsH00005162-M03；抗小鼠)以1∶500稀释于5％BSA中。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在室温下用二抗(PDHB抗小鼠；Hif 1a和半胱天冬酶3抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
PKM2、SDHB和SDHC的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的PKM2、SDHB或SDHC的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。将SDHC的一抗(ABNOVA H00006391-M02；抗小鼠)以1∶500稀释。SDHB的一抗来自Abcam ab4714-200；抗小鼠；以1∶1000稀释。丙酮酸激酶M2(PKM2)的一抗来自Biologicals H00005315-D0IP；抗兔；以1∶500稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(SDHB&C抗小鼠；和PKM2抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
LDH和Bik的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA(于TBS-T中)中的LDH或Bik的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。LDH的一抗来自Abcam ab2101；抗山羊；以1∶1000稀释。Bik的一抗来自CellSignaling#9942；抗兔；以1∶1000稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(LDH抗山羊；Jackson Laboratories)和Bik抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
Western印迹实验9
本实验中所使用的细胞为HepG2细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在24或48小时的处理后收获所述细胞。处理HepG2样品，并且基本上如上所述进行凝胶电泳，转移，染色和扫描。
肌动蛋白的实验方案：
基本上如上所述的，通过用肌动蛋白的一抗成功地探测印迹来测定肌动蛋白的水平。
半胱天冬酶3和MMP-6的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离肌动蛋白印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的半胱天冬酶3或MMP-6的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。将半胱天冬酶3的一抗(Abcam ab44976-100；抗兔)以1∶500稀释于5％BSA中。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在室温下用二抗(MMP-6抗小鼠；半胱天冬酶3抗兔；1∶10,000稀释)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
LDH的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA或5％牛奶中的LDH的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。将LDH 080309b1的一抗(Abcam ab2101；抗山羊)以1∶1000稀释于5％BSA中。将LDH080309b2的一抗(Abcam ab2101；抗山羊)以1∶1000稀释于5％牛奶中。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在室温下用二抗(Jackson Immuno Research抗山羊；1∶10,000的稀释度；305-055-045)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
转醛醇酶和Hif1a的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的转醛醇酶或Hif1a的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。转醛醇酶的一抗(Abcam ab67467；抗小鼠)以1∶1000稀释。将Hif1a的一抗(Abcamab2185；抗兔)以1∶5000稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(抗小鼠或抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
IGFBP3和TP53的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的IGFBP3或TP53的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。IGFBP3的一抗(Abcam ab76001；抗兔)以1∶1000稀释。将TP53的一抗(Sigma Aldrich AV02055；抗兔)以1∶100稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
转醛醇酶和PDHB的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的转醛醇酶或PDHB的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。转醛醇酶的一抗(Santacruz sc51440；抗山羊)以1∶200稀释。将PDHB的一抗(Novus Biologicals H00005162-M03；抗小鼠)以1∶500稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(抗山羊或抗小鼠；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
结论
异柠檬酸脱氢酶-1(IDH-1)
异柠檬酸脱氢酶是作为通常在线粒体基质中发生的TCA循环的部分的酶之一。然而，IDH1是催化异柠檬酸盐至α-酮戊二酸的氧化脱羧并且在两步骤过程中产生二氧化碳的酶的细胞溶胶形式。IDH1是存在细胞溶胶和过氧化物酶体中的NADP+依赖性形式。IDH1被Ser113磷酸化灭活并且在许多种类(包括不具有柠檬酸循环的种类)中表达。IDH1似乎通常用作肿瘤抑制剂，当失活时其通过HIF-1途径的活化部分促成肿瘤发生(Bayley 2010；Reitman，2010)。最近的研究在胶质母细胞瘤的病因学中涉及IDH1的灭活突变(Bleeker，2009；Bleeker，2010)。
利用辅酶Q10的治疗增加IDH1在癌细胞系(包括MCF-7、SKMEL28、HepG2和PaCa-2细胞)中的表达。在SCC25细胞系中存在表达的适度增加。相反地，原代人源性成纤维细胞HDFa、nFIB和主动脉平滑肌细胞HASMC的培养物未显示IDH1响应辅酶Q10的表达模式的显著改变。α-酮戊二酸(α-KG)是TCA循环中的至关重要的中间产物，其从异柠檬酸盐生物化学合成并且最终转化成琥珀酰coA并且为可药用的MIM和表观代谢转变剂。α-KG的产生用作TCA循环中的关键接合点(juncture)，因为其可被细胞用于再补充循环的中间产物，从而导致还原等当量的产生以增强氧化磷酸化。因此，辅酶Q10介导的IDH1表达的增加可导致可被线粒体TCA循环用于增强癌细胞的氧化磷酸化的中间产物的形成。结果概述于下表中。
表29：HDFa和MCF-7中的IDH1
 组成   归一化的平均强度
 HDF，培养基   346
  HDF24-50-辅酶Q10   519
  HDF24-100-辅酶Q10   600
  MCF，培养基   221
  MCF24-50-辅酶Q10   336
  MCF24-100-辅酶Q10   649
表30：治疗后HASMC相对HepG2中的IDH1
  量—组成   归一化的强度
  HAS5g48-培养基   20
  HAS5g48-50-辅酶Q10   948
  HAS5g48-100-辅酶Q10   1864
  HAS22G48-培养基   1917
  HAS22G48-50-辅酶Q10   1370
  HAS22G48-100-辅酶Q10   1023
  Hep5g48-培养基   14892
  Hep5g48-50-辅酶Q10   14106
  Hep5g48-100-辅酶Q10   15774
  Hep22G48-培养基   16558
  Hep22G48-50-辅酶Q10   15537
  Hep22G48-100-辅酶Q10   27878
表31：处理后HASMC相对PACA2的IDH1
  量—组成   归一化的强度
  HAS5g48-培养基   562
  HAS5g48-50-辅酶Q10   509
  HAS5g48-100-辅酶Q10   627
  HAS22G48-培养基   822
  HAS22G48-50-辅酶Q10   1028
  HAS22G48-100-辅酶Q10   1015
  PACA5g48-培养基   1095
  PACA5g48-50-辅酶Q10   1095
  PACA5g48-100-辅酶Q10   860
  PACA22G48-培养基   1103
  PACA22G48-50-辅酶Q10   1503
  PACA22G48-100-辅酶Q10   1630
ATP柠檬酸裂解酶(ACL)
ATP柠檬酸裂解酶(ACL)是在细胞溶胶中催化乙酰-CoA和草酰乙酸盐的形成的同源四聚体(～126kd)。该反应是脂肪酸、胆固醇和乙酰胆碱的生物合成以及糖生成的非常重要的第一步骤(Towle等人，1997)。营养物和激素调节该关键酶的表达水平和磷酸化状态。已报导了Akt和PKA对ACK的Ser454磷酸化(Berwic k.，DC MW等人，2002；Pierce MW等人，1982)。
数据描述了辅酶Q10在正常和癌细胞中对ATP柠檬酸裂解酶的效应。始终观察到在癌细胞中存在ACL酶的表达的剂量依赖性减少。相反地，在正常细胞中似乎存在朝向增加的ACL表达的趋势。已证明细胞溶胶ACL是在生长因子刺激过程中和在分化过程中组蛋白乙酰化所必需的。ACL利用细胞溶胶葡萄糖衍生的柠檬酸盐产生组蛋白乙酰化所必需的乙酰CoA(在瘤形成过程中是非常重要的过程)的事实证明辅酶Q10诱导的ACL表达在影响癌细胞功能中的作用。通过细胞溶胶ACL从柠檬酸盐产生的乙酰CoA在细胞分裂过程中用作新脂质和胆固醇的生物合成的来源。因此，辅酶Q10诱导的ACL表达的变化改变正常细胞相对癌细胞的用于脂质和胆固醇的合成的乙酰CoA的可获得性。结果概述于下表中。
表32：HDFa和MCF-7中的ATPCL
  组成   平均归一化的强度
  HDF-培养基   ～15000
  HDF-50-辅酶Q10   ～17500
  HDF-100-辅酶Q10   ～25000
  MCF-培养基  ～7500
  MCF-50-辅酶Q10  ～7500
  MCF-100-辅酶Q10  ～12500
表33：HASMC相对HepG2中的ATP柠檬酸裂解酶～kd条带
  量—组成   归一化的强度
  HAS5g48-培养基   24557
  HAS5g48-50-辅酶Q10   23341
  HAS5g48-100-辅酶Q10   25544
  HAS22G48-培养基   27014
  HAS22G48-50-辅酶Q10   21439
  HAS22G48-100-辅酶Q10   19491
  Hep5g48-培养基   28377
  Hep5g48-50-辅酶Q10   24106
  Hep5g48-100-辅酶Q10   22463
  Hep22G48-培养基   24262
  Hep22G48-50-辅酶Q10   31235
  Hep22G48-100-辅酶Q10   50588
表34：HASMC相对PACA2中的ATP柠檬酸酶～kd的条带
  量—组成   归一化的强度
  HAS5g48-培养基   11036
  HAS5g48-50-辅酶Q10   12056
  HAS5g48-100-辅酶Q10   15265
  HAS22G48-培养基   18270
  HAS22G48-50-辅酶Q10   15857
  HAS22G48-100-辅酶Q10   13892
  PACA5g48-培养基   11727
  PACA5g48-50-辅酶Q10   8027
  PACA5g48-100-辅酶Q10   4942
  PACA22G48-培养基   8541
  PACA22G48-50-辅酶Q10   9537
  PACA22G48-100-辅酶Q10   14901
表35：以CTRL的％表示的HepG2和PACA2中的ATP柠檬酸裂解酶
  量—组成   归一化的强度
  PACA5g48-培养基   1.00
  PACA5g48-50-辅酶Q10   0.68
  PACA5g48-100-辅酶Q10   0.42
  PACA22G48-培养基   1.00
  PACA22G48-50-辅酶Q10   1.12
  PACA22G48-100-辅酶Q10   1.74
  Hep5g48-培养基   1.00
  Hep5g48-50-辅酶Q10   0.85
  Hep5g48-100-辅酶Q10   0.79
  Hep22G48-培养基   1.00
  Hep22G48-50-辅酶Q10   1.29
  Hep22G48-100-辅酶Q10   2.09
丙酮酸激酶M2(PKM2)
丙酮酸激酶是参与糖酵解途径的酶。其负责将磷酸从磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转移至二磷酸腺苷(ADP)的转移，以产生ATP和丙酮酸盐。PKM2是糖酵解性丙酮酸激酶的同工酶，其表达的特征在于组织的代谢功能，即M2同工酶在正常快速增殖的具有高能量需要的细胞例如胚胎细胞中表达并且也在少数正常的已分化组织(所述组织需要高速率的核酸合成)例如肺和胰岛细胞中表达。PKM2因肿瘤对糖酵解途径的依赖(以满足细胞能量需要)而在肿瘤细胞中高度表达。通常被认为被限制于胚胎的PKM2的同工酶在癌细胞中重新表达。表达PKM2的细胞偏爱具有增加的乳酸盐产量和减少的氧化磷酸化的更强的有氧糖酵解表型(显示代谢表型的转变)。因此，癌细胞中PKM2表达的减少可转变或下调通过糖酵解途径进行的能量产生，在癌症的治疗中是有用的策略。数据显示正常和癌细胞中PKM2的可变表达模式，癌细胞相对于正常细胞显示更高的表达水平。利用辅酶Q10对细胞的处理改变了正常细胞和癌细胞中PKM2上条带和下条带水平的表达模式。在测试的癌细胞中，存在PKM2表达的剂量依赖性减少，并且未在正常细胞中观察到显著变化。这些结果概述于下表中。
表36：HepG2中的丙酮酸激酶肌肉形式2上条带
Figure BPA00001497288601631
表37：HepG2中丙酮酸激酶肌肉形式2下条带(58KD)
Figure BPA00001497288601632
表38：处理后HASMC细胞中丙酮酸激酶肌肉形式2上条带
  量—组成   归一化的强度
  5g48-培养基   608
  5g48-50-辅酶Q10   811
  5g48-100-辅酶Q10   611
  22G48-培养基   516
  22G48-50-辅酶Q10   595
  22G48-100-辅酶Q10   496
  22G24-培养基   301
  22G24-50-辅酶Q10   477
  22G24-100-辅酶Q10   701
乳酸脱氢酶(LDH)
LDH是催化丙酮酸盐与乳酸盐的互变同时伴随NADH与NAD+的互变的酶。其具有在低细胞氧张力下将丙酮酸转化成乳酸盐以在牺牲线粒体氧化磷酸化的情况下产生还原当量和产生ATP的能力。癌细胞通常显示增加的LDH的表达以维持糖酵解流来产生ATP以及还原当量和还原线粒体氧化磷酸化酶系(OXPHOS)。因此，减少细胞中LDH的表达可使代谢从乳酸盐的产生转变成促进丙酮酸盐进入TCA循环。利用辅酶Q10的治疗减少癌细胞的乳酸脱氢酶(LDH)表达并且对正常细胞影响最小，从而支持辅酶Q10在通过使细胞质丙酮酸盐至乳酸的转化最小化而引发从糖酵解产生ATP的癌细胞生物能学至线粒体氧化磷酸化酶系来源的转变中的作用。结果概述于下表中。
表39：HepG2中的乳酸脱氢酶
表40：来自2个实验的以对照％表示的HepG2中的乳酸脱氢酶
Figure BPA00001497288601651
表41：PACA2中的乳酸脱氢酶
Figure BPA00001497288601652
丙酮酸脱氢酶-B(PDH-E1)
丙酮酸脱氢酶β(PDH-E1)是作为将丙酸酸盐转化成乙酰CoA的丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)的部分的第一个酶成分。PDH-E1需要硫胺素作为其活性的辅因子，进行丙酮酸盐至乙酰CoA的转化以进入线粒体的TCA循环所必需的PDC复合物中的前两个生物化学反应。因此，癌细胞中PKM2和LDH表达的同时减少连同PDH-E1表达的增加可增加丙酮酸盐朝向促进线粒体氧化磷酸化酶系产生ATP的进入速率。所述数据显示对于正常和癌细胞系中PDH-E1的表达，该酶的基线表达在癌细胞中相对于正常细胞减少。利用辅酶Q10的处理与癌细胞中PDH-E1蛋白的表达的递增相关并且在正常细胞中变化最小。所述结果概述于下表中。
表42：HepG2中的丙酮酸脱氢酶β
Figure BPA00001497288601661
表43：PACA2中的丙酮酸脱氢酶β
Figure BPA00001497288601662
表44：处理后HASMC中的丙酮酸脱氢酶β
  量—组成   归一化的体积
  5g48-培养基   140
  5g48-50-辅酶Q10   147
  5g48-100-辅酶Q10   147
  22G48-培养基   174
  22G48-50-辅酶Q10   149
  22G48-100-辅酶Q10   123
  22G24-培养基   140
  22G24-50-辅酶Q10   145
  22G24-100-辅酶Q10   150
半胱天冬酶3
细胞凋亡起始的控制通常表现在起始因子半胱天冬酶、半胱天冬酶-2、-9和-8/10的水平。在细胞凋亡的外部途径中，半胱天冬酶-8，当被激活时，直接切割和激活执行者半胱天冬酶(例如半胱天冬酶-3)。活性半胱天冬酶-3切割并且激活其他半胱天冬酶(6、7和9)以及细胞中的相关靶(例如PARP和DFF)。在这些研究中，测量癌细胞系和正常细胞系中响应酶Q10的效应子半胱天冬酶-3蛋白的水平。应当指出，虽然细胞凋亡的控制通过起始因子半胱天冬酶来进行，但许多信号转导途径相反通过直接抑制效应子半胱天冬酶而中断细胞凋亡信号的传递。例如，P38MAPK磷酸化半胱天冬酶-3并且抑制其活性(Alvarado-Kristensson等人，2004)。有趣地，相同研究中蛋白磷酸酶(PP2A)或蛋白激酶Cδ(PKCδ)(Voss等人，2005)的激活可抵消38MAPK的效应，从而增加半胱天冬酶-3活化并且支持细胞凋亡信号的传递。因此，半胱天冬酶-3激活的水平上或半胱天冬酶3激活后的事件可在一些情况下决定细胞的最终命运。
半胱天冬酶-3是在细胞凋亡的执行阶段起中枢作用的半胱氨酸-天冬氨酸激酶。辅酶Q10处理增加癌细胞的半胱天冬酶3的水平。相反地，在正常细胞中，半胱天冬酶-3在正常细胞中的表达被适度减少。所述结果概述于下表中。
表45：PACA2中的半胱天冬酶3
  量—组成   归一化的体积(24小时)   归一化的体积(48小时)
  5g-培养基   324   300
  5g-50-辅酶Q10   325   701
  5g-100-辅酶Q10   374   291
  22G-培养基   344   135
  22G-50-辅酶Q10   675   497
  22G-100-辅酶Q10   842   559
表46：来自2个实验的以对照％表示的HepG2细胞中的半胱天冬酶3
  量—组成   以对照％表示的归一化的体积
  5g24-培养基   1..00
  5g24-50-辅酶Q10   1.08
  5g24-100-辅酶Q10   1.76
  5g48-培养基   1.00
  5g48-50-辅酶Q10   1.44
  5g48-100-辅酶Q10   0.95
  22G24-培养基   1.00
  22G24-50-辅酶Q10   1.39
  22G24-100-辅酶Q10   1.78
  22G48-培养基   1.00
  22G48-50-辅酶Q10   1.50
  22G48-100-辅酶Q10   1.45
表47：处理后HASMC中的半胱天冬酶3
  量—组成   归一化的体积
  5g48-培养基   658
  5g48-50-辅酶Q10   766
  5g48-100-辅酶Q10   669
  22G48-培养基   846
  22G48-50-辅酶Q10   639
  22G48-100-辅酶Q10   624
  22G24-培养基   982
  22G24-50-辅酶Q10   835
  22G24-100-辅酶Q10   865
琥珀酸脱氢酶(SDH)
琥珀酸脱氢酶，也称为琥珀酸-辅酶Q还原酶，是参与TCA和电子传递链的线粒体内膜的复合物。在TCA中，该复合物催化琥珀酸至延胡索酸的氧化同时伴随泛醌至泛醇的还原。(Baysal等人，Science2000；和Tomlinson等人，Nature Genetics 2002)。发现SDH B、C和D亚基的种系突变为家族性副神经节瘤或平滑肌瘤的起始事件(Baysal等人，Science 2000)。
利用Western印迹分析表征用辅酶Q10处理的癌细胞的线粒体制剂中SDH亚基B的表达。所述结果表明辅酶Q10处理与细胞的线粒体中增加的SDH蛋白水平相关。这些结果表明辅酶Q10的作用机制之一是通过增加线粒体酶例如SDHB的水平来使细胞的代谢向TCA循环和线粒体转变。所述结合概述于下表中。
表48：NCIE0808Mitopreps中的琥珀酸脱氢酶B
  组成—时间   平均归一化的体积
  培养基   531
  50uM辅酶Q10，3小时   634
  100uM辅酶Q10，3小时   964
  50uM辅酶Q10，6小时   1077
  100uM辅酶Q10，6小时   934
低氧诱导因子-1
低氧诱导因子(Hif)是由α和β亚基组成的转录因子。在常氧条件下，Hif1α的蛋白质水平因其通过一系列翻译后事件的连续降解而非常低。糖酵解与氧化磷酸化之间的转变通常被认为受两个酶PDH和LDH的相对活性控制，所述相对活性决定丙酮酸盐的代谢命运。Hif通过诱导LDH水平并且通过刺激PDK抑制PDH活性来控制该至关重要的歧点。由于这种使丙酮酸代谢从线粒体转向细胞溶胶的能力，Hif被认为是癌细胞中生物能量转换的至关重重的调节者。
利用辅酶Q10的处理减少了癌细胞的线粒体制剂的Hif1α蛋白水平。在正常细胞的全细胞裂解产物中，观察到Hif1的下条带，其也显示减少。所述结果概述于下表中。
表49：处理后HASMC细胞中的Hif1α下条带
  量—组成   归一化的体积
  5g48-培养基   22244
  5g48-50-辅酶Q10   21664
  5g48-100-辅酶Q10   19540
  22G48-培养基   14752
  22G48-50-辅酶Q10   17496
  22G48-100-辅酶Q10   23111
  22G24-培养基   21073
  22G24-50-辅酶Q10   18486
  22G24-100-辅酶Q10   17919
表50：处理后HepG2的Hif1α上条带
  量—组成   归一化的体积
  5g24-培养基   12186
  5g24-50-辅酶Q10   8998
  5g24-100-辅酶Q10   9315
  5g48-培养基   8868
  5g48-50-辅酶Q10   8601
  5g48-100-辅酶Q10   10192
  22G24-培养基   11748
  22G24-50-辅酶Q10   14089
  22G24-100-辅酶Q10   8530
  22G48-培养基   8695
  22G48-50-辅酶Q10   9416
  22G48-100-辅酶Q10   5608
实施例21用CoQ10处理的正常和癌细胞中耗氧率(OCR)和细胞外酸化(ECAR)的分析
本实施例显示在应激因子(例如，高血糖症、低氧、乳酸)不存在和/或存在的情况下细胞对于利用本发明的代表性MIM/表观代谢转变剂-CoQ10的处理的暴露与朝向代表在正常生理条件下在正常细胞中观察到的值的糖酵解/乳酸盐生物合成和线粒体氧化磷酸化(如通过ECAR和OCR值测量的)的转变相关。
本申请人已在先前的部分中显示：癌细胞中利用CoQ10的处理与增强线粒体氧化磷酸化(同时伴随糖酵解和乳酸盐生物合成的减少)的特定蛋白质的表达的变化相关。该实例显示线粒体氧化磷酸化的直接量度可通过使用SeaHorse XF分析仪(在体外实验模型中测量溶解氧和细胞外pH水平的仪器)测量细胞系的耗氧率(OCR)来获得。(SeaHorse Biosciences Inc，North Billerica，MA).
细胞外微环境的pH在肿瘤中相比于细胞内(细胞质)pH和周围正常组织呈相对酸性。肿瘤的该特征起着多个目的，包括侵入细胞外基质(ECM)的能力、肿瘤转移的标志属性，所述属性随后启动信号转导级联，所述级联进一步调节：，
●肿瘤血管生成
●增加的控制细胞周期周转的阻滞机制的激活
●促进抗免疫监视的细胞逃脱系统的免疫调节机制
●增加对糖酵解流和乳酸盐利用的依赖性的代谢控制元件
●用于增加致癌性的至关重要的细胞凋亡基因家族例如Bcl-2、IAP、EndoG、AIF的失调
然而不希望受任何特定理论束缚，肿瘤的外部微环境的酸性pH是从肿瘤细胞挤出的氢离子浓度(因来自改变的糖酵解表型的增加的乳酸盐产生而导致)的增加的结果。
在本实验中，在CoQ10存在和不存在的情况下获得正常细胞系的OCR和细胞外酸化率(ECAR)以测定基线值。观察到在其天然营养环境，正常细胞系的基线OCR率不同，并且通常为细胞在体内的生理作用的函数。
例如，使用非癌细胞系HDFa进行一组实验，所述非癌细胞系是成年人真皮成纤维细胞细胞系。成纤维细胞是主要合成和分泌形成组织的结构构架(基质(stroma))的细胞外基质(ECM)成分和胶原的细胞。此外，已知成纤维细胞用作许多功能例如伤口愈合和局部免疫调节的组织代表(ambassador)。在正常生理条件下，使用糖酵解和氧化磷酸化的组合满足正常成纤维细胞的能量需要—糖酵解提供ECM的合成所必需的营养物。
与HDFa相反，HASMC(人主动脉平滑肌细胞)发现于动脉、静脉、淋巴管、胃肠道、呼吸道、膀胱和具有经历受调控的兴奋-收缩偶联的其他组织中。平滑肌例如HASMC细胞经历收缩的能力需要由ATP提供的能量。这些组织从其中可从线粒体提供ATP的低能模式转换至其中通过转换至糖酵解以快速产生ATP来提供能量的高能模式(在运动/应激过程中)。因此，正常平滑肌细胞可使用线粒体OXPHOS和糖酵解的组合来满足它们在正常生理环境下的能量需要。
在使用SeaHorse XF分析仪在这些这些细胞系中测量的其余OCR值中观察到它们各自的生理作用(即，HDFa和HASMC)的差异。下面的图29和30描述了在生理上正常的葡萄糖(约4.6mM)和高葡萄糖(血糖过多的)条件下生长的HDFa和HASMC细胞的OCR。
在5.5mM葡萄糖存在的情况下，在正常氧可用度下在任何处理不存在的情况下HDFa的基线OCR值为约40皮摩尔/分钟(图29)。当将细胞维持在22mM葡萄糖上时，该值略微升高。相反地，在HASMC细胞中，5.5mM葡萄糖上的OCR值为约90皮摩尔/分钟，然而在22mM葡萄糖上，OCR值下降至约40皮摩尔/分钟。因此，在血糖过多的条件下，HDFa与HASMC之间存在差异反应，这进一步证明它们各自的生理组成和功能的固有差异。
细胞中利用CoQ10的处理与代表在正常(5mM)葡萄糖条件下观察到的条件的OCR的变化相关。在低氧张力存在的情况下，生理反应的复杂性变得更复杂。因此，CoQ10暴露与正常细胞中朝向对于特定细胞是天然的生理状态的OCR率的变化相关。
下表51描述了在5.5mM和22mM的葡萄糖上，在常氧和低氧条件下，在CoQ10存在或不存在的情况下HDFa细胞的ECAR值(mpH/分钟)。可观察到在正常细胞中，利用CoQ10的处理对ECAR值具有最小的影响，即使其影响这些细胞的OCR。在高葡萄糖低氧条件下，利用CoQ10的处理与升高的ECAR至在未处理的常氧条件下观察到的值的下降相关。
表51：在5.5mM和22mM的葡萄糖上，在常氧和低氧条件下，在CoQ10存在或不存在的情况下HDFa细胞的ECAR值
Figure BPA00001497288601731
在表52中，HASMC中测量的基线ECAR值(mpH/分钟)比HDFa的基线ECAR值高。低氧条件的诱导引起最可能与继发于增加的糖酵解的细胞内低氧诱导的酸中毒相关的ECAR的增加。
表52：在5.5mM和22mM的葡萄糖上，在常氧和低氧条件下，在CoQ10存在或不存在的情况下HASMC细胞的ECAR值
Figure BPA00001497288601741
观察到利用CoQ10的处理与低氧条件下血糖过多的HASMC细胞的ECAR率朝向可在常氧正常葡萄糖条件下观察到的值的下降趋势相关。这些数据显示对于特定类型的细胞的生理作用是固有的生理变量的存在，当用CoQ10处理时，观察到的异常条件(例如，高血糖症)的改变向正常转变。
相反地，癌细胞(例如，MCF-7、PaCa-2)因它们在培养中维持的糖酵解表型而相对于正常细胞固有地倾向于在更高水平的葡萄糖下培养。利用CoQ10的处理引起OCR值的一致减少(图31和图32)。
CoQ10对MCF-7和PaCa-2细胞的OCR值的效应与CoQ10对正常HDFa和HASMC细胞的效应相似，其中可变反应暗示着基于癌细胞系的个别代谢特征谱的治疗反应。
表53：在5.5mM和22mM的葡萄糖上，在常氧和低氧条件下，在CoQ10存在或不存在的情况下PaCa-2细胞的ECAR值
Figure BPA00001497288601751
表53描述了PaCa-2细胞的ECAR值。与正常细胞相反，癌细胞在表型上倾向于使用高葡萄糖进行ATP产生(增强的糖酵解)，从而导致21mpH/分钟的更高的ECAR(表53，未处理的常氧17mM的ECAR)。利用CoQ10的处理在这些条件下产生ECAR率的显著减少，最可能地与糖酵解产生的乳酸的减少关联。这些细胞中OCR的相关减少可能与增加的线粒体氧化磷酸化酶系的功效相关。
在许多其他正常和癌细胞系中测定OCR和ECAR值的相似比较(数据未显示)，所述细胞系包括：HAEC(正常人主动脉内皮细胞)、MCF-7(乳腺癌)、HepG2(肝癌)和高度转移性PC-3(前列腺癌)细胞系。在所有测试的细胞系中，在应激因子(例如，高血糖症、低氧、乳酸)不存在和/或存在的情况下对CoQ10的暴露与代表在正常生理条件下正常细胞中观察到的值的OCR和ECAR值的转变相关。因此，CoQ10在癌症治疗中的总体效应(包括细胞死亡)是其与细胞生物能学从糖酵解至线粒体氧化磷酸化酶系的转变协作的对蛋白质组学、基因组学、代谢组学结果的整体影响的下游效应。
实施例22：用于CoQ10的生物合成的结构单元分子
本实验显示用于CoQ10生物合成的某些前体，例如用于苯醌环的生物合成的某些前体和用于类异戊二烯重复的生物合成以及用于它们与苯醌环(“结构单元成分”)的连接的某些前体，可被单独地或组合地施用至靶细胞，并且导致细胞凋亡抑制剂Bcl-2的下调和/或细胞凋亡促进剂半胱天冬酶-3的上调。某些前体或其组合还可抑制细胞增殖。数据显示此类CoQ10前体可用于取代CoQ10来获得与CoQ10施用基本上相同的结果。
用于本实验的某些示例性实验条件列于下面。
将Skmel-28黑素瘤细胞培养在补充有5％胎牛血清(FBS)和1X终浓度的抗生素的DMEM/F12中。将细胞培养至85％汇合，用结构单元成分处理3、6、12和24小时。随后将细胞沉淀，进行Western印迹分析。
测试结构单元成分包括L-苯丙氨酸、DL-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-酪氨酸、D L-酪氨酸、D-酪氨酸、4-羟基-苯丙酮酸酯、乙酸苯酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯(香草扁桃酸酯或VMA)、香草酸、4-羟基-苯甲酸酯、吡哆素、泛醇、甲羟戊酸、乙酰甘氨酸、乙酰-CoA、法呢基和2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌。
在Western印迹分析中，将细胞沉淀在冷PBS中，裂解，使用BCA蛋白质测定定量蛋白质水平。将全细胞裂解物加载入4％上样12％电泳Tris-HCl凝胶。随后将蛋白质转移至硝酸纤维素纸，然后用5％牛奶Tris-缓冲液封闭1小时。随后将蛋白质暴露于一抗(Bcl-2和半胱天冬酶-3)，进行过夜。随后将硝酸纤维素纸暴露于Pico化学发光剂进行5分钟，记录蛋白质表达。在暴露后，使用相同的方法定量肌动蛋白。通过使用ImageJ，定量蛋白质表达的水平。使用t检验分析统计学显著性。
所述实验的举例说明性结果概述于下在面。
结构单元成分L-苯丙氨酸的Western印迹分析：在进行醌环结构的合成途径之前，将L-苯丙氨酸转化成酪氨酸。进行western印迹分析以定量黑素瘤细胞中细胞凋亡蛋白质的表达的任何变化。测试的浓度为5μm、25μm和100μm。最初研究将L-苯丙氨酸加入DMEM/F12培养基，所述培养基包含0.4M的浓度的苯丙氨酸。对于5μm、25μm和100μm，培养基中L-苯丙氨酸的终浓度分别为0.405M、0.425M和0.500M。对Skmel-28细胞测试这些终浓度，进行3、6、12和24小时的温育期。在加入处理培养基之前将细胞培养至80％的汇合，如上所述使用印迹分析法收获细胞。在3小时和12小时温育后对于100μmL-苯丙氨酸观察到Bcl-2的统计上显著的增加。对于5μm L-苯丙氨酸，在6小时的温育后观察到Bcl-2的统计上显著的减少。对于25μm L-苯丙氨酸，在12小时的温育后观察到Bcl-2的统计上显著的减少和半胱天冬酶-3的统计上显著的增加。Bcl-2的统计让显著的减少表示细胞凋亡潜能的变化并且半胱天冬酶-3的统计上显著的增加确认细胞正在经历细胞凋亡。与对照相比较，总是存在Bcl-2减少的趋势，即使由于样本容量和标准偏差的原因，这些时间点在本实验中不是统计上显著的。
结构单元成分D-苯丙氨酸的Western印迹分析：测试D-苯丙氨酸(生物活性L-苯丙氨酸的化学合成形式)以与L-苯丙氨酸比较。对于全部3个浓度(5μm、25μm和100μm)的D-苯丙氨酸，在6小时的温育后Bcl-2表达显著减少。此外对于5μm和25μm，在3小时的温育存在显著的减少。对于5μM和100μm浓度，在6小时的温育后观察到半胱天冬酶-3表达的显著增加。
结构单元成分DL-苯丙氨酸的Western印迹分析：也测试DL-苯丙氨酸以与L-苯丙氨酸比较。再次地，对Skmel-28细胞测试5μm、25μm和100μm的浓度。温育期为3、6、12和24小时。在3小时的温育后观察到半胱天冬酶-3的统计上显著的增加。在24小时的温育后观察到Bcl-2的统计上显著的减少。虽然在所有其他浓度和温育时间点上存在不断减少的Bcl-2和不断增加的半胱天冬酶-3趋势，但它们在本实验中不是统计上显著的。
结构单元成分L-酪氨酸的Western印迹分析：L-酪氨酸是用于合成CoQ10的醌环结构的结构单元成分。L-酪氨酸的初步测试不导致高至足以进行western印迹分析的蛋白质浓度。根据本研究，对于Western印迹分析测试25μm以下的浓度。所使用的DMEM/F12培养基包含0.398467M的浓度的L-酪氨酸二钠盐。使初始浓度增加500nm、5μm和15μm。在12小时的温育后对于500nm浓度观察到半胱天冬酶-3的统计上显著的增加。对于5A也观察到半胱天冬酶-3的统计上显著的增加。在24小时的温育后对于5μm的浓度观察到Bcl-2的统计上显著的减少。在24小时的温育后对于500μm和5μm浓度观察到Bcl-2的统计上显著的减少。
结构单元成分D-酪氨酸的Western印迹分析：测试D-酪氨酸(L-酪氨酸的合成形式)以与L-酪氨酸对melanonal细胞的细胞凋亡效应相比较。基于利用L-酪氨酸的初步研究，选择低于25μm的浓度进行western印迹分析。测试的浓度为1μm、5μm和15μm。对于12和24小时的时间段，对于5μm和15μm浓度，D-酪氨酸显示Bcl-2表达的减少。对于3、12和24小时的时间段，对于5μm的浓度，半胱天冬酶-3显著增加。对于12和24小时的时间段，对于1μm也存在半胱天冬酶-3表达的增加。此外，对于12小时的时间段，对于5μm存在半胱天冬酶-3表达的增加。
结构单元成分DL-酪氨酸构Western印迹分析：也测试D L-酪氨酸(L-酪氨酸的合成形式)以与L-酪氨酸对细胞的细胞凋亡效应相比较。在12小时温育后在1μm和15μm浓度上和在24小时的温育后对于5μm看到Bcl-2表达的统计上的减少。在12小时的温育后对于5μm和15μm也观察到半胱天冬酶-3表达的增加。
结构单元成分4-羟基-苯丙酮酸的Western印迹分析：4-羟基-苯丙酮酸来源于酪氨酸和苯丙氨酸并且可在环结构的合成中起着重要作用。对于Bcl-2和半胱天冬酶-3表达测试1μm、5μm和15μm的浓度。对于5μm和15μm浓度，在24小时的温育后存在Bcl-2表达的显著减少以及在12小时的温育后存在半胱天冬酶-3表达的显著增加。
结构单元成分乙酸苯酯的Western印迹分析：乙酸苯酯具有被转化成4-羟基-苯甲酸酯的潜能，其在侧链至环结构的连接中起着重要作用。测试的浓度为1μm、5μm和15μm。对于乙酸苯酯，在12小时和24小时的温育后，对于5μm和15μm的浓度存在Bcl-2表达的减少。在12小时和24小时的温育后对于5μm和15μm的浓度观察到半胱天冬酶-3表达的增加。
结构单元成分3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯(香草扁桃酸酯或VMA)的Western印迹分析：VMA是用于CoQ10醌环结构的合成的另外成分。测试的浓度为100nm、250nm、500nm、1μm、25μm、50μm和100μm。虽然在本实验中未观察到统计上显著的细胞凋亡效应，但数据显示Bcl-2表达的下调趋势。
结构单元成分香草酸的Western印迹分析：香草酸是用于醌环的合成的前体并且在500nm、5μm和15μm的浓度上对其进行测试。Western印迹分析测量Bcl-2和半胱天冬酶-3的表达。已显示对于500nm和5μm的浓度，在24小时的温育时间点上香草酸显著减少Bcl-2的表达。对于15μm的浓度，在3小时的温育后，存在Bcl-2表达的减少。对于用15μm温育24小时的细胞，半胱天冬酶-3的表达存在显著的增加。
结构单元成分4-羟基苯甲酸酯的Western印迹分析：4-羟基苯甲酸在类异戊二烯侧链至环结构的连接中起着重要作用。测试的浓度为500nm、1μm和50μm。在24小时的温育后对于15μm的浓度存在Bcl-2浓度的显著减少。
结构单元成分4-吡哆素的Western印迹分析：吡哆素是用于CoQ10的醌环结构的合成的另一种前体结构单元。对于该化合物的测试的浓度为5μM、25μM和100μm。测定细胞的Bcl-2和半胱天冬酶-3的水平。吡哆素显示在24小时的温育后黑素瘤细胞中Bcl-2的显著减少。
结构单元成分泛醇的Western印迹分析：泛醇在CoQ10的醌环结构的合成起着重要作用。对黑素瘤细胞测试的浓度为5μm、25μm和100μm。对于25μm的浓度，该化合物显示Bcl-2表达的显著减少。
结构单元成分甲羟戊酸的Western印迹分析：甲羟戊酸是用于CoQ10的合成的主要成分之一。在500nm、1μm、25μm和50μm的浓度上测试该化合物。在本实验中不存在Bcl-2表达的显著减少或半胱天冬酶-3表达的显著增加。
结构单元成分乙酰甘氨酸的Western印迹分析：用于CoQ10的合成的另一个途径是类异戊二烯(侧链)合成。乙酰甘氨酸的添加将辅酶A转化成乙酰CoA，所述乙酰CoA进入甲羟戊酸途径以进行类异戊二烯的合成。测试的浓度为5μm、25μm和100μm。在12小时的温育后对于5μm和25μm的浓度，乙酰甘氨酸的测试显示Bcl-2表达的显著减少。在24小时的温育时间点上记录对于100μm浓度的Bcl-2的显著减少。
结构单元成分乙酰-CoA的Western印迹分析：乙酰-CoA是用于CoQ10的合成的甲羟戊酸途径的前体。测试的浓度为500nm、1μm、25μm和50μm。对于测试的时间点和浓度未观察到Bcl-2的显著减少或半胱天冬酶-3表达的显著增加。
与法呢基组合的结构单元成分L-酪氨酸的Western印迹分析：L-酪氨酸是用于CoQ10醌环结构的合成的前体之一。先前的实验测试L-酪氨酸在具有L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的介质中的反应。在本研究中，在不添加L-丙氨基酸和L-酪氨酸的介质中检查L-酪氨酸。在本研究中，测试的L-酪氨酸的终浓度为500nm、5μm和15μm。以50μm的浓度测试法呢基。对于3和6小时的时间点未观察到显著的反应。
结构单元成分与法呢基组合的L-苯丙氨酸的Western印迹分析：在不含L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的介质中检查与法呢基组合的L-苯丙氨酸，一种用于醌环结构的合成的前体。进行western印迹分析以测定Bcl-2和半胱天冬酶-3的表达。L-苯丙氨酸的终浓度为：5μm、25μm和100μm。以50μm的浓度加入法呢基。本研究显示对于大多数测试的浓度和组合Bcl-2表达减少，如下表中所描述的。
表54：L-苯丙氨酸和/或法呢基
Figure BPA00001497288601811
4-羟基-苯甲酸酯与苯醌的组合的细胞增殖测定：本组实验使用细胞增殖测定法评估组合不同结构单元分子对细胞增殖的效应。
第一研究检查组合4-羟基-苯甲酸酯与苯醌的效应。将细胞温育48小时，之后对活细胞进行细胞计数。将每一个测试组与对照相比较，并且将每一个组合组与苯醌对照相比较。针对苯醌的添加统计分析化合物。下表概述了细胞计数结果，其中X标记表示细胞数目的统计上的减少。
表55：4-羟基苯甲酸酯和/或苯醌
Figure BPA00001497288601812
Figure BPA00001497288601821
对于用4-羟基苯甲酸酯和苯醌以及组合温育的细胞存在细胞数目的显著减少。对于与70μm苯醌组合的50μm 4-羟基苯甲酸酯的组合，存在相对于苯醌对照的细胞数目的显著减少。这表明对于该摩尔比的协同效应。
进行另外的研究，测试另外的摩尔比。对于第一测试，在500nm、1μm和50μm的浓度上测试4-羟基苯甲酸酯。测试与2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌(Benzo)组合的这些浓度。测试的Benzo的浓度为25μm、50μm和100μm。将黑素瘤细胞培养至80％汇合，以40K个细胞/孔的浓度接种在6孔板中。用CoQ10、4-羟基苯甲酸酯、Benzo以及4-羟基苯甲酸酯/Benzo的组合处理细胞。
进行T-检验，以p＜0.05作为统计上显著的。X表示细胞数目的统计上的减少。
表56：4-羟基苯甲酸酯和/或2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌(Benzo)
  对照vs Benzo 25μm   X
  对照vs Benzo(B)50μm
  对照vs Benzo(B)100uM   X
  对照vs 4-羟基苯甲酸酯(HB)500nm   X
  对照vs HB 1μm   X
  对照vs HB 50μm   X
  500nm HB vs 500nm HB w/25B   X
  500nm HB vs 500nm HB w/50B   X
  500nm HB vs 500nm HB w/100B   X
  1uM HB vs 1μm HB w/25B   X
  1uM HB vs 1μm HB w/50B   X
  1uM HB vs 1μm HBw/100B
  50uM HB vs 50μm HBw/25B   X
  50uM HB vs 50μm HB w/50B   X
  50uM HB vs 50μm HB w/100B
  500nm HB w/25B vs 25B   X
  500nm HB w/50B vs 50B   X
  500nm HB w/100B vs 100B   X
  1μm HB w/25B vs 25B   X
  1μm HB w/50B vs 50B   X
  1μm HB w/100B vs 100B
  50μm HB w/25B vs 25B   X
  50μm HB w/50B vs 50B   X
  50μm HB w/100B vs 100B
对于含有HB的处理培养基存在细胞增殖的显著增加。此外，HB与苯醌的组合显示与用相应的苯苯醌浓度温育的细胞相比较细胞数目的显著减少。
还对新生成纤维细胞进行细胞增殖测定。测试的HB的浓度为500nm、5μm和25μm。还在25μm、50μm和100μm上测试HB与苯醌的组合。以40k个细胞/孔接种黑素瘤细胞，将其处理24小时。利用胰蛋白酶处理细胞，使用库耳特计数器进行定量。
统计分析未显示成纤维细胞的显著减少。这显示在正常细胞中具有最低毒性至无毒性。
乙酸苯酯和苯醌的组合的细胞增殖测定：乙酸苯酯是4-羟基苯甲酸的合成的前体(促进环结构的接合)。进行细胞增殖测定以测定温育与CoQ10和苯醌组合的乙酸苯酯的效应。
表57：乙酸苯酯和/或苯醌
  对照和25/25μm Ben   X
  对照和25/50μm Ben   X
  对照和25/100μm Ben   X
  对照和25/25μm Q-10   X
  对照和25/25μm Q-10   X
  对照和25/50μm Q-10   X
  对照和25/100μm Q-10   X
  对照和Ben 25   X
  对照和Ben 50   X
  对照和Ben 100   X
  对照和Q-10 25
  对照和Q-10 50
  对照和Q-10 100   X
  Ben 25μm和500nm/25μm Ben   X
  Ben 25μm和5nm/25μm Ben   X
  Ben 25μm和25nm/25μm Ben   X
  Ben 50μm和500nm/50μm Ben   X
  Ben 50μm和5nm/50μm Ben   X
  Ben 50μm和25nm/50μm Ben   X
  Ben 100μm和500nm/100μm Ben
  Ben 100μm和5nm/100μm Ben
  Ben 100μm和25nm/100μm Ben
  Q-10 25μm和500nm/25μm Q-10   X
  Q-10 25μm和5nm/25μm Q-10   X
  Q-10 25μm和25nm/25m Q-10   X
  Q-10 50μm和500nm/50μm Q-10   X
  Q-10 50μm和5nm/50μm Q-10   X
  Q-10 50μm和25nm/50μm Q-10   X
  Q-10 100μm和500nm/100μm Q-10   X
  Q-10 100μm和5nm/100μm Q-10   X
  Q-10 100μm和25nm/100μm Q-10   X
数据显示乙酸苯酯与苯醌的组合的添加显著减少细胞增殖。与CoQ10和乙酸苯酯的组合与单独利用CoQ10和苯醌的温育相比较显著减少细胞数目。
4-羟基-苯甲酸酯与法呢基的组合的细胞增殖测定：将4-羟基-苯甲酸酯与法呢基组合温育。结果的概述列于下面。将4-羟基苯甲酸酯组与对照和法呢基对照组相比较。X表示细胞数目的统计上的减少。
表58：4-羟基-苯甲酸酯和/或法呢基
Figure BPA00001497288601851
L-苯丙氨酸与苯醌的组合的细胞增殖测定：进行细胞增殖测定以测试与苯醌组合的L-苯丙氨酸的组合。下面是L-苯丙氨酸相对于对照和苯醌对照的结果的概述。X表示统计上的减少。
表59：L-苯丙氨酸和/或苯醌
Figure BPA00001497288601862
Figure BPA00001497288601871
对于与苯醌组合的L-苯丙氨酸看到相似的协同作用。
L-苯丙氨酸与法呢基的组合的细胞增殖测定：与法呢基组合温育的L-苯丙氨酸的组合细胞增殖研究的初步结果。将L-苯丙氨酸与对照和法呢基对照组相比较。X表示细胞数目的统计上的减少。
表60：L-苯丙氨酸和/或法呢基
L-酪氨酸与苯醌的组合的细胞增殖测定：将L-酪氨酸与苯醌组合温育，之后进行细胞计数。将所述组合与对照组和苯醌对照组相比较。
表61：L-酪氨酸和/或苯醌
苯醌的添加不增强L-酪氨酸对细胞数目的影响。
L-酪氨酸与苯醌的组合的细胞增殖测定：本研究检查L-酪氨酸与法呢基的组合。将所述组与对照和法呢基对照组相比较。
表62：L-酪氨酸和/或法呢基
Figure BPA00001497288601891
组合L-酪氨酸与法呢基在本实验中似乎对减少细胞的数目不具有协同效应。
将CoQ10的合成分成两个主要部分，所述部分由环结构的合成和侧链结构的合成组成。此处，致癌细胞补充有作为用于侧链和环结构成分的合成的前体的化合物。这些结果将所述研究聚焦至参与环结构的合成的3种主要成分和在环结构至侧链结构的连接中起着重要作用的2种化合物。已显示Bcl-2的显著减少和半胱天冬酶-3表达的显著增加的3种化合物为：1)L-苯丙氨酸、2)L-酪氨酸和3)4-羟基苯丙酮酸酯。牵涉侧链至环结构的连接的2种化合物为：1)4-羟基苯甲酸盐和2)乙酸苯酯。
这些结果还显示与2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌(苯醌)组合的这些化合物的外源递送显著抑制细胞增殖。这表明给环结构补充用于将侧链连接至苯醌环的化合物可补足受损的CoQ10合成机制。这也可有助于稳定分子以维持细胞过程所需的功能性质。乙酸苯酯是4-羟基苯甲酸酯的合成的前体，将其与苯醌组合外源递送在致癌细胞中具有相似效应。
实施例23糖尿病细胞模型中辅酶Q10对基因表达的调节
辅酶Q10是通过直接影响氧化磷酸化在正常线粒体功能的维持中具有已确定的作用的内源分子。提供了证明辅酶Q10在调节细胞内靶中的能力的实验证据，所述能力以表示治疗终点的形式用作代谢障碍例如糖尿病的关键指标。
为了理解辅酶Q10如何调节与糖尿病的病因或治疗相关的基因的表达，将来源于人肾的永生化原代肾小管细胞系(HK-2)和人主动脉平滑肌细胞(HASMC)的原代培养物用作实验模型。通常将HK-2和HASMC细胞维持在5.5mM葡萄糖的培养基中，该浓度是相应于在人血中被认为是正常的范围的浓度。然而，为了刺激糖尿病环境，随后将两种细胞系维持在22mM葡萄糖中，该浓度相应于在与慢性高血压相关的人血中观察到的范围。随后让细胞繁殖3代以便细胞内调节过程在功能上适应于模拟糖尿病状态。细胞系的选择基于除了受损的心血管功能的进行性病理生理学外，糖尿病对肾功能不全和至终末期肾脏病(ESRD)的进展的生理影响。
使用糖尿病PCR阵列获得的辅酶Q10对HK-2细胞中基因表达的效应
糖尿病PCR阵列(SABiosciences)提供了对84个基因的同时筛选。本研究中测试的4个处理是：
●HK-2；
●在22mM葡萄糖上维持的HK-2H；
●HK2(H)+50μm辅酶Q10；和
●HK2(H)+100μm辅酶Q10.
在糖尿病阵列(Cat#PAHS-023E，SABiosciences Frederick MD)上对HK-2样品的实时PCR数据进行严格分析以排除其中基因调节相对于HK-2正常未处理的细胞未达到至少2倍调节(p值小于0.05)的所有结果。观察到被慢性高血糖或被辅酶Q10调节的基因列于表63中，并且它们的功能和亚细胞定位(来源于Ingenuity Pathway分析)列于表64中。
表63
Figure BPA00001497288601911
表64
Figure BPA00001497288601912
Figure BPA00001497288601921
在具有经调节的水平的被检测的RNA转录物中，癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)被鉴定为在HK2(H)细胞(特别是用100μM辅酶Q10处理的)被高度上调。CEACAM-1，也称为CD66a和BGP-I，为属于CEA超家族的膜结合CEA亚家族的115-200KD I型跨膜糖蛋白。在细胞表面上，其形成非共价同和异二聚体。细胞外区域包括3个C2-型Ig样结构域和一个N末端V型Ig样结构域。包括区域C-末端至第二C2-型结构域(aa 320和以上)的多个剪接变体存在。已提出小鼠中完整CEACAM1表达的缺乏促进与糖尿病相关的代谢综合征，然而CEACAM1的表达的增加与增加的胰岛素内化相关，这表明胰岛素敏感性和葡萄糖利用(例如，葡萄糖从血液移动至细胞内)的增加，从而缓解了胰岛素抗性(2型糖尿病的标志特征)。
如表63中所显示的，在利用辅酶Q10处理的糖尿病HK-2细胞中胰岛素受体(INSR)的表达也被改变。不希望受理论束缚，通过用辅酶Q10处理增加INSR的表达应当增强胰岛素敏感性(单独或除了CEACAM1的表达外)，潜在地逆转与糖尿病相关的主要生理/代谢并发症。
使用线粒体阵列获得的辅酶Q10对HK-2细胞中基因表达的效应
使用线粒体阵列(Cat#PAHS 087E，SABisociences Frederick MD)测定糖尿病中线粒体基因的差异表达。被慢性高血糖和/或辅酶Q10处理调节的基因列于表65中，而它们的功能和定位包括在表66中。
表65
Figure BPA00001497288601922
Figure BPA00001497288601931
表66
Figure BPA00001497288601932
迄今为止，在用辅酶Q10处理的糖尿病HK-2细胞中鉴定的4个线粒体基因(表65)在糖尿病中的作用未得到表征。
研究2：使用糖尿病PCR阵列获得的辅酶Q10对HASMC细胞中基因表达的效应
糖尿病PCR阵列(SABiosciences)提供了对84个基因的同时筛选。本研究中测试的4个处理是：
●HASMC；
●在22mM葡萄糖上维持的HASMC H；
●HASMC(H)+50μm辅酶Q10；和
●HASMC(H)+100μm辅酶Q10.
在糖尿病阵列(Cat#PAHS-023E，SABiosciences Frederick MD)上对HASMC细胞样品的实时PCR数据进行严格分析以排除其中基因调节相对于HASMC正常未处理的细胞未达到至少2倍调节(p值小于0.05)的所有结果。观察到被慢性高血糖或被辅酶Q10调节的基因列于表67中。
表67
Figure BPA00001497288601941
在HASMC细胞中，利用辅酶Q10对血糖过多细胞的处理导致改变的基因的表达，所述基因参与调节血功能(AGT)、胰岛素敏感性(CEACAM1、INSR、SELL)和炎症/免疫功能(IL-6、TNF、CCL5)。不希望受理论束缚，INSR的表达的增加可与HASMC细胞的增加的胰岛素敏感性相关，所述增加的胰岛素敏感性是可有益于糖尿病的治疗的生理性质，然而已有人提出IL-6，除了其免疫调节性质外，还通过作用于骨骼肌细胞、脂肪细胞、肝细胞、胰腺β细胞和神经内分泌细胞直接和间接地影响葡萄糖的动态平衡和代谢。当激活时，正常T细胞表达和分泌RANTES和趋化因子(C-Cmotif)配体(CCL5)。CCL5由脂肪细胞表达，并且RANTES的水平在肥胖症和2型糖尿病中增加。然而如表67中所显示的，利用辅酶Q10对HASMC细胞的处理引起CCL5表达的显著减少。基于上述数据，预期辅酶Q10的施用在糖尿病的治疗中将具有治疗益处。
使用线粒体阵列获得的辅酶Q10对HASMC细胞中基因表达的效应
使用线粒体阵列(Cat#PAHS 087E，SABisociences Frederick MD)测定糖尿病中线粒体基因的差异表达。被慢性高血糖和/或辅酶Q10处理调节的基因示于表68中。
表68
Figure BPA00001497288601951
利用辅酶Q10对血糖过多HASMC细胞的处理导致基因的改变的表达，所述基因调节程序化细胞死亡或细胞凋亡(BCL2L1，PMIAP1也称为NOXA)、转运蛋白(SLC25A1[柠檬酸转运蛋白]、SLC25A13[天冬氨酸-谷氨酸交换剂]、SLC25A19[硫胺素焦磷酸盐转运蛋白]和SLC25A22[谷氨酸-氢协同转运蛋白])和线粒体基质转运蛋白(MFN1、TIMM44和TOMM40)。此类转运蛋白的活性在克雷布斯循环所必需的前体的调节和线粒体氧化磷酸化的维持中起着重要作用。这些结果表明糖尿病HASMC细胞对辅酶Q10的暴露与细胞质和线粒体基因的表达的变化相关，这从而与辅酶Q10在糖尿病的治疗中提供治疗益处相符。
通过用辅酶Q10处理HASMC细胞和HK-2细胞或在血糖过多环境中获得的数据的比较显示4个基因在两个细胞系(例如，在基因表达测定中PIK3C2B和SELL以及在线粒体阵列测定中TOMM40和TSPO)中通常受到辅酶Q10调节。这些结果显示在糖尿病环境中利用辅酶Q10对细胞的处理与已知牵涉糖尿病的引发或治疗的基因的改变的表达相关。
等同方案：
本领域技术人员将承认，或能够确定通过只使用常规实验，许多方面等同于本文中描述的特定实施方案和方法。此类等同物旨在包括在下列权利要求的范围内。

Claims (44)

1.一种用于治疗哺乳动物的代谢障碍、减轻其症状、抑制其进展或预防其的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的包含至少一种环境影响剂(env-influencer)的药物组合物，其中所述环境影响剂在哺乳动物的患病细胞中选择性引发朝向标准化的线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能转变。
2.权利要求1所述的方法，其中所述环境影响剂在哺乳动物的正常细胞中基本上不引发朝向线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能转变。
3.权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物为人(或非人哺乳动物)。
4.权利要求1所述的方法，其中所述代谢障碍对利用辅酶Q10或其代谢产物或其类似物的治疗易起反应或敏感。
5.权利要求1所述的方法，其中所述代谢障碍的特征在于导致改变的基因调控和/或蛋白质间相互作用的失调的线粒体氧化磷酸化功能，所述失调促成或原因性地导致代谢疾病。
6.权利要求1所述的方法，其中所述环境影响剂包括：
(a)苯醌或至少一种促进苯醌环的生物合成的分子，和
(b)至少一种促进类异戊二烯单元的合成和/或类异戊二烯单元至苯醌环的连接的分子。
7.权利要求6所述的方法，其中所述至少一种促进苯醌环的生物合成的分子包括：L-苯丙氨酸、DL-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-酪氨酸、D L-酪氨酸、D-酪氨酸、4-羟基-苯丙酮酸酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯(香草扁桃酸酯或VMA)、香草酸、吡哆素或泛醇。
8.权利要求6所述的方法，其中所述至少一种促进类异戊二烯单元的合成和/或类异戊二烯单元至苯醌环的连接的分子包括：乙酸苯酯、4-羟基-苯甲酸酯、甲羟戊酸、乙酰甘氨酸、乙酰-CoA或法呢基。
9.权利要求1所述的方法，其中所述环境影响剂包括：
(a)L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和4-羟基苯丙酮酸的一种或多种；和
(b)4-羟基苯甲酸酯、乙酸苯酯和苯醌的一种或多种。
10.权利要求1所述的方法，其中所述环境影响剂：
(a)抑制Bcl-2表达和/或促进半胱天冬酶-3表达；和/或，
(b)抑制细胞增殖。
11.权利要求1所述的方法，其中所述环境影响剂是多维细胞内分子(MIM)。
12.权利要求11所述的方法，其中所述MIM选自：α酮戊二酸盐/α酮戊二酸、苹果酸盐/苹果酸、琥珀酸盐/琥珀酸、葡糖胺、腺苷、腺苷二磷酸、葡糖苷酸/葡糖醛酸、烟酸、烟酸二核苷酸、丙氨酸/苯丙氨酸、吡哆素、硫胺或黄素腺嘌呤二核苷酸。
13.权利要求1所述的方法，其中所述环境影响剂是表观代谢转变剂(epi-shifter)。
14.权利要求13所述的方法，其中所述表观代谢转变剂选自：转醛醇酶、转酮醇酶、琥珀酰CoA合酶、丙酮酸羧化酶或核黄素。
15.权利要求13所述的方法，其中所述表观代谢转变剂是辅酶Q10。
16.权利要求1所述的方法，其中所述待治疗的人的组织中的环境影响剂的浓度与代表健康或正常状态的人组织的对照标准的环境影响剂的浓度不同。
17.权利要求1所述的方法，其中所述给人施用的所述环境影响剂的形式与在人的全身性循环中发现的主要形式不同。
18.权利要求1所述的方法，其中所述足以治疗人的代谢障碍的量上调或下调线粒体氧化磷酸化。
19.权利要求18所述的方法，其中所述足以治疗人的代谢障碍的量调节葡萄糖的无氧使用和/或乳酸盐生物合成。
20.权利要求1所述的方法，其中所述治疗通过环境影响剂与HNF4α的相互作用发生。
21.权利要求1所述的方法，其中所述治疗通过环境影响剂与转醛醇酶的相互作用发生。
22.权利要求1所述的方法，其中所述代谢障碍选自糖尿病、肥胖症、糖尿病前期、代谢综合征以及代谢障碍的任何关键因素。
23.权利要求22所述的方法，其中所述代谢障碍是糖尿病，并且所述环境影响剂影响β细胞功能、胰岛素代谢和/或胰高血糖素沉积。
24.权利要求22所述的方法，其中所述代谢障碍是肥胖症，并且所述环境影响剂影响线粒体中的β细胞氧化、脂肪细胞大小的减小和/或皮质醇水平的控制。
25.权利要求22所述的方法，其中所述代谢障碍是心血管疾病，并且所述环境影响剂影响血管中膜的平滑肌细胞增殖的减少、脂质过氧化作用、凝血烷-ax2合成、TNFα、IL-1B、血小板聚集、一氧化氮(NO)产量的减少、斑块沉积和/或标准化的血糖控制。
26.权利要求22所述的方法，其中代谢障碍的所述关键因素选自空腹葡萄糖受损、葡萄糖耐量受损、增加的腰围、增加的内脏脂肪含量、增加的空腹血浆葡萄糖、增加的空腹血浆甘油三酯、降低的空腹高密度脂蛋白水平、增加的血压、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、心血管疾病、动脉硬化、冠状动脉病、周围血管疾病、脑血管病、充血性心力衰竭、升高的血浆去甲肾上腺素、升高的心血管相关炎症因子、促成血管内皮功能障碍的升高的血浆因子、高脂蛋白血症、动脉硬化或动脉粥样硬化、摄食过度、高血糖症、高脂血症和血压升高或高血压、升高的血浆餐后甘油三酯或游离脂肪酸水平、增强的细胞氧化性应激或其血浆指标、增加的循环高凝状态、肝脏脂肪变性、肝脏脂肪变性、肾病，包括肾衰竭和肾功能不全。
27.权利要求1所述的方法，还包括施用另外的治疗剂。
28.权利要求27所述的方法，其中所述另外的治疗剂选自糖尿病治疗剂、糖尿病并发症治疗剂、抗高血脂药、降压药或抗高血压药、抗肥胖药、利尿药、化学治疗剂、免疫治疗剂、免疫抑制剂等。
29.一种用于在需要治疗代谢障碍的哺乳动物的患病细胞中选择性增加线粒体氧化磷酸化的方法，所述方法包括：给所述哺乳动物施用治疗有效量的包含至少一种环境影响剂的药物组合物，从而在所述哺乳动物的患病细胞中选择性增加线粒体氧化磷酸化。
30.权利要求29所述的方法，其还包括上调选自表2-4和表6-28以及表63-68中所列的具有正倍数改变的分子的一个或多个基因的表达；和/或下调选自表2-4和表6-28以及表63-68的具有负倍数变化的分子的一个或多个基因的表达。
31.权利要求29所述的方法，其还包括调节一个或多个基因的表达，所述基因选自HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11、XIAP、20BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-羟基苯甲酸酯、中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C和钙调蛋白激酶II。
32.权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述代谢障碍选自糖尿病、肥胖症、糖尿病前期、代谢综合征以及代谢障碍的任何关键因素。
33.权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述代谢障碍的关键因素选自空腹葡萄糖受损、葡萄糖耐量受损、增加的腰围、增加的内脏脂肪含量、增加的空腹血浆葡萄糖、增加的空腹血浆甘油三酯、降低的空腹高密度脂蛋白水平、增加的血压、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、心血管疾病、动脉硬化、冠状动脉病、周围血管疾病、脑血管病、充血性心力衰竭、升高的血浆去甲肾上腺素、升高的心血管相关炎症因子、促成血管内皮功能障碍的升高的血浆因子、高脂蛋白血症、动脉硬化或动脉粥样硬化、摄食过度、高血糖症、高脂血症和血压升高或高血压、升高的血浆餐后甘油三酯或游离脂肪酸水平、增强的细胞氧化性应激或其血浆指标、增加的循环高凝状态、肝脏脂肪变性、肝脏脂肪变性、肾病，包括肾衰竭和肾功能不全。
34.权利要求29-33中任一项所述的方法，其还包括施用另外的治疗剂。
35.权利要求34所述的方法，其中所述另外的治疗剂选自糖尿病治疗剂、糖尿病并发症治疗剂、抗高血脂药、降压药或抗高血压药、抗肥胖药、利尿药、化学治疗剂、免疫治疗剂、免疫抑制剂等。
36.一种鉴定在治疗代谢障碍中是有效的试剂的方法，所述方法包括：
(1)选择环境影响剂；
(2)鉴定能够转变细胞的代谢状态的环境影响剂；和
(3)确定所述环境影响剂在治疗代谢障碍中是否有效；
从而鉴定在治疗代谢障碍中是有效的试剂。
37.权利要求36所述的方法，其中通过测量mRNA表达、蛋白质表达、脂质或代谢产物浓度、生物能分子的水平、细胞能量、线粒体功能和线粒体数量的任一个或多个的改变，环境影响剂被鉴定为能够转变细胞的代谢状态。
38.权利要求36所述的方法，其中在治疗代谢障碍中是有效的环境影响剂能够降低患者的葡萄糖水平或脂质水平。
39.一种包含根据权利要求36-39中任一项所述的方法鉴定的试剂的组合物。
40.一种包括权利要求39所述的组合物的试剂盒。
41.一种降低患者的葡萄糖水平的方法，包括给所述患者施用有效量的权利要求39所述组合物。
42.一种降低患者的脂质水平的方法，包括给所述患者施用有效量的权利要求39所述组合物。
43.一种用于治疗哺乳动物的辅酶Q10反应性障碍、减轻其症状、抑制其进展或预防其的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的包含至少一种环境影响剂(env-influencer)的药物组合物，其中所述环境影响剂在哺乳动物的患病细胞中选择性引发朝向在正常生理条件下在哺乳动物的正常细胞中观察到的糖酵解和线粒体氧化磷酸化的水平的细胞代谢能转变。
44.权利要求43所述的方法，其中所述辅酶Q10反应性障碍是代谢障碍。
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