CN101721350A - 一种叶酸介导靶向的聚合物胶束 - Google Patents

Abstract

本发明属药物制剂领域，涉及一种叶酸介导靶向聚合物胶束，尤其是一种包载难溶性抗肿瘤药物的叶酸介导靶向聚合物胶束。本发明采用一定比例的两种生物相容的叶酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺材料制成叶酸介导靶向聚合物胶束，其包载有难溶性抗肿瘤药物，使难溶性抗肿瘤药物有效增溶在其所形成的聚合物胶束内，经试验证实，具有特异性靶向抑制肿瘤细胞生长、有效规避了巨噬细胞吞噬的双重优势，为难溶性抗肿瘤药物提供了一种理想的新型药物载体和制剂形式。

Description

一种叶酸介导靶向的聚合物胶束

技术领域

本发明属药物制剂领域，涉及一种叶酸介导靶向聚合物胶束，尤其是一种包载难溶性抗肿瘤药物的叶酸介导靶向聚合物胶束。

背景技术

临床治疗肿瘤的药物，其中的难溶性抗肿瘤药物的给药，特别是注射给药的最大障碍是药物溶解度低，难于制备合适的制剂，往往需要采取各种增加溶解度的方法，如将药物制备成盐、加入助溶剂及表面活性剂增溶等。由于相对安全的表面活性剂较容易获得，所以通过表面活性剂增溶往往成为首选。例如紫杉醇(paclitaxel，PCL)是从红豆杉属植物紫杉的树干和树皮中提取得到的天然抗癌药，临床上主要用于卵巢癌、乳腺癌及非小细胞肺癌的治疗，其注射液治疗对顺铂耐药或未控制的卵巢癌亦有效，对食道癌和肺癌也有一定疗效。PCL难溶于水(＜6mg/L)，不稳定，口服生物利用度差。上市的注射剂所采用的增溶溶媒聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)易产生高敏性、神经毒性、肾毒性、心脏毒性等不良反应，且在给药过程中能够溶解静脉注射输液管中的增塑剂，加之PCL本身对心脏和肾脏等组织亦有毒副作用，而限制了PCL在临床上的应用。同样的情况也出现在喜树碱等抗肿瘤药物的注射剂中。因此研究开发难溶性抗肿瘤药物载体，对临床治疗有着重要的意义。近年来，两亲性嵌段共聚物的胶束载药系统引起了广泛的关注。

聚合物胶束作为药物载体发展于20世纪90年代，是由两亲性聚合物在水溶液中自发形成的一种自组装结构，亲水性片段形成外壳，疏水性片段形成内核，构成独特的核-壳结构，并将疏水性抗肿瘤药物包载于内核中；亲水性组分多为聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯(PEO)等；疏水性组分多为聚氧丙烯、聚苯乙烯、聚氨基酸、聚酯等，粒径一般为小于100nm，具有载药量高、载药范围广、稳定性好、体内滞留时间长以及增加药物的稳定性、提高生物利用度和降低毒副作用等特点，还可以连接具有特异性识别功能的配基对其表面进行修饰实现主动靶向给药，使药物有效地到达靶点。近年来，药物靶向传释系统作为治疗肿瘤和癌症的重要手段之一成为研究重点，既可以改善因抗肿瘤药物选择性不强而导致药物分布全身各器官的问题，又可以提高药物活性，降低药物毒副作用。

现有技术公开了叶酸(Folic acid)是一种分子结构中含有喋呤环的小分子维生素(VB₁₁)，在生理条件下很难自由透过细胞膜，必须进行内化才能被人体所吸收。研究发现两种内化叶酸的机制：一是低亲和力的跨膜蛋白，转运四氢叶酸、二氢叶酸(叶酸的还原态)进入细胞内；二是高亲和力的叶酸受体，可吸收叶酸进入细胞内。叶酸受体(FR)是一种糖蛋白膜受体，在某些实体肿瘤细胞膜表面高度表达，而在正常组织低表达，对于叶酸或叶酸的偶联物都有高度的亲和力，因此可介导含有叶酸及其偶联物的载体进入肿瘤细胞内。利用叶酸与叶酸受体特异性结合的特点，将叶酸连接到聚合物胶束表面，使聚合物胶束具有靶向肿瘤细胞的特性，从而提高抗肿瘤药物的生物利用度，降低毒副作用。

然而，叶酸分子过量会导致载药胶束被巨噬细胞吞噬，从而降低靶向肿瘤细胞的作用，降低药效。因此，研制一种可规避巨噬细胞吞噬的叶酸受体靶向纳米胶束作为难溶性抗肿瘤药物的载体，可以改变药物分布，增加药物在体内滞留时间，提高药物的肿瘤组织靶向性，在肿瘤靶向诊断和治疗中，有着广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种叶酸介导靶向的聚合物胶束，尤其是一种包载难溶性抗肿瘤药物的叶酸介导靶向聚合物胶束。本发明的聚合物胶束为可静脉注射的难溶性抗肿瘤药物叶酸受体靶向纳米胶束制剂，可有效规避巨噬细胞，延长药物在体内滞留时间，并具有良好的靶向肿瘤细胞的作用，增加药物在肿瘤组织分布，从而提高疗效，降低毒性。

本发明具体公开了叶酸受体靶向纳米胶束的载体材料的合成，以及通过筛选含叶酸材料在载体中所占比例，使载药胶束具有有效规避巨噬细胞的特点，并包载难溶性抗肿瘤药物，构建叶酸受体靶向纳米载药胶束给药系统。

本发明所述的的叶酸介导靶向的聚合物胶束，由叶酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺材料按0.1∶100-10∶100摩尔比形成，其包载有难溶性抗肿瘤药物。

所述的叶酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺两种材料中的聚乙二醇分子量为2300-5000，其中的磷脂酰乙醇胺选自二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(DSPE)、氢化豆磷脂乙醇胺(HSPE)、氢化蛋磷脂乙醇胺(HEPE)；其中的叶酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺与甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的摩尔比为0.1∶100-10∶100，优选摩尔比为1∶100。

所包载的难溶性药物选自紫杉烷类药物如紫杉醇、喜树碱类药物如9-硝基喜树碱、嗯环类药物如阿霉素。

本发明提供了可静脉注射的难溶性抗肿瘤药物叶酸受体靶向纳米胶束载体材料的制备方法，包括材料分离纯化，及纯度检测方法的建立。

本发明提供了可静脉注射的难溶性抗肿瘤药物叶酸受体靶向纳米胶束的制备方法，包括：

1)制备载体材料FA-PEG-DSPE

制备Folate-PEG-NH₂；

制备Folate-PEG-SUC；

制备Folate-PEG-DSPE；

2)制备载体材料MPEG-DSPE；

3)制备FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE为载体的载药胶束。

本发明的叶酸介导靶向的聚合物胶束进行了肿瘤细胞体外实验，实验结果表明，将FA-PEG-DSPE与MPEG-DSPE按照摩尔比0.1∶100-10∶100混合作为载体，优选摩尔比1∶100，采用成膜水化法包载难溶性抗肿瘤药物，制成的载药叶酸偶联聚合物胶束，能有效规避巨噬细胞，体外抗肿瘤活性显著高于无叶酸载药胶束以及游离药物。

附图说明

图1显示：载体材料FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE高效液相检测图谱。

图2显示：载体材料FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE分别对细胞产生毒性结果。

图3显示：载体材料的CMC测定结果，

其中，A：MPEG-DSPE；B：FA-PEG-DSPE。

图4显示：为本发明中实施例6中流式细胞法结合载药叶酸偶联胶束抑制肿瘤细胞生长法，筛选胶束载体材料中FA-PEG-DSPE与MPEG-DSPE的最佳比例。

具体实施方式

以下借助非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例1制备载体材料FA-PEG-DSPE

制备Folate-PEG-NH₂

取30.9mg(0.15mmol)DCC溶于5ml二甲亚砜(DMSO)，加入300mgNH₂-PEG-NH₂，66.2mg Folate，10μl吡啶，25℃搅拌24h，加入10ml蒸馏水终止反应，离心，取上清液，用蒸馏水透析，冻干。依次用DEAE Sepharose FF离子交换柱和Sephadex G-15柱结合AKTA explorer快速纯化系统进行分离纯化，冻干，得黄色的Folate-PEG-NH₂固体154mg。

制备Folate-PEG-SUC

取Folate-PEG-NH₂80.9mg溶于1ml DMF，SUC 23.8mg溶于1ml DMF，混合，50℃反应，点板检测反应进行。反应4h后加2ml蒸馏水终止反应，用SephadexG-15柱结合AKTA explorer快速纯化系统进行分离纯化，冻干，得黄色的Folate-PEG-SUC固体71mg。

制备Folate-PEG-DSPE

取Folate-PEG-SUC 71.7mg溶于1ml氯仿，DCC 5.8mg溶于0.5ml氯仿，混合，DSPE 122.2mg溶于3ml氯仿，加入上述溶液中，50℃反应，点板检测反应进行。5h后反应完全，旋蒸，除氯仿，真空干燥过夜。再加入乙醇50ml，搅拌10min，7500r/min 20min离心，取上清液，重复几次，合并上清液，过滤，旋蒸，除乙醇，真空干燥过夜，加蒸馏水搅拌，离心，取上清液冻干，得黄色的Folate-PEG-DSPE(FA-PEG-DSPE)58.7mg。

FA-PEG-DSPE纯度检测

将上述制得到的FA-PEG-DSPE，用HPLC法对其纯度进行检测，纯度为94.3％(图1，A/B)。

实施例2制备载体材料MPEG-DSPE

制备MeO-PEG-SUC

取MeO-PEG-NH₂200mg溶于2ml DMF，SUC 80mg溶于1ml DMF，混合，50℃反应，点板检测反应进行。反应4h后加2ml蒸馏水终止反应，用Sephadex G-15柱结合AKTA explorer快速纯化系统进行分离纯化，冻干，得白色的MeO-PEG-SUC固体159.9mg。

制备MeO-PEG-DSPE

取MeO-PEG-SUC 90mg溶于1ml氯仿，DCC 8mg溶于1ml氯仿，混合，DSPE 254.4mg溶于4ml氯仿，加入上述溶液中，50℃反应，点板检测反应进行。5h后反应完全，旋蒸，除氯仿，真空干燥过夜。再加入乙醇50ml，搅拌10min，7500r/min 20min离心，取上清液，重复几次，合并上清液，过滤，旋蒸，除乙醇，真空干燥过夜得白色的MeO-PEG-DSPE(MPEG-DSPE)86.7mg。

MPEG-DSPE纯度检测

将上述方法制备得到的MPEG-DSPE，用HPLC法对其纯度进行检测，纯度为95.8％(图1，C/D)。

实施例3载体材料细胞毒性检测

将对数生长期的宫颈癌细胞HeLa以7.5×10³cells/well，接种于96孔板，24h后分别给予由胶束载体材料FA-PEG-DSPE与MPEG-DSPE配制成的0.2～20uM的胶束溶液，置于37℃培养箱中培育48h后，加入20μl 5mg/ml的MTT溶液，37℃培养4h后将培养液替换成200μl DMSO，振荡10min，用酶标仪在490nm测定吸光度值。

结果显示，在0.2～20uM浓度范围内，FA-PEG-DSPE的细胞存活率为93.47±3.402％～73.20±2.043％，MPEG-DSPE的细胞存活率为96.21±7.261％～84.18±1.697％，说明载体材料本身对细胞的毒性较小，对接下来的药物敏感性试验的影响较小(图2)。

实施例4载体材料CMC测定

采用芘荧光探针法。分别配置一系列浓度的FA-PEG-DSPE/芘，以及MPEG-DSPE/芘的无水氯仿溶液，加入到干净的试管中，用氮气吹干氯仿，并真空避光干燥过夜；在各试管中加入一定量的10mM，pH7.4的HBS缓冲液，使各试管中FA-PEG-DSPE和MPEG-DSPE的浓度为0.002～0.04mg/ml，芘的浓度为0.014mg/ml，将混合液置于25℃水浴避光振荡24h后，过滤除去游离的芘，并采用荧光光谱法检测包载于胶束中的芘的浓度，激发波长350nm，发射波长440nm。

测定结果通过数据处理得出FA-PEG-DSPE和MPEG-DSPE的CMC分别为1.0×10^-5M和0.97×10^-5M(图3)。

实施例5制备FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE为载体的载药胶束

制备紫杉醇(PCL)载药胶束

将MPEG-DSPE与FA-PEG-DSPE按摩尔比100∶1溶于无水氯仿中，加入PCL的乙腈溶液，旋蒸成膜后放入真空干燥箱过夜挥净有机溶液，用一定量的10mMpH7.4的HBS水化，37℃水浴振荡20min，用220nm膜过滤除去未包载的药物，得到载药胶束溶液。

PCL在乙腈/水＝52/48(v/v)中230nm处的标准曲线方程为：

y＝94.099x+24.008(r＝0.9998)x为PCL浓度(μg/ml)，A为吸光度。

制备9-硝基喜树碱(9-NC)载药胶束

将MPEG-DSPE与FA-PEG-DSPE按摩尔比100∶1溶于无水氯仿中，加入9-NC的乙腈溶液，旋蒸成膜后放入真空干燥箱过夜挥净有机溶液，用一定量的10mM pH5.5的HBS水化，37℃水浴振荡20min，用220nm膜过滤除去未包载的药物，得到载药胶束溶液。

9-NC在甲酸/水/乙腈＝0.169/45/55(v/v/v)中368nm处的标准曲线方程为：

y＝46.182x+2.3065(r＝0.9999)x为9-NC浓度(μg/ml)，A为吸光度。

制备阿霉素(DOX)载药胶束

将MPEG-DSPE与FA-PEG-DSPE按摩尔比100∶1溶于无水氯仿中，加入DOX的甲醇溶液(DOX与三乙胺摩尔比1∶2.2)，旋蒸成膜后放入真空干燥箱过夜挥净有机溶液，用一定量的10mM pH7.0的HBS水化，37℃水浴振荡20min，透析除去未包载的药物并冻干，得到载药胶束粉末。

DOX在0.01M磷酸二氢钾溶液(用冰醋酸调节pH 3.0)/乙腈＝70/30(v/v)中480nm处的标准曲线方程为：

y＝21.868x-10.086(r＝0.9998)x为DOX浓度(μg/ml)，A为吸光度。

所得载药胶束平均粒径均为25nm左右，成圆整球形。

实施例6筛选载药胶束中FA-PEG-DSPE与MPEG-DSPE的最佳比例

采用FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE摩尔比分别为0∶100，1∶100，2∶100，5∶100，10∶100，制备包载罗丹明123(Rh-123)的纳米胶束。分别加入到正常培养的巨噬细胞RAW264.7中约1h后，消化并用pH7.4的PBS洗涤3遍，采用流式细胞术(FCM)进行检测，结果显示：

FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE摩尔比为0∶100和1∶100时，没有表达荧光的巨噬细胞；2∶100时表达荧光的巨噬细胞为0.11％；5∶100时表达荧光的巨噬细胞为67.06％，10∶100时表达荧光的巨噬细胞为98.30％。

采用FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE摩尔比分别为0.1∶100，0.2∶100，1∶100，2∶100，5∶100，制备包载9-NC的纳米胶束(9-NC浓度为0.9μg/ml)。分别加入到接种于96孔板的HeLa细胞中，在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO₂、饱和湿度)连续培养24h后，采用MTT法测定细胞存活率。结果显示：

FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE摩尔比为0.1∶100时，细胞存活率为52.19％，0.1∶100时为51.29％，0.2∶100时为48.78％，0.5∶100时为35.42％，1∶100时为22.19％，2∶100时为21.15％，5∶100时为21.0％。

优选FA-PEG-DSPE/MeO-PEG-DSPE摩尔比1∶100构建混合胶束(图4)。

实施例7难溶性抗肿瘤药物叶酸受体靶向纳米胶束对体外肿瘤细胞的抑制作用

用含10％小牛血清(BCS)的RPMI1640培养液，在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO₂、饱和湿度)连续培养HeLa、SGC7901、BXPC3三种细胞，分别以7.5×10³cells/well接种于96孔板，24h后，将培养液替换为200μl的叶酸偶联载药胶束、无叶酸载药胶束及游离药物三种制剂，继续相同条件培养24h后采用MTT法测定细胞存活率。结果表明：叶酸偶联载药胶束有明显的抑制肿瘤细胞生长作用，三种溶液制剂的抑制作用程度依次为：叶酸偶联胶束＞无叶酸胶束＞游离药物。结果表明，叶酸偶联胶束具有较好的肿瘤细胞靶向性。

表1是9-NC纳米胶束在体外对肿瘤细胞HeLa、SGC7901、BXPC3抑制作用的IC₅₀值比较。

表1

Claims (7)

1.一种叶酸介导靶向的聚合物胶束，其特征在于，由叶酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺材料按0.1∶100-10∶100摩尔比形成叶酸介导靶向的聚合物胶束，其包载有难溶性抗肿瘤药物。

2.根据权利要求1所述的叶酸介导靶向的聚合物胶束，其特征在于，所述叶酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺与甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的摩尔比为1∶100。

3.根据权利要求1所述的叶酸介导靶向的聚合物胶束，其特征在于，所述叶酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺材料中的聚乙二醇分子量为2300-5000。

4.根据权利要求1所述的叶酸介导靶向的聚合物胶束，其特征在于，所述磷脂酰乙醇胺选自二硬脂酸磷脂酰乙醇胺、氢化豆磷脂乙醇胺或氢化蛋磷脂乙醇胺。

5.根据权利要求1所述的叶酸介导靶向的聚合物胶束，其特征在于，所包载的难溶性药物选自紫杉烷类药物、喜树碱类药物或嗯环类药物。

6.根据权利要求5所述的叶酸介导靶向的聚合物胶束，其特征在于，所包载的难溶性药物选自紫杉醇、9-硝基喜树碱或阿霉素。

7.权利要求1的叶酸介导靶向的聚合物胶束，其特征在于是可静脉注射的难溶性抗肿瘤药物叶酸受体靶向纳米胶束制剂。

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