CN102188382A - 磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体，磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸与蛋黄卵磷脂的摩尔比为0.05％～0.15％，且所述脂质体的粒径小于150nm。制备方法为先将DSPE-PEG2000-FA制备成胶束，然后再将其与紫杉醇纳米脂质体共同孵育得到。本发明的原料中不使用临床不允许使用的材料。该脂质体粒径小、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸的含量低，有良好的药物包封率和胶体稳定性，并可被叶酸(+)的敏感和耐药的卵巢癌细胞有效摄取，显示叶酸依赖性的细胞毒性，药效明显强于紫杉醇注射液。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗肿瘤的药物，具体涉及一种磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体及其制备方法；本发明还涉及所述脂质体在制备治疗卵巢癌药物方面的应用。
背景技术
细胞毒性药物在对肿瘤进行化疗时，常因药物不能在肿瘤部位达到有效浓度而导致化疗失败，同时也会增加毒副作用。
卵巢癌是妇科肿瘤的元凶，死亡率很高。因为卵巢癌＞90％为叶酸受体阳性表达，表达量高，而正常卵巢上皮叶酸受体阴性，在叶酸受体(叶酸)介导的卵巢癌靶向治疗中，将药物与叶酸结合，利用叶酸受体在肿瘤细胞的过度表达，以叶酸受体为作用靶点，即可将药物主动靶向肿瘤细胞，从而提高药物在肿瘤组织分布，达到靶向诊断、治疗的目的。
紫杉醇是临床常用的有效治疗卵巢癌的药物。纳米技术是药物传输的良好工具和载体：方法新颖，装载药物量大，体积小易于进入细胞；在机体内可被生物降解从而不造成对机体毒害。因此叶酸偶联纳米紫杉醇脂质体是对卵巢癌非常有效的靶向治疗药物。
以下文献报道了不同的叶酸-紫杉醇脂质体及其制备方法：
1、Yuan H，Miao J，Du YZ，et al.Cellular uptake of solid lipid nanoparticles and cytotoxicity of encapsulated paclitaxel in A549cancer cells.Int J Pharm.2008Feb 4；348(1-2)：137-45Yuan中，分别制备了聚乙二醇修饰的紫杉醇脂质体和叶酸偶联紫杉醇脂质体。
但是该方法制备的脂质体有如下缺点：
一是制备脂质体所用的原料仅有硬脂酸，缺乏胆固醇等对脂质体膜起稳定作用的物质，造成脂质体膜的流动性较强，包封的药物容易泄漏；
二是叶酸偶联紫杉醇脂质体仅将叶酸与脂肪酸相连接，中间没有聚乙二醇连接，制成的脂质体在体内代谢过快，影响药效，而不具备长循环脂质体延缓药物代谢，增加体内循环时间等优越性；
三是制成的两种脂质体粒径均较大，分别为374.3±54.9nm，369.3±49.3nm，所以药效很低：对A549细胞(肺腺癌细胞)的IC50分别为1.86±0.13μg/ml，0.21±0.02μg/ml。远大于本发明制备的叶酸偶联纳米紫杉醇的粒径140.5±10.3nm，及对SKOV 3细胞的IC50 0.027±0.002μg/ml，药效远低于本发明的药物。
2、A folatere ceptor-targeted liposomal formulation for paclitaxel Jun Wu，Qing Liu，Robert J.Lee.A Folate receptor-targeted liposomal formulation for paclitaxe l[J].International Journal of Pharmaceutics.316(2006)：148 153。其制备中先将DSPE-PEG-FA(磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸)放入脂材中，然后用薄膜分散-挤压法制备叶酸偶联纳米紫杉醇脂质体。在容器中分别加入紫杉醇、磷脂、胆固醇和无水乙醇，溶解后除去乙醇，当容器内容物呈薄膜状附着于容器壁时，加入水并进行超声波震荡，然后将所得混合物用挤压器通过0.1um的微孔滤膜，即得紫杉醇纳米脂质体混悬液；
该方法制备的脂质体有如下缺点：
一是所得到的脂质体连接叶酸前后的粒径变化较大，加靶前紫杉醇脂质体粒径在60nm左右，加靶后增大约30nm左右。原因在于制备中DSPE-PEG-FA(磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸)的FA侧(即亲水性的靶头叶酸端)在制备中有可能隐藏于脂质体内部(位于双层磷脂之间的水相中)，可能会减弱叶酸的靶向能力；
二是药效也较低，对KB细胞(人口腔鳞癌细胞)的IC50为0.048um；而本发明制备的药物与文献1的包封率相近，对SKOV3细胞的IC50仅为0.036nm。
三是磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸在脂质体中含量较高，与磷脂的摩尔比达0.5％，由于其中的叶酸可与人体内的叶酸受体结合，而导致用药者正常叶酸摄入的不足，引起疾病，如巨幼细胞性贫血，周围神经病。
3、A Folate Receptor Targeted Lipid Nanoparticle Formulation for a Lipophilic Paclitaxel Prodrug
Phillip J.Stevens，Ma saru Sekido，Robert J.Lee.A Folate Receptor Targeted Lipid Nanoparticle Formulation for a Lipophilic Paclitaxel Prodrug[J].Pharmaceutical Research.21(2004)：2153-2157
该文献中的药物是合成产物，将Paclitaxel-CHOL(紫杉醇-胆固醇)进行化合连接，合成所得药物药效非常低，对KB细胞的IC50仅为0.61um。可能因紫杉醇-胆固醇合成物严重影响紫杉醇的药效。
4、Preparation and characterization of methoxy poly(ethylene glycol)/poly(e-caprolactone)amphiphilic block copolymeric nanospheres for tumor-speci□c folate-mediated targeting of anticancer drugs
Eun Kyoung Park，Sang Bong Lee，Young Mong Lee.Preparation and characterizat ion of methoxy poly(ethyleneglycol)/poly(e-caprolactone)amphiphilic block copolymericnanospheres for tumor-speci□c folate-mediated targeting ofanticancer drugs.Biomatrials.26(2005)：1053-1061.
此方法的合成原料中，使用PCL聚己内酯，这是一种常用于研究的合成支架聚合物，因为生物相容性不好，未被批准临床应用。
5、叶酸靶向紫杉醇纳米脂质体的制备及其生物学效应的研究(苏州大学2008届放射医学毕业生汪梅花的毕业论文，导师许玉杰)
文献中提到使用吐温-80协助DSPE-PEG-FA进入脂质体中，未测包封率，而合成药物对KB细胞的IC50为0.095um，药效低于文献2。
因为上述文献方法所制备的叶酸-紫杉醇纳米脂质体或者药效较低，影响了临床的使用效果，或使用不允许临床使用的物质。因此有必要开发出新的叶酸-紫杉醇纳米脂质体的制备方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点，不使用未被批准临床允许使用的材料，制备出粒径小、药效高的叶酸偶联纳米紫杉醇脂质体，用于治疗卵巢癌。
本发明提供了一种磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体，制备该脂质体的原料为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸、紫杉醇、蛋黄卵磷脂和胆固醇，其特征是磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸与蛋黄卵磷脂的摩尔比为0.05％～0.15％，且所述脂质体的粒径小于150nm。
上述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体的制备方法，其步骤是：
1)制备磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸胶束
将磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸(以下简称DSPE-PEG2000-FA)溶解于甲醇和氯仿混合溶液(1∶9，体积比)，加入蒸馏水进行水浴超声乳化后，除去甲醇和氯仿，得到澄明DSPE-PEG2000-FA胶束溶液。
2)用薄膜分散-挤压法制备纳米紫杉醇脂质体混悬液
在容器中分别加入紫杉醇、蛋黄卵磷脂、胆固醇和无水乙醇，溶解后除去乙醇，当容器内物呈薄膜状附着于容器壁时，加入水并进行超声波震荡，然后将所得混合物用挤压器通过0.1um的微孔滤膜，即得紫杉醇纳米脂质体混悬液，呈细小油滴悬浮于水中。
如果需要得到用于细胞实验中激光共聚焦显微镜动态观察药物在癌细胞内的富集过程的样品，此步骤中，还可加入异硫氰酸荧光素作为荧光指示剂。
如果需要得到冻干制剂，此步骤中，还可以将所得混悬液加入适量蔗糖，经冷冻干燥制成冻干制剂。
3)采用共孵育法制备DSPE-PEG2000-FA修饰的叶酸偶联纳米紫杉醇药物
将步骤1所得胶束溶液和步骤2所得混悬液混合，置60℃环境中1小时，得到DSPE-PEG2000-FA修饰的紫杉醇纳米脂质体药物，为混悬液。
本发明的有益效果：
1、叶酸-紫杉醇纳米脂质体药物粒径小
粒径测定：以水为分散介质，稀释约20倍后，用激光粒度测定仪测得平均粒径为140.5±10.3nm，多分散指数(PDI)0.263±0.061，
粒径在150nm以下可有效逃避非网状内皮系统(RES)的捕获，增强药效。
而文献1的两种脂质体粒径分别是374.3±54.9nm和369.3±49.3nm。
2、紫杉醇脂质体连接叶酸前后粒径变化小
DSPE-PEG2000-FA为两亲性线型聚合物，一端DSPE链为亲脂性，另一端为亲水性。在DSPE-PEG2000-FA修饰脂质体形成过程中，DSPE端可与磷脂膜结合，FA作为靶头暴露在脂质体表面，既增加了脂质体的体内循环时间，又可靶向作用于高表达叶酸受体的病变部位。
因为本发明首先制备了磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸的胶束，胶束的脂相磷脂酰乙醇胺侧与脂质体的脂相外层磷脂间融合(即亲脂性端直接插入磷脂膜)。这样，可使亲水性的靶头FA侧(即磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸的的叶酸一端)全部在脂质体外，可以充分发挥叶酸的靶向能力。而现有技术的方法(如背景技术中所述文献2)由于没有先制备胶束，会有部分叶酸端存在于双层磷脂之间，脂质体粒径增大30nm，而减弱叶酸的靶向能力，降低药效。
本发明的脂质体经测定，连接叶酸后，较步骤1所得的纳米紫杉醇的粒径(121.6±12.7nm，PDI 0.262±0.031)仅增大19nm(见图2、图3)，但此差异无统计学意义(t值2.013；p值0.114；P＞0.05)。
3、脂质体中药物的包封率高，保证了药物的纯度和有效性
包封率的测定：采用葡聚糖凝胶(Sephadex G-50)柱过滤法分离未包封药物，测定吸光度，计算浓度和含药量，作洗脱曲线(见图1)。
按以下公式计算包封率：包封率＝脂质体含药量/(脂质体含药量+游离药物量)×100％。
测得包封率高达97％，比较原料药紫杉醇纳米脂质体的包封率99％无显著下降，符合文献(Shih-Jiuan Chiu，Shujun Liu，Danilo Perrotti.Efficient delivery of a Bcl-2-specific antisense oligodeoxy ribonucleotide(G3139)Via transferrin receptor-targeted liposomes[J].Journalof Controlled Release.2006：199 207)记载的＜2％～4％工艺标准，保证了药物的纯度和有效性。
4、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸比例低，仅0.1％，不会导致正常叶酸摄入的不足。
实施例中，制备所用原料紫杉醇∶蛋黄卵磷脂∶胆固醇∶DSPE-PEG2000-FA具体含量分别是2.5mg∶47.14mg∶11.60mg∶0.48mg，摩尔比为：紫杉醇∶蛋黄卵磷脂∶胆固醇∶DSPE-PEG2000-FA＝1∶45∶9∶0.045
其中DSPE-PEG2000-FA(磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸)与蛋黄卵磷脂的摩尔比是0.1％，小于背景技术中所述文献2中0.5％的比例，降低了由于磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸中的叶酸结合叶酸受体导致正常叶酸摄入的不足的副作用，如巨幼细胞性贫血，周围神经病等。
5、治疗卵巢癌的离体实验效果好
1)叶酸偶联纳米紫杉醇药物在卵巢癌细胞内的富集程度检测
用激光共聚焦显微镜动态观察叶酸偶联纳米紫杉醇药物在卵巢癌细胞内的富集过程，结果证实：叶酸偶联纳米紫杉醇药物对SKOV3细胞膜具有趋向性，药物在癌细胞细胞内富集。
2)叶酸偶联纳米紫杉醇药物的细胞毒效应分析
药物作用后细胞生长曲线结果表明：对敏感株细胞SKOV3、耐药株SKOV3/TAX细胞，叶酸偶联纳米紫杉醇的药效稍强于纳米紫杉醇。
3)MTT检测药物对卵巢癌细胞的杀伤作用
与纳米紫杉醇、市售紫杉醇注射液进行了对比，结果证实：叶酸偶联纳米紫杉醇对卵巢癌细胞(SKOV3细胞或SKOV 3/TAX细胞)的杀伤效果强度均明显高于对照药物纳米紫杉醇或普通紫杉醇。
4)流式细胞术测定细胞增殖和凋亡指数
结论：叶酸偶联纳米紫杉醇细胞凋亡率均明显高于对照药物纳米紫杉醇或普通紫杉醇。
5)电镜观察细胞形态学改变
结论：叶酸偶联纳米紫杉醇比对照药物纳米紫杉醇穿膜作用好，在细胞内聚集浓度高、杀伤作用更强。
6、治疗卵巢癌的动物体内实验效果好
1)裸鼠腹腔种植瘤卵巢癌模型
不给药的荷瘤裸鼠生存期约为35天，而给药后荷瘤裸鼠的生存期＞88天，证明了紫杉醇治疗卵巢癌具有非常好的疗效。
2)流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡
结果表明：腹腔给药凋亡晚期和坏死细胞比较多，肿瘤细胞杀伤效果腹腔组效果最好。
3)电镜观察肿瘤细胞形态学改变
结果表明：给药后肿瘤细胞形态学改变明显，出现明显的凋亡形态学改变。
上述细胞及动物实验表明：叶酸-紫杉醇纳米脂质体可靶向作用于肿瘤特异性叶酸受体，使传统的化疗药物和肿瘤特异性的抗体结合，增强了药物对肿瘤靶向选择，提高了疗效并减少药物的毒副作用，有很可观的临床应用前景。
总之，本发明提供了的靶向叶酸偶联纳米紫杉醇的新制剂及其制备方法。先将DSPE-PEG2000-FA制备成胶束，然后再将其与紫杉醇纳米脂质体共同孵育制备DSPE-PEG2000-FA修饰的紫杉醇纳米脂质体。该制剂有良好的药物包封率和胶体稳定性，并可被叶酸(+)的敏感和耐药的卵巢癌细胞有效摄取，显示叶酸依赖性的细胞毒性，药效明显强于紫杉醇注射液，同时该药腹腔注射抗肿瘤疗效明显优于静脉注射。为叶酸偶联纳米紫杉醇靶向治疗卵巢癌的临床应用提供了理论依据。
附图说明
图1是对本发明制备的叶酸-紫杉醇纳米脂质体药物进行包封率测定时的洗脱曲线图；
图2是本发明制备的叶酸-紫杉醇纳米脂质体药物进行粒径测定时所得的粒径透射电镜图，药物的粒径范围140.5±10.3nm，多分散指数(PDI)0.263±0.061；
图3是制备步骤1所得的纳米紫杉醇进行粒径测定时所得的粒径透射电镜图，粒径范围121.6±12.7nm。
图4SKOV3细胞叶酸受体免疫组化染色阳性40×；
图5SKOV3/TAX细胞叶酸受体免疫组化染色阳性40×；
图6无叶酸培养基中叶酸偶联纳米紫杉醇作用后SKOV3细胞死亡率；
图7加叶酸培养基中叶酸偶联纳米紫杉醇作用后SKOV3细胞死亡率；
图820min后叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SKOV 3细胞内的富集；
图940min后叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SKOV 3细胞内的富集；
图101h后叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SKOV3细胞内的富集；
图112h后叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SKOV3细胞内的富集；
图124h后叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SKOV3细胞内的富集；
图138h后叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SKOV3细胞内的富集；
图14细胞生长曲线；
图150.02μg/ml叶酸偶联纳米紫杉醇对SKOV3细胞作用12h后的细胞周期分布，凋亡率为2.36％；
图160.02μg/ml叶酸偶联纳米紫杉醇对SKOV3细胞作用24h后的细胞周期分布，凋亡率为15.88％；
图170.02μg/ml叶酸偶联纳米紫杉醇对SKOV3细胞作用48h后的细胞周期分布，凋亡率为32.81％；
图180.02μg/ml纳米紫杉醇对SKOV3细胞作用12h后的细胞周期分布，凋亡率为2.07％；
图190.02μg/ml纳米紫杉醇对SKOV3细胞作用24h后的细胞周期分布，凋亡率为10.55％；
图200.02μg/ml纳米紫杉醇对SKOV3细胞作用48h后的细胞周期分布，凋亡率为16.7％；
图210.02μg/ml紫杉醇注射液对SKOV3细胞作用12h后的细胞周期分布，凋亡率为0.11％；
图220.02μg/ml紫杉醇注射液对SKOV3细胞作用24h后的细胞周期分布，凋亡率为0.92％；
图230.02μg/ml紫杉醇注射液对SKOV3细胞作用48h后的细胞周期分布，凋亡率为1.17％；
图240.02μg/ml叶酸偶联纳米紫杉醇对SKOV3细胞作用12h后的细胞周期分布，凋亡率为2.36％；
图250.2μg/ml叶酸偶联纳米紫杉醇对SKOV3细胞作用12h后的细胞周期分布，凋亡率为6.34％；
图262μg/ml叶酸偶联纳米紫杉醇对SKOV3细胞作用12h后的细胞周期分布，凋亡率为7.42％；
图270.02μg/ml纳米紫杉醇对SKOV3细胞作用12h后的细胞周期分布，凋亡率为2.07％；
图280.2μg/ml纳米紫杉醇对SKOV3细胞作用12h后的细胞周期分布，凋亡率为2.57％；
图292μg/ml纳米紫杉醇对SKOV3细胞作用12h后的细胞周期分布，凋亡率为3.47％；
图300.02μg/ml紫杉醇注射液对SKOV3细胞作用12h后的细胞周期分布，凋亡率为0.11％；
图310.2μg/ml紫杉醇注射液对SKOV3细胞作用12h后的细胞周期分布，凋亡率为0.62％；
图322μg/ml紫杉醇注射液对SKOV3细胞作用12h后的细胞周期分布，凋亡率为0.94％；
图332μg/ml叶酸偶联纳米紫杉醇作用于SKOV3细胞24h后的细胞周期分布，凋亡率为32.48％；
图342μg/ml叶酸偶联纳米紫杉醇作用于SKOV3/TAX细胞24h后的细胞周期分布，凋亡率为13.4％；
图35纳米紫杉醇作用SKOV3细胞后的电镜图；
图36叶酸偶联纳米紫杉醇作用SKOV3细胞后的电镜图；
图37纳米紫杉醇作用SKOV3/TAX细胞后的电镜图；
图38叶酸偶联纳米紫杉醇作用SKOV3/TAX细胞后的电镜图；
图39裸鼠腹腔注入SKOV3细胞后5周，可见裸鼠腹腔内有粟粒样病灶，分布于肠管表面；
图40腹腔病灶HE染色后×10镜下证实为卵巢浆液性上皮性腺癌；
图41对照组裸鼠肿瘤细胞流式散点图；
图42对照组裸鼠肿瘤细胞流式象限图；
图43腹腔组裸鼠肿瘤细胞流式散点图；
图44腹腔组裸鼠肿瘤细胞流式象限图；
图45静脉组裸鼠肿瘤细胞流式散点图；
图46静脉组裸鼠肿瘤细胞流式象限图；
图47给药4天后对照组细胞凋亡坏死改变；
图48给药7天后对照组细胞凋亡坏死改变；
图49给药2天后腹腔组细胞凋亡坏死改变；
图50给药7天后腹腔组细胞凋亡坏死改变；
图51给药2天后静脉组细胞凋亡坏死改变；
图52给药4天后静脉组细胞凋亡坏死改变；
图53给药7天后静脉组细胞凋亡坏死改变。
具体实施方式
实施例1叶酸偶联纳米紫杉醇药物的制备(一)
1.仪器与材料
1.1仪器
高效液相色谱仪(ShimadzuLC-10AT，日本岛津，包括SPD-10A紫外检测)；N2000色谱工作站(浙江智达)；Zetasizer3000激光粒子测定仪(英国马尔文)；超声波清洗机(JP-010S，深圳洁盟)；冷冻干燥机(FD-1A-50，成都比朗)；旋转蒸发仪(RE-501，北京来亨)；电热恒温干燥箱(101-3，北京久恒隆)
1.2药品
紫杉醇(南京康海制药有限公司，含量98.6％)；蛋黄卵磷脂(德国avanti polar lipids公司)；胆固醇(国药集团化学试剂有限公司)；磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸(德国avanti polar lipids公司)；紫杉醇对照品(中国药品生物制品检定所，含量99.08％)；甲醇、乙腈均为色谱醇，其他试剂为分析纯。
2.制备过程
2.1纳米紫杉醇(紫杉醇脂质体)药物的制备
处方：紫杉醇2.5mg：蛋黄卵磷脂47.14mg：胆固醇11.60mg：DSPE-PEG2000-FA0.48mg，FITC 0.5mg(摩尔比为：紫杉醇∶蛋黄卵磷脂∶胆固醇∶DSPE-PEG2000-FA＝1∶45∶9∶0.045)。
精密取处方量紫杉醇/紫杉醇+异硫氰酸荧光素(FITC 0.5mg)、蛋黄卵磷脂和胆固醇置茄形瓶中，加入20mL无水乙醇，水浴超声使药物和脂材溶解，于45℃旋转蒸发减压除去乙醇。加入适量水30℃水浴超声波震荡30min，用挤压器将脂质体依次过0.8um，0.4um，0.2um，0.1um的微孔滤膜，即得紫杉醇脂质体混悬液。加入适量蔗糖，经冷冻干燥制成冻干制剂。
2.2DSPE-PEG2000-FA胶束的制备
采用超声乳化-溶剂挥发法制备DSPE-PEG2000-FA胶束。将1mgDSPE-PEG2000-FA溶解于甲醇和氯仿混合溶液((1∶9，体积比))，加入约5.3ml蒸馏水水浴超声乳化，除去甲醇和氯仿，得到澄清透明DSPE-PEG2000-FA胶束溶液。
2.3DSPE-PEG2000-FA修饰的叶酸偶联纳米紫杉醇药物的制备
采用共孵育法制备DSPE-PEG2000-FA修饰的纳米紫杉醇药物。精密量取处方量的紫杉醇脂质体混悬液和DSPE-PEG2000-FA胶束溶液，充分混合，置60℃的电热恒温干燥箱1小时，即得DSPE-PEG2000-FA修饰的紫杉醇纳米脂质体混悬液。
3.产物叶酸-紫杉醇纳米脂质体药物的鉴定
3.1鉴定方法
3.1.1粒径测定
取制备的脂质体混悬液和胶束适量，以水为分散介质，稀释约20倍后，用激光粒度测定仪测定样品的平均粒径。
3.1.2包封率的测定
采用葡聚糖凝胶(Sephadex G-50)柱过滤法分离未包封药物，取脂质体混悬液0.5ml上柱分离，以水为洗脱液洗脱，流速控制为0.8～1.0mL/min；以每隔2min分管接收洗脱液，共接取16份，分别稀释至一定浓度后；对所有样品于227nm测定吸光度，计算浓度和含药量，作洗脱曲线，见图1。
含脂质体的接收液合并后以无水乙醇破乳，稀释至一定浓度后。测定含量，按以下公式计算包封率：
包封率＝脂质体含药量/(脂质体含药量+游离药物量)×100％。
3.1.3紫杉醇标准品溶液的配制、色谱测定及标准曲线的生成
准确称取10mg紫杉醇标准对照品，用甲醇溶解后定容，得到1000mg/L的紫杉醇标准溶液，再用甲醇稀释配制成100、50、25、10、5mg/L的标准溶液系列，4℃避光保存。
色谱条件：色谱柱DiamonsilC18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈∶甲醇∶水(40∶12∶48)；流速：1.0ml/min；检测波长：227nm；柱温40℃。
标准曲线和线性范围：取配制的紫杉醇标准溶液，按色谱条件进样，录色谱峰并对其积分、分析，以峰面积area(Y)和质量浓度concentration(X)作出标准曲线，进行回归确定线性范围，得出标准曲线方程为：Y＝19946X+2617，r＝0.999。线性范围为5～100mg/L。
3.1.4统计学处理
采用Spss16.0软件，对不同数据进行方差分析、t检验及X2检验。
3.2鉴定结果
3.2.1所得产物的粒径
终产物叶酸偶联纳米紫杉醇药物的粒径(140.5±10.3)nm，多分散指数(PDI)0.263±0.061，较步骤1所得的纳米紫杉醇的粒径(121.6±12.7nm，PDI 0.262±0.031)仅增大19nm，但此差异无统计学意义(t值2.013；p值0.114；P＞0.05)。叶酸偶联纳米紫杉醇粒径仍控制在150nm以下，可有效逃避非网状内皮系统(RES)的捕获，增强药效。见图2、图3。
3.2.2包封率
叶酸-紫杉醇纳米脂质体药物的包封率高达97％，比较原料药紫杉醇纳米脂质体的包封率99％无显著下降，符合＜2％～4％工艺标准，保证了药物的纯度和有效性。
实施例2叶酸偶联纳米紫杉醇药物的制备(二)
方法同实施例1，但制备纳米紫杉醇脂质体时，原料中不加异硫氰酸荧光素(FITC)，其它材料同实施例1。
实验例1叶酸偶联纳米紫杉醇靶向治疗卵巢癌的体外细胞实验研究
1.实验材料
SKOV3细胞，军事医学科学院李春海教授馈赠；
SKOV3/TAX，本实验室诱导，方法按Sudimack JJ，Adams D，Rotaru J，et al.Folate receptor- mediated liposomal delivery of a lipophilic boron agent to tumor cells in vitro for neutron capture
BALB/c雌裸鼠，购自北京大学医学部动物部；
培养液RPM I-1640(Sigma)、无叶酸RPM I-1640培养液(GIBCO)、叶酸受体单克隆抗体MOV18(Enzo life Science)、凋亡检测试剂盒均购自北京宝赛公司；
叶酸偶联纳米紫杉醇：实施例1。
2.实验方法
2.1免疫组化染色筛查卵巢癌叶酸受体阳性细胞株
参照文献(M R Buist，C F M Molthoff，P Kenemans，et al.Distribution of OV-TL 3and MOv18in normal and malignant ovarian tissue[J]J Clin Pathol 1985；48：631-636methods[J].Cancer Res，1990，50(2)：3218-3223)的方法，免疫组化染色筛查卵巢癌叶酸受体阳性细胞株。阳性细胞表现为胞膜着色(棕黄色)。
2.1.1SKOV3细胞爬片入丙酮固定10分钟。PBS冲洗，5分钟×3。
2.1.2用3％过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×3。
2.1.3正常动物非免疫血清工作液封闭，室温孵育30分钟，倾去血清，勿洗。
2.1.4滴加适当比例稀释的MOV18，37℃孵育1小时。PBS冲洗，5分钟×3。空白对照为不加一抗，其他步骤相同。
2.1.5滴加生物素标记的二抗工作液，37℃孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。
2.1.6滴加链亲和素-过氧化酶工作液，37℃孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。
2.1.7滴加新鲜配制的DAB工作液，显微镜下观察5-10min。MOV-18单抗免疫组化染色结果如图4、图5示。
2.1.8自来水冲洗，苏木素复染，脱水，中性树胶封片。
2.2检测游离叶酸对于叶酸偶联纳米紫杉醇药物的干扰作用
参照文献(Paranjpe PV，Chen Y，Kholodovych V，et al.Tumor-targeted bio-conjugate based delivery of camptothecin：design，synthesis and in vitro evaluation.J Control Release，2004，100(2)：275 292)原理设计实验。因叶酸偶联纳米紫杉醇对SKOV3细胞的杀伤作用是由叶酸受体介导的，则培养基内加入叶酸会与叶酸受体竞争性结合而降低药物对细胞的杀伤效果。
2.2.1将浓度为0.025μg/ml叶酸偶联纳米紫杉醇药物作用于对数生长期的SKOV3细胞(培养基为加入1mM/L叶酸的1640)，对照组细胞采用无叶酸1640培养基。
2.2.224h后用0.25％胰酶消化细胞使待测细胞浓度为1.5×106/ml。取1ml细胞，在4℃下1000r/min离心10min，弃上清。
2.2.3加入1ml冷PBS液，轻轻震荡使细胞悬浮，在4℃下1000r/min离心10min，弃上清。重复该步骤两次。
2.2.4将细胞重新悬浮于500μl Binding Buffer。
2.2.5加入20μl碘化丙啶(PI)，避光室温反应，1小时内上流式细胞仪检测细胞凋亡率，无叶酸组细胞死亡率明显高于加叶酸组细胞，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1，图6、图7。
表1叶酸偶联纳米紫杉醇作用后SKOV3细胞的凋亡率
| 凋亡细胞数 | 总细胞数 | 凋亡率 | |
| 加叶酸组 | 272 | 23444 | 1.16％* |
| 无叶酸组 | 1148 | 7823 | 14.67％ |
*P＜0.01加叶酸组vs无叶酸组
本实验的原理是叶酸偶联纳米紫杉醇与叶酸竞争性结合癌细胞上的叶酸受体，故加叶酸组，药物对细胞的杀伤率较低，定量的间接验证叶酸偶联纳米紫杉醇确实是通过叶酸受体起作用的。
卵巢浆液性乳头状囊腺癌SKOV3细胞及其耐药株SKOV3/TAX细胞均为叶酸(+)细胞，可介导叶酸纳米紫杉醇药物通过叶酸受体介导的胞吞作用富集于细胞内，发挥抗肿瘤效果。细胞培养基中加入游离叶酸封闭叶酸受体可明显降低叶酸纳米紫杉醇药物对细胞的杀伤作用，也进一步证明了药物对细胞的作用是由细胞表面的叶酸受体介导的。文献报道约93％的卵巢癌患者中过表达叶酸(林凤云，朱照静.叶酸受体介导的靶向给药研究进展.国外医学药学分册.2006，33(3)：178-181)，故本实验中使用卵巢癌细胞模型来探讨叶酸偶联纳米紫杉醇对卵巢癌的靶向治疗作用更接近临床实际，有一定的临床意义。
2.3叶酸偶联纳米紫杉醇药物在卵巢癌细胞内的富集
实验方法：用激光共聚焦显微镜动态观察叶酸偶联纳米紫杉醇药物在卵巢癌细胞内的富集过程，具体方法参照文献(Jun Wu，Qing Liu，Robert J.Lee.A Folate receptor-targeted liposomal formulation for paclitaxel[J].International Journal of Pharmaceutics.316(2006)：148 153)。
操作步骤为：将浓度为0.01mg/ml的异硫氰酸荧光素FITC标记的叶酸偶联纳米紫杉醇药物加入贴壁生长的SKOV3细胞中。药物分别作用20min，40min，1h，2h，4h，8h后，倒掉培养液，用PBS液冲洗2次，加入4％多聚甲醛4℃固定。12h后倒掉固定液，加入甘油/PBS混合液封片，激光共聚焦显微镜下动态观察叶酸(+)的SKOV3细胞通过叶酸主动摄取叶酸偶联纳米紫杉醇药物的过程，即药物被细胞内吞的过程和药物富集于肿瘤细胞的浓度。
结果：
随叶酸偶联纳米紫杉醇药物对SKOV3细胞作用时间的延长，细胞内药物浓度越来越大；同时在各时间点都观察到细胞膜处药物浓度聚集，说明叶酸偶联纳米紫杉醇药物对细胞膜的趋向性，肿瘤细胞对药物的摄取是通过叶酸受体介导的。但随着时间的推移，细胞膜上的叶酸受体饱和后，将会影响药物的继续吸收，表现为胞膜处荧光强度相对减弱。见图8-13(叶酸偶联纳米紫杉醇药物在SKOV3细胞内的富集过程)。图8-13示随着药物作用时间延长，肿瘤细胞内绿色荧光强度逐渐增强，胞浆轮廓越来越清晰，胞膜处绿色荧光聚集以4h最强，8h开始减弱。
结论：叶酸偶联纳米紫杉醇药物对SKOV3细胞膜具有趋向性，药物在癌细胞细胞内富集。
2.4叶酸偶联纳米紫杉醇药物的细胞毒效应分析
2.4.1药物作用后细胞生长曲线
取对数生长期的SKOV3细胞、SKOV3/TAX细胞，分别用0.25％胰酶消化后制成1×104/ml的单细胞悬液，以每孔1ml接种于24孔细胞培养板上。24小时后弃培养液，分三组加入含药培养液，空白组不加药，对照组加0.2μg/ml纳米紫杉醇注射液，实验组加0.2μg/ml叶酸偶联纳米紫杉醇。加药后每隔48h换相同培养液一次，每隔24h计数1次，每次每组计数3孔的细胞，取平均数，连续7d。绘制细胞生长曲线，按Patterson公式(Yang LY，Trujillo JM.Biological characterization of multidrug resistant human colon carcinoma sublines induced by two)计算细胞在对数生长期的细胞群体倍增时间(TD)。
结果表明：对敏感株细胞SKOV3、耐药株SKOV3/TAX细胞，叶酸偶联纳米紫杉醇的药效稍强于纳米紫杉醇。但实验组与对照组细胞SKOV3及SKOV3/TAX生长速度均极慢，未出现明显对数生长期。见图14细胞生长曲线。
2.4.2MTT检测药物对卵巢癌细胞的杀伤作用
实验分组用药物如下：
实验组：实施例2叶酸偶联纳米紫杉醇；
对照组1：纳米紫杉醇；(南京康海药业有限公司)
对照组2：市售紫杉醇注射液。(海南中化联合制药工业有限公司)
取对数生长期的卵巢癌敏感株SKOV3细胞、耐药株SKOV3/TAX细胞，浓度为4×104/ml，以每孔200μl接种于96孔细胞培养板，培养24h后弃培养基，分别加入含有叶酸偶联纳米紫杉醇(实验组)、纳米紫杉醇(对照组1)、紫杉醇注射液(对照组2)药物的培养液，药物浓度梯度均为200，20，2，0.2，0.02，0.002μg/ml，每孔设5个复孔。培养48h后弃含药培养液，每孔加20μlMTT(5mg/ml)。4小时后弃MTT，每孔加入150μlDMSO。振荡5min后，用自动酶标仪测492nm处各孔吸光度OD值。对照孔培养液中不加药，空白孔中为无细胞的培养基。计算细胞存活率(实验孔OD值/对照孔OD值X100％)，以浓度一存活曲线作回归方程，得出各种药物的半数抑制浓度(IC50)。见表2。
表2各种药物对两组细胞IC50值(μg/ml)
注：*p＜0.01(实验组vs对照组)，#p＜0.05(SKOV3vs SKOV3/TAX)
由表2可见，无论对于SKOV3细胞和SKOV3/TAX细胞来说，药效强度均为叶酸偶联纳米紫杉醇＞纳米紫杉醇＞紫杉醇注射液。三组之间的药效差别均有统计学意义(均p＜0.01)。紫杉醇和纳米紫杉醇注射液的药物浓度越大，细胞死亡越多，药效与药物浓度呈正相关；而叶酸偶联纳米紫杉醇的药物浓度为0.2，2μg/ml时细胞死亡比率相近(p＞0.05)，药物浓度为200μg/ml与20μg/ml(p＞0.05)时细胞几乎全部死亡。
比较敏感组与耐药组细胞之间的差异，三种药物对敏感株细胞SKOV3的杀伤效果均强于耐药株SKOV3/TAX细胞，有显著性差异(p＜0.05)。SKOV3/TAX细胞对以上三种药物的耐药指数分别为紫杉醇注射液RI＝10.33，纳米紫杉醇RI＝9.78，叶酸偶联纳米紫杉醇RI＝8.87，p＞0.05。虽三者间的差异无统计学意义，但叶酸偶联纳米紫杉醇有下降趋势。
结论：叶酸偶联纳米紫杉醇对卵巢癌细胞(SKOV3细胞或SKOV3/TAX细胞)的杀伤效果强度均明显高于对照药物纳米紫杉醇或普通紫杉醇。
2.4.3流式细胞术测定细胞增殖和凋亡指数
将浓度梯度为2，0.2，0.02μg/ml的叶酸偶联纳米紫杉醇(实验组)、纳米紫杉醇(对照组1)、紫杉醇注射液(对照组2)三种药物分别作用于对数生长期的SKOV3细胞及SKOV3/TAX细胞。作用12h，24h，48h后用0.25％胰酶消化细胞使待测细胞浓度为1.5×106/ml。取1ml细胞，在4℃下1000r/min离心10min，弃上清。加入300μl含5％胎牛血清的PBS液及700μl无水乙醇，-20℃固定48h。然后3000rpm离心30s，弃上清。加入1ml PBS液，3000rpm离心30s，弃上清。加入Rna seA(50mg/ml)200μl，37℃水浴30min。加入300μl碘化丙啶(PI)工作液(50mg/ml)，避光室温反应，1小时内上流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率。
结果表明，各组细胞凋亡率与药物种类、药物浓度和作用时间均有关。在相同药物浓度、相同作用时间时，叶酸偶联纳米紫杉醇组和纳米紫杉醇组细胞凋亡率明显高于紫杉醇注射液组，差别有显著意义(p＜0.05)，叶酸偶联纳米紫杉醇组较纳米紫杉醇组细胞凋亡率有增高趋势，但差别未达到统计学意义(p＞0.05)。相同药物在相同药物浓度时，作用时间越长，对细胞的损伤越大，即48h＞24h＞12h，差别均有显著意义(p＜0.05)。药物浓度越大，对细胞的杀伤作用也越强，(p＜0.05)。叶酸偶联纳米紫杉醇的药物浓度为0.2，0.02μg/ml时细胞死亡比率相近，药物浓度为200μg/ml与20μg/ml时细胞几乎全部死亡。同时，三种药物对敏感细胞的杀伤作用均比耐药细胞明显增强，(p＜0.05)。见表3-5，图15-34。
注：SKOV3/TAX细胞加药后的流式结果变化趋势图与SKOV3细胞类似，故不再附图。
表3给药12h后各组细胞凋亡率(％，
)
注：#p＜0.05(实验组vs对照组)，*p＜0.05(2μg/ml vs 0.02μg/ml)，⊙p＜0.05(SKOV3/TAX vs SKOV3)
表4给药24h后各组细胞凋亡率(％，
)
注：#p＜0.05(实验组vs对照组)，*p＜0.05(2μg/ml vs 0.02μg/ml)，⊙p＜0.05(SKOV3/TAX vs SKOV3)
表5给药48h后各组细胞凋亡率(％，
)
注：#p＜0.05(实验组vs对照组)，*p＜0.05(2μg/ml vs 0.02μg/ml)，⊙p＜0.05(SKOV3/TAX vs SKOV3)
结论：叶酸偶联纳米紫杉醇细胞凋亡率均明显高于对照药物纳米紫杉醇或普通紫杉醇。
2.4.4电镜观察细胞形态学改变
将浓度为0.2μg/ml的纳米紫杉醇注射液和叶酸偶联紫杉醇药物分别作用于SKOV 3细胞和SKOV3/TAX细胞。24h后用细胞刷刮下细胞，离心10min(1000r/min)，弃上清，将4℃的戊二醛固定液轻轻加入沉淀的细咆中。4℃固定1-2h后转移到4℃冲洗液中(0.18M蔗糖in0.1MPB)，保存1-2h，中间换液2次，然后加入4℃锇酸固定液中固定1h。蒸馏水冲洗后，乙醇梯度脱水。然后用包埋剂浸透包埋样品，进行修块、切片。醋酸铀和柠檬酸铅染色超薄切片后，透射电镜下观察，可见典型的细胞凋亡的超微结构改变。SKOV3细胞和SKOV3/TAX细胞在两种药物作用组均可见明显区别，叶酸偶联纳米紫杉醇组细胞核明显空泡化，染色质固缩、边缘化，线粒体明显肿胀，胞浆内可见大量小泡状结构；纳米紫杉醇注射液组细胞核仅有轻度染色质固缩、边缘化，线粒体轻度肿胀，细胞核及细胞浆内无泡状结构出现。见图35-38。图35、36分别为SKOV3细胞纳米紫杉醇与叶酸偶联纳米紫杉醇作用后的电镜图。
图37、38分别为SKOV3/TAX细胞纳米紫杉醇与叶酸偶联纳米紫杉醇作用后的电镜图。
结论：叶酸偶联纳米紫杉醇比对照药物纳米紫杉醇穿膜作用好，在细胞内聚集浓度高、杀伤作用更强。
实验例2叶酸偶联纳米紫杉醇靶向治疗卵巢癌的动物体内实验研究
1.裸鼠腹腔种植瘤卵巢癌模型的建立
参照文献(李文锦，钱和年，吕文英.人卵巢上皮性癌裸鼠皮下移植瘤模型和膜水瘤模型的建立，中华妇产科杂志.1993，28：38)，将卵巢浆液性乳头状囊腺癌SKOV3细胞置于CO2孵箱内培养，培养液为RPMI1640，细胞长满，胰酶消化后调整细胞浓度达到3×107/ml。取4～6周龄的3只Balb/c雌裸鼠腹腔内注射进行预实验，每只裸鼠注射0.1ml，每周测量裸鼠体重，观察裸鼠腹胀、消瘦情况及精神状态。5周后处死裸鼠剖视腹腔(其中1只裸鼠自然死亡，另2只裸鼠体重明显下降，消瘦、精神萎靡)，于腹腔肠管表面及腹膜可疑肿瘤结节部位取标本；上述标本经福尔马林固定后石蜡包埋；将石蜡包埋标本切成6um厚，常规HE染色，显微镜下观察，证实其为卵巢浆液性上皮性腺癌。见图39、图40。
建模成功后，按照预实验方法开始正式实验，建立30只裸鼠腹腔种植瘤卵巢癌模型。
2.叶酸偶联纳米紫杉醇靶向治疗裸鼠卵巢癌
2.1实验步骤：
取荷瘤裸鼠30只，两周后给药，随机分为腹腔叶酸偶联纳米紫杉醇给药组、静脉叶酸偶联纳米紫杉醇给药组和对照组(腹腔纳米紫杉醇)共三组，每组10只。各组紫杉醇剂量均为20mg/kg，间隔一周后各组又以同样剂量给药1次，共2次。每隔2天测量各裸鼠的体重、腹围、毛色、精神状态及一般活动，若出现动物死亡，即予以剖视。给药后第2，4，7，9，11天每天每组各处死1只裸鼠，第64，67天分2次处死其余裸鼠，剖视腹腔，取标本。
2.2实验结果：
2.2.1裸鼠一般情况变化
第一次给药后，静脉给药因加重裸鼠的心脏负担，而出现呼吸稍急促，腹腔给药的各动物未见明显异常。第二次给药后，静脉给药的动物出现周身较苍白，呼吸急促，走路摇晃，约2min后全身泛红，运动恢复；腹腔给药的各动物出现活动稍迟缓，但很快恢复正常。表明静脉给药组化疗后不良反应较腹腔给药明显。在随后的观察期至给药后67天中，各组动物均未见自然死亡，三组动物大部分体重稍增加，活动可。不给药的荷瘤裸鼠生存期约为35天，而给药后荷瘤裸鼠的生存期＞88天，证明了紫杉醇治疗卵巢癌具有非常好的疗效。
2.2.2裸鼠腹围变化
给药前及给药7天后，各组动物平均腹围分别为：对照组6.80±0.21cm及6.84±0.11cm，腹腔组6.68±0.33cm及7.18±0.37cm，静脉组6.71±0.22cm及6.78±0.21cm，均P＞0.05，无显著统计学意义。给药14天后，给药42天后，各组动物腹围变化均无显著统计学意义。
2.2.3腹腔种植瘤体数目
给药后第2，4，7，9，11天每天每组各处死1只裸鼠，剖视腹腔，计数肉眼可见腹腔种植瘤体数目。各组平均数分别为腹腔组3.38±1.77，静脉组4.50±2.20，对照组3.86±1.95，P＞0.05，各组之间差异无统计学意义。
2.2.4.流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡
每组分别取裸鼠的腹腔种植瘤组织，研磨法处理标本使细胞悬液浓度约为1.5×106/ml。以FCM方法检测细胞凋亡情况(不仅用了PI还用了AnnexinV-FTTC)。
步骤按凋亡检测试剂盒的要求操作的；即取1ml细胞，在4℃下1000r/min离心10min，弃上清。加入1ml冷PBS液，轻轻震荡使细胞悬浮，在4℃下1000r/min离心10min，弃上清，重复两次。将细胞重新悬浮于200μl Binding Buffer，加入10μl annexin-V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15min。加入300μl Bi nding Buffer，加入10μl碘化丙啶(PI)，避光室温反应，1小时内上流式细胞仪检测细胞凋亡坏死情况。各组细胞凋亡率分别为腹腔组84.63％，静脉组10.12％，对照组35.23％，p＜0.01。见图41-46。
FSC-SSC Height图散点横坐标值越接近于1000代表测试细胞体积越大，可见腹腔组细胞体积偏大，对照组与静脉组相似。考虑可能由于腹腔给药后细胞凋亡坏死空泡化明显所致(从下面的电镜形态图上可证实)。
Annexin-FITC-PI图散点落在第一象限代表正常细胞，第二象限代表凋亡早期细胞，第三象限代表凋亡晚期细胞，第四象限代表坏死细胞，可见腹腔组凋亡晚期和坏死细胞比较多，对照组和静脉组大部分为正常细胞。结果表明：肿瘤细胞杀伤效果腹腔组效果最好，对照组与静脉组效果相似，逊于腹腔组。
2.2.5.电镜观察肿瘤细胞形态学改变
处死裸鼠后，剖视腹腔，取腹腔种植瘤体，将其切成约1mm3小块后加入4℃的戊二醛固定液中。按前述方法进行透射电镜下观察，可见典型的细胞凋亡的超微结构改变。显示给药时间越长，细胞核染色质变化越大，由染色质固缩到染色质边集化，并且边集化程度渐加重，线粒体脱嵴，肿胀，粗面内质网脱颗粒等细胞坏死现象逐渐明显，胞体逐渐缩小，核膜及细胞膜仍保持完整。不同组之间比较可见腹腔组与静脉组细胞核染色质固缩及边集化严重，腹腔组线粒体肿胀明显，而静脉组粗面内质网脱颗粒现象明显；对照组细胞核染色质固缩及边集程度轻，线粒体轻度脱嵴。见图47-53。
讨论
卵巢浆液性乳头状囊腺癌SKOV3细胞及其耐药株SKOV3/TAX细胞均为叶酸(+)细胞，可介导叶酸纳米紫杉醇药物通过叶酸介导的胞吞作用富集于细胞内发挥抗肿瘤效果。细胞培养基中加入游离叶酸封闭叶酸受体可明显降低叶酸纳米紫杉醇药物对细胞的杀伤作用，也进一步证明了药物对细胞的作用是由细胞表面的叶酸受体介导的。文献报道约93％的卵巢癌患者中过表达叶酸，故本实验中使用卵巢癌细胞模型来探讨叶酸偶联纳米紫杉醇对卵巢癌的靶向治疗作用更接近临床实际，有一定的临床意义。
体外实验证实，无论是敏感株还是耐药株细胞，叶酸偶联纳米紫杉醇、纳米紫杉醇及紫杉醇注射液对肿瘤细胞的损伤作用均随着给药时间的延长越来越明显；关于药物浓度对肿瘤细胞的影响，紫杉醇和纳米紫杉醇注射液的药物浓度越大，细胞死亡越多，药效与药物浓度呈正相关；MTT显示叶酸偶联纳米紫杉醇的药物浓度为0.2，0.02μg/ml时细胞死亡比率相近，药物浓度为200μg/ml与20μg/ml时细胞几乎全部死亡，表明叶酸偶联纳米紫杉醇的药效既与药物浓度有关，也与叶酸受体饱和度有密切关系。叶酸偶联纳米紫杉醇对耐药卵巢癌细胞也有明显的细胞毒性，药效强于紫杉醇注射液，提示临床上可将该药尝试应用对紫杉醇注射液耐药的卵巢癌患者。虽然叶酸介导紫杉醇进入细胞并不能逆转耐药细胞对紫杉醇的耐药性，但能通过将更多的紫杉醇靶向的带入细胞从而提高了药物的利用率来增加细胞毒作用。
裸鼠体内实验结果发现，叶酸偶联纳米紫杉醇腹腔给药对癌细胞的杀伤效果明显大于静脉给药组和对照组，因为腹腔用药可以直接以较高浓度靶向作用于局部肿瘤及肿瘤中浸润的巨噬细胞(也是叶酸受体阳性，是药物靶细胞)。从而发挥最大的一室效应。同时因叶酸偶联纳米紫杉醇粒径(140.5nm)较卵巢癌组织血管内皮细胞间裂隙(＜100nm)稍大，不易向血液中扩散从而减少药物对其他器官的正常细胞而致的毒副作用。
Claims (8)
1.一种磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体的制备方法，其步骤是：
1)制备磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸胶束，
将磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸溶于甲醇和氯仿混合溶液，加入蒸馏水进行水浴超声乳化后，除去甲醇和氯仿，得到澄明的胶束溶液；
2)用薄膜分散-挤压法制备纳米紫杉醇脂质体混悬液，
在容器中分别加入紫杉醇、蛋黄卵磷脂、胆固醇和无水乙醇，溶解后除去乙醇，当容器内容物呈薄膜状附着于容器壁时，加入水并进行超声波震荡，然后将所得混合物用挤压器通过0.1um的微孔滤膜，即得紫杉醇纳米脂质体混悬液；
3)采用共孵育法制备磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体，
将步骤1所得胶束溶液和步骤2所得混悬液混合，置60℃环境中1小时，得到所述脂质体药物，为混悬液。
2.权利要求1所述的制备方法，步骤2)中，所述通过0.1um的微孔滤膜是用挤压器将脂质体依次过过0.8um，0.4um，0.2um的微孔滤膜后，再通过0.1um的微孔滤膜。
3.权利要求1所述的制备方法，步骤2)中，所得混悬液加入蔗糖，经冷冻干燥制成冻干粉。
4.一种磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体，制备该脂质体的原料为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸、紫杉醇、蛋黄卵磷脂和胆固醇，其特征是磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸与蛋黄卵磷脂的摩尔比为0.05％～0.15％，且所述脂质体的粒径小于150nm。
5.权利要求4所述的脂质体，其特征是按权利要求1所述方法制备的。
6.权利要求4或5所述的脂质体在制备治疗肿瘤药物中的用途。
7.权利要求4或5所述的肿瘤，是卵巢癌。
8.一种治疗卵巢癌药物，其活性成分是权利要求4或5所述的脂质体。
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