CN101878229A - 用于治疗癌症的免疫脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于多重治疗罹患癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤所代表癌症的人患者的免疫脂质体，并涉及在所述方法中使用的组合物。本发明还涉及免疫脂质体用于在癌症疗法中治疗多药抗性的用途。

Description

用于治疗癌症的免疫脂质体
本发明属于癌症治疗领域。特别地，本发明涉及用于一线和更高线治疗罹患癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤所代表的癌症的人患者并涉及在所述方法中使用的组合物。
表皮生长因子受体(EGFR)是ErbB家族的酪氨酸激酶受体，所述酪氨酸激酶受体在许多上皮肿瘤中被异常激活。受体激活导致几种下游胞内底物的召集和磷酸化，这导致促有丝分裂信号传导和其他促进肿瘤的细胞活性。在人肿瘤中，受体过量表达与更侵入性的临床过程相关(1，2)。针对结合配体的胞外结构域的单克隆抗体和受体酪氨酸激酶的低分子量抑制剂目前处于临床开发的高级阶段。
在可获得的抗EGFR单抗当中，最充分表征的一种单抗是嵌合的人：小鼠MAb西妥昔单抗。西妥昔单抗是具有活跃的自分泌EGFR回路的培养癌细胞的生长的强力抑制剂。现在已经完成单独或者与化学疗法或放射疗法联合给予的一系列西妥昔单抗I期、II期和III期研究。发现西妥昔单抗是安全的，但是它显示一些副作用，包括在多达40-70％全部治疗患者中的痤疮样皮肤疹和2％患者中发生的过敏样或过敏反应。在4％患者中检测到针对嵌合抗体的非中和性人抗体。发现如通过抗体清除率的饱和作用所确定的最佳生物学剂量是在每周200至400mg/m2的范围内(3)。西妥昔单抗目前在许多国家被视为患有结肠直肠癌的患者和头颈肿瘤中的标准疗法的部分。
多柔比星是最广泛使用的用于治疗实体瘤和血液恶性病的抗癌药之一。它有效对抗多种癌症类型，并广泛用作单一药物或用于联合化疗方案中。除在治疗乳腺癌中的重要地位之外，多柔比星还在卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、胃癌、膀胱癌和小细胞肺癌、子宫肉瘤、急性成淋巴细胞白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和软组织及骨肉瘤中显示抗肿瘤活性。尽管多柔比星展示了优异的抗肿瘤活性谱，然而它在临床实践中的使用受到药物相关毒性、特别地骨髓抑制和心脏毒性限制(援引：″Principals and Practice of Oncology，DeVita，第6版″)。
利用多柔比星的脂质体封装来改变该药物的组织分布和药物代谢动力学并提高其治疗指数。聚乙二醇化的脂质体多柔比星(DOXYL，OrthoBiotech Products LP，Bridgewater，NJ；CAELYX，Schering Plough，Kenilworth，NJ)是多柔比星的一种新制剂。聚乙二醇化保护脂质体免遭单核吞噬细胞系统探测并增加循环时间，从而允许更多地定向递送多柔比星至肿瘤细胞。
聚乙二醇化的脂质体多柔比星已经作为单一药物在患有转移性或复发性乳腺癌的患者中显示效力，客观应答率范围是9％至33％(4，5)。与常规多柔比星相比，聚乙二醇化的脂质体多柔比星具有相似的效力谱和改善的安全性谱，伴以明显降低的心脏毒性发生率和明显更少的心脏事件，以及降低的骨髓抑制、粘膜炎、恶心、呕吐和脱发的发生率。
另一方面，聚乙二醇化的脂质体多柔比星与掌跖红斑(PPE＝手足综合征)相关，其中所述掌跖红斑是用游离多柔比星时很少或从未见到的一种毒性。
除在乳腺癌中使用外，脂质体多柔比星在治疗卡波奇氏肉瘤(6，7)和复发性卵巢癌(8)中发挥充分确立的作用，并且还成功地用于患有不同类型的淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肉瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、间皮瘤、泌尿道移行细胞癌和用在子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、小细胞及非小细胞肺癌、肝细胞癌、子宫内膜癌、肾细胞癌、头颈癌和胆管癌的患者中(在(9)中综述)。
对于临床前研究，通过使用与脂质体膜共价缀合的嵌合MAb西妥昔单抗(C225，西妥昔单抗，爱必妥，ImClone Systems公司，纽约，美国；Merck KGaA，达姆施塔特，德国)Fab’片段构建了抗EGFR免疫脂质体。设计该方法旨在通过导向受体和内化性药物载体提供最大药物递送至癌细胞，其中所述的导向受体和内化性药物载体稳定、无免疫原性、长寿命、具有延长的血液及组织驻留时间并且能够递送大的有效荷载的多样类型药物。在优化MAb片段的同时，也优化了缀合方法学。开发了一种新的胶束掺入方法，包括2步骤缀合MAb片段至预制的载药脂质体(10)。首先，将MAb片段(Fab’)共价地缀合至溶液中的衍生化PEG-磷脂酰乙醇胺(MAL-PEG-DSPE)接头，产生易于自发形成胶束的免疫缀合物。接下来，所述缀合物通过受控加热法掺入预载药物的脂质体，从而产生与PEG链的末端共价缀合并与脂质体锚接的MAb片段。
当C225的Fab’仅以中等密度(每个脂质体30个Fab’)在免疫脂质体上存在时，这些免疫脂质体在一系列过量表达EGFR或EGFRvIII的癌细胞系中显示极有效的结合和内化，如荧光显微镜法和FACS所示(11)。这些癌细胞系包括表皮样癌细胞(A431)、乳腺癌细胞(MDA-MB-468)、恶性神经胶质瘤细胞(U87)和EGFRvIII稳定转化体NR6-M细胞。相反，无关的免疫脂质体(抗-HER2)和对照脂质体(无MAb)不结合或聚积于A431、MDA-MB468、U87或NR6-M细胞中。另外，抗EGFR免疫脂质体不可检测地结合至非过量表达EGFR的细胞(乳腺癌细胞系SKBR-3或MCF-7)或聚积于其中。
在体外条件下，使用载有pH敏感探针(HPTS)的抗EGFR免疫脂质体进行免疫脂质体摄取、内化和胞内药物递送的定量研究。这种方法允许定量分析在中性pH(表面结合)与酸性pH(内吞相关)下的免疫脂质体摄取的动力学(12)。在MDA-MB-468细胞中，抗EGFR免疫脂质体在5分钟内结合，随后在15分钟处开始胞内聚积并升高直至240分钟。以饱和浓度存在时，靶向EGFR的免疫脂质体在MDA-MB-468细胞中的总摄取量是1.70fmol磷脂/细胞，这对应于13,000个脂质体/细胞的摄取量。非靶向的脂质体在MDA-MB-468细胞中的摄取量是小于300个脂质体/细胞，显示因定向递迭所致的大于43倍增加。抗EGFR免疫脂质体在非过量表达EGFR的MCF-7细胞中的摄取量是450个ILs/细胞，显示过量表达EGFR的MDA-MB468细胞中28倍更多的积累。
在体内，抗EGFR免疫脂质体(ILs)在单次静脉内给药后显示作为稳定构建体在正常成年大鼠中的极长循环，同时具有与那些立体稳定的(“隐形(stealth)”)的脂质体不可区分的药物代谢动力学(13)。另外，重复施用显示清除率不升高，这进一步证实免疫脂质体保留作为隐形脂质体特征的长循环作用和非免疫原性。在一系列肿瘤异种移植物模型(MDA-MB-468、U-87和U-87vIII)中评价了载有多种抗癌药的抗EGFR免疫脂质体(C225-ILs-dox)的潜在治疗效力(13)。
仍未显示抗EGFR免疫脂质体系统(ILs)用于临床环境中治疗人的可行性。在这方面的一个主要顾虑涉及抗EGFR免疫脂质体(例如以脂质体方式封装的多柔比星(Doxil，Caelyx))的已知毒性。这里，最明显的毒性副作用是掌跖红斑(PPE＝手足综合征)，其中可以在作为例行肿瘤学实践中标准的每隔4周短时输注形式的40-50mg/m2剂量观察到所述的掌跖红斑。类似地，抗EGFR抗体如西妥昔单抗的重大副作用是皮肤毒性，通常表现为面部和躯干的痤疮样疹。此种副作用可能是表皮以相对高的水平表达EGFR这一事实的后果。因而，临床环境中使用抗EGFR免疫脂质体的一个主要安全顾虑是借助抗EGFR抗体例如西妥昔单抗引导所述脂质体至过量表达EGFR的细胞也可能增加该药物的皮肤毒性。
另外，仍然未显示并且极其不可预测的是封装化疗药物例如多柔比星、长春瑞滨(vinorelbine)或氨甲蝶呤(methotrexate)的抗EGFR免疫脂质体(ILS)是否可以治疗性地用于已经接受、但不应答一种或多种标准疗法(一线、二线、三线等)患者群体即非应答者群体中。
多线治疗中所观察到应答缺乏的可能原因之一是癌细胞多药抗性的发展。
抗药性仍然是癌症治疗中的主要挑战。内因性或获得性抗药性在大部分癌症中频繁出现并且经常同时涉及对多种药物抵抗(多药抗性，MDR)。已经对抗药性描述了许多机制。这些机制包括：药物输出泵(如P-糖蛋白(PGP)和多药抗性蛋白(MRP))过量表达；药物摄取减少，如叶酸载体改变；药物失活，如借助谷胱甘肽介导的还原作用；靶酶过量表达，如胸苷酸合酶上调；药物靶(如拓扑异构酶II)的改变；DNA修复能力提高；发生凋亡的能力降低和其他机制(在(30)和(31)中综述)。在这些机制当中，PGP在多药抗性中的作用已经成为最深入研究的对象之一。由MDR1基因编码的PGP是ABC(ATP结合盒)转运蛋白家族的成员并且频繁地在MDR表型中过量表达。能够介导药物排出的其他膜结合型转运蛋白包括多药抗性蛋白MRP和其他相关蛋白((32)、(33)和(34))。这些蛋白质主动地转运多种杂环底物(包括细胞毒药物如蒽环类药、长春碱类、米托蒽醌、紫杉醇和其他药物)离开细胞或进入其他细胞区室((32)、(33)和(34))。
这些抗药性机制的特异性抑制剂已经广泛地用作恢复药物敏感性的手段(综述，见(35))。尽管仍在积极研究中，但抗药性特异抑制剂仍没有获得临床用途的注册。治疗成功的进展受阻于此类事项，如特异性不充分、可预测的和不可预见的毒性、不确定已知抗药性机制的真实普遍性和贡献、缺乏鉴定依赖特定机制的肿瘤的预测性测定法和抗药性机制的多样性和冗余性((35))。
因而需要提供备选策略以安全地治疗性治疗已经显现癌症的患者、特别地属于非应答者群体的患者，即不应答或不再应答常规癌症化学疗法的患者。特别地，需要提供备选策略以克服癌疗法中的内在性或获得性抗药性。
能够在本发明的范围内通过提供基于药物递送系统的治疗方法满足这种提供备选策略的需要，其中所述的药物递送系统包含靶向EGFR的免疫脂质体，所述免疫脂质体在过量表达EGFR的细胞的细胞浆中显示广泛内化(多达30,000个ILs/细胞)，但在非过量表达的细胞中不显示内化，并且当封装几种化疗药物(多柔比星、长春瑞滨和氨甲蝶呤)之任一种药物时还显示突出的细胞毒性。
现在已经在本发明的范围内惊讶地发现在临床设立的施用抗EGFR免疫脂质体、特别地包含几种化疗药物例如多柔比星、长春瑞滨或氨甲蝶呤之任一种药物的免疫脂质体至罹患癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症并且未经历过化学疗法的人患者，并且特别地施用至已经接受过，但不应答或停止应答至少一种标准疗法(一线)、特别地至少二种标准疗法(二线)、特别地至少三种标准疗法(三线)，不过尤其地不应答或停止应答全部可用的标准疗法(多线)的患者，不仅引起该疾病稳定化、特别地引起部分应答、但是尤其地引起完全应答，而且显示没有或基本上没有副作用、特别地显示没有或基本上没有掌跖红斑(PPE＝手足综合征)和/或皮肤毒性。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的包含识别并与实体瘤表面上的EGF受体抗原结合的抗体或抗体片段的免疫脂质体，用于一线至多线治疗临床设立的人患者中的癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明和如本文中先前所述的包含识别并与实体瘤表面上的EGF受体抗原结合的抗体或抗体片段的免疫脂质体，其用于二线治疗临床设立的人患者中的癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明和如本文中先前所述的包含识别并与实体瘤表面上的EGF受体抗原结合的抗体或抗体片段的免疫脂质体，其用于三线治疗临床设立的人患者中的癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明和如本文中先前所述的包含识别并与实体瘤表面上的EGF受体抗原结合的抗体或抗体片段的免疫脂质体，其用于四线治疗临床设立的人患者中的癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明和如本文中先前所述的包含识别并与实体瘤表面上的EGF受体抗原结合的抗体或抗体片段的免疫脂质体，其用于五线治疗临床设立的人患者中的癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明和如本文中先前所述的包含识别并与实体瘤表面上的EGF受体抗原结合的抗体或抗体片段的免疫脂质体，其用于六线治疗临床设立的人患者中的癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明和如本文中先前所述的包含识别并与实体瘤表面上的EGF受体抗原结合的抗体或抗体片段的免疫脂质体，其用于七线和更高线治疗临床设立的人患者中的癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明和如本文中先前所述的包含识别并与实体瘤表面上的EGF受体抗原结合的抗体或抗体片段的免疫脂质体，其用于治疗、特别地用于多线治疗罹患癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症并且未经历过化学疗法的人患者、特别地是已经接受过、但不应答至少一种标准疗法、特别地至少二种标准疗法、特别地至少三种标准疗法，但是尤其地不应答所有可使用的标准疗法的患者。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体，其用于治疗、特别地用于多线治疗具有如本文中先前所述的局部推进的或转移性肿瘤的人患者，其中所述的肿瘤仍然正在进展。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体用于治疗、特别地用于多线治疗患有癌症、特别地由如本文中先前所述的局部推进的或转移性肿瘤所代表癌症的人患者，其中脂质体封装了抗癌化合物，特别地抑制细胞性化合物，特别地封装选自以下的化合物：道诺霉素、伊达比星、米托蒽醌、丝裂霉素、顺铂和其他铂类似物、长春新碱、表柔比星、阿克拉霉素、氨甲蝶呤、依托泊苷、多柔比星、表柔比星、长春瑞滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和其他氟化嘧啶、嘌呤或核苷、尤其地吉西他滨、博来霉素、丝裂霉素、普卡霉素、放线菌素D、环磷酰胺和其衍生物、噻替派、卡芥氮、紫杉醇、多西他赛和其他紫杉烷衍生物和分离物、喜树碱、多肽、核酸、具有硫代磷酸酯核苷酸间键的核酸和具有聚酰胺核苷酸间键的核酸，但是尤其地封装选自多柔比星、表柔比星和长春瑞滨的化合物，特别地封装多柔比星。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体，其用于治疗、特别地用于多线治疗患有癌症、特别地由如本文中先前所述的局部推进的或转移性肿瘤所代表癌症的人患者，其中该患者的非应答性由多药抗性机制引起。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体，其用于治疗、特别地用于多线治疗人患者，所述的人患者患有癌症、特别地由如本文中先前所述的局部推进的或转移性肿瘤所代表的癌症并且已经显现多药抗性。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的用于治疗、特别地用于多线治疗人患者的免疫脂质体，所述人患者属于患有癌症、特别地由如本文中先前所述的局部推进的或转移性肿瘤所代表癌症的非应答者群体，特别地属于已经显现多药抗性的患者，其中所述免疫脂质体具有标准MTT测定法中所确定的在1.0μg/ml与5.0μg/ml之间、特别地0.8μg/ml与3.5μg/ml之间、特别地0.7μg/ml与2.5μg/ml之间、特别地0.6μg/ml与2.0μg/ml之间、特别地0.5μg/ml与1.5μg/ml之间、特别地0.4μg/ml与1.0μg/ml之间、特别地0.3μg/ml与0.5μg/ml之间、特别地0.2μg/ml与0.4μg/ml之间的IC50。该免疫脂质体特别地是包含多柔比星的免疫脂质体。
在本发明的一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的用于治疗、特别地用于多线治疗人患者的免疫脂质体，所述人患者属于患有癌症、特别地由如本文中先前所述的局部推进的或转移性肿瘤所代表癌症的非应答者群体，特别地属于已经显现多药抗性的患者，其中所述免疫脂质体具有比游离抗癌药的细胞毒性在3倍至5倍之间、在5倍至20倍之间、在10倍至30倍之间、在15倍至40倍之间、在20倍至50倍之间、在25倍至60倍之间、在30倍至70倍之间、在35倍至80倍之间、在40倍至90倍之间、在50倍至100倍之间更高、在80倍至150倍之间、在120倍至250倍之间更高的细胞毒性。
在本发明的一个实施方案中，提供了用于治疗、特别地用于多线治疗人患者的免疫脂质体，所述人患者患有癌症、特别地由如本文中先前所述的局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症，其中所述的治疗引起疾病稳定化，特别地引起部分应答，但是尤其地特别引起完全应答。
在本发明的一个实施方案中，抗EGFR免疫脂质体以10mg/m2和40mg/m2身体表面、特别地30mg/m2与50mg/m2之间、特别地40mg/m2与60mg/m2之间、特别地50mg/m2与70mg/m2之间、特别地60mg/m2与80mg/m2之间、特别地70mg/m2与90mg/m2之间、特别地75mg/m2与100mg/m2的剂量水平给予，作为短时输注每隔2至6周，特别地每隔3至5周，但是特别地每隔4周给予。短时输注意为至少10分钟、特别地至少20分钟、特别地至少30分钟、特别地至少40分钟、特别地至少60分钟、特别地至少90分钟、特别地至少120分钟、特别地至少240分钟的输注时间。
在一个实施方案中，本发明涉及如本文中先前所述的用于治疗、特别地用于多线治疗人患者的免疫脂质体，所述人患者罹患癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症，其中所述的治疗显示没有或基本上没有毒性副作用，特别地显示没有或基本上没有掌跖红斑(PPE＝手足综合征)和/或皮肤毒性。
在一个实施方案中，本发明涉及如本文中先前所述的用于治疗、特别地用于多线治疗人患者的免疫脂质体，特别地包含多柔比星化合物的免疫脂质体，所述人患者罹患癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症，其中所述的治疗在5mg/m2与20mg/m2身体表面之间、特别地10mg/m2与40mg/m2之间、特别地30mg/m2与50mg/m2之间、特别地40mg/m2与60mg/m2之间、特别地50mg/m2与70mg/m2之间、特别地60mg/m2与80mg/m2之间、特别地70mg/m2与90mg/m2之间、特别地75mg/m2与100mg/m2之间的免疫脂质体浓度上显示没有或基本上没有毒性副作用，特别地显示没有或基本上没有掌跖红斑(PPE＝手足综合征)和/或皮肤毒性。
在本发明的一个实施方案中，提供了用于治疗、特别地用于多线治疗人患者的免疫脂质体，所述人患者患有癌症、特别地由如本文中先前所述的局部推进的或转移性肿瘤所代表的癌症，其中抗体或抗体片段共价地结合至脂质体膜，特别地共价地缀合至与脂质体锚接的接头分子的末端。接头分子特别地是亲水聚合物，但尤其地是聚乙二醇。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明和如本文中所述的免疫脂质体包含针对EGF受体的结合配体的胞外结构域的单克隆抗体、特别地嵌合抗体例如嵌合MAb C225或人源化抗体例如人源化MAb EMD72000，其中提供所述的免疫脂质体用于治疗、特别地用于多线治疗患有癌症、特别地由如本文中先前所述的局部推进的或转移性肿瘤所代表癌症的人患者。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物，其中待治疗的癌症是乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胃癌、膀胱癌、子宫肉瘤、多发性骨髓瘤和软组织及骨肉瘤。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的用于治疗，特别地用于多线治疗临床设立的人患者的免疫脂质体，其中所述患者罹患选自卡波奇氏肉瘤、复发性卵巢癌、软组织肉瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、间皮瘤、泌尿道移行细胞癌、子宫内膜癌、胰腺癌、小细胞及非小细胞肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌、食管癌、结肠直肠癌、肛门癌、阴道癌、外阴癌、前列腺癌、皮肤的基底细胞癌、头颈癌和胆管癌的癌症，所述癌症特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤代表。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物用于治疗，特别地用于多线治疗临床设立的的人患者，其中所述的患者罹患选自前列腺癌、胰腺癌、肾癌、食管癌、结肠癌和直肠癌的癌症，所述癌症特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤代表。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合用于多线治疗、特别地二线、特别地三线、特别地四线治疗临床设立的的人患者，其中所述的患者罹患前列腺癌，具有在激素和/或多西他赛和/或米托蒽醌治疗下已经进展的肿瘤。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物用于多线治疗、特别地用于二线、特别地三线、特别地四线治疗临床设立的的人患者，其中所述的患者罹患胰腺癌或胆囊癌，具有在吉西他滨和/或卡培他滨和/或奥沙利铂治疗下已经进展的肿瘤。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物用于多线治疗、特别地用于二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线治疗临床设立的的人患者，其中所述的患者罹患肾癌，具有在干扰素和/或卡培他滨和/或舒尼替尼和/或索拉菲尼治疗下已经进展的肿瘤。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物用于多线治疗、特别地用于二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线治疗临床设立的的人患者，其中所述的患者罹患膀胱上皮癌，具有在顺铂或卡铂和/或吉西他滨和/或多柔比星和/或氨甲蝶呤和/或长春新碱治疗下已经进展的肿瘤。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物用于多线治疗、特别地用于二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线治疗临床设立的的人患者，其中所述的患者罹患非小细胞肺癌，具有在顺铂或卡铂和/或吉西他滨和/或长春瑞滨和/或培美曲塞和/或多西他赛和/或吉非替尼治疗下已经进展的肿瘤。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物用于多线治疗、特别地用于二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线治疗临床设立的的人患者，其中所述的患者罹患小细胞肺癌，具有在顺铂或卡铂和/或依托泊苷和/或伊立替康和/或多柔比星和/或长春新碱和/或环磷酰胺和/或托泊替康治疗下已经进展的肿瘤。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物用于多线治疗、特别地用于二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线治疗临床设立的的人患者，其中所述的患者罹患间皮瘤，具有在顺铂或卡铂和/或吉西他滨和/或培美曲塞治疗下已经进展的肿瘤。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物用于多线治疗、特别地用于二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线治疗临床设立的的人患者，其中所述的患者罹患乳腺癌，具有在顺铂或卡铂和/或多柔比星和/或长春新碱和/或环磷酰胺和/或紫杉醇和/或多西他赛和/或吉西他滨和/或长春瑞滨和/或卡培他滨和/或丝裂霉素和/或氨甲蝶呤和/或米托蒽醌和/或贝伐单抗和/或曲妥珠单抗下已经进展的肿瘤。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物用于多线治疗、特别地用于二线、特别地三线、特别地四线治疗临床设立的的人患者，其中所述的患者罹患食管癌，具有在顺铂和/或5-FU和/或多西他赛和/或西妥昔单抗治疗下已经进展的肿瘤。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物用于多线治疗、特别地用于二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线治疗临床设立的的人患者，其中所述的患者罹患在替莫唑铵和/或贝伐单抗和/或伊立替康和/或长春新碱和/或丙卡巴肼和/或CCNU和/或BCNU治疗下已经进展的脑肿瘤。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物用于多线治疗、特别地用于二线、特别地三线治疗临床设立的的人患者，其中所述的患者罹患肝细胞癌，具有在舒尼替尼和/或索拉非尼治疗下已经进展的肿瘤。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中先前所述的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物用于多线治疗、特别地用于二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线、特别地六线、特别地七线治疗临床设立的的人患者，其中所述的患者罹患结肠癌和/或直肠癌，具有在西妥昔单抗和/或贝伐单抗和/或奥沙利铂和/或伊立替康和/或卡培他滨和/或5-FU治疗下已经进展的肿瘤。
在本发明的一个实施方案中，提供了用于治疗、特别地用于多线治疗患有癌症、特别地由如本文中先前所述的局部推进的或转移性肿瘤所代表癌症的人患者的免疫脂质体，其中实现在5％与10％之间、特别地7％与15％之间、特别地9％与20％之间、特别地12％与25％之间、特别地18％与30％之间、特别地22％与35％之间、特别地28％与40％之间、特别地32％与45％之间、特别地38％与50％之间、特别地42％与55％之间、特别地48％与60％之间、特别地52％与60％之间、特别地52％与70％之间、特别地52％与75％之间、特别地58％与80％之间、特别地62％与85％之间、特别地68％与90％之间、特别地72％与95％之间并且直至100％的应答率。
在一个实施方案中，本发明涉及包含根据本发明和如本文中先前公开的免疫脂质体和可药用载体或赋形剂或稀释剂的药物组合物，其用于一线至多线治疗、特别地用于二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线、特别地六线、特别地七线和更高线治疗临床设立的人患者、特别地属于非应答者群体的人患者、特别地属于非应答者群体的已经显现多药抗性的人患者中癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症。
在一个实施方案中，本发明涉及一线至多线治疗、特别地二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线、特别地六线、特别地七线和更高线治疗临床设立的人患者、特别地属于非应答者群体的人患者、特别地属于非应答者群体的已经显现多药抗性的人患者中癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表癌症的方法，所述方法为通过施用根据本发明和如本文中先前公开的免疫脂质体或药物组合物至所述的人患者。
在一个实施方案中，本发明涉及用根据本发明和如本文中先前公开的免疫脂质体或药物组合物治疗患有癌症、特别地患有由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症并且未经历过化学疗法的人患者、特别地治疗已经接受过、但不应答至少一种标准疗法、特别地至少二种标准疗法、特别地至少三种标准疗法，但是尤其地不应答所有可使用的标准疗法的患者的方法。
特别地，本发明涉及治疗已经显现多药抗性人患者的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及使用根据本发明和如本文中先前公开的免疫脂质体或药物组合物以制备药物的方法，所述的药物用于一线至多线治疗、特别地二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线、特别地六线、特别地七线和更高线治疗临床设立的人患者中、特别地属于非应答者群体的人患者中、特别地属于非应答者群体的已经显现多药抗性的人患者中癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症。
在一个实施方案中，本发明涉及使用根据本发明和如本文中先前公开的免疫脂质体或药物组合物以制备药物的方法，其中所述药物用以治疗患有癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症并且未经历过化学疗法的人患者、特别地治疗已经接受过、但不应答至少一种标准疗法、特别地至少二种标准疗法、特别地至少三种标准疗法，但是特别地不应答所有可使用的标准疗法的患者。
特别地，本发明涉及使用根据本发明和如本文中先前公开的免疫脂质体或药物组合物以制备药物的方法，其中所述药物用以治疗已经显现多药抗性的人患者。
在一个实施方案中，提供了根据本发明和如本文中所述的包含识别并与实体瘤表面上的EGF受体抗原结合的抗体或抗体片段并且还在脂质体中封装抗肿瘤化合物的免疫脂质体或包含这种免疫脂质体的药物组合物，用于治疗已经显现多药抗性的患者或患者群体中的这种多药抗性。
在一个实施方案中，本发明涉及包含根据本发明和如本文中所述的免疫脂质体和可药用载体或赋形剂或稀释剂的用于治疗患者或患者群体中癌症、特别地用于治疗乳腺癌或结肠直肠癌或这两种癌症的药物组合物，其中所述的患者或患者群体已经显现多药抗性、特别地显现针对用一种或多种抗癌药治疗的多药抗性，其中所述抗癌药选自多西他赛、米托蒽醌、吉西他滨、卡培他滨、奥沙利铂、干扰素、舒尼替尼、索拉菲尼、顺铂或卡铂、多柔比星、氨甲蝶呤、长春新碱、长春瑞滨、培美曲塞、吉非替尼、依托泊苷、伊立替康、环磷酰胺、托泊替康、环磷酰胺、紫杉醇、丝裂霉素、贝伐单抗、曲妥珠单抗、5-FU、西妥昔单抗、替莫唑胺、贝伐单抗、丙卡巴肼、CCNU和BCNU。
在一个实施方案中，所述的多药抗性包含选自以下药物中的一种或多种抗癌药物：多西他赛、米托蒽醌、吉西他滨、卡培他滨、奥沙利铂、舒尼替尼、索拉菲尼、顺铂、5-FU、西妥昔单抗、贝伐单抗、奥沙利铂和伊立替康。
在一个实施方案中，提供了包含根据本发明和如本文中所述的免疫脂质体和可药用载体或赋形剂或稀释剂的药物组合物用于治疗、特别地用于多线治疗癌症、特别地用于治疗乳腺癌或结肠直肠癌或这两种癌症，其中所述的免疫脂质体封装了多柔比星并且还包含抗体MAb C225或抗体EMD72000或其片段，其仍显示所述抗体之一者或两者的特异结合特性。
在一个实施方案中，提供了包含根据本发明和如本文中所述的免疫脂质体和可药用载体或赋形剂或稀释剂的药物组合物用于治疗患者或患者群体中癌症、特别地用于治疗乳腺癌或结肠直肠癌或这两种癌症，其中所述的患者或患者群体已经显现多药抗性、特别地显现针对用一种或多种抗癌药治疗的多药抗性，其中所述抗癌药选自多西他赛、米托蒽醌、吉西他滨、卡培他滨、奥沙利铂、干扰素、舒尼替尼、索拉菲尼、顺铂或卡铂、多柔比星、氨甲蝶呤、长春新碱、长春瑞滨、培美曲塞、吉非替尼、依托泊苷、伊立替康、环磷酰胺、托泊替康、环磷酰胺、紫杉醇、丝裂霉素、贝伐单抗、曲妥珠单抗、5-FU、西妥昔单抗、替莫唑胺、贝伐单抗、丙卡巴肼、CCNU和BCNU，其中所述的免疫脂质体封装了多柔比星并且还包含抗体MAb C225或抗体EMD72000或其片段，其仍显示所述抗体之一者或两者的特异结合特性。
定义
术语“包含”通常以包括的意思使用，也就是说允许一种或多种特征或组分存在。
如本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数称谓，除非上下文另外清楚地说明。例如，术语“一位患者”包括多位患者。术语“一种免疫脂质体”包括多种免疫脂质体，包括其混合物。
术语“EGF受体”或“EGFR”、“ErbB1”、“HER1”是本领域认可的术语并且在本文中同义地使用并理解为指作为受体酪氨酸激酶(RTK)I类家族成员的受体蛋白，其包括EGFR(ErbB1、HER1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。作为靶抗原，EGFR是在多种人实体瘤中过量表达的轻易可及的细胞表面受体。在这个定义中也包括EGFR的突变体，特别地III类突变体，例如EGFRvIII，其在ECD内部的第2-7外显子中含有缺失，导致符合可读框地缺失编码序列的801bp和在融合接头处生成新的甘氨酸残基。
如本文中所用的术语“一线治疗”或“一线疗法”是本领域认可的术语并理解为指首次化学疗法治疗癌症，它可以与手术和/或放射疗法联合，也称初级治疗或初级疗法。
如本文中所用的术语“二线治疗”或“二线疗法”是本领域认可的术语并理解为指当初始或初级治疗(一线或初级疗法)不奏效或停止奏效时给予的化学疗法治疗。
如本文中所用的术语“三线、四线、五线等治疗”或三线、四线、五线等疗法”是本领域认可的术语并理解为指当初始治疗和任意的后续治疗(一线、二线、三线等疗法)不奏效或停止奏效时给予的化学疗法治疗。
术语“多线”治疗是通用术语并在本文中理解为指在不奏效或已经停止奏效的初始或初级治疗(一线或初级疗法)之后的任意的更高线治疗。
如本文中所用的术语“基本上无副作用”或“基本上无不利副作用”是本领域认可的术语并理解为指的轻微至中等药物相关作用或毒性，它不是剂量限制的。
如本文中所用的术语“EGFR阳性肿瘤”理解为指含有例如通过免疫组织化学试验(例如FDA批准的EGFR pharmaDx试剂盒(“DAKO”试验；DAKO Notrth America，Inc)、Zymed EGFR试剂盒或Ventana EGFR 3C6抗体)检测到的至少1％、特别地至少2％、3％、4％或5％、特别地至少10％EGFR阳性细胞的肿瘤，特别地，所述的EGFR阳性细胞过量表达EGFR抗原和/或EGFR的突变体，特别地III类突变体，例如EGFRvIII。
“药学有效量”是指施用至人或动物生物时诱导可检测的药理学和/或生理学作用的化学物质或化合物。
相应的药学有效量可以取决于待治疗的特定患者、待治疗的疾病和施用的方法。另外，药学有效量取决于所用的具体蛋白质，特别地该蛋白质是否额外地含有或不含有如所述的药物。治疗通常包括药物组合物的多次施用，通常间隔几小时、几日或几周。本发明免疫脂质体的剂量单位的药学有效量通常在5mg/m2与100mg/m2待治疗患者的身体表面之间的范围内。
“可药用”指生理上可耐受并且在施用至人时一般不产生变态反应或类似异常反应如胃不适、眩晕等的分子实体和组合物。
如本文中所用的术语“抗体”或“诸抗体”是本领域认可的术语并且理解为指与已知抗原结合的分子或分子活性片段，特别地术语“抗体”或“诸抗体”指免疫球蛋白分子并指免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异地结合抗原的结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白可以是任意型(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)或类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
“抗体”在本发明的范围内意图包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、双特异性抗体、猿猴源化抗体、人抗体和人源化抗体以及其活性片段。术语“片段”指抗体或抗体链的一部分或区段，其比完整或完全抗体或抗体链包含更少的氨基酸残基。与已知抗原结合的分子活性片段的例子包括分开的轻链和重链、Fab、Fab/c、Fv、Fab’和F(ab’)2片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物和上文所提及任意抗体和片段的表位结合片段。片段可以通过化学处理或酶处理完整或完全抗体或抗体链获得。片段也可以通过重组手段获得。示例性片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc和/或Fv片段。术语“抗原结合片段”指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其结合抗原或与完整抗体竞争(即与衍生这些片段的完整抗体竞争)抗原结合(即特异结合)。
抗体结合片段通过重组DNA技术产生或通过酶切割或化学切割完整免疫球蛋白产生。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc、Fv、单链和单链抗体。
这些活性片段可以借助许多技术从给定抗体衍生。例如，纯化的单克隆抗体可以用酶如胃蛋白酶切割，并经过HPLC凝胶过滤处理。随后可以通过膜过滤法和其他方法收集并浓缩含有Fab片段的适宜级分。关于进一步描述用于分离抗体活性片段的一般技术，见例如(14)；(15)。
“嵌合抗体”是这样的抗体，其中该抗体的一个或多个区域来自一个动物物种并且该抗体的一个或多个区域来自一个不同的动物物种。优选的嵌合抗体是包括来自灵长动物免疫球蛋白的区域的嵌合抗体。用于人临床用途的嵌合抗体一般理解为具有来自非人动物例如啮齿动物的可变区，同时恒定区来自人，相反，人源化抗体使用来自非人抗体的CDR，同时大部分或全部可变构架区来自人免疫球蛋白并且全部恒定区来自人免疫球蛋白。人嵌合抗体一般理解为具有来自啮齿动物的可变区。常见的人嵌合抗体具有人重链恒定区和人轻链恒定区，同时重链和轻链的可变区均来自啮齿动物抗体。嵌合抗体可以包括相对于人恒定区天然氨基酸序列和天然啮齿动物可变区序列的一些变化。嵌合和人源化抗体可以通过本领域熟知的方法制备，所述方法包括CDR移植方法(见，例如美国专利号5,843,708；6,180,370；5,693,762；5,585,089；5,530,101)、链改组策略(见例如美国专利号5,565,332)(16)、分子模建策略(美国专利号5,639,641)等。
“人源化抗体”指掺入至少一种人源化免疫球蛋白或抗体链或其片段、特别地至少一条人源化轻或重链的一类工程化抗体。所述人源化免疫球蛋白或抗体链或其片段，但是特别地至少一条人源化轻或重链衍生自非人来源，特别地衍生自非人抗体，一般是啮齿动物起源。一般以至少一个CDR区的形式提供对人源化抗体的所述非人贡献，所述的CDR区分散在衍生自一种(或多种)人免疫球蛋白的构架区当中。此外，可以改变构架支持残基以保留结合亲和性。
人源化抗体可以进一步包含恒定区(例如在轻链的情况下，至少一个恒定区或其部分，并且在重链的情况下，优选3个恒定区)。
获得“人源化抗体”的方法是本领域技术人员熟知的。
“人源化抗体”也可以通过能够在大动物例如兔中产生亲和力成熟的人样多克隆抗体的新基因工程方法获得(http://www.rctech.com/bioventures/-therapeutic.php)。
术语“免疫脂质体剂量”或“免疫脂质体浓度”通常指截留于脂质体中的抗癌药的浓度。
“脂质体”指由脂质、特别地形成小泡的脂质组成的球状小泡，其能够在水中自发排列成脂质双层结构，其中该脂质的疏水部分与双层膜的内部疏水区接触并且其首基部分指向该膜的外部极性表面。形成小泡的脂质一般具有两条烃链，特别地酰基链，和极性或非极性的首基。形成小泡的脂质由天然存在或合成来源的脂质(包括磷脂如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂)组成，其中所述两条烃链一般长约14-22个碳原子并且具有可变的不饱和度。其酰基链具有可变饱和度的上述脂质和磷脂可以商业地获得或根据公开的方法制备。用于本发明组合物中的其它合适脂质包括糖脂和固醇，如胆固醇及其也可以用于脂质体中的各种类似物。
也可以在脂质体中适宜地使用一般具有亲脂部分如固醇、酰基或二酰基链并且其中脂质具有总体净正电荷的阳离子脂质。该脂质的首基一般携带正电荷。示例性阳离子脂质包括1，2-二油基氧基-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP)；N-[1-(2，3-双十四烷氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)；N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)；N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)；3[N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)和二甲基双十八烷基铵(DDAB)。形成小泡的阳离子脂质也可以是中性脂质如二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，或两亲性脂质如以阳离子脂质衍生化的磷脂，如聚赖氨酸或其他聚胺脂质。
脂质体可以包括用亲水聚合物衍生化的形成小泡的脂质以形成脂质体表面上的亲水聚合物链表面层。形成小泡的脂质、特别地磷脂，如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)可以共价地接合至亲水聚合物，其在脂质体周围形成亲水聚合物链表面层。适合与形成小泡的脂质衍生化的亲水聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺(polyaspartamide)和亲水肽序列。所述聚合物可以作为均聚物或作为嵌段或随机共聚物使用。
优选的亲水聚合物链是聚乙二醇(PEG)，优选地作为具有在200-20,000道尔顿之间、更优选地在500-10,000道尔顿之间、仍更优选地在750-5000道尔顿之间分子量的PEG链。甲氧基或乙氧基封端的PEG类似物也是以多种聚合物大小例如120-20,000道尔顿商业可获得的优选亲水聚合物。
在脂质体形成时添加至脂质混合物并处于脂质聚合物缀合物形式的额外聚合物链产生从脂质体脂质双层的内表面和外表面均伸出的聚合物链。一般通过包括0.5-20摩尔百分数之间的聚合物衍生化脂质与剩余的脂质体形成组分(例如形成小泡的脂质)实现在脂质体形成时添加脂质聚合物缀合物。
已经在例如美国专利号5,395,619、在美国专利号5,013,556、在美国专利号5,631,018和在WO 98/07409中描述了制备用亲水聚合物衍生化的形成小泡的脂质。将理解的是亲水聚合物可以稳定偶联至脂质或借助不稳定键偶联，这允许包衣的脂质体在血流中循环时或应答于刺激物时脱去聚合物链表层。
“内化抗体”是与细胞表面上的受体或其他配体结合后被转运至细胞内例如转运至溶酶体或其他细胞器或转运至细胞浆内的抗体。
本发明涉及用于一线至多线治疗、特别地至二线、特别地至三线、特别地至四线、特别地至五线、特别地至六线、特别地至七线和更高线治疗临床设立的人患者中癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表癌症的免疫脂质体，其中所述的免疫脂质体包含识别并与实体瘤表面上的EGF受体抗原结合的抗体或抗体片段并且包含至少一种抗肿瘤药。
本发明的免疫脂质体组合物因而也包括特异性识别并与肿瘤衍生细胞的表面上EGF受体结合的抗体或抗体片段，包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc、Fv、单链和单链抗体。在另一个实施方案中，该抗体包含与肿瘤衍生细胞的表面上EGF受体特异性结合的至少一个结合结构域。在另一个实施方案中，该抗体是包含与肿瘤衍生细胞的表面上EGF受体特异性结合的至少一个结合结构域的单链抗体。
抗体可以通过本领域已知的共价方法接合至脂质体。为了共价地接合抗体至脂质体，将含有末端官能化聚乙二醇链的衍生化脂质掺入脂质体。在脂质体形成后，末端官能化基团可以与抗体反应用于偶联抗体至脂质体。
存在广泛类型的用于接合所选亲水性聚合物至所选脂质并活化聚合物的游离未接合末端以与所选配体反应的技术，并且特别地已经广泛研究了亲水性聚合物聚乙二醇(PEG)(18；19；20；21；22)。
通常，将PEG链官能化以含有适于例如与多种类型配体中存在的巯基、氨基和醛或酮(一般衍生自温和氧化抗体的糖部分)偶联的反应基。此类PEG末端反应基的例子包括马来酰亚胺(用于与巯基反应)、N-羟琥珀酰亚胺(NHS)或NHS碳酸酯(用于与伯胺反应)、酰肼或肼(用于与醛或酮反应)、碘乙酰基(偏好地与巯基反应)和二硫代吡啶(硫羟反应性)。通过这些方法中任意方法制备携带所截留物并承载表面结合的靶向性配体的脂质体，即靶向的治疗性脂质体。优选的制备方法是插入法，其中预制的脂质体与靶向性缀合物孵育以实现靶向性缀合物插入脂质体双层。在这种方法中，通过多种技术(如(23)中详述的那些技术)制备脂质体，并且下文将描述为支持本发明所制备的脂质体的具体例子。一般而言，脂质体是可以由简单的脂质膜水化技术形成的多层小泡(MLV)。在这种方法中，在容器中蒸发溶解于适宜有机溶剂中的上文详述类型的脂质体形成脂质的混合物以形成薄膜，该薄膜随后被含水介质覆盖。该脂质膜水化以形成MLV，通常大小在约0.1至10微米之间。脂质体可以包括用亲水聚合物衍生化的形成小泡的脂质以形成脂质体表面上的亲水聚合物链表面层。脂质-聚合物缀合物的添加是任选的，因为在插入步骤后，如下文所述，脂质体将包括脂质-聚合物-靶向性配体。在脂质体形成时添加至脂质混合物并处于脂质聚合物缀合物形式的额外聚合物链产生从脂质体脂质双层的内表面和外表面均伸出的聚合物链。一般通过包括0.5-20摩尔百分数之间的聚合物衍生化脂质与剩余的脂质体形成组分(例如形成小泡的脂质)实现在脂质体形成时添加脂质聚合物缀合物。制备聚合物衍生化脂质的示例性方法和形成聚合物包衣的脂质体的示例性方法已经在美国专利号5,013,556、5,631,018和5,395,619中描述，所述专利通过引用的方式并入本文。将理解的是亲水聚合物可以稳定偶联至脂质或借助不稳定键偶联，这允许包衣的脂质体在血流中循环时或应答于刺激物时脱去聚合物链表层。
备选地，抗体-脂质衍生物可以首先形成并随后掺入脂质体。作为例子，将抗体偶联至游离DSPE-PEG分子的马来酰亚胺基团。抗体偶联的DSPE-PEG分子随后用来形成小泡。
在形成脂质体后，掺入靶向性配体以获得靶向细胞的治疗性脂质体。通过孵育预制的脂质体与如上文所述制备的脂质-聚合物-配体缀合物来掺入靶向性配体。将预制的脂质体和缀合物在实现缀合物与脂质体缔合的条件下孵育，所述的缔合可以包括该缀合物与外部脂质体双层相互作用或缀合物插入脂质体双层。更具体地，将这两种组分在实现缀合物与脂质体以如下方式缔合的条件下孵育，使得靶向性配体从脂质体表面指向外部并因而可用于与其相关受体相互作用，将理解的是基于几种变量确定有效实现此种缔合或插入的条件，所述变量包括想要的插入速率(其中较高的孵育温度可以实现较快的插入速率)、可以安全加热配体而不影响其活性的温度和较小程度地包括脂质及脂质组合物的相变温度。还将理解的是插入过程可以因存在溶剂如两亲性溶剂(包括聚乙二醇和乙醇)或去污剂而变化。
当脂质-聚合物-配体缀合物形式的靶向性缀合物与含水溶剂混合时，该缀合物一般将形成胶束溶液。缀合物的胶束溶液与预制脂质体的悬液混合以将缀合物与脂质体孵育和缔合或将缀合物插入脂质体的脂质双层。孵育过程有效实现脂质-聚合物-抗体缀合物与脂质体的外部双层小叶缔合或插入其中以形成免疫脂质体。
在制备后，免疫脂质体优选地具有如通过例如动态光散射法在30[度]或90[度]所测量的小于约200nm、优选在约85-120nm之间并更优选在90-110nm之间的尺寸。
脂质体组合物一般用以下述摩尔比存在的脂质组分制备：约30-75百分数形成小泡的脂质、25-40百分数胆固醇、0.5-20百分数聚合物衍生化脂质和0.0001-10摩尔百分数用于抗体偶联的脂质衍生物。
一般而言，如下文所述，通过在脂质体形成之前添加治疗药物至形成小泡的脂质而将该药物掺入脂质体以截留该药物于形成的脂质体中。如果该药物是疏水的，则直接添加药物至疏水混合物。如果该药物是亲水的，则可以添加该药物至含水介质，其中所述含水介质覆盖蒸发的脂质的薄膜。
在本发明中待使用的脂质体包含抗肿瘤药。构思了用于本发明中的抗肿瘤化合物，包括但不限于植物生物碱，如长春新碱、长春碱和依托泊苷；蒽环类药抗生素包括多柔比星、表柔比星、柔红霉素；氟尿嘧啶；抗生素，包括博来霉素、丝裂霉素、光神霉素、放线菌素D；拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱及其类似物；和铂化合物，包括顺铂及其类似物如卡铂。适合使用的其他常规化疗药是本领域技术人员已知的并且包括天冬酰胺酶、白消安、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、雌莫司汀磷酸钠、氟尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、羟基脲(羟脲)、异环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、盐酸氮芥(氮芥)、美法仑、巯基嘌呤、氨甲蝶呤(MIX)、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、丙卡巴肼、链脲佐菌素、硫鸟嘌呤、噻替派、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、六甲嘧胺(HMM)、米托胍腙(甲基GAG；甲基乙二醛双脒基腙；MGBG)、司莫司汀(甲基CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和硫酸长春地辛。
在本发明的一个实施方案中，脂质体具有适于外渗入实体瘤的尺寸。在脂质体也包含亲水聚合物链表面层以延长脂质体的血液循环寿命时，这是特别有用的。保持循环持续较长时间段例如大于约2-5小时的脂质体能够渗入显示受损泄露性脉管系统或内皮屏障的肿瘤和感染部位。此类脂质体一般是在约40-200nm之间，更优选是在50-150nm之间，最优选是在70-120nm之间。
将所选药剂通过标准方法掺入脂质体，所述标准方法包括(i)通过用该药物的水溶液水化脂质薄膜被动截留水溶性化合物，(ii)通过水化含有该药物的脂质薄膜被动截留亲脂化合物，和(iii)加载对抗内部/外部脂质体pH梯度的可离子化药物。其他方法如反向蒸发法也是合适的。
备选地，药物可以通过主动运输机制掺入预制的脂质体。一般而言，在这种情况下，药物应答于差异性钾离子或氢离子浓度而摄入脂质体中(Mayer，1986；Mayer 1989)。
在脂质体形成后，可以筛分脂质体以获得具有基本上均一大小范围的、一般在约0.01至0.5微米之间、更优选在0.03-0.40微米之间的脂质体群体。用于REV和MLV的一种有效筛分方法包括经过一系列聚碳酸酯膜挤出脂质体的含水悬液，所述的聚碳酸酯膜具有所选的范围0.03至0.2微米、一般0.05、0.08、0.1或0.2微米的统一孔径。膜的孔径大体对应于经该膜挤出所产生的脂质体的最大尺寸，特别地在经相同的膜挤出该制备物两次或多次的情况下。均化方法也用于减小脂质体大小至100nm或更小的尺寸(24)。
可以通过这些方法中的任意方法制备携带所截留物并承载表面结合的靶向性配体的脂质体，即靶向的治疗性脂质体。优选的制备方法是插入法，其中预制的脂质体与靶向性缀合物孵育以实现靶向性缀合物插入脂质体双层。在这种方法中，通过多种技术(如(23)中详述的那些技术)制备脂质体，并且下文描述为支持本发明所制备的脂质体的具体例子。一般而言，脂质体是多层小泡(MLV)或单层小泡(ULV)。
MLV可以通过简单的脂质膜水化技术形成。在这种方法中，在容器中蒸发溶解于适宜有机溶剂中的上文详述类型的脂质体形成脂质的混合物以形成薄膜，该薄膜随后由含水介质覆盖。该脂质膜水化以形成MLV，通常大小在约0.1至10微米之间。
ULV可以通过反复冻融法形成。在这种方法中，1-2-油酰基-3-sn-甘油磷酸胆碱和Chol或者DSPC和Chol(摩尔比3∶2)与mPEGDSPE(0.5-5mol％磷脂)混合。随后将脂质体通过具有0.1、0.08和0.05μm定义孔径的聚碳酸酯滤器挤出几次。这产生一般具有直径70-120nm大小的脂质体。脂质体的尺寸可以由动态光散射法确定。可以使用标准磷酸盐测定法测量脂质体浓度。
通过上述任意方法能够获得的抗EGFR免疫脂质体具有临床相关性并且可以用于二线和更高线治疗罹患癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤所代表癌症的人患者中。构思的用于本发明中的免疫脂质体包含识别并与实体瘤表面上的EGF受体抗原结合的抗体或抗体片段。特别地，该免疫脂质体包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc、Fv片段或者是单链抗体。
构思的用于本发明中的免疫脂质体还包含抗肿瘤药，特别地还包含选自多柔比星、表柔比星和长春瑞滨中的抗肿瘤药、特别地还包含多柔比星。
本发明的免疫脂质体可以以包含所述免疫脂质体和可药用载体和/或稀释剂和/或赋形剂的药物组合物的形式施用至人患者。
本发明药物组合物的配制可以根据本领域技术人员已知的标准方法学完成。
本发明的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物可以在固体剂、液体剂、气雾剂的形式以合适的药学有效剂量施用至受试者。固体组合物的例子包括丸剂、膏剂和可植入的剂量单元。丸剂可以经口施用。治疗性膏剂可以局部施用。可植入的剂量单元可以局部地施用，例如在肿瘤部位，或可以植入以全身性释放治疗性组合物，例如皮下植入。液体组合物的例子包括适用于输注的制剂、适用于肌内、皮下、静脉内、动脉内注射的制剂和用于局部和眼内施用的制剂。气雾制剂的例子包括用于施用至肺部的吸入制剂。
本发明的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物可以通过标准施用途径施用。一般而言，所述组合物可以通过局部、经口、直肠、鼻、皮内、腹膜内或肠胃外(例如静脉内、皮下或肌内)途径施用。此外，该组合物可以掺入持续释放基质如生物降解性聚合物，所述聚合物植入想要递送至的位置附近，如在肿瘤部位处。施用方法包括施用单次剂量、以预定时间间隔施用重复剂量和持续施用预定的时间段。
所属领域的技术人员熟知药物组合物的剂量将取决于多种因素，例如待治疗的病症，所用的具体组合物和其他临床因素，如患者的重量、尺寸、性别和总体健康状况、身体表面积、待施用的化合物或组合物、同时施用的其他药物、和施用途径。
本发明的免疫脂质体或包含所述免疫脂质体的药物组合物可以与生物活性物质或化合物或其他组合物组合施用，所述的组合物包含所述生物活性物质或化合物，特别地抗肿瘤化合物，特别地至少一种抑制细胞性化合物，特别地选自以下的化合物：道诺霉素、伊达比星、米托蒽醌、丝裂霉素、顺铂和其他铂类似物、长春新碱、表柔比星、阿克拉霉素、氨甲蝶呤、依托泊苷、多柔比星、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和其他氟化嘧啶、嘌呤或核苷、特别地吉西他滨、博来霉素、丝裂霉素、普卡霉素、放线菌素D、环磷酰胺和其衍生物、噻替派、BCNU、紫杉醇、多西他赛和其他紫杉烷衍生物和分离物、喜树碱、多肽、核酸、具有硫代磷酸酯核苷酸间键的核酸和具有聚酰胺核苷酸间键的核酸，但尤其地多柔比星、表柔比星和长春瑞滨，以及本发明的抗体和任选地可药用载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
药学活性物质，特别地免疫脂质体中截留的抗肿瘤化合物，可以以0.1mg/m2和2.5g/m2身体表面和每次给药之间的量存在。一般而言，施用方案应当在本发明抗肿瘤化合物的0.5mg/m2与1000mg/m2之间的范围内，特别地在1.0mg/m2至500mg/m2之间的范围内并且特别地在5.0mg/m2与250mg/m2之间的范围内、特别地在10.0mg/m2与150mg/m2之间的范围内，同时处于这些范围内的全部各个数字也是本发明的部分。如果施用通过连续输注进行，更适宜的剂量可以是每小时在每公斤体重单位0.01μg和10mg之间的范围，同时处于这些范围内的全部各个数字也是本发明的部分。
免疫脂质体的抗体浓度在每微摩尔磷脂1μg至150μg抗体或抗体片段之间的范围内，特别地在每微摩尔磷脂5μg至100μg抗体或抗体片段之间的范围内，特别地在每微摩尔磷脂10μg至100μg抗体或抗体片段之间的范围内，特别地在每微摩尔磷脂20μg至50μg抗体或抗体片段之间的范围内，特别地在每微摩尔磷脂30μg至40μg抗体或抗体片段之间的范围内。
本发明的免疫脂质体制备物可以制备为药物组合物的形式，用于例如通过静脉内、皮下或肌内注射或通过静脉内滴注进行肠胃外施用，其中所述的药物组合物含有溶解于或分散在本领域技术人员熟知的可药用载体中的分离和纯化的免疫脂质体。
就肠胃外施用的药物组合物而言，可以使用任意的常规添加剂，如赋形剂、佐剂、黏合剂、崩解剂、分散剂、润滑剂、稀释剂、吸收增强剂、缓冲剂、表面活性剂、增溶剂、防腐剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、注射用增溶剂、pH调节剂等。
促进活性化合物加工成可以药学方式使用的制备物的可接受载体、稀释剂和佐剂在所用的剂量和浓度对接受者无毒并且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如TWEEN
Figure GPA00001141945700281
PLURONICS
Figure GPA00001141945700282
或聚乙二醇(PEG)。
施用药物组合物的形式可以是全身或局部的。例如，此类组合物的施用可以是各种肠胃外途径，如皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、鼻内、经皮、颊途径或借助植入装置，并且也可以通过蠕动手段递送。
施用通常以肠胃外例如静脉内，特别地以输注形式进行。用于肠胃外施用的制品包括无菌的水溶液或非水溶液、混悬剂和乳剂。非水溶剂包括但不限于丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。含水溶剂可以选自由水、醇/水溶液、乳浊液或悬液组成的组，包括盐水和缓冲的介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格液或固定油，静脉内载体包括液体和养分补充物、电解质补充物(如基于林格右旋糖的那些电解质补充物)和其他载体。也可以存在防腐剂(例如抗微生物剂)、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
药物组合物还可以包含蛋白质载体例如血清白蛋白或免疫球蛋白，特别地人来源的蛋白质载体。根据药物组合物的预期用途，其他生物活性物质可以在本发明的药物组合物中存在。
在本发明的一个方面，产生了如本文中所述的免疫脂质体(ILs)，其结合EGFR以提供抗体指导的抗癌药有效胞内递送入靶细胞，旨在研究通过这种方法是否可能克服抗药性机制，所述抗药性机制仍是癌症疗法中更好结果的重大障碍。
ILs可以按模块方式用共接连接至含有多种药物或探针的稳定化脂质体的多种MAb或MAb片段构建，所述的MAb或MAb片段包括嵌合抗体例如来自C225(西妥昔单抗、爱必妥
Figure GPA00001141945700291
)的Fab’或人源化抗体例如EMD72000。
随后可以用如此产生的ILs治疗也以mdr介导多药抗性为特征的过量表达EGFR的细胞，例如人乳腺癌细胞系MDA-MB-231/mdr或结肠直肠癌细胞系HT-29/mdr。在多药抗性细胞系中，载有多柔比星(dox)的ILs能显示产生比游离多柔比星大15-86倍的细胞毒性(例如HT-29/mdr细胞中ILs-dox的IC50＝0.37而游离多柔比星的IC50＝6.0(μg dox/ml)。在非耐受性HT-29细胞中，多柔比星的免疫脂质体细胞毒性是与游离药物的免疫脂质体细胞毒性可比较的(IC50＝0.23μg dox/ml对0.36μg dox/ml)，而比非靶向的脂质体多柔比星具有显著更多的细胞毒性(IC50＞27μg dox/ml)。令人感兴趣的是，MDA-MB-231/mdr细胞中的胞内分布研究揭示了游离多柔比星与免疫脂质体dox递送之间的明显差异。虽然游离多柔比星被有效泵出这种多药抗性肿瘤细胞之外，但在相同浓度上的免疫脂质体dox在胞浆中实现3.5-8倍更高的dox累积并且在胞核中实现3.5-4.9倍更高的dox累积。
最后，在MDA-MB-231/mdr异种移植物模型中的体内疗法研究证实抗EGFR ILs-dox有效靶向多药抗性细胞的能力。尽管游离多柔比星在这种高度多药抗性肿瘤模型中在其MTD上没有显示任何活性，然而抗EGFRILs-dox显示令人印象深刻的明显优于全部其他疗法的抗肿瘤作用。
根据本发明和如本文中披露的免疫脂质体因而对过量表达EGFR的肿瘤细胞提供有效和靶向的药物递送并且甚至对多药抗性细胞显示强烈活性。
本领域技术人员会理解除了具体描述的那些内容之外，本文中所述的本发明易受变化和改变。将理解的是本发明包括全部此类变化和改变，而不脱离本发明的精神和基本特征。本发明也分别或总体地包括在本发明中提及或显示的全部步骤、特征、组合物和化合物，以及任意和全部组合或任意两个或多个所述步骤或特征。本公开因而以全部所述方面加以考虑并且不限于此，从而本发明的范围由所附权利要求书指示，并且属于等同性意思和范围内的全部变化意图包含于本发明范围内。
在本说明书通篇范围内援引多篇参考文献，每份参考文献通过全部引用的方式并入本文。
将参考以下实施例更充分地理解前面的描述。然而，此类实施例举例说明实施本发明的方法并且不意图限制本发明的范围。
实施例
目标群体是已经接受过所有可使用的标准疗法的具有过量表达EGFR的实体瘤的患者。
特别地，所述患者罹患以下癌症并且肿瘤在以下治疗下已经进展：
前列腺癌，具有在激素、多西他赛、米托蒽醌治疗时进展的肿瘤。
胰腺癌和胆囊癌，具有在吉西他滨、卡培他滨、奥沙利铂治疗时进展的肿瘤。
肾癌，具有在干扰素、卡培他滨、舒尼替尼、索拉菲尼治疗时进展的肿瘤。
膀胱上皮癌，具有在顺铂或卡铂、吉西他滨、多柔比星、氨甲蝶呤、长春新碱治疗时进展的肿瘤。
非小细胞肺癌，具有在顺铂或卡铂、吉西他滨、长春瑞滨、培美曲塞、多西他赛、吉非替尼治疗时进展的肿瘤。
小细胞肺癌，具有在顺铂或卡铂、依托泊苷、伊立替康、多柔比星、长春新碱、环磷酰胺、托泊替康治疗时进展的肿瘤。
间皮瘤，具有在顺铂或卡铂、吉西他滨、培美曲塞治疗时进展的肿瘤。
乳腺癌，具有在顺铂或卡铂、多柔比星、长春新碱、环磷酰胺、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨、卡培他滨、丝裂霉素、氨甲蝶呤、米托蒽醌、贝伐单抗、曲妥珠单抗治疗时进展的肿瘤。
食管癌，具有在顺铂或卡铂、5-FU、多西他赛治疗时进展的肿瘤。
头颈癌，具有在顺铂或卡铂、5-FU、多西他赛、西妥昔单抗治疗时进展的肿瘤。
脑肿瘤，具有在替莫唑胺、贝伐单抗、伊立替康、长春新碱、丙卡巴肼、CCNU、BCNU治疗时进展的肿瘤。
肝细胞癌，具有在舒尼替尼、索拉非尼治疗时进展的肿瘤。
结肠和直肠癌，具有在西妥昔单抗、贝伐单抗、奥沙利铂、伊立替康、卡培他滨、5-FU治疗时进展的肿瘤。
在试验中测试的治疗性化合物是C225-ILs-dox，是一种其中EGFR特异性抗体C225与含有多柔比星的脂质体的脂质膜共价结合的构建体。使用这种化合物的基本理由是这样的事实：多柔比星是许多种人肿瘤中最有效的药物之一并且高百分数的这些恶性病确实表达EGFR。
A：I期研究CC1的方案
1.选择标准
1.1.患者总数
大约30位患者。
1.2.纳入标准
在登记参与本研究前，候选人必须达到全部以下标准：
1.组织学证明的局部推进的或转移性实体瘤。
2.ECOG表现≤2。
3.没有额外的标准疗法可用于该患者。
4.在最新近可评价的肿瘤组织中确定的EGFR过量表达(根据DAKOEGFR pharmDx-试验)。
5.无伴行的抗肿瘤疗法(类固醇是允许的-在乳腺癌和前列腺癌中，需要类固醇剂量在研究期间保持稳定)。
6.自停止任何先前抗肿瘤治疗以来至少4周(在亚硝基脲或丝裂霉素C的情况下6周)。
7.在具有先前蒽环类药暴露史的患者中，要求正常的超声心动图(LVEF＞50％)。
8.年龄≥18岁。
9.男性或女性。
10.育龄女性和男性患者必须使用有效避孕措施。
11.在参与本研究前，愿意并且能够签署知情同意书并且在本研究持续期间服从本方案。
1-3.排除标准：
如果符合以下任意标准，则必须从本研究排除候选人：
1.妊娠和/或哺乳。
2.具有以下实验室值的患者
嗜中性粒细胞＜1.5x109个/L
血小板＜100x109个/L
血清肌酸＞3.0x正常上限
ALAT、ASAT＞3.0x正常上限(在肝脏转移作为酶改变的唯一可能原因的患者中5.0x)
碱性磷酸酶＞3.0x正常上限(在肝脏转移或骨转移作为酶改变的唯一可能原因的患者中5.0x)
胆红素＞3.0x正常上限
3.在治疗开始前4周内参与任何调查性药物研究。
4.具有临床明显和失控的肾病或肝病的患者。
5.临床明显的心脏病：充血性心力衰竭(纽约心脏协会III或IV类)；有症状的冠状动脉病；用药物疗法没有充分控制的心律不齐；在最近12个月内的心肌梗死。
6.可能有损患者参与本试验的能力的(由研究人员判定的)任何严重的基础性医学病症(例如活跃的自身免疫病、失控的糖尿病等)。
7.根据瑞士治疗产品署批准的产品信息施用爱必妥TM或CaelyxTM时禁忌的任何伴行药物。
8.累积的多柔比星剂量＞300mg/m2BSA(或心脏毒性蒽环类药等同物)。
9.具有由研究人员判定为临床明显并妨碍知情同意或干扰顺应性的失控性发作、中枢神经系统疾病或精神病学失能的患者。
10.脑转移。
2.安全性参数
2.1.不利事件(主要对象)
临床研究期间遭遇的全部不利事件将记录于患者的历史/文件中。
临床不利事件的强度将根据NCI CTC评级系统3.0版(http://ctep.info.nih.gov/reporting/ctc.html)评级。
2-2.实验室参数
在研究启动之前，必须记录参与实验室的正常值。本研究期间必须实施以下实验室操作：
每周(根据需要在新施用研究药物之前)：
血红蛋白-白细胞计数，包括白细胞分类计数
血小板计数
每4周(在新施用研究药物之前)：
ASAT-ALAT
胆红素
碱性磷酸酶
血清肌酸
LDH
钙
尿分析(“U-状况”：检测红细胞尿、白细胞尿和蛋白尿)
仅在周期1期间的药物代谢动力学研究：
在0、24、48、96小时和在第8日的血样(2x7.5ml血清管)
2.3.生命体征和体格检查
在研究开始之前应当记录以下生命体征和体格检查结果：
体温
血压
心率
高度(一旦开始筛查)
重量
体力状况(ECOG)
2.4.专门研究
对于药物代谢动力学研究，将在0、24、48、96小时以及在第8日抽取血样(2x7.5ml血清管)。血浆将通过离心从全血分开并冷冻在-80℃以进一步分析。多柔比星浓度将由荧光确定。由于游离多柔比星的快速清除率，这种简单分析提供对循环性完整C225-ILs-dox的优异测量。将使用PK Solution 2.0软件(Summit Research Serviced，Montrose，CO，美国)，通过非区室药物代谢动力学数据分析确定药物代谢动力学参数。
2.5.针对毒性的剂量调整
这是一个剂量逐步升高研究(I期)。对于细节，还参见10.3.2部分。
在感受到毒性(DLT)但受益于疗法的个体患者中，根据主要研究人员的临床判断所确定，以降低的剂量继续治疗是可选项(撤出研究)。
如果可能，应当对症治疗毒性。如果毒性出现，将使用适宜的治疗来改善体征和症状，包括针对恶心和呕吐的止吐药、针对腹泻的止泻药、针对药物发热的退热药和抗组胺药和针对皮肤毒性的50％DMSO软膏剂。
2.6 支持措施
2.6.1 恶心/呕吐
应当从第一周期开始给予患者预防性止吐治疗。推荐使用5-HT3-受体-拮抗剂。应当给予在前面周期中感受等级≥3恶心/呕吐的任何患者更有侵入性的止吐预防措施。
尽管给予适宜药物，如果等级≥3恶心/呕吐持续，则该患者必须从本研究退出。
2.6.2 腹泻
对第一周期不推荐预防性抗腹泻疗法。然而，在腹泻首次发生后，该患者应当在首次发作后接受用洛哌丁胺：4mg对症治疗，随后在每次新发作用2mg洛哌丁胺对症治疗直至腹泻康复(每日不超过16mg)。
尽管给予适宜药物，如果等级≥3腹泻持续，则该患者必须从本研究退出。
2.6.3.掌跖红斑(PPE＝手足综合征)
应当从第一周期开始给予患者预防性治疗。患者应当在第-1至4日经口接受8mg地塞米松BID、在第5日接受4mg地塞米松BID并且在第6日接受4mg地塞米松。额外地，患者应当在治疗时间期间每日(经口)接受150mg吡哆醇(维生素B6)(20)。尽管给予适宜药物，如果2或3级PPE出现，则C225-ILs-dox的施用应当中断最长14日。一旦PPE的严重性降低至CTC等级1，则患者可以继续治疗(如果不因DLT放弃)。
尽管给予预防性或对症治疗，如果等级2或3毒性持续，则该患者必须从本研究退出。
3.疾病评价(功效标准)
3.1.总体应答率(次要目标)
虽然应答率不是本试验的主要目的，但是将通过标准指标评价具有可测量疾病的患者。肿瘤评估将在筛查期间和在2、4和6个治疗周期后进行。在治疗结束后，第一年每隔3个月并随后根据临床需要开展评估。如果记录到进展，则在本研究范围内将不必开展进一步评估。在应答性患者中，应答必须在首次记录该应答后最少4周进行证实。
主要功效标准是将根据附录1中给出的用于报告癌症治疗结果的RECIST标准评估的总体应答率。
必须在全部评价期间对每位患者确保连续CT扫描与X射线(例如利用反差等)的一致性，同时相同技术在整个治疗期间自始至终用于评价损害。
3.2.进展时间
将从患者开始治疗的时间至患者首次记录为具有疾病进展的时间来测量进展时间。
必须充分记录并根据RECIST标准评估疾病进展。
4.研究流程
4.1.筛查
在进行任何研究特定筛查流程前必须提交知情同意书。
筛查流程可以在两个阶段进行。第一组评估可以在第1日治疗开始之前4周内的任意时间进行。第二组评估必须在治疗开始之前7日内进行。如果评估在第1日进行，它们必须在研究药物施用之前结束。
第-28日至第1日(首日C225-ILs-dox，在药物施用之前)评估
Figure GPA00001141945700361
4.2.在治疗期间
肿瘤评估将在筛查期间和在2、4和6个治疗周期后进行。在治疗结束后，第一年每隔3个月并此后根据临床需要开展评估。如果记录到进展，则在本研究范围内将不必开展进一步评估。在应答性患者中，应答必须在首次记录该应答后最少4周进行证实。
实验室安全性评估：
血红蛋白、白细胞和血小板将在第一周期期间每周进行分析，并且如果没有相反的临床指示，在后续周期期间每隔2周进行分析。
转氨酶、胆红素、碱性磷酸酶、肌酸酐、钙、LDH和尿状况将每隔4周进行分析。
将在每次访问时记录不利事件。
将在全部患者中在治疗前和治疗2和6个周期后(或在研究结束时)并且如果临床提示时开展超声波心动描记法。
5.研究设计
这是一个单中心、开放研究。
将以两个阶段进行患者召募。首先，患者根据10.3.2部分(剂量方案和剂量调节)登记。第二阶段允许根据如MTD所确定的剂量水平额外地召募至多6位额外患者。
已经完成治疗期(24周)并显示完全或部分应答以及稳定疾病的患者将进入本研究的观察期。该期将在纳入最后患者后12个月结束。
在治疗期或观察期期间的任何时间，下述患者将离开研究并任由研究人员治疗，所述患者根据附录1中给出的用于报告癌症治疗结果的RECIST标准具有疾病进展的体征或因不可接受的毒性而中断治疗。
6.研究药物治疗
6.1.药物名称、制剂、贮存
将供应C225-IL-dox作为肠胃外施用的每20ml小药瓶10mg多柔比星溶液剂(0.5mg多柔比星/ml)使用。C225-ILs-dox应当贮存在2-8℃。
6.1.1.脂质体制备
通过使用反复冻融以水化脂质膜的脂质膜水化-挤出法(23)制备脂质体。脂质体包含1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇(摩尔比3∶2)，具有甲氧基聚乙二醇(mPEG)-1，2-二硬脂酰-3-sn-甘油磷酸乙醇胺(DSPE；0.5-5mol％磷脂；Avanti Polar Lipids；Alabaster，AL)。水化后，将脂质体通过聚碳酸酯滤器(0.1μm孔径)挤出10次。脂质体大小由动态光散射法确定(一般80-100nm)。磷脂浓度由磷酸盐测定法测量(25)。
对于载有ADS645WS(American Dye Source，魁北克，加拿大)的脂质体，将荧光染料(5mmol/L)溶解于缓冲液中以再水化干燥的脂质。在被动加载后，使用Sephadex G-75层析法除去未封装的染料。
为封装化疗药物多柔比星(Bedford实验室，Bedford，OH)和表柔比星(Pharmacia，Kalamazoo，Ml)，使用硫酸铵进行标准的远程加载方法(26，27)。为封装长春瑞滨，在蔗糖八硫酸酯三乙基铵的溶液(TEA8SOS；0.65mol/L TEA，pH 5.2-5.5)中水化后如所述制备脂质体。在Sepharose CL-4B大小排阻柱上除去未截留的TEA8SOS。以350g药物/mol磷脂的药物对磷脂比添加长春瑞滨并且用1N HCl调节pH至6.5，随后在60℃启动加载过程持续30分钟。所得脂质体长春瑞滨在Sephadex G-75柱上纯化以除去未封装的药物。
6.1.2 单克隆抗体片段和免疫脂质体的制备
如之前所述切割并还原完整C225mAb(西妥昔单抗，爱必妥；ImCloneSystems，在New York，NY)(11)。Fab’片段共价地缀合至PEG-DSPE链末端处的马来酰亚胺基团(Mal-PEG-DSPE；Nektar，Huntsville，AL；参考文献8)。对于C225-Fab’，缀合效率一般是30％至50％。为掺入进预制的脂质体或商品PLD(Doxil，Alza Pharmaceuticals，Palo Alto，CA)，通过在55℃以30μg Fab’/μmol磷脂的蛋白质/脂质体比共孵育30分钟，将mAb缀合物掺入脂质体，产生70％至80％的掺入效率(11)。
6.1.3 制剂
C225-ILs-dox将在University Hospital of Basel的药房(Prof.C.Surber)制备。C225-ILs-dox将贮存在pH 6-7的HEPES缓冲盐水(0.9％NaCI；HEPES 2mM)，以浓度0.5mg多柔比星/ml。将C225-ILs-dox添加至250ml 5％葡萄糖中用于注射(500ml，对剂量水平50mg/m2和以上)。
这种制剂必须在葡萄糖中稀释后24小时内使用。稀释的C225-ILs-dox应当是清亮和浅红色的溶液，没有任何聚集迹象。
6.1.4 贮存要求
小瓶的C225-ILs-dox必须在冰箱内在2°-8℃范围的温度贮存以确保最佳保留物理和生物化学完整性。重要的是不冻结该研究药物，因为脂质体将被破坏。C225-ILs-dox可能对剪切有诱导的应力(例如搅拌或从注射器快速推出)敏感。剧烈操作(如振摇)C225-ILs-dox溶液可能导致蛋白质聚集并可以产生云雾状溶液。小瓶仅设计为单次使用。
6.2 包装和标注
本研究药物C225-ILs-dox的小瓶如下标注：
仅用于临床试验使用
研究CC1
C225-ILs-dox
总含量：20ml，0.5mg多柔比星/ml＝10mg/小瓶
贮存在2-8℃之间(勿冻结)
失效日期：
批号：
研究员姓名：
患者标识：
6.3 研究治疗
6.3.1.剂量选择的原理
在众多II期和III期试验中并还在例行肿瘤学实践中使用的Caelyx标准剂量是40-50mg/m2，作为短时输注每4周给予。以这个剂量给予的该药物的主要毒性之一是掌跖红斑(PPE＝手足综合征)。类似地，西妥昔单抗的重要可能的副作用是皮肤毒性，通常本身表现为面部和躯干的痤疮样疹。此种副作用可能是表皮以相对高的水平表达EGFR这一事实的后果。因而，这项研究的主要安全性顾虑是借助抗EGFR抗体西妥昔单抗引导Caelyx至过量表达EGFR的细胞也可能增加该药物的皮肤毒性。
在这项I期研究范围内的治疗以非常低剂量的Caelyx即十分之一标准剂量的药物(与建立的临床方案中250mg/m2(加载剂量400mg/m2)相比，对应于大约0.9mg/m2的抗体(西妥昔单抗)剂量)进行并且计划以小的增量提高剂量。
6.3.2 剂量方案和剂量调节
患者将三位患者成组分别以下述剂量水平治疗(C225-ILs-dox的定量和剂量水平以mg多柔比星定义)：
水平1＝5mg/m2
水平2＝10mg/m2
水平3＝20mg/m2
水平4＝30mg/m2
水平5＝40mg/m2
水平6＝50mg/m2
水平7＝60mg/m2
水平8＝70mg/m2
水平9＝80mg/m2
在每个剂量水平上，3位患者可以同时登记参与。在给定剂量水平的3位患者已经接受至少一个完整治疗周期后，如果在给定剂量水平没有剂量限制性毒性(DLT)出现，将允许升高至下一个较高的剂量。将由团队在审阅前面组的全部可用毒性数据后作出进入下一个剂量水平的决定。DLT定义为任意的4级毒性、持续超过1周的任意3级毒性或/和3级热性嗜中性白细胞减少症(定义为嗜中性粒细胞＜1.0x10e9/l和发热＞38.5℃)。排除恶心、呕吐、厌食和脱发(2级)是剂量限制性毒性。类似地，与原发肿瘤显然相关的不利事件如疾病进展将不视为DLT。此外，当定义并分析DLT时，必须考虑预先存在的毒性。
视为DLT的3级毒性的例子：
·在PPD(手足综合征)的情况下，3级毒性定义为溃疡性皮炎或皮肤改变，伴有干扰功能的疼痛，并因而视为DLT。
·在腹泻的情况下，3级毒性定义为超过基线的每日大于7次排便；失禁；静脉内补液大于24小时和/或住院，并因而视为DLT。
·在左心室功能的情况下，3级毒性定义为应答于介入治疗的有症状心机能障碍和/或射血分数下降低于40％，并因而视为DLT。
如果DLT在任何剂量水平上出现，则以下原则将适用：
 在给定剂量水平上具有的DLT的患者数 逐步升高决定规则
 3位患者中0位患者   3位患者进入下一个剂量水平
≥2   将停止剂量逐步升高。将宣布该剂量水平是最大施用的剂量(施用的最高剂量)。如果先前仅以该剂量治疗3位患者，则三位(3)额外患者将进入下一个较低的剂量水平。
 在给定剂量水平上具有的DLT的患者数 逐步升高决定规则
3位患者中1位患者   至少3位更多的患者进入这个剂量水平。如果这3位患者中0/3或1/3经历DLT，继续至下一个剂量水平。如果这个组的2/3或更多患者遭受DLT，则停止剂量逐步升高，并宣布该剂量是最大施用的剂量。如果先前仅以该剂量治疗3位患者，则三位(3)额外患者将进入下一个较低的剂量水平。
 在低于最大施用剂量的最高剂量水平上6位患者中有2位或以下的患者   这一般是推荐的2期剂量。至少6位患者必须进入推荐的2期剂量。
将允许依次剂量逐步升高直至在相同剂量水平上治疗的3-6位患者中对3位患者观察到DLT。在此刻，将不允许进一步剂量逐步升高。未来可能研究的最大耐受剂量(MTD)随后将定义为比不得不停止剂量逐步升高的剂量水平低的剂量水平。
在经历了毒性的个体患者中，根据主要研究人员的临床判断所确定并且按照第6.5章中详述的规则，以降低的剂量继续治疗是可选项。
6.3.3.治疗持续期
患者将进行治疗直至疾病进展，但持续最多6个周期。
6.4.伴行治疗
必须以病例报告形式汇报全部并行药物。
7.过早退出
患者可以在任何时间并因任何原因退出本研究，而不影响他们的恰当治疗权利。研究人员有权利因最有利于患者的任何原因请患者退出，所述原因包括间发疾病、不利事件、治疗失败或违反方案。
在本研究期间怀孕的患者将退出。退出的原因应当标记为违反方案并且应当将妊娠报告为严重不利事件。
尽管应当尽可能避免退出，然而应理解退出可以在研究期间出现。无论何时患者出于任何原因退出研究，必须对该患者完成最终研究评价，无论退出原因是什么。关于该患者的全部文件记录必须尽可能完整。
8.警告和注意事项
视为严重的任何不利事件必须立即(在一个工作日内)报告给Ghristoph Mamot博士或Christoph Rochlitz教授(二者均来自巴塞尔大学医院肿瘤学系；联系方式见本方案的标题页)。
C225-ILs-dox疗法仅应当在治疗癌症患者方面有经验的医师监督下启动。由于这是在瑞士巴塞尔大学肿瘤学系实施的一个单中心研究，仅该系的医师与研究人员密切合作实施该治疗。
关于皮肤毒性，请参考10.3.1(剂量选择的原理)
9.统计方法和考虑事项
9.1 总体考虑事项
这是评价C225-ILs-dox在患有晚期实体瘤的患者中安全性的I期研究。功效是该项研究的次要目的，因而在治疗之前、期间和之后的肿瘤量值会提供关于针对C225-ILs-dox的肿瘤应答的一些初步数据。然而，功效分析将是纯粹描述性的并且没有开展正式的统计学检验。
9.2 样本量
本试验的样本量基于这样的研究设计，其中使用所述研究设计来提供试验期间遭遇剂量限制性毒性(DLT)时的安全性终止规则。研究计划是在每个剂量水平上召募3位患者，同时取决于毒性，在这些剂量水平的每一剂量水平上随后纳入最多另外的3位额外患者。当3至6位患者中3位患者在特定剂量水平(DLT剂量)感受到DLT时，将终止试验。
如果在某一剂量水平的真实毒性率是“P”，则宣布该剂量为毒性(DLT剂量)的概率如下：
  毒性率(P)   检测DLT剂量的概率
  0.2   0.099
  0.3   0.256
  0.4   0.456
  0.5   0.656
  0.6   0.821
  0.7   0.930
  0.8   0.983
9.3.主要和次要分析
9.3.1.主要变量
患者针对每一剂量水平的不利事件谱将就事件的频率和数目进行概括。类似地，也概括了感受到DLT的患者的数目和比例。将提供全部不利事件和实验室数据的清单。
9.3.2.次要变量
将列表说明属于每种应答类别(见7.2.1.)的患者的比例。
10.伦理学考虑事项
本方案已经书写成文，并且试验将根据赫尔辛基宣言、ICH颁布良好临床实践指南(Guidelines of Good Clinical Practice)和瑞士管理机关要求进行。
在将任何患者纳入本试验之前，研究人员必须确保该试验已经由当地伦理委员会批准并且瑞士治疗产品署已经开放该中心。
10.1 知情同意书和患者信息
知情同意书应当以地伦理委员会批准的书面形式获得并且由患者签名。两份知情同意书应当签名，其中一份递交给该患者。
在寻求知情同意书时，应当使用附件中提供的患者信息(根据当地伦理委员会的要求修订)并且应当递交一份副本给该患者。
知情同意流程必须遵守ICH和瑞士治疗产品署颁布的良好临床实践指南。
全部患者将被告知试验目的、可能的不利感受、在不利事件出现时如何反应和他/她可能遭遇的流程及可能危害。他们将被告知对患者数据严格保密，但是他们需要知道他们的医学纪录可以由除治疗医师之外的授权个人审阅。
研究人员必须向患者提供考虑是否参与的足够机会并且使被迫或过度影响的概率最小化。提供的信息应当以患者可理解的语言书写并且不可以包括可能放弃患者任何合法权利或可能豁免研究人员、赞助商或研究机构过失责任的任何内容。
将强调的是参与是自愿的并且允许患者在他或她愿意的任何时候拒绝进一步参与该方案。这不损害患者的后续护理。
在转变损益比的新数据可获得的情况下，患者应当再次同意。
11.附件
11.1.Recist标准
实体肿瘤应答评价标准(RECIST)(29)
对具有可测量疾病的全部患者评价应答。
可测量的疾病-存在至少一种可测量的损害。如果这种可测量疾病限于孤立损害，其肿瘤特征应当由细胞学/组织学证实。
·可测量的损害：可以在至少一个维度上精确测量的损害，所述损害具有使用常规技术时20mm的最长直径3或用螺旋CT扫描时10mm的最长直径3。
·不可测量的损害：全部其他损害，包括小损害(用常规技术时最长直径＜20mm或用螺旋CT扫描时最长直径＜10mm)，即，骨损害、柔脑脊膜疾病、腹水、胸膜/心包膜渗出、炎性乳腺疾病、皮肤/肺淋巴管炎、囊性损害并且还包括未证实并随后由成像技术证实的腹部包块。
损害的评价
靶损害的评价A
·完全应答(CR)：全部靶损害消失
·部分应答(PR)：以基线总和LD为参考，靶损害的最长直径(LD)的总和下降至少30％。
·进展(PD)：参考自开始治疗或出现一种或多种新损害以来所记录的最小总和LD，靶损害的LD总和增加至少20％。
·稳定的疾病(SD)：参考自开始治疗以来的最小总和LD，既没有足够地缩小至定性PR，也没有足够地增加至定性PD。
非靶损害的评价B
·完全应答(CR)：全部非靶损害消失和肿瘤标记水平正常化。
·不完全应答：一种或多种非靶损害持续(非CR)或/和肿瘤标记水平维持高于正常限。
·进展(PD)：一种或多种新损害出现和/或现有非靶损害毫无疑义地进展。C
注：
·肿瘤标记单独不能用来评估应答。如果肿瘤标记初始高于正常上限，它们必须对全部损害已消失时视为处于完全临床应答的患者归一化。
·细胞学和组织学：如果这种可测量疾病限于孤立损害，则其肿瘤特征应当由细胞学/组织学证实。
这些技术可以用来区分罕有病例(例如，其中已知的残余良性肿瘤可能仍保留的肿瘤类型如生殖细胞肿瘤中的残余损害)中的PR和CR。
当可测量的肿瘤已经符合应答或稳定性疾病的标准时，细胞学证实治疗期间出现或恶化的任何渗出物的肿瘤来源对于区分应答或稳定性疾病与进展性疾病是必须遵循的(渗出可以是该治疗的副作用)。
最好总体应答的评价
最好总体应答是从治疗开始直至疾病进展/复发所记录的最好应答(以开始治疗以来所记录的最小量值作为进展性疾病的参考)。患者的最好应答指定将取决于量值和证实标准的实现。
A代表全部所涉及器官的全部可测量损害直至最多10处损害应当被鉴定为靶损害并且在基线处记录和测量。应当基于靶损害的大小(具有最长直径的损害)及它们对精确反复测量(通过成像技术或临床测量)的适用性选择靶损害。将计算全部靶损害的长直径(LD)的总和并且报道为基线总和LD。该基线总和LD将作为参考用来进一步表征疾病的可测量维度的客观肿瘤应答。
B全部其他损害(或疾病部位)应当被鉴定为非靶损害并也应当在基线处记录。不要求量值，不过在整个随访期间应当指出这些损害中每一种损害的存在或不存在。
C尽管“非靶”损害的清晰进展仅是例外，然而在这种环境下，治疗医师的选择应当为主导并且进展状况应当在稍后时间由评审专家组(或试验主持人)证实。
  靶损害   非靶损害   新损害应答   总体
  CR   CR   无   CR
  CR   非CR/非PD   无   PR
  PR   非PD   无   PR
  SD   非PD   无   SD
  PD   任意   有或无   PD
  任意   PD   有或无   PD
  任意   任意   有   PD
注：
·应当将健康状况全面恶化的要求中断治疗而当时没有疾病进展客观证据的患者报道为“有症状的恶化”。应当全力记录客观进展，即便在中断治疗后。
·在一些情况下，可能难以区分残留疾病与正常组织。当完全应答的评价取决于这种决定因素时，推荐应当在证实完全应答状况之前研究残余损害(细针头抽吸/活组织检查)。
评价可测量疾病的指南
全部量值应当使用尺子或卡尺记录以米制符号记录。全部基线评价应当在根据评估计划注册之前14日内进行。
注：在以往辐射过的区域内的肿瘤损害最佳地不视为可测量的疾病。
应当在基线处和随访期间使用相同的评估方法和相同技术来表征每种所鉴定和报告的损害。CT和MRI是测量为应答评估所选择的靶损害的目前可用性和重复性最好的方法。当使用两种方法来评估疗法的抗肿瘤作用时，优选基于成像的评价法来通过临床检查评价。
·仅当临床损害为浅表时(例如，皮肤小结，可触及性淋巴结)，才会认为它们是可测量的。在皮肤损害的情况下，推荐通过彩色照相记录，包括尺子以估计损害的尺寸。
·可接受胸部X射线片上的损害为可测量的损害，当这些损伤是清晰限定的并被充气肺包围时。然而，优选CT。
·常规CT和MRI应当以10mm或更小截距切片厚度连续地进行。螺旋CT应当使用5mm连续的重构算法进行。这适用于胸部、腹部和骨盆。头和颈部端部通常需要特殊的方法。
·当本试验的主要目的是客观性应答评价时，超声术(US)不应当用来测量临床上不容易接近的肿瘤损害。它是临床测量浅表可触及性小结、皮下损害和胸腺小结的可能替代。超声术也可能用来证实通常由临床检查评估的浅表性损伤的彻底消失。
证实性量值/应答持续期
证实
为了向一种状况指定PR或CR，必须通过重复研究证实肿瘤量值的改变，其中所述的重复研究应当在首次满足应答标准4周后进行。在SD的情况下，随访量值必须在试验7周后符合SD标准至少一次(见评估安排，附件23.18)。
总体应答的持续期
从对CR/PR(无论先记录到哪种)符合测量标准的时间直至客观记录到复发性或进展性疾病的首个日期，测量总体应答的持续期(以开始治疗以来所记录的最小量值作为进展性疾病的参考)。
从CR首先符合测量标准的时间直至客观记录到复发性疾病的首个日期，测量总体完全应答的持续期。
稳定疾病的持续期
以开始治疗以来所记录的最小量值作为参考，从开始治疗直至符合进展标准，测量稳定性疾病。
11.2.合格形式
纳入标准
在登记参与本研究前，候选人必须达到全部以下标准(如果是的话，勾选每个空格)：
1.组织学证明的局部推进的或转移性实体瘤。
2.ECOG表现≤2。
3.没有额外的标准疗法可用于该患者。
4.在最新近可评价的肿瘤组织中确定的EGFR过量表达(根据DAKOEGFR pharmDx-试验)。
5.无伴行的抗肿瘤疗法(类固醇是允许的-在乳腺癌和前列腺癌中，需要类固醇在研究期间保持稳定)。
6.自停止任何先前抗肿瘤治疗以来至少4周(在亚硝基脲或丝裂霉素C的情况下6周)。
7.在具有先前蒽环类药暴露史的患者中，要求正常的超声心动图(LVEF＞50％)。
8.年龄≥18岁。
9.男性或女性。
10.育龄女性和男性患者必须使用有效避孕措施。
11.在参与本研究前，愿意并且能够签署知情同意书并且在本研究持续期间服从本方案。
排除标准：
如果符合以下任意标准，则必须从本研究排除候选人(如果是的话，勾选每个空格)：
1.妊娠和/或哺乳。
2.具有以下实验室值的患者
嗜中性粒细胞＜1.5x109个/L
血小板＜100x109个/L
血清肌酸＞3.0x正常上限
ALAT、ASAT＞3.0x正常上限(在肝脏转移作为酶改变的唯一可能原因的患者中5.0x)
碱性磷酸酶＞3.0x正常上限(在肝脏转移或骨转移作为酶改变的唯一可能原因的患者中5.0x)
胆红素＞3.0x正常上限
3.在治疗开始前4周内参与任何调查性药物研究。
4.具有临床明显和失控的肾病或肝病的患者。
5.临床明显的心脏病：充血性心力衰竭(纽约心脏协会III或IV类)；有症状冠状动脉病；用药物疗法没有充分控制的心律不齐；在最近12个月内的心肌梗死。
6.可能有损患者参与本试验的能力的(由研究人员判定的)任何严重的基础性医学病症(例如活跃自身免疫病、失控的糖尿病等)。
7.根据瑞士治疗产品署批准的产品信息施用爱必妥TM或CaelyxTM时禁忌的任何伴行药物。
8.累积的多柔比星剂量＞300mg/m2BSA(或心脏毒性蒽环类药等同物)。
9.具有由研究人员判定为临床明显并妨碍知情同意或干扰顺应性的失控性发作、中枢神经系统疾病或精神病学失能的患者。
10.脑转移。
12.结果
在下表中包括I期试验的初步结果。这些结果显示直至50mg/m2浓度不能或很少能够观察到药物相关的毒性作用。特别地，在甚至更高的剂量上没有发现皮肤毒性、特别地没有掌跖红斑，而与此同时，观察到清晰的功效信号，甚至在所用的最低剂量上也是如此。
表1：I期试验的初步结果
  患者编号 剂量(每m2) 肿瘤 周期 3/4级毒性   功效(最好的应答)
  1   5mg   前列腺   2   无   PD*
  2   5mg   胰腺   2   无   PD
  3   5mg   肾细胞   2   无   PD
  4   10mg   胰腺   1   无   n.e.
  5   10mg   食管   3   无   SD
  6   10mg   结直肠   6   无   SD
  7   20mg   结直肠   2   无   PD
  8   20mg   胰腺   1   无   PD
  9   20mg   头颈   4   无   SD
  10   30mg   间皮   6   无   PR
  11   30mg   前列腺   2   无   PD
  12   30mg   胰腺   2   无   PD
  13   40mg   膀胱   2   无   PD
  14   40mg   膀胱   6   无   SD(MR)
  15   40mg   肾细胞   1   无   n.e.
  患者编号 剂量(每m2) 肿瘤 周期 3/4级毒性   功效(最好的应答)
16 50mg 肝细胞 2   3级嗜中性白细胞减少症 n.e.
(*2周期后最小肿瘤进展。回溯地，PSA下降和肺转移缓和持续18个月)。
(在迄今治疗的所有16位患者中根本没有皮肤毒性)
PD          进展
SD          稳定性疾病
SD  (MR)    稳定性疾病(最小应答)
PR          部分应答
n.e         未评价
B 多药抗性研究
1.材料
1.1 试剂
用于脂质体制备的试剂包括：DilC18(3)-DS(Molecular Probes；Leiden，Netherlands)；DSPC，胆固醇，和mPEG-DSPE(Avanfi Polar Lipids；Alabaster，AL，USA)；Mal-PEG(2000/3400)-DSPE(Nektar；Huntsville，AL，美国)；有机溶剂和其他试剂纯化学品(SIgma-Aldrich AG；Buchs，瑞士)。
多柔比星(Adriblastin RD
Figure GPA00001141945700511
；Pfizer AG，Zürich，瑞士)和聚乙二醇化的脂质体多柔比星(Caelyx
Figure GPA00001141945700512
，Essex Chemie AG，Luzern，瑞士)商业地从药房获得。
免疫脂质体含有衍生自C225(西妥昔单抗，爱必妥)或EMD72000(马妥珠单抗)(均为Merck KGaA，达姆施塔特，德国)的Fab’。两种单克隆抗体均是与EGFR胞外结构域(ECD)结合并因而阻断EGFR配体如EGF和TGF-α(36)激活作用的重组IgG1。MAb C225是嵌合MAb，而EMD72000是从转基因小鼠衍生的人源化MAb(37)。
MAb EMD72000由德国达姆施塔特Merck KGaA友好提供。
1.2.细胞系
MDA-MB-231人乳腺癌和结肠直肠癌细胞系HT-29癌细胞系从巴塞尔大学研究系或美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。这些细胞系的抗性形式由Susan Bates(MDA-MB-231 Vb100；NIH，Bethesda，美国)和由
Figure GPA00001141945700513
博士(HT-29RDB；Charité，柏林，德国)提供。在加湿气氛95％空气和5％CO2在37℃将MDA-MB-231细胞维持于“改良MEM锌选项”培养基(Invitrogen AG，巴塞尔，瑞士)中和将HT-29维持在RPMI-1640(Sigma-Aldrich AG，布克斯，瑞士)，所述培养基补充有10％胎牛血清，100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
2.脂质体制备、加载和抗体掺入
2.1 脂质体制备
根据反复冻融法(23)，使用DSPC和胆固醇(摩尔比3∶2)与mPEG-DSPE(0.5-5mol％磷脂)制备单层脂质体。简而言之，随后将脂质体通过具有0.1μm定义孔径的聚碳酸酯滤器挤出10次，产生如动态光散射法所确定的90-120nm直径的脂质体。使用标准磷酸盐测定法测量脂质体浓度。
对于摄取和内化研究，用0.1-0.3mol％DilC18(3)-DS(一种可以稳定掺入脂质体膜的荧光脂质)((38)(39))标记脂质体。
为封装多柔比星，利用硫酸铵进行远程加载法(remote-loadingmethod)((27)(26))。首先，将干燥脂质在250mM硫酸铵中于pH 5.5再水化，随后如上文所述挤出。使用Sephadex G-75柱/HEPES缓冲盐水(pH7.0)，通过大小排阻层析法除去游离硫酸铵。脂质体随后在60℃与多柔比星孵育30分钟。在这些条件下，当使用每微摩尔磷脂150μg药物时，加载效率一般在95-100％范围内。使用Sephadex G-75柱，通过大小排阻层析法除去所有未封装的多柔比星。此外，商业地获得聚乙二醇化的脂质体多柔比星(PLD/Caelyx
Figure GPA00001141945700521
/Doxil
Figure GPA00001141945700522
)。
2.2 MAb片段制备、缀合和脂质体掺入
对于C225-和EMD72000-Fab’，将完整MAb与0.1M乙酸钠(pH 3.7)中的胃蛋白酶(重量比1∶20)在37℃孵育3小时，随后对HEPES缓冲盐水(pH 6.0)透析。所得F(ab)2用2-巯基乙胺或2-巯基乙醇在37℃于氩气下还原15分钟，然后通过使用Sephadex G-25的凝胶过滤法回收。还原效率一般是70-90％。
Fab’如以往所述缀合至Mal-PEG-DSPE((11)(12))。通过SDS-PAGE评价缀合效率，从而允许比较游离MAb片段与缀合物；缀合效率一般对于C225是30-50％并且对于EMD72000是40-60％。为掺入包含制备的脂质体药物和探针或商品聚乙二醇化的脂质体多柔比星的预制脂质体，通过在55℃共孵育30分钟将形成胶束溶液的MAb片段缀合物(Fab’-Mal-PEG-DSPE)掺入脂质体。作为结果，缀合物通过疏水DSPE结构域与脂质体的脂质外层接合。通过Sepharose CL-4B凝胶过滤法将未掺入的缀合物和游离药物与免疫脂质体分开。当使用DilC18(3)-DS标记的脂质体时，小于5％的荧光与胶束级分共缔合，这显示该标记的最小转移。如所述地使用一系列蛋白质标准品和凝胶扫描与定量法，通过SDS-PAGE评估缀合MAb片段的掺入效率。对于C225和EMD72000，一般而言，75-85％添加的MAb缀合物掺入免疫脂质体，这对应于每个脂质体30-40个Fab’片段。
3.研究设计
3.1 结合和内化研究
对于流式细胞术研究，将250,000个细胞在37℃与12孔板中的盐水(对照)、脂质体或以DilC18(3)-DS标记的靶向EGFR的免疫脂质体共孵育2小时，用PBS充分洗涤，随后分开并贮存在冰上直至进行流式细胞术。因而进行荧光显微镜术研究，除了从12孔平板移出细胞之外。
含有C225-Fab’的免疫脂质体比对照脂质体在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中显示高大约2个数量级的累积，所述对照脂质体在这些细胞中仅产生背景荧光水平。在多药抗性次级细胞系MDA-MB-231 Vb100中存在相似的模式。
也在过量表达EGFR的结肠癌HT-29细胞及其多药抗性次级细胞系HT-29 RDB中评价了含有C225-Fab’的免疫脂质体的结合和摄取。这里，免疫脂质体在过量表达EGFR的HT-29细胞中显示超过1个数量级的更多摄取并且在mdr细胞系HT-29 RDB中显示可比较的研究结果。在无EGFR过量表达的对照细胞系MCF-7中，非靶向的脂质体与抗EGFR免疫脂质体之间不存在摄取/结合的差异(数据未显示)。这些结果表明两个同基因细胞系中对免疫脂质体摄取的高度选择性，与这两个细胞系的mdr特征无关。
与对照脂质体孵育后靶细胞中最小荧光摄取的观察结果与聚乙二醇化脂质体的非反应特性一致((12)(40))，并且还证实DilC18(3)-DS可以用作基于脂质体的稳定标记，而没有明显交换至细胞膜中。
3.2 细胞毒性研究
在靶细胞中评价含有多柔比星的EGFR-靶向的免疫脂质体的特异性细胞毒性，其中所述的靶细胞以密度每孔8,000个细胞接种于96孔平板内并且使其生长过夜。在37℃应用免疫脂质体或对照治疗2小时，随后用PBS洗涤并重新添加生长培养基。细胞进一步在37℃孵育3日并使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)染色法(41)分析细胞成活力。对于使用排出泵抑制剂维拉帕米的细胞毒性研究，在整个实验期间这种化合物以100μM浓度添加至培养基。
在过量表达EGFR的HT-29野生型结肠癌细胞，处理2小时后，靶向EGFR的免疫脂质体多柔比星显示实质的体外细胞毒性(IC50＝0.25μg/ml)，这接近于游离多柔比星的体外细胞毒性(IC50＝0.3μg/ml)(表2)。因而，多柔比星的EGFR靶向免疫脂质体递送如游离多柔比星(一种在体外轻易横穿细胞膜的两亲性小分子)的快速扩散一样有效。另一方面，通过将C225-Fab’缀合至PLD所衍生的靶向EGFR的免疫脂质体多柔比星在HT-29细胞中比非靶向的PLD本身(未达到IC50)显示大得多的细胞毒性，表明递送过程是抗体依赖的(表2)。值得注意地，仅用抗体C225持续2小时的相似处理在这种测定法中不显示细胞毒性，这证实免疫脂质体活性归因于定向药物递送并且与C225在这个短暂孵育时间期间的潜在抗增殖作用不相关。另外，含有C225-Fab’但缺少所封装药物的免疫脂质体(“空的免疫脂质体”)在这些测试条件下类似地不显示细胞毒性。在缺少EGF受体的MCF-7细胞中也未见到C225-免疫脂质体-dox的作用(阴性对照；数据未显示)。
在多药抗性次级细胞系HT-29RDB中进行相同实验。值得注意地，在这种细胞系中，多柔比星的免疫脂质体递送(IC50＝0.5μg/ml)优于游离药物(IC50＝9.5μg/ml；＝19倍)并且还优于脂质体药物(未达到IC50)。汇总我们的这部分研究，尽管游离多柔比星在HT-29细胞系的多药抗性变体中与野生型细胞系相比具有低得多的细胞毒性，然而对于免疫脂质体化合物而言几乎不存在差异，与这种细胞系中的不同mdr特征无关，这表明免疫脂质体能够在这种环境下回避多药抗性机制。
也在以多药抗性为特征的过量表达EGFR的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 Vb100中评价了使用多柔比星的免疫脂质体介导的细胞毒性并且与使用缺少mdr的其亲本细胞系MDA-MB-231的结果比较。在亲本野生型MDA-MB-231中，含有C225-Fab’的ILs与游离多柔比星本身一样有效地递送多柔比星，其也可以轻易穿透细胞膜并且比非靶向的脂质体多柔比星/PLD明显具有更强细胞毒性(IC50＝0.3μg/ml，相对于0.6μg/ml，相对于120μg/ml)。
令人感兴趣地，在高度药物抗性MDA-MB-231 Vb100细胞系中，载有多柔比星(dox)的ILs产生比游离多柔比星高216倍的细胞毒性，并且也比非靶向的脂质体多柔比星具有明显更高的细胞毒性(IC50＝0.6μg/ml，相对于130μg/ml，相对于大于900μg/m)。
在维拉帕米的存在下重复抗性MDA-MB-231 Vb100细胞中的相同实验。维拉帕米能够抑制排出泵并因而逆转多药抗性的特定机制。实际上，通过添加维拉帕米至这个实验，能有效地转变多药抗性机制，并且因而游离多柔比星如在野生型MDA-MB-231细胞系中那样有效(IC50＝0.9μg/ml)。相反，维拉帕米的添加没有进一步提高由抗EGFR免疫脂质体递送的多柔比星的效力(IC50＝0.5μg/ml)，因而证实了我们的研究结果：ILs能够克服多药抗性机制并且该递送系统不受排出泵存在的影响。
表2：细胞毒性研究的汇总结果
PLD非靶向的脂质体多柔比星
C225-ILs-dox C225抗体靶向的脂质体多柔比星
3.3 多柔比星在细胞浆和胞核中的累积
对于比较性累积研究，肿瘤细胞(HT-29、HT-29 RDB、MDA-MB-231或MDA-MB-231 Vb100)以每孔200,000个细胞的密度接种在12孔板中。游离多柔比星、非靶向的脂质体多柔比星(PLD)和免疫脂质体多柔比星已经以3μg/ml多柔比星浓度在37℃应用了2小时，随后用培养基进行2轮洗涤。维拉帕米以0、10或100μM浓度添加至实验。在无任何处理下孵育另外2小时后，如下分析细胞：
在移去培养基后，细胞用1ml含有FCS的培养基洗涤一次，随后用1ml含钙和镁的PBS在室温(RT)3分钟。将PBS用400μl C100T溶液(100ml含有2.1g柠檬酸和0.5ml Tween 20)替换。以300转/分钟振摇10-15分钟引起细胞膜溶解和释放细胞核，如显微镜术所证实。将每孔的全部内容物转移至0.5ml透明PCR管并在室温和1200rcf离心5分钟。以这种方式，胞核将沉积在管底尖处，这对后续加工是重要的。为确定细胞浆中的多柔比星，取出350μl上清液并与350μl酸性甲醇(含有1M正磷酸的甲醇)混合。对于多柔比星的胞核累积，含有胞核的沉淀物用500μl含有1％C100T的PBS洗涤两次并且利用如前所述的后续离心法离心。在仔细移去最终上清液后，来自沉淀物的多柔比星由400μl 50％酸性甲醇过夜提取。
从细胞浆提取物和胞核提取物转移300μl至96孔平板并通过“SpertraMax Gemini Fluorimeter”(Molecular Devices)测量。
3.4 肿瘤异种移植物模型
在MDA-MB-231野生型和抗性乳腺癌异种移植物肿瘤模型中研究非靶向的脂质体相对于抗EGFR免疫脂质体的效力。Swiss nu/nu小鼠(5-6周；Charles River，法国)以过量表达EGFR的MDA-MB-231肿瘤细胞(1x107个细胞，野生型或抗性)皮下(s.c.)注射至动物背部。一旦肿瘤异种移植物已经建立并且和肿瘤测量为150-250mm3，将小鼠随机分配至不同处理组(根据研究，8-10只动物/组)。全部静脉内治疗通过尾静脉注射，一般以100-200μl体积进行。脂质体和抗EGFR免疫脂质体(C225-和EMD72000-)以剂量10mg多柔比星/kg/剂静脉内施用3周，每周1次，总剂量30mg dox/kg。游离药物按照与脂质体或免疫脂质体相同的时间进度表以30mg dox/kg多柔比星MTD进行静脉内注射。在对照组中，盐水以相同注射体积和时间进度表静脉内施与。
肿瘤植入后监测肿瘤生长55-100日。小鼠一周三次称重并就毒性进行检查。使用卡尺每周2-3次进行肿瘤测量，并且使用等式：(长度X宽度2)/2计算肿瘤体积。
在缺少mdr特征的野生型MDA-MB-231异种移植物模型中，以分成10mg/kg的周剂量三次的30mg dox/kg总剂量静脉内施用抗EGFR免疫脂质体-dox。从抗EGFR MAb C225或从EMD 72000制备抗EGFR免疫脂质体。对照治疗包括：剂量和时间进度表与免疫脂质体相同的盐水；游离多柔比星和非靶向的脂质体多柔比星(商业聚乙二醇化的脂质体多柔比星；PLD)。
与盐水治疗相比时，游离多柔比星产生一些肿瘤生长抑制。通过PLD实施的多柔比星非靶向脂质体递送在这个高剂量上诱导肿瘤消退和胜过游离药物的明显提高的效力。用抗EGFR免疫脂质体-dox的治疗，无论使用C225或EMD72000，引起实质的肿瘤消退并且总体上是最有效的治疗。直到第77日，对于PLD组、G225-ILs-dox组和EMD72000-ILs-dox组而言肿瘤消退是相似的。然而，在追踪期间，用非靶向PLD治疗的肿瘤均开始重新生长而用免疫脂质体多柔比星即C225-ILs-dox和EMD72000-ILs-dox治疗的肿瘤不显示生长活动直至观察结束(第100日)，表明了如以往在其他异种移植物肿瘤模型中报道的抗EGFR免疫脂质体的治愈性潜力。
在以非常相似的EGFR过量表达(数据未显示)、但额外地以多药抗性为特征的MDA-MB-231 Vb100异种移植物模型中重复相同实验。再次，以分成10mg/kg三次周剂量的30mg dox/kg总剂量静脉内施用从C225或EMD72000衍生的抗EGFR免疫脂质体-dox。比较物包括：剂量和时间进度表与免疫脂质体相同的盐水；游离多柔比星和非靶向的脂质体多柔比星(商业聚乙二醇化的脂质体多柔比星；PLD)。
在这个高度多药抗性模型中，与盐水治疗相比，游离多柔比星不显示任何肿瘤生长抑制作用。通过PLD实施的多柔比星的非靶向脂质体递送在这个高剂量上显示一些肿瘤生长抑制作用。有趣并且重要地，用抗EGFR免疫脂质体-dox的治疗，无论使用C225或EMD72000，引起实质的肿瘤消退并且总体上是最有效的治疗。与EMD72000-ILs-dox相比，C225-ILs-dox似乎是适度地更有效。然而，这仅是一种趋势并且不是统计显著的。总之，本试验的结果说明抗EGFR免疫脂质体甚至对多药抗性肿瘤是有效的并且可以克服mdr机制(见表3)。
在两种模型中，抗EGFR免疫脂质体-dox被小鼠充分耐受。用抗EGFR免疫脂质体-dox的治疗与没有大的体重损失相关：
表3：肿瘤异种移植物研究的结果
IC50(μg/ml) MDA-231 WT MDA-231 Vb100   MDA-231 Vb100维拉帕米
  PLD   120   ＞900   740
  游离多柔比星   0.6   130   0.9
  C225-ILs-dox   0.3   0.6   0.5
3.5 统计分析
为评价结果的统计显著性，分析了肿瘤体积并对每个时间点使用Student t检验(2样本单独的t检验)比较不同治疗组。此外，基于每只小鼠的秩总数进行多变量(秩)检验。在最后的治疗后的每个时间点上的肿瘤尺寸在该日的全部小鼠内进行秩评定并将秩加总。在每种情况下对两个治疗组通过2样本t检验比较秩总数(42)。
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和WO 98/07409。

Claims (49)

1.免疫脂质体，其包含识别并结合至实体瘤表面上的EGF受体抗原的抗体或抗体片段并且还在脂质体中封装了抗肿瘤化合物，用于多线治疗临床设立的人患者中的癌症，特别地由局部推进的或转移性肿瘤所代表的癌症。
2.根据权利要求1的免疫脂质体，其中所述肿瘤是EGFR阳性肿瘤。
3.根据权利要求1或2的免疫脂质体，其中脂质体封装了抑制细胞性化合物。
4.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中抗肿瘤化合物是选自以下的化合物：道诺霉素、伊达比星、米托蒽醌、丝裂霉素、顺铂和其他铂类似物、长春新碱、表柔比星、阿克拉霉素、氨甲蝶呤、依托泊苷、多柔比星、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和其他氟化嘧啶、嘌呤或核苷、尤其地吉西他滨、博来霉素、丝裂霉素、普卡霉素、放线菌素D、环磷酰胺和其衍生物、噻替派、BCNU、紫杉醇、多西他赛和其他紫杉烷衍生物和分离物、喜树碱、多肽、核酸、具有硫代磷酸酯核苷酸间键的核酸、和具有聚酰胺核苷酸间键的核酸。
5.根据权利要求4的免疫脂质体，其中细胞毒化合物是选自多柔比星、表柔比星和长春瑞滨的化合物。
6.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于二线治疗人患者。
7.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于三线治疗人患者。
8.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于四线治疗人患者。
9.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于五线治疗人患者。
10.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于六线治疗人患者。
11.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于七线治疗人患者。
12.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于多线治疗已经接受、但不应答所有可使用的标准疗法的患者群体。
13.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中肿瘤仍然正在进展。
14.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中患者已经发展了多药抗性。
15.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中治疗导致疾病的稳定化。
16.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中治疗导致部分应答。
17.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中治疗导致完全应答。
18.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中治疗显示没有或基本上没有毒性副作用。
19.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中治疗不显示皮肤毒性。
20.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中治疗不显示掌跖红斑(PPE＝手足综合征)。
21.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中治疗在5mg/m2和80mg/m2之间的浓度显示没有或基本上没有毒性副作用。
22.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中治疗在直到40mg/m2的浓度显示没有或基本上没有毒性副作用。
23.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中抗体或抗体片段共价地结合至脂质体膜。
24.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中抗体共价地缀合至与脂质体锚接的接头分子的末端。
25.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中接头分子是聚乙二醇。
26.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中抗体是针对EGF受体的结合配体的胞外结构域的单克隆抗体。
27.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于治疗临床设立的人患者中选自由卡波奇氏肉瘤、复发性卵巢癌、软组织肉瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、间皮瘤、泌尿道移行细胞癌、子宫内膜癌、胰腺癌、小细胞和非小细胞肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌、食管癌、结肠直肠癌、肛门癌、阴道癌、外阴癌、前列腺癌、皮肤的基底细胞癌、头颈癌和胆管癌组成的组中的癌症，所述癌症特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤代表。
28.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于治疗临床设立的人患者中选自由前列腺癌、胰腺癌、肾癌、膀胱上皮癌、食管癌、头颈癌、结肠直肠癌、肝细胞癌和间皮瘤组成的组中的癌症，所述癌症特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤代表。
29.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于多线治疗临床设立的人患者中的癌症，其中所述患者罹患前列腺癌，具有在激素和/或多西他赛和/或米托蒽醌治疗下已经进展的肿瘤。
30.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于多线治疗临床设立的人患者中的癌症，其中所述患者罹患胰腺癌，具有在吉西他滨和/或卡培他滨和/或奥沙利铂治疗下已经进展的肿瘤。
31.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于多线治疗临床设立的人患者中的癌症，其中所述患者罹患肾癌，具有在干扰素和/或卡培他滨和/或舒尼替尼和/或索拉菲尼治疗下已经进展的肿瘤。
32.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于多线治疗临床设立的人患者中的癌症，其中所述患者罹患食管癌，具有在顺铂和/或5-FU和/或多西他赛和/或西妥昔单抗治疗下已经进展的肿瘤。
33.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于多线治疗临床设立的人患者中的癌症，其中所述患者罹患结肠癌和/或直肠癌，具有在西妥昔单抗和/或贝伐单抗和/或奥沙利铂和/或伊立替康和/或卡培他滨和/或5-FU治疗下已经进展的肿瘤。
34.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于多线治疗临床设立的人患者中的癌症，其中所述患者罹患膀胱上皮癌，具有在顺铂或卡铂和/或吉西他滨和/或多柔比星和/或氨甲蝶呤和/或长春新碱治疗下已经进展的肿瘤。
35.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于多线治疗临床设立的人患者中的癌症，其中所述患者罹患间皮瘤，具有在顺铂或卡铂和/或吉西他滨和/或培美曲塞治疗下已经进展的肿瘤。
36.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于多线治疗临床设立的人患者中的癌症，其中所述患者罹患肝细胞癌，具有在舒尼替尼和/或索拉非尼治疗下已经进展的肿瘤。
37.根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，用于治疗临床设立的患有癌症、特别地患有由局部推进的或转移性肿瘤所代表的癌症的人患者，其中实现5％和95％之间的应答率。
38.药物组合物，其包含根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体和可药用载体或赋形剂或稀释剂，用于一线至多线治疗、特别地用于二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线、特别地六线、特别地七线和更高线治疗临床设立的人患者中的癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症。
39.一线至多线治疗、特别地二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线、特别地六线、特别地七线和更高线治疗临床设立的人患者中的癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症的方法，所述方法通过施用根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体或药物组合物至所述人患者而实施。
40.治疗患有癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症并且未经历过化学疗法的人患者、特别地治疗已经接受过、但不应答至少一种标准疗法、特别地至少二种标准疗法、特别地至少三种标准疗法，但是尤其地不应答所有可使用的标准疗法的患者的方法，所述方法通过施用根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体或药物组合物至所述人患者而实施。
41.使用根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体或药物组合物用来制备药物的方法，所述药物用于一线至多线治疗，特别地二线、特别地三线、特别地四线、特别地五线、特别地六线、特别地七线和更高线治疗临床设立的人患者中的癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症。
42.使用根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体或药物组合物用来制备药物的方法，所述药物用于治疗患有癌症、特别地由局部推进的或转移性肿瘤、特别地EGFR阳性肿瘤所代表的癌症并且未经历过化学疗法的人患者、特别地治疗已经接受过、但不应答至少一种标准疗法、特别地至少二种标准疗法、特别地至少三种标准疗法，但是尤其地不应答所有可使用的标准疗法的患者。
43.免疫脂质体，其包含识别并结合至实体瘤表面上的EGF受体抗原的抗体或抗体片段并且还在脂质体中封装了抗肿瘤化合物，用于治疗已经显现多药抗性的患者或患者群体中的多药抗性。
44.药物组合物，其包含根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体和可药用载体或赋形剂或稀释剂，用于治疗已经显现多药抗性的患者或患者群体中的癌症。
45.根据权利要求44的药物组合物，用于治疗乳腺癌。
46.根据权利要求44的药物组合物，用于治疗结肠直肠癌。
47.根据权利要求44的药物组合物，其中所述的多药抗性包含选自由以下药物组成的组中的一种或多种抗癌药物：多西他赛、米托蒽醌、吉西他滨、卡培他滨、奥沙利铂、干扰素、舒尼替尼、索拉菲尼、顺铂或卡铂、多柔比星、氨甲蝶呤、长春新碱、长春瑞滨、培美曲塞、吉非替尼、依托泊苷、伊立替康、环磷酰胺、托泊替康、环磷酰胺、紫杉醇、丝裂霉素、贝伐单抗、曲妥珠单抗、5-FU、西妥昔单抗、替莫唑胺、贝伐单抗、丙卡巴肼、CCNU和BCNU。
48.根据权利要求47的药物组合物，其中所述的多药抗性包含选自由以下药物组成的组中的一种或多种抗癌药物：多西他赛、米托蒽醌、吉西他滨、卡培他滨、奥沙利铂、舒尼替尼、索拉菲尼、顺铂、5-FU、西妥昔单抗、贝伐单抗、奥沙利铂和伊立替康。
49.药物组合物，其包含根据前述权利要求任一项所述的免疫脂质体，其中所述的免疫脂质体封装了多柔比星并且还包含抗体MAb C225或抗体EMD72000或其片段，其仍显示所述抗体之一者或两者的特异结合特性。
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