CN111375069A - 一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物及其制备方法 - Google Patents

一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物，包括负载紫杉醇的TPP‑PEG‑EBMB胶束，制备方法包括：S1.以聚乙二醇单甲醚、4‑溴甲基苯甲酸乙酯为原料，得到EBMB‑PEG；S2.将所述EBMB‑PEG单端氨基化得到EBMB‑PEG‑NH2；S3.将所述EBMB‑PEG‑NH2与TPP聚合，得到TPP‑PEG‑EBMB；S4.利用溶剂法制备载紫杉醇的TPP‑PEG‑EBMB胶束，通过聚乙二醇衍生物的修饰，提高紫杉醇线粒体靶向性。

Description

一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物及其制备方法
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤成为严重威胁人类健康的疾病，据统计每年因病致死的人中有21.75%死于癌症。目前大量研究证实，肿瘤的发生发展与细胞凋亡密切相关，而线粒体对细胞凋亡具有调控作用。紫杉醇为线粒体介导的抗肿瘤药物，在临床上用于乳腺癌、肺癌、鼻咽癌和卵巢癌等多种癌症的治疗。文献表明紫杉醇可以提高线粒体膜通透性，使胞浆内钙离子浓度升高，线粒体膜电位下降，影响肿瘤细胞周期，增加细胞凋亡率。但紫杉醇属于亲脂性小分子，存在水难溶性、对肿瘤细胞无选择性，故到达细胞线粒体的量过少，导致临床上疗效不理想，而加大给药剂量又会引起严重的耐药性。因此，提高紫杉醇水溶性及线粒体靶向性对于增强药物的疗效至关重要。
现有技术中，通常通过制备PEG 氨基酸衍生物，并通过氨基酸连接臂将 PEG 连接到紫杉醇上以增强水溶性；而提高靶向性一般有被动靶向和主动靶向两种，主动靶向是利用利用细胞表面的受体对配体的特异性识别来实现的定向运输，通过在载药纳米颗粒表面结合一些特定的配体，如叶酸、抗体和一些小分子多肽、模拟物等，通过它们与肿瘤组织中对应过表达受体的结合来实现药物前体在肿瘤组织中的聚集，其应用受受体表达对象的限制，并非对所有肿瘤细胞有效；被动靶向又称EPR效应，主要是指借助效应获得大分子纳米药物在肿瘤组织中的蓄积来增强对病变组织的靶向作用，靶向性不强，需对其结构进行进一步的修饰。
申请号为CN103768046的专利公开了一种注射用紫杉醇纳米晶体及其制备方法，所制备的紫杉醇纳米晶体进入体内以后，利用网状内皮系统(RES)的靶向识别来作用于肿瘤细胞，但易被当作异物吞噬，靶向性不强，同时易蓄积在RES丰富的组织，比如肝、和脾，引起血药浓度的急剧降低，需要浓度不稳定。
发明内容
本发明提供一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物及其制备方法，通过聚乙二醇衍生物的修饰，提高紫杉醇线粒体靶向性。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物，包括负载紫杉醇的TPP-PEG-EBMB胶束，(3-丙羧基)三苯基溴化膦（TPP）阳离子可介导肿瘤药物、高分子聚合药物靶向进入线粒体，EBMB作为间隔臂降低紫杉醇的水解率，保证靶向性的同时克服由于靶向修饰带来的快速水解的问题。
优选地，所述聚乙二醇的分子量为5kDa-20kDa，若聚乙二醇分子量太大，由于聚乙二醇链长增长空间位阻增大，会遮蔽药物表面的一些基团，则修饰后的药物水解活力会下降，若聚乙二醇分子量太小，则形成不了胶束；
进一步地，还提供一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物的制备方法，包括以下步骤：
S1.以聚乙二醇单甲醚、4-溴甲基苯甲酸乙酯为原料，得到EBMB-PEG；EBMB-PEG为两亲性共聚物能在水介质中形成具有疏水性内核与亲水性外壳的超分子聚集体，疏水性内核包载药物，提高难溶性药物的溶解度，并可保护药物不降解，同时控制药物缓慢释放，同时纳米胶束可通过网格蛋白和小窝蛋白的介导，增强药物的跨膜转运和细胞内蓄积能力，还可以内吞的形式进入细胞，增强对肿瘤细胞的靶向性。
S2.将所述EBMB-PEG单端氨基化得到EBMB-PEG-NH2，为下一步偶联TPP做准备；
S3.将所述EBMB-PEG-NH2与TPP聚合，得到TPP-PEG-EBMB，TPP 阳离子具有线粒体靶向性，鉴于线粒体内膜带150-180 mV负电荷，细胞膜带30-60 mV 负电荷，而TPP 为三苯基膦阳离子带正电荷，正负电荷相互吸引，促使TPP 阳离子聚集于线粒体的能力提高100-500倍，能够克服高黏度细胞液的阻碍，增强所制备的嵌段聚合物对肿瘤细胞的靶向性；
S4.利用溶剂法制备载紫杉醇的TPP-PEG-EBMB胶束，本方案是通过酯化反应将TPP-PEG-EBMB键合到紫杉醇的2’-OH上，EBMB作为间隔臂连接紫杉醇，同时紫杉醇作为亲脂性小分子药物，包裹在疏水性PE 内核中，形成了较为稳定的纳米胶束体系，故紫杉醇在释药非常缓慢，有助于延长药物的体内循环时间，提高药物的生物利用度；
优选地，所述S4步骤还包括添加助溶剂，助溶剂同时含有疏水基团和亲水基团，亲水基团引入内核嵌段用来增加胶束内核同疏水药物的相容性，提高载药量，优选地，所述助溶剂为烟酰胺及其衍生物，其衍生物具体可以为二甲基烟酰胺。
优选地，所述S2步骤如下：将EBMB-PEG经氯代、叠氮化、氢化还原，得到所述EBMB-PEG-NH2，所述S4步骤中紫杉醇与TPP-PEG-EBMB的摩尔比为3-5:10，若紫杉醇含量太高，负载量有限，则浪费紫杉醇，若紫杉醇含量过低，则TPP-PEG-EBMB位点未完全反应。
优选地，所述S1步骤的反应温度为80-100℃，反应时间为20-24小时，本方案中用油浴加热，保证反应进行且不会因温度过高而产生过多副产物。
优选地，还包括加入保护剂冻存所述载紫杉醇的TPP-PEG-EBMB胶束。
优选地，所述保护剂包括海藻糖、甘露醇、羟丙基β-环糊精、蔗糖、泊洛萨姆中的至少两种，保护剂在在胶束制备完成后冻存之前添加的，添加了保护剂的胶束保存更为稳定，且解冻后使用的活性降低较小。
本方案的有益效果在于：
1. TPP 阳离子聚集于线粒体的能力提高100-500 倍，能够克服高黏度细胞液的阻碍，增强所制备的嵌段聚合物对肿瘤细胞的靶向性；
2. EBMB作为间隔臂连接紫杉醇，克服单纯的PEG修饰靶向修饰带来的快速水解的问题；
3. PEG-EBMB可通过网格蛋白和小窝蛋白的介导，增强药物的跨膜转运和细胞内蓄积能力，还可以内吞的形式进入细胞，增强对肿瘤细胞的靶向性。
4.由于TPP-PEG-EBMB对酸不敏感，以其嵌段聚合物负载紫杉醇无论在酸性还是中性环境中，紫杉醇原药从聚合物载体水解下来的速度都很慢，稳定性强；
5. 添加保护剂在在胶束制备完成后冻存之前添加的，添加了保护剂的胶束保存更为稳定，且解冻后使用的活性降低较小。
6. 添加助溶剂同时含有疏水基团和亲水基团，亲水基团引入内核嵌段用来增加胶束内核同疏水药物的相容性，提高载药量。
说明书附图
图1为实施例及对比例中紫杉醇降解率的结果。
具体实施方式
下面通过实施例及附图对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
制备EBMB-PEG：
将10g干燥过的聚乙二醇单甲醚（M=2000）加入到20ml干燥过的四氢呋喃中，在氮气保护的情况下向其中加入0.5g氢化纳粉末，立即产生大量气泡，室温下搅拌4小时。
将4-溴甲基苯甲酸乙酯溶于5ml干燥过的四氢呋喃中，冰浴滴加到上述反应液中，滴加在半小时内完成，继续反应2小时，加水终止反应。旋蒸除去四氢呋喃和水，然后用90ml二氯甲烷分三次溶解产物，合并所有的二氯甲烷，离心取上清液，旋蒸掉大部分二氯甲烷后再用正己烷沉淀三次。旋蒸除去溶剂，然后加入1mol/ml的氢氧化钠水溶液溶解粗产物，80℃油浴反应24小时，待反应结束冷却后，用浓盐酸将上述溶液调至酸性。旋蒸除去溶剂，用90ml二氯甲烷分三次溶解产物，再合并所有的二氯甲院，离心取上清液，旋蒸除去溶剂，即得到产物EBMB-PEG。
氨基化制备得到EBMB-PEG-NH2：
取EBMB-PEG 2000 80g(0.04mol)溶于甲苯350ml中，再加入吡啶8ml和氯化亚砜23ml，120℃回流2h。反应液冷至室温，过滤，滤液减压蒸除甲苯，冷至室温。所得黏稠液体中加入二氯甲烷300ml和Al2O3200g(2mol)，搅拌2h，过滤。滤液减压蒸去二氯甲烷。剩余物滴至冷无水乙醚2.5L中，析出白色沉淀，抽滤，滤饼减压干燥，得白色粉末状固体；
将上述白色粉末溶于DMF 400ml中，加入叠氮化钠35g(0.54mol)，115℃回流2h，冷至室温，过滤。滤液减压蒸除DMF，冷至室温，用二氯甲烷300ml溶解，过滤，滤液浓缩后滴至冷无水乙醚3L中沉淀，抽滤，滤饼减压干燥，得白色固体。
将如上所得白色固体(52g，0.025mol)溶于无水乙醇-二氯甲烷(6∶1)混合溶剂300ml中，加10％钯炭3g，室温5atm氢化24h。反应液经0.22μm微孔滤膜抽滤，滤液浓缩后滴至冷无水乙醚3L中沉淀，抽滤，滤饼减压干燥，得白色粗品，即EBMB-PEG-NH2。
制备TPP-PEG-EBMB：
称取100mgCTPP溶于10ml氯仿，加入200μl三乙胺，124mgEDC和74mgNHS，室温搅拌2h，然后再加入25ml浓度为25mg/ml EBMB-PEG-NH2的氯仿溶液，再氮气的保护下，室温搅拌过夜，粗反应物采用冰乙醚多次洗涤，离心取下层沉淀物，再冷冻干燥，即获得TPP-PEG-EBMB嵌段共聚物。
制备载紫杉醇的TPP-PEG-EBMB胶束：
称取紫杉醇原料5mol，TPP-PEG-EBMB 10mol，1mg烟酰胺，加入色谱纯甲醇20 mL促使两者完全溶解，转移至旋蒸瓶中，通入适量氮气排除空气进行保护，启动旋转蒸发仪，于40 ℃温度下形成一层均匀的干燥薄膜，再在低温真空条件下冷冻干燥12 h 除尽残留的有机溶剂，加入适量PBS 轻微搅拌促进薄膜水合，40 ℃水浴下水化1 h 后，再超声0.5 h 促进粒子分散，0.2 μm 微孔滤膜滤过，添加羟丙基β-环糊精、蔗糖，最后采用低温冷冻干燥24 h，即得所述载紫杉醇TPP-PEG-EBMB纳米胶束。
将亲脂性红色荧光剂DID包裹在TPP-PEG-EBMB纳米胶束内核，制备载DID的TPP-PEG-EBMB纳米胶束，负载方法如下：将18mgTPP-PEG-EBMB、2.34mg DID、1mg烟酰胺溶解于3ml乙腈中，在40℃下旋转蒸发约2h除去有机溶剂，加入5ml注射用水在40℃的水浴锅中搅拌1h，0.8μm滤膜过滤，得载DID的TPP-PEG-EBMB纳米胶束。
实施例2
制备EBMB-PEG：
将10g干燥过的聚乙二醇单甲醚（M=2000）加入到20ml干燥过的四氢呋喃中，在氮气保护的情况下向其中加入0.5g氢化纳粉末，立即产生大量气泡，室温下搅拌4小时。
将4-溴甲基苯甲酸乙酯溶于5ml干燥过的四氢呋喃中，冰浴滴加到上述反应液中，滴加在半小时内完成，继续反应2小时，加水终止反应。旋蒸除去四氢呋喃和水，然后用90ml二氯甲烷分三次溶解产物，合并所有的二氯甲烷，离心取上清液，旋蒸掉大部分二氯甲烷后再用正己烷沉淀三次。旋蒸除去溶剂，然后加入1mol/ml的氢氧化钠水溶液溶解粗产物，100℃油浴反应20小时，待反应结束冷却后，用浓盐酸将上述溶液调至酸性。旋蒸除去溶剂，用90ml二氯甲烷分三次溶解产物，再合并所有的二氯甲院，离心取上清液，旋蒸除去溶剂，即得到产物EBMB-PEG。
氨基化制备得到EBMB-PEG-NH2：
取EBMB-PEG 2000 80g(0.04mol)溶于甲苯350ml中，再加入吡啶8ml和氯化亚砜23ml，120℃回流2h。反应液冷至室温，过滤，滤液减压蒸除甲苯，冷至室温。所得黏稠液体中加入二氯甲烷300ml和Al2O3200g(2mol)，搅拌2h，过滤。滤液减压蒸去二氯甲烷。剩余物滴至冷无水乙醚2.5L中，析出白色沉淀，抽滤，滤饼减压干燥，得白色粉末状固体；
将上述白色粉末溶于DMF 400ml中，加入叠氮化钠35g(0.54mol)，115℃回流2h，冷至室温，过滤。滤液减压蒸除DMF，冷至室温，用二氯甲烷300ml溶解，过滤，滤液浓缩后滴至冷无水乙醚3L中沉淀，抽滤，滤饼减压干燥，得白色固体。
将如上所得白色固体(52g，0.025mol)溶于无水乙醇-二氯甲烷(6∶1)混合溶剂300ml中，加10％钯炭3g，室温5atm氢化24h。反应液经0.22μm微孔滤膜抽滤，滤液浓缩后滴至冷无水乙醚3L中沉淀，抽滤，滤饼减压干燥，得白色粗品，即EBMB-PEG-NH2。
制备TPP-PEG-EBMB：
称取100mgCTPP溶于10ml氯仿，加入200μl三乙胺，124mgEDC和74mgNHS，室温搅拌2h，然后再加入25ml浓度为25mg/ml EBMB-PEG-NH2的氯仿溶液，再氮气的保护下，室温搅拌过夜，粗反应物采用冰乙醚多次洗涤，离心取下层沉淀物，再冷冻干燥，即获得TPP-PEG-EBMB嵌段共聚物。
制备载紫杉醇的TPP-PEG-EBMB胶束：
称取紫杉醇原料3mol，TPP-PEG-EBMB 10mol，1mg烟酰胺，加入色谱纯甲醇20 mL促使两者完全溶解，转移至旋蒸瓶中，通入适量氮气排除空气进行保护，启动旋转蒸发仪，于40 ℃温度下形成一层均匀的干燥薄膜，再在低温真空条件下冷冻干燥12 h 除尽残留的有机溶剂，加入适量PBS 轻微搅拌促进薄膜水合，40 ℃水浴下水化1 h 后，再超声0.5 h 促进粒子分散，0.2 μm 微孔滤膜滤过，添加海藻糖、甘露醇，最后采用低温冷冻干燥24 h，即得所述载紫杉醇TPP-PEG-EBMB纳米胶束。
将亲脂性红色荧光剂DID包裹在TPP-PEG-EBMB纳米胶束内核，制备载DID的TPP-PEG-EBMB纳米胶束，负载方法如下：将18mgTPP-PEG-EBMB、2.34mg DID、1mg二甲基亚酰胺溶解于3ml乙腈中，在40℃下旋转蒸发约2h除去有机溶剂，加入5ml注射用水在40℃的水浴锅中搅拌1h，0.8μm滤膜过滤，得载DID的TPP-PEG-EBMB纳米胶束。
实施例3
制备EBMB-PEG：
将10g干燥过的聚乙二醇单甲醚（M=2000）加入到20ml干燥过的四氢呋喃中，在氮气保护的情况下向其中加入0.5g氢化纳粉末，立即产生大量气泡，室温下搅拌4小时。
将4-溴甲基苯甲酸乙酯溶于5ml干燥过的四氢呋喃中，冰浴滴加到上述反应液中，滴加在半小时内完成，继续反应2小时，加水终止反应。旋蒸除去四氢呋喃和水，然后用90ml二氯甲烷分三次溶解产物，合并所有的二氯甲烷，离心取上清液，旋蒸掉大部分二氯甲烷后再用正己烷沉淀三次。旋蒸除去溶剂，然后加入1mol/ml的氢氧化钠水溶液溶解粗产物，90℃油浴反应22小时，待反应结束冷却后，用浓盐酸将上述溶液调至酸性。旋蒸除去溶剂，用90ml二氯甲烷分三次溶解产物，再合并所有的二氯甲院，离心取上清液，旋蒸除去溶剂，即得到产物EBMB-PEG。
氨基化制备得到EBMB-PEG-NH2：
取EBMB-PEG 2000 80g(0.04mol)溶于甲苯350ml中，再加入吡啶8ml和氯化亚砜23ml，120℃回流2h。反应液冷至室温，过滤，滤液减压蒸除甲苯，冷至室温。所得黏稠液体中加入二氯甲烷300ml和Al2O3200g(2mol)，搅拌2h，过滤。滤液减压蒸去二氯甲烷。剩余物滴至冷无水乙醚2.5L中，析出白色沉淀，抽滤，滤饼减压干燥，得白色粉末状固体；
将上述白色粉末溶于DMF 400ml中，加入叠氮化钠35g(0.54mol)，115℃回流2h，冷至室温，过滤。滤液减压蒸除DMF，冷至室温，用二氯甲烷300ml溶解，过滤，滤液浓缩后滴至冷无水乙醚3L中沉淀，抽滤，滤饼减压干燥，得白色固体。
将如上所得白色固体(52g，0.025mol)溶于无水乙醇-二氯甲烷(6∶1)混合溶剂300ml中，加10％钯炭3g，室温5atm氢化24h。反应液经0.22μm微孔滤膜抽滤，滤液浓缩后滴至冷无水乙醚3L中沉淀，抽滤，滤饼减压干燥，得白色粗品，即EBMB-PEG-NH2。
制备TPP-PEG-EBMB：
称取100mgCTPP溶于10ml氯仿，加入200μl三乙胺，124mgEDC和74mgNHS，室温搅拌2h，然后再加入25ml浓度为25mg/ml EBMB-PEG-NH2的氯仿溶液，再氮气的保护下，室温搅拌过夜，粗反应物采用冰乙醚多次洗涤，离心取下层沉淀物，再冷冻干燥，即获得TPP-PEG-EBMB嵌段共聚物。
制备载紫杉醇的TPP-PEG-EBMB胶束：
称取紫杉醇原料3mol，TPP-PEG-EBMB 7mol，1mg烟酰胺，加入色谱纯甲醇20 mL促使两者完全溶解，转移至旋蒸瓶中，通入适量氮气排除空气进行保护，启动旋转蒸发仪，于40 ℃温度下形成一层均匀的干燥薄膜，再在低温真空条件下冷冻干燥12 h 除尽残留的有机溶剂，加入适量PBS 轻微搅拌促进薄膜水合，40 ℃水浴下水化1 h 后，再超声0.5 h 促进粒子分散，0.2 μm 微孔滤膜滤过，添加蔗糖、泊洛萨姆，最后采用低温冷冻干燥24 h，即得所述载紫杉醇TPP-PEG-EBMB纳米胶束。
将亲脂性红色荧光剂DID包裹在TPP-PEG-EBMB纳米胶束内核，制备载DID的TPP-PEG-EBMB纳米胶束，负载方法如下：将18mgTPP-PEG-EBMB、2.34mg DID、1mg烟酰胺溶解于3ml乙腈中，在40℃下旋转蒸发约2h除去有机溶剂，加入5ml注射用水在40℃的水浴锅中搅拌1h，0.8μm滤膜过滤，得载DID的TPP-PEG-EBMB纳米胶束。
对比例1
制备载紫杉醇的PEG-EBMB胶束：
将10g干燥过的聚乙二醇单甲醚（M=2000）加入到20ml干燥过的四氢呋喃中，在氮气保护的情况下向其中加入0.5g氢化纳粉末，立即产生大量气泡，室温下搅拌4小时。
将4-溴甲基苯甲酸乙酯溶于5ml干燥过的四氢呋喃中，冰浴滴加到上述反应液中，滴加在半小时内完成，继续反应2小时，加水终止反应。旋蒸除去四氢呋喃和水，然后用90ml二氯甲烷分三次溶解产物，合并所有的二氯甲烷，离心取上清液，旋蒸掉大部分二氯甲烷后再用正己烷沉淀三次。旋蒸除去溶剂，然后加入1mol/ml的氢氧化钠水溶液溶解粗产物，80℃油浴反应24小时，待反应结束冷却后，用浓盐酸将上述溶液调至酸性。旋蒸除去溶剂，用90ml二氯甲烷分三次溶解产物，再合并所有的二氯甲院，离心取上清液，旋蒸除去溶剂，即得到产物EBMB-PEG。
称取紫杉醇原料3mol，EBMB-PEG 7mol，1mg烟酰胺，加入色谱纯甲醇20 mL促使两者完全溶解，转移至旋蒸瓶中，通入适量氮气排除空气进行保护，启动旋转蒸发仪，于40 ℃温度下形成一层均匀的干燥薄膜，再在低温真空条件下冷冻干燥12 h 除尽残留的有机溶剂，加入适量PBS 轻微搅拌促进薄膜水合，40 ℃水浴下水化1 h 后，再超声0.5 h 促进粒子分散，0.2 μm 微孔滤膜滤过，最后采用低温冷冻干燥24 h，即得所述载紫杉醇EBMB-PEG纳米胶束。
将亲脂性红色荧光剂DID包裹在EBMB-PEG纳米胶束内核，制备载DID的EBMB-PEG纳米胶束，负载方法同上述负载紫杉醇的方法。
对比例2
制备载紫杉醇的TPP-PEG胶束：
称取100mgCTPP溶于10ml氯仿，加入200μl三乙胺，124mgEDC和74mgNHS，室温搅拌2h，然后再加入25ml浓度为25mg/ml PEG-NH2的氯仿溶液，再氮气的保护下，室温搅拌过夜，粗反应物采用冰乙醚多次洗涤，离心取下层沉淀物，再冷冻干燥，即获得TPP-PEG嵌段共聚物。
称取紫杉醇原料3mol，TPP-PEG 7mol，1mg烟酰胺，加入色谱纯甲醇20 mL促使两者完全溶解，转移至旋蒸瓶中，通入适量氮气排除空气进行保护，启动旋转蒸发仪，于40 ℃温度下形成一层均匀的干燥薄膜，再在低温真空条件下冷冻干燥12 h 除尽残留的有机溶剂，加入适量PBS 轻微搅拌促进薄膜水合，40 ℃水浴下水化1 h 后，再超声0.5 h 促进粒子分散，0.2 μm 微孔滤膜滤过，最后采用低温冷冻干燥24 h，即得所述载紫杉醇TPP-PEG纳米胶束。
将亲脂性红色荧光剂DID包裹在TPP-PEG纳米胶束内核，制备载DID的TPP-PEG纳米胶束，负载方法如下：将18mg TPP-PEG、2.34mg DID、1mg烟酰胺溶解于3ml乙腈中，在40℃下旋转蒸发约2h除去有机溶剂，加入5ml注射用水在40℃的水浴锅中搅拌1h，0.8μm滤膜过滤，得载DID的TPP-PEG纳米胶束。
实施例4
对实施例1-3及对比例1-2所制备的载药胶束做靶向性评价，具体步骤如下：
将A549 肺癌细胞以1×105 个的密度接种于24孔培养板内，用血清培养基培养48 h，将荧光剂质量浓度为100 ng/mL 的载DID纳米胶束，再与细胞共同孵育2 h，孵育结束后换用无血清培养基，采用100 nmol/L 的Mitotracker Green（MTG，线粒体绿色荧光探针）使线粒体染色30 min（显绿色），5μg/mL 的Hoechst 33342 使细胞核染色5 min（显蓝色），采用激光共聚焦显微镜观察这5 种荧光标记纳米胶束进入线粒体情况，激光共聚显示，蓝色标记的细胞核部位蓝色标记的细胞核部位均有DID 的红色荧光出现，但载DID TPP-PEG-EBMB纳米胶束大部分聚集在绿色荧光标记的线粒体周围，而载DID PEG-EBMB相对较少。由此分析，TPP-PEG-EBMB纳米胶束有助于DID的跨膜转运进入细胞，可能是由于TPP 阳离子由于呈正电荷，可以加快载药系统跨越负电荷的线粒体膜，增强药物的线粒体靶向性。
实施例5
对实施例1-3及对比例1-2所制备的载药胶束做降解效果评价，具体步骤如下：
将实施例1-3及对比例1-2所制备的载药胶束在PBS（pH7.4,0.01M）,37℃条件下孵育一天，通过HPLC检测紫杉醇的释放率，结果如图1所示，可知，载紫杉醇的 TPP-PEG-EBMB胶束，释放药物慢，药物半衰期长，缓释效果好。
本发明的内容并不局限在上述的实施例中，本领域技术人员在本发明的技术指导思想内得出的其他实施例，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物，其特征在于，包括负载紫杉醇的TPP-PEG-EBMB胶束。
2.根据权利要求1所述的一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为5kDa-20kDa。
3.根据权利要求1所述的一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.以聚乙二醇单甲醚、4-溴甲基苯甲酸乙酯为原料，得到EBMB-PEG；
S2.将所述EBMB-PEG单端氨基化得到EBMB-PEG-NH2；
S3.将所述EBMB-PEG-NH2与TPP聚合，得到TPP-PEG-EBMB；
S4.利用溶剂法制备载紫杉醇的TPP-PEG-EBMB胶束。
4.根据权利要求3所述的一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物的制备方法，其特征在于，所述S4步骤还包括添加助溶剂。
5.根据权利要求4所述的一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物的制备方法，其特征在于，所述助溶剂为烟酰胺及其衍生物。
6.根据权利要求3所述的一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物的制备方法，其特征在于，所述S2步骤如下：将EBMB-PEG经氯代、叠氮化、氢化还原，得到所述EBMB-PEG-NH2。
7.根据权利要求3所述的一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物的制备方法，其特征在于，所述S4步骤中紫杉醇与TPP-PEG-EBMB的摩尔比为3-5:10。
8.根据权利要求3所述的一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物的制备方法，其特征在于，所述S1步骤的反应温度为80-100℃，反应时间为20-24小时。
9.根据权利要求3所述的一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物的制备方法，其特征在于，还包括加入保护剂冻存所述载紫杉醇的TPP-PEG-EBMB胶束。
10.根据权利要求9所述的一种靶向释放的聚乙二醇改性紫杉醇药物的制备方法，其特征在于，所述保护剂包括海藻糖、甘露醇、羟丙基β-环糊精、蔗糖、泊洛萨姆中的至少两种。
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