MX2011011940A - Metodos para tratamiento de trastornos oncologicos usando intercambiadores epimetabolicos, moleculas intracelulares multidimensionales, o influenciadores ambientales. - Google Patents

Metodos para tratamiento de trastornos oncologicos usando intercambiadores epimetabolicos, moleculas intracelulares multidimensionales, o influenciadores ambientales.

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Abstract

Se describen métodos y formulaciones para tratar trastornos oncológicos en seres humanos usando intercambiadores epimetabólicos, moléculas intracelulares multidimensionales o influyentes ambientales.

Description

MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS ONCOLÓGICOS USANDO CAMBIADORES EPIMETABOLICOS, MOLÉCULAS INTRACELULARES MULTIDIMENSIONALES O INFLUENCIADORES AMBIENTALES Solicitudes relacionadas: La presente solicitud reivindica prioridad de la Solicitud provisional estadounidense Serie No. 61/177,241, presentada el 11 de mayo de 2009, con el titulo "Methods for 1 Treatment of Oncological Disorders Using an Epimetabolic Shifter (Coenzyme Q10)" ["Métodos para el tratamiento de trastornos oncológicos usando un cambiador epimetabólico (coenzima Q10)"] (Expediente del agente No.: 117732-00601), solicitud provisional estadounidense Serie No.. 61/177,243, presentada el 11 de mayo de 2009, con el titulo "Methods for Treatment of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters, Multidimensional Intracellular Molecüles or Environmental Influencers" ["Métodos para el tratamiento de trastornos oncológicos usando cambiadores epimetabólicos, moléculas intracelulares multidimensionales o influenciadores ambientales"] (Expediente del agente No.: 117732-00701) , solicitud provisional estadounidense Serie No. 61/177, 244, presentada el 11 de mayo de 2009, con el titulo "Methods for the Diagnosis of Oncological Disorders Using , Epimetabolic Shifters, Multidimensional Intracellular Molecüles or Environmental Influencers" ["Métodos para el diagnóstico de trastornos oncológicos usando cambiadores epimetabólicos, moléculas intracelulares multidimensionales o influenciadores ambientales"] (Expediente del agente No.: 117732-00801) , solicitud provisional estadounidense Serie No. 61/177, 245, presentada el 11 de mayo de 2009, con el titulo "Methods for Treatment of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters, Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers" ["Métodos para el tratamiento de trastornos metabólicos usando cambiadores epimetabólicos, moléculas intracelulares multidimensionales o influenciadores ambientales"] (Expediente del agente No.: 117732-00901) y solicitud provisional estadounidense Serie No. 61/177, 246, presentada el 11 de mayo de 2009, con el título "Methods for the Diagnosis of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters, Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers" ["Métodos para el diagnóstico de trastornos metabólicos usando cambiadores epimetabólicos, moléculas intracelulares multidimensionales o influenciadores ambientales"] (Expediente del agente No. : 117732-01001) . Todo el contenido de cada una de las solicitudes anteriores se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Actualmente el cáncer es una de las principales causas de muerte en las naciones en desarrollo y es una importante amenaza a la sociedad moderna. El cáncer se puede desarrollar en cualquier tejido de cualquier órgano a cualquier edad. En todo el mundo, más de 10 millones de personas son diagnosticadas con cáncer cada año y se calcula que esta cantidad ascenderá a 15 millones de casos nuevos por año para el año 2020. Se cree que el cáncer causa seis millones de muertes cada año o 12% de las muertes en todo el mundo.
La etiología del cáncer no se entiende completamente. El cáncer ha estado unido o asociado con mucho factores durante los diversos años de investigaciones en curso, incluyendo susceptibilidad genética, trastornos de rotura de cromosomas, virus, factores ambientales y trastornos inmunológicos . El cáncer abarca una amplia categoría de afecciones médicas. Las células cancerosas pueden surgir en casi cualquier órgano y/o tejido del cuerpo. El cáncer se desarrolla cuando las células en una parte del cuerpo comienzan a crecer o a diferenciarse de forma descontrolada .
Pese a que las investigaciones recientes han aumentado ampliamente nuestro entendimiento de muchos de los mecanismos moleculares de la tumorigénesis y han proporcionado diversas vías nuevas para el tratamiento del cáncer, los tratamientos estándar para la mayoría de las neoplasias siguen , siendo la resección macroscópica, la quimioterapia y la radioterapia. Si bien son cada vez más exitosos, cada uno de estos tratamientos puede causar diversos efectos laterales no deseados. Por ejemplo, la cirugía podría dar como resultado dolor, lesión traumática al tejido sano y cicatrices. La terapia de radiación tiene la ventaja de destruir las células cancerosas pero también daña el tejido no canceroso a la vez. La quimioterapia implica la administración de diversos fármacos anticáncer a un paciente. Estos tratamientos estándar generalmente están acompañados por efectos laterales adversos, por ej . , náuseas, supresión inmune, ulceración gástrica y tumorigénesis secundaria.
A lo largo de los años, muchos individuos y empresas han realizado extensas investigaciones a la búsqueda de mejoras en los tratamientos para la amplia gama de cánceres. Las empresas están desarrollando agentes bioactivos que incluyan entidades químicas, por ej . , moléculas pequeñas y biológicos, por ej . , anticuerpos, con el deseo de proporcionar terapias más beneficiosas para el cáncer. Algunos de los agentes bioactivos probados han funcionado y han proporcionado efectos terapéuticos beneficiosos en algunos individuos o tipos de cánceres y otros no han tenido éxito o han tenido efectos terapéuticos mínimos en sus protocolos de prueba. Otros agentes bioactivos estudiados a la fecha tienen mecanismos de acción que no se entienden completamente.
La coenzima Q10, también denominada en la presente CoQlO, Q10, ubiquinona o ubidecarenona es un complemento nutricional popular y se puede encontrar en forma de cápsulas en tiendas de nutrición, tiendas de alimentos naturales, farmacias y similares, como un complemento vitamínico para ayudar a proteger el sistema inmune mediante las propiedades antioxidantes del ubiquinol, la forma reducida de la CoQlO. La CoQlO es reconocida en la técnica y se describe adicionalmente en la Solicitud internacional No. WO 2005/069916, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia La CoQlO se encuentra en la mayoría de los tejidos del cuerpo humano y los tejidos de otros mamíferos. La distribución en tejidos y el estado de reducción-oxidación de la CoQlO en humanos han sido revisados en un artículo de revisión por Bhagavan HN, et ál . , Coenzyme Q10: Absorption, tissue uptake, metabolism and pharmacokinetic, Free Radical Research 40(5), 445-453 (2006) (en lo sucesivo, Bhagavan, et ál.) . Los autores informan que "como regla general, los tejidos con requisitos de alta energía o actividad metabólica como el corazón, el riñon, el hígado y el músculo contienen concentraciones relativamente altas de CoQlO." Los autores indican además que "[una] porción importante de la CoQlO en tejidos se encuentra en la forma reducida como la hidroquinona o uniquinol, con la excepción del cerebro y los pulmones", lo que "parece ser un reflejo del mayor estrés oxidativo en estos dos tejidos." En particular, Bhagavan et ál. informan que en el corazón, el riñon, el hígado, el músculo, el intestino y la sangre (plasma), alrededor de 61%, 75%, 95%, 65%, 95% y 96%, respectivamente, de la CoQlO se encuentra en la forma reducida. De manera similar, Ruiz-Jiminez, et ál., Determination of the ubiquinol-10 and ubiquinone-10 (coenzyme Q10) in human serum by liquid chromatography tándem mass spectrometry to evalúate the oxidative stress, J. Chroma A 1175(2), 242-248 (2007) (en lo sucesivo Ruiz-Jiminez, et ál.) informan que cuando el plasma humano se evaluó para determinar la Q10 y la forma reducida de Q10 (Q10H2), la mayoría (90%) de la molécula se encontró en la forma' reducida.
La CoQlO es muy lipofílica y, en su mayoría, insoluble en agua. Debido a su insolubilidad en agua, solubilidad limitada en lípidos y peso molecular relativamente alto, la eficacia de la absorción de la CoQlO administrada oralmente es baja. Bhagavan, et ál . informan que "en un estudio con ratas se informó que solamente se absorbió alrededor de 2-3% de la CoQlO administrada oralmente." Bhagavan, et ál . informan además que los "[d]atos de los estudios en ratas indican que la CoQlO se reduce a ubiquinol ya sea durante o luego de la absorción en el intestino . " La CoQlO ha estado asociada con el cáncer en la literatura durante muchos años. A continuación se describen algunos ejemplos representativos pero no del todo inclusivos de las asociaciones informadas en la literatura. Karl Folkers, et ál., Survival of Cáncer Patients on Therapy with Coenzyme Q10, Biochemical and Biophysical Research Communication 192, 241-245 (1993) (en lo sucesivo "Folkers, et ál.") describe ocho historias clínicas de pacientes con cáncer "sometidos a terapia con CoQlO" y sus historias de supervivencia "por períodos de 5-15 años." La CoQlO se administró oralmente a ocho pacientes con diferentes tipos de cáncer, incluyendo carcinoma pancreático, adenocarcinoma, carcinoma de laringe, cáncer de mama, colon, pulmón y próstata. Folkers, et ál. establecen que "estos resultados justifican actualmente los protocolos sistémicos." Lockwood, et ál . , Progress on Therapy of Breast Cáncer with Vitamin Q10 and the Regression of etastases, Biochemical and Biophysical Research Communication 212, 172-177 (1995) (en lo sucesivo "Lockwood, et ál.") es otro artículo de revisión que informa sobre el "[a] vanee de la terapia del cáncer de mama con Vitamina Q10". Lockwood, et ál. remiten a Folkers, et ál., que "cubre 35 años de investigación internacional en animales y humanos que reveló niveles variables de vitamina Q10 en tejidos no tumorales y tumorales e incluye datos sobre la vitamina Q10 que son intrínsecos al sistema de defensa del hospedador según se basa en más sobrevivientes de ratones tratados con tumores". Lockwood, et ál. establecen adicionalmente que "[e]l potencial de la terapia con vitamina Q10 del cáncer humano se volvió evidente en 1961" basándose en un estudio que determinó los niveles sanguíneos de CoQlO en 199 pacientes suecos y estadounidenses con cáncer que reveló niveles variables de deficiencias en casos de cáncer de mama. La patente estadounidense No. 6,417,233, emitida el 9 de julio de 2002 (en lo sucesivo Sears, et ál.) describe composiciones que contienen benzoquinonas solubles en lípidos, por ej . , coenzima Q10, para la prevención y/o el tratamiento de mitocondriopatías . Sears, et ál. establecen que "se ha informado que el tratamiento con CoQlO proporciona algunos beneficios en pacientes con cáncer (véase columna 2, líneas 30-31) ." A la fecha de presentación de esta solicitud, el Instituto Nacional de Cáncer informó que no se ha llevado a cabo ningún ensayo clínico bien diseñado que implique grandes cantidades de pacientes tratados con CoQlO en el tratamiento del cáncer debido a que "la forma en la que se realizaban los estudios y la cantidad de información obtenida no dejaba en claro si los beneficios eran causados por la coenzima Q10 o por otra cosa." Véase Instituto Nacional de Cáncer (NCI), disponible en www . cáncer . gv/caneertopies/pdq/cam/coenzymeQIO/patient/allp ages (29 de setiembre de 2008). En particular, el NCI cita tres estudios pequeños sobre el uso de CoQlO como una terapia adyuvante luego del tratamiento estándar en pacientes con cáncer de mama, donde pareció que el tratamiento ayudaba a algunos pacientes y reitera que la "debilidad en el diseño y el informe del estudio, sin embargo, no dejó claro si los beneficios eran causados por la coenzima Q10 o por otra cosa". El NCI especifica que "estos estudios tenían la siguiente debilidad: los estudios no eran aleatorizados ni controlados; los pacientes usaban otros' complementos además de la coenzima Q10; los pacientes recibían tratamientos estándar antes o durante la terapia con coenzima Q10 y los detalles no se informaban para todos los pacientes en los estudios." El NCI informa además acerca de "los informes anecdóticos de que la coenzima Q10 ha ayudado a algunos pacientes con cáncer a vivir más tiempo, incluyendo pacientes con cáncer de páncreas, pulmón, colon, recto y próstata", pero establece que "los pacientes descritos en estos informes, sin embargo, también recibieron tratamientos diferentes a la coenzima Q10 incluyendo quimioterapia, terapia de radiación y cirugía".
La publicación de la solicitud de patente estadounidense 2006/0035981, publicada el 16 de febrero de 2006 (en lo sucesivo "Mazzio 2006") describe métodos y formulaciones para tratar o prevenir cánceres humanos y animales usando composiciones que explotan la vulnerabilidad de los cánceres con respecto a su requisito anaeróbico de fosforilación no oxidativa de glucosa para obtener energía, de manera opuesta al hospedador. Las formulaciones de Mazzio 2006 contienen uno o más compuestos que promueven de forma sinérgica el metabolismo oxidativo y/o impiden el metabolismo anaeróbico de la glucosa o deshidrogenasa de ácido láctico y más particularmente se describen como que contienen "2, 3-dimetoxi-5-metil-l, 4-benzoquinona (en la presente también denominada "DMBQ") (base quinoide) y opciones para toda la serie de ubiquinona incluyendo hidroquinonas, ubicromenoles, ubicromanoles correspondientes o derivados y análogos sintetizados/naturales. Véase Mazzio 2006, página 3, párrafo 0010. Mazzio 2006 establece "las ubiquinonas de cadena corta (CoQ<3) como agentes anticáncer y también establece que la "2 , 3-dimetoxi-5-metil-l , -benzoquinona (DMBQ) es por encima de 1000 veces más potente que la CoQlO como un agente anticáncer". Véase Mazzio 2006, página 3, párrafo 0011. Mazzio 2006 también establece que el estudio "no encontró que la CoQlO fuera tan letal como se esperaba" y al igual que "estudios anteriores que han usado la CoQlO contra el cáncer han sido un tanto contradictorios" Véase Mazzio 2006, páginas 3-4 para obtener una lista extensa de citas que respaldan esta exposición.
La publicación de solicitud de patente estadounidense 2007/0248693, publicada el 25 de octubre de 2007 (en lo sucesivo "Mazzio 2007") también describe composiciones nutracéuticas y su uso para el tratamiento o la prevención del cáncer. Nuevamente, esta solicitud de patente publicada se enfoca en las ubiquinonas de cadena corta y específicamente establece que la CoQlO no es un componente importante de esta invención. De acuerdo con azzio 2007 "mientras que la CoQlO puede aumentar el Vmáx de la actividad del complejo II mitocondrial en células cancerosas (Mazzio and Solimán, Biochem Pharmacol. 67:1167-84, 2004), esto no controló la tasa de respiración mitocondrial o el uso de 02 a través del complejo IV. Además, la CoQlO no era tan letal como se esperaba. Asimismo, los resultados de la CoQlO contra el cáncer han sido contradictorios." Véase Mazzio 2007, página 5, párrafo 0019.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN: Los solicitantes han descrito anteriormente formulaciones tópicas de CoQlO y métodos para reducir la velocidad de crecimiento tumoral en sujetos animales (Hsia et ál., WO 2005/069916 publicado el 4 de agosto de 2005). En los experimentos descritos en Hsia et ál . , se mostró que la CoQlO aumentaba la tasa de apoptosis en un cultivo de células de cáncer de piel pero no en células normales. Además, se mostró que el tratamiento de animales con tumores con una formulación tópica de CoQlO reducía drásticamente la velocidad de crecimiento tumoral en los animales .
La presente invención se basa, al menos en parte, en un entendimiento más completo del rol de la CoQlO en un humano y/o una célula. En particular, los métodos y formulaciones de la presente invención se basan, al menos en parte, en el conocimiento obtenido sobre la actividad terapéutica de la CoQlO para trastornos oncológicos recabada mediante el diseño y la implementación de ensayos clínicos humanos y/o mediante la administración de CoQlO a sujetos humanos y la observación de los resultados sorprendentes e inesperados que se producen durante estos ensayos y/o regímenes de tratamiento. Los métodos y formulaciones de la presente invención se basan adicionalmente, al menos en parte, en la percepción obtenida sobre el mecanismo terapéutico de CoQlO a partir de estudios extensos del tratamiento de CoQlO de células in vitro1.
Específicamente, en al menos una modalidad, los métodos y las formulaciones de la presente invención se basan, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que la aplicación de Coenzima Q10 (también denominada CoQlO o Q10 en la presente) a células da como resultado una inducción selectiva de una respuesta apoptótica en células cancerosas, sin efecto o, en algunos casos, con un efecto positivo en el crecimiento de células normales. Además, en al menos una modalidad adicional, se encontró inesperadamente que las líneas celulares derivadas de cánceres agresivos eran más sensibles a la CoQlO (por ej . , requerían menores concentraciones y/o tiempos de tratamiento de CoQlO para la citotoxicidad y/o inducción de apoptosis) en comparación con líneas celulares derivadas de cánceres menos agresivos o no agresivos. Se observó una respuesta al tiempo y a la dosis de los niveles mitocondriales de Q10 donde, luego de 48 horas, el nivel de Q10 en la mitocondria de células aumentó seis veces . En al menos una modalidad adicional, la invención se basa adicionalmente en el sorprendente e inesperado descubrimiento de que la Q10 se mantiene en la forma oxidada suministrada (prooxidante) y no se convierte en la forma reducida (antioxidante) de Q10H2 en ninguna cantidad significativa. En otra modalidad, la invención aun se basa adicionalmente en el descubrimiento de que la expresión de una cantidad significativa de genes se modula en las células tratadas con la forma oxidada de Q10. Se encontró que estas proteínas moduladas se agrupaban en diversas vías celulares, incluyendo apoptosis, biología del cáncer y crecimiento celular, glucólisis y metabolismo, transporte molecular y señalización celular.
: En su conjunto, los resultados descritos en la presente han proporcionado una percepción del mecanismo terapéutico de la Q10. Por ejemplo, sin pretender limitarse por la teoría, los descubrimientos de los Solicitantes indican que la Q10 y, en particular, la forma oxidada de la Q10, induce un cambio metabólico en el microambiente celular. Se sabe que el metabolismo diferencial ocurre en células cancerosas (el efecto Warburg) , por el cual la mayoría de las células cancerosas predominantemente producen energía mediante glucólisis seguida por fermentación de ácido láctico en el citosol, en vez de mediante fosforilación oxidativa (oxidación de piruvato) en la mitocondria. Los descubrimientos de los Solicitantes indican que la Q10 es capaz de cambiar el estado metabólico de células cancerosas del uso anaeróbico de glucosa a la fosforilación oxidativa mitocondrial .
Con base en los datos de los Solicitantes presentados en la presente, se ha identificado a la Q10 como una molécula intracelular multidimensional (MIM) y como un cambiador epimetabólico (cambiador Epi) . La presente invención proporciona métodos para identificar otras MIM y/o cambiadores Epi. La presente invención proporciona además MIM, cambiadores Epi y métodos para tratar un trastorno oncológico mediante el uso de los mismos.
Por consiguiente, la invención proporciona, en un primer aspecto, un método para tratar o prevenir un trastorno oncológico en un humano; el método comprende administrar un influenciador ambiental (influenciador amb.) al humano en una cantidad suficiente como para tratar o prevenir el trastorno oncológico, donde el influenciador amb. no es la Coenzima Q10, tratando o previniendo asi el trastorno oncológico en el humano.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas, inhibir el avance o prevenir un trastorno oncológico en un mamífero; el método comprende: administrarle al mamífero que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende al menos un influenciador ambiental (influenciador amb.), donde el influenciador ambiental provoca selectivamente, en una célula cancerosa del mamífero, un cambio de energía metabólica celular desde glucólisis a fosforilación oxidativa mitocondrial hacia niveles observados en una célula normal del mamífero en condiciones fisiológicas normales .
Tal como se usa en la presente, "glucólisis" incluye opcionalmente la biosíntesis de lactato asociada que produce lactato a partir de piruvato.
En algunas modalidades, el influenciador ambiental no provoca sustancialmente, en células no cancerosas del mamífero, el cambio de energía metabólica celular desde glucólisis a fosforilación oxidativa mitocondrial .
En algunas modalidades, el mamífero es humano mamífero no humano.
En algunas modalidades, el influenciador ambiental no es la Coenzima Q10 o los metabolitos o análogos de la misma (incluyendo análogos que no tienen repeticiones de isoprenilo o tienen al menos una) .
En algunas modalidades, el trastorno oncológico responde o es sensible al tratamiento con Coenzima Q10 o los metabolitos o análogos de la misma.
En algunas modalidades, el influenciador ambiental induce mecanismo de muerte celular o apoptosis en la célula cancerosa .
En algunas modalidades, el influenciador ambiental inhibe la angiogénesis en la célula cancerosa.
En algunas modalidades, el influenciador ambiental induce una modulación de los elementos relacionados con la inmunidad dentro del microambiente en la célula cancerosa.
En algunas modalidades, el influenciador ambiental induce un cambio en el control del ciclo celular en la célula cancerosa.
En algunas modalidades, el influenciador ambiental comprende: (a) benzoquinona o al menos una molécula que facilita la biosíntesis del anillo de benzoquinona y (b) al menos una molécula que facilita la síntesis y/o la unión de las unidades isoprenoides al anillo de benzoquinona.
En algunas modalidades, la al menos una molécula que facilita la biosíntesis del anillo de benzoquinona comprende: L-fenilalanina, DL-fenilalanina, D-fenilalanina, L-Tirosina, DL-Tirosina, D-Tirosina, 4-hidroxi-fenilpiruvato, 3-metoxi-4-hidroximandelato (vanililmandelato o VMA) , ácido vanílico, piridoxina o pantenol .
En algunas modalidades, la al menos una molécula que facilita la síntesis y/o la unión de las unidades isoprenoides al anillo de benzoquinona comprende: fenilacetato, 4-hidroxi-benzoato, ácido mevalónico, acetilglicina, acetil-CoA o farnesilo.
En algunas modalidades, el influenciador ambiental comprende: (a) uno o más L-fenilalanina, L-tirosina y 4-hidroxifenilpiruvato y (b) uno o más de 4-hidroxibenzoato, fenilácetato y benzoquinona .
En algunas modalidades, el influenciador ambiental: (a) inhibe la expresión de Bcl-2 y/o promueve la expresión de Caspasa-3 y/o (b) inhibe la proliferación celular.
En una modalidad, el influenciador amb. es una molécula intracelular multidimensional (MIM) . En algunas modalidades, la MIM se selecciona de: alfa cetoglutarato / alfa ácido cetoglutárico, Malato / ácido málico, Succinato / ácido succinico, Glucosamina, Adenosina, Difosfato de adenosina, Glucuronida / ácido glucurónico, ácido nicotinico, dinucleótido de ácido nicotinico, Alanina / Fenilálanina, Piridoxina, Tiamina o Flavin Adenina Dinucleótido. En una modalidad, la MIM se selecciona del grupo que consiste en acetil Co-A, palmitil Co-A, L-carnitina y aminoácidos (por ej . , tirosina, fenilálanina y cisteina) .
En una modalidad, el influenciador amb. es un cambiador epimetabólico (cambiador epi) . En algunas modalidades, el cambiador epimetabólico se selecciona de: Transaldolasa, Transcetolasa, Succinil CoA sintasa, Piruváto Carboxilasa o Riboflavina. En una modalidad, el cambiador epi se selecciona del grupo que consiste en vitamina D3 y componentes de ECM. En una modalidad, los componentes de ECM se seleccionan del grupo que consiste en fibronectina; inmunomoduladores (por ej . , TNFOÍ O cualquiera de las interleucinas, por ej . , IL-5, IL-12, IL-23) , factores angiogénicos y factores apoptóticos.
' En una modalidad, se trató una población de humanos y al menos 25% de la población tuvo un nivel de influenciador ambiental sistémico (por ej . , Coenzima Q10) que era terapéutico para el trastorno que se estaba tratando. En otras modalidades, se trató una población de humanos y al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de la población tuvo un nivel de influenciador ambiental sistémico (por ej . , Coenzima Q10) que era terapéutico para el trastorno que se estaba tratando. Se debería entender que se pretende que los intervalos que tienen cualquiera de estos valores como el límite superior o inferior también sean parte de esta invención, por ej . , 10% a 25%, 15% a 35%, 25% a 50%, 35% a 60%, 40% a 70%, 50% a 75%, 60% a 85% o 70% a 90%.
En una modalidad, se trató una población de humanos y al menos 25% de la población tuvo una disminución de síntomas según se midió mediante criterios de valoración reconocidos en la técnica incluyendo patología de tejidos, observaciones clínicas, análisis fotográficos, tomografía computada, generación de imágenes mediante MRI, marcadores de cáncer en sangre, suero o plasma.
I En una modalidad, se trató una población de humanos y al menos 50% de la población tuvo una disminución de síntomas según se midió mediante criterios de valoración reconocidos en la técnica incluyendo patología de tejidos, observaciones clínicas, análisis fotográficos, tomografía computada, generación de imágenes mediante MRI, marcadores de cáncer en sangre, suero o plasma.
En otras modalidades, se trató una población de humanos y al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más1 de la población tuvo una disminución de los síntomas según! se midió mediante criterios de valoración reconocidos en la técnica incluyendo patología de tejidos, observaciones clínicas, análisis fotográficos, tomografía computada, generación de imágenes mediante MRI, marcadores de cáncer en sangre, suero o plasma. Se debería entender que sé pretende que los intervalos que tienen cualquiera de estos valores como el límite superior o inferior también sean parte de esta invención, por ej . , 10% a 25%, 15% a 35%, 25% a 50%, 35% a 60%, 40% a 70%, 50% a 75%, 60% a 85% En diversas modalidades, la población de humanos tratados puede ser de alrededor de 3 pacientes, alrededor de 5 pacientes, alrededor de 10 pacientes , alrededor de 15 pacientes, alrededor de 20 pacientes, alrededor de 25 pacientes, alrededor de 30 pacientes, alrededor de 35 pacientes, alrededor de 40 pacientes, alrededor de 50 pacientes, alrededor de 60 pacientes, alrededor de 70 pacientes, alrededor de 80 pacientes, alrededor de 90 pacientes, alrededor de 100 pacientes , alrededor de 125 pacientes, alrededor de 150 pacientes , alrededor de 160 pacientes, alrededor de 175 pacientes , alrededor de 200 pacientes, alrededor de 250 pacientes, alrededor de 300 pacientes, alrededor de 400 pacientes o más . En una modalidad, la población de humanos tratados es [sic] Se debería entender que también se pretende que los intervalos que tienen cualquiera de estos valores como el límite superior o inferior sean parte de esta invención, por ej . , alrededor de 10 a alrededor de 25, alrededor de 15 a alrededor de 35, alrededor de 25 a alrededor de 50 o alrededor de 20 a alrededor de 160 pacientes.
Se entenderá que un experto en la técnica será capaz, tras la examinación de uno o más criterios de valoración reconocidos en la técnica, de reconocer a un paciente que tuvo . una disminución de síntomas con base en el conocimiento común en la técnica. Por ejemplo, un experto en la técnica será capaz de examinar y comparar las fotografías de una lesión por cáncer de piel, tal como carcinoma cutáneo de célula escamosa in situ, antes y después del tratamiento (por ej . , tal como las fotografías que se proporcionan en la presente en los Ejemplos) y podrá reconocer una disminución de síntomas con base en, por ejemplo, una disminución en el tamaño de la lesión, el color de la lesión o cualquier otra característica visual de la lesión que típicamente es indicativa de cáncer. En otro ejemplo, un experto en la técnica será capaz de examinar y comparar la patología del tejido de, por ej . , un cáncer de piel, antes y después del tratamiento y podrá reconocer una disminución de síntomas con base en un cambio en la patología del tejido que indique, por ej . , una disminución en la oncogenicidad o en la gravedad del cáncer. En otro ejemplo, un experto en la técnica será capaz de examinar y comparar una tomografía computada o una imagen de MRI de un tumor o sitios de lesiones metastásicas antes y después del tratamiento y podrá reconocer una disminución de los síntomas con base en, por ejemplo, una disminución en el tamaño de un tumor primario o una disminución en el tamaño o cantidad de lesiones metastásicas .
En una modalidad, la cantidad suficiente para tratar el trastorno oncológico en el humano regula por disminución el uso anaeróbico de glucosa (y/o la biosíntesis de lactato) y regula por aumento la fosforilación oxidativa mitocondrial .
En una modalidad, el trastorno oncológico que se está tratando no es un trastorno típicamente tratado mediante administración tópica, por ej . , cáncer de mama o próstata, con la expectativa de una administración sistémica de un agente activo a niveles terapéuticamente eficaces.
En una modalidad, la concentración del influenciador amb. en los tejidos del humano que se está tratando es diferente que la de un estándar de control de tejido humano representativo de un estado saludable o normal.
En una modalidad, la forma del influenciador amb. administrada al humano es diferente que la forma predominante encontrada en la circulación sistémica en el humanó .
En una modalidad, el tratamiento se produce mediante una interacción del influenciador amb. con un gen que se selecciona del grupo de genes enumerados en las Tablas 1-28 (por ej . , Tablas 2-4, 6-28; especialmente aquellos genes cuya regulación por aumento o por disminución se ha mostrado consistentemente en los mismos tipos celulares usando diferentes métodos de ensayo o aquellos genes cuya regulación por aumento o por disminución se ha mostrado consistentemente en diferentes tipos celulares, ya sea con el mismo método de ensayo o con uno diferente; preferentemente la magnitud de la regulación por aumento o disminución es idéntica o similar (por ej . , la cantidad máxima de aumentos o disminuciones es menor a 10%, 25%, 50%, '75%, 100%, 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces la cantidad mínima de aumentos o disminuciones) .
En una modalidad, el tratamiento se produce mediante una interacción del influenciador amb. con una proteína que se selecciona del grupo que consiste en HNF4-alfa, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-Lll (Bim) , XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, cMyc, transaldolasa 1, COQ1, COQ3, COQ6, i preniltransferasa, 4-hidrobenzoato, factor citosólico de neutrófilos 2, sintasa de óxido nítrico 2A, superóxido dismutasa 2, VDAC, canal Bax, ANT, Citocromo c, complejo 1, complejo II, complejo III, complejo IV, Foxo 3a, DJ-1, IDH-1, CptlC, Cam cinasa II y/o cualquiera de los genes enumerados en las Tablas 1-28 (por ej . , Tablas 2-4, 6-28) .
En una modalidad, el trastorno oncológico se selecciona del grupo que consiste en: una leucemia, un linfoma, un melanoma, un carcinoma y un sarcoma.
En una modalidad, el método comprende adicionalmente administrar un agente terapéutico o un régimen terapéutico adicionales.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno oncológico agresivo en un humano, que comprende la administración de un influenciador ambiental ( influenciador amb.) .al humano a una dosis seleccionada inferior a la de un régimen de dosificación usado o seleccionado para trastornos oncológicos menos agresivos o no agresivos, tratando o previniendo asi el trastorno oncológico agresivo.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno oncológico no agresivo en un humano, que comprende la administración de un influenciador ambiental (influenciador amb.) al humano a una dosis seleccionada mayor a la de un régimen de dosificación usado o seleccionado para trastornos oncológicos agresivos, tratando o previniendo asi el trastorno oncológico no agresivo.
En una modalidad, el trastorno oncológico se selecciona del grupo que consiste en: una leucemia, un linfoma, un melanoma, un carcinoma y un sarcoma.
En una modalidad, el trastorno oncológico agresivo se selecciona del grupo que consiste en carcinoma pancreático, carcinoma hepatocelular, sarcoma de Ewing, cáncer de mama metastásico, melanoma metastásico, cáncer de cerebro (astrócitoma, glioblastorna) , cáncer neuroendocrino, cáncer de colon, cáncer de pulmón, osteosarcoma, cáncer de próstata independiente de andrógenos, cáncer de ovario y linfoma no de Hodgkin.
En una modalidad, el trastorno oncológico no agresivo se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama no metastásico, cáncer de próstata dependiente de andrógenos, cáncer microcitico de pulmón y leucemia linfocítica aguda.
En una modalidad, el método comprende adicionalmente un régimen de tratamiento que se selecciona del grupo que consiste en cirugía, radiación, terapia hormonal, terapia con anticuerpos, terapia con factores de crecimiento, citocinas y quimioterapia.
En aun otro aspecto, la invención proporciona un método para bloquear (selectivamente), en una célula cancerosa de un mamífero que necesita tratamiento para un trastorno oncológico, el uso anaeróbico de glucosa (glucólisis) y aumentar la fosforilación oxidativa mitocondrial ; el método comprende: administrarle al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un influenciador amb. para bloquear selectivamente el uso anaeróbico de glucosa y aumentar la fosforilación oxidativa mitocondrial en la célula cancerosa del mamífero, hacia niveles observados en una célula normal del mamífero en condiciones fisiológicas normales.
En una modalidad, el método comprende adicionalmente (1) regular por aumento la expresión de uno o más genes que se seleccionan del grupo que consiste en los genes establecidos en las Tablas 1-28 (por ej . , 2-4 y 6-28) que tiene' un cambio múltiplo positivo y/o (2) regular por disminución la expresión de uno o más genes que se seleccionan del grupo que consiste en los genes establecidos en las Tablas 1-28 (por ej . , 2-4 y 6-28) que tiene un cambio múltiplo negativo.
En una modalidad, el método comprende adicionalmente modular la expresión de uno o más genes que se seleccionan del grupo que consiste en HNF4-alfa, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-Lll (Bim) , XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, cMyc, transaldolasa 1, COQ1, COQ3, C0Q6, preniltransferasa, 4-hidrobenzoato, factor citosólico de neutrófilos 2, sintasa de óxido nítrico 2A, superóxido dismutasa 2, VDAC, canal Bax, ANT, Citocromo c, complejo 1, complejo II, complejo III, complejo IV, Foxo 3a, DJ-1, IDH-1, CptlC y Cam cinasa II.
En una modalidad, el trastorno oncológico se selecciona del grupo que consiste en: una leucemia, un linfoma, un melanoma, un carcinoma y un sarcoma.
En una modalidad, el método comprende adicionalmente un régimen de tratamiento que se selecciona del grupo que consiste en cirugía, radiación, terapia hormonal, terapia de anticuerpo, terapia con factores de crecimiento, citocinas y quimioterapia.
En aun otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un influenciador ambiental eficaz para tratar, aliviar los síntomas , inhibir el avance o prevenir un trastorno oncológico en un mamífero; el método comprende: (1) obtener una muestra biológica enferma que comprende células cancerosas del trastorno oncológico y una muestra biológica normal que no comprende células cancerosas; (2) poner en contacto las muestras biológicas enferma y normal con un influenciador ambiental candidato; (3) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en las muestras biológicas enferma y normal, donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 1-28 (por ej . , Tablas 2-4 y 6-28) que tiene un cambio múltiplo positivo y/o que tiene un cambio múltiplo negativo; (4) comparar el nivel de expresión del o los marcadores en las muestras biológicas enferma y normal; donde un influenciador ambiental eficaz se identifica como el influenciador ambiental candidato que aumenta el nivel de expresión del o los marcadores que tiene un cambio múltiplo positivo y/o reduce el nivel de expresión del o los marcadores que tienen un cambio múltiplo negativo, en la muestra biológica enferma pero sustancialmente no en la muestra biológica normal.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método para tratar, aliviar síntomas, inhibir el avance o prevenir un trastorno oncológico en un mamífero; el método comprende: (1) obtener una muestra biológica enferma que comprende células cancerosas del trastorno oncológico y una muestra biológica normal que no comprende células cancerosas; (2) poner en contacto las muestras biológicas enferma y normal con un influenciador ambiental candidato; (3) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en las muestras biológicas enferma y normal, donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 1-28 que tienen un cambio múltiplo positivo y/o que tienen un cambio múltiplo negativo; (4) comparar el nivel de expresión del o los marcadores en las muestras biológicas enferma y normal; donde un influenciador ambiental eficaz se identifica como el influenciador ambiental candidato que aumenta el nivel de expresión del o los marcadores que tienen un cambio múltiplo positivo y/o reduce el nivel de expresión del o los marcadores que tienen un cambio múltiplo negativo, en la muestra biológica enferma pero sustancialmente no en la muestra biológica normal; (5) administrarle al mamífero el influenciador ambiental eficaz; tratando así el trastorno oncológico en el mamífero .
En aun otra modalidad relacionada, la invención proporciona un método para identificar un influenciador ambiental eficaz para tratar, aliviar los síntomas, inhibir el avance o prevenir un trastorno oncológico en un mamífiero; el método comprende: (1) obtener una muestra biológica enferma que comprende células cancerosas del trastorno oncológico y una muestra biológica normal que no comprende células cancerosas; (2) poner en contacto las muestras biológicas enferma y normal con un influenciador ambiental candidato; (3) determinar el nivel de glucolisis y fosforilación oxidativa mitocondrial en las muestras biológicas enferma y normal, antes y después de entrar en contacto con el influenciador ambiental candidato; donde un influenciador ambiental eficaz se identifica como el influenciador ambiental candidato que aumenta el nivel de fosforilación oxidativa mitocondrial y/o reduce el nivel de glucolisis en la muestra biológica enferma pero susta cialmente no en la muestra biológica normal.
En aun otra modalidad relacionada, la invención proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas, inhibir el avance o prevenir un trastorno oncológico en un mamífero; el método comprende: (1) obtener una muestra biológica enferma que comprende células cancerosas del trastorno oncológico y una muestra biológica normal que no comprende células cancerosas; (2) poner en contacto las muestras biológicas enferma y normal con un influenciador ambiental candidato; (3) determinar el nivel de glucólisis y fosforilación oxidativa mitocondrial en las muestras biológicas enferma y normal, antes y después de entrar en contacto con el influenciador ambiental candidato; donde un influenciador ambiental eficaz se identifica como el influenciador ambiental candidato que aumenta el nivel de fosforilación oxidativa mitocondrial y/o diminuye el nivel de glucólisis en la muestra biológica enferma pero sustancialmente no en la muestra biológica normal y (4) administrar al mamífero el influenciador ambiental eficaz, tratando así el trastorno oncológico en el mamífero.
En algunas modalidades, el nivel de glucólisis se mide como ECAR, y/o donde el nivel de fosforilación oxidativa mitocondrial se mide como OCR.
En una modalidad, el influenciador amb. no es la coenzima Q10.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar una molécula intracelular multidimensional (MIM) que comprende (a) poner en contacto una célula con una molécula endógena; (b) controlar el efecto de la molécula endógena en un perfil de microambiente celular y (c) identificar una molécula endógena que induce un cambio en el perfil de microambiente celular, identificando asi una MI .
En una modalidad, el método comprende además comparar los efectos de la molécula endógena sobre el perfil de microambiente celular de una célula enferma y una célula de referencia normal; identificar una molécula endógena que induce diferencialmente un cambio al perfil de microambiente celular de la célula enferma en comparación con la célula de referencia normal, identificando asi una MIM.
En una modalidad, el efecto sobre el perfil de microambiente celular se controla mediante la medición de un cambio en el nivel o la actividad de una molécula celular que se selecciona del grupo que consiste en ARNm, proteina, lipidos y metabolitos.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un cambiador epimetabólico (cambiador epi) , que comprende (a) comparar los perfiles moleculares para dos o más células o tejidos, donde los dos o más células o tejidos muestran estados de enfermedad diferenciales; (b) identificar una molécula del perfil molecular para el cual un cambio en el nivel tiene correlación con el estado de enfermedad; (c) introducir la molécula a una célula y (d) evaluar la capacidad de la molécula de cambiar el estado metabólico de una célula, donde una molécula capaz de cambiar el estado metabólico de una célula se identifica como un cambiador Epi .
En una modalidad, el perfil molecular se selecciona del grupo que consiste en un perfil de metabolitos, perfil de lipidos, perfil de proteínas o perfil de ARN.
En una modalidad, la molécula no afecta de forma negativa la salud o crecimiento de una célula normal.
En aun otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un agente que es eficaz para tratar un trastorno oncológico, que comprende: (1) proporcionar un influenciador ambiental candidato; (2) determinar la capacidad del influenciador ambiental candidato de cambiar el estado metabólico de una célula y (3) determinar si el influenciador ambiental candidato es eficaz en el tratamiento de trastornos oncológicos, donde el influenciador ambiental candidato capaz [sic] en el tratamiento del trastorno oncológico se identifica como el agente eficaz en el tratamiento del trastorno oncológico.
En una modalidad, el influenciador amb. se identifica como capaz de cambiar el estado metabólico de una célula mediante la medición de un cambio en uno o más de expresión de ARNm, expresión de proteina, niveles lipidíeos, niveles metabólicos, niveles de moléculas bioenergéticas, energía celular, función mitocondrial y cantidad mitocondrial .
En aun otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende un agente identificado de acuerdo con los métodos de la invención que anteceden.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas, inhibir el avance o prevenir un trastorno o estado que responde a la CoQlO en un mamífero; el método comprende: administrarle al mamífero que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende al menos un influenciador ambiental (influenciador amb.), donde el influenciador ambiental provoca selectivamente, en una célula enferma del mamífero, un cambio de energía metabólica celular hacia niveles de glucólisis y fosforilación oxidativa mitocondrial observados en una célula normal del mamífero en condiciones fisiológicas normales .
En algunas modalidades, el trastorno que responde a la CoQlO es un trastorno oncológico.
En los casos en que corresponda o que no esté específicamente desmentido, se considera que cualquiera de las modalidades descritas en la presente se puede combinar con cualquier otra modalidad o modalidades, aun si las modalidades se describen en diferente aspectos de la invención .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS: Figura 1: Sensibilidad de SK-MEL-28 a 24 horas de tratamiento con Q10 medida por la cantidad de células apoptóticas tempranas y tardías .
, Figura 2: Sensibilidad de SKBR3 a 24 horas de tratamiento con Q10 medida por la cantidad de células apoptóticas tempranas y tardías .
Figura 3: Sensibilidad de PaCa2 a 24 horas de tratamiento con Q10 medida por la cantidad de células apoptóticas tempranas y tardías .
Figura 4: Sensibilidad de PC-3 a 24 horas de tratamiento con Q10 medida por la cantidad de células apoptóticas tempranas y tardías .
Figura 5: Sensibilidad de HepG2 a 24 horas de tratamiento con Q10 medida por la cantidad de células apoptóticas tempranas y tardías.
Figura 6: Sensibilidad de MCF-7 a 24 horas de tratamiento con Q10 medida por la cantidad de células apoptóticas tempranas y tardías.
Figura 7: Medición de células apoptóticas tras 24 horas de tratamiento con Q10, según se mide por el método Apostrand ELISA.
Figura 8: Análisis de gel de ejemplo de electroforesis en gel 2-D. Se marcan las manchas extirpadas para su identificación.
Figura 9: Red de interacción entre proteínas identificadas por electroforesis en gel 2-D moduladas por Q10 en células SK-MEL-28.
Figura 10: La senda de fosfato de pentosa adaptada de Verhoeven et ál. (Am. J. Hum. Genet. 2001 68 (5) : 1086-1092 ) .
Figura 11: Gel 2-D del material enriquecido con mitocondrias de células SK-MEL-28. Se marcan las manchas extirpadas e identificadas mediante caracterización de espectrometría de masas.
Figura 12: Cuadro comparativo de las cantidades relativas de Q10 presentes en mitocondria de SK-MEL-28 luego de la adición exógena de 100 µ? de Q10 al medio de cultivo.
Figuras 13A y 13B: Procesos conocidos de mapeo de vía de apóptosis.
Figura 14: Análisis de transferencia Western de Bcl-xl.
Figura 15: Análisis de transferencia Western de un conjunto de muestra SK-MEL-28 probado con un anticuerpo de Vimentina.
Figura 16 : Análisis de transferencia Western de lisis celular a partir de una cantidad de líneas celulares, evaluadas con cinco anticuerpos que se dirigen a los complejos de fosforilación oxidativa (MitoSciences #MS601) .
Figura 17: Comparación de transferencia Western de niveles de Fl-alfa.
Figura 18: Comparación de transferencia Western de la respuesta a Q10 con C-Ill-Core 2. i Figura 19: Comparación de transferencia Western de respuesta a QIO con C-II-30.
Figura 20: Comparación de transferencia Western de respuesta a QIO con C-IV-COX II.
Figura 21: Comparación de transferencia Western de respuesta a QIO con C-I-20 (ND6) .
Figura 22: Análisis de transferencia Western de una variedad de tipos celulares en comparación con cinco proteínas mitocondriales .
Figura 23: Comparación de transferencia Western de respuesta a QIO con proteína C-V-a de Complejo V.
Figura 24: Comparación de transferencia Western de respuesta a QIO con C-III-Core 1.
Figura 25: Comparación de transferencia Western de respuesta a QIO con Porin (VDAC1) .
Figura 26: Comparación de transferencia Western de respuesta a QIO con Ciclofilina D.
Figura 27: Comparación de transferencia Western de respuesta a QIO con Citocromo C.
Figura 28: Modelo teórico de Q10 (esferas) insertado en el canal de unión lipidica de HNF4alfa (lM7W.pdb) en la conformación abierta Hélice 10.
Figura 29: Gráfica que ilustra la concentración de CoQlO epidérmica en un cerdo macho luego del tratamiento con una composición de la presente descripción que tiene un potenciador de penetración.
Figura 30: Gráfica que ilustra la concentración de CoQlO epidérmica en un cerdo hembra luego del tratamiento con una composición de control.
Figura 31: Ilustración fotográfica de una lesión diana pretratada 1.
Figura 32: Ilustración fotográfica de una lesión diana postratamiento 1.
Figura 33: Ilustración fotográfica de una lesión diana pretratada 2.
Figura 34: Ilustración fotográfica de una lesión diana postratamiento 2.
Figura 35: Ilustración fotográfica de una lesión diana pretratada 3.
Figura 36: Ilustración fotográfica de una lesión diana postratamiento 3.
Figura 37: OCR en células HDFa en varias afecciones de glucosa en condiciones normóxicas e hipóxicas .
Figura 38: OCR en células HASMC en varias afecciones de glucosa en condiciones normóxicas e hipóxicas.
Figura 39: Valores de OCR en células de cáncer de mama CF-7 en ausencia y presencia de 31510 y factores estresantes .
Figura 40: Valores de OCR en células de cáncer pancreático PaCa-2 en ausencia y presencia de 31510 y factores estresantes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN: I. Visión general y definiciones Tal como se usa en la presente, cada uno de los siguientes términos tiene el significado que se le asocia al mismo en esta sección.
Los artículos "un" y "una" se usan en la presente para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. ? modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento .
Los términos "que incluye" e "incluyendo" se usan en la presente con el significado "que incluye, a modo no taxativo" y se usan de forma intercambiable con esa frase.
El término "o" se usa en la presente para significar "y/o" y se usa de forma intercambiable con ese término, a menos que el contexto claramente indique otra cosa.
El término "tal como" se usa en la presente con el significado "tal como pero sin limitarse a" y se usa de forma intercambiable con esa frase.
Un "paciente" o "sujeto" a ser tratado por el método de la invención puede significar un animal humano o no humano, preferentemente un mamífero. Cabe destacar que las observaciones clínicas descritas en la presente se realizaron con sujetos humanos y, al menos en algunas modalidades, los sujetos son humanos.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de un compuesto que, cuando se administra a un paciente para tratar una enfermedad, es suficiente para lograr dicho tratamiento para la enfermedad. Cuando se administra para prevenir una enfermedad, la cantidad es suficiente para evitar o atrasar el inicio de la enfermedad. La "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo del compuesto, la enfermedad y su gravedad, la edad, el peso, etc. del paciente a ser tratado.
"Prevenir" o "prevención" se refiere a una reducción en el riesgo de contraer una enfermedad o trastorno (es decir, hacer que al menos uno de los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen en un paciente que puede estar expuesto o predispuesto a la enfermedad, pero que aún no ha experimentado o presentado síntomas de la enfermedad) .
El término tratamiento "profiláctico" o "terapéutico" se refiere a la administración al sujeto de una o más de las presentes composiciones. Si se administra antes de la manifestación clínica de la afección no deseada (por ej . , enfermedad u otro estado no deseado del animal hospedador) entonces el tratamiento es profiláctico, es decir, protege al hospedador de contraer la afección no deseada, mientras que si se administra luego de la manifestación de la afección no deseada, el tratamiento es terapéutico (es decir, pretende disminuir, mejorar o mantener la afección no deseada existente o los efectos laterales que surgen de la misma) .
El término "efecto terapéutico" se refiere a un efecto local o sistémico en animales, particularmente mamíferos y más particularmente humanos, causado por una sustancia farmacológicamente activa. Por lo tanto el término significa cualquier sustancia que se pretende para el uso en el diagnóstico, la cura, la mitigación, el tratamiento o la prevención de una enfermedad o en la mejora de afecciones y el desarrollo físico o mental deseables en un animal o humano. La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de tal sustancia que produce algún efecto local o sistémico deseado a una relación riesgo/beneficio razonable que se puede^ aplicar a cualquier tratamiento. En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto dependerá de su índice terapéutico, solubilidad y similares. Por ejemplo, algunos compuestos descubiertos mediante los métodos de la presente invención se pueden administrar en una cantidad suficiente para producir una relación riesgo/beneficio razonable que se puede aplicar a dichoi tratamiento.
"Paciente" significa cualquier animal (por ej . , un mamífero humano o no humano) que se puede someter al menos a una intervención médica (por ej . , tratamiento, pruebas diagnósticas/prognósticas, etc.) que incluye caballos, perros, gatos, chanchos, cabras, conejos, hámsters, monos, cobayos, ratas, ratones, lagartijas, víboras, ovejas, ganado, peces y aves.
"Vía metabólica" se refiere a una secuencia de reacciones mediadas por enzimas que transforman un compuesto en otro y proporcionan intermediarios y energía para las funciones celulares. La vía metabólica puede ser lineal o cíclica.
"Estado metabólico" se refiere al contenido molecular de un. ambiente celular, multicelular o de tejido particular en un punto dado en el tiempo según se mide mediante diversos indicadores químicos y biológicos que se relacionan con un estado de salud o enfermedad.
El término "micromatriz" se refiere a una matriz de diferentes polinucleótidos , oligonucleótidos , polipéptidos (por ej . , anticuerpos) o péptidos sintetizados en un sustrato, tal como papel, nailon u otro tipo de membrana, filtro, chip, lámina de vidrio o cualquier otro soporte sólido adecuado.
Los términos "trastornos" y "enfermedades" se usan de forma inclusiva y se refieren a cualquier desvío de la estructura o función normal de cualquier parte, órgano o sistema del cuerpo (o cualquier combinación de los mismos) . Una enfermedad especifica se manifiesta por síntomas y signos característicos, incluyendo cambios biológicos, químicos y físicos y generalmente se asocia con una variedad de otros factores que incluye, a modo no taxativo, factores demográficos, ambientales, de empleo, genéticos y médicamente históricos. Algunos signos, síntomas y factores relacionados característicos se pueden cuantificar mediante una variedad de métodos para proporcionar información importante de diagnóstico.
El término "expresión" se usa en la presente para hacer referencia al proceso por el cual un polipéptido es producido a partir de ADN . El proceso implica la transcripción del gen en ARNm y la traducción de este ARNm en un polipéptido. Dependiendo del contexto en el que se usa, "expresión" puede referirse a la producción de ARN, proteína o ambas .
Los términos "nivel de expresión de un gen" o "nivel de expresión génica" se refieren al nivel de ARNm, así como una o más transcripciones nacientes pre-ARNm, intermediarios de procesamiento de transcripciones, ARNm maduro/s y productos de degradación o el nivel de proteína codificado por el gen en la célula.
El término "modulación" se refiere a la regulación por aumento (es decir, activación o estimulación), regulación por disminución (es decir, inhibición o supresión) de una respuesta o ambos en combinación o separados. Un "modulador" es un compuesto o molécula que modula y puede ser, por ej . , un agonista, antagonista, activador, estimulador, supresor o inhibidor.
El término "intermediario de la vía de biosintesis de coenzima" tal como se usa en la presente, caracteriza aquellos compuestos que se formaron entre la conversión química/biológica de tirosina y Acetil-CoA en ubiquinona. Los intermediarios de la vía de biosintesis de coenzima incluyen 3-hexaprenil-4-hidroxibenzoato, 3-hexaprenil- , 5-dihidroxibenzoato, 3-hexaprenil-4-hidroxi-5-metoxibenzoato, 2-hexaprenil-6-metoxi-l , 4-benzoquinona, 2-hexaprenil-3-metil-6-metoxi-l, -benzoquinona, 2-hexaprenil-3-metil-5-hidroxi-6-metoxi-l, 4-benzoquinona, 3-Octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2-octaprenil-6-metoxifenol, 2-octaprenil-3-metil-6-metoxi-l, 4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil-5-hidroxi-6-metoxi-l, 4-benzoquinona, 2-decaprenil-3-metil-5-hidroxi-6-metoxi-l, 4-benzoquinona, 2-decaprenil-3-metil-6-metoxi-l, 4-benzoquinona, 2-decaprenil-6-metoxi-l, 4-benzoquinona, 2-decaprenil-6-metoxifenol, 3-decaprenil-4-hidroxi-5-metoxibenzoato, 3-decaprenil- , 5-dihidroxibenzoato, 3-decaprenil-4-hidroxibenzoato, 4-hidroxifenilpiruvato, 4- hidroxifenillactato, 4-hidroxi-benzoato, 4-hidroxicinamato y hexaprenidifosfato .
El término "Trolamina", tal como se usa en la presente, se refiere a Trolamina NF, Trietanolamina, TEAlan ®, TEAlan 99%, Trietanolamina, 99%, Trietanolamina, NF o Trietanolamina, 99%, NF. Estos términos se pueden usar de manera intercambiable en la presente.
En algunas modalidades, los compuestos de la presente invención, por ej . , las MIM o los cambiadores epi descritos en la presente, se pueden usar para tratar un estado que responde a la Coenzima Q10 en un sujeto que lo necesita. Las expresiones "estado que responde a la coenzima QIO" o "estado/enfermedad que responde a la CoQlO" incluyen enfermedades, trastornos, estados y/o afecciones que se pueden tratar, prevenir o de otra forma mejorar mediante la administración de Coenzima QIO. Sin pretender limitarse por ninguna teoría en particular y como se describe adicionalmente en la presente, se cree que la CoQlO funciona, al menos parcialmente, mediante la inducción de un cambio metabólico al microambiente celular, tal como un cambio hacia el tipo y/o nivel de fosforilación oxidativa en células de estado normal. Por consiguiente, en algunas modalidades, los estados que responden a la CoQlO son estados que surgen de un metabolismo alterado del microambiente celular. Los estados que responden a la coenzima Q10 incluyen, por ejemplo, trastornos oncológicos que, por ejemplo, pueden tender a la glucólisis y biosintesis de lactato. En algunas modalidades, los trastornos oncológicos que responden a la CoQlO incluyen cáncer del hígado, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de hígado o cáncer de huesos, carcinomas de células escamosas, carcinomas de células básales, melanomas y queratosis actínica, entre otros. Los estados que responden a la coenzima Q10 incluyen adicionalmente otros trastornos oncológicos tal como se describen en la presente.
Los estados que responden a la coenzima Q10 también incluyen, por ejemplo, trastornos metabólicos tales como obesidad, diabetes, pre-diabetes, síndrome metabólico, saciedad y anormalidades endocrinas. Los estados que responden a la coenzima Q10 también incluyen otros trastornos metabólicos como se describe en la presente.
En algunas modalidades, los compuestos de la presente invención, por ej . , las MIM o cambiadores epi descritos en la presente, comparten una actividad común con la coenzima Q10. Tal como se usa en la presente, la frase "comparten una actividad común con la coenzima Q10" se refiere a la capacidad de un compuesto de presentar al menos una porción de la misma actividad que la Coenzima Q10 o una actividad similar. En algunas modalidades, los compuestos de la presente invención presentan 25% o más de actividad de la coenzima Q10. En algunas modalidades, los compuestos de la presente invención presentan hasta e incluyendo alrededor de 130% de actividad de la coenzima Q10. En algunas modalidades, los compuestos de la presente invención presentan alrededor de 30%, 31%, 32*5/ 33%/ 34% 35%/ 36% 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48% 49%, 50%, 51%, 52%, 53% f 54%, 55%, 56%/ 57%/ 58%, 59%, 60% 61%, 62%, 63% , 64%, 65%, 66% , 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72% 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 85%/ 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98%, 99%, 100% , 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106% 107%, ' 108% , 109%, 110%, 111%, 112% , 113%, 114%, 115%, 116% 117%, : 118% , 119%, 120%, 121%, 122% , 123%, 124%, 125%, 126% 127%, 128%, 129% o 130% de la actividad de la coenzima Q10.
Se debe comprender que cada uno de los valores enumerados en este párrafo se puede modificar con el término "alrededor de". Además, se debe comprender que cualquier intervalo que se define por cualesquiera dos valores enumerados en este párrafo pretende estar abarcado por la presente invención. Por ejemplo, en algunas modalidades, los compuestos de la presente invención presentan entre alrededor de 50% y alrededor de 100% de la actividad de la coenzima Q10. En algunas modalidades, la actividad compartida por la coenzima Q10 y los compuestos de la presente invención es la capacidad de inducir un cambio en el metabolismo celular. En algunas modalidades, la actividad compartida por una CoQlO y los compuestos de la presente invención se mide por OCR (tasa de consumo de oxigeno) y/o ECAR (tasa de acidificación extracelular) .
Tal como se usa en el presente, "trastorno oncológico" se refiere a todos los tipos de cáncer o neoplasia o tumores malignos encontrados en humanos, incluyendo, a modo no taxativo: leucemias, linfornas, melanómas, carcinomas y sarcomas. Tal como se usa en la presente, los términos o expresiones "trastorno oncológico", "cáncer", "neoplasia" y "tumor" se usan de manera intercambiable y en forma singular o plural, se refieren a células que han experimentado una transformación maligna que las hace patológicos para el organismo hospedador. En algunas modalidades, el trastorno oncológico es un, estado que responde a la coenzima Q10.
En algunas modalidades, el trastorno oncológico o cáncer se caracteriza por una falta de apoptosis. En otras modalidades, el trastorno oncológico o cáncer se caracteriza por una mayor angiogénesis . En otras modalidades, el trastorno oncológico o cáncer se caracteriza por una degradación de matriz extracelular (ECM).' En aun otras modalidades, el trastorno oncológico o cáncer se caracteriza por una pérdida del control del ciclo celular. En aun otras modalidades, el trastorno oncológico o cáncer se caracteriza por un cambio en la gestión metabólica de fosforilación oxidativa mitocondrial a mayor uso y/o dependencia de lactato y flujo glucolitico. En modalidades adicionales, el trastorno oncológico o cáncer se caracteriza por mecanismos inmunomoduladores adaptados que evadieron la inmunovigilancia . En una modalidad, el trastorno oncológico o cáncer se caracteriza por al menos dos de las características anteriores, por ej . , mayor angiogénesis y degradación de ECM. En una modalidad, el trastorno oncológico o cáncer se caracteriza por al menos tres de las características anteriores. En una modalidad, el trastorno oncológico o cáncer se caracteriza por al menos cuatro de las características anteriores. En una modalidad, el trastorno oncológico o cáncer se caracteriza por al menos cinco de las características anteriores. En una modalidad, el trastorno oncológico o cáncer se caracteriza por las seis características anteriores.
Por consiguiente, en algunas modalidades, los compuestos de la presente invención funcionan mediante la restauración de la capacidad de apoptosis o de inducir apoptosis. En otras modalidades, los compuestos de la presente invención funcionan mediante la reducción, disminución o inhibición de la angiogénesis. En aun otras modalidades, los compuestos de la presente invención funcionan mediante la restauración o el reestablecimiento de la matriz extracelular . En otras modalidades, los compuestos de la presente invención funcionan mediante la restauración del control del ciclo celular. En aun otras modalidades, los compuestos de la presente invención funcionan mediante el cambio de la gestión metabolica desde la glucólisis a la fosforilación oxidativa mitocondrial . En modalidades adicionales, los compuestos de la presente invención funcionan mediante la restauración de la inmunovigilancia o la restauración de la capacidad del cuerpo de reconocer la célula cancerosa como extraña.
Sin pretender limitarse por ninguna teoría en particular, se cree que típicamente hay una cascada coordinada de eventos que se juntan y se convierten en un cáncer. Es decir, en algunas modalidades, el cáncer no depende únicamente de una causalidad de raíz 1-gen-l-proteína. En algunas modalidades, cáncer es un estado de enfermedad fisiológica que se manifiesta en cambios y alteraciones en los tejidos que se convierten en tumores, estados de tejido alterados, por ej . , energéticos, integridad de matriz extracelular comprometida que permite el potencial metastásico, la falta de inmunovigilancia y/o el estado alterado de la angiogénesis .
Las células cancerosas primarias (es decir, células obtenidas cerca del sitio de transformación maligna) se pueden distinguir fácilmente de las células no cancerosas mediante técnicas bien establecidas, particularmente examinación histológica. La definición de una célula cancerosa, tal como se usa en la presente, incluye no solo una célula cancerosa primaria sino también células madre cancerosas, asi como células progenitoras cancerosas o cualquier célula derivada de una célula cancerosa predecesora. Esto incluye células cancerosas con metástasis y cultivos in vitro y lineas celulares derivadas de células cancerosas. Cuando se hace referencia a un tipo de cáncer que normalmente se manifiesta como un tumor sólido, un tumor "clínicamente detectable" es uno que es detectable con base en la masa tumoral; por ej . , mediante procedimientos tales como tomografía, imagenología por resonancia magnética, rayos X, ultrasonido o palpación, y/o que es detectable debido a la expresión de uno o más antígenos específicos para el cáncer en una muestra que se obtiene de un paciente.
Tal como se usa en la presente, "cambio múltiplo positivo" se refiere a "regulación por aumento" o "aumento (de expresión) " de un gen que se lista en las tablas relevantes .
Tal como se usa en la presente, "cambio múltiplo negativo" se refiere a la "regulación por disminución" o "disminución (de expresión) " de un gen que se lista en las tablas relevantes .
En algunas modalidades, en los casos en que un gen particular listado esté asociado con más de una condición de tratamiento, tal como diferentes periodos de tiempo luego, de un tratamiento o tratamiento mediante diferentes concentraciones de un influenciador ambiental potencial (por e . , CoQlO), el cambio múltiplo paira ese gen particular se refiere al tiempo de tratamiento más prolongado registrado. En otras modalidades, el cambio múltiplo para ese gen particular se refiere al tiempo de tratamiento más breve registrado. En otras modalidades, el cambio múltiplo para ese gen particular se refiere al tratamiento mediante la concentración más alta del influenciador amb. (por ej . CoQlO) . En otras modalidades, el cambio múltiplo para ese gen particular se refiere al tratamiento mediante la concentración más baja de influenciador amb. (por ej . CoQlO). En aun otras modalidades, el cambio múltiplo para ese gen particular se refiere a la modulación (por ej . , regulación por aumento o disminución) en una forma que es consistente con el efecto terapéutico del influenciador amb.
En algunas modalidades, el cambio múltiplo positivo o negativo se refiere al de cualquier gen listado en cualquiera de las Tablas 1-28 (por ej . , 2-4 y 6-28) . En algunas modalidades, el cambio múltiplo positivo o negativo se refiere al de cualquier gen listado en cualquiera de las Tablas 1-28 (por ej . , 2-4 y 6-28), con la excepción de una de las tablas (por ej . , excepto por la Tabla 1, excepto por la Tabla 5, etc.)- En algunas modalidades, el cambio múltiplo positivo o negativo se refiere al de cualquier gen listado en cualquiera de las Tablas 1-28 (por ej . , 2-4 y 6-28) , con la excepción de cualesquiera dos de las tablas (por ej . , excepto por las Tablas 1 y 5, excepto por la Tabla 2 y 16, etc.)- E algunas modalidades, el cambio múltiplo positivo o negativo se refiere al de cualquier gen listado en cualquiera de las Tablas 1-28 (por ej . , 2-4 y 6-28) , con la excepción de cualesquiera tres de las tablas o con la excepción de cualesquiera cuatro de las tablas o con la excepción de cualesquiera 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de las tablas. En algunas modalidades, el cambio múltiplo positivo o negativo se refiere al de cualquier gen listado en cualquiera de las Tablas 1-28 (por ej . , 2-4 y 6-28), excepto por las tablas 1, 5, 9 y 12.
A continuación se hará referencia en detalle a las modalidades preferidas de la invención. Si bien la invención se describirá junto con las modalidades preferidas, se entenderá que no se pretende que la invención quede limitada a esas modalidades preferidas. Por el contrario, se pretende cubrir las alternativas, modificaciones y equivalentes que se puedan incluir dentro del espíritu y alcance de la invención según se define por las reivindicaciones adjuntas.
II. Influenciadores ambientales La presente invención proporciona métodos para tratar trastornos oncológicos mediante la administración de un influenciador ambiental. Los "influenciadores ambientales" (influenciadores amb.) son moléculas que influyen o modulan el ambiente de la enfermedad de un mamífero humano o no humano en una forma beneficiosa permitiendo que el ambiente de la enfermedad del humano (o el mamífero no humano) cambie, vuelva a o mantenga un ambiente normal o saludable que lleve a un estado normal. Los influenciadores amb. incluyen moléculas intracelulares multidimensionales (MI ) y cambiadores epimetabólicos (cambiadores epi) como se define a continuación.
; En algunas modalidades, las MIM y los cambiadores epi descritos en la presente excluyen los que se usan convencionalmente como complementos alimenticios. En algunas modalidades, estas MIM y/o cambiadores Epi que se describen en la presente son de grado farmacéutico. En algunas modalidades, las MIM y/o el cambiador Epi de grado farmacéutico tienen una pureza entre alrededor de 95% y alrededor de 100% e incluye todos los valores entre 95% y 100%. En algunas modalidades, la pureza de las MIM y/o el cambiador Epi es de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 99.9 o 100%. En algunas modalidades, las MIM y/o el cambiador Epi están libres o sustancialmente libres de endotoxinas . En otras modalidades, las MIM y/o el cambiador Epi están libres o sustancialmente libres de materiales de proteina extraños. En algunas modalidades, las MIM y/o el cambiador Epi es CoQlO. 1. Molécula intracelular multidimensional (MIM) > El término "molécula intracelular multidimensional (MIM)" es una versión aislada o una versión sintéticamente producida de una molécula endógena que es producida naturalmente por el cuerpo y/o está presente en al menos una célula de un humano. Una MIM se caracteriza por uno o más, dos o más, tres o más o todas las siguientes funciones. Las MIM son capaces de ingresar a una célula y el ingreso a la célula incluye el ingreso completo o parcial a la célula, siempre que la porción biológicamente activa de la molécula ingrese completamente a la célula. Las MIM son capaces de inducir una transducción de señal y/o un mecanismo de expresión génica dentro de una célula. Las MIM son multidimensionales en el sentido de que las moléculas tienen un efecto terapéutico y portador, es decir, de administración de fármaco. Las MIM también son multidimensionales en el sentido de que las moléculas actúan de una forma en un estado de enfermedad y de una formad diferente en un estado normal. Por ejemplo, en el caso de CoQ-10, la administración de CoQ-10 a una célula de melanoma en presencia de VEGF lleva a un menor nivel de Bcl2 que, a su vez, lleva a un menor potencial oncogénico para la célula del melanoma. Por el contrario, en un fibroblasto normal, la coadministración de CoQ-10 y VEFG no tiene efecto en los niveles de Bcl2. Preferentemente, las MIM actúan selectivamente en células de un estado de enfermedad y sustancialmente no tienen efecto en células (emparejadas) de un estado normal. Preferentemente, las MIM selectivamente vuelven a las células de un estado de enfermedad más similares desde el punto de vista de fenotipo, estado metabólico, genotipo, nivel de expresión de ARNm/proteína, etc. a las células (emparejadas) de un estado normal.
En una modalidad, una MIM también es un cambiador epi . En otra modalidad, una MIM no es un cambiador epi . El experto en la técnica comprenderá que se pretende que una MIM de la invención también abarque una mezcla de dos o más moléculas endógenas, donde la mezcla se caracteriza por una o más de las funciones anteriores. Las moléculas endógenas en la mezcla están presentes en una proporción tal que la mezcla funciona como una MIM.
Las MIM pueden ser moléculas basadas en lipidos o no basadas en lipidos. Los ejemplos de MIM incluyen, a modo no taxativo, CoQlO, acetil Co-A, palmitil Co-A, L-carnitina, aminoácidos como, por ejemplo, tirosina, fenilalanina y cisteina. En una modalidad, la MIM es una molécula pequeña. En una modalidad de la invención, la MIM no es CoQlO. Las MIM se pueden identificar de forma rutinaria por un experto en la, técnica usando cualquiera de los ensayos descritos en detalle en la presente.
En algunas modalidades, las MIM incluyen compuestos en la familia de la Vitamina B o nucleósidos, mononücleótidos o dinucleótidos que comprenden un compuesto en la familia de la Vitamina B. Los compuestos en la familia de la vitamina B incluyen, por ejemplo, tiamina (vitamina Bl) , niacina (también conocida como ácido nicotínico o vitamina B3) o piridoxina (vitamina B6) asi como iprovitaminas tales como pantenol (provitamina B5) . En algunas modalidades, la MIM se selecciona a partir de tiamina, niacina y piridoxina. Los nucleósidos, mononücleótidos o dinucleótidos que comprenden un compuesto en la familia de la vitamina B incluyen, por ejemplo, nucleósidos, mononücleótidos o dinucleótidos que incluyen una molécula de adenina o niacina (ácido nicotínico) . En algun'as modalidades, la MIM se selecciona de adenosina, difosfato de adenosina (ADP) , dinucleótido de flavina adenina (FAD, que comprende partes de vitamina B2 y ADP) y dinucleótido de ácido nicotínico.
, En otras modalidades, las MIM incluyen aminoácidos. Los ejemplos de aminoácidos incluyen, por ejemplo, tirosina (por ej . , L-tirosina) , cisteina, fenilalanina (por ej . , L-fenilalanina) y alanina. En algunas modalidades, el aminoácido es fenilalanina o alanina. En algunas modalidades, las MIM incluyen derivados de aminoácidos tales como 4-hidroxifenilpiruvato o acetilglicina. i En algunas modalidades, la MIM es un análogo de glucosa, por ej . , una molécula de glucosa donde un sustituyente -OH o -CH2OH ha sido remplazado con un sustituyente -COOH, -COO~ o -N¾. Los ejemplos de análogos de glucosa incluyen glucosamina, ácido glucurónico, glucuronida y glucuronato.
. En algunas modalidades, la MIM se selecciona a partir de compuestos de fórmula (I) : donde n es un entero de 0 o 1; R1, R2, R3 y R4, cuando están presentes, se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno e hidroxilo o R1 y R2 se toman juntos con el carbono en el que están unidos para formar un grupo carbonilo (C=0) ; W es -COOH o -N(CH3)3+y , X es hidrógeno, una carga negativa o un catión de metal alcalino, tal como Na+ o. [sic] Se debe entender que cuando n es 0, el grupo CHR3 está unido al sustituyente W.
En algunas modalidades, W es -?( (¾ ) 3+ . En algunas modalidades, la I es una carnitina, tal como L-carnitina.
En algunas modalidades, la MIM es un ácido dicarboxilico . En algunas modalidades, W es -COOH. En algunas modalidades, R3 es hidrógeno. En algunas modalidades, n es 0. En algunas modalidades, cada R1 y R2 es independientemente hidrógeno. En algunas modalidades, W es -COOH, R3 es hidrógeno, n es 0 y cada R1 y R2 es independientemente hidrógeno. En algunas modalidades, n es 1. En algunas modalidades, R1 y R2 se toman juntos con el carbono en el que están unidos para formar un grupo carbonilo (C=0) . En algunas modalidades, R4 es hidrógeno. En algunas modalidades, R4 es hidroxilo. En algunas modalidades, W es -COOH, R3 es hidrógeno, n es 1 y R1 y R2 se toman juntos con el carbono en el que están unidos para formar un grupo carbonilo (C=0) .
En algunas modalidades, la MIM es un intermediario del ciclo de Kreb, cuyo exceso lleva al ciclo de Kreb hacia la fosforilación oxidativa productiva. Los ejemplos de intermediarios del ciclo de Kreb que son MIM incluyen ácido succinico o succinato, ácido málico o malato y ácido a-cetoglutárico o -cetoglutarato .
En algunas modalidades, la MIM es un componente básico de CoQlO, que tiene la siguiente estructura: Por lo tanto, los componentes básicos de CoQlO incluyen, a modo no taxativo, fenilalanina, tirosina, 4-hidroxifenilpiruvato, fenilacetato, 3-metoxi-4-hidroximandelato, ácido vanílico, 4-hidroxibenzoato, ácido mevalónico, farnesilo, 2 , 3-dimetoxi-5-metil-p-benzoquinona , así como los ácidos o iones correspondientes de los mismos. En algunas modalidades, la MIM se selecciona de fenilalanina, tirosina, 4-hidroxifenilpiruvato, fenilacetato y 4-hidroxibenzoato.
Métodos para identificar MIM La presente invención proporciona métodos para identificar una I . Los métodos para identificar una MI implican, generalmente, la adición exógena de una molécula endógena a una célula y la evaluación del efecto sobre la célula, por ej . , el perfil microambiental celular que proporciona la molécula endógena. Los efectos en la célula se evalúan en uno o más de los niveles celular, de ARNm, de proteina, de lipidos y/o de metabolitos para identificar alteraciones en el perfil de microambiente celular. En una modalidad, las células son células cultivadas, por ej . , in vitro. En una modalidad, las células están presentes en un organismo. La molécula endógena se puede agregar a la célula a una única concentración o se puede agregar a la célula en un intervalo de concentraciones. En una modalidad, la molécula endógena se agrega a las células de forma tal que el nivel de molécula endógena en las células se eleva (por ej . , se eleva en 1.1 vez, 1.2 veces, 1.3 veces, 1.4 veces, 1.5 veces, 1.6 veces, 1.7 veces, 1.8 veces, 1.9 veces, 2.0 veces, 3.0 veces, 4.0 veces, 5.0 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces, 40 veces, 45 veces, 50 veces o más) en comparación con el nivel de molécula endógena en una célula no tratada de control.
Las moléculas que inducen un cambio en la célula según se detectan por alteraciones en, por ejemplo, uno cualquiera o más de morfología, fisiología y/o composición (por ej . , ARNm, proteina, lipido, metabolito) se pueden evaluar adicionalmente para determinar si los cambios inducidos en el perfil de microambiente . celular son diferentes entre un estado celular de enfermedad y un estado celular normal. Las células (por ej . , lineas de cultivos celulares) de variado origen de tejido, tipo celular o estado de enfermedad se pueden evaluar para lograr una evaluación comparativa. Por ejemplo, los cambios inducidos en el perfil de microambiente celular de una célula cancerosa se pueden comparar con cambios inducidos a una célula no cancerosa o célula normal. Una molécula endógena que se observa que induce un cambio en el perfil microambiental de una célula (por ej . , induce un cambio en la morfología, fisiología y/o composición, por ej . , ARNm, proteína, lipido o metabolito de la célula) y/o que induce de forma diferencial (por ej . , preferentemente) un cambio en el perfil microambiental de una célula enferma en comparación con una célula normal, se identifica como una MIM. 1 Las MIM de la invención pueden ser MIM basadas en lípidos o MIM no basadas en lípidos . Los métodos para identificar MIM basadas en lípidos implican . los métodos basados en células antes descritos en los que la molécula endógena basada en lípidos se agrega de forma exógena a la célula. En una modalidad preferida, la molécula endógena basada en lípidos se agrega a la célula de forma tal que el nivel de la molécula endógena basada en lipidos en la célula se eleve. En una modalidad, el nivel de la molécula endógena basada en lipidos se eleva en 1.1 vez, 1.2 veces, 1.3 veces, 1.4 veces, 1.5 veces, 1.6 veces, 1.7 veces, 1.8 veces, 1.9 veces, 2.0 veces, 3.0 veces, 4.0 veces, 5.0 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces» 40 veces, 45 veces, 50 veces o más, en comparación con él nivel en una célula no tratada de control. La formulación y administración de la molécula basada en lipidos a la célula depende de las propiedades de cada molécula probada, pero en la técnica se conocen muchos métodos. Los ejemplos de formulación y administración de moléculas basadas en lipidos incluyen, a modo no taxativo, solubilización mediante cosolventes, moléculas portadoras, liposomas, dispersiones, suspensiones, dispersiones de nanoparticulas, emulsiones, por ej . , emulsiones de aceite en agua o agua en aceite, emulsiones multifase, por ej . , emulsiones de aceite en agua en aceite, atrapamiento y encapsulamiento de polímero. La administración de la MIM basada en lipidos a la célula se puede confirmar mediante la extracción de los lipidos celulares y la cuantificación de la MIM mediante métodos de rutina conocidos en la técnica, tal como espectrometría de masas.
Los métodos para identificar las MIM no basadas en lipidos implican los métodos basados en células descritos anteriormente donde una molécula endógena no basada en lipidos se agrega de forma exógena a la célula. En una modalidad preferida, la molécula endógena no basada en lipidos se agrega a la célula de forma tal que el nivel de la molécula endógena no basada en lipidos en la célula se eleveL En una modalidad, el nivel de la molécula endógena no basada en lipidos se eleva en 1.1 vez, 1.2 veces, 1.3 veces, 1.4 veces, 1.5 veces, 1.6 veces, 1.7 veces, 1.8 veces> 1.9 veces, 2.0 veces, 3.0 veces, 4.0 veces, 5.0 veces 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces, 40 veces, 45 veces, 50 veces o más, en comparación con el nivel en una célula no tratada de control. La formulación y administración de la molécula no basada en lipidos a la célula depende de las propiedades de cada molécula probada, pero en la técnica se conocen muchos métodos. Los ejemplos de formulaciones y modos de administración de moléculas no basadas en lipidos incluyen, a modo no taxativo, solubilización mediante cosolventes, moléculas portadoras, transporte activo, atrapamiento o adsorción de polímero, injerto de polímero, encapsulamiento liposomal y formulación con sistemas de administración dirigidos. La administración de la MIM no basada en lipidos a la célula se puede confirmar mediante la extracción del contenido celular y la cuantificación de la MIM por métodos de rutina conocidos en la técnica, tal como espectrometría de masas . 2. Cambiadores Epimetabolicos (cambiadores Epi) Tal como se usa en la presente un "cambiador epimetabólico" (cambiador epi) es una molécula (endógena o exógena) que modula el cambio metabólico desde un estado saludable (o normal) a un estado de enfermedad o viceversa, manteniendo o restableciendo asi la salud celular, del tejido, del órgano, sistema y/o hospedador en un humano. Los cambiadores epi son capaces de lograr la normalización en un microambiente de tejido. Por ejemplo, un cambiador epi incluye cualquier molécula que es capaz, cuando se la agrega o se quita de una célula, de afectar el microambiente (por ej . , el estado metabólico) de una célula. El experto en la técnica comprenderá que se pretende que un cambiador epi de la invención también abarque una mezcla de dos o más moléculas, donde la mezcla se caracteriza por una o más de las funciones anteriores. Las moléculas en la mezcla están presentes en una proporción tal que la mezcla funciona como un cambiador epi. Los ejemplos de cambiadores epi incluyen, a modo no taxativo, coQ-10; vitamina D3; componentes de ECM como fibronectina; inmunomoduladores, como TNFa o cualquiera de las interleucinas , por ej . , IL-5, IL-12, IL-23; factores angiogénicos y factores apoptóticos. 1 En algunas modalidades, el cambiador epi es una enzima, como una enzima que participa directamente en la catalización de una o más reacciones en el ciclo de Kreb o produce un intermediario del ciclo de Kreb, cuyo exceso impulsa el ciclo de Kreb. En algunas modalidades, la enzima es una enzima de la fase no oxidativa de la senda de fosfato pentosa, tal como transaldolasa o transcetolasa . En otras modalidades, la enzima es una enzima componente o un complejo de enzima que facilita el ciclo de Kreb, tal como una sintasa o una ligasa. Los ejemplos de enzimas incluyen succinil CoA sintasa (enzima del ciclo de Kreb) o piruvato carboxilasa (una ligasa que cataliza la carboxilación reversible de piruvato para formar oxaloacetato (OAA) , un intermediario del ciclo de Kreb) .
En algunas modalidades, el cambiador epi es un componente básico de la CoQlO. Los componentes básicos de la CoQlO incluyen, a modo no taxativo, fenilalanina, tirosina, 4-hidroxifenilpiruvato, fenilacetato, 3-metoxi-4-hidroximandelato, ácido vanílico, 4-hidroxibenzoato, ácido mevalónico, farnesilo, 2 , 3-dimetoxi-5-metil-p-benzoquinona, así como los ácidos o iones correspondientes de los mismos. En algunas modalidades, el cambiador epi se selecciona de fenilalanina, tirosina, 4-hidroxifenilpiruvato, fenilacetato y 4-hidroxibenzoato.
' En algunas modalidades, el cambiador epi es un compuesto en la familia de la vitamina B. Los compuestos en la familia de la vitamina B incluyen, por ejemplo, riboflavina (vitamina B2) o análogos de la misma. Los cambiadores epi también incluyen cualquier análogo o profármaco que se pueda metabolizar in vivo en cualquiera de las MIM endógenas, tal como las descritas en la presente.
En una modalidad, el cambiador epi también es una MIM. En una modalidad, el cambiador epi no es CoQlO. Los cambiadores epi se pueden identificar de forma rutinaria por un experto en la técnica usando cualquiera de los ensayos descritos en detalle en la presente. (i) Métodos para identificar cambiadores epi Los cambiadores epimetabólicos (cambiador epi) son moléculas capaces de modular el estado metabólico de una célula, por ej . , inducir un cambio metabólico de un estado saludable (o normal) a un estado de enfermedad y viceversa y por lo tanto son capaces de mantener o restablecer la salud, celular, del tejido, del órgano, sistema y/o hospedador en un humano. Los cambiadores epi de la invención por lo tanto tienen utilidad en la evaluación diagnóstica de un estado de enfermedad. Los cambiadores epi de la invención tienen utilidad adicional en las aplicaciones terapéuticas, donde la aplicación o administración del cambiador epi (o modulación del cambiador epi mediante otras moléculas terapéuticas) logran una normalización en un microambiente de tejido y el estado de enfermedad.
La identificación de un cambiador epimetabólico implica, generalmente, establecer un perfil molecular, por ej . , de metabolitos, lipidos, proteínas o ARN (como perfiles individuales o en combinación) para un panel de células o tejidos que presenten estados de enfermedad diferenciales, evolución o agresividad. Una molécula del o los perfiles para los cuales un cambio en el nivel (por ej . , un mayor o menor nivel) tiene correlación con el estado, el avance o la agresividad de la enfermedad, se identifica como un potencial cambiador epi.
En una modalidad, un cambiador epi también es una MIM. Los cambiadores epi potenciales se pueden evaluar para determinar su capacidad de ingresar a células tras la adición exógena a una célula usando cualquiera de una cantidad de métodos de rutina conocidos en la técnica y mediante el uso de cualquiera de los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, el ingreso del cambiador epi potencial a la célula se puede confirmar mediante la extracción del contenido celular y la cuantificación del cambiador epi potencial mediante métodos de rutina conocidos en la técnica, tal como espectrometría de masas. Un cambiador epi potencial que es capaz de ingresar a una célula se identifica de ese modo como una MIM.
Para identificar un cambiador epi, un cambiador epi potencial se evalúa luego para determinar la capacidad de cambiar el estado metabólico de una célula. La capacidad de un cambiador epi potencial de cambiar un estado metabólico del microambiente celular se evalúa mediante la introducción (por ej . , adición exógena) a una célula de un cambiador epi potencial y el control en la célula de uno o más dé: cambios en la expresión génica (por ej . , cambios en expresión del ARNm o la proteina) , cambios de concentración en niveles de lipidos o de metabolitos, cambios en los niveles de molécula bioenergética, cambios en la energía celular y/o cambios en la función o cantidad de mitocondrias . Los cambiadores epi potenciales capaces de cambiar el estado metabólico del microambiente celular se pueden identificar de manera rutinaria por un experto en la técnica usando cualguiera de los ensayos descritos en detalle en la presente. Los cambiadores epi potenciales se evalúan adicionalmente para determinar la capacidad de cambiar el estado metabólico de una célula enferma hacia un estado saludable normal (o de lo contrario, la capacidad de cambiar el estado metabólico de una célula normal a un estado de enfermedad) . Un cambiador epi potencial capaz de cambiar el estado metabólico de una célula enferma a un estado saludable normal (o de cambiar el estado metabólico de una célula normal saludable a un estado de enfermedad) se identifica entonces como un cambiador epi. En una modalidad preferida, el cambiador epi no afecta de forma negativa la salud y/o el crecimiento de células normales .
. Los cambiadores epimetabólicos de la invención incluyen, a modo no taxativo, metabolitos de molécula pequeña, moléculas basadas en lipidos y proteínas y ARN. Para identificar un cambiador epimetabólico en la clase de metabolitos endógenos de molécula pequeña, se establecen perfiles metabólicos para un panel de células o tejidos que presentan estados de enfermedad diferenciales, evolución o agresividad. El perfil de metabolitos para cada célula o tejido se determina mediante la extracción de metabolitos de la célula o tejido y la posterior identificación y cuantificación de los metabolitos usando métodos de rutina conocidos por el experto en la técnica incluyendo, por ejemplo, métodos de espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida o espectrometría de masas acoplada a cromatografía de gas. Los metabolitos para los cuales un cambio en el nivel (por ej . , un mayor o menor nivel) tiene correlación con el estado, el avance o la agresividad de la enfermedad, se identifican como potenciales cambiadores epi .
Para identificar cambiadores epimetabólicos en la clase de moléculas endógenas basadas en lipidos, se establecen perfiles de lipidos para un panel de células o tejidos que presentan estados, avance o agresividad de enfermedad diferenciales. El perfil de lipidos para cada célula o tejido se determina mediante el uso de métodos de extracción de lipidos seguido por la identificación y cuantificación de los lipidos usando métodos de rutina conocidos por el experto en la técnica incluyendo, por ejemplo, métodos de espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida o espectrometría de masas acoplada a cromatografía de gas. Los lipidos para los cuales un cambio en el' nivel (por ej . , un aumento o disminución en el nivel de masa o de traza) se correlaciona con el estado, avance o agresividad de la enfermedad, se identifican como potenciales cambiadores epi.
Para identificar cambiadores epimetabólicos en la clase de proteínas y ARN, se establecen perfiles de expresión génica para un panel de células o tejidos que presentan estados, avance o agresividad de enfermedad diferenciales. El perfil de expresión para cada célula o tejido se determina a nivel del ARNm y/o la proteína mediante el uso de métodos estándar de matriz de ARNm proteómico, o de matriz genómica, por ej . , como se describen en detalle en la presente. Los genes para los cuales un cambio en la expresión (por ej . , un aumento o disminución en la expresión a nivel del ARNm o la proteína) tiene 1 correlación con el estado, el avance o la agresividad de la enfermedad, se identifican como potenciales cambiadores epi.
: Una vez que se establecen los perfiles moleculares descritos anteriormente (por ej . , para metabolitos solubles, moléculas basadas en lípidos, proteínas, ARN u otras clases biológicas de composiciones), se realiza el análisis de vía celular y bioquímica para elucidar los enlaces conocidos entre los cambiadores epi potenciales identificados en el ambiente celular. Esta información obtenida mediante tal análisis de vías celulares y/o bioquímicas se puede utilizar para separar en categorías las vías y los cambiadores epi potenciales.
Un experto en la técnica puede evaluar y confirmar adicipnalmente la utilidad de un cambiador epi para modular un estado de enfermedad, usando cualquiera de una cantidad de ensayos conocidos en la técnica o descritos en detalle en la presente. La utilidad de un cambiador epi de modular un estado de enfermedad se puede evaluar mediante la administración exógena directa del cambiador epi a una célula o a un organismo. La utilidad de un cambiador epi de modular un estado de enfermedad puede evaluarse alternativamente mediante el desarrollo de moléculas que modulen directamente al cambiador epi (por ej . , el nivel o la actividad del cambiador epi) . La utilidad de un cambiador epi de modular un estado de enfermedad también se puede: evaluar mediante el desarrollo de moléculas que modulen indirectamente el cambiador epi (por ej . , el nivel o actividad del cambiador epi) mediante la regulación de otras moléculas, tales como genes (por ej . , regulados a nivel del ARN o la proteina) , colocados en la misma vía que el cambiador epi.
El enfoque epimetabólico descrito en la presente facilita la identificación de las moléculas endógenas que existen en un microambiente celular y cuyos niveles se perciben y controlan mediante mecanismos genéticos, de ARNm o basados en proteínas. Las vías de respuesta a la regulación encontradas en células normales que son desencadenadas por un cambiador epi de la invención pueden proporcionar un valor terapéutico en un ambiente celular mal regulado o enfermo. Además, el enfoque epimetabólico descrito en la presente identifica cambiadores epi que pueden proporcionar una indicación diagnóstica para usarse en la selección de pacientes clínicos, un kit de diagnóstico de enfermedades o como un indicador prognóstico .
III. Ensayos útiles para identificar MIM/cambiadores epi Las técnicas y los métodos de la presente invención usados para separar e identificar moléculas y compuestos de interés incluyen a modo no taxativo: cromatografía líquida (LC) , cromatografía líquida de alta presión (HPLC) , espectroscopia de masas (MS), cromatografía de gas (GC) , cromatografía líquida/espectroscopia de masas (LC-MS), cromatografía de gas/espectroscopia de masas (GC-MS) , resonancia magnética nuclear (NMR) , imagenología por resonancia magnética (MRI) , infrarrojo transformado de Fourier (FT-IR) y espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente (ICP- S) . Se entiende además que las técnicas de espectrometría de masas incluyen, a modo no taxativo, el uso de instrumentos de sector magnético y doble enfoque, instrumentos de transmisión de cuadrípolo, instrumentos de trampa de iones cuadrípolo, instrumentos de tiempo de vuelo (TOF) , instrumentos de resonancia ciclotrónica iónica de transformación de Fourier (FT-MS) y desorción/ionización láser asistida por matriz/espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) .
Cuantificación de niveles moleculares bioenergéticos : Los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) se pueden identificar mediante cambios en los niveles moleculares bioenergéticos celulares (por ej . , ATP, piruvato, ADP, NADH, NAD, NADPH, NADP, acetilCoA, FADH2) de células a las que se les ha aplicado un cambiador epi candidato. Los ejemplos de ensayos de niveles moleculares bioenergéticos usan métodos colorimétricos , basados en fluorescencia y/o bioluminiscencia . Los ejemplos de tales ensayos se proporcionan a continuación.
Los niveles de ATP dentro de las células se pueden medir con una cantidad de ensayos y sistemas conocidos en la técnica. Por ejemplo, en un sistema, el ATP citoplásmico liberado de las células lisadas reacciona con luciferina y la luciferasa de enzima para producir luz. La bioluminiscencia se mide mediante un bioluminómetro y se puede calcular la concentración de ATP intracelular de las células lisadas (kit de ensayo EnzyLightTM ATP (EATP-100) , BioAssay Systems, Hayward, CA) . En otro sistema, por ejemplo, tanto ATP como su forma desfosforilada, ADP, se calculan mediante bioluminiscencia; luego de que se calculan los niveles de ATP, la ADP se transforma en ATP y luego se detecta y calcula usando el mismo sistema de luciferasa (kit de ensayo de proporción ADP/ATP ApoSENSORTM, BioVision Inc., Mountain View, CA) .
El piruvato es un intermediario importante en las vías metabólicas celulares. El piruvato se puede convertir en carbohidrato mediante gluconeogénesis , convertir en ácido graso o metabolizarse mediante acetil CoA o convertir en alanina o etanol, dependiendo del estado metabólico de una célula. Por lo tanto la detección de los niveles de piruvato proporciona una medición de la actividad metabólica y el estado de una muestra de célula. Un ensayo para detectar el piruvato, por ejemplo, usa un ensayo colorimétrico y fluorimétrico para detectar las concentraciones de piruvato dentro de diferentes intervalos (kit de ensayo de piruvato EnzyChromTM (Cat# EPYR-100) , BioAssay Systems, Hayward, CA) .
Los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) pueden influenciar el proceso de fosforilación oxidativa realizado por la mitocondria en las células, que están implicadas en la generación y el mantenimiento de moléculas bioenergéticas en las células. Además de los ensayos que detectan cambios en la energía celular en cultivos celulares y muestras directamente (descritos a continuación) , existen ensayos para detectar y cuantificar los efectos de compuestos en enzimas y complejos diferentes de la mitocondria en las células. Por ejemplo, el ensayo de actividad MT-OXC MitoTox™ Complete OXPHOS (MitoSciences Inc., Eugene, OR) puede detectar y cuantificar los efectos de los compuestos aplicados directamente a los complejos I y V extraídos de la mitocondria. Los ensayos para la detección y cuantificación de los efectos en complejos mitocondriales individuales como NADH deshidrogenasa (Complejo I), citocromo c oxidasa (Complejo IV) y ATP sintasa (Complejo V) también están disponibles (MitoSciences Inc., Eugene, OR) .
Medición de energía celular: Los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) también se pueden identificar mediante cambios en la energía celular. Un ejemplo de la medición de la energía celular es la medición en tiempo real del consumo de oxígeno molecular y/o el cambio en el pH del medio de un cultivo celular. Por ejemplo, la capacidad de un cambiador epi potencial de modular el estado metabólico de una célula se puede analizar usando, por ejemplo, el analizador XF24 (Seahorse, Inc.). Esta tecnología permite la detección en tiempo real de cambios en el oxígeno y el pH en una monocapa de células para evaluar la bioenergia de un microambiente celular. El analizador XF24 mide y compara las tasas de consumo de oxígeno (OCR) , que son una medida del metabolismo aeróbico y la acidificación extracelular (ECAR) que es una medida de la glucólisis, ambos indicadores clave de la energía celular.
Medición de fosforilación oxidativa y función mitocondrial La fosforilación oxidativa es un proceso mediante el cual se genera ATP a través de la oxidación de compuestos nutrientes, realizada en eucariotas mediante complejos de proteína incrustados en las membranas de la mitocondria. Como la fuente principal de ATP en las células de la mayoría de los organismos, los cambios en la actividad de fosforilación oxidativa pueden alterar fuertemente el equilibrio del metabolismo y la energía dentro de una célula. En algunas modalidades de la invención, los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) se pueden detectar y/o identificar por sus efectos sobre la fosforilación oxidativa. En algunas modalidades, los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) se pueden detectar y/o identificar por sus efectos sobre los aspectos específicos de la fosforilación oxidativa, incluyendo, a modo no taxativo, la cadena de transporte de electrones y la síntesis de ATP. 1 Los complejos de proteína incrustados en la membrana de la mitocondria que realizan procesos implicados en la fosforilación oxidativa llevan a cabo tareas específicas y se enumeran como I, II, III y IV. Estos complejos, junto con la sintasa de ATP trans-membrana interna (también conocida como Complejo V) son las entidades clave implicadas en el proceso de fosforilación oxidativa. Además de los ensayos que pueden examinar los efectos de los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) sobre la función mitocondrial en general y el proceso de fosforilación oxidativa en particular, existen ensayos que se pueden usar para examinar los efectos de un cambiador epi en un complejo individual de forma separada de otros complejos.
El complejo I, también conocido como NADH-coenzima Q oxidoirreductasa o NADH deshidrogenasa, es la primera proteina en la cadena de transporte de electrones. En algunas modalidades, se puede realizar la detección y cuantificación del efecto de un cambiador epi sobre la producción de NAD+ por el Complejo I. Por ejemplo, el complejo se puede inmunocapturar de una muestra en una placa de 96 pocilios; la oxidación de NADH a NAD+ tiene lugar junto con la reducción de una molécula de tinción que tiene una mayor absorbancia a 450 nM (kit de ensayo de microplaca de actividad de enzima del Complejo I, itoSciences Inc., Eugene, OR) .
El complejo IV, también conocido como, citocromo c oxidasa (COX) , es la última proteina en la cadena de transporte de electrones. En algunas modalidades, se puede realizar la detección y cuantificación del efecto de un cambiador epi sobre la oxidación del citocromo c y la reducción de oxigeno a agua por el Complejo IV. Por ejemplo, COX se puede inmunocapturar en una placa de micropocillos y la oxidación de COX se puede medir con un ensayo colorimétrico (kit de ensayo de microplaca de actividad de enzima del Complejo IV, MitoSciences Inc., Eugene, OR) .
La enzima final en el proceso de fosforilación oxidativa es ATP sintasa (Complejo V) que usa el gradiente de protones creado por los otros complejos para promover la síntesis de ATP a partir de ADP. En algunas modalidades, se puede realizar la detección y cuantificación del efecto de un cambiador epi sobre la actividad de la ATP sintasa. Por ejemplo, tanto la actividad de ATP sintasa como la cantidad de la ATP sintasa en una muestra se pueden medir para determinar la sintasa ATP que ha sido inmunocapturada en un pocilio de una placa de micropocillos . La enzima también puede funcionar como una ATPasa en algunas condiciones, por 10 tanto, en este ensayo de actividad de ATP sintasa, la proporción a la cual se reduce la ATP a ADP se mide mediante la detección de la oxidación simultánea de NADH a NAD+. La cantidad de ATP se calcula usando un anticuerpo etiquetado para ATPasa (kit de ensayo de microplaca de formación de dúplex de sintasa ATP (actividad + cantidad) MitoSciences Inc., Eugene, OR) . Los ensayos adicionales para la fosforilación oxidativa incluyen ensayos que prueban los efectos sobre la actividad de los Complejos II y III. Por ejemplo, se puede usar el sistema MT-OXC MitoToxTM Complete OXPHOS (MitoSciences Inc., Eugene, OR) para evaluar los efectos de un compuesto sobre el Complejo 11 y III así como el Complejo I, IV y V para proporcionar datos sobre los efectos de un compuesto sobre el sistema de fosforilación oxidativa completo.
Como se describe anteriormente, la observación en tiempo real de muestras de células intactas se puede realizar usando sondas para los cambios en el consumo de oxígeno y pH en el medio de cultivo celular. Estos ensayos de energía celular proporcionan una amplia visión global de la función mitocondrial y los efectos de los influenciadores ambientales potenciales (por ej . , MIM o cambiadores epi) sobre la actividad de la mitocondria dentro de las células de la muestra.
Los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) también pueden afectar la transición de permeabilidad mitocondrial (MPT) , un fenómeno donde las membranas mitocondriales experimentan un aumento en la permeabilidad debido a la formación de poros de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP) . Un aumento en la permeabilidad mitocondrial puede llevar a la hinchazón mitocondrial, una incapacidad de realizar la fosforilación oxidativa y la generación de ATP y la muerte celular. La MPT puede estar implicada en la inducción de apoptosis. (Véase, por ejemplo, Halestrap, A.P., Biochem. Soc. Trans. 34:232-237 (2006) y Lena, A. et ál. Journal of Translational Med. 7:13-26 (2009), incorporados en su totalidad a la presente mediante esta referencia) .
En algunas modalidades, se mide la detección y cuantificación del efecto de un influenciador ambiental (por ej . , MIM o cambiador epi) sobre la formación, discontinuación y/o efectos de MPT y MPTP. Por ejemplo, los ensayos pueden detectar la MPT mediante el uso de moléculas de tinción especializadas (calceina) que están ubicadas dentro de las membranas internas de la mitocondria y otros compartimientos citosólicos. La aplicación de otra molécula, C0CI2, sirve para suprimir la fluorescencia del tinte de calceina en el citosol. La C0CI2 no puede acceder, sin embargo, al interior de la mitocondria, por lo tanto la fluorescencia de la calceina en la mitocondria no se suprime a menos que haya ocurrido MPT y la C0CI2 puede acceder al interior de la mitocondria mediante MPTP. La pérdida de fluorescencia especifica de la mitocondria señala que ocurrió MPT. Se puede usar citometria de flujo para evaluar la fluorescencia celular y de organelos (kit de ensayo de poros de transición MitoProbeTM, Molecular Probes, Eugene, OR) . Los ensayos adicionales usan un microscopio de fluorescencia para evaluar los resultados experimentales (kit de ensayo de poros de transición mitocondrial Image-iTTM LIVE, Molecular Probes, Eugene, OR) . ; Medición de inflamación y proliferación celular ; En algunas modalidades de la invención, los influénciadores ambientales (por e . , MIM o cambiadores epi) se pueden identificar y evaluar por sus efectos sobre la producción o actividad de moléculas asociados con la inflamación y/o proliferación celular. Estas moléculas incluyen, a modo no taxativo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, componentes de la matriz extracelular, quimiocinas, neuropéptidos , neurofransmisores, neurotrofinas y otras moléculas implicadas en la señalización celular, asi como moléculas intracelulares, tales como las implicadas en la transducción de señales.
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un factor de crecimiento con propiedades angiogénicas, vasculogénicas y mitogénicas potentes. El VEGF estimula la permeabilidad e hinchazón endotelial y la actividad de VEGF se vé implicada en numerosas enfermedades y trastornos, incluyendo artritis reumatoide, cáncer metastásico, degeneración macular relacionada con la edad y retinopatia diabética .
¦ En algunas modalidades de la invención, un influenciador ambiental (por ej . , MIM o cambiador epi) se puede identificar y caracterizar por sus efectos sobre la producción de VEGF. Por ejemplo, las células mantenidas en condiciones hipóxicas o en condiciones que imitan la acidosis presentarán una mayor producción de VEGF. El VEGF secretado en el medio se puede someter a ensayo usando un ELISA u otro ensayo basado en anticuerpos, usando anticuerpos anti-VEGF disponibles (R&D Systems, Minneapolis, MN) . En algunas modalidades de la invención, un cambiador epi se puede identificar y/o caracterizar con base en su/s efecto/s sobre la capacidad de respuesta de las células a VEGF y/o con base en su/s efecto/s en la expresión o actividad del receptor VEGF.
, El factor de necrosis tumoral (TNF) es un mediador clave de la inflamación y la activación del sistema inmune implicado tanto en la función del sistema inmune sano como en las enfermedades autoinmunes. En algunas modalidades de la invención, un cambiador epi se puede identificar y caracterizar por sus efectos sobre la producción o la actividad del TNF. Por ejemplo, el TNF producido por células cultivadas y secretado al medio se puede cuantificar mediante ELISA y otros ensayos basados en anticuerpos conocidos en la técnica. Además, en algunas modalidades, un influenciador ambiental se puede identificar y caracterizar por su/s efecto/s en la expresión de los receptores para el TNF (Human TNF RI Duoset, R&D Systems, Minneapolis, MN) . i Los componentes de la matriz extracelular (ECM) están implicados tanto en la estructura de las células y tejidos como , en los procesos de señalización. Por ejemplo, las proteínas de unión al factor de crecimiento beta transformante latente son componentes de ECM que crean un depósito de factor de crecimiento beta transformado (TGFP) dentro de la ECM. El TGF$ unido a la matriz se puede liberar más tarde durante el proceso del remodelado de matriz y puede ejercer efectos de factor de crecimiento en las células cercanas (Dallas, S. Methods in Mol. Biol. 139:231-243 (2000) ) .
En algunas modalidades, un influenciador ambiental (por ej . , MIM o cambiador epi) se puede identificar o caracterizar por su/s efecto/s sobre la creación de ECM por células cultivadas. Los investigadores han desarrollado técnicas con las cuales se puede estudiar y cuantificar la creación de ECM por las células, asi como la composición de ECM. Por ejemplo, la síntesis de ECM por células se puede evaluar incrustando las células en un hidrogel antes de la incubación. Los análisis bioquímicos y de otro tipo se realizan en la ECM generada por las células luego de la recolección y digestión de células del hidrogel (Strehin, I. and Elisseeff, J. Methods in Mol. Bio. 522 : 34 9-362 ( 2009 ) ) .
En algunas modalidades, se puede identificar o caracterizar el efecto del influenciador ambiental (por ej . , MIM o cambiador epi) sobre la producción, estado o falta de ECM o uno de sus componentes en un organismo. Se han desarrollado técnicas para crear ratones condicionales con genes inactivados que permitan la desactivación de genes ECM particulares solo en tipos distintos de células o en determinadas etapas del desarrollo (Brancaccio, M. et ál. Methods in Mol Bio. 522 : 15- 50 ( 2009 ) ) . Por lo tanto se puede evaluar el efecto de la aplicación o administración de un cambiador epi o cambiador epi potencial sobre la actividad o ausencia de un componente ECM particular en un tejido particular o en una etapa particular del desarrollo.
Medición de la integridad de membrana plasmática y muerte celular Se pueden identificar los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) mediante cambios en la integridad de la membrana plasmática de una muestra celular y/o mediante cambios en la cantidad o porcentaje' de células que experimentan apoptosis, necrosis o cambios celulares que demuestran una mayor o menor similitud con la muerte celular .
Un ensayo para la lactato deshidrogenasa (LDC) puede proporcionar una medición de estado celular y niveles de daño. La LDH es una enzima citoplasmática estable y relativamente abundante. Cuando las membranas plasmáticas pierden la integridad física, la LDH se escapa al compartimiento extracelular . Las concentraciones más altas de LDH se correlacionan con niveles más altos de daño a la membrana plasmática y muerte celular. Los ejemplos de ensayos de LDH incluyen ensayos que usan un sistema colorimétrico para detectar y cuantificar los niveles de LDH en una muestra, donde la forma reducida de una sal de tetrazolio se produce mediante la actividad de la enzima de LDH (kit de lactato deshidrogenasa QuantiChromTM (DLDH-100) , BioAssay Systems, Hayward, CA; kit de detección de citotoxicidad de LDH, Clontech, Mountain View, CA) .
La apoptosis es un proceso de muerte celular programada que puede tener una variedad de diferentes eventos de inicio. Algunos ensayos pueden detectar cambios en la velocidad y/o número de células que experimentan apoptosis. Un tipo de ensayo que se usa para detectar y cuantificar la apoptosis es un ensayo de caspasa. Las caspasas son proteínas de cisteína específicas del ácido aspártico que se activan mediante la escisión proteolítica durante la apoptosis. Los ejemplos de ensayos que detectan las caspasas activadas incluyen los sistemas de ensayo PhiPhiLux® (Oncolmmunin, Inc., Gaithersburg, MD) y Caspase-Glo® ; 3/7 (Promega Corp., Madison, WI) . Los ensayos adicionales que pueden detectar la apoptosis y los cambios en el porcentaje o la cantidad de células que experimentan apoptosis en muestras comparativas incluyen ensayos de fragmentación TUNEL/DNA. Estos ensayos detectan los 180 a 200 pares de bases de fragmentos de ADN generados mediante nucleasas durante la fase de ejecución de apoptosis. Los ejemplos de ensayos de fragmentación TUNEL/DNA incluyen el kit de detección de muerte celular in situ (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) y el sistema TUNEL colorimétrico y fluorométrico DeadEnd™ TUNEL (Promega Corp., Madison, WI) .
, Algunos ensayos de apoptosis detectan y cuantifican proteínas asociadas con un estado apoptótico y/o no apoptótico. Por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad I I MultiTox-Fluor Múltiple (Promega Corp., Madison, I) usa un sistema fluorimétrico de un solo sustrato para detectar y cuantificar la proteasas especificas para células vivas y muertas, proporcionando asi una proporción de células vivas a células que han experimentado apoptosis en una muestra de tejido o célula.
Los ensayos adicionales disponibles para detectar y cuantificar la apoptosis incluyen ensayos que detectan la permeabilidad celular (por ej . , ensayo de apoptosis APOPercentage™, Biocolor, RU) y ensayos para Anexina V (por ej . , kit de detección de la apoptosis de anexina V-biotina, BioVision Inc., Mountain View, CA) .
IV. Tratamiento de trastornos oncológicos La presente invención proporciona métodos para tratar o prevenir un trastorno oncológico en un humano, que comprende la administración de un influenciador ambiental al humano en una cantidad suficiente como para tratar o prevenir el trastorno oncológico, tratando o previniendo asi el trastorno oncológico. En una modalidad, el influenciador ambiental no es CoQlO.
Tal como se usa en el presente, "trastorno oncológico" se refiere a todos los tipos de cáncer o neoplasia o tumores malignos encontrados en humanos, incluyendo, a modo no taxativo: leucemias, linfornas, melanomas, carcinomas y sarcomas. Tal como se usa en la presente, los términos o expresiones "trastorno oncológico", "cáncer", "neoplasia" y "tumor" se usan de manera intercambiable y en forma singular o plural y se refieren a células que han experimentado una transformación maligna que las hacen patológicos para el organismo hospedador. Las células cancerosas primarias (es decir, las células obtenidas cerca del sitio de transformación maligna) se pueden distinguir fácilmente de las células no cancerosas mediante técnicas bien establecidas, particularmente examinación histológica. La definición de una célula cancerosa, tal como se usa en la presente, incluye no solo una célula cancerosa primaria sino también células madre cancerosas, así como células progenitoras cancerosas o cualquier célula derivada de una célula cancerosa predecesora. Esto incluye células cancerosas con metástasis y cultivos in vitro y líneas celulares derivadas de células cancerosas. Cuando se hace referencia a un tipo de cáncer que normalmente se manifiesta como un tumor sólido, un tumor "clínicamente detectable" es uno que es detectable con base en la masa tumoral; por ej . , mediante procedimientos tales como tomografía, imagenología por resonancia magnética, rayos X, ultrasonido o palpación, y/o que es detectable debido a la expresión de uno o más antígenos específicos para el cáncer en una muestra que se obtiene de un paciente.
El término "sarcoma" generalmente se refiere a un tumor que está compuesto de una sustancia como el tejido conector embriónico y generalmente está hecho de células estrechamente empaquetadas incrustadas en una sustancia fibrilar u homogénea. Los ejemplos de sarcomas que se pueden tratar con un influenciador ambiental de la invención incluyen, a modo no taxativo, un condrosarcoma, fibrosarcoma, linfosarcoma, melanosarcoma, mixosarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, liposarcoma, sarcoma alveolar de partes blandas, sarcoma ameloblástico, sarcoma botiroide, sarcoma cloroma, coriocarcinoma, sarcoma embrional, sarcoma de tumor de Wilms, sarcoma endometrial, sarcoma estromal, sarcoma de Ewing> sarcoma facial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocitico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado idiopático múltiple, sarcoma inmunoblástico de células B, linfoma, sarcoma immunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiosarcoma, leucosarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocitico, sarcoma de Rous, sarcoma seroquistico, sarcoma sinovial y sarcoma telangiectáltico .
Se pretende que el término "melanoma" signifique un tumor que surge del sistema melanocitico de la piel y otros órganos. Los melanomas que se pueden tratar con un influenciador ambiental de la invención incluyen, a modo no taxativo, por ejemplo, melanoma acral lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma léntigo maligno, melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungal y melanoma de diseminación superficial.
El término "carcinoma" se refiere a un nuevo tumor maligno hecho de células epiteliales que tienden a infiltrarse en los tejidos circundantes y dan lugar a la metástasis. Los carcinomas que se pueden tratar con un influenciador ambiental de la invención incluyen, a modo no taxativo, por ejemplo, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenoquistico, carcinoma adenoide quistico, carcinoma adenomatosum, carcinoma de corteza suprarrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de célula alveolar, carcinoma de célula basal, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma de célula basoescamosa, bronquioalveolar carcinoma, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma coloide, carcinoma comedo, corpus carcinoma, carcinoma cribriforme, carcinoma en cuirasse, carcinoma cutáneo, carcinoma cilindrico, carcinoma de célula cilindrica, carcinoma de ducto, carcinoma durum, carcinoma embrional, carcinoma encefaloide, carcinoma epidermoide, carcinoma epitheliale adenoides, carcinoma exofitico, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de célula gigante, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de célula granulosa, carcinoma de la matriz pilosa, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de célula de Hurthle, carcinoma hialina, carcinoma hipemefroide, carcinoma embrionario infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidermal, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de célula de Kulchitzky, carcinoma de célula grande, carcinoma lenticular, carcinoma lenticulare, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medullare, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma molle, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparum, carcinoma mucocellulare , carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucosum, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatodo, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células de avena, carcinoma ossificans, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma preinyasivo, carcinoma de célula espinosa, carcinoma pultáceo, carcinoma de riñon de células renales, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatoide , carcinoma schneideriano, carcinoma cirroso, carcinoma escrotal, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma simple, carcinoma de célula pequeña, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoideas, carcinoma de células de huso, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de célula escamosa, carcinoma en collar, carcinoma telangiectásico, carcinoma telangiectoide, carcinoma de célula transicional, carcinoma tuberosum, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso y carcinoma villosum.
En general, un influenciador ambiental se puede usar para tratar de forma profiláctica o terapéutica cualquier neoplasia. En una modalidad, los influenciadores ambientales de la invención se usan para tratar tumores sólidos. En diversas modalidades de la invención, un influenciador ambiental (por ej . , CoQlO) se usa para el tratamiento de diversos tipos de cáncer de piel (por ej . , carcinoma de célula escamosa o carcinoma de célula basal) , cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de hígado o cáncer de hueso. En una modalidad, un influenciador ambiental, por e . , CoQlO, se usa para el tratamiento de un trastorno oncológico de la piel incluyendo, a modo no taxativo, carcinomas de célula escamosa (incluyendo SCCIS (in situ) y carcinomas de célula escamosa más agresivos) , carcinomas de célula basal (incluyendo carcinomas de célula superficial, nodular e infiltrante basal), melanomas y queratosis actínica. Sin embargo, el tratamiento usando un influenciador ambiental no se limita a los tipos de cánceres que anteceden. Los ejemplos de cánceres susceptibles de cura con un influenciador ambiental incluyen, a modo no taxativo, cáncer del cerebro, cabeza y cuello, próstata, mama, testicular, de páncreas, de hígado, de colon, de vejiga, de riñon, de pulmón, de pulmón no microcítico, melanoma, mesotelioma, útero, cuello del útero, ovario, sarcoma, hueso, estómago y meduloblastoma.
Otros cánceres que se pueden tratar con un influenciador ambiental de la invención incluyen, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmón de célula pequeña, tumores de cerebro primario, cáncer de estómago, cáncer de colon, insulanoma pancreático maligno, carcinoide maligno, cáncer de vejiga urinaria, lesiones de piel premalignas, cáncer testicular, linfomas, cáncer tiroideo, neuroblastoma, cáncer esofágico, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer cortical adrenal y cáncer de próstata. En una modalidad, el trastorno oncológico o cáncer que se puede tratar con el influenciador ambiental, por ej . , CoQlO, no es melanoma. 1 La presente invención proporciona además métodos para tratar o prevenir un trastorno oncológico en un humano, que comprende seleccionar a un sujeto humano que sufre de un trastorno oncológico y administrar a dicho humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un influenciador amb. capaz de bloquear el uso anaeróbico de glucosa y aumentar la fosforilación oxidativa mitocondrial, tratando o previniendo asi el trastorno oncológico.
Se pretende que la definición de una célula cancerosa, tal como se usa en la presente, incluya una célula cancerosa que produce energía mediante la glucólisis anaeróbica (por ej . , glucólisis seguida por fermentación de ácido láctico en el citosol) , glucólisis aeróbica o fosforilación oxidativa mitocondrial (por ej . , glucólisis seguida por la oxidación de piruvato en la mitocondria) o una combinación de glucólisis anaeróbica y glucólisis aeróbica. En una modalidad, una célula cancerosa produce energía predominantemente mediante glucólisis anaeróbica (por ej., al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de la energía de la célula se produce mediante glucólisis anaeróbica) . En una modalidad, una célula cancerosa produce energía predominantemente mediante glucólisis aeróbica (por ej . , ; al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de la energía de la célula se produce mediante glucólisis anaeróbica) . Se pretende que la definición de células cancerosas, tal como se usa en la presente, también incluya una población de células cancerosas o una mezcla de células cancerosas que comprenden células que producen energía mediante glucólisis anaeróbica y células que producen energía mediante glucólisis aeróbica. En una modalidad, una población de células cancerosas comprende predominantemente células que producen energía mediante glucólisis anaerobica (por ej., al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de las células en la población producen energía mediante glucólisis anaerobica) . En una modalidad, una población de células cancerosas comprende predominantemente células que producen energía mediante glucólisis aeróbica (por ej . , al menos' 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de las células en la población) .
' Tal como se usa en la presente, la frase "uso anaeróbico de glucosa" o "glucólisis anaerobica" o "vía de glucólisis" se refiere a la producción celular de energía mediante glucólisis seguida por la fermentación de ácido láctico en el citosol. Por ejemplo, muchas células cancerosas producen energía mediante glucólisis anaerobica. 1 Tal como se usa en la presente, la frase "glucólisis aeróbica" o "fosforilación oxidativa mitocondrial" se refiere a la producción celular de energía mediante glucólisis seguida por oxidación de piruvato en la mitocondria .
Tal como se usa en la presente, la frase "capaz de bloqu ar el uso anaeróbico de glucosa y aumentar la fosforilación oxidativa mitocondrial" o "un cambio de la vía de glucólisis a fosforilación oxidativa mitocondrial" i se refiere a la capacidad de un influenciador ambiental (por ej . , un cambiador epimetabólico) de inducir un cambio en el estado metabólico de una célula de glucólisis anaeróbica a glucólisis aeróbica o fosforilación oxidativa mitocondrial . Tal como se usa en la presente, "cambio (de glucólisis a fosforilación oxidativa mitocondrial) " se refiere a una reducción de la dependencia de energía en la vía de la glucólisis, preferentemente hacia un nivel visto en células normales. A la vez, el nivel absoluto de fosforilación oxidativa mitocondrial también se puede reducir o disminuir, pero está preferentemente asociado con una mayor eficacia de la fosforilación oxidativa mitocondrial . 1 En algunas modalidades de la invención, el trastorno oncológico que se está tratando no es un trastorno típicamente tratado mediante la administración tópica con la expectativa de una administración sistémica de un agente activo a niveles terapéuticamente eficaces. Tal como se usa en la presente, la frase "no es un trastorno típicamente tratado mediante la administración tópica" se refiere a trastornos oncológicos que no se tratan típica o rutinariamente con un agente terapéutico mediante la administración tópica sino que son típicamente tratados con un agente terapéutico mediante, por ejemplo, administración intravenosa. Los trastornos oncológicos que no son típicamente tratados mediante la administración tópica incluyen, a modo no taxativo, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático y cáncer de hueso .
La presente invención también proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno oncológico agresivo en un humano, que comprende la administración de un influenciador ambiental al humano a una dosis seleccionada inferior a la del régimen de dosificación usado o seleccionado para trastornos oncológicos menos agresivos o no agresivos, tratando o previniendo así el trastorno oncológico agresivo. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno oncológico no agresivo en un humano, que comprende la administración de un influenciador ambiental al humano a una dosis seleccionada mayor a la de un régimen de dosificación usado o seleccionado para trastornos oncológicos agresivos, tratando o previniendo así el trastorno oncológico no agresivo.
I Tal como se usa en la presente, el término "trastorno oncológico agresivo" se refiere a un trastorno oncológico que implica un tumor de rápido crecimiento. Un trastorno oncológico agresivo típicamente no responde o responde poco a un tratamiento terapéutico. Los ejemplos de un trastorno oncológico agresivo incluyen, a modo no taxativo, carcinoma pancreático, carcinoma hepatocelular, sarcoma de Ewing, cáncer de mama metastásico, melanoma metastásico, cáncer de cerebro (astrocitoma, glioblastoma) , cáncer neuroendocrino, cáncer de colon, cáncer de pulmón, osteosarcoma, cáncer de próstata no dependiente de andrógeno, cáncer de ovario y linfoma no de Hodgkin.
Tal como se usa en la presente, el término "trastorno oncológico no agresivo" se refiere a un trastorno oncológico que implica un tumor de crecimiento lento. Un trastorno oncológico no agresivo típicamente responde favorable o moderadamente al tratamiento terapéutico. Los ejemplos de un trastorno no oncológico incluyen, a modo no taxativo, cáncer de mama no metastásico, cáncer de próstata dependiente de andrógenos, cáncer de pulmón microcítico y leucemia linfocítica aguda. En una modalidad, los trastornos oncológicos no agresivos incluyen cualquier trastorno oncológico que no es un trastorno oncológico agresivo .
. Se pretende que una dosificación menor seleccionada de CoQlO para el tratamiento de trastornos oncológicos agresivos incluya una dosificación que es menor a un régimen de dosificación que se usa o selecciona típicamente para trastornos oncológicos menos agresivos o no agresivos. En diversas modalidades, la dosificación menor seleccionada de CoQlO es alrededor de 1.5 veces menor, alrededor d 2 veces menor, alrededor de 3 veces menor, alrededor de 4 veces menor, alrededor de 5 veces menor o alrededor de 10 veces menor que un régimen de dosificación que se usa o selecciona típicamente para trastornos oncológicos menos agresivos y no agresivos. Se comprenderá que una dosificación inferior seleccionada de CoQlO también incluye un tiempo de tratamiento más breve (por ej . , un tiempo de tratamiento 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces más corto) de CoQlO o una administración menos frecuente (por ej . , la mitad de veces tan frecuente, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces o 24 veces menos frecuente) de CoQlO en comparación con el tiempo de tratamiento o protocolo de administración típicamente usado o seleccionado para trastornos oncológicos menos agresivos o no agresivos. En diversas modalidades, la dosificación inferior seleccionada de coenzima Q10 para el tratamiento de trastornos oncológicos agresivos incluye alrededor de 0.0001 a alrededor de 5.0, alrededor de 0.001 a alrededor de 1.0, alrededor de 0.001 a alrededor de 0.5, alrededor de 0.001 a alrededor de 0.4, alrededor de 0.001 a alrededor de 0.30 , alrededor de 0.001 a alrededor de 0.25, alrededor de 0.001 a 0.20, alrededor de 0.001 a alrededor de 0.12 o alrededor de 0.001 a alrededor de 0.09 mg de CoQlO por centímetro cuadrado de piel. En otras modalidades, la coenzima Q10 se aplica al tejido diana a una dosis de alrededor de 0.0001, 0.001, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27, 0.28, 0.29, 0.30, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39, 0.40, 0.41, 0.42, 0.43, 0.44, 0.45, 0.46, 0.47, 0.48, 0.49 o 0.5 mg de CoQlO por centímetro cuadrado de piel. Se debería entender que se pretende que los intervalos que tienen cualquiera de estos valores como el límite superior o inferior también sean parte de esta invención, por ej . , alrededor de 0.005 a alrededor de 0.09 mg de CoQlO por centímetro cuadrado de piel.
: Se pretende que una dosificación mayor seleccionada de CoQlO para el tratamiento de trastornos oncológicos no agresivos incluya una dosificación que es mayor que un régimen de dosificación que se usa o selecciona típicamente para trastornos oncológicos agresivos. En diversas modalidades, la dosificación mayor seleccionada de CoQlO es alrededor de 1.5 veces, alrededor de 2 veces, alrededor de 3 veces, alrededor de 4 veces, alrededor de 5 veces o alrededor de 10 veces mayor que un régimen de dosificación que se usa o selecciona típicamente para trastornos oncológicos agresivos. Se comprenderá que una dosificación inferior seleccionada de CoQlO también incluye un tiempo de tratamiento más prolongado (por ej . , un tiempo de tratamiento 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces más prolongado) de CoQlO o una administración más frecuente (por ej . , 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces o 24 veces más frecuente) de CoQlO en comparación con el tiempo de tratamiento o protocolo de administración típicamente usado o seleccionado para trastornos oncológicos agresivos. En diversas modalidades, la dosificación mayor seleccionada de coenzima Q10 para el tratamiento de trastornos oncológicos agresivos incluye alrededor de 0.001 a alrededor 10.0, alrededor de 0.005 a alrededor de 10.0, alrededor de 0.01 a alrededor de 10.0, alrededor de 0.05 a alrededor de 5.0, alrededor de 0.05 a alrededor de 2.0, alrededor de 0.05 a alrededor de 1.0, alrededor de 0.05 a alrededor de 0.7, alrededor de 0.10 a alrededor de 0.50 o alrededor de 0.12 a 0.5 mg de CoQlO por centímetro cuadrado de piel. En otras modalidades, la coenzima Q10 se aplica al tejido diana a una dosis de alrededor de 0.001, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27, 0.28, 0.29, 0.30, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39, 0.40, 0.41, 0.42, 0.43, 0.44, 0.45, 0.46, 0.47, 0.48, 0.49, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0".9 mg o 1.0 mg de CoQlO por centímetro cuadrado de piel. · Se debería entender que se pretende que los intervalos que tienen cualquiera de estos valores como el límite superior o inferior también sean parte de esta invención, por ej . , alrededor de 0.15 a alrededor de 0.5 mg de CoQlO por centímetro cuadrado de piel.
En una modalidad, un influenciador ambiental de la invención reduce el tamaño del tumor, inhibe el crecimiento del tumor y/o prolonga el tiempo de supervivencia de un sujeto que tiene un tumor. Por consiguiente, esta invención también se refiere a un método para tratar tumores en un humano u otro animal mediante la administración a tal humano o animal de una cantidad eficaz y no tóxica de un influenciador ambiental. Un experto en la técnica seria capaz, mediante experimentación de rutina, de determinar cuál seria una cantidad eficaz y no tóxica de un influenciador ambiental a los efectos de tratar neoplasias. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de un influenciador ambiental puede variar de acuerdo con factores tales como la etapa de enfermedad (por ej . , la etapa I en comparación con la etapa IV) , edad, sexo, complicaciones médicas (por ej . , afecciones o enfermedades inmunosuprimidas ) y peso del sujeto y la capacidad del influenciador ambiental de provocar una respuesta deseada en el, sujeto. El régimen de dosificación se puede ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, varias dosis divididas se pueden administrar diariamente o la dosis se puede reducir proporcionalmente como se indica según las exigencias de la situación terapéutica .
V. Dianas terapéuticas para trastornos oncológicos La presente invención proporciona métodos para identificar dianas terapéuticas para trastornos oncológicos. La invención proporciona además dianas terapéuticas identificadas por tales métodos. La identificación de una diana terapéutica implica, generalmente, la aplicación exógena de un influenciador amb. o un influenciador amb. candidato a una célula o panel de lineas celulares y la posterior evaluación de cambios inducidos en una célula tratada en comparación con una célula no tratada de control. Los cambios celulares inducidos que se controlan incluyen, a modo no taxativo, cambios en la morfología, fisiología o composición, por ej . , niveles de ARN, proteína, lípidos o metabolitos en la célula. Los cambios celulares inducidos como resultado del tratamiento mediante un influenciador amb. candidato se pueden controlar usando cualquiera de los ensayos descritos en la presente. Por ejemplo, los cambios en la expresión génica a nivel del ARNm se pueden evaluar mediante matrices de PCR en tiempo real, mientras que los cambios en la expresión génica a nivel de la proteína se pueden controlar usando micromatrices de anticuerpo y electroforesis en gel 2-D. Los genes identificados como modulados por el influenciador amb. candidato (por ej . , a nivel del ARNm y/o de la proteína) se evalúan luego desde una perspectiva de Systems Biology usando análisis de vía (software Ingenuity IPA) y mediante una revisión de la literatura conocida. Los genes identificados como dianas terapéuticas potenciales se someten luego a ensayos de confirmación tales como análisis de transferencia Western, silenciamiento de ARNip o métodos de producción y caracterización de proteínas recombinantes .
Los ensayos de clasificación se pueden usar entonces para identificar los moduladores de las dianas. Los moduladores de las dianas terapéuticas son útiles como agentes terapéuticos novedosos para tratar trastornos oncológicos. Los moduladores de las dianas terapéuticas se pueden identificar de forma rutinaria usando ensayos de clasificación descritos en detalle en la presente o mediante el uso de metodologías de rutina conocidas por el experto en la técnica.
Los genes identificados en la presente como modulados (por ej . , modulados por aumento o modulados por disminución a nivel del ARNm o de la proteína) por el IM/cam iador Epi, CoQlO, son dianas de fármaco de la invención. Las dianas de fármacos de la invención incluyen, a modo no taxativo, los genes enumerados a continuación en las Tablas 1-28 en la presente. Con base en los resultados de los experimentos descritos por los Solicitantes en la presente, las proteínas clave moduladas por la Q10 se asocian con o se pueden clasificar en diferentes vías o grupos de moléculas, incluyendo factores de transcripción, respuesta apoptótica, vía de fosfato pentosa, vía biosintética, estrés oxidativo (pro-oxidante) , alteraciones de membrana y metabolismo de fosforilación oxidativa. Las proteínas clave moduladas por la CoQlO se resumen de la siguiente forma, con base en los resultados proporcionados en la presente. Una proteína clave modulada por la CoQlO y que es un factor de transcripción es HNF4alfa. Las proteínas clave que son moduladas por la CoQlO y se asocian con la respuesta apoptótica incluyen Bcl-xl, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-Lll (Bim) , XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA y cMyc. Una proteína clave que es modulada por la CoQlO y se asocia con la vía de la pentosa fosfato es transaldolasa 1. Las proteínas clave que son moduladas por la CoQlO y se asocian con una senda biosintética incluyen COQ1, COQ3, COQ6, preniltransferasa y 4-hidroxibenzoato . Las proteínas clave que son moduladas por la CoQlO y se asocian con el estrés oxidativo (pro-oxidante) incluyen el factor citosólico de neutrófilos 2, sintasa de óxido nítrico 2A y superóxido dismutasa 2 (mitocondrial) . Las proteínas clave que son moduladas por la CoQlO y se asocian con el metabolismo de fosforilación oxidativa incluyen Citocromo c, complejo I, complejo II, complejo III y complejo IV. Las proteínas clave adicionales que son moduladas directa o indirectamente por la CoQlO incluyen Foxo 3a, DJ-1, IDH-1, CptlC y Cam cinasa II.
Por consiguiente, en una modalidad de la invención, un diana de fármaco puede incluir HNF4-alfa, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-Lll (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, cMyc, transaldolasa 1, COQ1, COQ3, COQ6, preniltransferasa, 4-hidrobenzoato, factor citosólico de neutrófilos 2, sintasa de óxido nítrico 2A, superóxido dismutasa 2, VDAC, canal Bax, ANT, Citocromo c, complejo 1, complejo II, complejo III, complejo IV, Foxo 3a, DJ-1, IDH-1, CptlC y Cam cinasa II. En una modalidad preferida, una diana de fármaco puede incluir HNF4A, Transaldolasa, NM23 y BSCv. En una modalidad, la diana de fármaco es TNF4A. En una modalidad, la diana de fármaco es transaldolasa. En una modalidad, la diana de fármaco es NM23. En una modalidad, la diana de fármaco es BSCv. A continuación se describen los ensayos de clasificación útiles para la identificación de moduladores de dianas de fármaco identificadas.
VI . Ensayos de clasificación La invención también proporciona métodos (también denominados en la presente como "ensayos de clasificación") para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de prueba (por ej . , proteínas, péptidos, peptidomiméticos , peptoides, moléculas pequeñas u otros fármacos) , que modulan la expresión y/o actividad de una diana terapéutica identificada de la invención. Tales ensayos típicamente comprenden una reacción entre una diana terapéutica de la invención y uno o más componentes del ensayo. Los otros componentes pueden ser el compuesto de prueba en sí mismo una combinación de compuestos de prueba y un compañero de unión natural de un marcador de la invención. Los compuestos identificados mediante ensayos tales como los descritos en la presente pueden ser útiles, por ejemplo, para tratar o prevenir un trastorno oncológico.
¦ Los compuestos de prueba usados en los ensayos de clasificación de la presente invención se pueden obtener a partir de cualquier fuente disponible, incluyendo bibliotecas sistemáticas de compuestos naturales y/o sintéticos. Los compuestos de prueba también se pueden obtener mediante cualquiera de los diversos enfoques en métodos de biblioteca de combinación conocidos en la técnica incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas peptoides (bibliotecas de moléculas que tienen las funcionalidades de péptidos pero con una estructura principal no peptídica novedosa que son resistentes a la degradación enzimática pero que igualmente permanecen bioactivas, véase, por ej . , Zuckermann et á., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85); bibliotecas de fase sólida o de fase de solución paralelas direccionables de forma espacial; métodos de biblioteca sintética que requieren desconvolución, el método de biblioteca "una perla-un compuesto" y métodos de biblioteca sintética usando selección por cromatografía de afinidad. Los enfoques de biblioteca biológica y de biblioteca peptoide se limitan a bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques se pueden aplicar a oligómero peptídico, no peptídico o bibliotecas de moléculas pequeñas de compuestos (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145).
Los ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares se pueden encontrar en la técnica, por ejemplo en: DeWitt et ál . (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:6909; Erb et ál. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91:11422; Zuckermann et ál. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et ál. (1993) Science 261:1303; Carrell et ál . (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl . 33:2059; Carell et ál . (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 y en Gallop et ál. (1994) J. Med. Chem. 37:1233.
Las bibliotecas de compuestos se pueden presentar en solución (por ej . , Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421) o sobre perlas (Lam, 1991, Nature 354:82-84), chips (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), bacterias y/o esporas, (Ladner, USP 5,223,409), plásmidos (Culi et ál, 1992, Proc Nati Acad Sci EUA 89:1865-1869) o en fagos (Scott y Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et ál, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. 87:6378-6382;, Felici, 1991, J. Mol. Biol . 222:301-310; Ladner, anteriormente) .
Los métodos de clasificación de la invención comprenden poner en contacto una célula con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba de modular la expresión y/o actividad de una diana terapéutica de la invención en la célula. La expresión y/o actividad de una diana terapéutica de la invención se puede determinar como se describe en la presente. La expresión y/o actividad de una diana terapéutica de la invención también se puede determinar usando métodos de rutina conocidos por el experto en la técnica. En una modalidad, un compuesto se selecciona con base en su capacidad de aumentar la expresión y/o actividad de una diana terapéutica de la invención. En una modalidad, un compuesto se selecciona con base en su capacidad de aumentar la expresión y/o actividad de una diana terapéutica seleccionada de las proteínas listadas en las Tablas 1-28, donde la diana terapéutica se modula por aumento por CoQlO (por ej . , presenta un cambio múltiplo positivo) . En una modalidad, un compuesto se selecciona con base en su capacidad de disminuir la expresión y/o actividad de una diana terapéutica de la invención. En una modalidad, un compuesto se selecciona con base en su capacidad de disminuir la expresión y/o actividad de una diana terapéutica seleccionada de las proteínas listadas en las Tablas 1-28, donde la diana terapéutica se modula por disminución por CoQlO (por ej . , presenta un cambio múltiplo negativo) .
En otra modalidad, la invención proporciona ensayos para clasificar compuestos candidatos o de prueba que son sustratos de una diana terapéutica de la invención o porciones biológicamente activas de la misma. En aun otra modalidad, la invención proporciona ensayos para clasificar compuestos candidatos o de prueba que se unen a una diana terapéutica de la invención o porciones biológicamente activas de la misma. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba de unirse directamente a una diana terapéutica se puede lograr, por ejemplo, mediante el acoplamiento del compuesto con un radioisótopo o una etiqueta enzimática de forma tal que la unión del compuesto a la diana del fármaco se pueda determinar por la detección del compuesto marcador etiquetado en un complejo. Por ejemplo, los compuestos (por ej . , sustratos marcadores) se pueden etiquetar con 131I, 1 5I, 35S, 1C o 3H, ya sea directa o indirectamente y el radioisótopo se puede detectar mediante el conteo directo de radioemisión o mediante el conteo de centelleo. De manera alternativa, los componentes del ensayo se pueden etiquetar enzimáticamente con, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa y la etiqueta enzimática se puede detectar mediante determinación de la conversión de un sustrato apropiado en producto.
Esta invención se relaciona adicionalmente con agentes novedosos identificados mediante los ensayos de clasificación antes descritos. Por consiguiente, se encuentra dentro del alcance de esta invención usar de forma1 adicional un agente identificado como se describe en la presente en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, un agenté capaz de modular la expresión y/o actividad de un marcador de la invención identificado como se describe en la presente se puede usar en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos laterales del tratamiento con tal agente. De manera alternativa, un agente identificado como se describe en la presente se puede usar en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de tal agente. Además, esta invención se refiere a los usos de agentes novedosos identificados mediante los ensayos de clasificación descritos anteriormente para el tratamiento como se describió anteriormente.
VII Composiciones farmacéuticas y administración farmacéutica Los influenciadores ambientales de la invención se pueden incorporar en las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un influenciador ambiental de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente, un "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión,- revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada de fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden incluir además pequeñas cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o amortiguadores, que potencian la vida útil o la efectividad del influenciador ambiental.
Las' composiciones de la presente invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación liquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones liquidas (por ej . , soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, pildoras, polvos, cremas, lociones, linimentos, ungüentos o pastas, gotas para administrarse al ojo, oído o nariz, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica pretendidas.
Los influenciadores ambientales de la presente invención se pueden administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Para muchas aplicaciones terapéuticas, la via/el modo de administración preferido es la inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como lo comprenderá el experto en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En determinadas modalidades, el compuesto activo se puede preparar con un portador que protegerá al compuesto de la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tal como acetato de etilenvinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son conocidos generalmente por los expertos en la técnica. Véase, por ej . , Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. En una modalidad, el modo de administración es parenteral (por ej . , intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular) . En una modalidad, el influenciador ambiental se administra mediante inyección o infusión intravenosa. En otra modalidad, el influenciador ambiental se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea. En una modalidad preferida, el influenciador ambiental se administra tópicamente.
Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, una microemulsión, una dispersión, un liposoma u otra ; estructura ordenada adecuada para altas concentraciones del fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del compuesto activo (es decir, influenciador ambiental) en la cantidad necesaria en un solvente apropiado con un ingrediente de los mencionados anteriormente o una combinación de los mismos, según sea necesario, seguido por una esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los antemencionados. En el caso de polvos liofilizados y estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por aspersión que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada en condiciones estériles del mismo. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como lecitina, manteniendo el tamaño de partículas necesario en caso de una dispersión y utilizando tensioactivos . La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ocasionarse mediante la inclusión de un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina en la composición.
Las técnicas y formulaciones se pueden encontrar generalmente en Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa . Para la administración sistémica, se prefiere la inyección, incluyendo intramuscular, intravenosa, intraperitoineal y subcutánea. Para la inyección, los compuestos de la invención se pueden formular en soluciones liquidas, preferentemente en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank o solución de Ringer. Además, los compuestos se pueden formular en forma sólida y volver a disolver o suspender inmediatamente antes de su uso. También se incluyen las formas liofilizadas .
Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden adoptar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ej . , almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa) ; rellenos (por ej . , lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido de calcio) ; lubricantes (por ej . , estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ej . , almidón de papa o glicolato de almidón sódico) ; o agentes humectantes (por ej . , lauril sulfato sódico) . Los comprimidos se pueden recubrir mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden adoptar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones o pueden presentarse como un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ej . , jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas) ; agentes I emulsionantes (por ej . , lecitina o acacia); vehículos no acuosbs (por ej . , aceite ationde, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados) ' y conservantes (por ej . , p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbipo) . Las preparaciones también pueden contener sales amortiguadoras, agentes saborizantes , colorantes y endulzantes según corresponda.
Las preparaciones para administración oral pueden formularse adecuadamente para proporcionar la liberación contrblada del compuesto activo. Para la administración bucaT las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional. Para la administración mediante inhalación, los compuestos para usarse de acuerdo con la presente invención se administran convenientemente en forma de una presentación de aerosol en spray a partir de paquetes presurizados o un nebulízador, con el uso de un propulsor adecuado, por ej . , diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ej . , gelatina para usarse en un inhalador o insuflador se pueden formular de forma que contengan una mezcla del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Los compuestos pueden formularse para administración parenteral por inyección, por ej . , mediante inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en la forma de dosificación unitaria, por ej . , en ampollas o contenedores de múltiples dosis, con un conservador agregado. Las composiciones pueden adoptar formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constituirse con un vehículo adecuado, por ej . , agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.
Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ej . , que contienen bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos .
Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos también se pueden formular como una preparación mantenida. Tales formulaciones de larga actuación se pueden administrar mediante la implantación (por ejemplo, de forma subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico o como derivados solubles en pequeñas cantidades, por ejemplo, como una sal soluble en pequeñas cantidades.
La administración sistémica también puede ser mediante métodos transmucosos o transdérmicos . Para la administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera que se desea penetrar. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, sales biliares y derivados de ácidos fusídicos; también se pueden usar detergentes para facilitar la penetración. La administración transmucosal puede ser mediante atomizadores nasales o usando supositorios. Para la administración tópica, el o los compuestos de la invención se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas tal como se conoce generalmente en la técnica. Una solución de lavado se puede usar localmente para tratar una lesión o inflamación para acelerar la curación .
Las composiciones, si se desea, pueden presentarse en un envase o un dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el principio activo. El paquete puede comprender por ejemplo una lámina metálica o de plástico, tal como un envase de burbujas. El envase o dispositivo dispensador puede estar acompañado por instrucciones para su administración.
, Para las terapias que implican la administración de ácidos nucleicos, el o los compuestos de la invención se pueden formular para una variedad de modos de administración, incluyendo administración sistémica y tópica o localizada. Las técnicas y formulaciones se pueden encontrar qeneralmente en Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. Para la administración sistémica, se prefiere la inyección, incluyendo intramuscular, intravenosa, intraperitoineal, intranodal y subcutánea. Para la inyección, el o los compuestos de la invención se pueden formular en soluciones liquidas, preferentemente en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank o solución de Ringer. Además, el o los compuestos se pueden formular en forma sólida y volver a disolverse o suspenderse inmediatamente antes de su uso. También se incluyen las formas liofilizadas .
En una modalidad, las composiciones que comprenden un influenciador ambiental se administran tópicamente. Es preferible presentar el ingrediente activo, es decir, influenciador amb., como una formulación farmacéutica. El ingrediente activo puede comprender, para la administración tópica, desde alrededor de 0 . 001% a alrededor de 20 % p/p, en peso de la formulación en el producto final, pese a que puede comprender tanto como 30% p/p, preferentemente de alrededor de 1 % a alrededor de 20 % p/p de la formulación. Las formulaciones tópicas de la presente invención comprenden un ingrediente activo junto con uno o más portadores aceptables para eso y opcionalmente cualquier otro ingrediente/s terapéutico/s . El o los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de que sean compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de los mismos.
Al tratar a un paciente que presenta un trastorno de interés, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente o agentes tales como estos. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad del compuesto que da como resultado la mejora de los síntomas o una prolongación en la supervivencia en un paciente.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DEs0 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) . La proporción de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción DL5o/DE5o. Se prefieren los compuestos que ^presentan índices terapéuticos altos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivos celulares y los estudios en animales se pueden usar para formular un espectro de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE50 con poca o nada de toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada.
Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede calcular inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluye la CI50 según se determina en cultivo celular. Dicha información puede utilizarse para determinar de manera más precisa las dosis útiles para los seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante HPLC.
El médico particular puede elegir la formulación, vía de administración y dosificación exactas en vista del estado del paciente. (Véase, por e . , Fingí et ál., in The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975, Cap. 1 p. 1) . Cabe destacar que el médico tratante sabrá cómo y cuándo terminar, interrumpir o ajustar la administración debido a toxicidad o a disfunciones de los órganos. En cambio, el médico tratante también sabrá ajustar el tratamiento a niveles más altos si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluida la toxicidad) . La magnitud de una dosis administrada en el manejo del trastorno neogénico de interés variará según la gravedad de la afección a ser tratada y la vía de administración. La gravedad de la afección puede, por ejemplo, evaluarse, en parte, mediante métodos de evaluación de pronóstico estándar. Además, la dosis y tal vez la frecuencia de dosis, también variarán de acuerdo con la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual. Se puede usar un programa comparable con el discutido anteriormente en la medicina veterinaria.
Dependiendo de las afecciones específicas que se están tratando, tales agentes se pueden formular y administrar de forma sistémica o local. Las técnicas para la formulación y administración se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa . (1990). Las vías adecuadas pueden incluir administración oral, rectal, transdérmica, vaginal, transmucosa o intestinal; administración parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, asi como inyecciones intratecales , intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales , intranasales o intraoculares , entre otras'.
Las composiciones descritas anteriormente se pueden administrar a un sujeto en cualquier formulación adecuada. Además del tratamiento de un trastorno oncológico con formulaciones tópicas de CoQlO, en otros aspectos de la invención, la CoQlO se puede administrar por otros métodos. Por ejemplo, la CoQlO- se puede formular para la administración parenteral, por ej . , para inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular o intratumoral . Se pueden usar otros métodos de administración, por ejemplo, administración liposomal o difusión a partir de un dispositivo impregnado con la composición. Las composiciones se pueden administrar en un solo bolo, inyecciones múltiples o mediante infusión continua (por ejemplo, intravenosamente o por diálisis peritoneal). Para la administración parenteral, las composiciones se formulan preferentemente en una forma esterilizada libre de pirógenos. Las composiciones de la invención también se pueden administrar in vitro a una célula (por ejemplo, para inducir apoptosis en una célula cancerosa en un cultivo in vitro) simplemente agregando la composición al fluido en el cual está contenida la célula.
Dependiendo de las afecciones especificas que se están tratando, tales agentes se pueden formular y administrar de forma sistémica o local. Las técnicas para la formulación y administración se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990). Las vías adecuadas pueden incluir administración oral, rectal, transdérmica, vaginal, transmucosa o intestinal; administración parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares asi como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o infraoculares, entre otras1.
Para la inyección, los agentes de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o amortiguador salino fisiológico. Para tal administración transmucosa, en la formulación se usan los penetrantes apropiados para penetrar la barrera. Tales penetradores son generalmente conocidos en la técnica.
El uso de portadores farmacéuticamente aceptables para formular los compuestos descritos en la presente para poner en práctica la invención en dosificaciones adecuadas para la administración sistémica se encentra dentro del alcance de la invención. Con la elección adecuada de un portador y la práctica de fabricación adecuada, las composiciones de la presente invención, en particular, las formuladas como soluciones, se pueden administrar parenteralmente, tal como por inyección intravenosa. Los compuestos se pueden formular fácilmente usando portadores farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica en dosificaciones adecuadas para la administración oral. Tales portadores permiten que los compuestos de la invención se formulen como comprimidos, pildoras, cápsulas, líquidos, geles> jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un paciente a ser tratado.
Los agentes que se desean administrar intracelularmente se pueden administrar mediante el uso de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, tales agentes se pueden encapsular en liposomas, luego se pueden administrar como se describió anteriormente. Los liposomas son bicapas lípidas estériles con interiores acuosos. Todas las moléculas presentes en una solución acuosa al momento de la formación de liposomas se incorporan el interior acuoso. Los contenidos liposomales se protegen del microambiente externo y, debido a que los liposomas se fusionan con membranas celulares, son administrados eficazmente en el citoplasma celular. Además, debido a su hidrofobicidad, las moléculas orgánicas pequeñas se pueden administrar directamente de forma intracelular .
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para usarse en la presente invención incluyen composiciones donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr su objetivo deseado. Los expertos en la técnica son capaces de determinar las cantidades eficaces, especialmente en vista de la descripción detallada proporcionada en la presente. Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Las preparaciones formuladas para la administración oral pueden estar en forma de comprimidos, grageas, cápsulas o soluciones. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar de una manera conocida, por ej . , mediante procesos de mezclado, disolución, granulado, fabricación de grageas, levigado, emulsificación, encapsulamiento, atrapado o liofilización convencionales. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen preparaciones liquidas o semiliquidas adecuadas para la penetración a través de la piel al sitio donde se requiere tratamiento, tal como bálsamos, lociones, cremas, ungüentos o pastas y gotas adecuadas para la administración al ojo, oído o nariz. Las gotas de acuerdo con la presente invención pueden comprender soluciones o suspensiones acuosas u oleosas estériles y se pueden preparar mediante la disolución del ingrediente activo en una solución acuosa adecuada de un agente bactericida y/o fungicida y/o cualquier otro conservante adecuado y preferentemente incluyen un agente activo de superficie. La solución resultante puede entonces aclararse y esterilizarse mediante filtración y transferirse al recipiente mediante una técnica aséptica. Los ejemplos de agentes bactericidas y fungicidas adecuados para la inclusión en las gotas son nitrato o acetato fenilmercúrico (0.002%), cloruro de benzalconio (0.01%) y acetato de clorhexidina (0.01%). Los solventes adecuados para la preparación de una solución oleosa incluyen glicerol, alcohol diluido y propilenglicol .
Las lociones de acuerdo con la presente invención incluyen las adecuadas para la aplicación a la piel o los ojos. Una loción para los ojos puede comprender una solución acuosa estéril que opcionalmente contiene un bactericida que se puede preparar mediante métodos similares a los usados para la preparación de gotas. Las lociones o bálsamos para la aplicación a la piel también pueden incluir un agente para acelerar el secado y para enfriar la piel, tal como un alcohol o acetona y/o un humectante tal como glicerol o un aceite tal como aceite de castor o aceite de arachis.
¦ Las cremas, ungüentos o pastas de acuerdo con la presente invención son formulaciones semisólidas del ingrediente activo para aplicación externa. Se pueden realizar mediante la mezcla del ingrediente activo en forma finamente dividida o en polvo, solos o en solución o suspensión en un fluido acuoso o no acuoso, con la ayuda de maquinaria adecuada con una base grasosa o no grasosa. La base puede comprender hidrocarburos tales como parafina dura, blanda o liquida, glicerol, cera de abejas, un jabón metálico, un mucilago, un aceite de origen natural tal como aceite de almendra, maíz, arachis, ricino u oliva; grasa de lana o sus derivados o un ácido graso tal como ácido esteárico u oleico junto con un alcohol tal como propilenglicol o macrogeles. La formulación puede incorporar cualquier ingrediente activo de superficie adecuado tal como un ingrediente activo de superficie aniónico, catiónico o no iónico tal como ésteres de sorbitán o derivados de polioxietileno de los mismos. También se pueden incluir agentes de suspensión tales como gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorgánicos tales como sílices silicáceos y otros ingredientes tales como lanolina.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres de ácido graso sintético tales como oleato de etilo o triglicéridos o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. 1 Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener mediante la combinación de los compuestos activos con excipientes sólidos, opcionalmente moliendo una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, luego de la adición de auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o centros de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenos tales como azúcares, incluyendo lactosa, sucrosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona (PVP) . Si se desea, se pueden agregar agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, ágar o ácido alginico o una sal de los mismos tal como alginato de sodio.
Se proporcionan centros de grageas con revestimiento adecuado. A estos efectos, se pueden usar soluciones de azúcar concentrada, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, carbopol gel, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes o mezclas de solventes orgánicos adecuadas. Se pueden agregar tintes o pigmentos a los recubrimientos de comprimidos o grageas para la identificación o caracterización de diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.
Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar oralmente incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, asi como cápsulas suaves, selladas hechas de gelatina y un plastificante tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos mezclados con un relleno como lactosa, aglutinantes como almidones y/o lubricantes como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden agregar establizadores .
. La composición puede incluir un sistema amortiguador, si se desea. Los sistemas amortiguadores se eligen para mantener o amortiguar el pH de las composiciones dentro de un intervalo deseado. El término "sistema amortiguador" o "amortiguador" tal como se usa en la presente se refiere a un agente o agentes solutos que, cuando están en una solución de agua, estabilizan tal solución contra un cambio importante en el pH (o concentración o actividad de ion de hidrógeno) cuando se le agregan ácidos o bases a los mismos. El agente o agentes solutos que son por lo tanto responsables de una resistencia o cambio en el pH a partir de un valor de pH amortiguado de partida en el intervalo antes1 indicado son bien conocidos. Mientras que existen innumerables amortiguadores adecuados, el monohidrato de fosfato de potasio es un amortiguador preferido.
El valor de pH final de la composición farmacéutica puede : variar dentro del intervalo fisiológico compatible. Necesariamente, el valor de pH final es uno que no irrita la piel del ser humano y preferentemente es tal que se facilita el transporte transdérmico del compuesto activo, es decir, CoQlO. Sin violar esta restricción, el pH se puede seleccionar para mejorar la estabilidad del compuesto de CoQlO y ajustar la consistencia cuando sea necesario. En una modalidad, el valor de pH preferido es de alrededor de 3.0 a alrededor de 7.4, más preferentemente alrededor de 3.0 a alrededor de 6.5, más preferentemente de alrededor de 3.5 a alrededor de 6.0.
Para los vehículos para administración tópica preferidos, el componente restante de la composición es agua,1 que es necesariamente purificada, por ej . , agua desionizada. Tales composiciones de vehículo de administración contienen agua en el intervalo de más de alrededor de 50 a alrededor de 95 por ciento, con base en el peso total de la composición. La cantidad específica de agua presente no es crítica, sin embargo, se puede ajustar para obtener la viscosidad (generalmente alrededor de 50 cps a alrededor de 10,000 cps) y/o concentración deseadas de los otros componentes. El vehículo de administración tópica preferentemente tiene una viscosidad de al menos alrededor de 30 centipoises.
Otros potenciadores de la penetración a la piel transdérmica también se pueden usar para facilitar la administración de CoQlO. Son ejemplos los sulfóxidos como dimetilsulfóxido (D SO) y similares; amidas cíclicas como l-dodecilazacicloheptan-2-ona (Azone.TM., una marca comercial registrada de Nelson Research, Inc.) y similares; amidas como ?,?-dimetil acetamida (DMA) N,N-dietil toluamida, ?,?-dimetil formamida, ?,?-dimetil octamida, N, -dimetil decamida y similares; derivados de pirrolidona como N-metil-2-pirrolidona, 2-pirrolidona, ácido 2-pirrolidon-5-carboxilico, N- (2-hidroxietil) -2-pirrolidona o ásteres de ácido graso de los mismos, l-lauril-4-metoxicarbonil-2-pirrolidona, N-seboalquilpirrolidonas y similares; polioles como propilenglicol, etilenegilcol, polietileneglicol , dipropilenglicol, glicerol, hexanotriol y similares; ácidos grasos lineales y ramificados como oleico, linoleico, láurico, valérico, heptanoico, caproico, miristico, isovalérico, neopentanoico, trimetil hexanoico, isoesteárico y similares; alcoholes como etanol, propanol, butariol, octanol, oleilo, estearilo, linoleilo y similares; tensioactivos aniónicos como laurato de sodio, laurilsulfato de sodio y similares; tensioactivos catiónicos como cloruro de benzalconio, cloruro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio y similares; tensioactivos no iónicos como éteres de polioxietileno propoxilados, por ej . , Poloxámero 231, Poloxámero 182, Poloxámero 184 y similares, los ácidos grasos etoxilados, por ej . , T een 20, Myjr 45 y similares, los derivados de sorbitán por ej . , Tween 40, Tween 60, Tween 80, Span 60 y similares, los alcoholes etoxilados, por ej., polioxietilen (4) lauril éter (Brij 30), polioxietilen 2) oleil éter (Brij 93) y similares, lecitina y derivados de lecitina y similares; los terpenos como D-limoneno, -pineno, ß-careno, a-terpineol, carvol, carvona, mentona, óxido de limoneno, óxido a-pineno, aceite de eucalipto y similares. También son adecuados como potenciadores de la penetración a la piel los ácidos y ésteres orgánicos como ácido salicilico, metil salicilato, ácido cítrico, ácido succínico y similares.
En una modalidad, la presente invención proporciona composiciones de CoQlO y métodos para su preparación. Preferentemente, las composiciones comprenden al menos alrededor de 1% a alrededor de 25% de CoQlO p/p. La CoQlO se puede obtener de Asahi Kasei N&P (Hokkaido, Japón) como UBIDECARENONA (USP) . La CoQlO también se puede obtener de Kaneka Q10 como Kaneka Q10 (USP UBIDECARENONA) en forma de polvo (Pasadena, Texas, EUA) . La CoQlO usada en los métodos que se ejemplifican en la presente tienen las siguientes características: los solventes residuales cumplen con el requisito USP 467; el contenido de agua es menor a 0.0%, menor a 0.05% o menor a 0.2%; el residuo a la ignición es 0.0%,i menor a 0.05% o menor a 0.2%, menor a; [sic] el contenido de metal pesado es menor a 0.002% o menor a 0.001%; la pureza entre 98-100% o 99.9% o 99.5%. Los métodos para preparar las composiciones se proporcionan en la sección de ejemplos a continuación.
: En algunas modalidades de la invención, se proporcionan métodos para tratar o prevenir un trastorno oncológico en un humano mediante la administración tópica de la coenzima QIO al humano de forma tal que ocurra el tratamiento o la prevención, donde al humano se le administra una dosis tópica de coenzima QIO en un vehículo tópico donde la coenzima QIO se aplica al tejido diana en un intervalo de alrededor de 0.01 a alrededor de 0.5 miligramos de coenzima Q10 por centímetro cuadrado de piel. En una modalidad, la coenzima Q10 se aplica al tejido diana en un intervalo de alrededor de 0.09 a alrededor de 0.15 mg de CoQlO por centímetro cuadrado de piel. En diversas modalidades, la coenzima Q10 se aplica al tejido diana en un intervalo de alrededor de 0.001 a alrededor de 5.0, alrededor de 0.005 a alrededor de 1.0, alrededor de 0.005 a alrededor de 0.5, alrededor de 0.01 a alrededor de 0.5, alrededor de 0.025 a alrededor de 0.5, alrededor de 0.05 a alrededor de 0.4, alrededor de 0.05 a alrededor de 0.30, alrededor de 0.10 a alrededor de 0.25 o alrededor de 0.10 a 0.20 mg de CoQlO por centímetro cuadrado de piel. En otras modalidades, la coenzima Q10 se aplica al tejido diana a una dosis de alrededor de 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27, 0.28, 0.29, 0.30, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39, 0.40, 0.41, 0.42, 0.43, 0.44, 0.45, 0.46, 0.47, 0.48, 0.49 o 0.5 mg de CoQlO por centímetro cuadrado de piel. En una modalidad, la coenzima Q10 se aplica al tejido diana a una dosis de alrededor de 0.12 mg de CoQlO por centímetro cuadrado de piel. Se debería entender que también se pretende que los intervalos que tienen uno de estos valores como el límite superior o inferior sean parte de la invención, por ej . , alrededor de 0.03 a alrededor de 0.12, alrededor de 0.05 a alrededor de 0.15, alrededor de 0.1 a alrededor de 0.20 o alrededor de 0.32 a alrededor de 0.49 mg de CoQlO por centímetro cuadrado de piel.
En otra modalidad de la invención, la coenzima Q10 se administra en forma de una crema de CoQlO a una dosificación entre 0.5 y 10 miligramos de la crema de CoQlO por centímetro cuadrado de piel, donde la crema de CoQlO comprende entre 1 y 5% de coenzima Q10. En una modalidad, la crema de CoQlO comprende alrededor de 3% de coenzima Q10. En otra modalidad, la crema de CoQlO comprende alrededor de 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5% o 5% de coenzima Q10. En diversas modalidades, la crema de CoQlO se administra a una dosificación de alrededor de 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 o 10 miligramos de crema de CoQlO por centímetro cuadrado de piel. Se debería entender que se pretende que los intervalos que tienen cualquiera de estos valores como el límite superior o inferior también sean parte' de esta invención, por ej . , entre alrededor de 0.5 y alrededor de 1.5 y 2.5 o alrededor de 2.5 y 5.5 mg de CoQlO por centímetro cuadrado de piel.
; En otra modalidad, la coenzima Q10 se administra en forma de una crema de CoQlO a una dosificación de entre 3 y 5 miligramos de la crema de CoQlO por centímetro cuadrado de piel, donde la crema de CoQlO comprende entre 1 y 5% de coenzima Q10. En una modalidad, la crema de CoQlO comprende alrededor de 3% de coenzima Q10. En otra modalidad, la crema de CoQlO comprende alrededor de 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5% o 5% de coenzima Q10. En diversas modalidades, la crema de CoQlO se administra a una dosificación de alrededor de 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, >3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 o 5.0 miligramos de crema de CoQlO por centímetro cuadrado de piel. Se debería entender que se pretende que los intervalos que tienen cualquiera de estos valores como el límite superior o inferior también sean parte de esta invención, por ej . , entre alrededor de 3.0 y alrededor de 4.0, ;alrededor de 3.3 y 5.3 o alrededor de 4.5 y 4.9 mg de CoQlO por centímetro cuadrado de piel.
Determinados aspectos de la invención proporcionan métodos para tratar o prevenir un trastorno oncológico en un humano mediante la administración tópica de coenzima Q10 al humano de forma tal que ocurra el tratamiento o la prevención, donde la coenzima QIO se aplica tópicamente una o más veces por 24 horas durante seis semanas o más.
Determinados aspectos de la invención proporcionan métodos para la preparación de una crema de coenzima QIO al 3% que incluye las etapas de preparar una Fase A, B, C, D y E y combinar todas las fases de forma tal que se forme una emulsión de aceite en agua de crema de CoQlO al 3%.
En algunas modalidades, los ingredientes de la Fase A incluyen alquil C12-15 benzoato NF a 4.00 % p/p, alcohol cetilico NF a 2.00 % p/p, estearato de glicerilo /PEG-100 a 4.5 % p/p y alcohol estearilico NF a 1.50 % p/p mientras que los ingredientes de la Fase B incluyen monoetil éter de dietilenglicol NF a 5.00 % p/p, glicerina USP a 2.00 % p/p, propilenglicol USP a 1.50 % p/p, fenoxietanol NF a 0.475 % p/p, agua purificada USP a 16.725 % p/p y 2% de dispersión de carbómero a 40.00 % p/p y los ingredientes de la Fase C incluyen ácido láctico USP a 0.50 % p/p, solución de lactato de sodio USP a 2.00 % p/p, trolamina NF a 1.30 % p/p y agua purificada USP a 2.50 % p/p. Además, en estas modalidades, los ingredientes de la Fase D incluyen dióxido de titanio USP a 1.00% p/p mientras que los ingredientes de la Fase E incluyen concentrado de 21% de CoQlO a 15% p/p.
En algunas otras modalidades, los ingredientes de la Fase A incluyen triglicérido cáprico/caprilico a 4.00 % p/p, alcohol cetilico NF a 2.00 % p/p, estearato de glicerilo /PEG-100 a 4.5% y alcohol estearilico NF a 1.5 % p/p mientras que los ingredientes de Fase B incluyen monoetil éter de dietilenglicol NF a 5.00 % p/p, glicerina USP a 2.00 % p/p, .propilenglicol USP a 1.50 % p/p, fenoxietanol NF a 0.475 % p/p, agua purificada USP a 16.725 % p/p y 2% de dispersión de carbómero a 40.00 % p/p y los ingredientes de Fase C incluyen ácido láctico USP a 0.50 % p/p, solución de lactato de sodio USP a 2.00 % p/p, trolamina NF a 1.30 % p/p y agua purificada USP a 2.50 % p/p. Además, en estas modalidades, los ingredientes de la Fase D incluyen dióxido de titanio USP a 1.00% p/p mientras que los ingredientes de la Fase E incluyen concentrado de 21% de CoQlO a 15% p/p.
; En determinadas modalidades de la invención, se proporcionan métodos para la preparación de una crema de coenzima Q10 al 3% que incluyen las etapas de (1) agregar los ingredientes de Fase A a un recipiente adecuado y calentar hasta 70-80 grados C en un baño de agua; (2) agregar los ingredientes de Fase B, excluyendo la dispersión de carbómero a un recipiente adecuado y mezclar para formar una Fase B mezclada; (3) colocar los ingredientes de Fase E en un recipiente adecuado y derretirlos a 50-60° C usando un baño de agua para formar una Fase E derretida; (4) agregar la dispersión de carbómero a un tanque de mezcla y calentar hasta 70-80°C mientras se mezcla; (5) agregar la Fase B mezclada al tanque de mezcla mientras se mantiene la temperatura a 70-80°C; (6) agregar los ingredientes de Fase C al tanque de mezcla mientras se mantiene la temperatura a 70-80° C; (7) agregar los ingredientes de Fase D al tanque de mezcla y seguir mezclando y homogeneizando los contenidos del tanque de mezcla; luego (8) detener la homogeneización y enfriar los contenidos del tanque de mezcla hasta 50-60° C; luego (9) discontinuar la mezcla y agregar la Fase E derretida al tanque de mezcla para formar una dispersión; (10) luego se vuelve a mezclar hasta que la dispersión sea suave y uniforme, luego (11) enfriar los contenidos del tanque de mezcla hasta 45-50 °C.
En algunas otras modalidades de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la crema de CoQlO al 3%. La crema incluye la fase A con C12-15 alquil benzoato a 4.00 % p/p de la composición, alcohol cetilico a 2.00 % p/p de la composición, alcohol estearilico a 1.5 % p/p, estearato de glicerilo y PEG-100 a 4.5 % p/p; una fase B con glicerina a 2.00 % p/p, propilenglicol a 1.5 % p/p, etoxidiglicol a 5.0 % p/p, fenoxietanol a 0.475 % p/p, una dispersión de carbómero a 40.00 % p/p, agua purificada a 16.725 % p/p; una fase C con trietanolamina a 1.300 % p/p, ácido láctico a 0.500 % p/p, solución de lactato de sodio a 2.000 % p/p, agua a 2.5 % p/p; ,una fase D con dióxido de titanio a 1.000 % p/p y una fase E con concentrado de 21% de CoQlO 21% a 15.000 % p/p. En algunas modalidades, la dispersión de carbómero incluye agua, fenoxietanol , propilenglicol y carbómero 940.
En algunas otras modalidades de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende crema, de CoQlO al 3%. La crema incluye la fase A con triglicérido cáprico/caprilico a 4.00 % p/p de la composición, alcohol cetilico a 2.00 % p/p de la composición, alcohol estearilico a 1.5 % p/p, estearato de glicerilo y PEG-100 a 4.5 % p/p; una fase B con glicerina a 2.00 % p/p, propilenglicol a 1.5 % p/p, etoxidiglicol a 5.0 % p/p, fenoxietanol a 0.475 % p/p, una dispersión de carbómero a 40.00 % p/p, agua purificada a 16.725 % p/p; una fase C con trietanolamina a 1.300 % p/p, ácido láctico a 0.500 % p/p, solución de lactato de sodio a 2.000 % p/p, agua a 2.5 % p/p; una fase D con dióxido de titanio a 1.000 % p/p, y una fase E con concentrado de 21% de CoQlO a 15.000 % p/p. En algunas modalidades, la dispersión de carbómero incluye agua, fenoxietanol, propilenglicol y carbómero 940.
En algunas otras modalidades de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende crema de CoQlO al 1.5%. La crema incluye la fase A con C12-15 alquil benzoato a 5.000 % p/p, alcohol cetilico a 2.000 % p/p, alcohol estearilico a 1.5 % p/p, estearato de glicerilo y estearato de PEG-100 a 4.500 % p/p; una fase B con glicerina a 2.000 % p/p, propileno a 1.750 % p/p, etoxidiglicol a 5.000 % p/p, fenoxietanol a 0.463 % p/p, una dispersión de carbómero a 50 % p/p y agua purificada a 11.377 % p/p; una fase C con trietanolamina a 1.3 % p/p, ácido láctico a 0.400 % p/p, solución de lactato de sodio a 2.000 % p/p y agua a 4.210 % p/p; una fase D con dióxido de titanio a 1.000 % p/p y una fase E con concentrado de 21% de CoQlO a 1.500 % p/p.
En algunas otras modalidades de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende crema de CoQlO al 1.5%. La crema incluye la fase A con triglicérido cáprico/caprilico a 5.000 % p/p, alcohol cetilico a 2.000 % p/p, alcohol estearilico a 1.5 % p/p, estearato de glicerilo y estearato de PEG-100 a 4.500 % p/p; una fase B con glicerina a 2.000 % p/p, propileno a 1.750 % p/p, etoxidiglicol a 5.000 % p/p, fenoxietanol a 0.463 % p/p, una dispersión de carbómero a 50 % p/p y agua purificada a 11.377 % p/p; una fase C con trietanolamina a 1.3 % p/p, ácido láctico a 0.400 % p/p, solución de lactato de sodio a 2.000 % p/p y agua a 4.210 % p/p; una fase D con dióxido de titanio a 1.000 % p/p y una fase E con concentrado de 21% de CoQlO a 1.500 % p/p. En algunas modalidades, la dispersión de carbómero incluye agua, fenoxietanol y propilenglicol . 1. Terapias de combinación En algunas modalidades, un influenciador ambiental de la invención y/o composiciones farmacéuticas del mismo se pueden usar en una terapia de combinación con al menos un agente terapéutico adicional, que puede ser un influenciador ambiental diferente y/o una composición farmacéutica del mismo. El influenciador ambiental y/o la composición farmacéutica del mismo y el otro agente terapéutico pueden actuar de forma aditiva o, más preferentemente, sinérgica. En una modalidad, un influenciador ambiental y/o composición farmacéutica del mismo se administra junto con la administración de otro agente terapéutico. En otra modalidad, un compuesto y/o composición farmacéutica del mismo se administra antes o después de la administración de otro agente terapéutico.
En una modalidad, los métodos terapéuticos de la invención comprenden agentes adicionales. Por ejemplo, en una modalidad, un agente adicional para usarse en los métodos terapéuticos de la invención es un agente quimioterapéutico .
Los agentes quimioterapéuticos generalmente pertenecen a varias clases incluyendo, por ejemplo: 1. Inhibidores de la topoisomerasa II (antibióticos citotóxicos) tales como las antraciclinas/antracenedionas; por , ej . , doxorubicina, epirubicina, idarubicina y nemorubicina, las antraquinonas, por ej . , mitoxantrona y losox'antrona y las podofilotoxinas, por ej . , etoposida y teniposida; 2. Agentes que afectan la formación de microtúbulos (inhibidores mitóticos) tales como alcaloides vegetales (por ej . , un compuesto que pertenece a la familia de moléculas alcalinas que contienen nitrógeno derivadas de plantas que son biológicamente activas y citotóxicas) , por ej . , : taxanos, por ej . , paclitaxel y docetaxel y los alcaloides de la vinca; por ej . , vinblastina, vincristina y vinorelbina y los derivados de podofilotixina; 3. Agentes alquilantes tales como mostazas nitrogenada, compuestos de etilenimina, alquilsulfonatos y otros compuestos con una acción alquilante tal como nitrosoureas, dacarbazina, ciclofosfamida, ifosfamida y melfalán; 4. Antimetabolitos (inhibidores de nucleósido) , por ejemplo, folatos, por ej . , ácido! fólico, fiuropirimidinas, análogos de pirimidina o purina como 5-fluorouracilo, capecitabina, gemcitabina, metotrexato y edatrexato; 5. Inhibidores de topoisomerasa I, cómo topotecán, irinotecán y 9-nitrocamptotecina y derivados de camptotecina y 6. Compuestos/complejos de platino como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino . Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos para usarse en los métodos de la invención incluyen, a modo no taxativo, amifostina (etiol), cisplatino, dacarbazina (DTIC) , dactinomicina, mecloretamina (mostaza nitrogenada) , estreptozocina, ciclofosfamida, carmustina (BCNU) , lomustina (CCNU) , doxorubicina (adriamicina) , doxorubicina lipo (doxil) , gemcitabina (gemzar) , daunorubicina, daunorubicina lipo (daunoxoma) , procarbazina, mitomicina, citarabina, etopósido, metotrexato, 5-fluorouracilo (5-FU) , vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol) , docetaxel (taxotere) , aldesleucina, asparaginasa, busulfán, carboplatino, cladribina, camptotecina, CPT-I 1, 10-hidroxi-7-etil-camptotecina (SN38), dacarbazina, S-I capecitabina, ftorafur, 5 'desoxiflurouridina, UFT, eniluracil, desoxicitidina, 5-azacitosina, 5-azadesoxicitosina, alopurinol, 2-cloro adenosina, trimetrexato, aminopterina, metilen-1 O-desazaaminopterina (MDAM) , oxaplatino', picoplatino, tetraplatino, satraplatino, platino-DACH, ormaplatino, CI-973, JM-216 y análogos de los mismos, epirubicina, fosfato de etopósido, 9-aminocamptotecina, 10, 11-metilendioxicamptotecina, karenitecina, 9-nitrocamptotecina, TAS 103, vindesina, mostaza de L-fenilalanina, ifosfamidamefosfamida, perfosfamida, trofosfamida carmustina, semustina, epotilonas A-E, tomudex, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, amsacrina, etopósido fosfato, karenitecina, aciclovir, valaciclovir, ganciclovir, amantadina, rimantadina, lamivudina, zidovudina, bevacizumab, trastuzumab, rituximab, 5-Fluorouracilo, Capecitabina, Pentostatina, Trimetrexato, Cladribina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, idarubicina, mesna, irinotecán, mitox ntrona, topotecán, leuprolida, megestrol, melfalán, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobroman, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinorelbina, clorambucilo, cisplatino, doxorübicina, paclitaxel (taxol) y bleomicina y combinaciones de los mismos que son fácilmente aparentes para un experto en la técnica con base en el estándar apropiado de cuidado para un tumor o cáncer particulares.
En otra modalidad, un agente adicional para usarse en terapias de combinación de la invención es un agente biológico .
Los agentes biológicos (también denominados biológicos) son los productos de un sistema biológico, por ej . , un organismo, una célula o un sistema recombinante . Los ejemplos de tales agentes biológicos incluyen moléculas de ácido nucleico (por ej . , moléculas de ácido nucleico antisentido) , interferones , interleucinas , factores estimulantes de colonias, anticuerpos, por ej . , anticuerpos monoclonales, agentes anti-angiogénesis y citocinas. Los ejemplos de agentes biológicos se discuten en más detalle a continuación y generalmente pertenecen a varias clases incluyendo, por ejemplo: 1. Hormonas, análogos hormonales y complejos hormonales, por ej . , estrógenos y análogos de estrógenos, progesterona, análogos de progesterona y progestinas, andrógenos, adrenocorticoesteroides, antiestrógenos, antiandrógenos, antitestosteronas, inhibidores adrenales estroideos y hormonas anti-leutenizantes y 2. Enzimas, proteínas, péptidos, anticuerpos policlonales y/o monoclonales, como interleucinas, interferones, factor estimulante de colonias, etc.
En una modalidad, el biológico es un interferón. Los interferones (IFN) son un tipo de agente biológico que ocurre naturalmente en el cuerpo. Los interferones también se producen en el laboratorio y se suministran a pacientes con cáncer en terapia biológica. Se ha mostrado que mejoran la forma en la que el sistema inmune de un paciente con cáncer actúa contra las células cancerosas.
Los interferones pueden actuar directamente en las células cancerosas para ralentizar su crecimiento o pueden hacer que las células cancerosas se conviertan en células con un comportamiento más normal. Algunos interferones también pueden estimular los linfocitos citolíticos naturales (NK) , células T y los macrófagos, que son tipos de glóbulos blancos en la corriente sanguínea que ayudan a luchar contra las células cancerosas.
En una modalidad, el biológico es una interleucina . Las interleucinas (IL) estimulan el crecimiento y la actividad de muchas células inmunes. Son proteínas (citocinas y quimiocinas) que se producen naturalmente en el cuerpo, pero también se pueden hacer en el laboratorio.
Algunas interleucinas estimulan el crecimiento y la actividad de las células inmunes, tal como linfocitos, que funcionan para destruir las células cancerosas.
En otra modalidad, el biológico es un factor estimulante de colonias .
Los factores estimulantes de colonias (CSF) son proteínas que se les suministran a los pacientes para fomentar la producción de más células sanguíneas por las células madre dentro de la médula ósea. El cuerpo constantemente necesita nuevos glóbulos blancos, qlóbulos rojos y plaquetas, especialmente cuando tiene cáncer. Los CSF se administran, junto con la quimioterapia, para ayudar a estimular el sistema inmune. Cuando los pacientes con cáncer reciben quimioterapia, la capacidad de la médula ósea de producir nuevos glóbulos se suprime, haciendo que los pacientes sean más propensos a desarrollar infecciones. Algunas partes del sistema inmune no pueden funcionar sin los glóbulos, por lo tanto los factores estimulantes de colonias fomentan la producción de glóbulos blancos, plaquetas y glóbulos rojos por las células madre de la médula ósea.
Con una producción celular adecuada, otros tratamientos para el cáncer pueden seguir permitiendo que los pacientes reciban de forma segura dosis más altas de quimioterapia .
¦ En otra modalidad, el biológico es un anticuerpo. Los anticuerpos, por ej . , anticuerpos monoclonales, son agentes producidos en el laboratorio que se unen a las células cancerosas .
Cuando los agentes que destruyen el cáncer se introducen al cuerpo, buscan a los anticuerpos y destruyen las células cancerosas. Los agentes de anticuerpos monoclonales no destruyen las células sanas. Los anticuerpos monoclonales logran su efecto terapéutico mediante diversos mecanismos. Pueden tener efectos directos para producir apoptosis o muerte celular programada. Pueden bloquear los receptores del factor del crecimiento, deteniendo de forma eficaz la proliferación de células tumorales. En las células que expresan anticuerpos monoclonales, pueden lograr la formación de anticuerpos anti-idiotipo .
Los ejemplos de anticuerpos que se pueden usar en el tratamiento de combinación de la invención incluyen anticuerpos anti-CD20, tal como, a modo no taxativo, cetuximab, tositumomab, rituximab e ibritumomab. Los anticuerpos anti-HER2 también se pueden usar en combinación con un influenciador ambiental para el tratamiento del cáncer. En una modalidad, el anticuerpo anti-HER2 es trastuzumab (herceptin) . Otros ejemplos de anticuerpos que se pueden usar en combinación con un influenciador ambiental para el tratamiento de cáncer incluyen anticuerpos anti-CD25 (por ej . , alemtuzumab) , anticuerpos anti-CD-22 (por ej . , epratuzumab) y anticuerpos anti-CD33 (por ej . , gemtuzumab ozogamicina) . Los anticuerpos anti-VEGF también se pueden usar en combinación con un influenciador ambiental para el tratamiento de cáncer. En una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab. En otras modalidades, el agente biológico es un anticuerpo que es un anticuerpo anti-EFGR, por ej . , cetuximab. Otro ejemplo es el anticuerpo anti-glucoproteina 17-1A, edrecolomab .
En otra modalidad, el biológico es una citocina. La terapia de citocinas usa proteínas (citocinas) para ayudar a que el sistema inmune de un sujeto reconozca y destruya aquellas células que son cancerosas. Las citocinas se producen naturalmente en el cuerpo por el sistema inmune, pero también se pueden producir en el laboratorio. Esta terapia se usa con melanoma avanzado y con terapia adyuvante (terapia que se da luego del tratamiento primario contra el cáncer o además del mismo) . La terapia de citocinas alcanza todas las partes del cuerpo para destruir las células cancerosas y prevenir el crecimiento de tumores .
En otra modalidad, el biológico es una proteina de fusión. Por ejemplo, Apo2L/TRAIL recombinante humano (Genentech) se puede usar en una terapia de combinación. Apo2L/TRAIL es el primer agonista de receptor pro-apoptótico dual diseñado para activar los receptores pro-apoptóticos DR4 y DR5, que están implicados en la regulación de la apoptosis (muerte celular programada) .
. En una modalidad, el biológico es una molécula de ácido nucleico antisentido.
Tal como se usa en la presente, un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteina, por ej . , complementaria a la cadena de codificación de una molécula de ADNc de doble cadena, complementaria de una secuencia de ARNm o complementaria de la cadena de codificación de un gen. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido puede unirse mediante un hidrógeno a un ácido nucleico sentido.
En una modalidad, un agente biológico es una molécula de ARNip, por ej . , de una molécula que potencia la angiogénesis, por ej . , bFGF, VEGF y EGFR. En una modalidad, un agente biológico que inhibe la angiogénesis media el ARNi. La interferencia de ARN (ARNi) es una técnica pos-transcripcional de silenciamiento de gen direccionado que usa un ARN de doble cadena (ARNdc) para degradar el ARN mensajero (ARNm) que contiene la misma secuencia que el ARNdc (Sharp, P.A. y Zamore, P.D. 287, 2431-2432 (2000); Zamore, P.D., et ál. Cell 101, 25-33 (2000). Tuschl, T. et ál. Genes Dev. 13, 3191-3197 (1999); Cottrell TR, and Doerihg TL. 2003. Trends Microbiol. 11:37-43; Bushman F.2003. Mol Therapy. 7:9-10; McManus MT and Sharp PA. 2002. Nat Rev Genet. 3,737-47) . El proceso ocurre cuando una ribonucleasa endógena escinde el ARNdc más largo en ARN más cortos, por ej . , de 21 o 22 nucleótidos de longitud, denominados ARN interferentes pequeños o ARNip. Los segmentos más cortos de ARN median entonces la degradación del ARNm diana. Los kits para la síntesis de ARNi se encuentran comercialmente disponibles en, por ej . , New England Biolabs o Ambion. En una modalidad, una o más químicas para usarse en ARN antisentido se pueden emplear en moléculas que median el AR i.
El uso de ácidos nucleicos antisentido para regular por disminución la expresión de una proteína particular en una célula es conocido en la técnica (véase, por ej . , Weintraub, H. et ál., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, tomo 1(1) 1986; Askari, F.K. and McDonnell, W.M. (1996) N. Eng. J. ed. 334:316- 318; Bennett, .R. y Schwartz, S.M. (1995) Circulation 92:1981-1993; Mercóla, D. y Cohén, J.S. (1995) Cáncer Gene Ther. 2:47-59; Rossi, JJ. (1995) Br. Med. Bull. 51.217-225; Wagner, R.W. (1994) Nature 372:333-335). Una molécula de ácido nucleico antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la cadena de codificación de otra molécula de ácido nucleico (por ej . , una secuencia de ARNm) y por lo tanto es capaz de unirse mediante hidrógeno a la cadena de codificación de la otra molécula de ácido nucleico. Las secuencias antisentido complementarias de una secuencia de un ARNm pueden ser complementarias de una secuencia encontrada en la región de codificación del ARNm, la región 5' o 3' no traducida del ARNm o una región que une la región de codificación y una región no traducida (por ej . , en la unión de la región no traducida 5' y la región de codificación). Además, un ácido nucleico antisentido puede ser complementario en secuencia de una región reguladora del gen que codifica el ARNm, por ejemplo una secuencia de inicio de transcripción o un elemento regulador. Preferentemente, un ácido nucleico antisentido se diseña para ser complementario de una región anterior o que abarca el codón de inicio en la cadena de codificación o en la región 3' no traducida de un ARNm.
Debido a las secuencias de cadena de codificación de una molécula que potencian la angiogénesis , los ácidos nucleicos antisentido de la invención se pueden diseñar de acuerdo con las reglas del apareamiento de bases Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria de toda la región de codificación del ARNm, pero más preferentemente es un oligonucleótido que es antisentido solo a una porción de la región de codificación o dé no codificación del ARNm. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario de la región que rodea el sitio de inicio de traducción del ARNm. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, alrededor de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud.
Un ácido nucleico antisentido de la invención se puede construir usando síntesis química y reacciones de ligación enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ej . , un oligonucleótido antisentido) se puede sintetizar químicamente usando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de diversas maneras diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ej . , se pueden usar derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodóuracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilof dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N-6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, ?-6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiduracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3) y 2,6-diaminopurina . Para inhibir la expresión en células, se pueden usar uno o más oligonucleótidos antisentido. De manera alternativa, el ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente usando un vector de expresión en el cual se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito desde el ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido para un ácido nucleico diana de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección) .
En aun otra modalidad, la molécula de ácido nucleico antisentido de la invención es una molécula de ácido nucleico a-anomérica. Una molécula de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos de doble cadena específicos con ARN complementario donde, a diferencia de las a-unidades habituales, las cadenas son paralelas entre sí (Gaultier et ál. (1987) Nucleic Acids . Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido puede comprender también un 2 ' -o-metilribonucleótido (Inoue et ál. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131- 6148) o un análogo quimérico de ARN-ADN (Inoue et ál. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).
En otra modalidad, un ácido nucleico antisentido de la invención es un compuesto que media el ARNi . Los agentes que interfieren en el ARN incluyen, a modo no taxativo, moléculas de ácido nucleico que incluyen moléculas de ARN que son homologas al la secuencia genómica o el gen diana, "ARN pequeño interférente" (ARNpi) , "horquillado corto" o "ARN horquillado corto" (ARNhc) y pequeñas moléculas que interfieren con o la expresión de un gen diana mediante ARN interférente (ARNi) o que la inhiben. La interferencia del ARN es una técnica pos-transcripcional de silenciamiento de genesi direccionado que usa un ARN de doble cadena (ARNdc) para degradar el ARN mensajero (ARNm) que contiene la misma secuencia que el ARNdc (Sharp, P.A. y Zamore, P.D. 287, 2431-2432 (2000); Zamore, P.D., et ál . Cell 101, 25-33 (2000). Tuschl, T. et ál. Genes Dev. 13, 3191-3197 (1999)). El proceso ocurre cuando una ribonucleasa endógena escinde el ARNdc más largo en ARN más cortos, por e . , de 21 o 22 nucleótidos de longitud, denominados ARN interferentes pequeños o ARNip. Los segmentos más cortos de ARN median entonces la degradación del ARNm diana. Los kits para la síntesis de ARNi se encuentran comercialmente disponibles en, por ej . , New England Biolabs o Ambion. En una modalidad, se pueden usar una o más químicas descritas anteriormente para usarse en el ARN antisentido.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas que, por ej . , inhiben la angiogénesis, se pueden introducir al sujeto en una forma adecuada para la expresión de la proteína codificada en las células del sujeto también se pueden usar en los métodos de la invención [sic] . Los ejemplos de moléculas que inhiben la angiogénesis incluyen, a modo no taxativo, TSP-I, TSP-2, IFN-g, IFN-a, angiostatina, endostatina, tumastatina, canstatina, VEGI, PEDF, vasohibina y el fragmento de 16 kDa de la prolactina 2-Metoxiestradiol (véase, Kerbel (2004) J. Clin Invest 114:884, para una revisión).
Por ejemplo, una secuencia de ADNc de longitud completa o parcial se clona en un vector de expresión recombinante y el vector se transfecta en una célula usando técnicas de biología molecular estándar. El ADNc se puede obtener, por ejemplo, mediante amplificación usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) o analizando una biblioteca de ADNc apropiada. Las secuencia- de nucleótidos del ADNc se pueden usar para el diseño de cebadores de PCR que permiten la amplificación de un ADNc mediante métodos estándar de PCR o para el diseño de una sonda de hibridación que se puede usar para analizar una biblioteca de ADNc usando métodos de hibridación estándar. Luego del aislamiento o amplificación del ADNc, el fragmento de ADN se introduce en un vector de expresión adecuado.
Los ejemplos de agentes biológicos para usarse en los métodos de la invención incluyen, a modo no taxativo, gefitinib (Iressa), anastrazol, dietilstilbesterol, estradiol, premarin, raloxifeno, progesterona, noretinodrel, estisterona, dimestisterona, acetato de megestrol, acetato de medroxiprogesterona, caproato de hidroxiprogesterona, noretisterona, metiltestosterona, testosterona, dexametasona, prednisona, Cortisol, solumedrol, tamoxifeno, fulvestrant, toremifeno, aminoglutetimida, testolactona, droloxifeno, anastrozol, bicalutamida, flutamida, nilutamida, goserelina, flutamida, leuprolida, triptorelina, aminoglutetimida, mitotano, goserelina, cetuximab, erlotinib, imatinib, Tositumomab, Alemtuzumab, Trastuzumab, Gemtuzumab, Rituximab, Ibritumomab tiuxetano, Bevacizumab, Denileucina diftitox, Daclizumab, interferón alfa, interferón beta, anti-4-???, anti-4-lBBL, anti-CD40, anti-CD 154, anti- OX40, anti-OX40L, anti-CD28, anti-CD80, anti-CD86, anti-CD70, anti-CD27, anti- HVEM, anti-LIGHT, anti-GITR, anti-GITRL, anti-CTLA-;4, OX40L soluble, 4-IBBL soluble, CD154 soluble, GITRL soluble, LIGHTsoluble, CD70 soluble, CD80 soluble, CD86 soluble, CTLA4-Ig soluble, GVAX® y combinaciones de los mismos que son fácilmente evidentes para un experto en la técnica con base en el estándar apropiado de cuidado de un tumor o cáncer particulares. Las formas solubles de agentes se pueden realizar como, por ejemplo, proteínas de fusión, mediante unión de forma operativa del agente con, por ejemplo, una región Ig-Fc.
, Cabe destacar que se puede administrar más de un agente adicional, por ej . , 1, 2, 3, 4, 5, en combinación con un influenciador ambiental. Por ejemplo, en una modalidad, se pueden administrar dos agentes quimi'oterapéuticos en combinación con un influenciador ambiental. En otra modalidad, se pueden adminsitrar un agente quimioterapéutico, un agente biológico y un influenciador ambiental.
; Se pueden usar diversas formas de los agentes biológicos. Estas incluyen, a modo no taxativo, tales formas como moléculas proforma, moléculas no cargadas, complejos moleculares, sales, éteres, ésteres, amidas y similares que se activan biológicamente cuando se implantan, inyectan o insertan de otro modo en el tumor. ' Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no se debería considerar como limitantes. El contenido de todas las referencias y patentes publicadas y solicitudes de patente citadas en toda la solicitud se incorporan a la presente mediante esta referencia .
EJEMPLIFICACION DE LA INVENCIÓN ; Ahora que la invención se describió en términos generales, será más fácilmente comprendida con referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen simplemente a efectos de ilustración de algunos aspectos y modalidades de la presente invención y que no pretenden limitar la invención, como lo reconocerá un experto en la técnica a partir de las enseñanzas anteriores y los ejemplos a continuación, que otros ensayos, tipos celulares, agentes, construcciones o métodos de análisis de datos, todo a modo no taxativo, se pueden emplear sin alejarse del alcance de la invención tal cual es reivindicada.
Los contenidos de cualesquiera patentes, solicitudes de patente, publicaciones de patente o artículos científicos a los que se hace referencia en cualquier parte de esta solicitud se incorporan en su totalidad a la presente .
La puesta en práctica de la presente invención empleará, cuando corresponda y a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, virología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas se describen en la literatura. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., ed. por Sambrook y Russell (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 2001); el tratado Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Using Antibodies, segunda edición por Harlow y Lañe, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1999; Current Protocole in Cell Biology, ed. por Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford y Yamada, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, 1999 y PCR Protocols, ed. por Bartlett et ál . , Humana Press, 2003.
Ejemplo 1: Identificación de CoQlO como una MIM ! Para evaluar la CoQlO como una posible MIM, la CoQlO en forma oxidada se agregó de forma exógena a un panel de líneas celulares incluyendo líneas celulares de cáncer y líneas celulares de control normal y se analizaron los cambios inducidos al perfil de microambiente celular para cada ; línea celular en el panel. Los cambios en la morfología/fisiología celular y la composición celular, incluyendo niveles de ARNm y de proteína, se evaluaron y compararon para las células enfermas en comparación con las células normales. Los resultados de estos experimentos identificaron a la CoQlO y, en particular, la forma oxidada de la CoQlO, como una MIM.
En un primer conjunto de experimentos, los cambios en la morfología/fisiología celular se evaluaron mediante la examinación de la sensibilidad y la respuesta apoptotica de las células a la CoQlO. Un panel de lineas celulares de la piel incluyendo lineas celulares de control (cultivo primario de queratinocitos y melanocitos) y diversas lineas celulares de cánceres de piel (SK-MEL-28, un melanoma de piel no metastásico; SK- EL-2, un melanoma de piel metastásico o SCC, un carcinoma de célula escamosa; PaCa2, una linea celular de cáncer pancreático o HP-G2, una linea celular de cáncer de hígado) se trataron con diversos niveles de coenzima Q10. Los resultados de estos experimentos demostraron que las líneas celulares de cáncer presentaban una respuesta dependiente de la dosis alterada en comparación con las líneas celulares de control con una inducción de apoptosis y muerte celular en las células cancerosas únicamente. Los ejemplos de experimentos se describen en detalle en el Ejemplo 3 a continuación.
Los ensayos se usaron luego para evaluar los cambios en la composición de la célula luego del tratamiento con CoQlO. Los cambios en la expresión génica a nivel del ARNm se analizaron usando metodología de matriz de PCR en tiempo real. Los ejemplos de experimentos se describen en detalle en los Ejemplos 6 y 9-13 a continuación. En experimentos complementarios, los cambios en la expresión génica a nivel de la proteína se analizaron usando metodología de micromatriz de anticuerpos, electroforesis en gel bidimensional seguida por identificación de proteínas usando caracterización de espectrometría de masas y análisis de transferencia western. Los ejemplos de experimentos se describen en detalle a continuación en los Ejemplos 4, 7 y 8 respectivamente. Los resultados de estos ensayos demostraron que los cambios significativos en la expresión génica, tanto a nivel del ARNm como de la proteína, se indujeron en las líneas celulares examinadas debido a la adición de la forma oxidada de la CoQlO. Se encontró que los genes modulados mediante el tratamiento de la CoQlO se agrupaban en diversas vías celulares, incluyendo apoptosis, biología del cáncer y crecimiento celular, glucólisis y metabolismo, transporte molecular y señalización celular.
Los experimentos se realizaron para confirmar el ingreso de la CoQlO a las células y para determinar el nivel y la forma de la CoQlO presente en las células. En particular, el nivel de la coenzima Q10, así como la forma de CoQlO (es decir, oxidada o reducida) , presente en la mitocondria se determinó mediante el análisis de preparaciones enriquecidas con mitocondria a partir de células tratadas con CoQlO. Se confirmó que el nivel de la coenzima Q10 presente en la mitocondria aumentó en una forma dependiente del tiempo y la dosis con la adición de Q10 exógena. En un resultado sorprendente e inesperado, se determinó que la CoQlO estaba presente en la mitocondria principalmente en forma oxidada. Además, los cambios en los niveles de proteínas de muestras enriquecidas con mitocondrias se analizaron usando electroforesis en gel 2-D e identificación de proteínas mediante caracterización de espectrometría de masas. Los resultados de estos experimentos demostraron que los niveles de la forma oxidada de la CoQlO en la mitocondria en el transcurso del tiempo examinado se correlacionaron con una amplia variedad de cambios celulares, según se evidencia mediante la modulación de ARNm y los niveles de proteína para proteínas específicas relacionadas con vías metabólicas y apoptóticas. Los ejemplos de experimentos se describen en detalle en el Ejemplo 5 a continuación.
Los resultados descritos por los Solicitantes en la presente identificaron la CoQlO de la molécula endógena y, en particular, la forma oxidada de la CoQlO, como una MIM. Por ejemplo, los resultados identificaron la CoQlO como una MIM, debido a que se observó que la CoQlO induce cambios en la expresión génica tanto a nivel del ARNm como de la proteína. Los resultados identificaron que la CoQlO tenía un carácter multidimensional, debido a que la CoQlO indujo cambios diferenciales en la morfología/fisiología celular y la composición celular (por ej . , cambios diferenciales en la expresión génica tanto a nivel del ARNm como de la proteina) en un estado de enfermedad (por ej . , cáncer) en comparación con un estado normal (por ej . , no canceroso). Además, los resultados identificaron que la CoQlO tenia un carácter multidimensional en el sentido de que la CoQlO era capaz de ingresar a una célula y por lo tanto presentó efectos terapéuticos y de portador.
Ejemplo 2 : Métodos par identificar procesos relevantes para la enfermedad y biomarcadores para i trastornos oncológicos I i A partir de los ensayos basados en células donde las lineas celulares se trataron con una molécula de interés, las diferencias entre las células tratadas en comparación con las no tratadas se evalúa mediante ensayos de ARNm, matrices de anticuerpos de proteina y electroforesis en gel 2D. Las proteínas identificadas a partir de análisis de muestras comparativas a ser moduladas por la MI o el cambiador Epi se evalúan desde una perspectiva de Systems Biolqgy con un análisis de vía (software Ingenuity IPA) y una revisión de la literatura conocida. Las proteínas identificadas como posibles compuestos terapéuticos o biomarcadores diana se someten a ensayos de confirmación tales como análisis de transferencia Western, inactivación de ARNip o producción de proteina recombinante y métodos de caracterización .
Materiales y métodos para los ejemplos 3-8 Solución de coenzima Q10 Una coenzima Q10 de 500 µ? (5% de isopropanol en medio, de crecimiento celular) se preparó de la siguiente manera. Una solución de coenzima Q10 de 500 µ? y 10 mL se volvió a prepar cada vez. Peso molecular: 863.34 (0.0005 mol/L) (0.010 L) (863.34 g/mol) = 0.004317 g Para realizar 10 mL de una solución de 500 µ?, se pesaron 4.32 mg de coenzima Q10 en un tubo falcon de 15 mL y se agregaron 500 i de isopropanol. La solución se calentó en un baño de agua a 50-60°C mientras se agitaba para disolverla completamente. A esta solución, se le agregaron 9.5 mL de medio (el mismo medio donde se cultivaron las células) .
Cultivo celular Las células se obtuvieron de la American Type Culture Collection [Colección americana de cultivos tipo] o Gibco.
Las células se cultivaron en medio DMEM/F-12 complementado con 5% de suero bovino fetal, 0.25 ug/mL de Anfotericina, 100 ug/mL de estreptomicina y 100 U mL-1 de penicilina. Las células se mantuvieron en una atmósfera de 95% de aire y 5% de Co2 a 37 grados C.
Tratamiento con coenzima Q10 y aislamiento total de proteína ' Las células se cultivaron hasta una confluencia de 85% antes de la exposición con Q10. El medio complementado se acondicionó con Q10 y concentraciones de 50 y 100 micromoles. Los matraces se trataron con control, 50 µ? de Q10 y 100 µ? de Q10 por triplicado. La proteina se aisló del matraz tratado y de control luego de 4, 8, 12 y 24 horas. Para el aislamiento de proteínas, las células se lavaron tres veces con 5 mL de PBS helado a un pH de 7.4. Las células se rasparon en 3 mL de PBS, se sedimentaron por centrifugación y se volvieron a suspender en un amortiguador de lisis a pH 7. (80 mM de TRIS-HC1, 1% de SDS con inhibidores de proteasa y fosfotasa) . Las concentraciones de proteína se cuantificaron usando el método BCA.
Lineas celulares Las líneas celulares listadas a continuación se propagaron y se estableció un banco celular para cada una. Se realizó una producción a gran escala de células para diversos ensayos y el material se extrajo para ser analizado. En general, cuando un medio específico para células no era necesario para mantener las líneas i celulares, el medio usado para el crecimiento celular era DMEMF-12 con 5% de suero. Las células se cultivaron típicamente hasta 75-80% de confluencia (espaciado claro) antes de separar y usar los ensayos celulares y luego siguieron métodos de práctica estándar. Las siguientes líneas celulares se establecieron para los experimentos: , SK-MEL-28 (melanoma de piel no metastásico) SK-MEL-2 (melanoma de piel metastásico) 1 HEKa (queratinocitos, control de piel) HEMa (melanocito, control de piel) , nFIB (fibroblastos neonatales) HEP-G2 (cáncer de hígado) [línea celular SBH] , SkBr-3 (cáncer de mama, Her2 sobreexpresado) ¦ MCF-7 (cáncer de mama, mutación p53) PC-3 (cáncer de próstata) [línea celular SBH] 1 SkBr-3 (adenocarcinoma de mama humano) 1 NCI-ES-0808 I SCC (carcinoma de célula escamosa) PaCa-2 NIH-3T3 Cultivo celular: Las células se obtuvieron de la American Type Culture Collection o Gibco. Las células se cultivaron en medio DMEM/F-12 complementado con 5% de suero bovino fetal, 0.25 ug/mL de Anfotericina, 100 ug/mL de estreptomicina y 100 U mL-1 de penicilina. Las células se mantuvieron en una atmósfera de 95% de aire y 5% de Co2 a 37 grados C.
Las células SK- EL28 de melanoma maligno de piel se cultivaron y mantuvieron en D E /F12 con Glutamax (Invitrogen, Carlsbad CA) complementado con 5% de FBS, anfotericina y penicilina/estreptomicina. Las células se cultivaron a 37°C con 5% de C02. Los detalles de lineas celulares adicionales y condiciones de crecimiento se resumen en la tabla a continuación.
Tabla 1. Lineas celulares analizadas para determinar la sensibilidad a Q10.
Tratamiento de células SKMEL28 con Q10: i Se trataron células SK- EL28 con 100 µ de Q10 o el vehículo de control. La formulación de la Q10 fue la siguiente: En un tubo tapado de 15 mL, se transfirieron 4.32 ' mg de Q10 (proporcionada por Cytotech) y luego se disolvieron agregando 500 µ?? de isopropanol. La solución resultante se calentó en un baño de agua a 65°C y se agitó en un vórtex a gran velocidad. La solución de Q10/isopropanol se llevó hasta un volumen de 10 mL agregando medio de cultivo celular equilibrado. La solución madre luego se agitó en un vórtex para asegurar la máxima solubilidad de la Q10. La solución madre se diluyó (2 mL de solución con 8 mL de medio) para obtener una concentración final de 100 µ? de Q10. Para el vehículo de control, se agregaron 9.5 mL de medio a 500 pL de isopropanol. La solución de control se diluyó adicionalmente (2 mL de solución) con 8 mL de medio. Las células se extrajeron 6, 16, 24, 48 o 72 horas luego del inicio del tratamiento.
Tratamiento de células de SCC con Q10: Se trataron células de SCC con 100 µ? de Q10 (preparada como se describió anteriormente) durante 6 horas o 2 horas. Las células de control fueron células sin tratamiento. Las células se extrajeron y se sedimentaron en diferentes puntos luego del tratamiento y los sedimentos se congelaron de forma instantánea y se almacenaron a -80 °C hasta que se aisló el ARN en XTAL como se describe a continuación .
Aislamiento de ARN: Se lisaron células para aislar ARN en diferentes puntos del tratamiento usando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Inc., Valencia CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se cuantificó midiendo la densidad óptica a 260 nm.
Síntesis de la primera cadena: Se sintetizó ADNc de primera cadena a partir de 1 µg de ARN total usando el kit de síntesis de primera cadena RT2 (SABiosciences . , Frederick MD) según las recomendaciones del fabricante.
PCR en tiempo real: ' Los productos de la síntesis de primera cadena se diluyeron con agua, se mezclaron con el master mix verde SYBR (SABiosciences., Frederick MD) y se cargaron en matrices de PCR. La PCR en tiempo real se realizó en los matrices de PCR (matrices de apoptosis, matrices de diabetes, matrices de estrés oxidativo y protección antioxidante y matrices de proteína de choque térmico) (SABiosciences, Frederick MD) en un Biorad CFX96.
Determinación de la sensibilidad de las lineas celulares a la coenzima Q10 mediante el ensayo de nexina para apoptosis : Se cuantificó el porcentaje de células con apoptosis temprana y tardía siguiendo un tratamiento de 24 h con coenzima Q10. La apoptosis temprana y tardía se utilizó como marcador para comprender las diferencias en la sensibilidad de diversas líneas de células cancerosas con relación a la coenzima Q10. Las diferentes líneas celulares analizadas fueron PaCa2, HepG2, PC-3, SKBr3, MCF-7 y SK-MEL28. Las células se dejaron adherir durante la noche en placas de 96 pocilios. Estas células se trataron con vehículo de control, 50 µ de Q10 o 100 µ? de coenzima Q10. Luego de 24 horas, se calculó la presencia de células apoptóticas en un citómetro de flujo PCA96 (Guava Technologies, Hayward, CA) . Adicionalmente, algunas células se trataron con 4 µ? de estaurosporina durante 2 horas como control positivo para la apoptosis. Las células primero se lavaron con PBS y se separaron con 50 µL de Accumax (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA) a temperatura ambiente. La disociación se detuvo agregando medio de cultivo que contenía 1% de Pluronic F-68 (Sigma-Aldrich, San Luis, O) . Luego se agregaron 100 µ?, de reactivo de nexina (Guava Technologies, Hayward, CA) a cada uno de los pocilios. Luego de 20 minutos de incubación en la oscuridad, se realizó el ensayo en placas de baja unión para minimizar la unión de las células nuevamente al sustrato. El reactivo de nexina contenia dos tintes. Anexina-V-PE, que detecta la serina de fosfatidilo fuera de la célula, una característica de las células apoptóticas tempranas. El segundo tinte, 7-AAD, penetra solamente las células apoptóticas tardías, al tiempo que se excluye de las células vivas (saludables) y apoptóticas tempranas. Se determinó el porcentaje de cuatro poblaciones de células; vivas, apoptóticas tempranas, apoptóticas tardías y partículas, usando el software Cytosoft 2.5.7 (Guava Technologies, Hayward, CA) .
Inmunotransferencia Se analizaron aproximadamente 50 pg de proteína por muestra mediante inmunotransferencia . Todos los tratamientos se realizaron en triplicado con controles. Las proteínas se separaron en 12% de geles TRIS-HC1, se transfirieron mediante electroforesis a membranas de nitrocelulosa y se bloquearon usando una solución de 5% de leche y TBST antes de la incubación con anticuerpos primarios. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 grados C en una solución de 5% de BSA y TBST. Los anticuerpos secundarios se incubaron durante una hora a 4 grados. Todos los anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling Technology. Los anticuerpos se utilizaron en una proporción de 1:1000, con la excepción de Actina en una proporción de 1:5000. Las bandas se procesaron y los resultados se cuantificaron usando el software de análisis del densitómetro basado en NIH Java Image J. Todas las bandas también se sondaron y se normalizaron hasta su expresión de pActina respectiva.
Electroforesis bidimensional : Antes del enfoque isoeléctrico (IEF), las muestras se solubilizaron en 40 mM de Tris, 7 M de urea, 2 M de tiourea y 1% de detergente zwitteriónico C7, se redujeron con tributilfosfina y se alquilaron con 10 mM de acrilamida durante 90 min a temperatura ambiente. Luego la muestra se pasó por un dispositivo de corte Amicon Ultra de 10 kDa con al menos 3 volúmenes del amortiguador de resuspensión que consistía en 7 M de urea, 2 M de tiourea y 2% de CHAPS para reducir la conductividad de la muestra. Se sometieron cien microgramos de proteína a IEF en tiras de gradiente de pH inmovilizado de 11-cm con un pH de 3 a 10, pH de 4 a 7 o pH de 6,a 11 (GE, Amersham, EUA) hasta 100, 000 voltios por hora. Luego del IEF, las tiras de gradiente de pH inmovilizado se equilibraron en 6 M de urea, 2% de SDS, 50 mM de amortiguador de Tris-acetato, pH 7.0 y 0.01% de azul de bromofenol y se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS en 8 a 16% de gel precast Tris-HCl, 1 mm (Bio-Rad, EUA) . Los geles se procesaron en duplicado. Luego se fijaron, se tiñeron en rubí SPYRO, 80 mL/gel (Invitrogen, EUA) y se tomaron las imágenes en un escáner láser Fuji FLA-5100 o se transfirieron a una membrana de PVDF. 1 Se obtuvo información adicional para una muestra de control para analizar la utilidad de la identificación de proteínas a través del uso de métodos que utilizan separación pl selectiva de dPC (Protein Forest Inc.), seguida por digestión del tapón de dPC con tripsina con identificación del espectro de masa y semi-cuantitación (Nanomate o LC/LTQ/MS) . El análisis dPC realizado con una muestra de control demostró su utilidad en la identificación de un amplio subconjunto de proteínas. Los materiales producidos durante los estudios se archivaron para poder utilizarlos como recurso en caso de necesidad futura .
Análisis de imagen en gel 2D: El análisis de todas las imágenes en gel se realizó usando Progenesis Discovery y Pro (Nonlinear Dynamics Inc., Newcastle upon Tyne, RU) . Luego de detectar las manchas, emparejar, restar el fondo, normalizar y filtrar, los datos para las imágenes en gel rubí SPYRO se exportaron. Se realizaron comparaciones en pares entre los grupos usando la prueba t de Student en Progenesis Discovery para identificar manchas cuya expresión estuviera significativamente alterada (p > 0.05).
Matriz de anticuerpos: . Se utilizó una micromatriz de anticuerpos (matriz de anticuerpos XP725 Panorama, Sigma) para analizar más de 700 anticuerpos de proteina para evaluar los cambios en el nivel de concentración de proteina en las células tratadas con Q10 (SK-MEL-28, SCC) . La expresión de una proteina en un extracto celular se detecta cuando se une mediante un anticuerpo correspondiente manchado en el portaobjetos. Antes de la unión, las proteínas se etiquetan directamente con ün tinte fluorescente que se usa para visualización fluorescente y análisis cuantitativo. La matriz se usa para comparar perfiles de expresión de proteínas de dos muestras (muestras de prueba en comparación con referencia) , cada una etiquetada con un tinte Cy diferente (Cy3 o Cy5) y las dos muestras se colocan simultáneamente en concentraciones iguales de proteína en la matriz. Luego se registra la intensidad de señal fluorescente para cada muestra de forma individual a una longitud de onda correspondiente a la etiqueta de tinte de la muestra y se compara.
Dosis elevadas de coenzima Q10 regulan la expresión de genes implicados en las vías de estrés apoptótico, diabético y oxidativo en células SKMEL-28 cultivadas.
Detalles experimentales: Las células SKMEL-28 (No. de catálogo del ATCC HTB-72) son células de melanoma de' la piel no metastásico que se cultivaron en DMEM-F12 que contenia Glutamax (No. de cat. de Invitrogen 10565-042) complementado con 5% de FBS, penicilina, estreptomicina y anfotericina, se trataron con el vehículo o 100 uM de coenzima Q10 durante diversas cantidades de tiempo. Todo cambio en la expresión génica resultante del tratamiento con la coenzima Q10 se cuantificó usando matrices de PCR en tiempo real (Apoptosis No. de cat. PAHS-12, diabetes No. de cat. PAHS-023 y estrés oxidativo No. de cat. PAHS-065) . (SABiosciences, Frederick, MD) .
Se preparó una concentración madre de 500 uM de coenzima Q10 disolviendo 4.32 mg en 500 ul de isopropanol, que se diluyó adicionalmente hasta 10 mi agregando medio. La agitación en un vórtex y el calentamiento hasta 65°C de manera alternativa disolvieron la coenzima Q10. Se diluyeron 2 mi de la solución madre hasta 10 mi con medio para obtener 100 uM de Q10 con medio que se utilizó para tratar las células. Se preparó un vehículo en paralelo con un protocolo similar, salvo porque la coenzima Q10 no se agregó .
Las células SKMEL-28 se colocaron en una placa de 6 pocilios a una densidad de 1x10s células/pocilio. Luego de 24 horas, cuado las células se habían unido y tenían una confluencia del 50%, se agregaron el vehículo o 100 uM de Q10. Las células se extrajeron a las 6, 16, 24, 48 o 72 horas después del tratamiento con Q10, mientras que las células tratadas con vehículo se extrajeron luego de 24 horas. Se lisaron células para aislar ARN en diferentes puntos del tratamiento usando el kit RNeasy ini (Qiagen, Inc., Valencia CA, No. de cat 74104) siguiendo las instrucciones del fabricante, usando un tratamiento de desoxirribonucleasa en la columna y columna giratoria. El ARN se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm.
La PCR en tiempo real estuvo precedida por síntesis de ADNc de primera cadena usando 0.4-1 ug del ARN total como plantilla, usando el kit de síntesis de primera cadena RT2 (SABiosciences., Frederick MD, No. de cat. C-03) con una etapa de eliminación de ADN genómico según las recomendaciones del fabricante. Los productos de la síntesis de primera cadena se diluyeron con agua, se mezclaron con el master mix verde de SYBR (SABiosciences., Frederick MD, No. de cat. PA-010-12) y se cargaron en matrices de PCR que contenían ensayos de cebadores para 84 genes diferentes unidos en una vía común, 5 genes de mantenimiento utilizados para normalización, transcripción inversa y controles de PCR. La PCR en tiempo real se realizó en un Biorad Cfx96. La amplificación se comenzó con un inicio caliente para activar la enzima, seguido por 40 ciclos (etapa de desnaturalización a 90°C-15 segundos y etapa de hibridación y extensión a 60°C-1 minuto) seguidos por un programa de curva de fundición. Se organizaron los valores de ct, el resultado del termociclador de PCR para todos los grupos de tratamiento en una hoja de cálculo de Excel' y se cargaron en el software de análisis comparativo disponible en www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php.
Purificación de muestras enriquecidas con mitocondria: Detalles experimentales: Las células SKMEL-28, NCI-ES0808 y NIH-3T3 que se trataron con 100 µ? de Q10 durante 24 o 48 horas junto con las células que se extrajeron a t=0 se extrajeron lavándolas y raspándolas de los matraces T160. Las células se centrifugaron, se sedimentaron, se congelaron de forma instantánea y se almacenaron a -80°C hasta que se aislaron las mitocondrias. Los sedimentos celulares se descongelaron, se volvieron a suspender y se destruyeron en un homogenizador Dounce. El homogeneizado se centrifugó y las mitocondrias se aislaron usando reactivos, asi como el protocolo recomendado por el kit de aislamiento de mitocondrias para células cultivadas (MitoSciences, Eugene OR, No. de cat. MS852). La fracción mitocpndrial se separó en alícuotas y se almacenó a -80°C.
Método de cuantificación de la coenzima Q10 y Ubiquinol-10 : implemento un método para la determinación simultánea de la coenzima Q10 (Q10) y la forma reducida ubiqúinol-10 (Q10H2), con base en un método publicado recientemente (Ruiz-Jiménez, 2007, J. Chromatogr. A, 1175, 242-248) usando LC-MS/MS con ionización por electroaspersion (ESI) en el modo iónico positivo. La identificación altamente selectiva y la cuantificación sensible de la Q10 y Q10H2 es posible junto con la identificación de otros lipidos seleccionados. Se sometió una álicuota de las muestras enriquecidas con mitocondria de SK-MEL-28 tratadas con 100 µ? de Q10 a un pretratamiento convencional basado en precipitación proteica (100 µ? de concentrado de eritrocitos destruidos con ultrasonidos en 300 ;µ1 de 1-propanol) , extracción de liquido-líquido (agregar 100 µ? de agua al sobrenadante y extraer X3 con 200 µ? de n-hexanos) , evaporación de los extractos de hexanos combinados hasta sequedad y reconstitución en 50 µ? de 95:5 de metanol/hexanos (v/v) . El análisis se realizó mediante LC-MS/MS en un espectrómetro de masas de cuadrúpolo triple aters Quattro II con una columna de tamaño de partícula de 5 µp? Prism RP de 1 X 100 mm (Keystone Scientific) . Elución isocrática con 4 mM de formato de amonio en 20% de alcohol isopropílico, 80% de metanol, a una velocidad de flujo de 50 µ?/min. Se inyectaron diez µ? de cada muestra. El análisis de MRM se realizó usando transiciones de m/z 882.7>197.00 (Q10H2) y m/z 880.80>197.00 (Q10) con un voltaje de cono de 40 y una energía de colisión de 30.
I i I EJEMPLO 3: Sensibilidad de las lineas celulares a la CoQlO Se analizó una cantidad de lineas celulares para determinar su sensibilidad a la QIO luego de 24 horas de aplicación usando un reactivo (reactivo de nexina) que contenia una combinación de dos tintes, 7AAD y anexina-V-PE. Él tinte 7AAD ingresa a las células con membranas celulares permeabilizadas , principalmente las células que presentan una apoptosis tardía. La anexina-V-PE es un tinte que se une a la serina de fosfatidilo, que se expone en la superficie exterior de la membrana plasmática en las células apoptóticas tempranas . El reactivo de nexina entonces se puede utilizar para diferenciar entre diferentes poblaciones de células apoptóticas en un citómetro de flujo.
Las células PaCa2 mostraron un aumento tanto en las células apoptóticas tempranas como en aquellas apoptóticas tardías (entre 5-10% de células reguladas) con 50 µ? de Q10 y 100 µ? de Q10 luego de 24 horas de la aplicación de Q10. Las células PC-3 también mostraron un aumento tanto en la población apoptótica temprana como en aquella apoptótica tardía con 50 µ? y 100 µ? de Q10, si bien el aumento fue menor en comparación con las células PaCa2. Las células CF-7 y SK-MEL28 mostraron un aumento solamente en la población apoptótica temprana con 50 µ? y 100 µ? de Q10. Las células HepG2 también fueron sensibles al tratamiento con 50 µ? de Q10, donde hubo un aumento de alrededor del 20% de la población regulada en las etapas de apoptosis tardía y apoptosis temprana. SKBr3 fue la única línea celuiar analizada que no mostró aumentos significativos en la apoptosis temprana y tardía con el tratamiento con 50 µ? o 100 µ de Q10. Los resultados se muestran en las Figuras 1-6. ; Para proporcionar una confirmación adicional de que el tratamiento con Q10 provoca una respuesta apoptótica en las células cancerosas hepáticas HepG2, se evaluó un segundo ensayo de apoptosis usando el método basado en ELISA ApoStrand™ que mide el ADN de cadena simple. El ELISA ApoStrand™ se basa en la sensibilidad del ADN en células apoptóticas a la desnaturalización con formamida y la detección del ADN desnaturalizado con un anticuerpo monoclonal para el ADN de cadena simple (ADNcs) . El tratamiento de la línea de células cancerosas hepáticas HepG2 con 50 y 100 µ? de Q10 dio como resultado una apoptosis detectable, con una respuesta a la dosis de 17% y 32%, respectivamente (Figura 7). Estos resultados son coherentes con la observación de que la Q10 induce la apoptosis en otras líneas de células cancerosas de otros tejidos (por ej . , SCC, SKMEL-28, CF-7 y PC-3) .
EJEMPLO 4: Análisis proteómico de células tratadas con Q10 Los sedimentos celulares de muestras tratadas con Q10 se analizaron usando métodos proteómicos. Los sedimentos celulares se Usaron y se trataron para su uso en análisis de transferencia Western y gel 2-D. Se trataron tres tipos celulares (SKMEL-28, SCC y nFib) con Q10 y se presentaron para : caracterización proteómica mediante electroforesis en gel 2-D.
Análisis proteómico de células SKMEL-28 tratadas con Q10 , El primer conjunto experimental procesado y evaluado mediante transferencia Western y electroforesis en gel 2-D fue la linea celular de cáncer de la piel SKMEL-28. Este conjunto experimental incluyó células SK-MEL-28 tratadas a las 3', 6, 12 y 24 horas con 0, 50 o 100 µ? de Q10. i El conjunto de muestras de SK-MEL-28 tratadas con Q10 se sometió a electroforesis en gel 2-D (Figura 8) y se analizó para identificar los cambios en el nivel de proteina con relación a las muestras de control. Se realizó un análisis comparativo de 943 manchas en los veinticuatro geles', comparando la muestra de control con todas las muestras tratadas. El análisis incluyó la identificación de cambios en las manchas con el transcurso del tiempo debido a un aumento, una disminución o una modificación postraduccional .
El análisis encontró treinta y dos cambios de manchas diferenciales estadísticamente significativos. A partir de esto, veinte manchas no redundantes se extirparon y se presentaron para identificación proteica mediante digestión con tripsina y caracterización por espectrometría de masa. Los péptidos caracterizados se cotejaron con bases de datos de proteínas con análisis con el software Mascot y MSRAT para identificar la proteína (Tabla 2) .
Tabla 2. Proteínas que se determinó que tenían una respuesta diferencial al tratamiento con QIO en las células SKMEL-28.
Un hallazgo clave en este experimento fue la disminución de la Transaldolasa 1, lo que avala la premisa de que la Q10 actúa alterando el estado metabólico en las células cancerosas. La transaldolasa 1 es una enzima en la vía de la pentosa fosfato (también conocida como derivación de hexosa monofosfato) . La transaldolasa (EC:2.2.1.2) cataliza la transferencia reversible de una unidad de cetol de tres carbonos de la sedoheptulosa 7-fosfato al gliceraldehido 3-fosfato para formar eritrosa 4-fosfato y fructosa 6-fosfato. Esta enzima, junto con la transcetolasa, proporciona un enlace entre las vías glicolitica y pentosa-fosfato . Esto es relevante para la síntesis de NADPH y nucleótidos, para facilitar la producción de equivalentes de reducción para reacciones biosintéticas y mantener un ambiente de reducción.
Una publicación reciente (Basta, P., et. ál . agosto de 2008, Cáncer Detect Prevention, 32, 200-208) proporcionó pruebas de polimorfismo genético en la transaldolasa y se relacionó con el carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello. Otra publicación reciente (Qian, Y., et. ál. mayo de 2008, Biochem J, 415, 123-134) identificó la deficiencia de transaldolasa como un modulador de la homeostasis mitocondrial, el flujo de Ca2+ y la apoptosis.
A partir de estos resultados iniciales, los otras proteínas identificadas mediante la electroforesis en gel 2-D como moduladas por la Q10 en SK-MEL-28 se analizaron para detectar relaciones conocidas (Figura 9) . Una evaluación funcional de estas proteínas reveló que había un grupo: implicado en la señalización mediada por 14-3-3 (PDCP6IP, YWHAZ y VIM) , junto con proteínas individuales ligadas a una variedad de procesos [ciclo celular, vía de la pentosa fosfato (TALD01) , señalización de ceramida (CTSD) , biosíntesis de aminoacilo-ARNt (GARS) e importación de proteínas mitocondriales (TOM22) ] .
Análisis proteomico de células SCC tratadas con Q10 Otra línea celular de cáncer de la piel, el carcinoma de células escamosas (SCC) , también se preparó y se analizó mediante electroforesis en gel 2-D como un experimento de seguimiento al análisis previo de SK-MEL-28. Las células de SCC se trataron con 100 µ? de Q10 durante 6 horas o 24 horas antes de la extracción. También se extrajo un control de células sin tratar. Los sedimentos celulares se lisaron y las muestras se sometieron a electroforesis en 2-D (en duplicado) . Se realizó el análisis de más de seiscientas manchas de proteínas en el estudio comparativo, donde se comparó la muestra de control con los tratamientos de seis y veinticuatro horas.
. Los veinticinco cambios de manchas diferenciales estadísticamente significativos superiores se evaluaron a partir del análisis comparativo de los geles de electroforesis 2-D. A partir de esto, se extirparon doce manchas y se presentaron para identificación mediante digestión con tripsina y caracterización mediante espectrometría de masas (los resultados se resumen en la Tabla 3 a continuación) .
Tabla 3. Proteínas que se identificó que tenían una respuesta diferencial al tratamiento con 100 µ? de Q10 en células de SCC a las 6 y las 24 horas.
Transaldolasa 1: Como se observó previamente en las células SKMEL-28 tratadas con Q10, la enzima Transaldolasa 1 se moduló con una disminución en los niveles. Esto proporciona una confirmación independiente de la observación previa de un enlace entre la Q10 y las alteraciones en la transaldolasa (y, por lo tanto, el estado metabólico de la célula) .
La transaldolasa es una enzima en la fase no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato (Figura 10) . La vía de la pentosa fosfato es critica en el estado metabólico de las células para la generación de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (menos NADH) , para la biosintesis reductiva y en la formación de ribosa, que es un componente esencial del ATP, el ADN y el ARN. La transaldolasa también une la vía de la pentosa fosfato a la glucólisis. La glucólisis es la vía metabólica mediante la cual las células cancerosas obtienen la energía que necesitan para la supervivencia celular, ya que no se utiliza el proceso mitocondrial de la fosforilación oxidativa. La Q10 es un factor coenzimático esencial necesario para la fosforilación oxidativa y la producción de ATP mitocondrial.
BSCv: La mancha 23 fue una proteína humana novedosa del cromosoma 20 denominada BSCv. La proteína BSCv también se cohoce como proteína asociada con la membrana plasmática de adipocitos (nombres génicos : APMAP o C20orf3) y se prevé que sea una proteína de membrana tipo II de paso único con similitud de secuencia con la familia de proteínas de estrictosidina sintasa El tratamiento con Q10 provocó una reducción en los niveles de esta proteína. Esta proteína no está bien caracterizada ni se ha confirmado su homología con las estrictosidina sintasas. De manera interesante, esta proteina se ha asociado con una incidencia en la diferenciación de adipocitos (Albrektsen et ál . , 2001). Estudios proteómicos recientes de tejido adiposo omental humano identificaron BSCv como una de las nueve proteínas con expresión diferencial para el síndrome de ovario poliquístico (PCOS) de mujeres con obesidad mórbida (Cortón, 2008 Hum. Reprod. 23: 651-661) . Como proteína de superficie celular que responde a la Q10, un anticuerpo contra BSCv sería útil como biomarcador. Con base en los resultados actuales y la literatura disponible, BSCv puede tener una incidencia potencial en el cáncer y la diabetes.
NM23A: Se cree que la proteína de células no metastásicas 1 (N 23A, también conocida como NMEl) es un supresor metastásico. Este gen (NMEl) se identificó debido a sus menores niveles de transcriptasa en ARNm en células altamente metastásicas. La proteína tiene actividad como una nucleósido difosfato cinasa (NDK) y existe como un hexámero compuesto por la isoforma '?' (codificada por este gen) y 'B1 (codificada por N E2) . Se han identificado mutaciones en este gen en neuroblastomas agresivos. Las actividades de la NDK mantienen un equilibrio entre las concentraciones de diferentes nucleosidos trifosfatos como, por ejemplo, cuando la GTP producida en el ciclo de ácido cítrico (Kreb) se convierte en ATP. El complejo de NDK está asociado con p53 a través de la interacción con STRAP. Cabe destacar que STRAP está enlazado con HNF4A. Por consiguiente, NM23A es una proteína potencial implicada en las vías importantes para el control celular y el tratamiento de enfermedades.
Inhibidor de la disociación de GDP rho (GDI) alfa: GDI regula la reacción de intercambio de GDP/GTP de las proteínas Rho inhibiendo la disociación de GDP de las mismas y la unión posterior de GTP a ellas. La proteína se regula por aumento en las células cancerosas.
EJEMPLO 5: Análisis de enriquecimiento mitocondrial Diversos elementos de prueba sugirieron que se garantizó una evaluación más minuciosa de la incidencia de las proteínas mitocondriales y la biología del cáncer y la respuesta a la Q10. Primero, hay una incidencia esencial de la Q10 en el proceso de fosforilación oxidativa mitocondrial para la producción energética en células normales. No obstante, el cambio metabólico que ocurre en las células cancerosas es con respecto a la producción energética a través de la vía alternativa de la glucólisis, que no necesita Q10. Segundo, la respuesta apoptótica de las células necesita de las proteínas mitocondriales para tener lugar. Se ha establecido la Q10 como estimuladora de la appptosis en células cancerosas (proteínas de la familia de Bclc-2, citocromo c) . Por último, se detectó que nuevas proteínas mitocondriales eran moduladas por el tratamiento con Q10, según lo muestran los ejemplos de la modulación de los niveles proteicos de la proteina del receptor de importación mitocondrial TOM22 (véanse los experimentos descritos en la presente) .
Producción de muestras enriquecidas con mitocondria: Las células SKMEL-28 de cáncer de piel se trataron con 100 µ? de Q10 o un vehículo de imitación durante 6, 19 o 48 horas. Las células se extrajeron lavándolas y raspándolas de matraces T-160 (4 para cada punto de tiempo) . Las células se recolectaron mediante centrifugación y los sedimentos se congelaron de forma instantánea y se almacenaron a -80 °C. Los sedimentos celulares se volvieron a suspender y se destruyeron usando un hpmogenizador Dounce de 2 mL. Los reactivos y los métodos se obtuvieron de un kit de aislamiento de mitocondrias para células cultivadas (MitoSciences , No. de cat . MS852) . Las muestras de mitocondria resultantes se dividieron en alícuotas de 75 \i (4-5 alícuotas por muestra) y se almacenaron a -80 °C.
Análisis proteómico de muestras enriquecidas con mitocondria aisladas de células SK-MEL-28 tratadas con Q10 Se realizó electroforesis en gel 2-D en proteínas solubilizadas de dos alícuotas de las muestras enriquecidas con mitocondria SK- EL-28 tratadas con 100 µ? de Q10 durante 6, 19 y 48 horas (junto con los controles de vehículo de imitación correspondientes) . Las muestras se sometieron a electroforesis 2-D (en duplicado) . Se realizó el análisis de 525 manchas de proteínas en el estudio comparativo, donde se compararon las muestras de control con las muestras de otros puntos de tiempo (Figura 11) .
' Los nueve cambios de manchas diferenciales estadísticamente significativos se seleccionaron a partir del análisis comparativo de los geles de electroforesis 2-D. A partir de esto, 9 manchas se extirparon y se presentaron para identificación mediante digestión con tripsina y caracterización por espectrometría de masa. i ijabla 4. Proteínas gue se determinó gue tenían una respuesta diferencial al tratamiento con Q10 en las mitocondria de SKMEL-28.
Acil-CoA tioesterasa 7: Acil-CoA tioesterasa 7 (AC0T7) es un miembro de la familia enzimática que cataliza la hidrólisis de acil-CoA graso en CoA y ácido graso libres. Esta enzima, por lo tanto, tiene incidencia en la regulación del metabolismo lipidico y la señalización celular. ACOT7 tiene preferencia por sustratos de acil-CoA de cadena larga con cadenas de ácidos grasos de 8-16 átomos de carbono (C8-C16) . La función celular exacta de AC0T7 no se comprende por completo. La transcripción de este gen se activa mediante la proteína de unión al elemento regulador de esterol 2, lo que sugiere una función en el metabolismo del colesterol.
Los resultados en este Ejemplo indican que ACOT7 está posiblemente implicado en el metabolismo de la Q10, ya sea de forma directa o indirecta. Por lo tanto, el direccionamiento de ACOT7 podría facilitar la modulación de niveles intercelulares de Q10 y así impactar los efectos celulares de la Q10.
Piruvato cinasa : La piruvato cinasa es una enzima implicada en la última etapa de la glucólisis. Cataliza la transferencia de un grupo fosfato del fosfoenolpiruvato (PEP) a ADP, lo que proporciona una molécula de piruvato y una molécula de ATP. ' cinasa piruvato fosfoenolpiruvato (PEP) (PK) piruvato (Pyr) Se presume que la proteina es la de PKM2, la isoforma tipo 2, ya que esta se identificó a partir de la muestra de SK- EL-28 enriquecida con mitocondria . Se sabe que esta isoforma está implicada en la formación y la regulación de células tumorales.
Cuantlficación de los niveles de Q10 en mitocondrias implemento un método para la determinación simultánea de la coenzima Q10 (Q10) y la forma reducida ubiquinol-10 (Q10H2), con base en un método recientemente publicado (Ruiz-Jiménez , 2007, J. Chroma A, 1175, 242-248) a través del uso de LC-MS-MS con ionización por electroaspersión (ESI) en el modo positivo. La identificación altamente selectiva y la cuantificación sensible de la Q10 y Q10H2 es posible junto con la identificación de otros lípidos seleccionados. Se sometió una alícuota de las muestras enriquecidas con mitocondria de SK- EL-28 tratadas con 100 µ? de Q10 a un pretratamiento convencional basado en precipitación de proteínas, extracción de líquido-líquido, evaporación hasta sequedad y reconstitución con 95:5 de metanol/hexanos (v/v) . 1 En este análisis, se cuantificaron Q10, Q10H2 y Q9 (Tabla 5) . Los niveles de la molécula Q9 relacionada fueron bajos y cercanos al nivel de detección. El nivel de las muestras sin tratar fue relativamente coherente con la muestra tratada con Q10 a las 6 horas que tenia el mismo nivel. Para controlar la varianza de la muestra en el material total, los niveles de colesterol también se midieron para confirmar que las diferencias no se debían a errores en el tamaño de la muestra. Cuando se corrigieron los niveles de Q10 contra los valores totales de proteínas obtenidos mediante extracción de proteínas, otras alícuotas de , las mismas preparaciones mitocondriales, las proporciones relativas fueron comparativas [sic] . Por lo tanto, se obtuvo un aumento significativo en los niveles de Q10 a las 19 horas (~3 veces) con un aumento incluso mayor a las 48 horas (~6 veces) (Figura 12) .
Tabla 5. Resultados de la cuantificación por HPLC-MS para los niveles de Q10 presentes en las muestras enriquecidas con mitocondria de células SK-MEL-28 tratadas con 100 µ? de Q10 en el medio. 1 Un resultado sorprendente de este estudio fue el hallazgo de que la Q10 se suministró a las células como la forma oxidada. Para las muestras a las 48 horas, también se midió la forma reducida Q10H2 y se encontró que estaba presente en cantidades significativamente menores (0.28 ng/muestra de CoQ10H2 en comparación con 46.63 ng/muestra de CoQlO) . Hubo un aumento general (3 veces) en los niveles de Q10H2 en la muestra a las 48 horas tratada con Q10, si bien los niveles fueron cercanos al limite de detección presupuesto del ensayo. De manera interesante, la forma oxidada (Q10) puede actuar como un pro-oxidante en sistemas biológicos. De acuerdo con la literatura, cuando se evaluó el plasma humano para determinar la Q10 y Q10H2, se descubrió que la mayoría (90%) de la molécula estaba en la forma reducida de Q10H2 (Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chroma A, 1175, 242-248) que puede actuar como antioxidante.
Por lo tanto, estos resultados confirman y cuantifican que los niveles de Q10 aumentan en la mitocondria tras la adición exógena de Q10 al medio. Un descubrimiento sorprendente e inesperado fue que la Q10 se mantuvo en la forma oxidada proporcionada (pro-oxidante) y no se convirtió en la forma reducida (antioxidante) de Q10H2 en ninguna cantidad significativa.
EJEMPLO 6 : Matrices de PCR en tiempo real Experimento 1 : Matriz de apoptosis Como se indicó anteriormente en el Ejemplo 3, la exposición de células cancerosas a la Q10 induce la muerte de una parte de estas células debido a procesos apoptóticos. Para identificar proteínas implicadas en la respuesta a la Q10, se emplearon métodos de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para identificar cambios en el nivel de ARNm para genes/proteínas implicados en matrices de vías dirigidas para la apoptosis.
Usando matrices de PCR como herramienta de análisis, se evaluó un espectro de dianas moleculares que ofrecería potencialmente una percepción del modo de acción biológica de la Q10 dentro de las células. Se evaluaron cambios en los niveles de ARNm usando cuantificación por PCR en tiempo real para evaluar los niveles de ARNm en subconjuntos preseleccionados que contenían 80 dianas específicas para las vías.
Para la interpretación de los resultados de ARNm, se identificaron y evaluaron los genes alterados en su transcripción de ARNm en un nivel doble. El nivel de transcripción génica para producir ARNm solamente proporciona un cálculo aproximado de los cambios potenciales en el nivel de proteína expresada. El experto comprenderá que cada ARNm puede tener diferentes proporciones en las cuales se degrada o traduce de forma ineficaz, lo que da como resultado diferentes cantidades de proteína .
Células SkBr-3 tratadas con 50 um de Q10 durante 24 horas Se utilizó el método de ensayo de RT-PCR para proporcionar una medida de cambios del nivel de ARNm para un total de 84 proteínas relacionadas con la vía apoptótica. Los experimentos con el análisis de apoptosis por PCR en tiempo real en SkBr3 con Q10 (24 hr) identificaron los siguientes ARNm como afectados: Bcl2, Bcl2Ll, Bcl2Lll, Birc6, Bax, Xiap, Hprtl, Apafl, Abll, Braf. Estos resultados proporcionaron nuevamente pruebas 5 que avalan la respuesta apoptótica de las células cancerosas al tratamiento con Q10.
Tabla 6A Símbolo Regulación Unigen Refsec Descripción Gnombre por aumento- disminución BCL2L1 13.1957 Hs.516 NM_1385 1 tipo BCL2 BCL-XL/S 966 78 BNIP2 6.3291 Hs.646 NM_0043 proteina 2 de BNIP-2/NIP2 490 30 interacción de 19kDa E1B BCL2/adenovirus BCL2 5.4717 Hs.150 N _0006 CLL de células Bcl-2 749 33 B/linfoma 2 BIRC6 4.7966 Hs.150 NM_0162 6 que contiene APOLLON/BRUCE 107 52 la repetición de IAP baculoviral (apollon) BCL2L11 4.6012 Hs.469 NM_0065 11 tipo BCL2 BAM/BIM 658 38 (facilitador de la apoptosis) 4.3832 Hs.356 NM_0011 Inhibidor de la API3/BIRC4 076 67 apoptosis ligado a X 4.3832 Hs.550 NM_0043 Homólogo del B-raf 1/BRAF1 061 33 oncogén viral de sarcoma murino V-raf Bl 3.896 Hs.631 NM_0043 Proteina X Bax zeta 546 24 asociada con BCL2 2.6244 Hs.708 NM_0011 Factor 1 CED /DKFZp781 112 60 activador de la B1145 peptidasa apoptótica -160.6748 Hs.412 NM_0001 Hipoxantina HGPRT/HPRT 707 94 fosforribosiltr ansferasa 1 (síndrome de Lesch-Nyhan) Los resultados coherentes a partir de tres experimentos independientes de SK-MEL-28 se resumen a continuación de la Tabla 6B. Muchos genes se regulan en las células de SCC, así como con tratamiento con 100 µ? de Q10.
Los genes en la matriz de apoptosis que parecen regulados en las células de SCC se describen en la Tabla 7.
Descubrimos que muchos genes se regulan a las 6 horas, tanto en células SK-MEL-28 como en células de SCC. A las 24 horas, la regulación disminuye. Los genes que parecen regulados en células SK-MEL-28 y en células de SCC se describen en la Tabla 8. a 6B. Genes en las células SK-MEL-28 regulados mediante tratamiento con 100 µ? de Q10 cuando se analizan según la matriz de apoptosis.
Tabla 7. Genes en las células de SCC regulados mediante tratamiento con 100 µ de Q10 cuando se analizan según matriz de apoptosis. a las 24 horas Factor 2 asociado con el Regulado por aumento TRAF2 receptor del TNF a las 24 horas Tabla 8. Genes de la matriz de apoptosis regulados con el tratamiento con 100 µ? de Q10 tanto en células SK-MEL-28 como SCC TRAF2 Factor 2 asociado con el receptor del TNF De manera interesante, los niveles de ARNm alterados mostraron una regulación por aumento significativa en una serie de proteínas apoptoticas, con Bcl-xl como una de las más elevadas. Esto también se observó en los experimentos de la matriz de proteínas en células SK- EL-28.
; Bcl-xl es una molécula transmembrana en la mitocóndria (Bcl-xl significa "linfoma de células básales extrarlargo" ) . Se encuentra implicado en la vía de transducción de señales del FAS-L y es una de las muchas proteínas anti-apoptóticas miembro de la familia de proteínas Bcl-2. Se ha encontrado implicada en la supervivencia de células cancerosas. No obstante, se sabe que el corte y empalme alternativo de ARNm de Bcl-x humano puede dar como resultado al menos dos especies de ARNm de Bcl-x! distintas, Bcl-xL y Bcl-xS . El producto de proteína predominante (233 aminoácidos) es el mayor ARNm de Bcl-x, Bcl-xL, que inhibe la muerte celular tras el retiro del factor de crecimiento (Boise et ál . , 1993. Cell 74, 597-608).' Bcl-xS, por otra parte, inhibe la capacidad de Bcl-2 de inhibir la muerte celular y vuelve a las células más susceptibles a la muerte celular apoptótica. Los ensayos empleados no distinguen qué isoforma de Bcl-x se regula por aumento. La isoforma de Bcl-x que se regula por aumento mediante la CoQlO en estos estudios se puede determinar a través de métodos de rutina conocidos en la técnica, por ej . , 'mediante el uso de métodos de RT-PCR para evaluar la proporción de las dos isoformas de corte y empalme de ARNm (Bcl-xL en comparación con Bcl-sL) .
: A partir del estudio de proteínas relacionadas apoptóticas, se observó que había múltiples factores pro y anti—apoptóticos en la familia BCL-2 o que interactúan con i estos, factores y tienen niveles de expresión modulados (BCL2L11, BNIP2, BAG1, HRK, BAK1, BCL2 , BCL2L1) [sic]. Estas proteínas controlan la permeabilización de la membrana exterior mitocondrial . 1 Se observa un marcador temprano para la respuesta apopt'ótica con la regulación por aumento de la Caspasa-9 (16 horas), lo cual es coherente con las observaciones previas de apoptosis con las proteínas de caspasa 3/7. La provocación de vías de señalización de estrés da lugar a la liberación de citocromo c a partir de la mitocondria y la activación de apaf-1 (apoptosoma) que, a su vez, escinde la proenzima de la caspasa-9 en la forma activa. Luego del inicio, la caspasa-9 procede a la escisión de la procaspasa-3 y la procaspasa 7 para desencadenar vías apoptóticas adicionales.
También hay un nexo coherente con la familia de proteínas del receptor del factor de necrosis tumoral que se modula .
También se observa una fuerte regulación por disminución de la proteína tumoral p73. Los análisis de muchos tumores típicamente encontrados en humanos, incluyendo el cáncer de mama y de ovario, muestran una gran expresión de p73 en comparación con los tejidos normales en las áreas correspondientes. Hallazgos recientes sugieren que la sobreexpresión desregulada de los factores de transcripción en el cuerpo implicados en la regulación del ciclo celular y la síntesis del ADN en células de mamífero (es decir, E2F1) induce la expresión de p73. La idea es que p73 puede ser una oncoproteína, pero puede implicar mecanismos diferentes a la proteína p53 relacionada. Un mapeo con esquemas de la vía de apoptosis se proporciona en las Figuras 13A y 13B.
Células SKMEL-28 A partir del estudio de proteínas relacionadas apoptóticas, se observó que había múltiples factores pro y anti-apoptóticos en la familia BCL-2 o que interactúan con estos factores y tienen niveles de expresión modulados (BCL2L11 , BNIP2, BAG1, HRK, BAK1 , BCL2 , BCL2L1) [sic] . Estas proteínas controlan la permeabilización de la membrana exterior mitocondrial .
Se observa un marcador temprano para la respuesta apoptótica con la regulación por aumento de la Caspasa-9 (16 horas), lo cual es coherente con las observaciones previas de apoptosis con las proteínas de caspasa 3/7. La provocación de vías de señalización de estrés da lugar a la liberación de citocromo c a partir de la mitocondria y la activación de apaf-1 (apoptosoma) que, a su vez, escinde la proenzima de la caspasa-9 en la forma activa. Luego del inicio, la caspasa-9 procede a la escisión de la procaspasa-3 y la procaspasa 7 para desencadenar vías apoptoticas adicionales .
Tabla 9. Cambios en los niveles de ARNm para las células SK EL-28 tratadas con 100 µ de Q10, evaluados según matrices de RT-PCR con énfasis en las vías apoptoticas Hay un nexo coherente con la familia de proteínas del receptor del factor de necrosis tumoral que se modula.
También se observa una fuerte regulación por disminución de la proteína tumoral p73. Los análisis de muchos tumores típicamente encontrados en humanos, incluyendo el cáncer de mama y de ovario, muestran una gran expresión de p73 en comparación con los tejidos normales en las áreas correspondientes. Hallazgos recientes sugieren que la sobreexpresión desregulada de los factores de transcripción en el cuerpo implicados en la regulación del ciclo celular y la síntesis del ADN en células de mamífero (es decir, E2F1) induce la expresión de p73. La idea es que p73 puede ser una oncoproteína, pero puede implicar mecanismos diferentes a la proteína p53 relacionada.
Experimento 2: Matrices de PCR en tiempo real usando matriz de protección antioxidante y estrés oxidativo Para identificar las proteínas implicadas en la respuesta a la Q10, se utilizaron métodos de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para identificar cambios en el nivel de ARNm para genes/proteinas implicados en matrices de vías dirigidas para el estrés oxidativo y la protección antioxidante.
La Tabla 10 a continuación proporciona una lista de genes que se regulan en las células SK- EL28 con el tratamiento con 100 µ de Q10. Los resultados se proporcionan solamente para aquellos genes regulados en dos experimentos independientes. Si bien hay una cantidad significativa de regulación génica observada a las 6 horas, los cambios más significativos en los niveles de ARN se observan a las 48 horas.
Tabla 10. Genes en las células SK-MEL-28 que se regulan mediante el tratamiento con 100 µ? de Q10 según se observó en las matrices de protección antioxidante y estrés oxidativo. enfermedad granulomatosa crónica, autosomal 2) fue uno de los ARNm más inducidos al inicio (observado a las 6 horas) . Posteriormente, a las 16 horas y en lo sucesivo, el factor 1 citosólico de neutrofilos (NCF1) (enfermedad granulomatosa crónica, autosomal 1) se indujo a niveles muy elevados luego de una fase de retraso inicial.
El factor 2 citosólico de neutrofilos es la subunidad citos.ólica del complejo multiproteico conocido como NADPH oxidasa, comúnmente encontrada en los neutrofilos. Esta oxidasa produce una explosión de superóxido que se suministra a la luz del fagosoma de neutrofilos.
La NADPH oxidasa (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato-oxidasa) es un complejo enzimático unido a la membrana. Se puede encontrar en la membrana plasmática, asi como en la membrana del fagosoma. Está compuesto por seis subunidades . Estas subunidades son: una guanosina trifosfatasa Rho (GTPasa) , normalmente Racl o Rac2 (Rae significa sustrato de la toxina botulínica C3 relacionada con Rho) Cinco unidades "phox" (Phox significa oxidasa fagocitica) • P91-PH0X (contiene hemo) • p22phox • p40phox · p47phox (NCF1) • p67phox (NCF2) Cabe destacar que no cambian otros niveles de NADPH oxidasa. La enzima es NOX5, que es una NADPH oxidasa novedosa que genera superóxido y funciona como un canal H+ de forma dependiente de Ca(2+) . 1 Adicionalmente, también se reguló por aumento el intercambiador 1 RAC dependiente del 3, 4, 5-trifosfato de fosfatidilinositol (PREX1) . Esta proteina actúa como un factor de intercambio del nucleótido de guanina para la familia RHO de proteínas de unión a GTP pequeñas (RAC) . Ha mostrado unirse y activar RAC1 intercambiando GDP unida por GTP libre. La proteína codificada, que se encuentra principalmente en el citoplasma, se activa mediante la fosfatidilinositol-3, 4 , 5-trifosfato y las subunidades beta-gamma de proteínas G heterotriméricas .
La segunda proteína principal inducida temprana fue la sintasa de óxido nítrico 2A (inducible, hepatocitos) (N0S2A) . El óxido nítrico es un radical libre reactivo que actúa como un mediador biológico en diversos procesos, incluyendo la neurotransmisión y las actividades antimicrobianas y antitumorales . Este gen codifica una sintasa de óxido nítrico que se expresa en el hígado y se puede inducir mediante una combinación de lipopolisacáridos y algunas citocinas.
La superóxido dismutasa 2, mitocondrial (S0D2) es un miembro de la familia de superóxido dismutasa de hierro/manganeso. Codifica una proteína mitocondrial que forma un homotetrámero y se une a un ion de manganeso por subunidad. Esta proteína se une a los subproductos de superóxido de la fosforilación oxidativa y los convierte en peróxido de hidrógeno y oxígeno diatómico. Las mutaciones en este gen se han asociado con la cardiomiopatía idiopática (IDC) , el envejecimiento prematuro, la enfermedad de la neurona motora esporádica y el cáncer.
Un ejemplo de una proteína regulada por disminución es la secuencia de cabeza de tenedor MI (FOXMl), que se sabe que tiene una incidencia fundamental en el avance del ciclo celular, donde alcanza su pico la expresión de FOXMl endógena en las fases S y G2/M. Estudios recientes han demostrado que F0X 1 regula la expresión de una matriz amplia de genes específicos para G2/M, como Plkl, Ciclina B2, Nek2 y CENPF y tiene una incidencia fundamental en el mantenimiento de la segregación cromosomal y la estabilidad genómica. Ahora se conoce al gen FOXM1 como un proto-oncogén humano. La regulación por aumento anormal de F0XM1 está implicada en la oncogénesis del carcinoma de células básales (BCC) . La regulación por aumento de F0XM1 se encontró posteriormente en la mayoría de los cánceres humanos sólidos, incluyendo el de hígado, mama, pulmón, próstata, cérvix del útero, colon, páncreas y cerebro. Estudios adicionales con BCC y Q10 deberían evaluar los niveles de F0XM1.
Células SKMEL-28 , Se realizaron experimentos adicionales usando células SKMELL28. El nivel de ARNm presente en las células SKMEL-28 tratadas con 100 µ? de Q10 se comparó con los niveles de células sin tratar en diversos puntos usando métodos de PCR en tiempo real (RT-PCR) . La matriz de PCR (SABiosciences) es un conjunto de ensayos optimizados de cebadores de PCR en tiempo real en placas de 96 pocilios para genes con foco en vías o enfermedades, así como controles de calidad del ARN ápropiados . La matriz de PCR realiza análisis de expresión génica con sensibilidad a la PCR en tiempo real y capacidad de determinar perfiles de genes múltiples de una micromatriz .
Tabla 11. Lista y clasificación de los niveles de ARNm evaluados en la matriz de PCR de protección antioxidante y estrés oxidativo. Luego de seis horas de tratamiento con 100 |µ? de Q10 en células SKMEL-28, los mayores cambios en los niveles de ARNm se indican resaltando el código de la proteina (aumento -negrita; disminución -subrayado o sin cambio -cursiva) .
Antioxidantes : Glutationa Peroxidasas (GPx) : GPX1, GPX2, GPX3, GPX4, GPX5, GPX6, GPXl, GSTZ1.
Peroxirredoxinas (TPx) : PRDXl, PRDX2, PRDX3, PRDX4 , PRDX5, PRDX6.
Otras Peroxidasas: CAT, CSDE1, CYGB, DU0X1, DU0X2, EPX, GPR156, LPO, MPO, PIP3-E, PTGS1, PTGS2, PXDN, PXDNL, TPO, TT .
Genes implicados en el metabolismo de especies de oxigeno reactivo (ROS) : Superóxido Dismutasas (SOD) : SOD1, S0D2, S0D3.
Otros genes implicados en el metabolismo de superóxido: ALOX12, CCS, CYBA, DUOX1, DUOX2, GTF2I, MT3, NCF1, NCF2 , NOS2A, N0X5, PREX1, PRG3.
Otros genes implicados en el metabolismo de ROS: AOX1, BNIP3, EPHX2, MPV17, SFTPD.
Genes que responden al estrés oxidativo: ANGPTL7, APOE, ATOX1, CAT, CCL5, CSDE1, CYGB, DGDK, DHCR2 , DUOX1, DUOX2, DUSP1, EPX,. FOXM1, GLRX2, GPR156, GPX1, GPX2, GPX3, GPX4 , GPX5,\ GPX6, GPX7, GSS, KR 1, LPO, BL2, MPO, MSRA, MTL5, 5 N E5 , NUDT1 , OXR1, OXSR1, PDLIM1, PIP3-E, PNKP, PRDX2, PRDX5, PRDX6, PRNP, RNF7, SCARA3, SELS, SEPP1, SGK2 , SIRT2, SOD1, S0D2, SRXN1, STK25, TPO, TTN, TXNRD2.
Tabla 12. Evaluación en el tiempo del tratamiento con 100 10 µ? de SKMEL-28. Los cambios en los niveles de ARNm se controlaron a través de métodos de RT-PCR y se evaluó la matriz de proteínas de protección antioxidante y estrés oxidativo.
¦ El factor 2 citosólico de neutrófilos (NCF2, 65kDa, enfermedad granulomatosa crónica, autosomal 2) fue uno de los ARNm más inducidos al inicio (observado a las 6 horas) . Posteriormente, a las 16 horas y en lo sucesivo, el factor 1 citosólico de neutrófilos (NCF1) (enfermedad granulomatosa crónica, autosomal 1) se indujo a niveles muy elevados luego de una fase de retraso inicial.
El factor 2 citosólico de neutrófilos es la subunidad citosólica del complejo multiproteico conocido como NADPH oxidasa, comúnmente encontrada en los neutrófilos. Esta oxidasa produce una explosión de superóxido que se suministra a la luz del fagosoma de neutrófilos. La NADPH oxidasa (nicotinamida adenina dinucleótido fos fato-oxidasa ) es un complejo enzimático unido a la membrana. Se puede encontrar en la membrana plasmática, asi como en la membrana del fagosoma. Está compuesto por seis subunidades .
Estas subunidades son: • una guanosina trifosfatasa Rho (GTPasa) , normalmente Racl o Rac2 (Rae significa sustrato de la toxina botulinica C3 relacionada con Rho) · Cinco unidades "phox" (oxidasa fagocitica) .
• P91-PH0X (contiene hemo) • p22phox • p40phox • p47phox (NCF1) · p67phox (NCF2) Cabe destacar que no cambian otros niveles de NADPH oxidasa. La enzima es NOX5, que es una NADPH oxidasa novedosa que genera superóxido y funciona como un canal H+ de forma dependiente de Ca(2+) .
Adicionalmente, también se reguló por aumento el intercambiador 1 RAC dependiente del 3, , 5-trifosfato de fosfatidilinositol (PREX1) . Esta proteina actúa como un factor de intercambio del nucleótido de guanina para la familia RHO de proteínas de unión a GTP pequeñas (RAC) . Ha mostrado unirse y activar RAC1 intercambiando GDP unida por GTP libre. La proteína codificada, que se encuentra principalmente en el citoplasma, se activa mediante la fosfatidilinositol-3 , 4 , 5-trifosfato y las subunidades beta-gamma de proteínas G heterotriméricas .
La segunda proteína principal inducida temprana fue la sintasa de óxido nítrico 2A (inducible, hepatocitos) (N0S2A) . El óxido nítrico es un radical libre reactivo que actúa como un mediador biológico en diversos procesos, incluyendo la neurotransmisión y las actividades antimicrobianas y antitumorales . Este gen codifica una sintasa de óxido nítrico que se expresa en el hígado y se puede inducir mediante una combinación de lipopolisacáridos y algunas citocinas .
Un ejemplo de una proteína regulada por disminución es FOXMl, que se sabe que tiene una incidencia fundamental en el avance del ciclo celular donde alcanza su pico la expresión de FOXMl endógena en las fases S y G2/M. Estudios recientes han demostrado que FOXMl regula la expresión de una matriz amplia de genes específicos para G2/M, como Plkl, Ciclina B2, Nek2 y CENPF y tiene una incidencia fundamental en el mantenimiento de la segregación cromosomal y la estabilidad genómica. Ahora se conoce al gen F0X1 como un proto-oncogén humano. La regulación por aumento anormal de FOXMl está implicada en la oncogénesis del carcinoma de células básales (BCC) . La regulación por aumento de FOXMl se encontró posteriormente en la mayoría de los cánceres humanos sólidos, incluyendo de hígado, mama,; pulmón, próstata, cérvix, útero, colon, páncreas y cerebro .
Experimento 3 : Matrices de PCR en tiempo real usando una matriz de choque térmico Se ejecutaron matrices de choque térmico para las células de SCC y los datos de genes regulados se resumen a continuación en la Tabla 13.
Tabla 13. Genes de la matriz de choque térmico regulados con el tratamiento con 100 µ? de Q10 en células de SCC matriz de diabetes Los experimentos descritos en este ejemplo se realizaron para analizar la hipótesis general de que la Q10 tendría impacto en genes múltiples y alteraría el estado metabólico de una célula. El ARNm de células SKMEL-28 tratadas con 100 µ? de Q10 se evaluó mediante RT-PCR en comparación con un panel de proteínas diana implicadas en la diabetes y las vías relacionadas. Los resultados de este experimento demuestran que diversas proteínas implicadas en las vías glicólicas y el procesamiento de insulina se ven alteradas en sus niveles de expresión de ARNm (resumen en la Tabla 14) .
Tabla 14. Cambios principales en el nivel de ARNm para las células SKMEL-28 tratadas con 100 µ? de Q10 durante 16 horas.
Los resultados de este experimento inicial muestran que los niveles de ARNm para una variedad de proteínas relacionadas con la insulina se modularon en ambas direcciones. Los resultados indican que la Q10 tendría impacto en el tratamiento y/o la evaluación de la enfermedad diabética.
Luego se realizaron experimentos adicionales para confirmar los resultados obtenidos anteriormente a partir de células SK-MEL-28 tratadas con Q10. Muchos de los genes en las células SK-MEL-28 se regulan ya a las 6 horas luego del inicio del tratamiento con Q10. No obstante, la regulación inicial se vuelve menos evidente a las 16 y las 24 horas. A alrededor de las 48 horas, se descubrió que muchos de los genes en la matriz de diabetes se ven fuertemente regulados otra vez. Los resultados coherentes de dos o más experimentos independientemente se resumen a continuación de la Tabla 15. Las células de SCC también parecieron presentar regulación en algunos genes, tanto a las 6 como a las 24 horas luego del tratamiento con Q10.
Estos resultados a partir de células de SCC se resumen en el Tabla 16, mientras que los genes que se regulan tanto en las células SK-MEL-28 como en las células de SC se resumen en la Tabla 17.
Tabla 15. Genes en las células SK-MEL-28 regulados mediante el tratamiento con 100 µ? de Q10 cuando se analizan según la matriz de diabetes.
Tabla 16 Genes en las células de SCC regulados mediante tratamiento con 100 µ? de Q10 cuando se analizan según matriz de diabetes.
Tabla 17. Genes de la matriz de diabetes regulados con tratamiento con 100 µ? de Q10 tanto para células SK-MEL como SCC Los niveles de ARNm para una variedad de proteínas relacionadas con la insulina se modularon en ambas direcciones. La Q10 tiene impacto en la regulación del metabolismo celular y, por lo tanto, tiene influencia en enfermedades de desregulación metabólica como la diabetes.
Se describen a continuación con más detalle dos proteínas que se modularon de manera significativa.
Cinasa de proteina activada por mitógenos 14 (MAPK14) : La cinasa de proteína activada por mitógenos 14 (MAPK14) es un miembro de la familia de cinasas MAP. Las cinasas MAP actúan como un punto de integración para múltiples señales bioquímicas y están implicadas en una amplia variedad de procesos celulares como el desarrollo y la regulación de la transcripción, la proliferación y la diferenciación. Los resultados de este experimento muestran que la MAPK14 se reguló por disminución de forma significativa .
Factor nuclear de hepatocitos 4 alfa (HNF4A) : HNF4 (factor nuclear de hepatocitos 4) es una proteína del receptor nuclear que se expresa mayormente en el hígado, el intestino, el riñon y las células beta pancreáticas, crítica para el desarrollo del hígado. En humanos, hay dos isoformas de NHF4, alfa y gamma, codificadas por dos genes separados, HNF4A y HNF4G, respectivamente. (Véase, por ej . , Chartier FL, Bossu JP, Laudet V, Fruchart JC, Laine B (1994) . "Cloning and sequencing of cDNAs encoding the human hepatocyte nuclear factor 4 indícate the presence of two isoforms in human liver". Gene 147 (2) : 269-72.) .
' HNF4 se clasificó originalmente como un receptor huérfano. No obstante, luego se descubrió que HNF4 era constitutivamente activa en virtud de su unión continua a una variedad de ácidos grasos. (Véase, por ej . , Sladek F (2002). "Desperately seeking ... something" . Mol Cell 10 (2): 219-221 y Jump DB, Botolin D, ang Y, Xu J, Christian B, Demeure O (2005) . "Fatty acid regulation of hepatic gene transcription" . J Nutr 135 (11)). El dominio de unión al ligando de HNF4, como sucede con otros receptores nucleares, adopta un pliegue intercalado alfa-helicoidal canónico (véase, por ej . , Wisely GB, Miller AB, Davis RG, Thornquest AD Jr, Johnson R, Spitzer T, Sefler A, Shearer B, Moore JT, Miller AB, Willson TM, Williams SP (2002). "Hepatocyte nuclear factor 4 is a transcription factor that constitutively binds fatty acids". Structure 10 (9): 1225-34 y Dhe-Paganon S, Duda K, Iwamoto M, Chi YI, Shoelson SE (2002) . "Crystal structure of the HNF4 alpha ligand binding domain in complex with endogenous fatty acid ligand" . J Biol Chem 277 (41): 37973-6) e interactúa con proteínas coactivadoras . (Véase, por ej . , Duda K, Chi YI, Shoelson SE (2004) . "Structural basis for HNF-4alpha activation by ligand and coactivator binding". J Biol Chem 279 (22): 23311-6) .
Las mutaciones en el gen HNF4-OÍ se han ligado a la diabetes hereditaria juvenil de tipo 2 (MODY) . (Véase, por ej . , Fajans SS, Bell GI, Polonsky KS (2001). "Molecular mechanisms and clinical pathophysiology of maturity-onset diabetes of the young" . N Engl J Med 345 (13): 971-80).
El factor nuclear de hepatocitos 4 (HNF4) es un factor de transcripción especifico tisular que se sabe que regula una gran cantidad de genes en células pancreáticas y hepatocitos. Si bien HNF4 se expresa en gran medida en algunas partes del riñon, se sabe poco acerca de su incidencia en este órgano, asi como acerca de los genes regulados por HNF4 en las células renales. La abundancia y la abtividad de HNF4 se reducen frecuentemente en el carcinoma de células renales (RCC) , lo que indica determinada función de supresión tumoral de HNF4 en las células renales. De manera interesante, muchos de los genes regulados por HNF4 han mostrado verse desregulados en estudios de micromatriz de RCC. Estos genes (ACY1, WT1, SELENBP1, COBL, EFHD1, AGXT2L1, ALDH5A1, THEM2 , ABCB1, FLJ14146, CSPG2, TRIM9 y HEY1) son buenos candidatos para genes: cuya actividad se ve alterada tras el descenso de HNF4 en el RCC.
! : En la estructura del dominio de unión al ligando de HNF4alfa (lM7W.pdb; Dhe-Paganon (2002) JBC, 277, 37973), se observó un lipido pequeño que se co-purificó a partir de la producción de E. coli. El cristal contiene dos conformaciones de la proteina, donde la hélice extendida 10 y la :hélice corta 12 tienen conformaciones alternas. Tras la ex'aminación de la región de unión a lipidos, resultó i interesante observar que hay dos regiones de salida. Una región de salida tiene el grupo principal de lipidos pequeños y se observó que se co-localizan diversas regiones de cavidad con este puerto de salida. Una hipótesis podría ser que la Q10 se une específicamente a este factor de transcripción. Cuando la Q10 se modela en este túnel de unión¡ a lipidos, el anillo de Q10 encajaría en la cavidad superficial (Figura 28) . Una mutación de pérdida de función conocida (E276Q) tendría el potencial de ordenar los residuos que recubren esta cavidad superficial y, por lo tanto1, tienen un impacto negativo en la supuesta unión a la Q10. : Adicionalmente, con este modelo de unión a la Q10, la i cola 1 hidrofóbica se extendería más allá de la cavidad interna y entonces interactuaría con la hélice extendida 10. Por lo tanto, esta interacción podría potencialmente alterar la conformación del grupo 10/12 helicoidal. Esto luego1 podría alterar el equilibrio de i activación/inactivación de la actividad del factor de i transcripción. i EJEMPLO 7 : Análisis de micromatriz de anticuerpos La evaluación de la concentración de proteínas debido a la presencia de Q10 se evaluó a través de la utilización de métodos de micromatriz de anticuerpos. La micromatriz contenia anticuerpos para más de 700 proteínas, con muestras de un amplio espectro de tipos de proteínas y posibles marcadores de vías.
Se realizó un experimento inicial para evaluar los cambios en el nivel de concentración de proteína en células tratadas con Q10 con una micromatriz de anticuerpos (matriz de anticuerpos Panorama XP725, Sigma) y células SK-MEL-28 tratadas durante 6 o 24 horas. Las células se recolectaron y se, extrajeron para obtener un sobrenadante proteico soluble. Se etiquetaron dos porciones de proteína (~1 mg total) de cada muestra (a 1 mg/mL) con tinte fluorescente (Cy3 y Cy5, respectivamente) . El exceso de tinte se retiró de la proteína y el material se utilizó para las incubaciones de micromatrices . Para comparar dos muestras de puntos de tiempo diferentes, se mezclaron cantidades iguales de proteína, con cada muestra de diferente tipo de etiqueta (por ej . , el extracto a las 3 horas etiquetado con Cy3 se mezcló con el extracto a las 24 horas etiquetado con' Cy5) ., Luego de la incubación con el chip de micromatriz (de acuerdo con los protocolos recomendados por los fabricantes), los chips se lavaron y se secaron. Las micromatrices se analizaron con un escáner de láser fluorescente para medir la intensidad de fluorescencia relativa para los tintes Cy3 y Cy5.
Tabla 18. Proteínas con mayores niveles en las células SK-MEL-28 luego del tratamiento de 24 horas con 50 µ? de Q10 Tabla 19. Proteínas con mayores niveles en las células SK-MEL-28 luego del tratamiento de 24 horas con 50 µ? de Q10 Para confirmar las proteínas de apoptosis previamente observadas y para expandir la evaluación a una cantidad mayor de proteínas pro-apoptosis y anti-apoptosis, se eligieron dos métodos de ensayo que podían analizar la amplia familia de proteínas posiblemente implicadas.
En primer lugar, se utilizó una micromatriz de anticuerpos (matriz de anticuerpos Panorama XP725, Sigma) para analizar más de 700 anticuerpos de proteínas para evaluar los cambios en el nivel de concentración de proteína en células SK-MEL-28 tratadas durante 24 horas con 50 µ? de Q10.
De los experimentos de matriz de anticuerpos, en SKMEL-28 con Q10 (24 hr) , las siguientes son algunas de las proteínas identificadas con niveles alterados: Bcl-xl, Bmf, BTK, BLK, cJun (pSer63) , Conexina 32, PUMA bbc3, BID, Par4, cCbl . La conclusión clave de este estudio inicial fue que se alteran las proteínas pro-apoptosis esperadas.
Micromatriz de anticuerpos para SK-MEL-28 1 Se utilizó una micromatriz de anticuerpos (matriz de anticuerpos Panorama XP725, Sigma) para analizar más de 700 anticuerpos de proteínas para evaluar los cambios en nivel de concentración de proteína en células SK- EL tratadas durante 24 horas con 50 µ? de Q10.
Tabla 20. Cambios en los niveles de proteína en SKMEL-28 tratadas con 50 µ? de De los experimentos de matriz de anticuerpos, en SKMEL-28 con Q10 (24 hr) , las siguientes son algunas de las proteínas identificadas con niveles alterados: Bcl-xl, Bmf, BTK, IBLK, cJun (pSer63) , Conexina 32, PUMA bbc3, BID, Par4, cCbl . Estos datos confirman que los niveles de proteínas pro-ápoptosis se ven alterados tras la incubación con niveles elevados de Q10 agregada de forma exógena.
Bcl-xl ("linfoma de células básales -extra largo") es una molécula transmembrana en la mitocondria . Está implicada en la vía de transducción de señales del FAS-L y es una de las varias proteínas anti-apoptóticas miembro de la familia de proteínas Bcl-2. Ha estado implicada en la supervivencia de células cancerosas. No obstante, se sabe que el corte y empalme alternativo de ARNm de Bcl-x humano puede dar como resultado al menos dos especies de ARNm de Bcl-x distintas, Bcl-xL y Bcl-xS . El producto de proteína predominante (233 aminoácidos) es el ARNm de Bcl-x mayor, Bcl-xL, que inhibe la muerte celular tras el retiro del facto,r de crecimiento (Boise et ál., 1993. Cell 74, 597-608) . Bcl-xS, por otra parte, inhibe la capacidad de Bcl-2 de inhibir la muerte celular y vuelve a las células más susceptibles a la muerte celular apoptótica. 1 Tabla 21. Proteínas con mayores niveles en las células de SCC luego del tratamiento de 24 horas con 100 µ? de Q10 Tabla 22. Proteínas con menores niveles en las células de SCC luego del tratamiento de 24 horas con 100 µ? de Q10 EJEMPLO 8: Análisis de transferencia Western El primer experimento procesado y evaluado mediante transferencia Western y electroforesis en gel 2-D se realizó en la linea celular de cáncer de piel SKMEL-28. Este conjunto experimental implicó células SK- EL-28 tratadas a las 3, 6, 12 y 24 horas con 50 o 100 µ? de Q10.
Se evaluó una variedad de tipos de células mediante análisis de transferencia Western en comparación con un anticuerpo para Bcl-xL (Figura 14), un anticuerpo para Vimentina (Figura 15) , una serie de anticuerpos para la función de fosforilación oxidativa mitocondrial (Figuras 16-21) y en comparación con una serie de anticuerpos relacionados con la integridad de la membrana mitocondrial (Figuras 22-27) . Los resultados de estos experimentos demostraron que muchas de las proteínas examinadas se regularon por aumento o se regularon por disminución como resultado del tratamiento de células con Q10.
EJEMPLO 9 : Genes relacionados con la diabetes que se detectó que se modulaban en el nivel de ARNm mediante el tratamiento de células de cáncer pancreático (PaCa2) con 100 um de Q10 Se ejecutaron matrices de diabetes para muestras tratadas con lOOuM de Q10 en diversos puntos de tiempo luego del tratamiento. Los experimentos se realizaron esencialmente como se describió anteriormente. Los diversos genes que se encontró que se modulaban tras el tratamiento con Q10 se resumen en la Tabla 23 a continuación. Los resultados mostraron que los siguientes genes se modulan mediante el tratamiento con Q10: ABCC8, ACLY, ADRB3, CCL5, CEACAM1, CEBRA, FOXG1, FOXP3, G6PD, GLP1R, GPD1, HNF4A, ICAM1, IGFBP5 , INPPL1, IRS2, MAPK1 , ME1, NFKB1, PARP1, PIK3C2B, PIK3CD, PPARGC1B, PRKAG2, PTPN1, PYGL, SLC2A4, SNAP25, HNFlB, TNRFSF1A, TRIB3, VAPA, VEGFA, IL4R e IL6.
! Tabla 23: Genes de la matriz de diabetes cuya expresión se regula con 100 µ de Q10 y sus posibles funciones en una célula regulada por aumento (gris) y regulada por disminución (blanco) EJEMPLO 10 : Genes relacionados con la angiogénesis que se detectó que se modulaban en el nivel de ARNm mediante el tratamiento de células de cáncer I pancreático (PaCa2) con 100 um de Q10 Se ejecutaron matrices de angiogénesis para muestras tratadas con lOOuM de Q10 en diversos puntos de tiempo luego del tratamiento. Los experimentos se realizaron esencialmente como se describió anteriormente. Los diversos genes que se encontró que se modulaban tras el tratamiento con Q10 se resumen en la Tabla 24 a continuación. Los resultados mostraron que los siguientes genes se modulan mediante el tratamiento con Q10: AKTl, ANGPTL4, ANGPEP, CCL2, CDH4, CXCL1, EDG1, EFNA3, EFNB2, EGF, FGF1, ID3, IL1B, IL8, KDR, NRP1, PECAM1, PR0K2 , SERPINF1, SPHK1, STAB1, TGFB1, VEGFA y VEGFB.
Tabla 24: Lista de genes de la matriz de angiogénesis cuya expresión se regula con 100 µ? de Q10 y sus posibles funciones en una célula regulada por aumento (gris) y regulada por disminución (blanco) célula-célula, regulación negativa de la angiogénesis , respuesta de defensa a la bacteria VEGFÁ Anti-apoptosis, regula el TNF, regulado por HIF1 EJEMPLO 11: Genes relacionados con la apoptosis que se detectó que se modulaban en el nivel de ARNm mediante el tratamiento de células de cáncer pancreático (PaCa2) con 100 um de Q10 Se ejecutaron matrices de apoptosis para muestras tratadas con lOOuM de Q10 en diversos puntos de tiempo luego del tratamiento. Los experimentos se realizaron esencialmente como se describió anteriormente. Los diversos genes ¡que se encontró que se modulaban tras el tratamiento con Q10 se resumen en la Tabla 25 a continuación. Los resultados mostraron que los siguientes genes se modulan mediante el tratamiento con Q10: ABL1, AKT1, Bcl2Ll, BclAFl, CASP1, CASP2 , CASP6, CIDEA, FADD, LTA, TNF, TNFSF10A y TNFSF10. 1 Tabla 25: Lista de genes de la matriz de apoptosis cuya expresión se regula con 100 µ? de Q10 y sus posibles funciones en una célula regulada por aumento (gris) y regulada por disminución (blanco) EJEMPLO 12: Matrices de diabetes en PCR en células cáncer de hígado (HepG2) Se trataron células (de cáncer de hígado) HepG2 con el vehículo durante 24 horas o con 100 µ? de Q10 en diferentes duraciones. El tratamiento se inició en lxlO5 células por pocilio, siguiendo el procedimiento utilizado en las células PaCa2 (anteriormente, Ejemplos 9-11) . No obstante, la cantidad total de ARN que se extrajo de estas muestras fue menor a la esperada. La transcripción inversa se realiza normalmente usando 1 µg de ARN total (determinado con medición a 260 nm) . El volumen máximo que se puede utilizar por transcripción inversa es de 8 µ? . Dado que la concentración de ARN fue baja, el análisis de matrices de RT-PCR usando el vehículo y muestras tratadas con Q10 de 16 horas y 48 horas se realizó usando 0.44 pg de ARN. Las matrices proporcionaron un análisis inicial de tendencias y patrones en la regulación génica de HepG2 con el tratamiento con 100 µ? de Q10, como se resume en la Tabla 26 a continuación. Los resultados mostraron que cada uno de los genes PPARGC1A, PRKAA1 y SNAP25 se reguló por disminución a las 16 horas después del tratamiento (en aproximadamente 20 veces, 6 veces y 5 veces, respectivamente) . A las 48 horas después del tratamiento, PPARGC1A y PRKAA1 se habían normalizado o se habían regulado ligeramente por aumento, mientras que SNAP25 se había regulado por disminución en aproximadamente 2 veces.
Tabla 26: Lista de genes regulados en las matrices de diabetes cuando se tratan las células HepG2 con 100 µ de Q10 EJEMPLO 13: Matriz de angiogénesis en PCR en células de cáncer de hígado (HEP62) !Se trataron células (de cáncer de hígado) HepG2 con el vehículo durante 24 horas o con 100 µ? de Q10 en diferentes duraciones. El tratamiento se inició en 1x105 células por pocilio, siguiendo el procedimiento utilizado en las células PaCa2 (anteriormente, Ejemplos 9-11) . No obstante, la cantidad total de ARN que se extrajo de estas muestras fue menor a la esperada. La transcripción inversa se realiza normalmente usando 1 pg de ARN total (determinado con medición a 260 nm) . El volumen máximo que se puede utilizar por transcripción inversa es de 8 µ?. Dado ;que la concentración de ARN fue baja, el análisis de matrices de RT-PCR usando el vehículo y muestras tratadas con Q10 de 16 horas y 48 horas se realizó usando 0.44 ]ig de ARN. ', Las matrices proporcionaron un análisis inicial de tendencias y patrones en la regulación génica de HepG2 con el tratamiento con 100 µ? de Q10, como se resume en la Tabla¡ 27 a continuación. Los diversos genes qué se encontró que s,e modulaban tras el tratamiento con Q10 se resumen en la Tabla 27 a continuación. Los resultados mostraron que cada ¡uno de los genes ANGPTL3, ANGPTL4, CXCL1, CXCL3, CXCL5, ENG, MMP2 y TIMP3 se regularon por aumento a las 16 horas, después del tratamiento (en aproximadamente 5.5, 3, 3, 3'.2, 3, 3, 1 y 6.5 veces, 6 veces y 5 veces, respectivamente, con respecto al control) . ID3 se reguló por disminución a las 16 horas después del tratamiento con Q10, en aproximadamente 5 veces con respecto al control. A las 48 horas después del tratamiento, ANGPTL3 , CXCL1, i CXCL3; ENG y TIMP3 se mantenían regulados por aumento (en I aproximadamente 3.5, 1.5, 3.175, 2 y 3 veces, respectivamente, con respecto al control) , mientras que ANGPTL4, CXCL5, ID3 y MMP2 se regularon por disminución en i aproximadamente 1, 1, 2 y 18 veces, respectivamente, respecto al control.
: Tabla 27: Lista de genes regulados en la matriz angiogénesis cuando las células HepG2 se trataron con u de Q10 Las proteínas que se sabe que están implicadas en el proceso de angiogénesis fueron componentes en la matriz de RT-PCR. La angiogénesis es un proceso crítico mediante el cual las células cancerosas se vuelven malignas. Algunas de estas proteínas también están implicadas en la diabetes.
ANGPTL3 y ANGPTL : La literatura relacionada con ANGPTL3 conecta esta proteína con la regulación del metabolismo lipídico. En particular, la literatura (Li, C. Curr Opin Lipidol. abril de 2006; 17 (2) : 152-6) enseña que tanto las ¼ angiopoyetinas como las proteínas tipo angiopoyetina comparten estructuras de dominio similares. ANGPTL3 y 4 son los dos únicos miembros de esta superfamilia que inhiben la actividad de la lipoproteína lipasa. No obstante, ANGPTL3 y 4 se regulan de forma diferencial en niveles múltiples, lo que sugiere funciones no-redundantes in vivo. ANGPTL3 y 4 se procesan de forma proteolitica en dos mitades y se regulan de forma diferencial mediante receptores nucleares. La sobreexpresión transgénica de ANGPTL4, asi como la inactivación génica de ANGPTL3 o 4 demuestran que estas dos proteínas tienen una incidencia fundamental en el metabolismo de lipoproteínas : la ANGPTL3 derivada del hígado inhibe la actividad de la lipoproteína lipasa principalmente en el estado posprandial, mientras que ANGPTL4 tiene una gran incidencia tanto en el estado posprandial como en el estado en ayunas. Además, ANGPTL4 regula el suministro de ácidos grasos derivados de lipoproteína específico en tejidos. ANGPTL4 es, por lo tanto, un inhibidor endocrino o autócrino/paracrino de la lipoproteína lipasa, dependiendo de sus sitios de expresión.
La lipoproteína lipasa es una enzima que hidroliza lípidos en lipoproteínas, como los que se encuentran en quilomicrones y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) en tres ácidos grasos libres y una molécula de glicerol. La actividad de la lipoproteína lipasa en un tejido dado es la etapa limitante para la absorción de ácidos grasos derivados de triglicéridos . Los desequilibrios en la división de ácidos grasos tienen consecuencias metabólicas muy importantes. Las dietas altas en grasas han mostrado que ocasionan una sobreexpresión de LPL específica en tejidos, que se ha implicado en la resistencia a la insulina especifica de tejidos y el desarrollo consiguiente de diabetes mellitus tipo 2.
Los resultados en este Ejemplo indican que la Q10 modula proteínas implicadas en el metabolismo lipídico y, por ! lo tanto, amerita una mayor investigación de ANGPTL3/ANGPTL4 y sus vías relacionadas. Por ejemplo, se ha indicado que ANGPTL3/ANGPTL4 han tienen incidencia en las siguientes vías: Akt, colesterol, ácido graso, colesterol HDL, 'HNF1A, ITGA5, ITGA5, ITGAV, ITG83, trilodotinonina L, LIPG, LPL, apk, Nrth, NR1H3, PPARD, PTK2, RXRA, triacilglerol y ácido 9-cis-retinoico .
EJEMPLO 14: Matriz de apoptosis en PCR en células de cáncer de hígado (HEP62) : Se ejecutaron matrices de apoptosis para muestras tratadas con 100 uM de Q10 durante 16 y 48 horas como se describió anteriormente. No obstante, la matriz para las 48 horas se ejecutó con FAM como el fluoróforo en lugar de SYBR. Tanto el FAM como SYBR fluorescen a la misma longitud de onda.
Los diversos genes que se encontró que se modulaban tras el tratamiento con Q10 se resumen en la Tabla 28 a continuación. Los resultados mostraron que CASP9 se reguló por aumento a las 16 horas después del tratamiento con Q10 en aproximadamente 61 veces con respecto al control, mientras que BAGl y TNFRSFIA se regularon por disminución a las 16 horas después del tratamiento en aproximadamente 6 y 4 veces, respectivamente, con respecto al control. A las 48 horas después del tratamiento, CASP9, BAGl y TNFRSFIA se regularon por aumento en aproximadamente 55, 1 y 1 vez, respectivamente, con respecto al control. i Tabla 28: Lista de genes regulados en la matriz de apoptosis cuando las células HepG2 se trataron con 100 µ? de Q10 EJEMPLO 15: Evaluación de la capacidad de la MIM o el cambiador Epi de tratar un trastorno oncológico Se evaluó la capacidad de una MIM o un cambiador Epi seleccionados, por ej . , CoQlO, de tratar un trastorno oncológico, por ej., melanoma, en un modelo murino. Los tumores de melanoma se inducen en ratones mediante inyección de SK-MEL28 en la capa subcutánea. El estudio animal consiste en un grupo de tratamiento y uno de control, cada uno con cuatro ratones. Los ratones se inoculan con dos tumores. Se aplica una formulación tópica de la MIM o el cambiador Epi a los tumores en el grupo de tratamiento diariamente durante un periodo de 30 días, luegq de lo cual los tumores se extirpan y se determina la masa.1 Se identifica una MIM o un cambiador Epi como eficaz en el tratamiento del tumor cuando la diferencia en la masa media general del grupo de tratamiento es significativa en comparación con el control.
Ejemplo 16 : Identificación de una MIM asociada con un trastorno oncológico Para evaluar una molécula candidata (por ej . , un influenciador ambiental) como una MIM potencial, la MIM candidata seleccionada se agregó de forma exógena a un panel de líneas celulares, incluyendo líneas celulares enfermas (de cáncer) y líneas celulares de control normal y se analizaron los cambios inducidos en el perfil de microambiente celular para cada línea celular en el panel. Los cambios en la morfología, la fisiología celular y/o la composición celular, incluyendo, por ejemplo, niveles de ARNm y de proteína, se evaluaron y compararon para las células enfermas en comparación con las células normales.
Los cambios en la morfología/fisiología celular se evaluaron examinando la sensibilidad y la respuesta apoptotica de las células a la MI candidata. Estos experimentos se realizaron como se describió con detalle en el Ejemplo 3. En resumen, se trató un panel de líneas celulares que consistía en al menos una línea celular de control y al menos una línea celular de cáncer con diversas concentraciones de la MIM candidata. Se evaluó la sensibilidad de las líneas celulares a la posible MIM controlando la supervivencia celular en diversos puntos de tiempo, así como con respecto al rango de concentraciones aplicadas. La respuesta apoptotica de las líneas celulares a la: posible MIM se evaluó usando, por ejemplo, reactivo nexina en combinación con metodologías de citometría de flujo. El reactivo nexina contenía una combinación de dos tintes, 7AAD y anexina-V-PE y permitió la cuantificación de la población de células con apoptosis temprana y tardía. Se puede usar un ensayo de apoptosis adicional que mide el ADN de cadena única, usando, por ejemplo metodologías de ELISA APOSTRAND™. Se evaluaron y compararon la sensibilidad y la respúesta apoptotica de la enfermedad y las líneas celulares de control. Una molécula que presentó citotoxicidad diferencial y/o que indujo de forma diferencial la respuesta apoptotica en las células enfermas en comparación con las células normales se identificó como una MI .
¦ Se evaluaron los cambios en la composición de las células después del tratamiento con la MIM candidata . Los cambios en la expresión génica a nivel del ARNm se analizaron usando metodología de matriz de PCR en tiempo real.; Estos experimentos se realizaron como se describió con detalle en los Ejemplos 6 y 9-13. En resumen, la MIM candidata se agregó de forma exógena a una o más líneas celulares incluyendo, por ejemplo, una línea celular enferma y una línea celular de control normal y el ARNm se extrajo de las células en diversos puntos de tiempo después del tratamiento. El nivel de ARNm para genes implicados en vías específicas se evaluó usando matrices de vías dirigidas, incluyendo, por ejemplo, matrices específicas para apoptosis, estrés oxidativo y protección antioxidante, angiogénesis, choque térmico o diabetes. Los genes que se alteraron en su transcripción de ARNm en un nivel doble o mayor se identificaron y se evaluaron. Una molécula que indujo cambios en los niveles de ARNm en células y/o que indujo cambios diferenciales en el nivel de uno o más ARNm en las células enfermas en comparación con las células normales se identificó como una MIM.
En experimentos complementarios, los cambios en la expresión génica a nivel de proteina se analizaron usando metodología de micromatriz de anticuerpo, electroforesis en gel bidimensional seguida por identificación de proteínas usando caracterización de espectrometría de masas y análisis de transferencia western. Estos experimentos se realizaron como se describió con detalle en los Ejemplos 7, 4 y 8, respectivamente. En resumen, la MIM candidata se agrego de forma exógena a una o más líneas celulares incluyendo, por ejemplo, una línea celular enferma y una línea celular de control normal y la proteína soluble se extrajo de las células en diversos puntos de tiempo por ej . , a las 6 horas o 24 horas después del tratamiento. Los cambios inducidos en los niveles de proteína mediante la MIM candidata se evaluaron usando una micromatriz de anticuerpos que contenía anticuerpos para más de 700 proteínas, con muestras de un amplio espectro de tipos de proteínas y posibles marcadores de vías. Se puede realizar un análisis proteómico complementario adicional utilizando electroforesis en gel bidimensional (2-D) acoplada a metodologías de espectrometría de masas. La MIM candidata se agregó de forma exógena a una o más líneas celulares incluyendo, por ejemplo, una línea celular enferma y una línea celular de control normal y los sedimentos celulares se lisaron y se sometieron a electroforesis en gel 2-D. Los geles se analizaron para identificar cambios en los niveles de proteína en las muestras tratadas con relación a las muestras de control sin tratar. Se analizaron los geles para identificar cambios en las manchas con el transcurso del tratamiento debido a niveles mayores, niveles menores o modificación postraduccional . Se extirparon las manchas que presentaban cambios estadísticamente significativos y se presentaron para identificación proteica mediante digestión con tripsina y caracterización por espectrometría de masas. Los peptidos caracterizados se cotejaron con bases de datos de proteínas, por ejemplo, con análisis con el software ascot y SRAT para identificar las proteínas. Además del análisis en gel 2-D y los experimentos de micromatriz de anticuerpos que anteceden, los posibles cambios en los niveles de proteínas específicas inducidos por la MIM candidata se pueden evaluar mediante análisis de transferencia Western. En todos los experimentos proteómicos, las proteínas con mayores o menores niveles en las diversas líneas celulares se identificaron y evaluaron. Una molécula que indujo cambios en los niveles de proteína en células y/o que indujo cambios diferenciales en el nivel de una o más proteínas en las células enfermas en comparación con las células normales se identificó como una MIM.
Los genes que se descubrió que se modulaban con el tratamiento con una MIM candidata de los experimentos que anteceden se sometieron a análisis de vía celular y bioquímica y, por lo tanto, se pueden dividir en categorías en diversas vías celulares, incluyendo, por ejemplo, apoptosis, biología de cáncer y crecimiento celular, glucólisis y metabolismo, transporte molecular y señalización celular.
; Se realizaron experimentos para confirmar el ingreso de uña MIM candidata a las células, para determinar si la IM 'candidata se llega a ubicar en la célula y para determinar el nivel y la forma de la MIM candidata presente en las células. Estos experimentos se realizaron, por ejemplo, como se describió con detalle en el Ejemplo 5. Por ejemplo, para determinar el nivel y la forma de la MIM candidata presente en la mitocondria, se prepararon y analizaron preparaciones enriquecidas con mitocondria a partir de células tratadas con la MIM candidata. Se puede confirmar de esa forma que el nivel de la MIM candidata presente en la mitocondria aumenta en una forma dependiente del tiempo y la dosis con la adición de MIM candidata exógena. Además, los cambios en los niveles de proteína de muestras enriquecidas con mitocondria se analizaron usando electroforesis en gel 2-D e identificación de proteínas mediante caracterización de espectrometría de masas, como se describió anteriormente para las muestras de proteína celular totales. Las MIM candidatas que se determinó que ingresaron a la célula y que estaban presentes en niveles mayores, por ej . , en la mitocondria, se identificaron como MIM. Los niveles de la MIM candidata en la célula o, por ejemplo, específicamente en la mitocondria, durante el período examinado, pueden tener correlación con otros cambios celulares observados, como lo prueban, por ejemplo, la modulación de los niveles de ARNm y proteína para proteínas específicas.
Las MIM candidatas que se observó que inducían cambios en la composición celular, por ej . , que inducían cambios en la expresión génica a nivel del ARNm o la proteína, se identificaron como MIM. Las MIM candidatas que se observó que inducían cambios diferenciales en la morfología celular, la fisiología o la composición celular (por ej., cambios diferenciales en la expresión génica a nivel del ARNm o la proteína) , en un estado de enfermedad (por ,ej . , cáncer), en comparación con un estado normal (por ej., no canceroso), se identificaron como MIM y, en particular, se indicó que poseían un carácter multidimensional. Las MIM candidatas que se encontró que podían ingresar a la célula se identificaron como MIM y, en particular, se indicó que tenían carácter multidimensional, dado que la MIM candidata presenta de esa forma un efecto portador además de un efecto terapéutico.
Ejemplo 17: Identificación de CoQlO como un cambiador asociado con un trastorno oncológico Se trató un panel de lineas celulares de la piel que consistía en líneas celulares de control (cultivo primario de queratinocitos y melanocitos) y diversas líneas celulares de cáncer de piel (SK- EL-28, un melanoma de piel no metastásico; SK-MEL-2, un melanoma de piel metastásico o SCC, :un carcinoma de células escamosas; PaCa2, una línea celular de cáncer pancreático o HEP-G2, una línea celular de cáncer de hígado) con diversos niveles de coenzima Q10. Las líneas celulares cancerosas presentaron una respuesta dependiente de la dosis alterada en comparación con las líneas celulares de control con una inducción de apoptosis y muerte celular en las células cancerosas únicamente. Se presentan ejemplos detallados de experimentos, por ej . , en el Ej emplo 3 en la presente.
Se usaron ensayos para evaluar los cambios en la composición de los niveles de ARNm y proteína de las células antedichas después del tratamiento con CoQlO. Los cambios en la expresión de ARNm se analizaron usando micromatrices de PCR en tiempo real específicas para cada uno de apoptosis, estrés oxidativo y antioxidantes, angiogénesis y diabetes. Los cambios en la expresión de proteínas se analizaron usando análisis de micromatriz de anticuerpos y análisis de transferencia western. Los resultados de estos ensayos demostraron que los cambios significativos en la expresión génica, tanto a nivel del ARNm como de la proteína, se produjeron en las líneas celulares debido a la adición de la coenzima Q10. Se observó que diversos genes que se sabe que están asociados con o implicados en los procesos metabólicos celulares se modularon como resultado del tratamiento con CoQlO. Por ejemplo, se descubrió que la expresión de la proteina del receptor nuclear HNF4A se modulaba por aumento en las células luego del tratamiento con Q10. También se moduló la expresión de transaldolasa 1 (TAL) en las células tratadas con Q10. TAL equilibra los niveles de NADPH y el intermediario de oxigeno reactivo, mediante lo cual se regula el potencial de transmembrana mitocondrial, que es un punto de control critico de la síntesis de ATP y la supervivencia celular. De particular relevancia para los trastornos oncológicos, se identificaron diversos genes que se sabe que están asociados, por ej . , con la apoptosis, la biología de cáncer y el crecimiento celular, como regulados por la Q10. Se presentan ejemplos detallados de experimentos, por ej . , en los Ejemplos 4, 6, 7, 8 y 9 en la presente .
. La Q10 es un cofactor esencial para los procesos de fosforilación oxidativa en la mitocondria para la producción energética. El nivel de la coenzima Q10, así como : la forma de CoQlO presente en la mitocondria se determinó mediante el análisis de preparaciones enriquecidas con mitocondria a partir de células tratadas con GoQlO. Se confirmó que el nivel de la coenzima Q10 presente en la mitocondria aumentó en una forma dependiente del tiempo y la dosis con la adición de Q10 exógena. El transcurso del tiempo tuvo correlación con una amplia variedad de cambios celulares según se observó en la modulación de los niveles de ARNm y proteína para proteínas específicas relacionadas con vías metabólicas y apoptóticas. Se presentan ejemplos detallados de experimentos, por ej . , en el Ejemplo 5 en la presente, i ' Los resultados descritos en la presente identificaron la molécula endógena CoQlO como un cambiador epi . En particular, los resultados indicaron que la CoQlO inducía un cafnbio en el estado metabólico y la restauración parcial de ia función mitocondiral en las células. Estas conclusiones se basan en la siguiente interpretación de los datos , descritos en la presente y el conocimiento actual en la técnica correspondiente.
; Se sabe que la Q10 se sintetiza, se transporta de forma, activa a, se enriquece en y se utiliza en la membrana interna mitocondrial . También se sabe que la Q10 es un cofactor esencial para los procesos de fosforilación oxidativa en la mitocondria para la producción energética. No obstante, la mayoría de las células cancerosas producen predominantemente energía mediante glucólisis, seguida por fermentación de ácido láctico en el citosol, en lugar de mediante oxidación de piruvato en la mitocondria como la mayoría de las células normales. La fosforilación oxidativa implica los complejos de transporte de electrones y el citocromo c. La apoptosis implica la alteración de la mitocondria, con permeabilización de la membrana mitocbndrial interna mediante factores pro-apoptóticos . Al utilizar una vía de síntesis de energía metabólica diferente, las células cancerosas pueden mitigar la respuesta normal a la apoptosis hasta niveles anormales en la célula. Si bien no' desean limitarse por la teoría, los solicitantes proponen que la Q10 funciona regulando por aumento las proteínas de la vía de fosforilación oxidativa y así' produce un cambio en la función mitocondrial hasta un estado que reconocería los defectos oncogénicos y i desencadenaría la apoptosis. Por lo tanto, la Q10 actúa como un cambiador Epi al cambiar el estado metabólico de la célula.
Ejemplo 18: Identificación de un cambiador Epi asociado con un trastorno oncológico ¡ Se trató un panel de líneas celulares de la piel que consistía en líneas celulares de control (por ej . , cultivo primario de queratinocitos y melanocitos) y líneas celulares cancerosas (por ej . , SK-MEL-28, un melanoma de piel ' no metastásico; SK-MEL-2, un melanoma de piel metastásico o SCC, un carcinoma de células escamosas; PaCa2, una línea celular de cáncer pancreático o HEP-G2, una celular de cáncer de hígado) con diversos niveles de ún cambiador Epi candidato. Los cambios en la morfología/fisiología celular se evaluaron examinando la sensibilidad y la respuesta apoptótica de las células al cambiador Epi candidato. Estos experimentos se realizaron como se describió con detalle en el Ejemplo 3. En resumen, se evaluó la sensibilidad de las líneas celulares al cambiador Epi candidato controlando la supervivencia celular en diversos puntos de tiempo y en un rango de concentraciones aplicadas. La respuesta apoptótica de las líneas celulares al cambiador Epi candidato se evaluó usando, por ejemplo, reactivo nexina en combinación con metodologías de citometría de flujo. El reactivo nexina i contenía una combinación de dos tintes, 7AAD y anexina-V-PE i y permitió la cuantificación de la población de células con apoptpsis temprana y tardía. Se puede usar un ensayo de apoptpsis adicional que mide el ADN de cadena única, usando, por ejemplo metodologías de ELISA ApostrandTM. Se evaluaron y compararon la sensibilidad y la respuesta apoptótica de la enfermedad y las líneas celulares de control. Los cambiadores Epi candidatos se evaluaron con base 'en su capacidad de inhibir el crecimiento celular preferente o selectivamente en células cancerosas, en comparación con las células normales o de control. Los cambiadores Epi candidatos se evalúan adicionalmente con base n su capacidad de inducir preferente o selectivamente la appptosis en células cancerosas en comparación con las células normales o de control.
Se usaron ensayos para evaluar los cambios en la composición del nivel de ARNm y proteina de las células antes' identificadas después del tratamiento con el cambiador Epi candidato. Los cambios en los niveles de ARNm se analizaron usando micromatrices de PCR en tiempo real. Estos experimentos se realizaron como se describió con detalle en los Ejemplos 6 y 9-13. En resumen, el ARNm se extrajo de las células en diversos puntos de tiempo después del tratamiento. El nivel de ARNm para genes implicados en vías especificas se evaluó usando matrices de vías dirigidas, incluyendo matrices especificas para apoptosis, estrés oxidativo y protección antioxidante, angiogénesis, choque térmico o diabetes. Los genes que se alteraron en su transcripción de ARNm en un nivel doble o mayor se identificaron y se evaluaron.
Los cambios en la expresión de proteina se analizaron usando análisis de micromatriz de anticuerpo, análisis de electroforesis en gel 2-D acoplado con caracterización por espectrometría de masas y análisis de transferencia western. Estos experimentos se realizaron como se describió con detalle en los Ejemplos 7, 4 y 8, respectivamente. En resumen, se extrajo la proteína soluble de las células en diversos puntos de tiempo, por ej . , a las 6 horas o las 24 horas, después del tratamiento con el cambiador Epi candidato. Los cambios inducidos en los niveles de proteina mediante el cambiador Epi candidato se evaluaron usando una micromatriz de anticuerpos que contenia anticuerpos para más de 700 proteínas, con muestras de un amplio espectro de tipos de proteínas y posibles marcadores de vías. Se puede realizar un análisis proteómico complementario adicional utilizando electroforesis en gel bidimensional (2-D) acoplada a metodologías de espectrometría de masa. El cambiador Epi candidato se agregó de forma exógena a las líneas celulares y los sedimentos celulares se lisaron y se sometieron a electroforesis en gel 2-D. Los geles se analizaron para identificar cambios en los niveles de proteína en las muestras tratadas con relación a las muestras de control sin tratar. Se analizaron los geles para identificar cambios en las manchas con el transcurso del tratamiento debido a niveles mayores, niveles menores o modificación postraduccional . Se extirparon las manchas que presentaban cambios estadísticamente significativos y se presentaron para identificación proteica mediante digestión con tripsina y caracterización por espectrometría de masas. Los péptidos caracterizados se cotejaron con bases de datos de proteínas, por ejemplo, con análisis con el software Mascot y MSRAT para identificar las proteínas. Además del análisis en gel 2-D y los experimentos de micromatriz de anticuerpos que anteceden, los posibles cambios en los niveles de proteínas específicas inducidos por la IM candidata se pueden evaluar mediante análisis de transferencia Western. En todos los experimentos proteómicos, las proteínas con mayores o menores niveles en las diversas líneas celulares se identificaron y evaluaron.
¦ Los cambiadores Epi candidatos se evaluaron con base en los cambios inducidos a la expresión génica en los niveles de ARNm y/o proteína, en las líneas celulares debido a la adición del cambiador Epi candidato. En particular, los cambiadores Epi candidatos se evaluaron con base en su capacidad de modular genes que se sabe que están asociados con o implicados en procesos metabólicos celulares. De particular relevancia para los trastornos oncológicos, los cambiadores Epi candidatos se evaluaron con base en su capacidad de modular genes que se sabe que están asociados, por ejemplo, con la apoptosis, la biología de cáncer y el crecimiento celular.
El nivel del cambiador Epi candidato, así como la forma del cambiador Epi candidato presente en la célula o una ubicación celular particular se determina usando métodos habituales conocidos por los expertos. Por ejemplo, el nivel de cambiador Epi candidato en la mitocondria en el tiempo y en un espectro de dosis se determina analizando preparaciones enriquecidas con mitocondrias de células tratadas con el cambiador Epi candidato. Los niveles del cambiador Epi en la mitocondria en el tiempo se pueden comparar y correlacionar con otros cambios celulares observados, como la modulación del ARNm y los niveles de proteina para proteínas especificas relacionadas con vías metabólicas y apoptóticas.
: Los cambiadores Epi candidatos que se observó que inducían un cambio en el estado metabólico de una célula con base en los resultados obtenidos a partir de los experimentos que anteceden se identifican como cambiadores Epi. Por ejemplo, un cambiador Epi candidato que presenta citotoxicidad y/o que induce apoptosis en una célula se identifica como un cambiador Epi. Preferentemente, un cambiador Epi candidato que presenta citotoxicidad diferencial y/o que induce de forma diferencial la respuesta apoptótica en células (cancerosas) enfermas en comparación con células normales (por ej . , cambiadores Epi que modulan de forma diferencial la expresión de proteínas implicadas en la apoptosis en células cancerosas en comparación con células normales) se identifica como un cambiador Epi .
Ejemplo 19: Identificación de Vitamina D3 como cambiador Epi La vitamina D3 o la, 25-dihidroxivitamina D3 (también conocida como calcitriol) , es un metabolito de la vitamina D que se sintetiza a partir de la vitamina D mediante un proceso enzimático de dos etapas. La vitamina D3 interactúa con su receptor de vitamina D nuclear (VDR) ubicuo para regular la transcripción de un amplio espectro de genes implicados en la homeostasis de calcio y fosfato, asi como en la: división y diferenciación celular. Se ha indicado que la vitamina D3 tiene efectos anticancerigenos en diversos sistemas modelo, incluyendo carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma de próstata, cánceres de ovario, mama y pulmón (analizado en Deeb et ál. 2007 Nature Reviews Cáncer 7:684-700) .
; Se indica que los efectos anticancerigenos de la vitamina D3 implican mecanismos múltiples, incluyendo detención del crecimiento en la fase Gl del ciclo celular, apoptosis, diferenciación de células tumorales, alteración de las señales de supervivencia celular mediadas por el factor de crecimiento e inhibición de la angiogénesis y la adhesión celular (analizado en Deeb et ál. 2007 Nature Reviews Cáncer 7:684-700). Por ejemplo, con relación particular a la apoptosis, se ha indicado que la vitamina D3 induce la apoptosis al regular mediadores clave de la apoptosis, como al reprimir la expresión de las proteínas anti-apoptóticas , pro-supervivencia BCL2 y BCL-XL o al inducir la expresión de proteínas pro-apoptóticas (por ej . , BAX, I BAK y BAD) (Deeb et ál. 2007). En un ejemplo adicional, con relación particular a la angiogénesis, se ha indicado que la Vitamina D3 inhibe la proliferación de algunas células endoteliales derivadas de tumores, así como la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que induce la angiogénesis en tumores (analizado en asuda and Jones, 2006 Mol. Cáncer Ther. 5(4): 797-8070). En otro ejemplo, con relación particular a la detención del ciclo celular, se ha indicado que la Vitamina D3 induce la transcripción génica del inhibidor de cinasa dependiente de la ciclina p21WAFl/CIPI e induce la síntesis y/o estabilización de la proteína p27KIPI inhibidora de cinasa dependiente de la ciclina, ambas críticas para inducir la detención de Gl . (Deeb et ál. 2007).
Con base en las observaciones que anteceden, la Vitamina D3 se identifica como un cambiador Epi, es decir, debido a su capacidad de cambiar el estado metabólico de una célula. La vitamina D3 es un cambiador Epi debido a su capacidad de inducir apoptosis en una célula y, en particular, con base en su capacidad de inhibir de forma diferencial el crecimiento celular e inducir la respuesta apoptótica en células (cancerosas) enfermas en comparación con células normales (por ej . , modula de forma diferencial la expresión de proteínas, como BCL-2, BCL-XL y BAX, implicadas en la apoptosis en células cancerosas en comparación con células normales) .
Ejemplo 20: Sensibilidades relativas de células oncogénicas y normales a la coenzima Q10 Se examinaron y compararon los efectos del tratamiento con coenzima Q10 en una variedad de lineas celulares oncogénicas y normales. Se evaluó la sensibilidad de las células a la coenzima Q10 controlando la inducción de la apoptosis. El tratamiento de células con CoQlO se realizó como se describe detalladamente a continuación en los Materiales y Métodos. Se evaluó la inducción de apoptosis en las células tratadas controlando indicadores de apoptosis temprana (por ej . , expresión de Bcl-2, activación de caspasa, asi como usando ensayos de anexina V) como se describe a continuación. A partir de estos estudios, se determinó la dosificación de CoQlO mínima, por ej., la concentración de CoQlO y el tiempo de tratamiento necesarios para inducir apoptosis en el panel de líneas celulares .
'En un resultado inesperado y sorprendente, los datos demostraron que la eficacia del tratamiento con la coenzima Q10 era mayor en los tipos celulares que presentaban mayor oncogenicidad y/o mayor potencial metastásico, es decir, los tipos celulares que se derivaron de cánceres o tumores más agresivos. Los resultados de estos estudios se resumen a continuación en la Tabla 29. Los datos demuestran que la CoQ10! es más eficaz de forma dependiente tanto del tiempo como de la concentración en células en un estado canceroso más .agresivo. Adicionalmente, se observó un efecto divergente sorprendente en las células normales en comparación con las células oncogénicas . Específicamente, se descubrió de manera inesperada que la coenzima Q10 tenía ligeramente una función de apoyo en un ambiente de tejido normal, donde se observó mayor proliferación y migración en células normales, incluyendo queratinocitos y fibroblastos dérmicos .
: El efecto de la coenzima Q10 en los mecanismos proteicos y de regulación génica en cáncer es diferente en una célula normal. La maquinaria y los componentes celulares clave, como la fluidez de la membrana, los mecanismos de transporte, la inmunomodulación, la angiogénesis , el control del ciclo celular, la estabilidad genómica, el control oxidativo, el flujo glucolítico, el control metabólico y la integridad de proteínas de matriz extracelular, se desregulan y, por lo tanto, se altera la huella molecular y genética de la célula. El ambiente de la enfermedad favorece el gobierno de procesos de control celular. Los datos proporcionados en la presente sugieren que la CoQlO pone un mayor nivel de eficacia (por ej . , en las células cancerosas en comparación con las células normales y en las células de un estado canceroso más agresivo en comparación con las células de un estado canceroso menos agresivo o no agresivo) normalizando algunos procesos clave antedichos de una forma que permite un potencial apoptótico restablecido.
Tabla 29: Concentración de CoQlO y tiempo de tratamiento mínimos necesarios para inducir la apoptosis temprana en diversos tipos celulares.
Materiales y métodos Tratamiento y preparación celular 5 Células preparadas en discos o matraces Las células se cultivaron en matraces T-75 con medio pertinente complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de PSA (penicilina, estreptomicina, anfotericina 10 B) (Invitrogen y Cellgro) en una incubadora a 37 °C con niveles de 5% de C02 hasta alcanzar una confluencia del 70-80%. Para extraer las células para el tratamiento, los matraces se cebaron con 1 mL de tripsina, se aspiraron, se tripsinizaron con 3 mL adicionales y se incubaron a 37 °C durante 3-5 minutos. Luego las células se neutralizaron con un volumen igual de medio y la solución posterior se centrifugó a 10,000 rpm durante 8 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se volvieron a suspender con 8.5 mi de medio. Se leyó dos veces una mezcla de 500 ul de la resuspensión y 9.5 mi de isopropanol mediante un contador coulter y se determinó la cantidad apropiada de células que se ib'a a sembrar en cada disco. Se examinaron en triplicado el control y la concentración en un intervalo de grupos de 0-200 µ?. A partir de una solución madre de 500 µ? de CoQ-10, se realizaron diluciones en serie para lograr la concentración experimental deseada en platos apropiados. i Los platos se incubaron en una incubadora a 37 °C con niveles de 5% de C02 durante 0 - 72 horas, dependiendo del tipo ,celular y el protocolo experimental.
Aislamiento y cuantificación de proteínas i Células preparadas en platos 1 Luego de la terminación del período de incubación de tratamiento celular, se realizó el asilamiento de proteínas. Los platos de todos los grupos de tratamiento se lavaron dos veces con 2 mi y una vez con 1 mi de lx de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) helada. La PBS se aspiró de los platos luego de 2 lavados iniciales solamente. Las células se rasparon suavemente y se recolectaron en tubos de microcentrifugación usando el volumen final del tercer lavado y se centrifugaron a 10,000 rpm durante 10 minutos. Luego de la centrifugación, se aspiró el sobrenadante y se lisó el sedimento con 50 uL de amortiguador de lisis (1 uL de inhibidor de proteasa y fosfatasa por cada 100 uL de amortiguador de lisis) . Luego las muestras se congelaron durante la noche a -20 °C.
Células preparadas en matraces Luego de la terminación del periodo de incubación de tratamiento celular, se realizó el aislamiento de proteínas. Los matraces de todos los grupos de tratamiento se lavaron dos veces con 5 mL y una vez con 3 mL de lx de PBS helado. La PBS se aspiró de los matraces luego de los 2 primeros lavados solamente. Las células se rasparon suavemente y se recolectaron en tubos de centrifugación de 15 mL usando el volumen final del tercer lavado y se i centrifugaron a 10,000 rpm durante 10 minutos. Luego de la centrifugación, se aspiró el sobrenadante y se lisó el sedimento con una cantidad apropiada de amortiguador de lisis (1 uL de inhibidor de proteasa y fosfatasa por cada 100 uL de amortiguador de lisis) . El volumen del amortiguador de lisis dependió del tamaño del sedimento. Las muestras se transfirieron en tubos de micrpcentrifugación y se congelaron durante la noche a -20°G. i I Cuantificación de proteínas Las muestras se descongelaron a -4°C y se destruyeron por ultrasonidos para asegurar la homogenización al día siguiente al aislamiento de proteínas. La cuantificación de proteínas se realizó usando el kit de ensayo de proteínas micro: BCA (Pierce) . Para preparar muestras para inmuno-transferencia, se preparó una solución 1:19 de betamercaptoetanol (Signa) a amortiguador de muestra (Bio-Rad) . Las muestras se diluyeron 1:1 con la solución betamercaptoetanol-amortiguador de muestra, se hirvieron a 95°C durante 5 minutos y se congelaron durante la noche a -20°C.
Inmuno-transferencia Bcl-2, caspasa, 9, ciotocromo c El volumen de muestra a cargar por pocilio se determinó usando la concentración media bruta de proteína obtenida del ensayo de proteína BCA. Se cargaron aproximadamente 30-60 ]iq de proteína para cada punto de tiempo del tratamiento. Las proteínas se procesaron en triplicado en 12% de geles listos de Tris-HCl (Bio-Rad) o geles "handcast" en lx de amortiguador del proceso a 85 y 100 voltios. Luego las proteínas se transfirieron a papel de nitrocelulosa durante una hora a 100 voltios y se bloquearon durante otra hora en una solución de 5% de leche. Las membranas se colocaron en anticuerpo primario (1 uL de Ab:1000 uL de TBST) (Cell Signaling) durante la noche a -4°C. Al día siguiente, las membranas se lavaron tres veces durante diez minutos cada una con solución salina amortiguada con Tris Tween-20 (TBST) y se aplicó un anticuerpo secundario (anti-conejo, 1 uL de Ab: 1000 uL de TBST): durante una hora a -4o. Las membranas se volvieron a lavar tres veces durante diez minutos con TBST y se completó la quimioluminiscencia usando sustrato Pico o Femto (Pierce) . Luego las membranas se revelaron en intervalos que produjeron los mejores resultados visuales.
Luego de esto, las membranas se mantuvieron en TBST a -4°C hasta que se pudieron medir los niveles de actina.
Actina Las membranas se colocaron en anticuerpo primario de actin'a (1 uL de Ab:5000 uL de TBST) (Cell Signaling) durante 1 hora a -4°C, se lavaron tres veces durante diez minutos cada una con TBST y se aplicó un anticuerpo secundario ( anti-conej o, 1 uL de Ab: 1000 uL de TBST) durante una hora a -4°C. Las membranas se lavaron nuevamente tres veces durante diez minutos cada una con TBST y se terminó la quimioluminiscencia usando sustrato Pico (Pierce) . Luego las membranas se revelaron en intervalos que produjeron los mejores resultados visuales.
Ensayo de anexina V Las células se lavaron dos veces en PBS10X y se volvieron a suspender en amortiguador de unión (0.1 M de HEPES, pH 7.4; 1.4 M de NaCl; 25 mM de CaC12). Las muestras de 100 µ? se agregaron a un tubo de cultivo con 5 µ? de tinte anexina-PE o 7-ADD. Las células se mezclaron y se incubaron sin luz a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego de esto, se agregaron 400 µ? de IX de amortiguador de unión a cada muestra y se sometieron a análisis mediante citometria de flujo, i Los ejemplos 21-25 se toman en la presente de la solicitud internacional WO 2008/116135. Su contenido se incorpora a la presente en su totalidad. A los efectos de coherencia, los números de las tablas en estos ejemplos no se vuelven a numerar, pero estos números de tablas no se corresponden con las tablas referidas en las reivindicaciones, Ejemplo 21: Método para preparar un concentrado de 22% de CoQlO que incluye pentilenglicol Se produjo un concentrado con CoQlO como el agente bioactivo lipofilico. Se colocaron alrededor de 10 kilogramos (kg) de polisorbato 80 en una caldera de vacio y se calentaron hasta una temperatura de entre alrededor de 50°C y alrededor de 65°C. Se agregaron alrededor de 8.8 kg de CoQlO al polisorbato 80 y se aplicó vacio con la temperatura mantenida a entre alrededor de 50°C y alrededor de 65°C y los contenidos se mezclaron durante alrededor de 15 minutos. El material resultante se puede referir en la presente como la fase de CoQlO o la primera fase. La CoQlO se disolvió en el polisorbato 80 con la caldera de vacio sellada, con vacio, y la temperatura de la mezcla de polisorbato/CoQlO entre alrededor de 50°C y alrededor de 55°C.' ; En otra caldera se calentaron alrededor de 15.8 kg de agua hasta una temperatura de entre alrededor de 50°C y alrededor de 55°C y se agregaron alrededor de 0.2 kg de fenoxietanol y alrededor de 2 kg de pentilenglicol HYDROLITE 5®, USP, al agua y se mezcló hasta lograr transparencia y uniformidad. Luego se agregaron alrededor de 8 kg de PHOSPHOLIPON® 85G hasta lograr la dispersión. El material resultante se puede referir en la presente como la fase acuosa o la segunda fase. La fase acuosa logró una dispersión e hidratación uniforme de la lecitina tipo fosfolipón y se agregó al liquido CoQlO/polisorbato como se describe a continuación a una temperatura de entre alrededor de 50°C y alrededor de 55°C.
Se utilizó un homogenizador de escala de producción en línea Silverson, similar al modelo Silverson L4RT usado para los lotes de escala de laboratorio para combinar las dos fases descritas anteriormente, (es decir., la fase de CoQlO y la fase acuosa) . La homogenización tuvo lugar usando un tamiz fino de emulsión estándar Silverson, mezclando a pleno rendimiento (entre alrededor de 7000 rpm y alrededor de 10,000 rpm) durante un total de alrededor de 5 minutos a través de un bucle de recirculación cerrado y al vacío (entre alrededor de 18 mm y alrededor de 20 mm Hg) a temperaturas de entre alrededor de 50°C y alrededor de 55°C con agitación de barrido hasta que la CoQlO solubilizada se encontró completamente encapsulada y uniformemente dispersa, lo que creó una dispersión liposomal uniforme y espesa. El concentrado de CoQlO resultante tuvo CoQlO en una concentración de alrededor de 22% en peso. La concentración PHOSPHOLIPON® 85G fue alrededor de 8% en peso de la composición total, es decir, de la combinación de las dos fases descritas anteriormente.
En experimentos separados, se produjo un lote de laboratorio de un kg del concentrado de 22% de CoQlO descrito anteriormente y las muestras se tomaron en intervalos de 5 minutos durante la homogenización. El tamaño de partícula de los liposomas en diversos puntos de tiempo del muestreo se determinó utilizando equipo de difracción láser (Malvern 2000) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Los detalles del proceso de homogenizacion y los tamaños de partícula obtenidos durante la homogenizacion se indican a continuación en la Tabla 1.
Tabla 1 Como se puede observar a partir de la Tabla 1, la fórmula y el proceso del concentrado de CoQlO descritos anteriormente lograron producir liposomas con un diámetro promejdio de 107 nm y una distribución de partículas que incluyó 85% de todos los liposomas producidos en un tamaño de alrededor de 59 nm a alrededor de 279 nm. Un tiempo de proceso breve (alrededor de 5 minutos) produjo una dispersión de liposomas de CoQlO de forma tan eficaz como un tiempo de proceso largo (alrededor de 45 minutos) . Como se puede observar también a partir de lo que antecede, se obtuvieron partículas liposomales óptimas donde la CoQlO no se expuso a temperaturas superiores a alrededor de 55°C. i Ejemplo 22: Método para preparar una dispersión de 2% de carbómero ! Se preparó una dispersión polimérica de ácido acril'ico reticulado para su uso como agente de viscosidad en uña composición de crema. El ácido acrilico utilizado, CARBÓMERO 940, se preparó en una dispersión al 2% con los I siguientes componentes como se indica a continuación en la Tabla' 2: I i 1 Tabla 2 i 1 El proceso de fabricación se realizó de la siguiente forma; Primero se limpió y desinfectó el equipo. En una mesa,; se mezclaron los ingredientes de la fase 1 hasta volverse transparentes y uniformes. Se pesó y agregó la cantidad necesaria de agua (fase 2) a una caldera de recipiente de la fase del homogenizador descrito anteriormente en el Ejemplo 1. El agua se calentó con una camisa de agua caliente/vapor hasta una temperatura de entre; alrededor de 60°C y alrededor de 65°C. Luego la fase 1 se agregó al agua de la fase 2 con agitación moderada hasta volverse transparente y uniforme. El recipiente de la fase 1 se enjuagó con agua del proceso y la temperatura se mantuvo a entre alrededor de 60°C y alrededor de 65°C. Luego! el agitador se colocó en alto y se agregó polvo de CARBÓMERO 940 (fase 3).
' La temperatura se mantuvo a entre alrededor de 60°C y alrededor de 65°C y se continuó la mezcla a velocidad media-alta de entre alrededor de 500 rpm y alrededor de 800 rpm hasta que se agregó todo el polvo de CARBÓMERO 940. El polvo de CARBÓMERO se agregó lentamente al vórtex de la mezcla de las fases 1 y 2. El polvo se tamizó a mano lentamente de forma que la cantidad total de CARBÓMERO se agregara en menos de alrededor de 10 minutos.
La mezcla continuó a agitación media-alta hasta que todo el polvo se dispersó completamente y no quedaron "ojos de pescado". El proceso de fabricación se realizó de forma que todo el polvo de CARBÓMERO 940 sin neutralizar se dispersara completamente para crear una dispersión translúcida suave de polímero de CARBÓMERO completamente hidratado. La agitación del lote fue suficientemente alta para crear un vórtex visible, pero no tan alta como para ocasionar salpicadura del lote. Se produjo mezcla adecuada del lote a alta velocidad de entre alrededor de 800 rpm y alrededor de 1300 rpm durante un período de entre alrededor de 60. minutos y alrededor de 90 minutos. La temperatura del lote ;se mantuvo a entre alrededor de 60°C y alrededor de 65°C !al inicio de la mezcla y entre alrededor de 55°C y alrededor de 65°C durante la mezcla. La temperatura elevada ayudó; a la dispersión del polímero de CARBÓMERO y ayudó a evitar la aglomeración. 1 El lote se enfrió hasta entre alrededor de 25° y alrededor de 30° con agua fría a través de una camisa y la mezcla continuó con agitación media-alta. Se tomaron muestras para determinar la microcalidad, el pH, la gravedad específica y la viscosidad.
Ejemplo 23: Método para preparar cremas con CoQlO (1.5%, 3.0% y 5.0%) usando un concentrado de 22% de CoQlO ¡ Se formó una base de emulsión cremosa utilizando diversas fases para combinación con los liposomas con concentrado de CoQlO del Ejemplo 1. Las fases A, B, C y D se combinaron para formar la crema base. La fase E fue el concentrado de 22% de CoQlO del Ejemplo 1 (22% p/p de CoQlO) . A continuación se indican detalles de la preparación de la base de emulsión cremosa y la posterior adición del concentrado de 22% de CoQlO del Ejemplo 1.
¡Para la preparación de la crema con concentrado de i 22% de CoQlO al 1.5% en peso ("crema de CoQlO al 1.5%"), el procedimiento para combinar las diversas fases fue el siguiente, con los ingredientes indicados a continuación en las Tablas 3-7.
Tabla 3 Crema de CoQlO al 1.5% La fase A (la "fase oleosa") incluyó benzoatos de alquilo C12 que son ésteres ligeros agregados a efectos emolientes y de dispersión. El alcohol cetilico y el alcohol estearilico fueron ceras agregadas para impartir cuerpo o textura a la crema y la mezcla de estearato de glicerilo y estearato de PEG-100 fue un emulsionante principal que se incluyó para formar una emulsión de aceite en agua (o/w) . En una mesa, se pesaron los ingredientes de la fase A en una caldera de vacio y se calentaron hasta entre 1 alrededor de 70°C y alrededor de 75°C en un baño de agua .
' Tabla 4 La fase B (la "fase acuosa") contenía glicerina para la humectación e hidratación de la piel, propilenglicol para humectación, para ayudar a la penetración de la piel y para mejorar el perfil de conservación microbiológico, etoxidiglicol para potenciar la penetración de los lipospmas de CoQlO en la piel, fenoxietanol para conservación microbiológica, agua purificada como el solvente de la fase y dispersión de CARBÓMERO 940 del Ejemplo 2 anterior para controlar las propiedades reológicas de las fórmulas cremosas, así como para agregar estabilidad a la emulsión principal.
Los ingredientes de la fase B se colocaron en otra caldera de mezcla. Los ingredientes se mezclaron con mezcla de barrido moderada mientras gue se calentaban hasta entre alrededor de 70°C y alrededor de 75°C (sin vacío) . Cuando los ingredientes de la fase B alcanzaron entre alrededor de 70°C y alrededor de 75°C, los ingredientes de la fase A se agregaron a entre alrededor de 70°C y alrededor de 75°C con mezcla con barrido moderada. La mezcla de las fases A y B se hizo circular nuevamente a través de un homogenizador Silverson como se describió anteriormente en el Ejemplo 1 (cabezal estándar) y se continuó con la siguiente parte del proceso.
Tabla 5 - En la fase C (la "fase de amortiguación y neutralización"), el agua purificada actuó como un solvente y un diluyente para los otros ingredientes en esta fase. Trietanolamina fue el neutralizador principal del copolímero de ácido acrílico de CARBÓMERO en la fase acuosa (fase B) , se agregaron solución de lactato de sodio (60% p/p en agua) y ácido láctico como sistema amortiguador para ajustár y mantener el pH final de la crema entre alrededor de 5 ' y alrededor de 5.5, o sea, dentro del rango de pH natural de la piel.
! En una mesa, se pesaron y se mezclaron los ingredientes de la fase C hasta volverse uniformes y se calentaron hasta entre alrededor de 60°C y alrededor de 65°C. La mezcla de la Fase C luego se agregó a la caldera de mezcla de vacío que contenia las Fases A y B con mezclador de barrido en alto-medio.
Se continuó la mezcla mientras que se pasaba siguiente parte del proceso.
Tabla 6 Fase D (la "fase de pigmentación"). Se usó un grado de dióxido de titanio que se puede dispersar en agua en la fórmula solamente a los efectos de aclarar el tono del colorí final de la crema. El color amarillo-anaranjado de la crema> proporcionado por la CoQlO, se redujo sustancialmente y se mejoró de forma cosmética mediante la adición de alrededor de 1% ?/p de dióxido de titanio.
Para la Fase D del proceso, se agregó 1O2 ponderado al lote (Fases A, B y C) y se mezcló e hizo circular nuevamente a través del homogenizador Silverson (cabezal de alto cizallamiento) durante alrededor de 10 minutos o hasta lograr la uniformidad y extensión completas (se verificó el color para confirmar).
Era importante asegurarse de que no había aglomeración o formación de grumos del dióxido de titanio en las hojas de mezcla de barrido. Esto se confirmó mediante inspección visual. Se usó un homogenizador en linea! Silverson como se describió anteriormente en el Ejemplo 1 con un tamiz de alto cizallamiento para asegurar i la máxima desaglomeración y molienda del dióxido de titanio. La dispersión final del dióxido de titanio se verificó con un indicador de finura de grano Hegman PH-175. i Tabla 7 i Se detuvo la recirculación y el lote se enfrió hasta entre; alrededor de 50°C y alrededor de 55°C con el mezclador de barrido en medio, a una velocidad de alrededor de 30 rpm. El concentrado de 22% de CoQlO previamente ponderado (Fase E) del Ejemplo 1 se calentó hasta entre alrededor de 45°C y alrededor de 50°C y se agregó al lote I (Fases A, B, C y D) .
'Todas las fases se mezclaron con agitación de barrido a alrededor de 60 rpm con vacio aplicado hasta uniformidad. La temperatura se mantuvo a alrededor de 50°C.
! El lote se enfrió hasta entre alrededor de 35° y alrededor de 45° con mezcla a alrededor de 60 rpm y aplicación de vacio.
' El material resultante se colocó en recipientes de contención.
¡ Para la preparación de una crema con concentrado de 22% de CoQlO al 3% en peso ("crema de CoQlO al 3%"), se siguió exactamente el mismo procedimiento descrito anteriormente para la formación de crema con concentrado de 22% de CoQlO al 1.5% en peso ("crema de CoQlO al, 1.5%"). Los materiales para cada fase y las cantidades utilizadas se indican a continuación en las Tablas 8-12: Tabla 8 Tabla 9 , Tabla 10 Tabla 11 Tabla 12 Se preparó una crema similar usando el concentrado de 22% de CoQlO del Ejemplo 1 en una cantidad de alrededor de 25% en peso para crear una crema con concentrado de 22% de CoQlo! a una concentración de alrededor de 5% en peso.
¦ ' Un resumen del contenido de las cremas de CoQlO que tienen 1.5% de CoQlO en peso, 3% de CoQlO en peso y 5% de CoQlO1 en peso se indica a continuación en las Tablas 13, 14 y 15,¡ respectivamente. Cabe destacar en todos los ejemplos de formulaciones proporcionados anterior y posteriormente para las cremas de CoQlO, que la cantidad de concentrado de 22% ele CoQlO utilizada proporcionaría en efecto una concentración teórica final de concentrado de 22% de CoQlO de alrededor de 5% por encima de la concentración diana. Por lo tanto, para la "crema de CoQlO al 1.5%"), la cantidad de lote real utilizada fue de 7.5% en peso de concentrado de 22% de CoQlO que proporcionó 1.58% p/p de CoQlO;. La "crema de CoQlO al 3%" se realizó con 15% en peso del concentrado de 22% de CoQlO que proporcionó un contenido teórico de 3.15% de CoQlO. El 5% de fármaco en exceso se aqregó para prolongar la vida útil general del producto y mantener el contenido de fármaco entre alrededor de 90% y alrededor de 110% del contenido de fármaco etiquetado o previsto.
Tabla 13 i Crema de CoQlO al 1.5% Tabla 14 Crema de CoQlO al 3% Tabla 15 Crema de CoQlO al 5% | Nota: 5% del excedente de fabricación del concentrado de 22% de CoQlO se agregó a los lotes de crema de CoQlO al 1.5%; crema de CoQlO al 3% y crema de CoQlO al 5% (1.5% más 0.075%, 3% más 0.15% y 5% más 2.5%).
Ejemplo 24: Aplicación tópica de una crema de CoQlO (1.5%, 3.0% o 5.0%) Se aplicaron las cremas con CoQlO producidas en el Ejemplo 3 anterior (es decir, crema de CoQlO al 1.5%, crema de CoQlO al 3% y crema de CoQlO al 5%) a piel de porcino. El estudio de dosis tópica se realizó en dos cerdos cada uno, un macho y una hembra. Cada animal tuvo 6 áreas de i prueba, tres áreas de prueba en cada lado. Para cada cerdo, un lado (3 sitios) recibió una dosis por día durante 7 días, mientras que el otro lado de prueba (3 áreas de prueba) de cada cerdo recibió solamente una dosis en el día 1. Las cremas del Ejemplo 3, preparadas con etoxidiglicol, se utilizaron en los animales macho. Los animales hembra recibieron 3 fórmulas de prueba que contenían los mismos ingredientes que las muestras producidas en el Ejemplo 3 anterior, salvo porque contenían 5% de 1, 3-butilenglicol en lugar^ de 5% de etoxidiglicol . Los detalles de estas formulaciones realizadas con 1, 3-butilenglicol, que tenían 22% de concentrado de CoQlO al 1.5% en peso, 22% de concentrado de CoQlO al 3% en peso y 22% de concentrado de CoQlOj al 5% en peso, se encuentran a continuación en las Tablas 16, 17 y 18, respectivamente.
Tabla 16 de butilenglicol activo nominal de la Crema de CoQlO al 1.5% Tabla 17 Base de butilenglicol activo nominal de laCrema CoQlO al 3% Tabla 18 Base de butilenglicol activo nominal de la Crema CoQlO al 5% i Todos los animales recibieron la misma dosis de cada formulación, que fue de 200 mg, en un área de aplicación de 121 cm2 con aplicación única o diaria durante 7 días.
! Luego de la aplicación, se obtuvieron y analizaron I muestras de piel como se indica a continuación. El área de prueba de piel se lavó suavemente con una mezcla suave de jabón y agua (por ej . , 1% de jabón Ivory en agua o equivalente) para retirar toda formulación de prueba tópica residual. Si el área a extirpar era mayor que el área dosificada, el área dosificada se marcó con tinta indeleble para delimitar el área de piel dosificada. Se retiró un corte de piel de espesor total mediante bisturí con un tamaño de aproximadamente 10 cm x 10 cm hasta e incluyendo la capa adiposa. Luego de la extirpación, el corte de piel se colocó de forma horizontal y se envolvió en dos capas de envoltura plástica (SARAN WRAP.TM. o equivalente) y se congeló hasta alrededor de -70°C o menos de forma oportuna. Cada corte de piel se identificó según correspondiera (por ej . , ¡identificación del animal, número de estudio, fecha, etc.). Las muestras se mantuvieron a alrededor de -70°C o menos hasta su examinación.
¡ Cada corte de piel se colocó en una bolsa de plástico hermética y se descongeló en baños de agua de entre alrededor de 30°C y alrededor de 35°C. Luego de descongelados, cada corte de piel se enjuagó suavemente con agua desionizada destilada para retirar toda sangre y dosis superficial residual. Todos los tejidos subcutáneos (por ej . adiposo) se retiraron con bisturí hasta el nivel de la dermis papular.
, Cada corte de piel luego se marcó con cinta (TRANSPORE.TM. , de 3M) entre alrededor de 10 y alrededor de 20 veces hasta observar aproximadamente 10-25% de brillo superficial. Este proceso retiró el estrato córneo y toda dosisi superficial residual.
En cada lámina de piel total, se marcaron 6 áreas con tintad Las áreas marcadas fueron de 1 cm2.
Cada corte de piel se colocó en una bolsa de plástico hermética y se sumergió en un baño de agua de alrededor de 65°C (+/- 3°C) para iniciar el proceso de separación de la epidermis de la dermis. Los sitios de prueba luego se extirparon de la lámina de piel mediante perforación y se retiró la epidermis de la dermis mediante fórceps. Los corte;s de piel individuales se pesaron y se registró el peso. Los cortes de piel individuales se cortaron con un bisturí, se colocaron en tubos pre-etiquetados y se guardaron para análisis posteriores.
; Las muestras de prueba se extrajeron en isopropanol (IPA)i en un agitador durante alrededor de 47 horas, luego se almacenaron a alrededor de -20°C hasta el procesamiento adicional. Luego las muestras se centrifugaron a alrededor de 13,500 rpm durante alrededor de 10 minutos y el sobrenadante se recolectó en frascos ámbar de 2 mL.
Se realizó la cuantificación de CoQlO mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC-UV) . En resumen, se realizó HPLC en un sistema de HPLC Hewlett-Packard serie 1100 con un LC/MSD Agilent 1100. Se ejecutó un sistema solvente que incluía alrededor de 65% de etanol y alrededor de 35% de metanol a través de una columna Aquasil C18 (alrededor de 3mm. veces . alrededor de 100 mm, 5. mu.) a una velocidad de flujo de alrededor de 1 mL/min.
Se inyectaron diez microlitros de muestra. Las áreas pico I se cúantificaron hasta la concentración usando una curva i estándar externa preparada a partir del estándar puro. La I curva| se salpicó en IPA debido a problemas de solubilidad de la' CoQlO en agua.
! Los resultados del contenido de CoQlO en piel de mini-cerdo se resumen en las FIGS. 1 y 2 y las Tablas 19 y 20 a¡ continuación. Las 6 réplicas por corte de piel se i corri'gieron hasta el peso del tejido y se promediaron para obtener una media de cada sitio dosificado.
Tabla 19: peso del tejido SD ± medio (n=42) Tabla; 20: Medio: Concentración medida ± SD de CoQlO en piel 1 de porcinos (n=6/corte) ! <LLQ= por debajo del nivel inferior del espectro de validación de calidad (es decir, no se detectó) . 1 Los datos indicaron que se observaron cantidades medibles de CoQlO en todas las muestras epidérmicas y en muestras dérmicas seleccionadas.
Se descubrió que todos los sitios dosificados para la epidermis contenían CoQlO en niveles significativamente mayores que los sitios no dosificados (p<0.001).
; No hubo diferencias significativas entre los contenidos epidérmicos de CoQlO en las tres concentraciones de dosificación en cortes de piel de cerdo macho o hembra (p>0.02 ) .
; Entre los cerdos macho y hembra, en los sitios del lado : derecho del animal (1 día de dosificación), el contenido epidérmico para las dosis aplicadas de CoQlO al 1.5% i y CoQlO al 5% de la piel del macho fue significativamente mayor que el observado en la piel de la hembra (p<0.003), pero no con la dosis de CoQlO al 3% (p=0.0329) . Por lo tanto, como se puede observar a partir de los datos, la penetración de la CoQlO en dosis única fue significativamente mayor para la fórmula de etoxidiglicol en comparación con la fórmula de butilenglicol (p<0.003 para ¡las dosis de 1.5% y 5% y p=0.0329 para la dosis de 3%) . i ' Los niveles epidérmicos de los cortes de piel de macho, y de hembra, en las tres aplicaciones de dosis, para el periodo de dosificación de 7 días (lado izquierdo), fueron estadísticamente idénticos.
, El contenido dérmico solamente se observó en los cortes de piel de macho para las aplicaciones de dosis de CoQlO; al 1.5% y CoQlO al 5% del período de dosificación de 7 día;s (lado izquierdo) y la aplicación de dosis de CoQlO al l.5% del período de dosificación de 1 día (lado derecho) .
; Se proporciona un resumen de los datos de la siguiente forma en la Tabla 21: ' Tabla 21 I Si se deseara extrapolar los datos de la Tabla 21 al área total de piel, la penetración de la CoQlO seria como se indica a continuación en la Tabla 22.
Tabla 22 ¡Una única aplicación de la formulación en crema de CoQlO ! proporcionó un promedio de 12%, 17% o 70% de la dosis aplicada para las formulaciones en crema de CoQlO al 5%, 3% y 1.5% correspondientes. En general, la penetración de la en una base de dosis única fue significativamente para la fórmula de etoxidiglicol en comparación con la fórmula de butilenglicol (p<0.003 para las dosis al 1.5% y 5% y p=0.0329 para la dosis al 3%). Los datos indicaron i que hubo un aumento en el contenido epidérmico con concentración aplicada para CoQlO al 3% con una dosis de CoQlO 1 al 5% que es esencialmente igual a la dosis de CoQlO al 3%. Esto sugiere que la piel se volvió saturada con CoQlOien una dosis de CoQlO al 3% o que el vehículo no pudo proporcionar más CoQlO por encima de la concentración de CoQlO ¡ al 3%. Se puede observar que los niveles alcanzados en la piel luego de 7 días de aplicación tópica eran idénticos entre los 2 animales. jPara las formulaciones de etoxidiglicol y para los datos ; de aplicación única, se obtuvo una penetración promedio de 73.8%, 16.6% y 13.3% para las cremas que contienen etoxidiglicol al 1.5%, 3% y 5% de correspondientes .
Un descubrimiento inesperado e interesante fue la cantidad desproporcionada de CoQlO encontrada en la epidermis para la crema al 1.5% que es la dosis más baja de CoQlOj probada. Sin pretender limitarse por ninguna teoría, i esta penetración potenciada de CoQlO puede ser una función de la proporción de CoQlO a etoxidiglicol en las formulaciones en crema o puede relacionarse posiblemente con la proporción de etoxidiglicol a CoQlO y el fosfolípido liposóma. La proporción relativamente mayor de etoxidiglicol a CoQlO usada en la crema que contiene una concentración menor de CoQlO puede ser responsable de las cantidades mayores de CoQlO encontradas en la epidermis.
; La crema al 1.5% y crema al 3% completaron exitosamente también el análisis acelerado de 9 semanas (almacenamiento a alrededor de 35°C y alrededor de 50°C) pasaron 5 ciclos de descongelamiento envasadas en envases metálicos de tubo y frasco plástico y pasaron pruebas de estímulo microbiológico USP. Los resultados se confirmaron para el mismo sistema con varios lotes de desarrollo y a concentraciones al 1.5%, 3% y 5% en peso de CoQlO en la base de formulación de prototipo de crema.
Ejemplo 25: Método para formar cremas de CoQlO (al 1.5%, 3.0% y 5.0%) usando un concentrado de 21% de CoQlO Las cremas se produjeron como se describió en el Ejemplo 3 anterior, con la excepción de que se utilizó propilenglicol en lugar de pentilenglicol ( 1 , 2-pentanodiol ; Hidrolito-5, Symrise) . Se produjo primero un concentrado tal como se describió en el Ejemplo 1 anterior, con los componentes listados en la Tabla 23 a continuación: Tabla 23 Fórmula de lote - Concentrado de CoQlO El concentrado de CoQlO resultante (concentrado de 21% de CoQlO) tuvo CoQlO a una concentración de alrededor de 21% en peso.
Se preparó una dispersión de carbómero tal como se describió en el Ejemplo 2 anterior para su uso en la formación de la crema con los componentes listados en la Tabla 24 a continuación: Tabla 24 Fórmula de lote - Dispersión de carbómero ! Una crema que tiene 1.5% en peso de concentrado de 21% de CoQlO y otra crema que tiene 3% en peso de concentrado de 21% de CoQlO se prepararon tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 3, con los componentes listados en las Tablas 25 y 26 a continuación: 1 Tabla 25 Fórmula de lote - Crema CoQlO al 1.5% Tabla 26 Fórmula de lote - Crema de CoQlO al 3% Ejemplo 26: Método para formar un concentrado 21% de CoQlO que incluye propilenglicol ¡ Se preparó una composición de concentrado de 21% de CoQlO: combinando las fases A y B tal como se describe a continuación. La fase A incluyó Ubidecarenona USP (CoQlO) al 21% p/p y polisorbato 80 NF al 25% p/p. La fase B I incluyó propilenglicol USP al 10.00% p/p, fenoxietanol NF al 0.50% p/p, lecitina NF (FOSFOLIPON 85G) al 8.00% p/p y agua purificada USP al 35.50% p/p. Todos los porcentajes en peso I son relativos al peso de toda la composición de concentrado de 21% de CoQlO. Los porcentajes y detalles adiciónales se listan en la siguiente tabla.
Tabla 27a transparentes. Se agregó la cantidad de agua requerida a un segundo recipiente (Tanque de mezcla 1) . El Tanque de mezcla 1 se calentó hasta entre 45 y 55°C mientras se mezclaba. Se agregó la solución de fenoxietanol/propilenglicol al agua y se mezcló hasta que se volvió transparente y uniforme. Cuando los contenidos de la fase de agua en el Tanque de mezcla 1 se encontraban dentro del intervalo de 45 a 55°C, se agregó Fosfolipon G con mezcla baja a moderada. Mientras se evita cualquier formación de espuma, se mezclaron los contenidos del Tanque de mezcla 1 hasta que se dispersó uniformemente el Fosfolipon 85G. Se agregó el polisorbato 89 a un recipiente adecuado (Tanque de mezcla 2) y se calentó hasta entre 50 y 60°C, Luego se agregó la Ubidecarenona al Tanque de mezcla 2. Mientras se mantuvo la temperatura a entre 50 y 60°C se mezcló el Tanque de mezcla 2 hasta que se disolvió toda la Ubidecarenona. Luego de que se disolvió toda la Ubidecarenona, la fase de agua se transfirió lentamente al Tanque de mezcla 2. Cuando se combinaron todos los materiales, se homogeneizaron los contenidos hasta que la dispersión se volvió lisa y uniforme. En tanto se tuvo cuidado de no sobrecalentarse, se mantuvo la temperatura a entre, 50 y 60°C. Luego se detuvo la homogeneización y se transfirieron los contenidos del Tanque de mezcla 2 a un recipiente adecuado para su almacenamiento.
Ejemplo 27: Método para formar un lote de 0.5 kg concentrado de 21% de CoQlO que incluye propilenglicol ; Se prepararon 0.5 kg de una composición de concentrado de 21% de CoQlO combinando las fases A y B tal i como i se describe a continuación. La fase A incluyó i Ubidecarenona USP (CoQlO) al 21% p/p y polisorbato 80 NF al 25% p/p. La fase B incluyó propilenglicol USP al 10.00% p/p, ifenoxietanol NF al 0.50% p/p, lecitina NF (FOSFOLIPON i 85G) jal 8.00% p/p y agua purificada USP al 35.50% p/p. Todos, los porcentajes en peso son relativos al peso de toda la composición de concentrado de 21% de CoQlO en crema. Los porcentajes, las cantidades y los detalles adicionales se listan en la siguiente tabla.
Tabla 28a Todo el equipo estaba limpio e higiénico. Se pesó directamente Polisorbato 80 en una caldera PK-2 y se calentó en una caldera PK-2 al vacio a 50-55°C. Se pesó la Ubidecarenona USP en la mesa de laboratorio y el peso se verificó dos veces mediante adición al frasco PK-2 tarado (agitadores apagados). Se cerró y selló el PK-2. Se mezcló i el PK-2 cerrado y sellado con mezcladores de barrido en baja velocidad mientras se mantuvo la temperatura a 50-55°C y vacio encendido durante 15 minutos. Se examinó la fase para asegurar que se había disuelto todo el polvo en polisorbato antes de continuar con la siguiente etapa. En el PK-1, se agregó la cantidad de agua requerida y se calentó hasta 50-55°C. En la mesa de trabajo se pesaron fenoxietanol e Hidrolito-5 y se mezclaron hasta que se volvieron transparentes y uniformes y se agregó agua con mezcla moderada hasta que se volvió transparente y uniforme. Cuando la mezcla de agua anterior alcanzó 50-55°C, se agregó lecitina con mezcla baja-moderada, se evitó: la formación de espuma y se mezcló hasta q se dispersó. Se transfirió la fase de agua desde PK-1 a un recipiente de 5 galones. Con ambas fase de agua y fase de CoQlO a 50-55°C, se agregó la fase de agua a la fase CoQlO con mezcla de barrido moderada. Una vez que se transfirieron todos los materiales a PK-2, se recirculó el lote a través de Silverson con cabezal de corte estándar a 7000 rpm durante 3-5 minutos con frasco PK-2 cerrado y vacio encendido. Se mantuvo la temperatura a 50-55°C y no se permitió sobrecalentamiento. Se detuvo la recirculación y se enfrió el lote hasta 30-35°C con mezcla de barrido moderada. El concentrado se bombeó en recipientes de transferencia temporales.
Ejemplo 28: Método para preparar un lote de 20 kg de concentrado de 21% de CoQlO que incluye propilenglicol Se preparó un lote de 20 kg de concentrado de 21% de CoQlO combinando los ingredientes de las fases A, B y C. La fase A incluyó polisorbato 80 NF al 25.00% p/p y Ubidecarenona USP al 21.00% p/p- La fase B incluyó propilenglicol USP al 10.00% p/p y fenoxietanol NF al 0.50% p/p. La fase C incluyó agua purificada USP al 35.50% p/p y lecitina NF al 8.00% p/p. Los porcentajes, las cantidades y los detalles adicionales se presentan en la siguiente tabla ? Tabla 29 Para preparar el lote de 20 kg de concentrado de 21% de CoQlO, se limpió el área y se verificó que estuviera limpio. Se limpió todo el equipo y estaba dentro de la expiración/calibración . Se pesaron 100.0 gm de fenoxietanol y se colocaron en un vaso de precipitación limpio.
Para preparar la fase B, se pesaron 2.000 gm (dos mil gramos) de propilenglicol y se colocaron en un vaso de precipitación de SS de 2 L limpio. Adicionalmente, se pesaron 2000 gm de agua purificada y se colocaron en un recipiente limpio etiquetado "agua para enjuague".
Al vaso de precipitación de SS de 2 L que contiene los 2000 gm de propilenglicol pesados anteriormente, se agregaron 100 gm de fenoxietanol pesados anteriormente. El vaso de precipitación que contenia el fenoxietanol se enjuagó en el vaso de precipitación de 2 L con 1/3 del agua para enjuague. Los contenidos del vaso de precipitación de 2 L se mezclaron con una espátula hasta que se volvieron transparentes y uniformes y se etiquetaron como la fase B.
, En la siguiente etapa, se pesaron 1.600 gm de lecitina y se pesaron 5.100 gm de agua purificada. Las gráficas adecuadamente etiquetadas se colocaron en los registradores de temperatura TIC-1 para PK-1 y TIC-2 para PK-2. Se agregaron 5.100 gm de agua purificada al PK-1 y el agua se calentó manualmente en el PK-1 a 50-55°C. Se encendió el agitador y se mantuvo un leve vórtex. La solución de fase B se agregó luego lentamente desde el vaso de precipitación de SS de 2 L a PK-1. Luego se enjuagó el vaso de precipitación de SS con aproximadamente 1/3 del agua para enjuague. La sustancia de enjuague se agregó lentamente al PK-1. La temperatura se mantuvo manualmente a 50-55°C. Luego se agregó lentamente la lecitina NF y se mezcló hasta que se dispersó. La temperatura se mantuvo manualmente a 50-55°C y se continuó la mezcla hasta que la fase B estuvo pronta para transferirse a PK-2.
Para preparar la fase A, se pesaron 5.000 gm de polisorbato 80 y se colocaron en un recipiente limpio mientras se pesaron 4.200 gm de Ubidecarenona USP. Para componer el concentrado, el equipo incluyó un Tanque de vacio Lee (PK-2), un Homogeneizador Silverson (P-2) y una Bomba1 Waukesha (P-l) . Primero se confirmó que estaba cerrada la válvula inferior de PK-2. Luego se agregaron los 5.000 gm de polisorbato 80 pesados anteriormente en el PK-2 a través del portal de visor de vidrio. El visor de vidrio se remplazó en el PK-2 luego de que se completó la adición.
Luego se encendió el agitador PK-2 y se calentó manualmente el polisorbato 80 en el PK-2 hasta 50-55°C. Cuando la temperatura del polisorbato 80 alcanzó ese intervalo de temperatura, se agregaron los 4.200 gm de Ubidecarenona USP pesada anteriormente a través del portal de acceso en el PK-2. Se usó una espátula para retirar toda Ubidecarenona acumulada en las paletas del agitador durante la adición. Cuando se completó la adición, se remplazó el visor de vidrio. Se mantuvo manualmente la temperatura a entre 50-55°C y se mezcló durante 15 minutos. Se examinaron los contenidos del PK-2 a través del portal de visor de vidrio para evaluar si se disolvió la Ubidecarenona en el polisorbato 80. Luego se apagó el agitador PK-1 (A-l) . i Se agregaron los contenidos del PK-1 (fase B) al PK-2 a través del portal de acceso del PK-2. Luego se enjuagó el PK-1 con el "agua para enjuague" remanente. El PK-2 se calentó manualmente hasta 50-55°C. Luego se recircularon los contenidos del PK-2 a través de P-l y P-2 con el análisis de alto cizallamiento de Silverson en P-2 a rpm máximo durante 5-10 minutos. Se encendió el vacio y se i mantuvo en máximo para evitar la formación de espuma. La temperatura se mantuvo manualmente a 50-55°C.
Se retiraron cuatro muestras: dos muestras de 30 gm para microanálisis y dos muestras de 400 gm para análisis físico/químico. Se etiquetó un conjunto de muestras como i para 1 retener. Luego se transfirió el producto a un recipiente cerrado de HDPE limpio. El tamaño de lote fue 20.000 gm. i Ejemplo 29: Método para preparar una crema de CoQlO al ; 1.5% 'Se preparó una composición de crema de CoQlO al 1.5% combinando las fases A-E tal como se describe a continuación. La Fase A incluyó C12-15 alquil benzoato NF al 5.000% p/p, alcohol cetilico NF al 2.000% p/p, estearato de glicerilo/PEG-100 estearato al 4.5% p/p y alcohol estearilico NF al 1.5% p/p. Los porcentajes y las cantidades se reflejan en la siguiente tabla.
Tabla 30 I ¡ La fase B incluyó éter monoetilico de dietilenglicol NF al 5.000% p/p, glicerina USP al 2.000% p/p, propilenglicol USP al 1.750% p/p, fenoxietanol NF al 0.463% p/p, 'agua purificada USP al 11.377% p/p y dispersión de carbómero 2% al 50% p/p. Los porcentajes y las cantidades i se reflejan en la siguiente tabla. i Tabla 31 La fase C incluyó ácido láctico USP al 0.400% p/p, solución de lactato de sodio USP al 2.000% p/p, trolamina NF al 1.300% p/p y agua purificada USP al 4.210% p/p. Los porcentajes y las cantidades se reflejan en la siguiente tabla .
Tabla 32 La fase D incluyó dióxido de titanio USP al 1.000% p/p en tanto la fase E incluyó concentrado de 21% de CoQlO, 21% al 7.500% p/p. Todos los porcentajes en peso son relativos al peso de toda la composición en crema de CoQlO al 1.5%. Los porcentajes, las cantidades y los detalles adicionales se reflejan en las siguientes tablas.
Tabla 33 Tabla 34 Para preparar la composición de crema de CoQlO al 1.5%, se agregaron los ingredientes de fase A a un recipiente adecuado y se calentaron hasta entre 70 y 80°C en un baño de agua. Los ingredientes de fase B, con exclusión de la dispersión de carbómero, se agregaron a una calde;ra PK-2 y se mezclaron con mezcla de barrido moderada mientras se calentaron hasta entre 70 y 80°C. Se agregaron los ingredientes de fase C a un recipiente adecuado y se calentaron hasta entre 70 y 80°C en un baño de agua. El concentrado de CoQlO de fase E se colocó en un recipiente adecuado y se fundió entre 50 y 60°C usando un baño de agua, mientras se mezcló según fue necesario para asegurar la uniformidad. Se agregó la dispersión de carbómero a un recipiente adecuado (Tanque de mezcla) y se calentó hasta entre 70 y 80°C mientras se mezcló. Mientras se continuó la mezcla, se agregaron los ingredientes de fase B a la dispersión de carbómero calentada en el Tanque de mezcla i mientras se mantuvo la temperatura. Mientras se continuó la mezcla, se agregaron los ingredientes de fase C a los contenidos del Tanque de mezcla mientras se mantuvo la temperatura. El Tanque de mezcla se mezcló y homogeneizó continuamente. Luego se apagó el mezclador pero se continuó la hpmogeneización mientras se agregó el ingrediente de fase D al Tanque de mezcla. Luego se encendió el mezclador y se mezclaron y homogeneizaron los ingredientes hasta que se volvieron completamente uniformes y totalmente extendidos (verificar color) . Luego se detuvo la homogeneización y se enfrió el lote hasta entre 50 y 60°C. Luego, se apagó el mezclador y se agregó el concentrado de CoQlO fundido al Tanque de mezcla. Luego se encendió el mezclador y los contenidos se mezclaron/recircularon hasta que la dispersión se volvió lisa y uniforme. Luego se enfriaron los contenidos del Tanque de mezcla hasta 45 y 50°C. Luego se transfirieron los contenidos enfriados a un recipiente adecuado para almacenamiento hasta su envase.
Ejemplo 30: Método para preparar un lote de 0.5 kg de crema de CoQlO al 1.5% ; Se preparó una composición en crema de CoQlO al 1.5% combinando las fases A-E tal como se describe a continuación. La fase A incluyó C12-15 alquil benzoato NF al 5.000% p/p, alcohol cetilico NF al 2.000% p/p, estearato de glicerilo/PEG-100 estearato al 4.5% p/p y alcohol 1 estearilico NF al 1.5% p/p. Los porcentajes, las cantidades y los detalles adicionales se reflejan en la siguiente tabla .
Tabla 35 ! La fase B incluyó éter monoetilico de dietilenglicol NF l 5.000% p/p, glicerina USP al 2.000% p/p, propilenglicol USP al 1.750% p/p, fenoxietanol NF al 0.463% p/p, !agua purificada USP al 11.377% p/p y dispersión de i 5 carbómero 2% al 50% p/p. Los porcentajes, las cantidades y los detalles adicionales se reflejan en la siguiente tabla. i Tabla 36 'La fase C incluyó ácido láctico USP al 0.400% p/p, solución de lactato de sodio USP al 2.000% p/p, trietánolamina NF al 1.300% p/p y agua purificada USP al 4.210% p/p. Los porcentajes, las cantidades y los detalles adiciónales se reflejan en la siguiente tabla.
Tabla 37 La fase D incluyó dióxido de titanio USP al 1.000% p/p en tanto la fase E incluyó concentrado de CoQlO, 21% al 7.500% p/p. Todos los porcentajes en peso son relativos al peso de toda la composición en crema de CoQlO al 1.5%. Los porcentajes, las cantidades y los detalles adicionales se reflejan en la siguiente tabla.
Tabla 38 Para preparar la composición en crema de CoQlO al 1.5%,; se pesaron los ingredientes de fase A y se calentaron hasta entre 70-75°C en un baño de agua. Se agregaron los ingredientes de fase B a una caldera PK-2 y se mezclaron con mezcla de barrido moderada mientras se calentaron hasta entre 70-75°C. Cuando la fase B alcanza 70-75°C se agregó la fase A a 70-75°C con mezcla de barrido moderada. Luego se recircularon la fases A y B a través de Silverson. Se pesaron los ingredientes de fase C, se mezclaron hasta volverse uniformes y se calentaron hasta 60-65°C. Luego se agregaron los ingredientes de fase C a la caldera PK-2 con mezclado de barrido en medio-alto. Mientras se continuó la mezcla, se agregó la fase D al lote en la caldera PK-2. Se mezclo continuamente el lote y se recirculó a través de Silverson durante 10 minutos o hasta que se volvió completamente uniforme y totalmente extendido.
Se suspendió la circulación y se enfrió el lote hasta entre 50-55°C con mezcla de barrido en velocidad media.
Luego de calentar los ingredientes de fase E hasta entre 45 i y 50°C, se agregaron al lote y el lote se mezcló con vacio a velocidad moderada hasta volverse uniforme. La temperatura se mantuvo a 50 °C. Luego se enfrió el lote hasta 30-35°C con mezcla baja-moderada y vacio. Luego se bombeó el lote a un recipiente de retención.
Ejemplo 31: Método para preparar un lote de 20 kg de crema de CoQlO al 1.5% Se preparó un lote de 20 kg de composición de crema de CQQIO al 1.5% combinando los ingredientes de las fases A-E. Los porcentajes en peso, las cantidades y los detalles adicionales de los ingredientes para cada fase se presentan en la siguiente tabla. i Tabla 39 Se pesaron los productos químicos con especial cuidado para evitar derrame en el plato de pesaje. Primero se pesaron 200 gm de dióxido de titanio (fase D) , luego se pesaron 600 gm de agua purificada y se etiquetó como "agua para enjuague - Fase B".
Para preparar la Fase A, se pesaron 1000 gm de triglicérido cáprico/caprilico, 400 gm de alcohol cetilico NF, 300 gm de alcohol estearilico NF y 900 gm de estearato de gl'icerilo/PEG-100. Luego se agregaron estos ingredientes de fase A pesados anteriormente a un vaso de precipitación de SS de 4 L y el recipiente se etiquetó como Fase A. Obsérvese que esta premezcla se debe usar dentro de las 24 horas. Luego se cubrió el recipiente de Fase A y se puso a un lado para su uso posterior.
Para preparar la Fase B, se pesaron 10.000 gm de 2% de Dispersión de carbómero como en el ejemplo 11A. Adicionalmente, se pesaron 400 gm de glicerina USP, 350 gm de propilenglicol, 1.000 gm de éter monoetilico de dietilenglicol NF y 93 gm de fenoxietanol NF. Se pesaron 1675 gm de agua purificada y se etiquetó el recipiente como "agua; purificada para Fase B". Se agregaron estos ingredientes de fase A pesados anteriormente a un vaso de precipitación de SS de 10 L y se etiquetó como Fase B. Obsérvese que esta premezcla se debe usar dentro de las 24 horas. Se mezclaron manualmente los contenidos del recipiente de la fase B con una espátula hasta que se volvieron transparentes y uniformes. Luego se cubrió el i i recipiente de la fase B y se puso a un lado para su uso posterior .
Para preparar la Fase C, se pesaron 260 gm de trietanolamina NF, 400 gm de solución de lactato de sodio USP, 60%, 842 gm de agua purificada (etiquetada como "agua purificada para Fase C") y 80 gm de ácido láctico USP. Luego- se agregaron estos ingredientes de fase C pesados anteriormente a un vaso de precipitación de SS de 2 L en el siguiente orden: (1) 260 gm de trietanolamina, (2) 400 gm de solución de lactato de sodio, 60%, (3) 842 gm de agua purificada USP para la fase C y (4) 80 gm de ácido láctico USP. pbsérvese que esta premezcla se debe usar dentro de las 24 horas. Luego se mezclaron manualmente los contenidos del recipiente de fase C con una espátula hasta que se volvieron transparentes y uniformes. Luego se cubrió el recipiente de fase C y se puso a un lado para su uso posterior .
Para preparar la fase E, se pesaron y cubrieron 1500 gm de concentrado de 21% de CoQlO en un recipiente de fase E y se puso a un lado para su uso posterior.
Para preparar el lote de 20 kg de crema de CoQlO al 1.5% se necesitan 2 baños de agua. Se colocó el vaso de precipitación de la fase A en un baño de agua fijado hasta 70-75°C y se mezclaron manualmente los contenidos con una espátula hasta que se volvieron transparentes y uniformes. Luego se colocó el vaso de precipitación de fase C en un baño de agua fijado hasta 60-65°C y se mezclaron manualmente los contenidos del vaso de precipitación de fase C con una espátula hasta que se volvieron transparentes y uniformes. De modo similar, se colocó el vaso de precipitación de fase E en un baño de agua y se fijó hasta 50-55°C. Se mezclaron manualmente los contenidos del recipiente de la fase E con una espátula hasta que se volvieron transparentes y uniformes.
El equipo adicional usado incluyó un baño de agua (E-l)1, un Tanque de vacio Lee (PK-2), una Bomba Waukesha (P-l) y un square hole high shear screen para el Homogéneizador Silverson.
; Primero se confirmó que se cerró la válvula inferior de PK-2 y que se selló correctamente el PK-2. Luego se retiró el visor de vidrio del PK-2. Luego se agregaron los 10.000 gm anteriormente pesados de 2.0% de Dispersión de carbómero al PK-2 a través del portal de visor de vidrio. Se usó una espátula para transferir 2.0% de Dispersión de carbómero de las paredes de su recipiente. Luego se encendió el TIC-2 (registrador de temperatura) para el PK-2 y se verificó para asegurar un funcionamiento adecuado. Luegoj se encendió el agitador para el PK-2 (A-2) y se calentó el 2.0% de Dispersión de carbómero en el PK-2 con la chaqueta de vapor hasta 70-80°C. Se apagó el vacio. Luego se retiró el visor de vidrio del PK-2 y fase B, del vaso ,de precipitación de SS, se agregó lentamente en el PK-2 la través del portal de visor de vidrio. Luego se enjuagó el recipiente de fase B con el "agua para enjuague de Fase B" . Se agregó el enjuague en el PK-2 a través del portal de visor de vidrio. Luego se agregó lentamente la fase ] A al PK-2. Se usó una espátula para transferir i cualquier fase A de las paredes del vaso de precipitación de SS!. Obsérvese que la temperatura de la Fase A debe estar i entre¡ 70-80°C cuando se agrega al PK-2. Luego se abrió la válvula inferior del PK-2. Se encendieron el P-l (Bomba Waukesha) y el P-2 (Homogeneizador Silverson) y se i homogéneizaron los contenidos del PK-2 (Tanque de vacio) . i Se agiegó lentamente la Fase C al PK-2 a través del puerto de a ceso. Obsérvese que la temperatura debe estar entre 70-80°C cuando se agrega al PK-2. Luego se aseguró que la i homogeneizacion durara más de 5 minutos, luego se apagó el A-2 (^agitador) . Luego se tamizó lentamente el dióxido de i titanio de 200.0 gm pesados anteriormente de fase D a través de un filtro de malla 100 en el PK-2. Se usó una i de titanio que se ¡Luego se remplazó el visor de vidrio y se encendió el A-2. 'se continuaron mezclando los contenidos mientras se i recircularon a través de P-l (Bomba Waukesha) y P-2. Se homogeneizaron los contenidos durante 10 minutos o hasta que se volvieron completamente uniformes y totalmente extendidos (verificar color) . Se detuvo el P-2 luego de 10 minutos. Se enfriaron los contenidos del PK-2 hasta 50-60°C. Se retiró el visor de vidrio y se agregó lentamente el concentrado de 21% de CoQlO fundido (Fase E, como en el Ejemplo 7A) al PK-2. Luego se remplazó el visor de vidrio.
; Se mezclaron los contenidos del PK-2 hasta que se volvieron uniformes y se recircularon a través de P-1. La temperatura se mantuvo a 50-60°C. Comenzó el flujo de nitrógeno NF y luego se encendió la C-2 (bomba de vacío) . Obsérvese que es mejor evitar la formación de espuma del producto. Luego se enfrió el lote hasta 45-50°C y se encendieron el vacío y el nitrógeno NF. Cuando el producto se enfrió hasta temperatura [sic] , se apagó la C-2 y se liberó cualquier vacío con el nitrógeno NF. El flujo de nitrógeno NF permaneció encendido. Luego se purgó la i válvula de salida con el producto antes de recoger las muestras o envasar el producto. Se transfirió el producto en recipientes cerrados de HDPE limpios y pesados anteriormente. Se apagaron el A-2, P-1 y flujo de nitrógeno NF y se completó e indicó el lote en la gráfica de TIC-2.
'Se retiraron dos muestras de 30 gm (mínimo) para microanálisis y se retiraron dos muestras de 400 gm (mínimo) para análisis físico/químico. Se etiquetó un conjunto de muestras como "retener". Se pesaron los recipientes rellenos. El tamaño de lote proporcionado fue 20,000 gm.
Ejemplo 32: Método para preparar un lote de 18 kg de 2% de Dispersión de carbómero 'Se preparó un lote de 18 kg de composición de 2.0% de i Dispersión de carbómero combinando las fases A-C tal como I se describe a continuación. La fase A incluyó propilenglicol USP al 0.50% p/p y fenoxietanol NF al 5.00% p/p. La Fase B incluyó agua purificada USP al 92.50% p/p mientras que la Fase C incluyó Carbómero 940 NF al 2.00% p/p. Todos los porcentajes en peso son relativos al peso de toda la composición de 2.0% de crema de CoQlO. Los porcentajes y las cantidades de los ingredientes se listan en la siguiente tabla.
I I Tabla 40 , Se mezclaron en un recipiente adecuado los ingredientes de fase A hasta que se volvieron transparentes y uniformes. Se agregó el agua purificada de la fase B a un segundo recipiente (Tanque de mezcla) . Se retuvo una porción del agua purificada ("agua para enjuague") para enjuagar el recipiente de la fase A. Se calentó el agua en el se.gundo recipiente hasta entre 60 y 65°C. Se agregaron I los ingredientes de la fase A al agua de la fase B y se usó el "agua para enjuague" para enjuagar el recipiente de fase A. Luego se mezclaron manualmente los contenidos del recipiente de Fase A hasta que se volvieron transparentes y i uniformes. Se aumentó la velocidad de mezcla mientras se agregó lentamente (salpicadura) de Carbómero 940 de Fase C al Tanque de mezcla. Se continuó la mezcla hasta que se dispersó completamente todo el polvo y hasta que no había más "ojos de pescado". La temperatura se mantuvo entre 60 y 65°C. Luego se transfirieron los contenidos a un recipiente adecuado para su almacenamiento.
Ejemplo 33: Método para preparar un lote de 3 kg de 2% de Dispersión de carbómero ¡ Se preparó un lote de 3 kg de composición de 2.0% de Dispersión de carbómero combinando las fases A a C tal como se describe a continuación. La fase A incluyó propilenglicol USP al 5.00% p/p y fenoxietanol NF al 0.50% p/p. :La fase B incluyó agua purificada USP al 92.50% p/p mientras que la fase C incluyó Carbómero 940 NF al 2.00% p/p. Todos los porcentajes en peso son relativos al peso de toda . la composición de 2.0% de crema de CoQlO. Los porcentajes, las cantidades y los detalles adicionales se listan en la siguiente tabla.
Tabla 41 Todo el equipo estaba limpio e higienizado. En la mesa de trabajo, se mezclaron los ingredientes de fase A i hasta que se volvieron transparentes y uniformes. Se pesó la cantidad requerida de agua y se agregó a la caldera PK-1 (vaso de fase) . Se calentó el agua en PK-1 con agua caliente/chaqueta de vapor hasta 60-65°C. Se agregó la fase A al agua de la fase B con agitación moderada hasta que se volvió transparente y uniforme. Se enjuagó el recipiente de fase A con fase de agua en proceso mientras se mantuvo la temperatura a 60-65°C. Se continuó la mezcla a agitación mediai-alta hasta que se dispersó completamente todo el polvo y hasta que no había más "ojos de pescado". Se tomaron muestras de los contenidos para determinar la micro calidad, pH, gravedad específica y viscosidad. Luego se bombeó el lote en una bombona cerrada de 5 galones limpia e higiénica con base en pH, gravedad específica y viscosidad dentro de las especificaciones.
Ejemplo 34: Método para preparar un lote de 18 kg de 2% de Dispersión de carbómero Se preparó un lote de 18 kg de 2% de Dispersión de carbómero combinando los ingredientes de fases A, B y C. La fase A incluyó fenoxietanol NF al 0.50% p/p, propilenglicol USP al 5.00% p/p, agua purificada USP al 92.50% p/p y Carbómero 940 NF al 2.00% p/p.
I Tabla 41 El equipo usado en esta preparación de lotes incluyó una Balanza Sartorius, una Balanza Mettler, un Registrador de gráficas, un Tanque de fases Lee y un vaso de precipitación de acero inoxidable (SS) de 2 L.
¦ Antes de pesar los ingredientes se limpió el área de producción y se verificó gue estuviera limpia. Asimismo, se limpiaron y se verificó que estuvieran limpios todos los equipos y dentro de expiración/calibración. Se verificó y registró la calibración de la balanza. Se embetunaron los recipientes de pesaje para evitar el derrame en el plato de pesaje. Primero se pesaron 1.650 gm de agua purificada y se colocaron en un recipiente etiquetado "agua para enjuague".
Se pesaron también otros 15.000 gms de agua purificada. Se pesaron también 360 gms de Carbómero 940 NF.
Se preparó la fase A pesando 90 gms de fenoxietanol en un vaso de precipitación. Luego se pesaron 900 gms de propilenglicol USP en un vaso de precipitación de SS de 2 L. Luego se agregó el fenoxietanol NF pesado anteriormente al vaso de precipitación de SS de 2 L que contiene el propilenglicol pesado anteriormente. Se enjuagó el residuo de fénoxietanol que permanece en el vaso de precipitación con aproximadamente 1/3 del "agua para enjuague". Luego se etiquetó el recipiente como Fase A. Obsérvese que la premezcla se debe usar dentro de las 24 horas.
La fase A se mezcló con una espátula hasta que se volvió transparente y uniforme. Se retiró la espátula mientras se enjuagó con 1/3 del "agua para enjuague".
Luego de la preparación de la fase A se compuso la dispersión usando un Tanque de fase Lee (PK-1). Se colocó una gráfica etiquetada adecuada en el TIC-1 (registrador de temperatura) . Se encendió el TIC-1 (Registrador de temperatura Honywell) y se aseguró que funcionara adecuadamente. Una vez que se confirmó que estaba cerrada la válvula inferior en el PK-1, se agregó el agua purificada USP pesada anteriormente al PK-1. Se enjuagó el vaso de precipitación de SS en el PK-1 con el "agua para enjuague" restante.
Se encendió el agitador en moderado y se calentaron los contenidos del PK-1 con el agua caliente/chaqueta de vapor hasta 60-65°C. Los intervalos aceptables incluyen también 55-70°C. Se fijó el agitador en la velocidad más alta sin ocasionar salpicadura. Se cambió de manera uniforme el Carbómero 940 NF pesado anteriormente a través de un filtro de malla de 50 en el PK-1 por un periodo de al menos 15 minutos pero no más de 20 minutos. La temperatura diana' era 60-65°C, sin embargo, el intervalo aceptable era 55-70°C. Luego se encendió el agitador en velocidad alta. Se continuó la mezcla por al menos 1 hora en agitación alta hasta que se dispersó completamente todo .polvo y hasta que no había más "ojos de pescado". Se usó una espátula para dispersar cualquier polvo que estuviera atorado en el borde del vórtex.
Se retiraron dos muestras de 30 gm para microanálisis y dos muestras de 400 gm para análisis físico/químico. Se etiquetó un conjunto como "retener". Luego se transfirió el producto a recipientes cerrados de HDPE limpios. El tamaño de lote resultante fue 18.000 gm.
Ejemplo 35: Método para preparar una crema de CoQlO al 3% que incluye concentrado de 21% de CoQlO y alquil benzoato Se preparó una composición de crema de CoQlO al 3.0% combinando las siguientes fases. La fase A incluyó C12-15 alquil benzoato NF al 4.00% p/p, alcohol cetilico NF al 2.00% p/p, estearato de glicerilo/PEG-100 estearato al 4.50%: p/p y alcohol estearilico NF al 1.5% p/p. Los porcentajes, las cantidades y los detalles adicionales se listan en la siguiente tabla.
Tabla 43 1 La fase B incluyó éter monoetilico de dietilenglicol NF al 5.00% p/p, glicerina USP al 2.00% p/p, propilenglicol USP al 1.50% p/p, fenoxietanol NF al 0.475 % p/p, agua purificada USP al 16.725% p/p y Dispersión de carbómero, 2% al 40% p/p. Los porcentajes y las cantidades de los ingredientes se listan en la siguiente tabla.
I Tabla 44 La fase C incluyó ácido láctico USP al 0.50% p/p, solución de lactato de sodio USP al 2.00% p/p, Trietknolamina NF al 1.30% p/p y agua purificada USP al 2.50% p/p. Los porcentajes y las cantidades de los ingredientes se listan en la siguiente tabla.
Tabla 45 La Fase B incluyó dióxido de titanio USP al 1.00% p/p mientras que la Fase E incluyó concentrado de 21% de CoQlO, al 15.00% p/p. Los porcentajes y las cantidades de los ingredientes se listan en la siguiente tabla.
Tabla 46 Todos los porcentajes en peso son relativos al peso de toda la composición de crema de CoQlO al 3.0%.
Se agregaron los ingredientes de Fase A a un recipiente adecuado y se calentaron hasta entre 70 y 80°C I I I en un baño de agua. Los ingredientes de Fase B, sin incluir la Dispersión de carbómero, se agregaron a un recipiente adecuado y se mezclaron. Se agregaron también los ingredientes de Fase C a un recipiente adecuado y luego se calentaron hasta entre 70 y 80°C en un baño . de agua. Se colocó el concentrado de CoQlO de Fase E en un recipiente adecuado y fundido entre 50 y 60°C usando un baño de agua.
I Se mezclaron los ingredientes según fuera necesario para asegurar la uniformidad. Luego se agregó' la Dispersión de carbómero a un recipiente adecuado (Tanque de mezcla) y se calentó hasta entre 70 y 80°C mientras se mezcló. Mientras se mezclaban los ingredientes se agregaron los ingredientes de Fase B a los contenidos del Tanque de mezcla mientras se mantenía la temperatura. Los contenidos se mezclaron y homogéneizaron continuamente. Luego se apagó el mezclador, sin embargo, se sostuvo la homogeneización. Mientras se continuó la homogeneización, se agregó el dióxido de titanio de la Fase D al Tanque de mezcla. Luego se encendió el mezclador y se mezclaron los contenidos y se homogéneizaron adicionalmente hasta que se volvieron completamente uniformes y totalmente extendidos (verificar color) . Luego se detuvo la homogeneización y se enfrió el lote hasta entre 50 y 60°C. Luego se apagó el mezclador y se agregó el concentrado de CoQlO fundido al Tanque de mezcla. Se encendió posteriormente el mezclador y los contenidos se mezclaron/recircularon hasta que la dispersión se volvió lisa y uniforme. Luego se enfriaron los contenidos del Tanque de mezcla hasta entre 45 y 50°C.
Luego! se transfirieron los contenidos a un recipiente adecuado para su almacenamiento hasta su envase.
Ejemplo 36: Método para preparar un lote de 0.5 kg de crema de CoQlO al .3% que incluye concentrado de 21% de CoQlO y alquil benzoato 1 Se preparó un lote de 0.5 kg de composición de crema de CoQlO al 3.0% combinando las siguientes fases. La fase A incluyó C12-15 alquil benzoato NF al 4.00% p/p, alcohol cetilico NF al 2.00% p/p, estearato de glicerilo/PEG-100 estearato al 4.50% p/p y alcohol estearilico NF al 1.5% I p/p. I Los porcentajes y las cantidades se listan en la siguiente tabla.
Tabla 47 La fase B incluyó éter monoetilico de dietilenglicol NF al 5.00% p/p, glicerina USP al 2.00% p/p, propilenglicol USP al 1.50% p/p, fenoxietanol NF al 0.475% p/p, agua purificada USP al 16.725% p/p y Dispersión de carbómero, 2% i al 40% p/p. Los porcentajes y las cantidades se listan en la tabla de fases correspondiente a continuación.
Tabla 48 La Fase C incluyó ácido láctico USP al 0.50% p/p, solución de lactato de sodio USP al 2.00% p/p, trietanolamina NF al 1.30% p/p y agua purificada USP al 2.50% p/p. Los porcentajes, las cantidades y los detalles adicionales se listan en la siguiente tabla.
Tabla 49 La Fase D incluyó dióxido de titanio USP al 1.00% p/p mientras que la Fase E incluyó concentrado de 21% de CoQlO al 15.00% p/p. Los porcentajes, las cantidades y los detalles adicionales se listan en la siguiente tabla.
Tabla 50 Todos los porcentajes en peso son relativos al peso de toda la composición de crema de CoQlO al 3.0%.
¡ Se agregaron los ingredientes de Fase A a un recipiente adecuado y se calentaron hasta entre 70 y 80°C en un baño de agua. Los ingredientes de Fase B, sin incluir la Dispersión de carbomero, se agregaron a un recipiente adecuado y se mezclaron. Se agregaron también los ingredientes de Fase C a un recipiente adecuado y luego se calentaron hasta entre 70 y 80°C en un baño de agua. Se colocó el concentrado de 21% de CoQlO de Fase E en un recipiente adecuado y se fundió entre 50 y 60°C usando un baño de agua. Se mezclaron los ingredientes según fuera necesario para asegurar la uniformidad. Luego se agregó la Dispersión de carbomero a un recipiente adecuado (Tanque de mezcla) y se calentó hasta entre 70 y 80°C mientras se mezcló. Mientras se mezclaban los ingredientes se agregaron los ingredientes de Fase B a los contenidos del Tanque de mezcla mientras se mantenía la temperatura. Los contenidos se mezclaron y homogeneizaron continuamente. Luego se apagó el mezclador, sin embargo, se sostuvo la homogeneización. í I I Mientras se continuó la homogeneización, se agregó el i dióxido de titanio de la Fase D al Tanque de mezcla. Luego se encendió el mezclador y se mezclaron los contenidos y se homogeneizaron adicionalmente hasta que se volvieron completamente uniformes y totalmente extendidos (verificar color) . Luego se detuvo la homogeneización y se enfrió el lote hasta entre 50 y 60°C. Luego se apagó el mezclador y se agregó el concentrado de 21% de CoQlO fundido al Tanque de mezcla. Se encendió posteriormente el mezclador y los contenidos se mezclaron/recircularon hasta que la dispersión se volvió lisa y uniforme. Luego se enfriaron los contenidos del Tanque de mezcla hasta entre 45 y 50°C.
Luego¡ se transfirieron los contenidos a un recipiente i adecuado para su almacenamiento hasta su envase.
E emplo 37 : Método para preparar un lote de 0.5 kg de crema de CoQlO al 3% que incluye concentrado ! de 21% de CoQlO y triglicérido caprilico/cáprico ! I Se preparó un lote de 0.5 kg de composición de crema de CoQlO al 3.0% combinando las siguientes fases. La fase A incluyó Triglicérido caprilico/cáprico al 4.00% p/p, alcohol cetilico NF al 2.00% p/p, estearato de glicerilo/PEG-100 estearato al 4.50% p/p y alcohol estearilico NF al 1.5% p/p. Los porcentajes y las cantidades se listan en la siguiente tabla.
I Tabla 51 La fase B incluyó éter monoetilico de dietilenglicol NF al 5.00% p/p, glicerina USP al 2.00% p/p, propilenglicol USP al 1.50% p/p, fenoxietanol NF al 0.475% p/p, agua purificada USP al 16.725% p/p y Dispersión de carbómero, 2% al 40% p/p. Los porcentajes y las cantidades se listan en la tabla de fases correspondiente a continuación.
I Tabla 52 ¡La Fase C incluyó ácido láctico USP al 0.50% p/p, solución de lactato de sodio USP al 2.00% p/p, trietanolamina NF al 1.30% p/p y agua purificada USP al 2.50% p/p. Los porcentajes, las cantidades y los detalles adicionales se listan en la siguiente tabla.
Tabla 53 1 I La Fase D incluyó dióxido de titanio USP al 1.00% p/p miendras que la Fase E incluyó concentrado de 21% de CoQlO al 15.00% p/p. Los porcentajes, las cantidades y los detalles adicionales se listan en las siguientes tablas.
Tabla 54 Todos los porcentajes en peso son relativos al peso de toda la composición de crema de CoQlO al 3.0%.
I Se agregaron los ingredientes de Fase A a un recipiente adecuado y se calentaron hasta entre 70 y 80°C en un 'baño de agua. Los ingredientes de Fase B, sin incluir la Dispersión de carbómero, se agregaron a un recipiente adecuado y se mezclaron. Se agregaron también los i ingredientes de Fase C a un recipiente adecuado y luego se calendaron hasta entre 70 y 80°C en un baño de agua. Se coloco el concentrado de 21% de CoQlO de Fase E en un recipiente adecuado y se fundió entre 50 y 60°C usando un baño ¡de agua. Se mezclaron los ingredientes según ?µß^ necesario para asegurar la uniformidad. Luego se agregó la Dispersión de carbómero a un recipiente adecuado (Tanque de i mezcla) y se calentó hasta entre 70 y 80°C mientras se mezclo. Mientras se mezclaban los ingredientes se agregaron los ingredientes de Fase B a los contenidos del Tanque de Los contenidos Luego se apagó el mejzclador, sin embargo, se sostuvo la homogeneización. Mientras se continuó la homogeneización, se agregó el dióxido de titanio de la Fase D al Tanque de mezcla. Luego se encendió el mezclador y se mezclaron los contenidos y se homogeneizaron adicionalmente hasta que se volvieron completamente uniformes y totalmente extendidos (verificar color) . Luego se detuvo la homogeneización y se enfrió el lote hasta entre 50 y 60°C. Luego se apagó el mezclador y se agregó el concentrado de 21% de CoQlO fundido al Tanque de me¡zcla. Se encendió posteriormente el mezclador y los contenidos se mezclaron/recircularon hasta que la I dispersión se volvió lisa y uniforme. Luego se enfriaron los contenidos del Tanque de mezcla hasta entre 45 y 50°C. Luego ¡ se transfirieron los contenidos a un recipiente adecuado para su almacenamiento hasta desenvasar.
Ejemplo 38: Método para preparar un lote de 20 kg de crema de CoQlO al 3% que incluye concentrado de 21% de CoQlO y triglicérido caprilico/cáprico Se preparó un lote de 20 kg de composición de crema de CoQlO al 3.0% combinando los ingredientes de las fases A-E. Los porcentajes en peso, las cantidades y los detalles adicionales de los ingredientes para cada fase se presentan en la! siguiente tabla.
Tabla 55 Para preparar el lote de 20 kg de crema de CoQlO al 3% se, siguen los siguientes procedimientos. Antes de que se pesaran los ingredientes químicos, se tuvo especial cuidado para asegurar que el área y todo el equipo estuvieran limpios. Primero se pesaron los ingredientes químicos y se tuvo ^especial cuidado para evitar cualquier derrame en el plato; de pesaje .
Primero se pesaron 200 gm de dióxido de titanio USP (Fase D) . Luego se pesaron 600 gm de agua purificada (etiquetada "agua para enjuague Fase B").
Para preparar la fase A, se pesaron 800 gm de triglicérido cáprico/caprilico, 400 gm de alcohol cetílico NF, 300 gm de alcohol estearílico NF, 900 gm de estearato de glicerilo/PEG-100 estearato. Se agregaron estos ingredientes de fase A pesados anteriormente a un vaso de precipitación de SS de 4 L y se etiquetaron como Fase A. Obsérvese que esta premezcla se debe usar dentro de las 24 horas. Luego se cubrió el recipiente de la fase A y se puso a un lado para su uso posterior.
Para preparar la fase B, se pesaron 8.000 gm de 2.0% de Dispersión de carbómero, 400 gm de glicerina USP, 300 gm de propilenglicol, 1.000 gm de éter monoetilico de dietilenglicol NF, 95 gm de fenoxietanol NF, y 2.745 gm de agua purificada USP (etiquetada "agua purificada para Fase B") . Luego se agregaron estos ingredientes de fase B pesados anteriormente a un vaso de precipitación de SS de 10 L. Obsérvese que esta premezcla se debe usar dentro de las 24 horas. Se mezclaron manualmente los contenidos del recipiente de fase B usando una espátula hasta que se volvieron transparentes y uniformes. Luego se cubrió el recipiente de la fase B y se puso a un lado para su uso posterior .
Para preparar la fase C se pesaron 260 gm de trietanolamina NF, 400 gm de solución de lactato de sodio USP, 60%, 500 gm de agua purificada (etiquetada como "agua purificada para Fase C") y 100 gm de ácido láctico USP. Luego se agregaron estos ingredientes de la fase C a un vaso de precipitación de SS de 2 L en el siguiente orden: (1) 260 gm de trolamina, (2) 400 gm de solución de lactato de sodio, 60%, (3) 500 gm de agua purificada para la fase C y (4) 100 gm de ácido láctico USP. Se etiquetó el como Fase C. Obsérvese que esta premezcla se i debe usar dentro de las 24 horas. Luego se mezclaron manualmente los contenidos del recipiente de fase C con una espátula hasta que se volvieron transparentes y uniformes. i Luego: se cubrió el recipiente de fase C y se puso a un lado para su uso posterior.
Para preparar la fase E, se pesaron 3.000 gm de concentrado de 21% de CoQlO y se colocaron en un recipiente etiquetado fase E. El recipiente de fase E se tapó y puso a un lado para su uso posterior.
Para componer la crema de CoQlO al 3% se usaron 2 baños de agua para calentar las fases A, C y E. Primero, se colocó el vaso de precipitación de fase A en un baño de agua fijado hasta 70-75°C y los contenidos se mezclaron manualmente con una espátula hasta que se volvieron transparentes y uniformes. Se colocó el vaso de precipitación de fase C en un baño de agua que se fijó hasta! 60-65°C. Se mezclaron manualmente los contenidos del vaso de precipitación de fase C con una espátula hasta que se volvieron transparentes y uniformes. Se colocó el vaso de precipitación de fase E en un baño de agua y se fijó a una temperatura de 50-55°C. Se mezclaron manualmente los conteñidos del vaso de precipitación de fase E con una espátula hasta que se volvieron transparentes y uniformes.
Para componer la crema, se usaron un baño de agua (E-l), un Tanque de vacio Lee (PK-2), una Bomba Waukesha (P-l) y un square hole high shear screen para el Homogeneizador Silverson.
Primero se confirmó que la válvula inferior de PK-2 estuviera cerrado y que se hubiera sellado correctamente el PK-2.1 Luego se retiró el visor de vidrio del PK-2 y se agregaron 10.000 gm pesados anteriormente de 2.0% de Dispersión de carbómero al tanque de PK-2 a través del portal de visor de vidrio. Se usó una espátula para transferir cualquier 2% de Dispersión de carbómero de las paredes de su recipiente. Luego se encendió el TIC-2 (registrador de temperatura) para el PK-2 y se aseguró que el registrador tuviera un funcionamiento adecuado.
Se encendió el agitador (A-2) para el PK-2 y se calentaron 2.0% de Dispersión de carbómero con la chaqueta de vapor hasta 70-80°C. Luego se retiró el visor de vidrio del PK-2 y se agregó lentamente la fase B desde el vaso de precipitación de SS al PK-2 a través del portal de visor de i vidrio. Luego se enjuagó el recipiente de fase B con el "agua, para enjuague-Fase B". Luego se agregó el enjuague al PK-2 á través del portal de visor de vidrio.
Luego se agregó lentamente la fase A al PK-2. Se usó una espátula para transferir cualquier fase A remanente en las paredes del vaso de precipitación de SS . Obsérvese que la temperatura de la fase A debe estar entre 70-80°C cuando se agrega al PK-2.
Luego se abrió la válvula inferior del PK-2 y se encendieron la bomba P-l y P-2 (homogeneizador Silverson) . Se homogeneizaron los contenidos del PK-2.
Luego se agregó lentamente la fase C al PK-2 a través del puerto de acceso. Obsérvese que la temperatura debe estar' entre 70-80°C cuando se agrega. Se aseguró que la homogeneización durara al menos 5 minutos, luego se apagó el agitador A-2. Luego se tamizaron lentamente 200 gm pesados anteriormente de dióxido de titanio USP a través de un filtro de malla 100 al PK-2. Se usó una espátula para desplazar cualquier dióxido de titanio que se hubiera adherido a las paletas del PK-2. i Luego se remplazó el visor de vidrio y se encendió el agitador A-2. Se continuaron mezclando los contenidos mientras se recircularon a través de P-l y P-2. Se dejó continuar la homogeneización durante 10 minutos o hasta que se volviera completamente uniforme y totalmente extendida. Luego^ de 10 minutos se detuvo el P-2. Luego se enfriaron los contenidos del PK-2 hasta 50-60°C. Luego se retiró el visor de vidrio y se agregó lentamente el concentrado de 21% de CoQlO fundido de la fase E a través del puerto de acceso. Luego se remplazó el visor de vidrio.
Luego se mezclaron los contenidos del PK-2 con A-2 hasta que se volvieron uniformes. Se mantuvo la temperatura a 50-60°C y se recircularon los contenidos a través del i P-1. Luego se comenzó el flujo de nitrógeno NF y luego se encendió la bomba de vacio C-2. Obsérvese que se prefiere la evasión de formación de espuma del producto. Luego se enfrió el lote hasta 45-50°C, luego se encendieron el vacio y el nitrógeno. Cuando se enfrió el producto hasta temperatura, se apagó la C-2 (bomba de vacio) y se liberó cualquier vacío con el nitrógeno NF. El flujo de nitrógeno NF permaneció encendido. Se purgó la válvula de salida con el producto antes de recoger las muestras o envasar el producto . i 1 Luego se transfirió el producto en recipientes cerrados de HDPE limpios y pesados anteriormente. Se apagaron el agitador A-2, la bomba Waukesha P-1 y el flujo de nitrógeno NF. Se completó el lote y se indicó en la gráfica de TIC-2.
Se retiraron dos muestras de 30 gm (mínimo) para micro nálisis y dos muestras de 400 gm (mínimo) para análisis físico/químico. Se etiquetó un conjunto de muestras como "retener". Se pesaron los contenidos rellenos. Se obtuvo un tamaño de lote de 20 kg.
Ejemplo 39: Método para tratar SCCIS mediante aplicación tópica de crema CoQlO al 3% Se aplicó tópicamente una composición de crema de CoQlO al 3.0%, tal como se describió anteriormente (por ej . , ejemplos 15 y 16), a carcinomas de células escamosas cutáneas (SSCIS) in situ. Se trataron tópicamente 35 (treinta y cinco) sujetos con un medicamento de base en crema de emulsión de agua en aceite de CoQlO al 3.0%. Se envió y almacenó este medicamento a temperatura ambiente en recipientes resistentes a la luz.
Las poblaciones de análisis se definieron como (1) población con intención de tratar (ITT), (2) población segura y (3) población por protocolo (PP) . La población ITT incluyó todos los sujetos a quienes se les administró el fármaco de investigación (CoQlO al 3%) . La población segura incluyó todos los sujetos que tomaron al menos una dosis del producto de investigación. La población PP incluyó todos los sujetos que tuvieron SCCIS confirmado por medio de resultados histológicos en el punto de referencia, tuvieron un examen histológico en la semana 6 y no perdieron ninguna visita en el Ínterin.
Los sujetos eran además adultos femeninos o masculinos saludables con al menos una lesión de SSCIS no facial histológicamente confirmada. Las lesiones SSCIS que eran adecuadas para escisión tuvieron un área mínima de 0.5 cm2 y un diámetro máximo de 2.0 cm y estaban en una ubicación que se podía proteger de la luz solar con vestimenta durante el estudio. A aproximadamente la misma hora cada mañana, el sujeto se lavó el sitio de la lesión, luego! se distribuyó una pequeña cantidad del tamaño de una arveja (50-100 mg) del medicamento en crema tópico en un pedazo de papel o aplicador de cera. Luego el sujeto aplicó la cantidad adecuada de crema a la lesión y el área circundante usando un hisopo de algodón o palito aplicador. El área tratada no se lavó por al menos 8 horas luego de la aplicación. Se repitió el procedimiento a aproximadamente la misma hora cada noche. Se protegió la lesión y el área circundante de la luz solar con vestimenta.
El primer día del tratamiento se midió el diámetro de la lesión y se calculó el área. También se fotografiaron las lesiones. Se evaluaron los sujetos en las semanas 1, 2, 3, 4 y 5 y se llevó un registro de sus signos vitales: presión sanguínea, frecuencia de pulso, frecuencia de respiración, temperatura oral. También se graduaron los siguientes signos/síntomas clínicos de irritación cutánea basada en las siguientes tablas como una medida de seguridad del tratamiento con CoQlO al 3%: eritema, abrasión, sequedad, comezón, quemadura/picazón.
Eritema Tabla 56 Abrasión/Descamación Tabla 57 Sequedad Tabla 60 Evaluación de seguridad mediante Eritema: En el punto de referencia, 32 sujetos (91.4%) presentaron algún grado de eritema. Este signo fue considerado de ligero a leve en la mayoría de los sujetos (28 sujetos, 80%) y 4 sujetos (11.4%) presentaron color rojo marcado (Grado 3) . En la semana 6, el eritema estaba ausente en 4 sujetos (11.8%) y era ligero o leve en 30 sujetos (88.2%), en tanto no se observó eritema de Grado 3. El valor de eritema máximo observado durante el estudio mejoró en comparación con el punto:de referencia en 7 sujetos, no cambió en 15 sujetos y empeoró en 13 sujetos. El valor de eritema final mejoró en relación con el punto de referencia en 11 sujetos, no cambió en 22 sujetos y empeoró en 2 sujetos.
Evaluación de seguridad mediante Abrasión/Descamación: En el punto de referencia, 27 sujetos i (77.1%) presentaron algún grado de abrasión o descamación y 8 sujetos (22.9%) no presentaron ninguno. En la semana 6, no había abrasión o descamación visible en 16 sujetos (47.1%), era ligera en 17 sujetos (50%) y era moderada en únicamente 1 sujeto (2.9%). El valor máximo para abrasión/descamación observado durante el estudio mejoró en comparación con el punto de referencia en 7 sujetos, no cambió en 20 sujetos y empeoró en 8 sujetos. El valor de abrasión/descamación final mejoró en relación con el punto de referencia en 16 sujetos, no cambió en 14 sujetos y empeoró en 5 sujetos.
Evaluación de seguridad mediante Sequedad: Ocho sujetos (22.9%) presentaron sequedad ligera o moderada en el piimto de referencia, en tanto 77.1% no presentaron sequedad (Grado 1) o un brillo aceitoso (Grado 0) en el área de tratamiento. En la semana 6, todos menos 1 sujeto presentaron sequedad de Grado 0 o Grado 1 (97.1%). El valor de sequedad máximo observado durante el estudio mejoró en comparación con el punto de referencia en 7 sujetos, no cambió en 23 sujetos y empeoró en 5 sujetos. El valor de sequedad final mejoró en relación con el punto de referencia en 13 sujetos, no cambió en 21 sujetos y empeoró en 1 sujeto.
Evaluación de seguridad mediante Comezón: Una mayoría de sujetos en el punto de referencia informaron ausencia de comezón (74.3%) o comezón leve y ocasional (20%), mientras que 2¡ sujetos (5.7%) informaron comezón de Grado 2 o 3. En la semana 6 mejoró la comezón de modo que el 94.1% no tenía comezón y solamente 2 sujetos (5.9%) tenían comezón leve y ocasional. Desde la semana 1 a la semana 6 ningún sujeto tuvo comezón peor que Grado 1 (comezón leve y ocasional) . El valor de comezón máximo observado durante el estudio mejoró en comparación con el punto de referencia en 5 sujetos, no cambió en 24 sujetos y empeoró en 6 sujetos. El valor de comezón final mejoró en relación con el punto de referencia en 9 sujetos, no cambió en 24 sujetos y empeoró en 2 sujetos.
¡ Evaluación de seguridad mediante Quemadura/Picazón: En el punto de referencia, había ausencia de quemadura o picazón en la mayoría de los sujetos (94.3%) y era leve en 2 sujetos (5.7%). Estos valores permanecieron virtualmente intactos durante el estudio. Ningún sujeto tuvo un valor por encima de Grado 1 (leve) y no más de 2 sujetos tuvieron un valor de Grado 1 en ninguna visita desde el día 1 (punto de referencia) a la semana 6. El valor máximo para quemadura/picazón observado durante el estudio mejoró en comparación con el punto de referencia en 2 sujetos, no cambió a partir de "sin quemadura/picazón" en 28 sujetos y empeoró (de ninguno a leve) en 5 sujetos. El valor de quemadura/picazón final mejoró en relación con el punto de referencia en 2 sujetos, no cambió en 31 sujetos y empeoró en 2 sujetos.
También se midieron los diámetros de las lesiones y se calcularon las áreas para evaluar la eficacia del tratamiento con CoQlO al 3%. Al final del periodo de tratamiento de 6 semanas hubo una visita de interrupción donde; se llevó un registro de los signos vitales y se graduaron los signos/síntomas clínicos. Se realizó también un examen físico en la visita de interrupción de la semana 6. En la visita de interrupción se recogieron también muestras de sangre en ayunas dentro de 3 horas de la aplicación final de crema para determinar las concentraciones en plasma de CoQlO. Se fotografiaron las lesiones, se midieron los diámetros y se calculó el área.
Los resultados del tratamiento tópico de SSCIS con crema de CoQlO al 3% mostraron eficacia tal como se ilustra en las fotografías de antes y después de las Figuras 4 a 9. El criterio de valoración de eficacia primario era el porcentaje de sujetos con una respuesta completa definida como 'una evaluación de histología negativa de la lesión diana en la semana 6. Los criterios de valoración de eficacia secundarios se reflejan en el porcentaje de sujetos con una respuesta parcial, definidos como al menos una disminución del 50% en el área (el producto de los dos diámetros principales) de la lesión tratada en la semana 6. Los resultados mostraron que el 23.5% de la población ITT tuvo una respuesta completa en la semana 6 mientras que el 18.5%! de la población PP tuvo una respuesta completa en la semana 6.
Los resultados de eficacia secundarios mostraron que el 26.5% de la población ITT tuvo una respuesta parcial de 50% y que el 2.9% tuvo una respuesta parcial de 75% en la semana 6. Se observó una respuesta parcial tan temprano como en la semana 1 en 2 sujetos y la semana 2 en 8 sujetos. Las tasas de respuesta parciales más altas ocurrieron en las semanas 4 y 5. De manera interesante, de los 8 sujetos con una respuesta completa en la semana 6, 4 sujetos no tuvieron una respuesta parcial con base en inspección visual y ninguno tuvo una respuesta del 75%. En la población PP, el 22.2% tuvo una respuesta parcial del 50% mientras que 0% tuvo una respuesta parcial de 75%. El cambio medio y el cambio porcentual medio en el área de lesión fueron -0.3 cm2 y -26.1% respectivamente en la Población ITT en la semana 6 y -0.3 cm2 y -23.4% respectivamente en la Población PP. i ¡En general, la crema de CoQlO al 3% fue segura y bien tolerada. Se alcanzó la cura completa en aproximadamente 25% de los sujetos en la Población ITT.
Ejemplo 40: Método para tratar BCC mediante aplicación tópica de crema CoQlO al 3% El carcinoma de células básales (BCC) es la forma más común de neoplasia cutánea y, en general, la forma más común de cáncer en Estados Unidos. La Sociedad americana de Cáncer estima que se diagnostican más de 800.000 casos nuevos de carcinoma de células básales cada caño. El carcinoma de células básales superficiales (sBCC) raramente se difunde por metástasis y normalmente tiene cura a través de escisión quirúrgica o agentes tópicos.
Se aplicó tópicamente una composición de crema de CoQlO al 3.0%, tal como se describió anteriormente en los ejemplos 35-36, a 160 (ciento sesenta) adultos femeninos o macho saludables con una o más lesiones de carcinoma de células básales superficiales (sBCC) histológicamente confirmadas. Se designó una lesión diana con un área mínima de 0.5 cm2 y un diámetro máximo de 2.0 cm para tratamiento. La lesión de sBCC era no facial y podía estar protegida de la luz solar durante el estudio.
Este estudio fue un estudio paralelo, de vehículo controlado, doble ciego y aleatorio. Cada sujeto se separó aleatoriamente a uno de (4) cuatro grupos de estudio: crema de CoQlO al 1.5% qd (una vez al día) más crema de vehículo qd (una vez al día), crema de CoQlO al 3.0% qd (una vez al día) más crema de vehículo qd (una vez al día) , crema de CoQlO al 3.0% bid (dos veces al día) o crema de vehículo bid (dos veces al día). Cada grupo tenía 40 pacientes.
Tabla 61 i En una visita de detección inicial, se midieron los diámetros de las lesiones y se calculó el área. Se determinó el área midiendo los dos diámetros perpendiculares más grandes y se multiplicó para un resultado en cm2. Se tomaron y registraron los signos vitales de los sujetos y se realizó un examen físico. Se recogieron las muestras de sangre en ayunas y se realizó un análisis de conteo sanguíneo completo (CBC) así como un análisis químico clínico con panel de lípidos. Se recogieron las muestras de sangre para determinar las concentraciones en plasma de CoQlO de punto de referencia, se recogieron y envasaron las muestras duplicadas. También se realizó urinálisis y para las mujeres con potencial de reproducción se realizó un análisis de embarazo de orina. Luego se graduaron los sujetos para los siguientes signos/síntomas clínicos de irritación cutánea: eritema, abrasión, sequedad, comezón y quemadura/picazón.
En el primer día del estudio (Día 1), se registraron nuevamente los signos vitales de los sujetos y se graduaron I los signos/síntomas clínicos de irritación cutánea como en la visita de detección. También se entrevistó el sujeto para determinar eventos adversos, uso de productos tópicos concurrentes y uso de medicamentos concurrentes. Luego se fotografiaron las lesiones de sBCC diana y se midieron para determinar el diámetro y área como en la visita de detección. Luego se les proporcionó a los sujetos un kit de medicamentos que contenia los medicamentos de CoQlO. El paciente se aplicó la crema de CoQlO dos veces al día durante seis semanas a la lesión de sBCC y 1 cm de piel circundante .
El régimen de dosificación consistió en lavar el sitio de lesión a aproximadamente la misma hora cada mañana, colocar una cantidad pequeña del tamaño de una arveja (50-100 mg) de crema tópica desde el tubo AM a una pieza de papel o aplicador de cera. Luego el sujeto aplicó la cantidad adecuada de crema a la lesión y área circundante usando un hisopo o palito aplicador. El área tratada no se lavó por al menos 8 horas. A aproximadamente la misma hora cada noche, se repitió el procedimiento usando crema tópica desde el tubo PM.
Hubo visitas en el ínterin de parte del sujeto en las semanas 1, 2, 3, 4 y 5. En cada una de estas visitas, se registraron los signos vitales como en la visita de detección inicial y se graduaron los signos/síntomas clínicos. Se midió el diámetro de la lesión y se calculó el área.' Luego se entrevistó el sujeto para determinar casos adversos, uso de productos tópicos concurrentes y uso de medicamentos concurrentes. Se realizaron evaluaciones clínicas semanalmente .
Al final del período de tratamiento, 6 semanas, se registraron los signos vitales como en la visita de detección inicial y se graduaron los signos/síntomas clínicos. Se midió el diámetro de la lesión y se calculó el área. Se llevó a cabo también un examen físico. Se recolectaron también muestras de sangre en ayunas luego de la aplicación de crema final. Se recogieron las muestras de sangre no más de 3 horas luego de la aplicación de crema final para determinar las concentraciones en plasma de CoQlO. Se llevó a cabo un análisis de conteo sanguíneo completo (CBC) y se llevó a cabo un análisis químico clínico con panel de lipidos.
En la cuarta semana luego del tratamiento (semana 10 del estudio) , el sujeto volvió para evaluación y escisión final del sitio de lesión de sBCC. Se tomaron y registraron los signos vitales y se graduaron los signos/síntomas clínicos, similares a aquellos en la visita de detección inicial .
Los resultados del tratamiento mostraron, luego ficar la patología de 110 sujetos, que al menos 20% los pacientes que se trataron tópicamente con crema de CoQlO, al 3% demostraron una disminución de los síntomas como se midió por un criterio de valoración reconocido en la técnica. En particular, 24 de 110 sujetos no presentaron prueba de sBCC con base en una biopsia del sitio de la lesión a las 8 semanas.
Ejemplo 41: Resultados farmacocinéticos del tratamiento 1 tópico con CoQlO Setenta y dos ratones BALB/c se dividieron aleatoriamente en nueve grupos de ocho ratones cada uno (Grupos I-IX) . El grupo I no se trató. El día 0, los grupos II-VIII se trataron tópicamente con 0.1 g del artículo de prueba (una emulsión de aceite en agua que contiene crema CoQ10,al 3% p/p administrada con API 31510 radiomarcado con C-14)ja una velocidad de 5 mg/cm2. El API 31510 radioactivo se agregó al lote de crema al 3% para proporcionar una formulación en crema experimental con una actividad específica de aproximadamente 50 Ci g del producto o 5 Ci/g/dosis de aplicación. El artículo de prueba se aplicó tópicamente a la piel del lomo de cada ratón en los grupos II-IX con una varilla de vidrio. Inmediatamente después de la dosificación del grupo II se sacrificaron los animales y i se recogió y pesó una cantidad medida de sangre, orina, heces y órganos diana (hígado, páncreas y bazo) . Se procesó la sangre para el suero y se homogeneizó cada órgano. Se sacrificaron los grupos III-VIII a las 2, 4, 8, 12, 18 y 24 horas' luego de la dosificación, respectivamente, y se í recogieron las mismas muestras. El grupo IX se trató tópicamente con 0.1 g del articulo de prueba durante siete días j (días 0-6) . El dia 7, 24 horas después de la aplicación final del articulo de prueba el dia 6, se sacrificaron los grupos I y IX y se recogieron las mismas muestras que los grupos anteriores. Se midió cada muestra para jlas desintegraciones por minuto (DPM) y se calculó el tipo ¡de DPM/muestra medio para cada grupo.
La evaluación se basó en la medición de los niveles de radioactividad de suero, orina, heces y órganos diana (higajdo, páncreas y bazo) en varios puntos de tiempo con el objetivo de determinar los niveles relativos de penetración percutánea del articulo de prueba durante 24 horas y determinar dónde se acumula el fármaco con el método de aplicación. í ¡ En la gráfica a continuación se presenta un resumen de los pesos de muestra promedio en gramos para cada grupo.
I Tabla 62 ' Las desintegraciones por minuto (DPM) se presentan en i la Tabla 63 y se midieron en un contador de centelleo para cada i tipo de muestra de tejido de cada animal. Se calcularon las DPM promedio para cada tipo de muestra.
I Después de que los resultados se convirtieron en cantidades i de 1 mL, los promedios luego se dividieron en pesos de I órgano promedio para obtener las DPM por resultado en i gramos de tejido. Los resultados del control (Grupo I) i luego; se restaron de cada uno de los resultados del otro grupo i para quitar registros de cantidades de radiación de i fondo! y obtener la cantidad real de DPM promedio por gramo I de tejido para cada muestra en el grupo. Dividiendo por una constante de 2,220,000, los resultados se convirtieron en microcurios por gramo de tejido. Los resultados finales representan picocurios (microcunos x 1000 ) por gramos tejido. Los resultados de los órganos se presentan en cuadro y el gráfico a continuación.
RESULTADOS DE ORGANO DIANA Picocurios por gramo de tejido Tabla 63 Gráfico de resultados del órgano diana Horas después de la dosificación ¦Páncreas •Hígado- " - Bazo , Los datos reflejan que el artículo de prueba se acumuló sustancialmente en el páncreas aproximadamente ocho ( 8 ) horas luego de la dosificación y, en cantidades menores, en el hígado ocho horas luego de la dosificación. La cantidad de picocurios por gramo de tejido en el bazo y en el1 páncreas se redujo hasta casi cero, 18 horas luego de la dosificación . Los resultados del hígado en la hora 0 fueron anormales en un único animal con una cantidad excepcionalmente alta de DP cero horas después de la dosificación. Una posible explicación para este resultado anormalmente alto es que el animal logró ingerir el artículo de prueba directamente, ya sea lamiendo su propia piel 1 o lamiendo sus patas luego de frotar el sitio de dosificación. Esa posibilidad enviaría el artículo de prueba al hígado mucho más rápidamente que la absorción percutánea. Luego del pico de 8 horas, las cantidades en el hígado se redujeron ligeramente a las 12 horas pero luego aumentaron ligeramente a las 18 horas y se mantuvieron coherentes a lo largo de las 24 horas.
Resultados de órganos diana (continuación) De las cantidades de artículo de prueba que se acumularon en cada uno de los órganos diana para todos los animales en los grupo II a VIII, el porcentaje de picocurios por gramo de tejidos se presenta en el cuadro a continuación .
Tabla 65 Los grupos II-VIII se dosificaron con 4.112 microcurios del artículo de prueba. El cuadro a continuación presenta la cantidad de microcurios en cada órgano diana en cada período de tiempo.
Tabla 66 La división de esos números entre 4.112 (la cantidad de microcurios en cada dosificación) , da como resultado un porcentaje que representa la cantidad de artículo de prueba en cada órgano para cada período de tiempo. El cuadro a continuación presenta esos porcentajes.
Tabla 67 El porcentaje promedio del artículo de prueba en microcurios que alcanzó los órganos diana es 0.03%, 0.07% y 0.01% para el páncreas, hígado y bazo, respectivamente. ', Para las muestras de desechos corporales, los resultados finales se presentaron en picocurios por mL. Esta cantidad se obtuvo convirtiendo las DP en 1 mL, restando los resultados del Grupo I, y luego dividiendo por la constante 2,220,000 para obtener microcurios por mL. Multiplicando ese resultado por 1000, se obtuvieron picocurios por mL. Los picocurios promedio por mL para heces y orina se presentan en el cuadro y el gráfico a continuación.
Tabla 68 Gráfica de resultados de. muestra de desechos Hora después de la Dosificación "Heces · "Orina Tabla 69 I Los datos reflejan que el artículo de prueba acumulado sustancialmente en las heces ocho horas luego de la dosificación continuó presente a las 12 horas luego de la dosificación pero se redujo sustancialmente a las dieciocho horas luego de la dosificación. No hubo indicaciones de que el artículo de prueba se acumulara en la orina en cualquier momento durante el estudio.
¦ Los resultados de sangre se calcularon de la misma forma que se calcularon los resultados de las muestras de desechos. Estos cálculos para los picocurios por mL en sangre dieron como resultado números negativos dada la gran cantidad de DPM en el Grupo I, resultados de sangre de control. Este fue un resultado de dos animales que tienen lecturas de DPM más altas que las esperadas en la sangre. Los resultados de la sangre se presentan en el cuadro y el gráfico a continuación.
Tabla 70 Gráfica de resultados en sangre ¡ Horas drxpiiés dt la dostflcaclóii Tabla 71 Los datos indican que el articulo de prueba no se acumuló en la sangre; con la excepción de que el articulo de prueba podría haber estado presente en la sangre 18 horas después de la dosificación. Resulta raro que no encontraron cantidades significativas del artículo de prueba en la sangre, especialmente dado que el artículo de prueba se observó en el hígado y páncreas. Una explicación es la absorción percutánea del artículo de prueba a través de la piel directamente a los órganos; sin embargo, es poco probable que el artículo de prueba no entre en la sangre luego! de penetrar la piel. Otra posibilidad es que la sangré reconozca inmediatamente una sustancia extraña y deposite el material de prueba en el hígado. La última dosificación para el Grupo II fue 10:23 am y el primer animal sacrificado para el Grupo II fue 10:45 am. Veintidós minutos podría haber sido tiempo suficiente para que la sangre se librara del material extraño.
Los datos del Grupo IX se calcularon por separado mientras los animales en el Grupo IX se dosificaron repetidamente en vez de una sola vez y se dejaron 7 días para absorber el artículo de prueba. Los datos del Grupo IX se presentan en los cuadros a continuación.
Picocurios por gramo de tejido para muestras de órganos Páncreas Hígado Bazo Grupo IX 0.12 2.07 1.19 Tabla 72 Los picocurios promedio por gramo de tejido para los Grupos II-VIII fueron 1.24, 2.83 y 0.38 para el páncreas, hígado y bazo respectivamente. Los resultados del Grupo IX para los órganos estuvieron por debajo del promedio para el páncreas, casi promedio para el hígado y más altos que el promedio para el bazo. Los datos indican que hubo cantidades en aumento del artículo de prueba en el bazo el día 7 y que las cantidades del artículo de prueba en el hígado el día 7 fueron comparables a las mismas cantidades encontradas en el hígado 18 y 24 horas luego de la dosificación .
Picocurios por mL para muestras de desechos Heces Orina Grupo IX 25.0650 -0.0011 Tabla 73 Los picocurios promedio por mL para las heces para los Grupos II - VIII fueron 27.55 y para la orina fueron 0.0064. Los resultados de heces y orina del Grupo IX no fueron anormales y solo se mostraron mínimas señales del artículo de prueba en las heces.
Picocurios por mL de sangre Sangre Grupo IX -0.0538 Tabla 74 Al igual que con otros grupos, los resultados de sangre del Grupo IX indican que el artículo de prueba no estaba presente en la sangre.
; Los resultados generales indican que no hubo diferencias significativas entre los pesos de los órganos diana, cantidad de heces, orina o sangre entre los grupos. No se; detectaron cantidades significativas del artículo de prueba en la orina. No se recogió orina de los Grupos I (control), II (Hora 0) o VI (Hora 12) . Salvo para el Grupo VII (18 horas luego de la dosificación) , el artículo de prueba no se detectó en cantidades significativas en la j sangre en ningún momento durante el estudio. Las cantidades mayores de picocurios por gramo de tejido y picocurios por mL se registraron para el Grupo V (8 horas luego de la dosificación) y estaban más concentrados en las heces y el páncreas en ese momento. También en el Grupo V, los mayores niveles de picocurios por gramo de tejido se encontraron en el higado. Dentro del hígado, luego de un leve declive en la Hora 12, los niveles permanecieron coherentes a la Hora 18 y Hora 24 y se encontraron niveles comparables en el hígado para el Grupo IX (animales del Día 7) . Luego del pico 8 horas luego de la dosificación, las cantidades del páncreas disminuyeron hasta niveles de casi cero, incluidos los resultados del Grupo IX. Las cantidades del bazo aumentaron en la Hora 4 y luego se redujeron hasta niveles de casi cero en la Hora 18. Sin embargo, estas cantidades aumentaron para el Grupo IX, indicando artículo de prueba acumulado en el bazo el Día 7. Hubo absorción percutánea del artículo de prueba o un metabolito del material de prueba dado que el compuesto se encontró en el hígado y páncreas. Es extraño que no hubiera material de prueba i presente en la sangre en cantidades significativas dado que la vía esperada de transporte sería el flujo de sangre. Una posible explicación podría ser la depuración rápida del artículo de prueba de la sangre mediante el hígado y páncreas. Otra posibilidad es que el artículo de prueba podrík haber sido ingerido directamente por los animales, ya sea lamiendo la dosis en sí misma o lamiendo las patas que frotaron el sitio de dosificación. 42: Análisis Western de células tratadas con Coenzima Q10 j En las últimas cinco décadas se han generado inmensos volúmenes de información que implican factores ? endógenos/exógenos que influencian procesos específicos i como ! la causa subyacente de transformaciones malignas. Literatura clínica y básica proporcionan pruebas de que los cambios en la estructura y función del ADN cumplen una función importante en el inicio y la evolución del cáncer, i definiendo el cáncer como una enfermedad genética (Wooster, í 2010; ¡ Haiman, 2010) . A principios de los años 20, Otto Warburg y otros investigadores involucrados en la caracterización de cambios fundamentales en la etiología de i la ontogénesis describieron dos observaciones importantes: (a) l'a capacidad de las células de transportar y utilizar glucosa en la generación de ATP para la producción de i en presencia de oxígeno, también conocido como Warburg y (b) alteraciones en la estructura y función mitocondrial, incluidos cambios en el transporte de i electrones que lleva a una reducción en la producción de ATP mitocondrial . En los últimos años se ha visto un resurgimiento en la investigación de la función central de la bioenergética celular en la etiología del cáncer, esto es, considerando al cáncer como una enfermedad metabólica. j Históricamente, aunque las mutaciones en los genes han sido consideradas las responsables de los cambios en la génica, existe mucha literatura que apoya la que los procesos epigenéticos cumplen una función I crítica en la influencia de la expresión génica sobre el I respaldo de la carcinogénesis . Esto está probado por la i observación de que la tasa de mutación para la mayoría de los genes es baja y no puede ser responsable de las numerosas (espectro de) mutaciones encontradas en las I I células cancerosas . La alteración epigenética se regula mediante la metilación y modificación de colas de histona, ambos! cambios unidos inherentemente al estatus de energía (nutriente) de las células ya que requieren la disponibilidad de co-factores, por ej . , requisito de acetil I CoA para la acetilación de histona (ref) . La biosíntesis de acetil CoA depende de la glucólisis y ciclo de Kreb, i uniendio directamente el estatus de energía intracelular con la regulación de expresión y actividad génicas. i I I : En células normales, la fosforilación oxidativa I mitocbndrial genera ATP suficiente para cumplir con las exigencias de energía para mantener las actividades normales y la supervivencia celular. Una consecuencia de la producción de energía mitocondrial es la I generación de especie reactiva de oxígeno (ROS) , producción aberrante que lleva al daño de la mitocondria (refs.). Está bien 'establecido que la generación de ROS crónica por la mitocondria lleva a la acumulación cumulativa de mutaciones genéticas, un fenómeno que ha estado implicado en la etiología de la carcinogénesis . Se ha sugerido que las células cancerosas reducen la respiración mitocondrial para minimizar la generación de ROS y cambian a glucolisis para mantener la producción de energía. Por lo tanto, un cambio i progresivo de la generación de energía de fosforilación i oxidativa a glucolisis sería esencial para que una célula mantenga la producción de energía para mantener las I funciones fisiológicas y podría estar asociada a la evolución de un fenotipo celular normal al de una célula I cancerosa. El cambio progresivo en el perfil de energía I celular (bioenergético) de manera conjunta con la (mutaciones) en la estructura genética el metaboloma celular. Los cambios en el perfil metabolímico de células completas como consecuencia de la transición de fosforilación mitocondrial a glucolisis corresponden a un perfil metabolómico inducido i por bioenergética anormal y es la causa subyacente que i respalda la carcinogénesis. La intervención dirigida usando I una molécula endógena para provocar un cambio metabolómico I celular hacia las condiciones de un estado bioenergético celular asociado con una fosforilación oxidativa j mitocondrial normal no cancerosa, representa un criterio de valoración terapéutico en el tratamiento del cáncer.
Cóenzima QIO como una MIM que provoca un cambio Epi- Metabolómico Los datos presentados en la presente demuestran que el tratamiento de células cancerosas y normales con la coenzima QIO está asociado a cambios en la expresión de proteínas que regulan las terminales bioquímicas clave dentro de la continuidad del estrés oxidativo mitocondrial-glucólisis. La combinación de datos que describen la valoración de la expresión de proteínas mediante las tasas de transferencia Western y consumo de oxígeno, demuestra que én las células normales no existe una alteración significativa en las tasas de respiración mitocondrial y glucolítica normal después de la exposición a la coenzima QIO. Por lo tanto, los valores para la expresión de tasas de respiración mitocondrial y proteínas en líneas celulares normales, por ej . , un HDFa (fibroblasto adulto humano normal) , una HASMC (célula del músculo liso áortico humano normal), un nFib (fibroblasto normal) y HeKa (queratinocitos humanos normales) se pueden considerar representativos del estado fisiológico de referencia. Cualquier desviación en la expresión de tasas de respiración mitocondrial y proteínas en líneas celulares cancerosas por ej . , HepG2 (cáncer de hígado), PaCa-2 (cáncer pancreático) , MCF7 (cáncer de mama) , SK- EL (melahoma) y SCC-25 (carcinoma de células escamosas) , representa una alteración debido al inicio/evolución de la enfermedad, en este caso cáncer. Las pruebas experimentales proporcionan un respaldo a la hipótesis de que la i exposición de la coenzima Q10 a las células cancerosas está asocilada a la reorganización patofisiológica celular que es remiriiscente de células normales. Específicamente, los datos' proporcionados en la presente demuestran que la exposición de la coenzima Q10 en células cancerosas está asocilada al cambio en las vías glucolíticas y la fosforilación oxidativa mitocondrial responsables de la I inducción de la reorganización global de la arquitectura celular a la observada en células normales. i I I ; En células normales, los criterios de valoración del rendimiento glucolítico están unidos a la fosforilación i oxiddtiva mitocondrial (OXPHOS), esto es, generación de piruvjato a partir de glucosa mediante la vía glucolítica i para 'la entrada en el ciclo de Kreb (también conocido como ciclc| del ácido Tricarboxílico, ciclo del ácido Cítrico o I de CA) para generar equivalentes de reducción para I respaldar la OXPHOS mitocondrial para la producción de ATP. Por ¡lo tanto, en células normales la expresión y la orientación funcional de los productos génicos implicados en la glucólisis se ceban hacia la generación adecuada del piruvato y su entrada en el ciclo de Kreb. Esta expresión y I función desreguladas de proteínas clave que participan en las vías de la glucólisis y el ciclo de Kreb en células i cance'rosas dan como resultado una glucólisis mejorada con una reducción significativa en la función mitocondrial . La exposición de las células cancerosas a la coenzima Q10, una molécula endógena que influencia selectivamente la cadena i respiratoria mitocondrial, altera (normaliza) la expresión I de proteínas de las vías de la glucólisis y el ciclo de Kreb Ipara facilitar un cambio bioenergético de manera tal I que la producción de energía (esto es, generación de ATP) i se restituye en la mitocondria.
EXPERIMENTAL Experimento de transferencia western 1 i ! Las células usadas para el experimento fueron células i HDFa Iy MCF-7 que se trataron o no con la coenzima Q10 en dos ^concentraciones diferentes, 50 µ? y 100 µ?, y se extra1jeron luego de 24 horas de tratamiento. Los sedimentos i i de células completas se resuspendieron de a uno en 1 mL de I amortiguador C7 y se transfirieron a tubos de 15 mL I etiquetados. Las muestras luego se destruyeron por i ultrasonido en la cámara fría en hielo usando 6 pulsos de j ultrasonido ajustado a #14. Las muestras se centrifugaron durante un tiempo corto hasta 2500 g luego de la destrucción por ultrasonido y las muestras se transfirieron i a tubOs de 2 mL. El pH de cada muestra se verificó (el pH ser 9.0) usando la espuma restante en los tubos de de 50 mL. i La alquilación y reducción de muestras se realizaron para cada muestra agregando 10 ul de acrilamida 1M, 25 ul de tributifosfeno e incubación durante 90 min con mezcla intermitente. Luego de la incubación, se agregaron 10 ul de DTT 1M y los tubos se centrifugaron a 20,000 g a 20 grados durante 10 minutos y el sobrenadante se transfirió a unidades de filtro centrifugo etiquetadas Amicon Ultra con un corte de 10 k (catálogo Millipore No. UFC 801024) . Las muestras se centrifugaron durante 15 minutos a 2500 g en 2 intervalos. La conductividad se midió para determinar solo Chaps asi como las muestras usando un medidor de conductividad. Si la conductividad de las muestras es alta, entonces se agrega 1 mi de chaps para intercambio de amortiguador y se centrifugan nuevamente a 2500 g hasta que el volumen baja hasta 250 ul . Cuando la conductividad es 200 o menos las muestras se centrifugan en intervalos de 5 minutos a 2500 g hasta que el volumen del sobrenadante se encuentra entre 150 y 100 ul . Los sobrenadantes de muestra se transfieren a los tubos Eppendorf y se realiza el ensayo Bradford usando BSA como estándar.
Las muestras se procesaron según protocolos estándar tal tomo se describió anteriormente y la cantidad de proteina en cada una de las muestras se determinó mediante el énsayo Bradford. Los volúmenes de las muestras equivalentes a 10 ug de proteina se prepararon tal como se muestra a continuación con tinte de carga Lamelli (LDS) y i agua ^MilliQ, se procesaron en un gel de 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE (Invitrogen, catálogo No. NP0323Box) . i 1 Los geles se procesaron durante 50 minutos usando amortiguador MOPS IX usando un sistema NOVEX Xcell Surelock a 200 V. Los geles luego se transfirieron durante 1 hora usando un protocolo de transferencia húmedo NOVEX Xcell Surelock a 30 V. Las bandas se tiñeron con Simply Blue Safestain de Invitrogen (LC6065) .
Niveles de IDHl y ATP-Citrato Liasa en maestras de HDFa y MCF-7.
Luego de la transferencia, cada una de las bandas se colocó entre 2 papeles de filtro Whatman y se secó durante 15-20 minutos. Luego de secarse, las bandas se etiquetaron con la fecha, el tipo de muestra y banda 1 o banda 2 usando un lápiz HB. Los marcadores de peso molecular se esbozaron con el lápiz y con lineas simples para el azul y dobles para los marcadores de color. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una). La banda 1 se sondó con el anticuerpo primario para IDHl (Cell Signaling No. 3997) en TBST ¡con 5% de BSA (a diluciones 1:1000) y la banda 2 con el anticuerpo policlonal de conejo para ATP-Citrato Liasa en 5% de BSA (Cell Signaling No. 4332) a dilución 1:1000 por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación. i Luego' de la incubación durante la noche con anticuerpos I primarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T ( IX- 15'; ¡ 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo I secun'dario (anticonejo; dilución 1:10, 000) durante 1 h en I un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego: de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 mins y luegoj cada banda se analizó con un escáner 5100 Fuji Láser de resolución, 16 bit, láser verde, a 400V y a 500 Niveles de actina en maestras de HDFa y MCF-7. j Las bandas anteriores se depuraron por incubación i durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos j lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las 2 bandas se analizaron en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. Las bandas luego se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua j durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo para Actina en 5% de BSA (catálogo Sigma No. A5316, clon AC-74) a diluciones 1:5000 durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Luego de 1 hora de incubación con anticuerpo primario para Actina, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) ¡y se sondaron con el anticuerpo secundario (antiratón; i dilución 1:10,000) durante 1 h en el agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con T|BS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400V y a 500 V.
Experimento de transferencia western 2 Las células usadas para este experimento fueron células HSKMEL28, SCC-25, nFib y Heka que se trataron o no con la coenzima Q10 en dos concentraciones diferentes, 50 µ? o ;100 µ?, y se cultivaron luego de 3, 6 y/o 24 horas de tratamiento. Las muestras se procesaron y se ejecutaron a i 4—12%| de gel Bis-Tris Novex NuPAGE tal como se describió anteriormente. Los geles se ejecutaron, transfirieron y tiñerpn esencialmente tal como se describió anteriormente. de IDHl para las 4 líneas celulares Luego de la transferencia, la banda se secó durante 15-20 minutos, se activó con metanol durante 5 segundos, se lavó con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. La banda se bloqueó durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavó 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) . Esta luego se sondeó con el anticuerpo primario para IDHl (Cell Signaling No. 3997) en TBST con 5% de BSA (a diluciones 1:1000) por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación. Luego de la incubación durante la noche con anticuerpo primario para IDHl, la banda se lavó 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondó con el anticuerpo i secundario (anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, la banda se lavó 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y luego se incubó con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se analizó con escáner i 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400V y a 500 V.
Niveles de ATP-Citrato Liasa en 4 líneas celulares diferentes ; La banda de isocitrato deshidrogenase se depuró por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador De depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. La banda se analizó en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. La banda se activó con metanol durante 5 segundos, se lavó con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. La banda se bloqufeó durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavó 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) . Esta luego se sondeó con el anticuerpo policlonal de conejo para ATP-citrato liasa en 5% de BSA (Cell Signaling No. 4332) a dilución 1:1000 i durante la noche a 4 grados C con agitación. Luego de la incubación durante la noche con anticuerpo primario para ATP-citrato liasa, la membrana se lavó 3 veces TBS-T (IX- i 15'; ; 2X 5' cada una) y se sondó con el anticuerpo secundario (anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, la banda! se lavó 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) y luego se incubó con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400V y a 500 V.
I Niveles de actina en 4 líneas celulares diferentes La banda de ATP-citrato liasa se depuró por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' uno. La banda se analizó en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. La banda se activó con metanol durante 5 segundos, se lavó con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. La banda se i bloqueó durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavó 3 veces con TBS-T; (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondó con el anticuerpo para en 5% de BSA (catálogo Sigma No. A5316, clon AC-74) a diluciones 1:5000 durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Luego de 1 hora de incubación con anticuerpo primario para Actina, las membranas se lavaron 3 veces! TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (antiratón; dilución 1:10,000) durante 1 h en el agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (IX-15'; 2X 5 ' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde; a 400V y a 500 V.
Experimento de transferencia western 3 Las células usadas en el experimento fueron células HepG2 , HAS C y PACA2 que se trataron o no con la coenzima Q10 en dos concentraciones diferentes (50 µ? y 100 µ?) y se extrajeron luego de 48 horas de tratamiento. En este experimento (experimento de transferencia western 3) y en todos! los experimentos descritos a continuación en este I Ejemplo (esto es, experimentos de transferencia western 4 a 9), las células se trataron adicionalmente ya sea con 5 nM de glucosa ("5G") o 22 nM de glucosa ("22G"). Las muestras derivadas de las células se procesaron y se ejecutaron en i 4-12% de gel Bis-Tris Novex NuPAGE tal como se describió anteriormente. Los geles se ejecutaron, transfirieron y tiñerón esencialmente tal como se describió anteriormente.
I Niveles de IDH1, ATP-Citrato Liasa y Actina en HASMC en comparación con PACA2 y HepG2. j Los niveles de IDH1, ATP-citrato liasa y actina se determinaron sondando las bandas con anticuerpos primarios para IDHl, ATP-citrato liasa y actina, esencialmente tal como se describió anteriormente.
Experimento de transferencia western 4 Las células usadas para este experimento fueron células HepG2 que se trataron o no con la coenzima Q10 en dos concentraciones diferentes, 50 µ? o 100 µ?, y se cultivaron luego de 24 o 48 horas de tratamiento. Las muestras se procesaron y se llevaron a cabo en 4-12% de gel Bis-Tris Novex NuPAGE tal como se describió anteriormente. Los geles se ejecutaron, transfirieron y tiñeron esencialmente tal como se describió anteriormente. i Niveles de lactato deshidrogenasa en células HepG2 Luego de cada transferencia la banda se secó durante j 15-20! minutos, se activó con metanol durante 5 segundos, se lavó con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondaron con anticuerpo primario par lactato deshidrogenasa (abcam ab2101; policlonal) en 5% de BSA (a diluciones 1:1000) durante la noche a 4 grados C con agitación. Luego de la incubación durante la noche con anticuerpo primario para lactato deshidrogenasa, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (conejo anticabra; dilución 1:10,000) durante 1 h a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y luego I i se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400V y a 500 V.
Niveles de forma de piruvato cinasa muscular (PKM2) en células HepG2.
Las bandas de lactato deshidrogenasa se depuraron incubando durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C, y seguido de dos lavados de 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada ¡una. Las 2 bandas se analizaron en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo policlonal de conejo para piruvato cinasa M2 en¡ 5% de BSA (NOVUS BIOLOGICALS catálogo No. H00005315- D01P) a diluciones 1:500 durante 1 hora a 4 grados C con agitación. Luego de la incubación durante la noche con anticuerpo primario para piruvato cinasa M2, las membranas se lavaron 3 veces TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5" cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, bit, láser verde, a 400V y a 500 V.
Niveles de pixruvato deshidrogenasa beta en células HepG2 i Las bandas de piruvato cinasa se depuraron incubando durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C, y seguido de dos lavados de 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada una. Las 2 ban'das se analizaron en un escáner láser para verificar I si la depuración estaba completa. Luego de asegurarse de que la depuración del anticuerpo y el reactivo ECF hubieran funcionado, las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST i I durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo para piruvato deshidrogenase en 5% de BSA (ABNOVA catálogo No. H00005162-M03) a diluciones 1:500 durante la noche a 4 grados C con agitación. Luego de la incubación durante la noche con anticuerpo primario para piruvato deshidrogenasa, las membrjanas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) ;y se sondaron con el anticuerpo secundario (antiratón; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces i con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, ?6 bit, láser verde, a 400V y a 500 V.
I ! I Niveles de actina en células HepG2 Las bandas de piruvato deshidrogenasa se depuraron y luego, se volvieron a sondear para actina, esencialmente tal como describió anteriormente.
Experimento de transferencia western 5 ¡ Las células usadas para el experimento fueron células MIAPACA2 (PACA2) que se trataron o no con la coenzima Q10 en dos concentraciones diferentes, 50 µ? o 100 µ?, y se extrajeron luego de 24 o 48 horas de tratamiento. Las muestras de PACA2 se procesaron y los geles se llevaron a cabo, ! transfirieron, tiñeron y analizaron esencialmente como se describió anteriormente. í I i Niveles de lactato deshidrogenasa (LDH) y piruvato deshidrogenase [PDH) en células PaCa2 j Los niveles de LDH y PDH se determinaron sondeando las bandas sucesivamente con anticuerpos primarios para LDH y PDH, esencialmente como se describió anteriormente. de Caspasa 3 en células PaCa2 Las bandas se depuraron por incubación durante 30 i minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con i 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las 2 bandas se analizaron en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. Las bandas se activaron con metanbl durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 i minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T I (1X-151; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo para caspasa 3 en 5% de BSA (Santacruz Biotechnology No. sc7272) a diluciones 1:200 durante la noche a 4 grados C con agitación. Luego de la incubación durante la noche con anticuerpo primario para caspasa 3, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (antiratón; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400V y a 500 V. i Experimento de transferencia western 6 Las células que se usaron para este experimento de transferencia Western fueron PC-3, HepG2, MCF-7, HDFa y PACA2 que se trataron o no con la formulación de la coenzima Q10 IV y se extrajeron luego de 24 horas de tratamiento. Las muestras se procesaron y los geles se ejecutaron, transfirieron, tiñeron y analizaron esencialmente como se describió anteriormente. i Niveles de Capasa 3 y Actina en diferentes tipos celulares I Los niveles de Caspasa 3 y actina se determinaron sondando las bandas sucesivamente con anticuerpos primarios para Caspasa 3 y actina, esencialmente como se describió anteriormente .
Experimento de transferencia western 7 Las células usadas para el experimento fueron células de músculo liso de la aorta humano (HAS C) que se trataron o no con la coenzima Q10 en dos concentraciones diferentes, 50 µ? o 100 µ?, y se extrajeron luego de 24 o 48 horas de tratamiento. Las muestras de HASMC se procesaron y los geles! se ejecutaron, transfirieron, tiñeron y analizaron esencialmente como se describió anteriormente.
I Protocolo experimental para actina: ' Los niveles de actina se determinaron sondando las bandas con un anticuerpo primario para actina, I esencialmente como se describió anteriormente.
Protocolo experimental para Hif lalfa, Caspasa3 y PDHB: ¡ Las bandas de Actina se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se analizaron en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a i temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T ( IX—15 ' ; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo primario para Hifl alfa, Caspasa 3 o PDHB en 5% de BSA (a diluciones 1:200) por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación. El anticuerpo primario para Hif 1 alfa (Abcam ab2185; anticonejo) fue a una dilución 1:500 en 5% de' BSA. El anticuerpo primario para caspasa 3 (Santacruz sc7272; anticonejo) fue a una dilución 1:200 en 5% de BSA. El anticuerpo primario para piruvato deshidrogenasa beta (PDHB,) (Novus Biologicals H00005162-M03; antiratón) fue a una dilución 1:500 en 5% de BSA. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (PDHB antiratón; Hifla y Caspasa 3 anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (IX-15'; 2X 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400V y a 500 V.
Protocolo experimental para PKM2, SDHB y SDHC: Las bandas anteriores se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las banda¡s se analizaron en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minut¡os y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo primario para PKM2, SDHB o SDHC en 5% de BSA en TBS-T por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave;. EL anticuerpo primario para SDHC (ABNOVA H00006391-M02; antiratón) fue a una dilución 1:500. El anticuerpo primario para SDHB fue de Abcam ab4714-200; antiratón; a una dilución 1:500. El anticuerpo primario para piruvato cinasa M2 (PKM2) fue de Novus Biologicals H00005315-DOIP; I anticonejo; a una dilución 1:500. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) y se sondaron con el I anticuerpo secundario (SDHB & C antiratón y PKM2 anticónejo, dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de i incubación, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (IX- 15'; 2X 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF i durante 5 minutos y cada banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400V y a 500 V.
Protocolo experimental para LDH y Bik: ! Las bandas anteriores se depuraron por incubación duran¡te 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se analizaron en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. Las bandas se activaron con metan;ol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minut'os y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo primario para LDH o Bik en 5% de BSA en TBS-T por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación i suave. EL anticuerpo primario para LDH fue de Abcam ab2101; anticabra; a una dilución 1:1000. El anticuerpo primario I para ;Bik fue de Cell Signaling No. 9942; anticonejo; a una dilución 1:1000. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (IX- 15'; ¡ 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (LDH anticabra; Jackson Laboratories) y Bik anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (IX-15'; 2X 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y cada banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400.V y a 500 V.
Experimento de transferencia western 9 Las células usadas fueron células HepG2 que se trataron o no con la coenzima Q10 en dos concentraciones diferentes, 50 µ o 100 µ?, y se extrajeron luego de 24 o 48 horas de tratamiento. Las muestras de HepG2 se procesaron y los geles se ejecutaron, transfirieron, tiñeron y analizaron esencialmente como se describió anteriormente .
Protocolo experimental para actina: ; Los niveles de actina se determinaron sondando las bandas con un anticuerpo primario para actina, esencialmente como se describió anteriormente.
Protocolo experimental para caspasa3 y MMP-6: Las bandas de Actina se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo primario para caspasa 3 o MMP-6 en 5% de BSA por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave. El anticuerpo primario para caspasa 3 (Abcam ab44976-100; anticonejo) fue a una dilución 1:500 en 5% de BSA. El anticuerpo primario para MMP-6 (Santacruz i scMMO;029-ZB5; antiratón) fue a una dilución 1:100 en 5% de BSA. ¡Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) 1 y se sondaron con el anticuerpo secundario (MMP-6 antiratón; Caspasa 3 anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400V y a 500 V.
Protocolo experimental para LDH: Las bandas anteriores se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con i ! i i amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandajs se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavarjon con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutios . Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactjivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego i se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) y se sondajron con el anticuerpo primario para LDH en 5% de BSA o 5% de leche por incubación durante la noche a 4 grados C con jagitación suave. El anticuerpo primario para LDH 080309bl (Abcam ab2101; anticabra) fue a una dilución 1:10ojo en 5% de BSA. El anticuerpo primario para LDH 08030|9b2 (Abcam ab2101; anticabra) fue a una dilución 1:100!0 en 5% de leche. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces con I TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondaron con el antic-uerpo secundario (Jackson Immuno Research anticabra; dilución 1:10,000; 305-055-045) durante 1 h. Luego de 1 h i de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavar|on 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada I banda se analizó con un escáner 5100 Fuji Láser a resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400V y a 500 V. i Las bandas anteriores se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortjiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se la'varon 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sonda|ron con el anticuerpo primario para Transaldolasa o Hifla, en 5% de BSA por incubación durante la noche a 4 grado's C con agitación suave. El anticuerpo primario para Transaldolasa (Abcam ab67467; antiratón) fue a una dilución 1:500,. El anticuerpo primario para THifla (Abcam ab2185; anticonejo) fue a una dilución 1:500. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (antiratón o anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; '2X 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego i cada ¡banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 y 500V. i I Protocolo experimental para IGFBP3 y P53: ¡ Las bandas anteriores se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavadps con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 j minut s. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de i reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo primario para TIGFBP3 o TP53 en 5% de BSA por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave. El anticuerpo primario para IGFBP3 (Abcam ab76001; anticonejo) fue a una dilución 1:100. El anticuerpo primario para TP53 (Sigma Aldrich AV02055; anticonejo) fue a una dilución 1:100. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavar'on 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con i anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, l!6 bit, láser verde, a 400 y 500V.
Protocolo experimental para Transaldolasa y PDHB: Las bandas anteriores se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego i se laivaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada una) y se sondáron con el anticuerpo primario para Transaldolasa o PDHB en 5% de BSA por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave. El anticuerpo primario para Transaldolasa (Santacruz sc51440; anticabra) fue a una I dilución 1:200. El anticuerpo primario para PDHB (Novus Bioldgicals H00005162-M03 ; antiratón) fue a una dilución 1:500. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-15'; 2X 5' cada ! una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (anticabra o antiratón; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1X-151; 2X 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se analizó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 y 500V.
RESULTADOS Isocitrato deshidrogenasa- 1 (IDH-1) ! La isocitrato deshidrogenasa es una de las enzimas i que es parte del ciclo de TCA que ocurre normalmente dentro de lai matriz mitocondrial . Sin embargo, la IDHl es la forma citosólica de la enzima que cataliza la descarboxilación oxidativa del isocitrato en a-cetoglutarato y que genera dióxido de carbono en un proceso de dos pasos. IDHl es la forma dependiente de NADP+ que está presente en el citosol y la peroxisoma. La IDHl está inactivada por la fosforilación de Serll3 y se expresa en muchas especies que incluyen aquellas sin un ciclo de ácido cítrico. Parecería que la IDHl funciona normalmente como un supresor tumoral que tras la inactivación contribuye a la tumorigénesis parcialmente mediante activación de la vía HIF-1 (Bayley 2010;; Reitman, 2010) . Estudios recientes han implicado una i mutación de inactivación en IDHl en la etiología del glioblasotoma (Bleeker, 2009; Bleeker, 2010) .
El tratamiento con la coenzima Q10 aumentó la expresión de IDHl en lineas celulares cancerosas que incluyen células MCF-7, SKMEL28, HepG2 y PaCa-2. Hubo un moderado aumento en la expresión de lineas celulares SCC25.
En cultivos de contraste de fibroblastos derivados humanos primarios HDFa, nFIB y las células HASMC de músculo liso de la aorta humana, no demostraron cambios significativos en el patrón de expresión de la IDHl como respuesta a la coenzima Q10. a-cetoglutarato (a-KG) es un intermediario clave; en el ciclo de TCA, sintetizado bioquímicamente a partir de isocitrato y se convierte finalmente en succinilo coA y es un MIM y cambiador epi susceptibles de ser modificados por fármacos. La creación de a-KG sirve como coyuntura crítica en el ciclo de TCA ya que puede ser usado por la célula para reponer intermediarios del ciclo, dando como ^resultado la creación de equivalentes de reducción para aumentar la fosforilación oxidativa. Por lo tanto, el aumento mediado por la coenzima Q10 en la expresión de IDHl I daría! como resultado la formación de intermediarios que pueden ser usados en el ciclo de TCA mitocondrial para aumentar la formulación oxidativa en células cancerosas. Los resultados se resumen en las tablas a continuación.
Tabla 75 IDHl en HDFa y MCF-7 Tabla 76 IDH1 en HASMC en comparación con Hep62 luego del tratamiento Tabla 77 IDH1 en HASMC en comparación con PACA2 luego del tratamiento ATP-Citrato Liasa (ACL) i j La ATP-citrato Liasa (ACL) es una enzima de I homotetrámero (~126 kd) que cataliza la formación de acteil-CoA y oxaloacetato en el citosol. Esta reacción es un primer paso muy importante en la biosintesis de ácidos grasos, colesterol y acetilcolina, asi como para la glucogénesis (Towle et ál., 1997). Los nutrientes y las hormonas regulan el nivel de expresión y el estado de fosforilación de esta enzima clave. Se ha reportado la fosforilación Ser454 de ACL mediante Akt y PKA (Berwick., DC MW et ál., 2002; Pierce MW et ál., 1982).
Los datos describen el efecto de la coenzima Q10 sobre; la ATP-citrato liasa es ese en células normales y i cancerosas. Consecuentemente se observa que en células cancerosas hay una reducción dependiente de la dosis en la expresión de enzimas ACL. En contraste, esto parecería ser una tendencia hacia la expresión aumentada de ACL en células normales. Se ha demostrado que ACL citosólico es esencial para la acetilación de histona en células durante la estimulación del factor de crecimiento y durante la diferenciación. El hecho de que ACL utiliza el citrato derivado de glucosa citosólica para generar Acetil CoA I esencial para acetilación de histona, un proceso importante en el proceso neoplásico, demuestra una función en la expresión de ACL inducida por coenzima Q10 en la influencia de la> función de células cancerosas. Acetil CoA generado a partir del citrato por ACL citosólico sirve como una fuente para ía biosintesis de nuevos lípidos y colesterol durante la división celular. Por lo tanto, los cambios inducidos por la coenzima Q10 en la expresión de ACL alteran la disponibilidad de Acetil CoA para la síntesis de lípidos y colesterol en células normales en comparación con células cancerosas. Los resultados se muestran en las tablas a I continuación .
Tabla 78 ATPCL en HDFa y MCF-7 Tabla 79 Banda de ATP-Citrato Lisasa ~kd en HASMC en comparación con HepG2 Tabla 80 Banda de ATP-Citrato Lisasa ~kd en HASMC en 1 comparación con PACA2 Tabla 81 ATP-Citrato Lisasa en HepG2 y PACA2 como % de CTR Piruváto cinasa M2 (PKM2) La piruvato cinasa es una enzima implicada en la vía glucolitica. Es la responsable de la transferencia de fosfato desde el fosfoenolpiruvato (PEP) a la adenosina difosfonato (ADP) para generar ATP y piruvato. PKM2 es una isoenzima de la piruvato cinasa glicolitica, cuya expresión se caracteriza por la función metabólica del tejido, esto es, la ísoenzima M2 se expresa en células de proliferación rápida normales con necesidades de mucha energía tales como células embriónicas y también se expresa en pocos tejidos diferenciados normales tales como células islote de pulmón o pancreáticas que requieren una alta tasa de síntesis de ácido¡ nucleico. PK 2 se expresa altamente en células tumoráles debido a su dependencia de la vía glucolítica para cumplir con requisitos energéticos celulares. La isoforma PKM2 que normalmente se dice que está restringida de forma embrional se reexpresa en células cancerosas. Las células que expresan PKM2 favorecen un fenotipo glucolítico aeróbico más fuerte (muestran un cambio en el fenotipo metabólico) con una mayor producción de lactato y menor una fosforilación oxidativa. Por lo tanto, la reducción en la expresión de PK 2 en células cancerosas cambiaría o regularía por disminución la generación de energía mediante la vía glucolítica, una estrategia que es útil en el tratamiento del cáncer. Los datos demuestran que el patrón de expresión variable de PKM2 en células cancerosas y normales y las células cancerosoas, demuestran niveles mayores de expresión en comparación con las normales. El tratamiento de células alteró el patrón de expresión por la coenzima Q10 de los niveles de banda superior e inferior de PKM2 en células normales y cancerosas (Figuras 81-85) . En las células cancerosas analizadas, se dio una reducción dependiente de la dosis en la expresión de PKM2 y no se observó ningún cambio importante en las células normales, Los resultados se muestran en las tablas a continuación.
Tabla 82 Bada superior de forma 2 de Piruvato cinasa Muscular en HepG2 Tabla 83 Bada inferior de forma 2 de Piruvato cinasa Muscular (58, KD) en HepG2 Tabla 84 Bada superior de orma 2 de Piruvato cinasa Muscular en células HASMC luego del tratamiento.
Lactato deshidrogenasa (LDH) : LDH es una enzima que cataliza la interconversión de piruvato y lactato con la interconversión simultánea de NADH y NAD+. Tiene la capacidad de convertir el piruvato en lactato (ácido láctico) a una tensión de oxigeno celular bajo para la generación de equivalentes de reducción y generación de ATP a costa de la fosforilación oxidativa mitocóndrial . Las células cancerosas típicamente demuestran que una mayor expresión de LDH mantiene el flujo glucolítico para generar ATP y equivalentes de reducción y OXPHOS mitocondriales de reducción. Por lo tanto, la reducción de la expresión de LDH en células cancerosas cambiaría el metabolismo a partir de la generación de lactato para facilitar la entrada de piruvato en el ciclo de TCA. El tratamiento con la coenzima Q10 redujo la expresión de Lactato deshidrogenasa (LDH) en cáncer con un mínimo efecto sobre células normales, respaldando una función para la coenzima Q10 en la provocación de un cambio en la bioenergía de células cancerosas para la generación de ATP a partir de fuentes de OXPHOS de glicolíticas a mitocondriales minimizando la conversión de piruvato citoplasmático en ácido láctico. Los resultados se muestran en las tablas a continuación.
Tabla 85 Lactato deshidrogenasa en HepG2 Cantidad - Volumen Volumen Tabla 86 Lactato deshidrogenasa en Hep62 como % de control de 2 Experimentos Tabla 87 Lactato deshidrogenasa en PACA La Piruvato deshidrogenasa beta (PDH-E1) es el primer componente enzimático que es parte del complejo piruvato deshijdrogenasa (PDC) que convierte piruvato en acetil CoA.
PDH-E1 requiere tiamina como cofactor para su actividad, realiza las primeras dos reacciones bioquímicas en el complejo PDC esencial para la conversión del piruvato en acetil CoA para que ingrese en el ciclo de TCA en la mitocbndria. Por lo tanto, las reducciones concomitantes en la expresión de PK 2 y LDH junto con un aumento en la expresión de PDH-E1 en células cancerosas potenciarían la tasa de entrada del piruvato hacia el aumento de OXPHOPS mitocbndrial para la generación de ATP. Los datos muestran que para la expresión de PDH-E1 en líneas celulares normales y cancerosas, las expresiones de referencia de esta enzima se reducen en células cancerosas en comparación i con células normales. El tratamiento con la coenzima Q10 está lasociado al aumento progresivo en la expresión de las proteínas PDH-E1 en células cancerosas con cambios mínimos en las células normales. Los resultados se resumen en las tablas a continuación.
! Tabla 88 Piruvato deshidrogenasa beta en HepG2 I I Tabla 90 Piruvato deshidrogenasa beta en HASMC luego del tratamiento Caspasa 3 I El control del comienzo de la apoptosis normalmente se emplea en el nivel de las caspasas iniciadoras, caspasa- 2, -9 y -8/10. En la vía extrínseca de la apoptosis, la caspasa-8, una vez activa, escinde y activa directamente i las caspasas de ejecución (tales como caspasa-3) . La caspasa-3 activa escinde y activa otras caspasas (6, 7 y 9) así como dianas pertinentes en las células (por ej . , PARP y DFF).' En estos estudios, los niveles de la proteína caspasa-3 efectora se midieron en líneas celulares cancerosas y en líneas celulares normales como respuesta a la coenzima Q10. Se debe observar que aunque el control de la apoptosis se realiza mediante las caspasas iniciadoras, una cantidad de vías de señalización interrumpen en cambio la transmisión de la señal apoptótica a través de la i inhibición directa de caspasas efectoras. Por ej . , P38 MAPK fosfofila la caspasa-3 y suprime su actividad (Alvarado-Kristénsson et ál., 2004). Resulta interesante que la activación de los fosfatos de proteina (PP2A) en el mismo estudio o proteina cinasa C delta (PKC delta) (Voss et ál., í 2005) puede contrarrestar el efecto de p38 MAPK de amplificar la activación de caspasa-3 y reforzar la transmisión de la señal apoptótica. Por lo tanto, los eventos al nivel de la activación de caspasa-3 o luego de la activación de caspasa-3 pueden determinar el destino absoluto de la célula en algunos casos.
La caspasa-3 es una proteasa cisteina-ácido aspártico que cumple una función central en la fase de ejecución de la apoptosis celular. Los niveles de caspasa 3 en las células cancerosas se aumentaron con el tratamiento con la coenzima Q10. Por el contrario, la expresión de caspasa-3 en células normales se redujo moderadamente en células normales. Los resultados se resumen en las tablas a continuación .
Tabla 91 Caspasa 3 en PACA2 Cantidad - Volumen Volumen Tabla 93 Caspasa 3 en HASMC luego del tratamiento i Succinato deshidrogenasa (SDH) La succinato deshidrogenasa, también conocida como succinato-coenzima Q reductasa es un complejo de la membrana mitocondrial interna que está involucrada tanto en TCA como en la cadena de transporte de electrones . En el TCA, este complejo cataliza la oxidación de succinato en fumarato con la reducción concomitante de ubiquinona en ubiquinol. (Baysal et ál . , Science 2000; y Tomlinson et al., 'Nature Genetics 2002). Se descubrió que las mutaciones de lineas germinales en las subunidades de SDH B, C y D inician los eventos de paraganglioma o leiomioma familiar (Baysal et ál . , Science 2000).
Los análisis de transferencia western se usaron para caracterizar la expresión de la subunidad B de SDH en preparaciones mitocondriales de células cancerosas tratadas con ¡la coenzima Q10. Los resultados sugieren que el tratamiento con la coenzima Q10 está asociado a mayores los niveles proteicos de SDH en la mitocondria de las células. Estos' resultados sugieren que uno de los mecanismos de acción de la coenzima Q10 es cambiar el metabolismo de la célula hacia el ciclo de TCA y la mitocondria aumentando los niveles de enzimas mitocondriales tales como SDHB. Los resultados se resumen en la tabla a continuación.
Tabla 94 Succinato deshidrogenasa B en NCIE0808 Mitopreps El factor inducible por hipoxia (Hif) es un factor de transcripción compuesto por subunidades alfa y beta. En la normoxia, los niveles de proteínas de Hifl alfa son muy bajos debido a su continuada degradación a través de una secuencia de eventos post traduccionales . El cambio entre i la fosforilación glucolítica y oxidativa se considera generalmente que está controlado por las actividades relativas de dos enzimas PDH y LDH que determinan el destino catabólico del piruvato. Hif controla este punto de bifurcación crucial induciendo los niveles de LDH e inhibiendo la actividad de PDH estimulando PDK. Debido a esta ¡capacidad de desviar el metabolismo del piruvato desde la miltcondria hacia el citosol, se considera que Hif es un i mediador crucial del cambio bioenergético en células cancerosas .
El tratamiento con la coenzima Q10 redujo los niveles de la proteína Hifl alfa luego en las preparaciones mitocondriales de células cancerosas. En lisados de células j completas de células normales, se observó la banda inferior de Hifl y también mostró una reducción. Los resultados se resumen en las tablas a continuación.
Tabla 95 Banda inferior de Hifl alfa en células HASMC luego del tratamiento Tabla 96 Banda superior de Hifl alfa en HepG2 luego del tratamiento Ejemplo 43 Análisis de las tasas de consumo de oxigeno (OCR) y acidi icación extracelular (ECAR) en células normales y cancerosas tratadas con CoQlO ejemplo demuestra que la exposición de las tratamiento mediante un MIM/cambiador epi de la invención-CoQlO representativo en ausencia y/o presencia de factores estresantes (por ej . , hiperglicemia, hipoxia, i ácido, láctico) se asocian a un cambio hacia la glucólisis i (biosintesis de lactato y fosforilación oxidativa mitocbndrial (tal como se mide por los valores ECAR y OCR) representativos de valores observados en una célula normal en condiciones fisiológicas normales.
' Los solicitantes han demostrado en la sección previa que él tratamiento con CoQlO en células cancerosas está asociado a cambios en la expresión de proteínas específicas que potencian la fosforilación oxidativa mitocondrial con una reducción concomitante en la glucólisis y biosintesis de lactato. Este ejemplo muestra que una medida directa de la fosforilación oxidativa mitocondrial se puede obtener midiendo las tasas de consumo de oxígeno (OCR) en líneas celulares usando el analizador SeaHorse XF, un instrumento que 'mide el oxígeno disuelto y los niveles de pH extracelulares en un modelo experimental in vitro. (SeaHorse Biosciences Inc, North Billerica, MA) .
¡ El pH del microambiente extracelular es relativamente ácido: en tumores en comparación con el pH intracelular (citoplasmático) y tejidos normales circundantes. Esta i característica de los tumores sirve para muchos fines que incluyen la capacidad de invadir la matriz extracelular (ECM)1, un atributo distintivo de metástasis tumoral que i inicija posteriormente las cascadas de señalización que modulan adicionalmente : ; · angiogénesis tumoral I · mayor activación de mecanismos de detención que controlan la renovación del ciclo celular • mecanismos inmunomoduladores que facilitan un sistema de evasión celular contra la inmunovigilancia ! · elementos de control metabólico que aumentan la dependencia del flujo glucolitico y el uso de lactato • desregulación de familias génicas apoptóticas clave; tales como Bcl-2, IAP, EndoG, AIF que sirven para aumentar la oncogenicidad .
! Mientras que no se pretende quedar limitado por I ninguna teoría particular, el pH ácido del microambiente externo en el tumor es una consecuencia del aumento en las concentraciones del ion hidrógeno extrudidas de las células tumorales debido a una mayor producción de lactato a partir de uri fenotipo glucolitico alterado.
En este experimento, el OCR y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) en líneas celulares norma'les se obtuvieron en presencia y ausencia de CoQlO para determinar los valores del punto de referencia. Se observó que en su ambiente nutritivo natural, las tasas de OCR básales en líneas celulares normales son diferentes y son normalmente una función de los roles fisiológicos de i las células en el cuerpo.
Por ejemplo, se llevó a cabo un conjunto de experimentos usando la línea celular no cancerosa HDFa, que i es una línea celular de fibroblastos dérmicos de adultos humanos. Los fibroblastos son células que sintetizan y secrJtan principalmente los componentes de matriz I extra'celular (ECM) y colágeno que forman el marco estructural (estroma) para tejidos. Además, los fibroblastos son conocidos por ser útiles como embajadores tisulares de varias funciones, tales como cicatrización e i inmunomodulación localizada. En condiciones fisiológicas i normales, se cumplen los requisitos de energía en fibroblastos normales usando una combinación de glucólisis y fosforilación oxidativa - la glucólisis proporciona los nutrijentes necesarios para la síntesis de ECM. i I I j En oposición a HDFa, la HASMC (célula del músculo liso ¡aórtico humano) se encuentra en arterias, venas, vasos tractos gastrointestinales, tracto respiratorio, vejiga urinaria y otros tejidos con capacidad de ¡someterse a acoplamiento excitación-contracción i regulado. La capacidad de los músculos lisos, tales como I céluljas HASMC para someterse a contracción requiere energía proporcionada por ATP. Estos tejidos realizan una transición desde modos de energía baja donde ATP se puede sumiriistrar desde la mitocondria a modos de energía alta (dura¡nte el e ercicio/estrés) donde se proporciona la cambiando a glucólisis para una generación de ATP De este modo, las células del músculo liso normal usar una combinación de OXPHOS mitocondrial y glucójlisis para cumplir con sus requisitos de energía en un I ambiente fisiológico normal.
Ii I en sus funciones fisiológicas es, DFFa y HASMC) se observaron en los valores de OCR en reposo medidos en estas líneas celulares usando un analizador SeaHorse XF. Las Figuras 37 y 38 ¡ a continuación describen el OCR en células HDFa y HASMC cultivadas en condiciones de glucosa fisiológicamente normales (alrededor de 4.6 mM) y glucosa alta ( . i ¡ Los valores de OCR de referencia para HDFa en I ausen'cia de cualquier tratamiento en disponibilidad de I oxígeno normal son aproximadamente 40 pmoles/min (Figura 37, anterior) en presencia de 5.5 mM de glucosa. Este valor se eljevó ligeramente cuando las células se mantuvieron a 22 mM de1 glucosa. Por el contrario, en las células HASMC, los I valorjes de OCR a 5.5 mM de glucosa son aproximadamente 90 i pmolejS/min y el valor de OCR se redujo a aproximadamente 40 I pmole:s/min estando a 22 mM de glucosa. Por lo tanto, en i condiciones hiperglucémicas , existe una respuesta diferencial entre HDFa y HASMC, lo que demuestra adicionalmente diferencias inherentes en su estructura y función fisiológicas correspondientes.
El tratamiento con CoQlO en células está asociado a cambios en OCR que representa las condiciones observadas en condiciones de glucosa normales (5 mM) . La complejidad de la respuesta fisiológica está compuesta en presencia de una tensión de oxigeno baja. De este modo, la exposición de i CoQlOj está asociada a cambios en las tasas de OCR en células normales hacia el estado fisiológico que es natural a unaj célula particular.
La Tabla 97 a continuación describe los valores de ECAR (mpH/min) en células HDFa en presencia o ausencia de CoQlO en condiciones normóxicas e hipóxicas a 5.5 mM y 22 mM de glucosa. Se puede observar que en células normales el tratamiento con CoQlO tuvo una mínima influencia en los valores de ECAR, aunque tuvo una influencia sobre OCR en estas células. En condiciones hipóxicas de alta glucosa, el tratamiento con CoQlO se asoció con la disminución de ECAR i elevado hasta un valor que se observó en condiciones normóxicas no tratadas. 97 Valores de ECAR en células HDFa en presencia y ausencia de CoQlO en condiciones normóxicas e hipóxicas a 5.5 mM y 22 mM de glucosa Normoxia Hipoxia Normoxia Hipoxia (5.5 mM) (5.5 mM) (22 mM) (22 m ) j En la Tabla 98 los valores de ECAR de referencia i medidos (mpH/min) en HASMC fueron mayores en comparación con ios de HDFa. La inducción de condiciones hipoxicas I ocasionaron un aumento en ECAR muy probablemente asociado a la acldosis inducida por hipoxia intracelular posterior a i una aumentada.
Tabla 98 Valores de ECAR en células HASMC en presencia y i ausencia de CoQlO en condiciones normoxicas e hipoxicas a I 5.5 mM y 22 mM de glucosa ! Normóxico Hipóxico Normóxico Hipóxico ¡ (5.5 mM) (5.5 mM) (22 mM) (22 mM) iSe observó que el tratamiento con CoQlO está asociado a una ¡ tendencia descendente de las tasas de ECAR en células HASMC hiperglucémicas en condiciones hipóxicas hacia un valor que se observaría en condiciones de glucosa normal normóxica. Estos datos demuestran la presencia de variables fisiológicas que son inherentes a la función fisiológica de I un tipo específico de célula, las alteraciones observadas en condiciones anormales (por ej . , hiperglucemia) se cambian a normal al tratarse con CoQlO. i 1 Por el contrario, las células cancerosas (por ej . , i MCF-7|, PaCa-2) se ceban esencialmente para su cultivo en niveles mayores de glucosa en comparación con células I normales debido a su fenotipo glucolítico para su mantenimiento en el cultivo. El tratamiento con CoQlO provocó una reducción uniforme en los valores de OCR (Figura 39 y Figura 40) .
I Los efectos de CoQlO sobre los valores de OCR en i células CF-7 y PaCa-2 fueron similares a los de las células HDFa y HASMC normales, donde la respuesta variable sugería una respuesta terapéutica con base en el perfil metabólico individual de la línea celular cancerosa.
Tabla 99 Valores de ECAR en células PaCa-2 en presencia y ausencia de CoQlO en condiciones normoxicas e hipóxicas a ¡ 5.5 mM y 22 mM de glucosa Normoxia Hipoxia Normoxia Hipoxia (17 mM) (17 mM) (22 mM) (22 mM) La Tabla 99 describe los valores de ECAR en células PaCa-2. A diferencia de las células normales, las células cancerosas se ceban fenotipicamente para usar alta glucosa para la generación de ATP (glucólisis potenciada) lo que da como resultado un mayor ECAR (Tabla 99, ECAR para normoxia no tratada 17 mM) a 21 mpH/min. El tratamiento con CoQlO produce una reducción significativa en tasas de ECAR en estas condiciones, muy probablemente asociada a una reducción en el ácido láctico generado por glucólisis. La reducción asociada en OCR en estas células probablemente se asoció a la mayor eficacia del OXPHOS mitocondrial .
Una comparación similar de los valores de OCR y ECAR (no se muestran los datos) se determinó en varias otras lineas celulares cancerosas y normales, que incluyen: Lineas celulares de HAEC (células endoteliales áo.rticas humanas normales) , MCF-7 (cáncer de mama) , HepG2 (cáncer de hígado) y PC-3 altamente metastásico (cáncer de próstata) . En todas las lineas celulares analizadas, la exposición a CoQlO en ausencia y/o presencia de factores estresantes (por ej . , hiperglucemia, hipoxia, ácido láctico) se asoció i a un ¡cambio en los valores de OCR y ECAR que representan los valores observados en células normales en condiciones fisiológicas normales. Por lo tanto, el efecto general de CoQ10¡ en el tratamiento del cáncer, incluyendo muerte celular, es un efecto corriente abajo de su influencia colectiva en resultados proteómicos, genómicos, metabolómicos junto con el cambio de la bioenergética celular de la glucolisis a OXPHOS mitocondrial.
Ejemplo 44 Moléculas básicas para la biosintesis de CoQlO Este ejemplo demuestra que determinados precursores de la biosintesis de CoQlO, tal como aquellos para la biosintesis del anillo de benzoquinona y aquellos para la biosintesis de repeticiones isoprenoides y su unión al anillo de benzoquinona ("componentes básicos") se pueden administrar individualmente o en combinación con células diana y realizar una regulación por disminución del inhibidor de apoptosis Bcl-2, y/o regulación por aumento del promotor de apoptosis Caspasa-3. Determinados precursores o combinaciones de los mismos pueden inhibir también la proliferación celular. Los datos sugieren que dichos precursores de CoQlO se pueden usar en lugar de CoQlO para lograr sustancialmente los mismos resultados que la administración de CoQlO. 1 Algunas condiciones experimentales ejemplares usadas en los experimentos se enumeran a continuación.
Se cultivaron células de melanoma Skmel-28 en DMEM/F12 complementadas con 5% de suero bovino fetal (FBS) y IX ide concentración final de antibióticos. Las células se cultivaron hasta 85% de confluencia y se trataron con componentes básicos durante 3, 6, 12 y 24 horas. Luego se sedimentaron las células y se realizó el análisis de transferencia Western.
I , Los componentes básicos incluyen L-fenilalanina, DL-fenilalanina, D-fenilalanina, L-tirosina, DL-tirosina, D-tirpsina, 4-Hidroxi-fenilpiruvato, fenilacetato, 3-metOxi-4-hidroximandelato (vanililmandelato o VMA) , ácido vanílico, 4-hidroxi-benzoato, piridoxina, pantenol, ácido mevalónico, Acetilglicina, Acetil-CoA, Farnesilo y 2,3-Dimetoxi-5-metil-p-benzoquinona . j En el análisis de transferencia Western, se I sedimentaron las células en PBS frío, se lisaron y se cuantificaron los niveles de proteína usando un ensayo de proteína BCA. El lisado de célula completa se cargó en un gel Tris-HCl con 4% de carga y 12% de ejecución. Luego se transfirieron las proteínas a un papel de nitrocelulosa y luego i se bloquearon con 5% de solución tris-amortiguada con leche durante 1 hora. Las proteínas luego se expusieron a anticuerpos primarios (Bcl-2 y Caspasa-3) durante la noche.
El papel de nitrocelulosa luego se expuso a Pico Chemilluminescent durante 5 min y se registró la expresión de proteínas. Luego de la exposición, se cuantificó la actina usando el mismo método. Usando ImageJ se cuantificaron los niveles de expresión de proteínas. Se usó un prueba t para analizar la importancia estadística.
A continuación se resumen los resultados ilustrativos de los experimentos.
¦Análisis de transferencia Western del componente básico L-Fenilalanina: Antes de proceder a la vía de síntesis para la estructura del anillo de quinona, L-Fenilalanina se convierte en tirosina. Se realizó un análisis de transferencia Western para cuantificar todo cambio en la expresión de proteínas apoptóticas en las células de melanoma. Las concentraciones analizadas fueron 5 µ?, 25 µ? y 100 µ . Los estudios iniciales agregaron L-Fenilalanina a medio DMEM/F12 que contenía una concentración de fenilalanina 0.4 M. Para los 5 µ?, 25 µ? y 100 µ? la concentración final de la L-Fenilalanina en el medio fue 0.405 M, 0.425 y 0.500 M, respectivamente. Estas concentraciones finales se analizaron en las células Skmel^28 para períodos de incubación de 3, 6, 12 y 24 horas l Las células se cultivaron hasta una confluencia del 80% antes de la adición del medio de tratamiento y se extrajeron usando un procedimiento de análisis de transferencia Western tal como se describió anteriormente.
Se observó una disminución estadísticamente significativa en Bcl-2 para los 100 µ de L-Fenilalanina después de 3 horasj y 12 horas de incubación. Para los 5 µ? de I L-Fenilalanina, se observó una disminución estadísticamente significativa en Bcl-2 después de 6 horas de incubación. Para los 25 µ de L-Fenilalanina, se observó una disminución estadísticamente significativa en Bcl-2 y un aumento estadísticamente significativo en Caspasa-3 después de 121 horas de incubación. Una disminución estadísticamente significativa en Bcl-2 indica un cambio en el potencial apoptptico y un aumento estadísticamente significativo en Caspasa-3 confirma que las células están experimentando apoptpsis. Hubo una tendencia constante para la disminución en Bcl-2 en comparación con el control aunque debido al tamaño de muestra y desviación estándar estos puntos de tiempo no fueron estadísticamente significativos en este experimento .
! •Análisis de transferencia Western del componente básico D-Fenilalanina: Se analizó D-Fenilalanina, una forma químicamente sintética de la L-Fenilalanina bioactiva, para su comparación con L-Fenilalanina. Para las tres concentraciones (5 µ?, 25 µ? y 100 µ?) de D-Fenilalanina, I hubo una reducción significativa en la expresión de Bcl-2 i después de 6 horas de incubación. Además, para los 5 µ? y 25 µ?, hubo una reducción significativa después de 3 horas de incubación. Para las concentraciones de 5 µ? y 100 µ?, se observó un aumento significativo en la expresión de Caspasa-3 después de 6 horas de incubación.
Análisis de transferencia Western del componente básico DL-Fenilalanina: También se analizó DL-Fenilalanina para su comparación con L-Fenilalanina . Nuevamente, se analizaron las concentraciones de 5 µ?, 25 µ? y 100 µ? en células Skmel-28. Los periodos de incubación fueron 3, 6, 12 yj 24 horas. Se observó un aumento estadísticamente significativo en Caspasa-3 después de 3 horas de incubación. Se observó una disminución estadísticamente i significativa en Bcl-2 después de 24 horas de incubación.
Aunque hubo una tendencia de Bcl-2 en disminución y Caspasa-3 en aumento en todas las otras concentraciones y puntos de tiempo de incubación, no fueron estadísticamente significativos en este experimento.
Análisis de transferencia Western del componente básico L-Tirosina: L-Tirosina es un componente básico para la síntesis de la estructura del anillo de quinona de CoQlO1. La prueba inicial de L-Tirosina no tuvo como resultado una concentración de proteína suficientemente alta para el análisis de transferencia Western. A partir de este i estudio se probaron concentraciones en 25 µ? para análisis de transferencia Western. El medio DMEM/F12 usado contenía una concentración de sal disódica de L-Tirosina de 0.398467 M. La concentración inicial aumentó en 500 nM, 5 µ? y 15 µ?. Se observó un aumento estadísticamente significativo en Caspasa-3 para la concentración de 500 nM despues de 12 horas de incubación. Se observó también un aumento estadísticamente significativo en Caspasa-3 para la disminución estadísticamente significativa de 5A en Bcl-2 para la concentración de 5 µ? después de 24 horas de incubación. Se observó una disminución estadísticamente significativa en Bcl-2 para las concentraciones de 500 µ? y 5 µ después de 24 horas de incubación.
! Análisis de transferencia Western del componente básico D-Tirosina: Se analizó D-Tirosina, una forma sintética de L-Tirosina, para su comparación con el efecto apoptótico de L-Tirosina en células de melanoma. Con base en los estudios iniciales con L-Tirosina, se eligieron las concentraciones por debajo de 25 µ? para el análisis de transferencia Western. Las concentraciones analizadas fueron 1 µ?, 5 µ? y 15 µ?. D-Tirosina mostró una reducción en la¡ expresión de Bcl-2 para las concentraciones de 5 µ? y 15 µ? para los períodos de tiempo de 12 y 24 horas. Caspasa-3 aumentó de manera significativa para la concentración de 5 µ para los períodos de tiempo de 3, 12 y 24. Hubo también un aumento en la expresión de Caspasa-3 para ¡1 µ? para los períodos de tiempo de 12 y 24 horas.
Además hubo un aumento en la expresión de Caspasa-3 para 5 µ? para el período de tiempo de 12 horas.
Análisis de transferencia Western del componente básico DL-Tirosina: Se analizó DL-Tirosina, una forma sintética de L-Tirosina, para su comparación con el efecto apoptótico de L-Tirosina en las células. Hay una disminución estadística en la expresión de Bcl-2 observada en lajs concentraciones de 1 µ y 15 µ después de 12 horas de incubación y para los 5 µ? después de 24 horas de incubación. Se observó también un aumento en la expresión de Caspasa-3 para los 5 µ? y 15 µ? después de 12 horas de incubación .
Análisis de transferencia Western del componente básico 4-Hidroxi-fenilpiruvato: 4-Hidroxi-fenilpiruvato se deriva de los aminoácidos Tirosina y Fenilalanina y puede i incidir en la síntesis de la estructura del anillo. Se analizaron las concentraciones de 1 µ?, 5 µ y 15 µ? para la expresión de Bcl-2 y Caspasa-3. Para las concentraciones de 5 j µ? y 15 µ? hubo una reducción significativa en la expresión de Bcl-2 después de 24 horas de incubación y un I aumento significativo en la expresión de Caspasa-3 después de 12 horas de incubación.
Análisis de transferencia Western del componente básico Fenilacetato: Fenilacetato tiene el potencial de convertirse en 4-Hidroxi-benzoato, que incide en la unión de lat cadena lateral a la estructura del anillo. Las concentraciones analizadas fueron 1 µ , 5 µ? y 15 µ?. Para fenilacetato hubo una disminución en la expresión de Bcl-2 para la concentración de 5 µ y 15 µ? después de 12 horas y 24 horas de incubación. Se observó un aumento en la expresión de Caspasa-3 para la concentración de 5 µ? y 15 µ? después de 12 horas y 24 horas de incubación. j i ! Análisis de transferencia Western del componente 3-metoxi-4-hidroximandelato (vanililmandelato o VMA) : I VMA es un componente adicional para la síntesis de la estructura del anillo de quinona de CoQlO. Las concentraciones analizadas fueron 100 nM, 250 nM, 500 nM, 1 µ?, 25 µ?, 50 µ? y 100 µ . Aunque no se observó un efecto apoptótico estadísticamente significativo en este experimento, los datos indicaron una tendencia descendente de la ¡expresión de Bcl-2. ! i ¡Análisis de transferencia Western del componente básico ácido vanílico: Vanílico es un precursor para la síntesis del anillo de quinona y se analizó en una concentración de 500 nm, 5 µ? y 15 µ?. Un anális is de transferencia Western midió la expresión de Bcl-2 y Caspasa-3. Se mostró que el ácido vanílico reduce significativamente la expresión de Bcl-2 para las concentraciones de 500 nM y 5 µ en el punto de tiempo de 24 horas de incubación. Para la concentración de 15 µ? hay una reducción en la expresión de Bcl-2 después de 3 horas I de incubación. Para las células incubadas con 15 µ? durante 24 horas hubo un aumento significativo en la expresión de Caspasa-3.
Análisis de transferencia Western del componente básico 4-Hidroxibenzoato: El ácido de 4-Hidroxibenzoato incide en la unión de la cadena lateral isoprenoide a la estrujctura del anillo. Las concentraciones analizadas fueroíi 500 nM, 1 µ y 50 µ?. Hubo una reducción significativa en la expresión de Bcl-2 para la concentración de 15 µ? después de 24 horas de incubación.
Análisis de transferencia Western del componente básico 4-Piridoxina : Piridoxina es otro precursor básico para la síntesis de la estructura de anillo de quinona de CoQlO. Las concentraciones probadas para este compuesto son 5 µ?, 25 µ? y 100 µ?. Las células se ensayaron para determinar sus niveles de Bcl-2 y Caspasa-3. Piridoxina i mostró una reducción significativa en Bcl-2 después de 24 horas' de incubación en células de melanoma.
I ¦ Análisis de transferencia Western del componente básico Pantenol: Pantenol incide en la síntesis de la estructura del anillo de quinona de CoQlO. Las concentraciones analizadas en las células de melanoma fueron 5 µ?, 25 µ? y 100 µ?. Este compuesto mostró una reducción significativa en la expresión de Bcl-2 para la concentración de 25 µ?.
! I j Análisis de transferencia Western del componente básico Mevalónico: El ácido mevalónico es uno de los componentes principales para la síntesis de CoQlO. Este compuesto se probó en las concentraciones de 500 nM, 1 µ?, 25 m y 50 µ?. No hubo reducción significativa en la expresión de Bcl-2 o un aumento en la expresión de Caspasa-3 en este experimento.
Análisis de transferencia Western del componente básico Acetilglicina : Otra vía para la síntesis de CoQlO es la síntesis de isoprenoide (cadena lateral) . La adición de Acetilglicina convierte la Coenzima A en Acetil-CoA que ingresa en la senda mevalónica para la síntesis de la síntesis de isoprenoide. Las concentraciones analizadas fueron 5 µ?, 25 µ? y 100 µ?. La prueba de Acetilglicina mostró una disminución significativa en la expresión de Bcl-2 después de 12 horas de incubación para la concentración de 5 µ? y 25 µ?. Se registró una disminución significativa en Bcl-2 para la concentración de 100 µ? en el punto de tiempo de 24 horas de incubación.
Análisis de transferencia Western del componente básico Acetil-CoA: Acetil-CoA es un precursor para la senda mevalónica para la síntesis de CoQlO. Las concentraciones analizadas fueron 500 nm, 1 µ?, 25 µ? y 50 µ?. No se observó reducción significativa en expresión de Bcl-2 o I aumento en expresión de Caspasa-3 para los puntos de tiempo y conjcentraciones probados. j ; Análisis de transferencia Western del componente básico L-Tirosina en combinación con Farnesilo : L-Tirosina es uno de los precursores para la síntesis de la estructura del anillo de quinona para CoQlO. Un experimento previo probó' la reacción de L-Tirosina en medio con L-Fenilalanina y L-Tirosina. En este estudio se examinó L-Tirosina en medio sin la adición de L-Fenilalanina y L-Tirosina. En este estudio las concentraciones finales de L-Tirosina analizadas fueron 500 n , 5 µ? y 15 µ?. Se analizó Farne!silo a una concentración de 50 µ?. No se observó I respu'esta significativa para los puntos de tiempo de 3 y 6 horas¡. i Análisis de transferencia Western del componente básico L-Fenilalanina en combinación con Farnesilo : Se examinó L-Fenilalanina, un precursor para la síntesis de la estructura del anillo de quinona, en combinación con Farnesilo en medio libre de L-Tirosina y L-Fenilalanina. Se realizó un análisis de transferencia Western para ensayar la expresión de Bcl-2 y Caspasa-3. Las concentraciones finales de L-Fenilalanina fueron: 5 µ?, 25 µ? y 100 µ?. Se agregó Farnesilo a una concentración de 50 µ . Este estudio mostró una disminución en la expresión de Bcl-2 para la mayoría de las concentraciones y combinaciones probadas tal como se describe en la tabla a continuación.
I ; Ensayo de proliferación celular de la combinación de i 4-Hidroxi-Benzoato con Benzoquinona: Este conjunto de experimentos usó un ensayo de proliferación celular para evaluar el efecto de combinar las diferentes moléculas básicas en la proliferación celular.
; El primer estudio examinó el efecto de combinar I i 4-Hidioxi-Benzoato con Benzoquinona. Las células se i incubaron durante 48 horas, luego de lo cual se realizó un conte de células para determinar las células vivas. Se comparó cada grupo de prueba con el control y cada grupo de combinación se comparó con Benzoquinona de control. Los compuestos se analizaron estadísticamente para la adición de Benzoquinona. La siguiente tabla resume los resultados i del ¡conteo de células donde la marca X indica una disminución estadística en la cantidad de células.
Hay una disminución significativa en la cantidad de células para las células incubadas con 4-Hidroxibenzoico y benzoquinona y en combinación. Para la combinación de 50 µ de 4-Hidroxibenzoato en combinación con 70 µ? de Benzoquinona hay una reducción significativa en la cantidad de células en comparación con el control de Benzoquinona.
Esto l sugiere un efecto sinergistico para esta proporción molar .
Se realizaron estudios adicionales que analizaban propqrciones molares adicionales. Para la primera prueba se analizó 4-Hidroxibenzoico en concentraciones de 500 nM, 1 µ y 50 µ?. Estas concentraciones se analizaron en combinación con 2 , 3-Dimetoxi-5-metil-p-benzoquinona (Benzo) . Las concentraciones de Benzo analizada fueron 25 µ?, 50 µ? y 100 µ?. Las células de melanoma se cultivaron de confluencia y se sembraron en placas de 6 una concentración de 40K células por pocilio.
Las délulas se trataron con CoQlO, 4-Hidroxibenzoato, Benzo i y una; combinación de 4-Hidroxibenzoato/Benzo .
Se realizó una prueba con p<0.05 como X significa una de células.
I Hay una disminución significativa en la proliferación ra el medio de tratamiento que contiene HB. combinación de HB con benzoquinona mostró una significativa en la cantidad de células en comparación con las células incubadas con las concentraciones de benzoquinona correspondientes.
! También se realizó un ensayo de proliferación celular en células de fibroblastos neonatales. Las concentraciones de HB analizadas fueron 500 nM, 5 µ? y 25 µ?. También se analizó HB en combinación con benzoquinona en concentraciones de 25 µ?, 50 µ? y 100 µ?. Las células de melanoma se sembraron en células 40k por pocilio y se trataron durante 24 horas. Las células se tripsinizaron y cuantificaron usando un contador coulter.
El análisis estadístico no mostró una reducción significativa en las células de fibroblastos. Esto indica toxicidad mínima a no toxicidad en células normales.
Ensayo de proliferación celular de la combinación de fenilacetato y Benzoquinona: Fenilacetato es un precursor para ; la síntesis de ácido 4-Hidroxibenzoico (facilita la unión de la estructura del anillo) . Se realizó un ensayo de proliferación celular para ensayar el efecto de incubar fenilacetato en combinación con CoQlO y Benzoquinona. control y 25/25 µ? de Ben X control y 25/50 µ? de Ben X control y 25/100 µ? de Ben X , control y 25/25 µ? de Q-10 X 1 control y 25/25 µ? de Q-10 X control y 25/50 µ? de Q-10 X control y 25/100 µ? de Q-10 X control y Ben 25 X ; control y Ben 50 X control y Ben 100 X 1 Los datos indican que la adición de fenilacetato en combinación con benzoquinona disminuye significativamente la proliferación celular. La combinación con CoQlO y fenilacetato disminuye significativamente la cantidad de células en comparación con la incubación con CoQlO y benzoquinona sola.
: Ensayo de proliferación celular de la combinación de 4 -Hidroxi-Benzoato con Farnesílo: Se incubó 4-Hidroxi- Benzoato en combinación con Farnesilo. A continuación se i lista1 el resumen de los resultados. Los grupos de 4-Hidroxibenzoato se compararon con el control y grupos de control de Farnesilo. La X significa una disminución estadística en la cantidad de células.
! Ensayo de proliferación celular de la combinación de I L-Fenilalanina con Benzoquinona : Se realizó un ensayo de proliferación celular para analizar la combinación de L-Fenilalanina combinada con Benzoquinona. A continuación obra ¡un resumen de los resultados de L-Fenilalanina en comparación con el control y control de Benzoquinona. La X significa una disminución estadística.
Se observa una incidencia sinergistica similar para la L- Fenilalanina en combinación con Benzoquinona .
Ensayo de proliferación celular de la combinación de L-Fenilalanina con Farnesilo: Resultados preliminares para el estudio de proliferación celular de combinación de L-Fenilalanina incubada en combinación con Farnesilo. La L-Fenilalanina se comparó con el control y grupo de control de Farnesilo. Una X significa una disminución estadística en la cantidad de células.
! Ensayo de proliferación celular de la combinación de L-Tirosina con Benzoquinona: Se incubó L-Tirosina en combinación con Benzoquinona luego de lo cual se realizó un contep de células. Los grupos se compararon con los grupos de y grupo de control de Benzoquinona.
' La adición de Benzoquinona no amplió el efecto de L-Tirpsina en la cantidad de células. j Ensayo de proliferación celular de la combinación de L-Tirosina con Benzoquinona: Este estudio examinó la combinación de L-Tirosina con Farnesilo. Los grupos se i compararon con el control y grupos de control de Farnesilo.
I La combinación de L-Tirosina y Farnesilo no parece j tener! un efecto sinergistico en la reducción de la cantidad I i de células en este experimento. i i ¡ La síntesis de la CoQlO se divide en dos partes I principales, que consisten en la síntesis de la estructura del anillo y la síntesis de la estructura de la cadena lateral. Aquí, se complementan las células oncogénicas con que son precursores para la síntesis de la cadena lateral y los componentes de la estructura del anill . Nuestros resultados enfocaron el estudio a 3 I compojnentes principales implicados en la síntesis de la estrujctura del anillo y dos compuestos que inciden en la unión1i de la estructura del anillo a la estructura de la cadeJa lateral. Los tres compuestos que mostraron una reducción significativa en Bcl-2 y un aumento en la i exprejsión de Caspasa-3 son: 1) L-Fenilalanina, 2) L-Tir¡osina y 3) 4-Hidroxifenilpiruvato . Los dos compuestos I implicados en la unión de la cadena lateral a la estructura del anillo son: 1) 4-Hidroxibenzoato y 2) Fenilacetato. inhibp significativamente la proliferación celular. Esto indica que un complemento de la estructura del anillo con i compuestos para la unión de la cadena lateral al anillo de I benzoquinona puede complementar un mecanismo de síntesis de I CoQlOj deteriorado. Esto puede ayudar también en la i estabilización de la molécula para mantener las propiedades funcionales requeridas por los procesos celulares. Fenilacetato es un precursor para la síntesis de 4-Hidroxibenzoato, cuya administración exógena en combinación con benzoquinona tiene un efecto similar en las células oncogénicas. 45 Modulación de expresión génica mediante la Coenzima Q10 en modelo celular para diabetes La coenzima Q10 es una molécula endógena con una incidencia establecida en el mantenimiento de la función mitocbndrial normal influenciando directamente la fosforilación oxidativa. Se presentan evidencias experimentales que demuestran la capacidad de la coenzima Q10 e'n la modulación de dianas intracelulares que sirven como índices clave de trastornos metabólicos, tales como diabetes, de una manera representativa de criterios de valoración terapéuticos.
Para entender cómo la coenzima Q10 regula la expresión de genes asociados con la causa o el tratamiento de diabetes, se usaron líneas celulares próximas al riñon principales inmortalizadas derivadas de riñon humano (HK-2) y cultivos principales de las células del músculo liso áortico humano (HASMC) como modelos experimentales. Las células HK-2 y HASMC se mantienen normalmente en el cultivo de 5.5 mM de glucosa, que es una concentración que corresponde a un intervalo considerado normal en la sangre humana. Sin embargo, para estimular un ambiente diabético, ambas : líneas celulares se mantuvieron posteriormente a 22 mM de; glucosa, que corresponde al intervalo observado en la sangre humana asociado con hiperglucemia crónica. Posteriormente, las células se dejaron propagar por 3 pasajes de modo que los procesos de regulación intracelular se adaptaran funcionalmente para imitar un estado diabético. La opción de linea celular se basó en la influencia fisiológica de diabetes en disfunción renal y avance a la enfermedad renal en etapa terminal (ESRD) en adición a la patofisiologia progresiva de una función cardiovascular comprometida.
I La matriz de diabetes en PCR (SABiosciences) ofrece un análisis para 84 genes simultáneamente. Los 4 tratamientos analizados en este estudio fueron: HK-2; • HK-2 H mantuvo 22 mM de glucosa; • HK2(H) +50 µ? de Coenzima Q10 y • HK2 (H) + 100 µ? de Coenzima Q10.
! Se realizó un análisis restrictivo de los datos de PCR e tiempo real de las muestras de HK-2 en las matrices de diabetes (Cat No. PAHS-023E, SABiosciences Frederick MD) para ! excluir todos los resultados donde la regulación génica no fue al menos una regulación doble con respecto a las células no tratadas normales HK-2 con un valor p menor a 0.05. Los genes que se observó que se regulaban mediante hiperglucemia crónica o mediante coenzima Q10 se listan en la Tabla 100 y sus funciones y ubicaciones subcelulares (derijvadas de Ingenuity Pathway Analysis) se listan en la Tabla! 101.
Tabla 100 Tabla 101 I ' Entre las transcripciones de ARN detectadas con niveles modulados, se identificó la molécula de adhesión i celular antigeno carcino embriónico 1 (CEACAM1) como altamente regulada por aumento en células HK2 (H) , en particular con tratamiento con 100 µ? de coenzima Q10.
CEACAM-1, también conocida como CD66a y BGP-I, es una i glucoproteína transmembrana tipo I de 115-200 KD que pertenece a la subfamilia de CEA unida a la membrana de la superfamilia de CEA. En la superficie de células, forma homo y heterodimeros no covalentes . La región extracelular contiene tres dominios similares a Ig tipo C2 y un dominio similar a Ig tipo V del extremo N-terminal. Existen varias variantes de corte y empalme que implica regiones del extremo C-terminal al segundo dominio del tipo C2 (aa 320 y más allá) . Se ha sugerido que la falta de expresión de CEACAM1 intacta en ratones promueve el síndrome metabólico asociado con la diabetes, mientras que un aumento en la expresión de CEACAM1 está asociado con una mayor internalización de insulina que sugiere un aumento en la sensibilidad a la insulina y el uso de glucosa (por ej . , movimiento de glucosa desde la sangre a las células) , mitigando de este modo la resistencia a la insulina, una característica distintiva de diabetes mellitus tipo 2.
Tal como se muestra en la Tabla 100, también se alteró la expresión del receptor de insulina (INSR) en célulás HK-2 diabéticas tratadas con coenzima Q10. Sin limitarse por la teoría, el aumento en la expresión de INSR con el tratamiento de coenzima Q10 debería potenciar la sensibilidad a la insulina (sola o en adición a la expresión de CEACAM1) con el potencial de invertir una complicación metabólica/fisiológica mayor asociada con diabetes .
Efecto de coenzima Q1Q en la expresión génica en células HK-2 usando matrices mitocondriales La expresión diferencial de genes mitocondriales en diabetes se ensayó usando las matrices mitocondriales (Cat No. PAHS 087E, SABisociences Frederick MD) . Los genes que se regularon por hiperglucemia crónica y/o tratamiento con coenzima Q10 se listan en la Tabla 102 mientras que sus funciones y ubicaciones se incluyen en la Tabla 103.
Tabla 102 Tabla 103 Hasta la fecha, no está caracterizada la incidencia de los cuatros genes mitocondriales identificados (Tabla 102) en las células HK-2 diabéticas tratadas con coenzima Q10 en diabetes.
Estudio 2: Efecto de coenzima Q10 en la expresión génica en células HAS C usando la matriz de diabetes en PCR La matriz de diabetes en PCR (SABiosciences) ofrece un análisis de 84 genes simultáneamente. Los 4 tratamientos analizados en este estudio fueron: • HASMC; |· HASMC H mantenido a 22 mM de glucosa; • HASMC (H) + 50 µ? de Coenzima Q10 y • HASMC (H) + 100 µ? de Coenzima Q10.
' Se realizó un análisis restrictivo de los datos de i PCR en tiempo real de las muestras de células HAS C en las matrices de diabetes (Cat No. PAHS-023E, SABiosciences Frederick MD) para excluir todos los resultados donde regulación génica no fue al menos una regulación de dos veces; con respecto a las células sin tratar normales HASMC con un valor p menor a 0.05. Los genes que se observó que se regulaban mediante hiperglucemia crónica o mediante coenzima Q10 se listan en la Tabla 104.
Tabla 104 En las células HASMC, el tratamiento de células hiperglucémicas con coenzima Q10 dio como resultado la expresión alterada de genes implicados en la regulación de la función vascular (AGT) , sensibilidad a la insulina (CEACAM1, INSR, SELL) y función inmune/de inflamación (IL-6> TNF, CCL5) . Sin limitarse por la teoría, se puede asociar un aumento en la expresión de INSR con una mayor i sensibilidad a la insulina en células HASMC, que es una propiedad fisiológica que seria beneficiosa en el tratamiento de diabetes, donde se ha sugerido que la IL-6, además de sus propiedades inmunoreguladoras, afecta la homeostasis y el metabolismo de la glucosa, tanto directa como directamente, mediante acción sobre las células del músculo esquelético, adipocitos, hepatocitos, células ß pancreáticas y células neuroendócrinas. Tras la activación, las células T normales expresan y secretan RANTES y ligando de quimiocina (motivo C-C) (CCL5) . CCL5 se expresa mediante adipocitos y los niveles séricos de RANTES se aumentan en la obesidad y diabetes tipo 2. Sin embargo, tal como se muestra en la Tabla 104, el tratamiento de células HASMC con la coenzima Q10 provoca una disminución significativa en la expresión de CCL5. Con base en los datos anteriores, se espera que la administración de la coenzima Q10 tenga un beneficio terapéutico en la administración de diabetes.
Efecto de coenzima Q10 en la expresión génica en células HASMC' usando matrices mitocondriales La expresión diferencial de genes mitocondriales en diabetes se ensayó usando las matrices de mitocondria (Cat No. PAHS 087E, SABisociences Frederick MD) . Los genes que se regularon mediante hiperglucemia crónica y/o tratamiento con cóenzima Q10 se muestran en la Tabla 105. i Tabla 105 El tratamiento de células HAS C hiperglucémicas con coenzima Q10 dio como resultado la expresión alterada de genes que regulan la muerte celular programada o apoptosis (BCL2L1, PMIAP1 conocido también como NOXA) , proteínas transportadoras (SLC25A1 [transportador de citrato] , SLC25A13 [intercambiador de aspartato-glutamato] , SLC25A19 [transportador de pirofosfato de tiamina] y SLC25A22 [cotransportador de glutamato-hidrógeno] ) y proteínas de transporte de matriz mitocondrial (MFN1, TIMM44 y TOMM40) . Las actividades de estos transportadores inciden de manera importante en la regulación de precursores esenciales para el ciclo de Kreb y en el mantenimiento de la fosforilación oxidativa mitocondrial. Estos resultados indican que la exposición de células HASMC diabéticas a la coenzima Q10 se asocia con cambios en la expresión de genes mitocondriales y citóplásmicos, que a su vez es coherente con la coenzima QIO lo que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento de diabetes.
Una comparación de los datos obtenidos mediante tratamiento de células HASMC y células HK-2 con la coenzima QIO o en un ambiente hiperglucémico revela que 4 genes se regularon comúnmente mediante coenzima QIO en ambas lineas celulares (por ej . , PIK3C2B y SELL en el ensayo de expresión génica y TOMM40 y TSPO en el ensayo de matriz mitocjondrial) . Estos resultados demuestran que el tratamiento de células con la coenzima QIO en un ambiente diabético está asociado con la expresión alterada de genes que se conocen por estar implicados en la causa o el tratamiento de diabetes.
EJEMPLO 46 Efectos in vivo de administración de coenzima QIO en cáncer pancreático ! Se evaluó una formulación administrada intravenosamente de coenzima QIO para tratar cáncer pancreático en un modelo animal. Las ratas con cáncer pancreático inducido se separaron de forma aleatoria en grupos y recibieron uno de los siguientes 9 tratamientos: í ! · Grupo A: control I i ¡ · Grupo B: solución salina ¡ · Grupo C: vehículo · Grupo D: 5 mg/kg de coenzima QIO · Grupo E: 10 mg/kg de coenzima Q10 · Grupo F: 25 mg/kg de coenzima Q10 · Grupo G: 50 mg/kg de coenzima Q10 i · Grupo H: 5 mg/kg de Doxorubicina ' · Grupo I : 50 mg/kg de coenzima Q10 y 5 mg/kg de Doxorubicina Después de 28 días, todos los animales de los Grupos A y B y la mayoría de los animales del Grupo C murieron. Por el contrario, la mayoría de los animales de los Grupos D, E' y F permanecieron vivos, aquellos animales que recibieron la dosis más alta de coenzima QIO permanecieron vivos por más tiempo. De hecho, todos los animales que recibieron la dosis más alta de coenzima QIO (Grupo G) permanecieron vivos los 28 días. Estos datos demuestran una curva de respuesta a la dosis general en la cual aquellos animales que recibieron dosis más altas tuvieron una tasa de supervivencia mayor.
Para evaluar la eficacia de la coenzima QIO en el tratamiento de cáncer pancreático en combinación con Doxorubicina, al Grupo H se le administró solo Doxorubicina, mientras que al Grupo I se le administró la combinación de Doxorubicina y coenzima QIO. Después de 28 días, i una cantidad significativa de los animales del Grupo H había fallecido debido a la toxicidad de Doxorubicina, mientras que aquellos animales del Grupo I presentaron una mayor tasa de supervivencia. Estos datos sugieren que, ademas de aumentar la tasa de supervivencia asociada con cáncer pancreático, la coenzima Q10 puede mitigar también los efectos colaterales tóxicos de un régimen quimioterapéutico .
Equivalentes : i ¡ Los expertos en la técnica reconocerán o podrán determinar usando solamente la experimentación de rutina, muchos equivalentes de las modalidades y los métodos específicos descritos en la presente. Se pretende que dichos equivalentes estén comprendidos en el alcance de las siguientes reivindicaciones. i

Claims (44)

  1. , REIVINDICACIONES ? 1. Un método para tratar, aliviar los síntomas, inhibir el avance o prevenir un trastorno oncológico en un mamífero; el método comprende administrar al mamífero que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende al menos un inflüenciador ambiental (influenciador amb. ) , donde el influenciador ambiental provoca de forma selectiva, en una célula cancerosa del mamífero, un cambio de energía metabólica celular de la glucólisis a la fosforilación oxidativa mitocondrial , hacia niveles observados en una célula normal del mamífero en condiciones fisiológicas normáles . j I i 2. El método de la reivindicación 1, donde el influenciador ambiental no provoca de forma sustancial, en las células no cancerosas del mamífero, el cambio de energía metabólica celular de la glucólisis a la I fosforilación oxidativa mitocondrial. 3. El método de la reivindicación 1, donde el mamífero es un humano (o un mamífero no humano) . i 4. El método de la reivindicación 1, donde el influenciador ambiental no es la coenzima Q10 o los metabolitos o análogos de esta, incluidos los análogos sin repetición de isoprenilo o con al menos una repetición. • 5. El método de la reivindicación 1, donde el trastorno oncológico responde o es sensible al tratamiento con l¡a Coenzima Q10 o los metabolitos o análogos de esta. 6. El método de la reivindicación 1, donde el 1 influenciador ambiental induce el mecanismo de muerte celular o apoptosis en la célula cancerosa. 7. El método de la reivindicación 1, donde el influenciador ambiental inhibe la angiogénesis en la célula cancerosa . i 8. El método de la reivindicación 1, donde el influenciador ambiental induce una modulación de los elementos relacionados con la inmunidad en el microambiente en célula cancerosa. 9. El método de la reivindicación 1, donde el influ Ienciador ambiental induce un cambio en el control de ciclo celular en la célula cancerosa. j 10. El método de la reivindicación 1, donde el influenciador ambiental comprende: j (a) benzoquinona o al menos una molécula que facilita la biosintesis del anillo de benzoquinona y I ¡ i (b) al menos una molécula que facilita la síntesis y/o ¡la unión de unidades isoprenoides al anillo de benzdquinona . i 11. El método de la reivindicación 10, donde dicha al I menos, una molécula que facilita la biosíntesis del anillo de bénzoquinona comprende: L-fenilalanina, DL-fenilalanina, D-fenilalanina, L-Tirosina, DL-Tirosina, D-Tirosina, 3-metoxi-4-hidroximandelato , ácido vanílico, piridoxina o pantenol . i j 12. El método de la reivindicación 10, donde dicha al menos! una molécula que facilita la síntesis y/o la unión de I unidajdes isoprenoides al anillo de benzoquinona comprende: fenil'acetato, 4-hidroxi-benzoato, ácido mevalónico, acetijlglicina, acetil-CoA o farnesilo. i ! i I 13. El método de la reivindicación 1, donde el I influjenciador ambiental comprende lo siguiente: i ! (a) uno o más de L-fenilalanina, L-Tirosina y j 4-hidroxifenilpiruvato y ¡ (b) uno o más de 4-hidroxi benzoato, fenilacetato y i benzojquinona . I í j I 14. El método de la reivindicación 1, donde el influenciador ambiental: (a) inhibe la expresión de Bcl-2 y/o promueve la expresión de caspasa-3 y/o (b) inhibe la proliferación celular. j 15. El método de la reivindicación 1, donde el inflüenciador ambiental es una molécula intracelular multidimensional (MIM) . i ' 16. El método de la reivindicación 15, donde la MIM se selecciona de: alfa cetoglutarato / ácido alfa cetog'lutárico, malato /ácido málico, succinato / ácido succ nico, glucosamina, adenosina, difosfato de adenosina, glucuronida / ácido glucurónico, ácido nicotinico, dinucleótido de ácido nicotinico, alanina / fenilalanina, piridoxina, tiamina o dinucleótido de flavin adenina. i método de la reivindicación 1, donde el ambiental es un cambiador epimetabolico. i 18. El método de la reivindicación 17, donde el cambiador epimetabolico se selecciona de: transaldolasa, transcetolasa, succinil CoA sintasa, piruvato carboxilasa o ¡19. El método de la reivindicación 1, donde la cantidad terapéuticamente eficaz de dicho al menos un influenciador ambiental regula por disminución el uso anae óbico de glucosa y regula por aumento la fosforilación oxidativa mitocondrial . I 20. El método de la reivindicación 1, donde la forma del jinfluenciador ambiental administrado al humano es diferente de la forma que se encuentra predominantemente en la circulación sistémica en humanos. 21. El método de la reivindicación 1, donde el trastorno oncológico se selecciona del grupo que consiste en: una leucemia, un linfoma, un melanoma, un carcinoma y un sa'rcoma. I ¡ 22. El método de la reivindicación 1, que comprende adici'onalmente administrar al mamífero un agente terap Iéutico o régimen de tratamiento adicionales. 23. Un método para bloquear de forma selectiva, en una ¡ célula cancerosa de un mamífero que necesita tratamiento para un trastorno oncológico, el uso anaeróbico de glucosa (glucólisis) y aumentar la fosforilación oxida¡tiva mitocondrial; el método comprende lo siguiente: administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente I eficaz de al menos un influenciador amb. para bloquear de forma selectiva el uso anaeróbico de glucosa y para aumentar la fosforilación oxidativa mitocondrial en dicha célula cancerosa del mamífero, hacia niveles observados en una célula normal del mamífero en condiciones fisiológicas normales . ; 24. El método de la reivindicación 23, que comprende adicionalmente : ¡ (1) regular por aumento la expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en los genes que se indican en las Tablas 2-4 y 6-28, con un cambio múltiplo positivo y/o (2) regular por disminución la expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en los genes que se indican en las Tablas 2-4 y 6-28, con un cambio múltiplo negativo . 25. El método de la reivindicación 23, que comprende adicionalmente modular la expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en HNF4-alfa, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-Lll, XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, cMyc, transaldolasa 1, COQ1, COQ3, COQ6, preniltransferasa, 4-hidrobenzoato, factor citosólico de neutrófilos 2, sintasa de óxido nítrico 2A, superóxido dismutasa 2, VDAC, canal Bax, ANT, Citocromo c, complejo 1, complejo II, complejo III, complejo IV, Foxo 3a, DJ-1, IDH-1, CptlC y Cam cinasa II. 26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 23-25; donde el trastorno oncológico se selecciona del i I grupo que consiste en una leucemia, un linfoma, un melanoma, un carcinoma y un sarcoma. 27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 23-25 que comprende adicionalmente un régimen de tratamiento seleccionado del grupo que consiste en cirugía, radiación, terapia hormonal, terapia con anticuerpos, terapia con factores de crecimiento, citocinas y quimi'oterapia . i i I i ¡ 28. Un método para identificar un influenciador ambiental eficaz para tratar, aliviar los síntomas, inhibir el avance o prevenir un trastorno oncológico en un mamífero; el método comprende lo siguiente: (1) obtener una muestra biológica enferma que comprende células cancerosas del trastorno oncológico y una muestra biológica normal que no comprende células cancerosas, (2) poner en contacto las muestras biológicas enfermas y normales con un influenciador ambiental candidato, i ; (3) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en las muestras biológicas enfermas y i normales, donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores listados en las Tablas 2-4 y 6-28 con un cambio múltiplo positivo y/o con un cambio múltiplo negativo, (4) comparar el nivel de expresión de uno o más marcadores en las muestras biológicas enfermas y normales, donde un influenciador ambiental eficaz se identifica como Jun influenciador ambiental candidato que aumenta el nivel' de expresión de uno o más marcadores con un cambio múltiplo positivo y/o disminuye el nivel de expresión de uno o más marcadores con un cambio múltiplo negativo en la muestra biológica enferma, pero sustancialmente no en la muestra biológica normal. j ¡29. Un método para tratar, aliviar los síntomas, inhibir el avance o prevenir un trastorno oncológico en un mamífero; el método comprende lo siguiente: (1) obtener una muestra biológica enferma que comprende células cancerosas del trastorno oncológico y una muestra biológica normal que no comprende células cancerosas, I ii (2) poner en contacto las muestras biológicas enfermas y normales con un influenciador ambiental candidato, (3) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en las muestras biológicas enfermas y normales, donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores listados en las Tablas 1-28 con I un cambio múltiplo positivo y/o con un cambio múltiplo negativo, (4) comparar el nivel de expresión de uno o más marcajdores en las muestras biológicas enfermas y normales, donde] un influenciador ambiental eficaz se identifica como un irifluenciador ambiental candidato que aumenta el nivel de expresión de uno o más marcadores con un cambio múltiplo I positivo y/o disminuye el nivel de expresión de uno o más marcadores con un cambio múltiplo negativo en la muestra biológica enferma, pero sustancialmente no en la muestra biológica normal, i (5) administrar al mamífero el influenciador I ambiental eficaz [ I j y tratar de esa forma el trastorno oncológico en el mamífero . i i i I 30. Un método para identificar un influenciador I ambiental eficaz para tratar, aliviar los síntomas, inhibir el avance o prevenir un trastorno oncológico en un mamífero; el método comprende lo siguiente: j (1) obtener una muestra biológica enferma que I comprende células cancerosas del trastorno oncológico y una muestra biológica normal que no comprende células i cancerosas, poner en contacto las muestras biológicas y normales con un influenciador ambiental , [3) determinar el nivel de glucólisis y fosforilación oxidativa mitocondrial en las muestras biológicas enfermas y normales, antes y después de entrar en contacto con el influenciador ambiental candidato, donde un influenciador ambiental candidato eficaz se identifica como el influenciador ambiental candidato que aumenta el nivel de fosforilación oxidativa mitocondrial y/o ¡disminuye el nivel de glucólisis en la muestra biológica enferma, pero sustancialmente no en la muestra i biológica normal. i j I 31. Un método para tratar, aliviar los síntomas, inhibir el avance o prevenir un trastorno oncológico en un mamífero; el método comprende lo siguiente: (1) obtener una muestra biológica enferma que comprende células cancerosas del trastorno oncológico y una muestra biológica normal que no comprende células cancerosas, poner en contacto las muestras biológicas y normales con un influenciador ambiental , i (3) determinar el nivel de glucólisis y fosforilación oxidativa mitocondrial en las muestras biológicas enfermas y normales, antes y después de entrar en contacto con el influenciador ambiental candidato, donde un influenciador ambiental eficaz se identifica como el influenciador ambiental candidato que aumenta el nivel de fosforilación oxidativa mitocondrial y/o disminuye el nivel de glucólisis i en la¡ muestra biológica enferma, pero sustancialmente no en la biológica normal y (4) administrar al mamífero el influenciador ambiental eficaz y tratar de esa forma el trastorno oncológico en el mamífero . 32. El método de la reivindicación 30 o 31, donde el nivel de glucólisis se mide como ECAR y/o donde el nivel de fosforilación oxidativa mitocondrial se mide como OCR. 33. El método de la reivindicación 23, donde el I influenciador amb. no es la coenzima Q10. 34. Un método para identificar una molécula intracelular multidimensional que comprende lo siguiente: (1) poner en contacto una célula con una molécula endógena, (2) controlar el efecto de la molécula endógena en un perfil microambiental celular y (3) identificar una molécula endógena que induce un cambió en el perfil microambiental celular, mediante lo cual se identifica una molécula intracelular multidimensional. I I 35. El método de la reivindicación 34, que comprende adicionalmente : (1) comparar los efectos de la molécula endógena sobre1 el perfil microambiental celular de una célula enferma y una célula de control normal y ' (2) identificar una molécula endógena que induce de forma1 diferencial un cambio en el perfil microambiental celular de la célula enferma en comparación con la célula de control normal. 36. El método de la reivindicación 34 o 35, donde el efecto sobre el perfil microambiental celular se controla midiendo un cambio en el nivel o la actividad de una molécula celular seleccionada del grupo que consiste en ARNm, proteína, lípido y metabolito. 37. Un método para identificar un cambiador epimetabólico que comprende lo siguiente: (1) comparar los perfiles moleculares de dos o más células o tejidos, donde las dos o más células o tejidos presentan estados de enfermedad diferenciales, (2) identificar una molécula de los perfiles moleculares para los que tiene correlación un cambio de nivel con el estado de enfermedad, (3) introducir la molécula a una célula y (4) evaluar la capacidad de la molécula de cambiar el estado metabólico de una célula, donde una molécula que puede cambiar el estado metabólico de una célula se identifica como un cambiador i epimetabólico . '38. El método de la reivindicación 37, donde el perfil molecular se selecciona del grupo que consiste en: un perfil de metabolito, un perfil de lipido, un perfil de proteina o un perfil de ARN. 39. El método de la reivindicación 38, donde la molécula no afecta de forma negativa la salud ni el crecimiento de una célula normal. 40. Un método para identificar un agente eficaz en el tratamiento de un trastorno oncológico, que comprende lo siguiente : j (1) proporcionar un influenciador ambiental candidato, i (2) determinar la capacidad del influenciador ambiental candidato de cambiar el estado metabólico de una célula y (3) determinar si el influenciador ambiental candidato . es eficaz en el tratamiento del trastorno oncológico, donde el influenciador ambiental candidato que puede cambiar el estado metabólico de la célula y es eficaz en el tratamiento del trastorno oncológico se identifica como un agenté eficaz en el tratamiento del trastorno oncológico. i ¡41. El método de la reivindicación 40, donde el i cambió en el estado metabólico de la célula se determina midiendo un cambio en uno o más de la expresión de ARNm, la expresión de proteínas, los niveles lipidíeos, los niveles de metabolitos, los niveles de moléculas bioenergéticas, la energ a celular, la función mitocondrial y la cantidad mitoejondrial . i 42. Una composición que comprende un agente identificado de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 34-41. i para tratar, aliviar los síntomas, prevenir un trastorno que responde a la CoQlOj en un mamífero; el método comprende administrar al mamífero que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende al menos' un influenciador ambiental (influenciador amb.), donde, el influenciador ambiental provoca de forma selectiva, en una célula enferma del mamífero, un cambio de i energía metabólica celular hacia niveles de glucólisis y fosforilación oxidativa mitocondrial observados en células normales del mamífero en condiciones fisiológicas normales. 44. El método de la reivindicación 43, donde el trastorno que responde a la CoQlO es un trastorno i oncológico .
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