CN102579353B - 叶酸靶向的抗癌药物peg修饰的脂质体及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种叶酸靶向的抗癌药物PEG修饰的脂质体的制备方法及用途，该脂质体用下述方法制成：首先合成叶酸-聚乙二醇，然后用复乳法制得叶酸连接的抗癌药物脂质体，最后将二者进行连接，从而得到叶酸靶向的抗癌药物PEG修饰的脂质体。其用途在于靶向治疗卵巢癌、肝癌、乳腺癌等癌症，是一种很有效的抗生素类抗肿瘤药。

Description

叶酸靶向的抗癌药物PEG修饰的脂质体及制备方法

技术领域

本发明提供了一种叶酸靶向的抗癌药物PEG修饰的脂质体，同时还提供了该脂质体的制备方法与用途，属于生物医药领域。

背景技术

脂质体作为抗肿瘤药物载体具有改变药物在组织中的分布,提高治疗指数和生物利用度，增加疗效同时减小毒副作用的特点。本研究制备了抗癌药物脂质体,脂质体能够降低毒性，它还可被用作抗菌药物的载体，以及DNA和蛋白质大分子的传递载体。其作用机理在于脂质体与细胞膜 （生物膜）结构相似，脂质体的主要成份磷脂等类脂也是细胞膜的主要成份，所以脂质体与细胞膜之间有很强的亲合力。脂质体的膜与生物膜融合，脂质体所包含的活性成份被释放而进入细胞内，或者整个脂质体被细胞吞噬，活性成份在细胞内被吸收。

PEG化的脂质体被称为空间稳定脂质体，又称隐性脂质体或长循环脂质体，PEG作为一种极性分子，阻碍了免疫系统对其识别，减少单核-吞噬细胞系统摄取，显著延长了脂质体的循环时间，从而增强药物的口服生物利用度和血脑屏障转运效率。

叶酸是一种分子结构中含有喋呤环的小分子维生素，在生理条件下很难自由透过细胞膜，必须进行内化才能被人体所吸收；两种内化机制：一是低亲和力跨膜蛋白，转运四氢叶酸、二氢叶酸进入细胞内；二是高亲和力的叶酸受体，可吸收叶酸进入细胞内。

叶酸受体有两个GPI(糖基磷脂酰肌醇锚）锚定形式，α和β，它在大多数组织中是缺失的。FR-α在表皮癌中频繁地被放大，而FR-β的表达只存在于粒细胞性白血病和与慢性炎症性疾病相关的激活的巨噬细胞中。叶酸的衍生物和抗叶酸受体的抗体可通过受体介导的内吞作用被癌症细胞吸收，这样就提供了一种靶向传递到FR⁺细胞的机制。

发明内容

本发明提供一种叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体，其目的就是可有效地运载药物到达靶部位，提高药物的生物利用度，同时有效减小细胞毒性。

本发明还公开了上述脂质体的制备方法，适用于工业化生产。

本发明提供的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体，其特征在于结构如下所述：PEG两端分别连接叶酸和包有亲水性抗癌药物的脂质体。

本发明的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体制备方法，包括以下步骤：

1）叶酸活化酯的制备：按照（165～175）：（65～75）：（300～350）：（1650～1750）：（1～5）的摩尔比先后将叶酸、无水二甲基亚砜、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺及三乙胺混合在一起，在室温条件下反应12-15小时，过滤除去二环己基脲，得到叶酸活化酯溶液，反应式如下：

2）叶酸-PEG的合成：将NH₂-PEG-COOH溶于DMSO，NH₂-PEG-COOH与上述叶酸活化酯摩尔比为1∶（9～8），在氮气的保护下，NH₂-PEG-COOH溶液与叶酸活化酯反应5 h，于4℃条件下，将所得产物在DMSO中透析72～75h,然后在超纯水中透析48~55h，将最终产品在－20℃冷冻干燥；

3）复乳法制备叶酸靶向的抗癌药物PEG修饰的脂质体：

初乳的制备：将质量比为（10~30）：（1~4）：（7~25）：（1~3）的大豆卵磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰甘油、三油酸甘油酯混合，每100g 大豆卵磷脂加入2mL三氯甲烷-乙醚（1：1）混合溶剂中使其完全溶解，该溶液作为有机相；配制2ml含水溶性抗癌药物和精氨酸的水溶液作为内水相，该水溶液中抗癌药物浓度为15 g·L^-1，精氨酸浓度为5.6 g·L^-1，pH为4.6,将内水相缓慢滴入有机相中,涡旋振荡并探针超声5min,得到乳白色半透明状的W /O的初乳；

复乳的制备：将W /O的初乳滴入4倍于三氯甲烷-乙醚（1：1）体积的水溶液中，该溶液中精氨酸浓度为5.5 g·L^-1，葡萄糖的浓度为5.5%，pH为4.6；涡旋振荡后，超声5 min得W /O/W的复乳；在55℃下，向制得的W /O/W复乳中通入氮气，挥去有机相，得多囊泡脂质体的混悬液；

脂质体与叶酸的连接：将多囊泡脂质体加到10% 叶酸-PEG溶液中，二者体积比为1：（2～3）；静置35min，用3 000 r·min^-1离心40 min，倾去上清液，得到PEG2000修饰的多囊泡脂质体，再用pH为4.6、浓度为5.5 g·L^-1的精氨酸溶液调整水溶性抗癌药物质量浓度至5.5 g·L^-1，即得。

本发明的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体制备方法，还可由以下步骤得到：

1）叶酸活化酯的制备：将叶酸与N-羟基丁二酰胺形成活化酯，即首先将叶酸溶于二甲基亚砜中，再按照叶酸、N-羟基丁二酰胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶2∶2的比率混合，在搅拌条件下反应20 h，该反应在氮气保护的条件下进行；将所得混悬物10 000 r/min离心40 min，除去白色不溶物，取黄色上清液；

2）叶酸-PEG的合成：将NH₂-PEG-COOH溶于DMSO，NH₂-PEG-COOH与上述叶酸活化酯摩尔比为1∶（9～8），在氮气的保护下，NH₂-PEG-COOH溶液与叶酸活化酯反应5 h，于4℃条件下，将所得产物在DMSO中透析72～75h，然后在超纯水中透析48~55h，将最终产品在－20℃冷冻干燥；

3）复乳法制备叶酸靶向的抗癌药物脂质体：缓慢将40g/L的水溶性抗癌药物溶液（用0.1mol/L HCl调节pH值为1.2）加至等体积的氯仿溶液中，该氯仿溶液中含有质量比为（10~15）：（1.25～5）：（7.5～10）：（1～3）的大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰甘油、胆固醇和三油酸甘油酯；以10000×g高速剪切5min制成W/O型初乳；吸取该初乳注入5倍体积的含有5%葡萄糖注射液和40mmol/L赖氨酸游离碱的混合溶液的外水相中，以4000×g剪切25s形成W/O/W型复乳；

4）抗癌药物与叶酸的连接：在55℃下，向制得的W /O/W的复乳中通入氮气，挥去有机相，得多囊泡脂质体的混悬液，将所得多囊泡脂质体加到10%叶酸-PEG溶液，二者体积比为1：（3～2），静置35min，使多囊泡脂质体与叶酸-PEG溶液结合，以4 000 r·min^-1离心30 min，倾去上清液，得到叶酸连接的多囊泡脂质体，再用pH为4.6、浓度为5.5 g·L^-1的精氨酸溶液调整抗癌药物质量浓度至5.5 g·L^-1，即得。

本发明选择的PEG聚合度约为2000，其作为亲水性链接将叶酸与脂质体连接，同时又能延长表阿霉素脂质体在体内的循环时间，起到了很好的作用。将叶酸通过PEG连接到脂质体的表面，由于表阿霉素是种水溶性很好的药物，用该方法制备能得到包封率较高的脂质体。

本发明的积极效果在于：利用叶酸与叶酸受体特异性结合的特点，将抗癌药物脂质体通过PEG与叶酸连接，可将药物靶向、高效地输送到癌症部位，使脂质体具有靶向肿瘤细胞的特性，从而提高抗肿瘤药物的生物利用度，降低毒副作用；避免了注射用抗癌药物带来的脉管疼痛和脉管炎，以及长期应用有骨髓抑制和对肝功能不全者易产生蓄积中毒，从而使本发明将会有很广泛的应用。

附图说明

图1 为本发明实施例1抗癌药物在血液中的降解速度图；

图2为本发明实施例2抗癌药物在血液中的降解速度图；

图3为本发明实施例3抗癌药物在血液中的降解速度图；

图4为本发明实施例4抗癌药物在血液中的降解速度图；

图5为本发明实施例5抗癌药物在血液中的降解速度图；

图6为本发明实施例6抗癌药物在血液中的降解速度图。

具体实施方法

实施例1

叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体，其制备方法如下：

1、叶酸活化酯的制备：称取77mg叶酸,溶于6mL无水DMSO中，再加入72mg的DCC和201mgNHS及500μL三乙胺，室温反应12h。过滤除去二环己基脲，得到叶酸活化酯溶液。制备过程如下：

2、叶酸-PEG的合成：将6.03mol NH2-PEG-COOH溶解于30ml DMSO中，在氮气的保护下，与叶酸活化酯反应5 h，于4℃条件下，将所得产物在DMSO中透析72 h，在超纯水中透析48 h，将最终产品在－20℃冷冻干燥。

3、复乳法制备叶酸靶向的抗癌药物PEG修饰的脂质体：

（1）初乳的制备：称取PC300mg，DPPG35mg,CH250mg和TO30mg置于量瓶中,加入12 mL三氯甲烷-乙醚(1:1)混合溶剂使其完全溶解,作为有机相;配制12 mL的水溶液作为内水相，该溶液中抗癌药物的浓度为15 g·L^-1，精氨酸5.6 g·L^-1，pH为4.6，将内水相缓慢滴入有机相中,涡旋振荡并探针超声5min,得到乳白色半透明状的W /O的初乳。

（2）复乳的制备：将W /O的初乳滴入60 mL pH 4.6、含5.5 g·L^-1精氨酸溶液和5.5%葡萄糖的溶液中,涡旋振荡后,超声5 min得W /O/W的复乳。在55℃下，向制得的W /O/W的复乳中通入氮气,挥去有机相,得多囊泡脂质体（MVLs）的混悬液；

（3）脂质体与叶酸的连接：将所得多囊泡脂质体（MVLs）加到30mL 10% 的叶酸-PEG溶液中静置35min,使二者结合,用3 000 r·min^-1离心40 min,倾去上清液,得到连有叶酸的多囊泡脂质体,再用pH为4.6、浓度5.5 g·L^-1的精氨酸溶液调整抗癌药物质量浓度至5.5 g·L^-1；

2、生物利用度的测定：小鼠静脉注射叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体（L-EPI)a组和注射用盐抗癌药物(EPI)b组后，不同时间检测血液中抗癌药物含量，结果表明：b

组的抗癌药物在血液中的降解速度大于α组，见下图1。

结论：由该曲线可知，本发明所述的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的生物利用度高于注射用抗癌药物。

3、细胞毒性实验：MTT法测定本发明所述的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的细胞毒性，以注射用盐酸抗癌药物为对照。结果如下表：

实验组：MTT法测叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的细胞毒性

。

表注：用9个浓度梯度（1、2、4、6、8、10、12、14、16mmol.L ^-1 ）的叶酸靶向抗癌药物PEG化脂质体进行细胞毒性实验，每组设置A-F共6个平行实验。A平均：吸光度的平均值。

对照组：MTT法测定盐酸抗癌药物的细胞毒性

。

表注：分别用与上述样品相同浓度（即1、2、4、6、8、10、12、14、16mmol.L ^-1 ）的盐酸抗癌药物进行了9组实验，每组设置A-F共6个平行实验。A _平均 ：吸光度的平均值。

 结论：实验组的吸光度值显著高于对照组，说明实验组的活细胞数目多，叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体相对于注射用抗癌药物来说，其细胞毒性有很大程度的减小。

实施例2

叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的方法，包括以下步骤：

1、叶酸活化酯的制备：称取75mg叶酸,溶于5.5mL无水DMSO中，再加入67mg的DCC和196mgNHS及300μL三乙胺，室温反应13h。过滤除去二环己基脲，得到叶酸活化酯溶液。反应式如下：

2、叶酸-PEG的合成：将3.02mol NH2-PEG-COOH溶于15ml DMSO，在氮气的保护下，与叶酸活化酯反应5 h，于4℃条件下，将所得产物分别在DMSO中透析72h,在超纯水中透析48 h，将最终产品在－20℃冷冻干燥。

3、复乳法制备叶酸靶向的抗癌药物PEG修饰的脂质体：

（1）初乳的制备：称取PC185mg，DPPG160mg,CH125mg和TO30mg置于量瓶中,加入12 mL三氯甲烷-乙醚(1:1)混合溶剂使其完全溶解,作为有机相;配制12 mL水溶液作为内水相，该溶液中抗癌药物浓度为15 g·L^-1，精氨酸浓度为5.6 g·L^-1，pH为4.6含。将内水相缓慢滴入有机相中,涡旋振荡并探针超声5min,得到乳白色半透明状的W /O的初乳;

（2）复乳的制备：将W /O的初乳滴入60 mL溶液中,该溶液中精氨酸浓度为5.5 g·L^-1，葡萄糖浓度为5.5%，pH 4.6，涡旋振荡后,超声5 min得W /O/W的复乳，在55℃下向制得的W /O/W的复乳中通入氮气,挥去有机相,得多囊泡脂质体（MVLs）的混悬液；

（3）脂质体与叶酸的连接：将所得多囊泡脂质体（MVLs）加到30mL 10% 叶酸-PEG溶液中静置35min,使二者结合,用3 000 r·min^-1离心40 min,倾去上清液,得到连有叶酸的多囊泡脂质体,再用pH为4.6、浓度5.5 g·L^-1的精氨酸溶液调整抗癌药物质量浓度至5.5 g·L^-1，即得产品。

4、生物利用度的测定：小鼠静脉注射叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体（L-EPI)a组和注射用盐酸抗癌药物(EPI)b组后，不同时间检测血液中抗癌药物含量，结果表明：b组的抗癌药物在血液中的降解速度大于a组，见下图2。

结论：由该曲线可知，本发明所述的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的生物利用度高于注射用抗癌药物。

5、细胞毒性实验：MTT法测定本发明所述的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的细胞毒性，以注射用抗癌药物为对照。结果如下表：

实验组：MTT法测叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的细胞毒性

。

表注：用9个浓度梯度（1、2、4、6、8、10、12、14、16mmol.L ^-1 ）的叶酸靶向抗癌药物PEG化脂质体进行细胞毒性实验，每组设置A-F共6个平行实验。A平均：吸光度的平均值。

对照组：MTT法测定盐酸抗癌药物的细胞毒性

。

表注：分别用与上述样品相同浓度（即1、2、4、6、8、10、12、14、16mmol.L ^-1 ）的盐酸抗癌药物进行了9组实验，每组设置A-F共6个平行实验。A _平均 ：吸光度的平均值。

结论：实验组的吸光度值显著高于对照组，说明实验组的活细胞数目多，叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体相对于盐酸抗癌药物来说，其细胞毒性有很大程度的减小。

实施例3

叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的方法，包括以下步骤：

1、叶酸活化酯的制备：称取72mg叶酸,溶于5mL无水DMSO中，再加入62mg的DCC和190mgNHS及100μL三乙胺，室温反应15h。过滤除去二环己基脲，得到叶酸活化酯溶液。反应式如下：

2、叶酸-PEG的合成：将1.51molNH2-PEG-COOH溶于7.5gDMSO，在氮气的保护下，与叶酸活化酯反应5 h，于4℃条件下，将所得产物分别在DMSO和超纯水中分别透析72 h和48 h，将最终产品在－20℃冷冻干燥。

3、复乳法制备叶酸靶向的抗癌药物PEG修饰的脂质体：

（1）初乳的制备：称取PC175mg，DPPG150mg，CH100mg和TO20mg置于量瓶中,加入6 mL三氯甲烷-乙醚(1:1)混合溶剂使其完全溶解,作为有机相;配制6 mL的溶液作为内水相，该溶液中抗癌药物浓度为15 g·L^-1，精氨酸5.6 g·L^-1，pH为4.6，将内水相缓慢滴入有机相中,涡旋振荡并探针超声5min,得到乳白色半透明状的W /O的初乳;

（2）复乳的制备：将W /O的初乳滴入30 mL pH 4.6含5.5 g·L^-1精氨酸溶液和5.5%葡萄糖的溶液中,涡旋振荡后,超声5 min得W /O/W的复乳。在55℃下，向制得的W /O/W通入氮气,挥去有机相,得多囊泡脂质体（MVLs）的混悬液；

（3）脂质体与叶酸的连接：将所得MVLs加到15mL 10% 叶酸-PEG溶液15mL中静置35min,与脂质结合,用3 000 r·min^-1离心40 min,倾去上清液,得到连有叶酸的多囊泡脂质体,再用pH为4.6、浓度为5.5 g·L^-1的精氨酸溶液调整抗癌药物质量浓度至5.5 g·L^-1，即得产品。

4、生物利用度的测定：小鼠静脉注射叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体（L-EPI)a组和注射用盐酸抗癌药物(EPI)b组后,不同时间检测血液中抗癌药物含量,结果表明,b组的抗癌药物在血液中的降解速度大于a组,见下图3。

结论:由该曲线可知，本发明所述的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的生物利用度高于注射用抗癌药物。

5、细胞毒性实验：MTT法测定本发明所述的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的细胞毒性，以注射用盐酸抗癌药物为对照。结果如下表：

实验组：MTT法测叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的细胞毒性

。

表注：用9个浓度梯度（1、2、4、6、8、10、12、14、16mmol.L ^-1 ）的叶酸靶向抗癌药物PEG化脂质体进行细胞毒性实验，每组设置A-F共6个平行实验。A平均：吸光度的平均值。

对照组：MTT法测定盐酸抗癌药物的细胞毒性

。

表注：分别用与上述样品相同浓度（即1、2、4、6、8、10、12、14、16mmol.L ^-1 ）的盐酸抗癌药物进行了9组实验，每组设置A-F共6个平行实验。A _平均 ：吸光度的平均值。

结论：实验组的吸光度值显著高于对照组，说明实验组的活细胞数目多，叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体相对于盐酸抗癌药物来说，其细胞毒性有很大程度的减小。

实施例4

叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的方法，包括以下步骤：

（1）叶酸活化酯的制备：将叶酸与N-羟基丁二酰胺（NHS）形成活化酯，即将0.067mol叶酸溶于2mL二甲亚砜(DMSO)，与0.13mol n-羟基丁二酰胺、0.13mol二环己基碳二亚胺(DCC)在搅拌条件下反应20 h，反应在氮气保护的条件下进行。将所得混悬物10 000 r/min离心40 min，除去白色不溶物，取黄色上清液。

（2）叶酸-PEG的合成：将0.603molNH₂-PEG-COOH溶于3ml DMSO，在氮气保护的条件下与叶酸活化物反应4 h，将所得物质分别在DMSO和超纯水中于4℃条件下透析72 h和48 h，将最终产品在－20℃冷冻干燥。

（3）复乳法制备叶酸靶向的抗癌药物脂质体：缓慢将10mL 40g/L的抗癌药物溶液（以0.1mol/L HCl调节pH值为1.2）加至等体积的氯仿溶液中，该溶液中含PC200g，DPPG25g，CH150g和TO20g。以10000×g高速剪切5min制成W/O型初乳。吸取该初乳2mL注入10mL的含有5%葡萄糖注射液和40mmol/L赖氨酸游离碱的混合溶液（外水相）中，4000×g剪切25s形成W/O/W型复乳。

（4）抗癌药物与叶酸的连接：向制得的W /O/W的复乳中恒温55℃通入氮气,挥去有机相,得多囊泡脂质体（MVLs）的混悬液,将5mL多囊泡脂质体（MVLs）加到15mL的10% 叶酸-PEG溶液中静置35min,使二者结合,用4 000 r·min^-1离心30 min,倾去上清液,得到叶酸连接的多囊泡脂质体,再用pH为4.6、浓度为5.5 g·L^-1的精氨酸溶液调整抗癌药物质量浓度至5.5 g·L^-1。即得到产品。

生物利用度的测定：小鼠静脉注射叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体（L-EPI)a组和注射用盐酸抗癌药物(EPI)b组后,不同时间检测血液中抗癌药物含量,结果表明,b组的

抗癌药物在血液中的降解速度大于a组,见下图4。

结论:由该曲线可知，本发明所述的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的生物利用度高于注射用抗癌药物。

5、细胞毒性实验：MTT法测定本发明所述的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的细胞毒性，以注射用盐酸抗癌药物为对照。结果如下表：

实验组：MTT法测叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的细胞毒性

。

表注：用9个浓度梯度（1、2、4、6、8、10、12、14、16mmol.L ^-1 ）的叶酸靶向抗癌药物PEG化脂质体进行细胞毒性实验，每组设置A-F共6个平行实验。A平均：吸光度的平均值。

对照组：MTT法测定盐酸抗癌药物的细胞毒性

。

表注：分别用与上述样品相同浓度（即1、2、4、6、8、10、12、14、16mmol.L ^-1 ）的盐酸抗癌药物进行了9组实验，每组设置A-F共6个平行实验。A _平均 ：吸光度的平均值。

结论：实验组的吸光度值显著高于对照组，说明实验组的活细胞数目多，叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体相对于盐酸抗癌药物来说，其细胞毒性有很大程度的减小。

实施例5

叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的方法，包括以下步骤：

（1）叶酸活化酯的制备：将叶酸与N-羟基丁二酰胺（NHS）形成活化酯，即将0.2mol叶酸溶于6mL二甲亚砜(DMSO)，与0.4mol n-羟基丁二酰胺、0.4mol二环己基碳二亚胺(DCC)在搅拌条件下反应20 h，反应在氮气保护的条件下进行。将所得混悬物10 000 r/min离心40 min，除去白色不溶物，取黄色上清液。

（2）叶酸-PEG的合成：将1.8mol的NH₂-PEG-COOH溶于9.0ml DMSO，在氮气保护的条件下与叶酸活化物反应4 h，将所得物质分别在DMSO和超纯水中于4℃条件下透析72 h和48 h，将最终产品在－20℃冷冻干燥。

（3）复乳法制备叶酸靶向的抗癌药物脂质体：缓慢将30mL 40g/L的抗癌药物溶液（以0.1mol/L HCl调节pH值为1.2）加至等体积的氯仿溶液中，该溶液中含有PC240g，DPPG60g，CH180g和TO40g。以10000×g高速剪切5min制成W/O型初乳。吸取该初乳6mL注入30mL含有5%葡萄糖注射液和40mmol/L赖氨酸游离碱的混合溶液（外水相）中，4000×g剪切25s形成W/O/W型复乳。

（4）抗癌药物与叶酸的连接：向制得的W /O/W的复乳中恒温55℃通入氮气,挥去有机相,得多囊泡脂质体（MVLs）的混悬液,将15mL多囊泡脂质体（MVLs）加到30mL的10% 叶酸-PEG溶液中静置35min,用4 000 r·min^-1离心30 min,倾去上清液,得到叶酸连接的多囊泡脂质体,再用pH为4.6、浓度为5.5 g·L^-1的精氨酸溶液调整抗癌药物质量浓度至5.5 g·L^-1。即得到产品.

生物利用度的测定：小鼠静脉注射叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体（L-EPI)a组和注射用盐酸抗癌药物(EPI)b组后,不同时间检测血液中抗癌药物含量,结果表明,b组的抗癌药物在血液中的降解速度大于a组,见下图5。

结论:由该曲线可知，本发明所述的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的生物利用度高于注射用抗癌药物。

5、细胞毒性实验：MTT法测定本发明所述的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的细胞毒性，以注射用盐酸抗癌药物为对照。结果如下表：

实验组：MTT法测叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的细胞毒性

。

表注：用9个浓度梯度（1、2、4、6、8、10、12、14、16mmol.L ^-1 ）的叶酸靶向抗癌药物PEG化脂质体进行细胞毒性实验，每组设置A-F共6个平行实验。A平均：吸光度的平均值。

对照组：MTT法测定盐酸抗癌药物的细胞毒性

。

表注：分别用与上述样品相同浓度（即1、2、4、6、8、10、12、14、16mmol.L ^-1 ）的盐酸抗癌药物进行了9组实验，每组设置A-F共6个平行实验。A _平均 ：吸光度的平均值。

结论：实验组的吸光度值显著高于对照组，说明实验组的活细胞数目多，叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体相对于盐酸抗癌药物来说，其细胞毒性有很大程度的减小。

实施例6

叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的方法，包括以下步骤：

（1）叶酸活化酯的制备：将叶酸与N-羟基丁二酰胺（NHS）形成活化酯，即将1.3mol叶酸溶于无水DMSO，与2.6mol n-羟基丁二酰胺、2.6mol二环己基碳二亚胺(DCC)在搅拌条件下反应20 h，反应在氮气保护的条件下进行。将所得混悬物10 000 r/min离心40 min，除去白色不溶物，取黄色上清液。

（2）叶酸-PEG的合成：将11.7mol的NH₂-PEG-COOH溶于58ml DMSO，在氮气保护的条件下与叶酸活化物反应4 h，将所得物质分别在DMSO和超纯水中于4℃条件下透析72 h和48 h，将最终产品在－20℃冷冻干燥。

（3）复乳法制备叶酸靶向的抗癌药物脂质体：缓慢将200mL 40g/L的抗癌药物溶液（以0.1mol/L HCl调节pH值为1.2）加至等体积的氯仿溶液中，该溶液中含有PC300g，DPPG100g，CH200g和TO60g。以10000×g高速剪切5min制成W/O型初乳。吸取该初乳40mL注入200mL的含有5%葡萄糖注射液和40mmol/L赖氨酸游离碱的混合溶液（外水相）中，4000×g剪切25s形成W/O/W型复乳。

（4）抗癌药物与叶酸的连接：向制得的W /O/W的复乳中恒温55℃通入氮气,挥去有机相,得多囊泡脂质体（MVLs）的混悬液,将100mL所得多囊泡脂质体（MVLs）加到与250mL的10% 叶酸-PEG溶液中静置35min,与脂质结合,用4 000 r·min^-1离心30 min,倾去上清液,得到叶酸连接的多囊泡脂质体,再用pH为4.6、浓度为5.5 g·L^-1的精氨酸溶液调整抗癌药物质量浓度至5.5 g·L^-1。即得到产品。

生物利用度的测定：小鼠静脉注射叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体（L-EPI)a组和注射用盐酸抗癌药物(EPI)b组后,不同时间检测血液中抗癌药物含量,结果表明,b组的抗癌药物在血液中的降解速度大于a组,见下图6.。 

结论:由该曲线可知，本发明所述的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的生物利用度高于注射用抗癌药物。

5、细胞毒性实验：MTT法测定本发明所述的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的细胞毒性，以注射用盐酸抗癌药物为对照。结果如下表：

实验组：MTT法测叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体的细胞毒性

。

表注：用9个浓度梯度（1、2、4、6、8、10、12、14、16mmol.L ^-1 ）的叶酸靶向抗癌药物PEG化脂质体进行细胞毒性实验，每组设置A-F共6个平行实验。A平均：吸光度的平均值。

对照组：MTT法测定盐酸抗癌药物的细胞毒性

。

表注：分别用与上述样品相同浓度（即1、2、4、6、8、10、12、14、16mmol.L ^-1 ）的盐酸抗癌药物进行了9组实验，每组设置A-F共6个平行实验。A _平均 ：吸光度的平均值。

    结论：实验组的吸光度值显著高于对照组，说明实验组的活细胞数目多，叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体相对于盐酸抗癌药物来说，其细胞毒性有很大程度的减小。

以上实施例的生物利用度和MTT实验都证明：本发明制备的叶酸靶向的抗癌药物PEG化脂质体达到了增加生物利用度，同时减小细胞毒性的目的。

Claims (2)

1.一种叶酸靶向的抗癌药物PEG修饰的脂质体，其特征在于结构如下所述：PEG两端分别连接叶酸和包有亲水性抗癌药物的脂质体；

所述叶酸靶向的抗癌药物PEG修饰的脂质体的制备方法，包括以下步骤：

1）叶酸活化酯的制备：按照（165～175）：（65～75）：（300～350）：（1650～1750）：（1～5）的摩尔比先后将叶酸、无水二甲基亚砜、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺及三乙胺混合在一起，在室温条件下反应12-15小时，过滤除去二环己基脲，得到叶酸活化酯溶液，反应式如下：

2）叶酸-PEG的合成：将NH₂-PEG-COOH溶于DMSO，NH₂-PEG-COOH与上述叶酸活化酯摩尔比为1∶（9～8），在氮气的保护下，NH₂-PEG-COOH溶液与叶酸活化酯反应5 h，于4℃条件下，将所得产物在DMSO中透析72～75h,然后在超纯水中透析48~55h，将最终产品在－20℃冷冻干燥；

3）复乳法制备叶酸靶向的抗癌药物PEG修饰的脂质体：

初乳的制备：将质量比为（10~30）：（1~4）：（7~25）：（1~3）的大豆卵磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰甘油、三油酸甘油酯混合，每100g 大豆卵磷脂加入2mL三氯甲烷-乙醚（1：1）混合溶剂中使其完全溶解，该溶液作为有机相；配制2ml含水溶性抗癌药物和精氨酸的水溶液作为内水相，该水溶液中抗癌药物浓度为15 g·L^-1，精氨酸浓度为5.6 g·L^-1，pH为4.6,将内水相缓慢滴入有机相中,涡旋振荡并探针超声5min,得到乳白色半透明状的W /O的初乳；

复乳的制备：将W /O的初乳滴入4倍于三氯甲烷-乙醚（1：1）体积的水溶液中，该溶液中精氨酸浓度为5.5 g·L^-1，葡萄糖的浓度为5.5%，pH为4.6；涡旋振荡后，超声5 min得W /O/W的复乳；在55℃下，向制得的W /O/W复乳中通入氮气，挥去有机相，得多囊泡脂质体的混悬液；

脂质体与叶酸的连接：将多囊泡脂质体加到10% 叶酸-PEG溶液中，二者体积比为1：（2～3）；静置35min，用3 000 r·min^-1离心40 min，倾去上清液，得到PEG2000修饰的多囊泡脂质体，再用pH为4.6、浓度为5.5 g·L^-1的精氨酸溶液调整水溶性抗癌药物质量浓度至5.5 g·L^-1，即得。

2. 叶酸靶向的抗癌药物PEG修饰的脂质体，其特征在于结构如下所述：PEG两端分别连接叶酸和包有亲水性抗癌药物的脂质体；

所述的制备方法包括以下步骤：

1）叶酸活化酯的制备：将叶酸与N-羟基丁二酰胺形成活化酯，即首先将叶酸溶于二甲基亚砜中，再按照叶酸、N-羟基丁二酰胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶2∶2的比率混合，在搅拌条件下反应20 h，该反应在氮气保护的条件下进行；将所得混悬物10 000 r/min离心40 min，除去白色不溶物，取黄色上清液；

2）叶酸-PEG的合成：将NH₂-PEG-COOH溶于DMSO，NH₂-PEG-COOH与上述叶酸活化酯摩尔比为1∶（9～8），在氮气的保护下，NH₂-PEG-COOH溶液与叶酸活化酯反应5 h，于4℃条件下，将所得产物在DMSO中透析72～75h，然后在超纯水中透析48~55h，将最终产品在－20℃冷冻干燥；

3）复乳法制备叶酸靶向的抗癌药物脂质体：缓慢将40g/L的水溶性抗癌药物溶液（用0.1mol/L HCl调节pH值为1.2）加至等体积的氯仿溶液中，该氯仿溶液中含有质量比为（10~15）：（1.25～5）：（7.5～10）：（1～3）的大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰甘油、胆固醇和三油酸甘油酯；以10000×g高速剪切5min制成W/O型初乳；吸取该初乳注入5倍体积的含有5%葡萄糖注射液和40mmol/L赖氨酸游离碱的混合溶液的外水相中，以4000×g剪切25s形成W/O/W型复乳；

4）抗癌药物与叶酸的连接：在55℃下，向制得的W /O/W的复乳中通入氮气，挥去有机相，得多囊泡脂质体的混悬液，将所得多囊泡脂质体加到10%叶酸-PEG溶液，二者体积比为1：（3～2），静置35min，使多囊泡脂质体与叶酸-PEG溶液结合，以4 000 r·min^-1离心30 min，倾去上清液，得到叶酸连接的多囊泡脂质体，再用pH为4.6、浓度为5.5 g·L^-1的精氨酸溶液调整抗癌药物质量浓度至5.5 g·L^-1，即得。

Images