RS61273B1 - Lipozomska kompozicija i postupak za njeno dobijanje - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE PREDMETNOG PRONALASKA

1. Oblast predmetnog pronalaska

[0001] Ovaj predmetni pronalazak odnosi se na lipozomsku kompoziciju i postupak za njeno dobijanje. Predmetni pronalazak odnosi se na lipozomsku kompoziciju koja se poželjno može koristiti za farmaceutske primene i postupak za njeno dobijanje.

2. Opis odgovarajućeg stanja tehnike

[0002] Lipozom (u daljem tekstu, takođe poznat kao lipidna vezikula) je zatvorena vezikula formirana od lipidne dvoslojne membrane pomoću lipida, i ima vodenu fazu (unutrašnja vodena faza) u prostoru zatvorene vezikule. Lipozomi su obično prisutni u dispergovanom stanju u vodenom rastvoru (spoljna vodena faza) izvan zatvorene vezikule. Lipozomi su proučavani za razne primene kao što su imuni senzori, veštačke crvene krvne ćelije, i nosači sistema za isporuku lekova koristeći prednosti svojstava kao što su barijerni kapacitet, kapacitet zadržavanja jedinjenja, biokompatibilnost, stepen slobode postavljanja veličine čestice, podesna biorazgradivost i svojstva koja modifikuju površinu. Kod primena nosača, lipozomi mogu da inkapsuliraju jedinjenja rastvorljiva u vodi, lipofilne materije niske molekulske težine, polimere i širok spektar materijala.

[0003] U slučaju kada se lipozomi koriste naročito kao nosač sistema za isporuku leka, potrebno je napraviti veličinu čestice da bude oko 200 nm ili manje u smislu prolaska kroz biološku membranu. Dalje, u nosaču za sistem za isporuku leka, takođe je neophodno imati lipozome koji formiraju čestice koje se dobro disperguju pod temperaturnim uslovima od oko 37°C što je telesna temperatura sisara. Konkretno, s obzirom na fine čestice nano-veličine, poželjno je da se pruži stabilnost očuvanja sa različitih tački gledišta kao što je agregacija, taloženje, i curenje lekova.

[0004] Kao nosač sistema za isporuku leka, u slučaju kada se lek (rastvor ili slično koji sadrži lipozome koji sadrže lek) administrira intravenoznom injekcijom, potrebna je visoka bezbednost proizvoda za intravenoznu injekciju. Aditivi kao što su hlorovani rastvarači, na primer hloroform, ili pomoćna sredstva za dispergovanje čija upotreba nije dozvoljena su nepoželjni. Pored toga, takođe je neophodno i pružanje stabilnosti farmaceutskom proizvodu i shodno tome suzbijanje curenja leka, razgradnje lipida ili slično je potrebno nakon skladištenja. Dalje, takođe je potrebna pogodnost za sterilnu filtraciju kako bi se zagarantovala sterilnost. Kada se želi proizvodnja lipozoma kao farmaceutskog proizvoda u industrijskim razmerama, potrebno je uzeti u obzir gore opisane zahteve.

[0005] JP2006-522026A stavlja na uvid javnosti kompoziciju koja sadrži lipozome stabilno povezane sa najmanje jednim kamptotecinom rastvorljivim u vodi i najmanje jednim fluoropirimidinom, u kome molarni odnos kamptotecin: fluoropirimidin ima željene citotoksične, citostatičke, ili biološke efekte na ćelije ili homogenate ćelije kancera. Štaviše, ovaj dokument stavlja na uvid javnosti da lipozomi sadrže holesterol koji je prisutan u količini manjoj od 20 mol%. Međutim, nema opisa o osmotskom pritisku u spoljnoj vodenoj fazi i unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma.

[0006] JP2013-512262A stavlja na uvid javnosti lipozom koji sadrži irinotekan ili irinotekan hidrohlorid, neutralne fosfolipide i holesterol, u kojima je težinski odnos holesterol:neutralni fosfolipidi 1:3 do 5. Pored toga, postoji opis da lipozom sadrži irinotekan hidrohlorid, hidrogenizovani fosfatidilholin soje, polietilen glikol 2000-distearoil-fosfatidiletanolamin, i holesterol u težinskom odnosu komponenata od 1:3.4 do 3.8:0.34 do 0.38:0.8 do 0.95. Međutim, ne postoji jasan opis osmotskog pritiska u spoljnoj vodenoj fazi i unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma. Iako takav lipozom ima jonski gradijent, koji se formira puferom, između unutrašnje vodene faze i spoljne vodene faze lipozoma, postoji mogućnost da unutrašnja vodena faza može biti hiper-osmotska u odnosu na spoljnu vodenu fazu jer je lek napunjen. Međutim, pošto određena količina jona iscuri tokom punjenja leka, može se pretpostaviti da razlika u jonskom gradijentu nije velika. Pored toga, kada se takav težinski odnos komponenti pretvori u odnosu na ukupnu količinu lipidnih komponenti u lipozomskoj kompoziciji, sadržaj holesterola odgovara količini od 29 mol% do 36 mol%. Prema ovoj konverziji, izračunato je da molekulska težina hidrogenizovanog fosfatidilholina, polietilen glikol 2000-distearoil-fosfatidiletanolamina, i holesterola iznosi redom 785, 2730, i 387. Treba napomenuti da su pretvorene vrednosti minimalni i maksimalni procenti holesterola koji se mogu uzeti u gore pomenutom opsegu težinskog odnosa pojedinačne komponente.

[0007] WO2007/005754A2 stavlja na uvid javnosti lipozomsku kompoziciju koja sadrži osmotski gradijent od najmanje 350 mOsm/kg nakon diafiltracije, odnosno 2-struki osmotski pritisak unutrašnje vodene faze u odnosu na osmotski pritisak spoljne vodene faze.

[0008] U svim gore pomenutim dokumentima, lipozomska kompozicija koja ima praktično potrebnu dugoročnu stabilnost očuvanja i koja takođe ima odgovarajuću brzinu otpuštanja i postupak za njeno dobijanje nisu u potpunosti uspostavljeni, a odgovarajuća poboljšanja su poželjna.

REZIME PREDMETNOG PRONALASKA

[0009] U postupku adsorpcije i zadržavanja leka na lipididnoj membrani lipozoma, oslobađanje leka izvan lipozoma posaje otežano zbog jakih interakcija kao što su hidrofobne interakcije i elektrostatičke interakcije. Zbog toga se može održavati konfiguracija lipozomske kompozicije nakon proizvodnje, čime je lako obezbediti dugoročnu stabilnost očuvanja.

[0010] U ovom slučaju, postaje teško otpuštanje leka u pogođeno područje jer su interakcije prejake. Prema tome, idealno je inkapsulirati lek u rastvorenom stanju u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma, i takođe se čini da lipozomska kompozicija ima hiper-osmotske uslove, čime se pospešuje oslobađanje leka iz lipozomske kompozicije, pri čemu je moguće ostvariti pogodniju isporuku leka. Međutim, ostvarivanje hiper-osmotskih uslova rezultira u lakom curenju leka iz lipozomske kompozicije, pa je teško obezbediti dugoročnu stabilnost očuvanja.

[0011] Dalje, u slučaju kada se želi da se efikasno isporuči lek u pogođeno područje, poželjno je da lipozomi budu fine čestice sa prosečnom veličinom čestica od 100 nm ili manje. Međutim, formiranje mikročestice doprinosi povećanju zakrivljenosti (krivina) membrane lipozoma, što rezultira u poteškoćama u kapsuliranju leka.

[0012] U drugom aspektu, u slučaju kada je lek sadržan u lipozomu agens protiv kancera, postoje agensi protiv kancera čiji je napad na ćelije kancera u velikoj meri pod uticajem vremena izlaganja leka. Na primer, s obzirom da lek kao što je metabolički antagonist koji inhibira sintezu DNK napada samo neke ćelije u fazi sinteze DNK, efikasna citocidna svojstva ne mogu se dobiti ako je vreme izlaganja kratko. Kod takvog leka se u mnogim slučajevima ne postiže očekivana efikasnost leka jer se ne može postići dovoljno vremensko izlaganje u tumorima ako je metabolizam u telu nakon administriranja brz.

[0013] Pored toga, iako postoji takođe postupak administriranja kojim se postiže produženo izlaganje intravenskim kapanjem razblažene koncentracije antikancerogenog agensa kako bi se dobilo dovoljno vremena izlaganja, on je nepovoljan sa stanovišta kvaliteta života (eng. quality of life (QOL)), jer je pacijent vezan za vreme intravenskog kapanja.

[0014] Predmetni pronalazak je napravljen s obzirom na prethodne okolnosti, a cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi lipozomsku kompoziciju koja ima praktično potrebno dugoročnu stabilnost očuvanja, i koja je sposobna da na odgovarajući način kontroliše otpuštanje leka čineći unutrašnju vodenu fazu hiper-osmotskom, i postupak za dobijanje iste.

[0015] Kao rezultat opsežnih studija, predmetni pronalazači otkrili su lipozomsku kompoziciju koja je sposobna da na odgovarajući način kontroliše oslobađanje leka čak i kada je unutrašnja vodena faza hiper-osmotska, postavljanjem količine holesterola u lipidima lipozomske kompozicije na optimalni opseg od 10 do 35 mol%, i postupak za dobijanje istih. Ovaj predmetni pronalazak je završen na osnovu ovog otkrića.

[0016] Odnosno, prema predmetnom pronalasku, obezbeđena je lipozomska kompozicija, koja sadrži:

lipozome od kojih svaki ima unutrašnju vodenu fazu i vodeni rastvor koji čini spoljnu vodenu fazu i u kojoj su lipozomi dispergovani,

pri čemu je sadržaj holesterola 10 mol% do 35 mol% u odnosu na ukupnu količinu lipidnih komponenti u lipozomskoj kompoziciji, i

svaki od lipozoma inkapsulira lek u rastvorenom stanju, a osmotski pritisak unutrašnje vodene faze je 2-struki do 8-struki u odnosu na osmotski pritisak spoljne vodene faze.

[0017] U lipozomskoj kompoziciji predmetnog pronalaska, sledeći aspekti su poželjni.

[0018] Poželjno je da je lipozom jedna lamela.

[0019] Poželjno je da brzina oslobađanja leka iz lipozomske kompozicije u krvnoj plazmi sisara iznosi 20 mas%/24h ili više u odnosu na početnu inkapsuliranu količinu u lipozomskoj kompoziciji.

[0020] Poželjno, lipidi koji čine lipozom uključuju najmanje hidrogenizovani fosfatidilholin soje, 1,2-distearoil-3-fosfatidiletanolamin-polietilen glikol i holesterol.

[0021] Poželjno je da je prosečna veličina čestice lipozoma 5 nm do 100 nm.

[0022] Predmetni pronalazak je farmaceutske kompozicija koja sadrži gore-opisanu lipozomsku kompoziciju.

[0023] Predmetni pronalazak je postupak za proizvodnju lipozomske kompozicije koji obuhvata:

korak emulgovanja emulgirajućih lipida rastvorenih u organskom rastvaraču da bi se formirali lipozomi, bez koraka sušenja i očvršćavanja;

korak punjenja leka za inkapsuliranje u vodi rastvorljivog leka u lipozomima dobijenim u koraku emulgovanja; i

korak prilagođavanja osmotskog pritiska zamenom nekapsuliranog vodenog rastvora leka sa hipo-osmotskim rastvorom radi podešavanja osmotskog pritiska unutrašnje vodene faze da bude hiper-osmotski u odnosu na osmotski pritisak spoljne vodene faze,

pri čemu korak emulgovanja emulgujućih lipida da se formiraju lipozomi prilagođava sadržaj holesterola na 10 mol% do 35 mol% u odnosu na ukupnu količinu lipidnih komponenti u lipozomskoj kompoziciji, i

korak prilagođavanja osmotskog pritiska prilagođava osmotski pritisak unutrašnje vodene faze lipozoma na 2-struki do 8-struki u odnosu na osmotski pritisak spoljne vodene faze.

[0024] U postupku za dobijanje lipozomske kompozicije prema predmetnom pronalasku, poželjni su sledeći aspekti.

[0025] Poželjno je da se lipozomi dobijeni nakon koraka emulgovanja koriste u sledećem koraku bez obrade istiskivanjem.

[0026] Poželjno je da se korak punjenja leka i korak prilagođavanja osmotskog pritiska izvode istovremeno.

[0027] Prema lipozomskoj kompoziciji predmetnog pronalaska, moguće je obezbediti lipozomsku kompoziciju koja ima dugoročnu stabilnost očuvanja koja je potrebna za praktičnu upotrebu i koja je sposobna da na odgovarajući način kontroliše oslobađanje leka (poželjno je da može kontrolisati oslobađanje leka reda nekoliko desetina sati) čak i kada je unutrašnja vodena faza hiper-osmotska, postavljanjem količine holesterola u lipidima lipozomske kompozicije na optimalni opseg od 10 do 35 mol%, i postupak za proizvodnju istih.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0028]

Sl. 1 je grafikon odnosa između količine holesterola i procenata spoljne vodene faze. Sl. 2 je grafikon odnosa između količine holesterole i procenta spoljne vodene faze.

Sl. 3 je grafikon odnosa između vremena i brzine otpuštanja.

Sl. 4 je grafikon odnosa između vremena inkubacije i procenta spoljne vodene faze.

OPIS POŽELJNIH TEHNIČKIH REŠENJA

[0029] Termin "korak" kako se ovde koristi uključuje ne samo nezavisni korak, već takođe korak koji ne mora biti jasno odvojen od drugog koraka, ukoliko se može postići očekivani efekat koraka.

[0030] Rasponi numeričkih vrednosti prikazani sa "do" u ovoj specifikaciji podrazumevaju opsege koje uključuju numeričke vrednosti naznačene pre i posle "do" kao minimalne i maksimalne vrednosti, redom.

[0031] U predmetnom pronalasku, ukoliko nije drugačije naznačeno, % znači maseni percent.

[0032] Pozivajući se ovde na sadržaj komponente u kompoziciji, u slučaju da postoji više supstanci koje odgovaraju komponenti u kompoziciji, sadržaj znači, ukoliko nije drugačije naznačeno, ukupnu količinu više supstanci koje postoje u kompoziciji.

[0033] "Brzina inkapsulacije" odnosi se na odnos (maseni odnos ili molarni odnos) leka koji je inkapsuliran u lipozomu prema ugrađenom leku (napunjena količina), kada su sastojci lipozoma i lek ugrađeni da formiraju inkapsulirani nosač leka.

[0034] "Oslobađanje" znači da lek inkapsuliran u lipozom prolazi kroz lipidnu membranu koja čini lipozom i zatim izlazi napolje iz lipozoma.

[0035] "Brzina otpuštanja" odnosi se na odnos (težinski odnos ili molarni odnos) leka koji izlazi van lipozoma u kom su sastojci lipozoma i lek inkapsulirani prema leku inkapsuliranom u lipozomu.

[0036] "Brzina otpuštanja je spora" znači da je količina leka koja izlazi napolje iz lipozoma u jedinici vremena mala.

[0037] "Zadržavanje u krvi" označava svojstvo (stanje) u kome je lek, koji je u stanju da bude inkapsulira u lipozom, prisutan u krvi, u meti ("subjekat" ili "pojedinac", poželjno sisar kao što je čovek (pacijent), miš, majmun, ili domaća životinja) kojoj je administrirana lipozomska kompozicija (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži lipozomsku kompoziciju).

[0038] "Tumor" (koji se koristi naizmenično sa "kancerom" u predmetnom pronalasku) posebno uključuje solidne tumore kao što su kancer jednjaka, kancer želuca, kancer kolona, rektalni kancer, kancer jetre, kancer grkljana, kancer pluća, kancer prostate, kancer bešike, kancer dojke, kancer materice, kancer jajnika, i Kaposijev sarkom, i tečni tumori kao što je leukemija. Lokacije na kojima se tumor javlja su ćelije, tkiva, organi ili creva i njihova unutrašnjost.

[0039] U daljem tekstu, predmetni pronalazak će biti detaljno opisan.

[0040] Predmetni pronalazak je lipozomska kompozicija, koja uključuje:

lipozome od kojih svaki ima unutrašnju vodenu fazu i vodeni rastvor koji čini spoljnu vodenu fazu i u kojoj su lipozomi dispergovani,

u kojima je sadržaj holesterola 10 mol% do 35 mol% u odnosu na ukupnu količinu lipidnih komponenti u lipozomskoj kompoziciji, i

svaki od lipozoma inkapsulira lek u rastvorenom stanju, osmotski pritisak unutrašnje vodene faze je 2-struki do 8-struki u odnosu na osmotski pritisak spoljne vodene faze.

(Lipozom)

[0041] Lipozom je zatvorena vezikula formirana od lipidne dvoslojne membrane korišćenjem lipida, i ima vodenu fazu (unutrašnja vodena faza) unutar prostora zatvorene vezikule. Unutrašnja vodena faza sadrži vodu i slično. Lipozom je obično prisutan u stanju da je dispergovan u vodenom rastvoru (spoljna vodena faza) izvan zatvorene vezikule. Lipozom može biti jednoslojni (koji se takođe naziva jednoslojno lamelarni ili unilamelarni, i predstavlja strukturu koja ima jednu dvoslojnu membranu) ili višeslojni lamelarni (koji se takođe naziva i višelamelarni i predstavlja strukturu nalik luku koja ima više dvoslojnih membrane gde se pojedini slojevi dele vodenim slojevima). U predmetnom pronalasku, jedan lamelarni lipozom je poželjan sa stanovišta sigurnosti i stabilnosti u farmaceutskim primenama.

[0042] Lipozom nije posebno ograničen u pogledu oblika sve dok je lipozom sposoban da inkapsulira lek. "Inkapsuliranje" znači zauzimanje oblika u kome je lek sadržan u unutrašnjoj vodenoj fazi i samoj membrani u odnosu na lipozom. Na primer, lipozom može biti oblik gde je lek inkapsuliran u zatvorenom prostoru formiranom od membrane, oblik gde je lek uključen u samu membranu, ili njihova kombinacija.

[0043] Veličina (prosečna veličina čestice) lipozoma nije naročito ograničena, i iznosi 2 do 200 nm, poželjno 5 do 150 nm, poželjnije 5 do 120 nm, i još poželjnije 5 do 100 nm. U predmetnom pronalasku, "prosečna veličina čestice" znači prosečnu vrednost prečnika lipozoma izmerenu metodom rasejanja svetlosti.

[0044] Poželjno je da je lipozom u sfernom obliku ili morfologije bliske istom.

[0045] Komponenta (membranska komponenta) koja čini lipidni dvosloj lipozoma je izabrana od lipida. Kao lipid, bilo koji se može koristiti sve dok je rastvoren u mešanom rastvaraču organskog rastvarača rastvorljivog u vodi i organskom rastvaraču na bazi estra. Specifični primeri lipida uključuju fosfolipide, lipide koji nisu fosfolipidi, holesterole i njihove derivate. Ove komponente mogu biti sastavljene od pojedinačnih ili više komponenti.

[0046] Primeri fosfolipida uključuju prirodne ili sintetičke fosfolipide kao što je fosfatidilholin (lecitin), fosfatidil glicerol, fosfatidna kiselina, fosfatidil etanolamin, fosfatidil serin, fosfatidil inozitol, sfingomijelin i kardiolipin, ili njihovi hidrogenizovani proizvodi (na primer, hidrogenizovani fosfatidilholin soje (HSPC)). Među njima, je poželjan hidrogenizovani fosfolipid kao što je hidrogenizovani fosfatidilholin iz soje, ili sfingomijelin, a poželjniji je hidrogenizovani fosfatidilholin iz soje. U predmetnom pronalasku, "fosfolipid" takođe obuhvata derivat fosfolipida u kome je fosfolipid modifikovan.

[0047] Lipidi koji nisu fosfolipidi mogu biti lipidi koji ne sadrže fosfornu kiselinu, i njihovi primeri uključuju, ali nisu posebno ograničeni na, glicerolipid koji u molekulu ne sadrži segment fosforne kiseline, i sfingolipid koji u molekulu ne sadrži segment fosforne kiseline. U predmetnom pronalasku, izraz "lipidi koji nisu fosfolipidi" takođe obuhvata derivate lipida koji nisu fosfolipidi u kojima su napravljene modifikacije na lipidima koji nisu fosfolipidi.

[0048] U slučaju kada lipid koji nije fosfolipid sadrži baznu funkcionalnu grupu, na primer, u slučaju kada lipid, koji nije fosfolipid, je materijal gde je jedinjenje koje ima baznu funkcionalnu grupu vezano za lipid, lipid se odnosi na katjonizovani lipid. Katjonizovani lipid, na primer, postaje sposoban da modifikuje membranu lipozoma i stoga može povećati adhezivnost za ćelije koje su ciljna mesta.

[0049] Primeri holesterola uključuju holesterol koji sadrži kao osnovni skelet ciklopentahidrofenantren čiji su atomi ugljenika delimično ili u potpunosti hidrogenizovani i njegove derivate. Specifični primeri holesterola uključuju, ali nisu posebno ograničeni na, holesterol. Kada se prosečna veličina čestice smanji do 100 nm ili manje, zakrivljenost lipidne membrane postaje veća. Pošto deformacija membrane raspoređene u lipozomu takođe postaje veća, lek rastvorljiv u vodi postaje podložniji curenju. Međutim, kao sredstvo za suzbijanje svojstava curenja, efikasno je dodavanje holesterola ili slično kako bi se popunila deformacija membrane izazvana lipidima (membranski-stabilizirajući efekat).

[0050] Očekuje se da dodatak holesterola u lipozomske kompozicije deluje na smanjenje fluidnosti lipozomske membrane zaustavljanjem membranskih praznina lipozoma, ili slično. Generalno, poželjno je da sadržaj holesterola u lipozomima obično iznosi do oko 50 mol% ukupnih molova lipidnih komponenata (ukupni lipid). Vezano za lipozomsku kompoziciju koja ima visok osmotski pritisak, veza između uslova visokog osmotskog pritiska lipozomske kompozicije i količine holesterola bila je nepoznata do sada. Međutim, predmetni pronalazak je otkrio neočekivan efekat da se brzina oslobađanja leka kod sisara može prilagoditi kontrolom količine holesterola u optimalnom opsegu, u uslovima visokog osmotskog pritiska lipozomske kompozicije. U predmetnom pronalasku, u ukupnim molovima lipidnih komponenti u lipozomskoj kompoziciji (ukupni lipid sadržan u lipozomskoj kompoziciji), sadržaj holesterola je 10 do 35 mol%, poželjno 15 do 25 mol%, i još poželjnije 17 do 21 mol%.

[0051] Pored gore pomenutih komponenti, hidrofilni polimer ili slično za poboljšanje zadržavanja u krvi, masna kiselina, diacetil fosfat ili slično kao stabilizator membranske strukture, ili αtokoferol ili slično mogu biti dodati lpozomu kao antioksidans. U predmetnom pronalasku, je poželjno da se ne koriste aditivi kao što je sredstvo za dispergovanje koje nije odobreno za upotrebu u intravenskoj injekciji u farmaceutskim primenama, na primer, surfaktant ili slično.

[0052] Lipozom iz predmetnog pronalaska poželjno sadrži hidrofilne polimerno-modifikovane proizvode fosfolipida, lipide koji nisu fosfolipidi, ili holesterole kao fosfolipide, lipide koji nisu fosfolipidi, holesterole i njihove derivate.

[0053] Primeri hidrofilnog polimera uključuju, ali nisu posebno ograničeni na, polietilen glikole, poliglicerole, polipropilen glikole, polivinil alkohole, kopolimer naizmeničnog stiren-anhidrida maleinske kiseline, polivinilpirolidon, i sintetičku poliamino kiselinu. Gore-pomenuti hidrofilni polimeri mogu se koristiti sami ili u kombinaciji dva ili više njih.

[0054] Među njima, sa stanovišta zadržavanja formulacije u krvi, poželjni su polietilen glikoli, poligliceroli, ili polipropilen glikoli, a poželjniji polietilen glikol (PEG), poliglicerol (PG), ili polipropilen glikol (PPG). Polietilen glikol (PEG) se najčešće koristi i poželjan je zbog toga što poboljšava zadržavanje u krvi.

[0055] Molekulska težina PEG-a nije posebno ograničena. Molekulska težina PEG-a je 500 do 10,000 daltona, poželjno 1,000 do 7,000 daltona, i još poželjnije 2,000 do 5,000 daltona.

[0056] U lipozomu predmetnog pronalaska, poželjnije je koristiti lipid modifikovan PEG-om (PEG-modifikovani lipid), zajedno sa glavnim lipidom sadržanim u lipozomu. Primeri PEG-modifikovanog lipida uključuju 1,2-disteaoil-3-fosfatidiletanolamin-polietilen glikol kao što je 1,2-distearoil-3-fosfatidiletanolamin-PEG2000 (proizvodi ga Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), 1,2-distearoil-3-fosfatidiletanolamin-PEG5000 (proizvodi ga Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) i distearoil glicerol-PEG2000 (proizvodi ga Nippon Oil & Fats Co., Ltd.). Ovi PEG-modifikovani lipidi mogu se dodati u količini od 0.3 do 50 mas%, poželjno 0.5 do 30 mas%, i još poželjnije 1 do 20 mas% u odnosu na ukupan sadržaj lipida.

[0057] U lipozomu ovog predmetnog pronalaska, poželjna je lipidna kombinacija hidrogenizovanog fosfatidilholina iz soje (glavni lipid sadržan u lipozomu), 1,2-distearoil-3-fosfatidiletanolamin-polietilen glikola (lipid koji se koristi u kombinaciji sa glavnim lipidom), i holesterola.

[0058] Lipozomska kompozicija predmetnog pronalaska poželjno ne sadrži anjonski polimer (polianjon). U predmetnom pronalasku, pošto je moguće kontrolisati otpuštanje pomoću osmotskog pritiska unutrašnje vodene faze, postoje prednosti u tome što je opšta prilagodljivost odlična, a lekovi koji se mogu koristiti u lipozomima nisu ograničeni.

(Lek)

[0059] Lipozom predmetnog pronalaska može da sadrži kao lek najmanje jedan od lekova rastvorljivih u vodi.

[0060] U slučaju leka rastvorljivog u vodi, oblik koji se zadržava u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma je povoljan, ali može se desiti slučaj kada lek postaje podložan curenju jer je lipidna dvoslojne membrana tanka i mekana. Međutim, prema postupku za proizvodnju lipozoma iz ovog predmetnog pronalaska, moguće je proizvesti lipozom koji ima sigurnost i stabilnost čak i kada je veličina čestice lipozoma podešena na oko 100 nm ili manje.

[0061] Lek obuhvaćen lekom može biti bilo koji lek rastvorljiv u vodi koji se može inkapsulirati u lipozome, a njegovi specifični primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, materije rastvorljive u vodi koje imaju fiziološku aktivnost ili farmakološku aktivnost kao što su enzimi, proteini, peptidi, nukleinske kiseline (DNK, iRNK, siRNK, miRNK), jedinjenja niske molekulske težine, šećeri (oligosaharidi i polisaharidi), polimerna jedinjenjenja, antitumor agensi, antimikrobni agensi, kontrastna sredstva, antioksidanti, antiinflamatorni agensi, agensi za beljenje, ovlaživači, i sredstvo za rast kose. U slučaju korišćenja lipozoma kao nosača za sistem za isporuku leka, lek rastvorljiv u vodi je poželjno jedinjenje niske molekulske težine sa stanovišta stabilnosti.

[0062] Specifični primeri leka rastvorljivog u vodi uključuju antikancer agense kao što je antikancer agens n abazi antraciklina kao što je doksorubicin, daunorubicin ili epirubicin, antikancer agens zasnovan na cisplatini kao što je cisplatina ili oksaliplatina, antikancer agens zasnovan na taksanu kao što je paklitaksel ili docetaksel, antikancer agens zasnovan na alkaloidu vinblastinu kao što je vinkristin ili vinblastin, antikancer agens zasnovan na bleomicinu kao što je bleomicin, i antikancer agens zasnovan na sirolimusu kao što je sirolimus, i metabolički antagonisti kao što je metotreksat, fluorouracil, gemcitabin, citarabin i pemetreksed. Među njima je poželjan lek rastvorljiv u vodi kao što je doksorubicin, gemcitabin ili pemetreksed.

(Lek rastvorljiv u vodi, inkapsuliran u rastvorenom stanju)

[0063] Lek rastvorljiv u vodi inkapsuliran u lipozomu predmetnog pronalaska prisutan je u rastvorenom stanju u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma. Ovde se, s obzirom na rastvoreno stanje, smatra se da je inkapsuliran u rastvorenom stanju u slučaju kada je količina leka napunjena u odnosu na zapreminu lipozoma ispod rastvorljivosti zasićenja leka u tečnosti kompozicije unutrašnje vodene faze. Dalje, čak i kada je količina napunjenog leka iznad rastvorljivosti zasićenja leka, slučaj kada Cryo-TEM ne “vidi” kristale leka i XRD merenje ne primećuje obrasce difrakcije koji se pripisuju kristalnoj rešetki što ukazuje na to da se veći deo leka rastvara usled ubrzanja rastvaranja u fizičko-hemijskom okruženju stvorenom lipidnom membranom, delimičnim ugrađivanjem leka u lipidnu membranu ili slično i smatra se da je inkapsuliran u rastvorenom stanju. Dalje, slučaj koji se inkapsulira metodom punjenja za kapsuliranje leka formiranjem čvrste supstance unutar lipozoma nije rastvoreno stanje navedeno u predmetnom pronalasku, čak i kada je lek visoko rastvorljiv u vodi.

[0064] Lek rastvorljiv u vodi koji se kapsulira u rastvorenom stanju poželjno ima rastvorljivost u vodi od 1 mg/ml ili više, a još poželjnije rastvorljivost u vodi od 10 mg/ml ili više.

(Postupak za dobijanje lipozomske kompozicije)

[0065] Postupak za dobijanje lipozoma prema predmetnom pronalasku je postupak za proizvodnju lipozomske kompozicije koji obuhvata:

korak emulgovanja emulgirajućih lipida rastvorenih u organskom rastvaraču da bi se formirao lipozom, bez sušenja i koraka očvršćavanja;

korak punjenja leka za kapsuliranje u vodi rastvorljivog leka u lipozomu dobijenom u koraku emulgovanja; i

korak punjenja leka za podešavanje osmotskog pritiska unutrašnje vodene faze lipozoma na 2-struko do 8-struko u odnosu na osmotski pritisak spoljne vodene faze.

[0066] Postupak za dobijanje lipozomske kompozicije može po potrebi da uključuje i druge korake, kao što je korak isparavanja, uparavanjem organskog rastvarača koji se koristi u koraku emulgovanja.

[0067] Korak emulgovanja emulgirajućih lipida rastvorenih u organskom rastvaraču da bi se formirao lipozom, bez sušenja i koraka očvršćavanja, nije ograničen sve dok je korak emulgovanja, ali je poželjno korak primene visoke sile smicanja i izvođenja mikropartikulacije sa korakom emulgovanja koji uključuje organski rastvarač. Ako je potrebno, može se izvršiti isparavanje (uklanjanje rastvarača) organskog rastvarača koji se koristi u koraku emulgovanja da bi se formirao lipozom.

(Korak emulgovanja)

[0068] U koraku emulgovanja, uljana faza u kojoj je bar jedan lipid rastvoren u organskom rastvaraču i vodena faza se mešaju da bi se dobio vodeni rastvor koji sadrži lipide, koji se zatim emulguje uz mešanje. Uljana faza u kojoj je lipid rastvoren u organskom rastvaraču i vodena faza se pomešaju, mešaju i emulguju da bi se na taj način pripremila emulzija u kojoj se uljana faza i vodena faza emulguju u U/V tipu. Nakon mešanja, lipozom se formira uklanjanjem dela ili celog organskog rastvarača izvedenog iz uljane faze primenom koraka isparavanja koji će biti opisan u nastavku. Alternativno, deo ili sav organski rastvarač u uljanoj fazi isparava tokom mešanjaemulgovanja da bi se formirao lipozom.

[0069] Kao postupak mešanja, koriste se ultrazvučni talasi ili mehanička sila smicanja za minijaturizaciju čestice. Pored toga, obrada istiskivačem koji omogućava prolazak kroz filter koji ima određeni prečnik pora ili obrada mikrofluidizatorom može se izvršiti radi ujednačavanja veličina čestica. Upotreba istiskivača ili slično može rezultirati razgradnjom sekundarno formiranih multivezikularnih lipozoma u univerzikularne lipozome. U predmetnom pronalasku, sa stanovišta pojednostavljenja proizvodnog procesa poželjno je da se lipozom u stanju kad lek koji nije napunjen koristi u sledećem koraku bez obrade istiskivanjem.

[0070] U predmetnom pronalasku, prosečna veličina čestice lipozoma koji se priprema može se kontrolisati proizvoljnim izborom brzine i vremena mešanja. U cilju dobijanja lipozoma koji ima sigurnost i stabilnost, poželjno je obezbediti smicanje pri perifernoj brzini od 20 m/sek ili većoj za vodeni rastvor koji sadrži lipid. Smicanje nije ograničeno, a specifičan primeristog je poželjno smicanje pri perifernoj brzini od 20 m/sek do 35 m/sek, i još poželjnije smicanje pri perifernoj brzini od 23 m/sek do 30 m/sek.

(Uljana faza)

[0071] Kao organski rastvarač koji služi kao uljana faza, koristi se mešani rastvarač u vodi rastvorljivog organskog rastvarača i organskog rastvarača na bazi estra. U predmetnom pronalasku je poželjno da se organski rastvarač kao što je hloroform, metilen hlorid, heksan ili cikloheksan u suštini ne koriste kao organski rastvarači i još je poželjnije da se ovi organski rastvarači uopšte ne koriste.

[0072] Organski rastvarač rastvorljiv u vodi nije posebno ograničen, i poželjno je organski rastvarač koji ima osobinu da se opciono meša sa vodom. Specifični primeri organskog rastvarača rastvorljivog u vodi uključuju alkohole kao što je metanol, etanol, n-propanol, izopropanol, nbutanol, izobutanol, i t-butanol; glikoli kao što je glicerol, etilen glikol, i propilen glikol; i polialkilen glikoli kao što je polietilen glikol. Među njima su poželjni alkoholi. Alkohol je poželjno najmanje jedan odabran od etanola, metanola, 2-propanola ili t-butanola, poželjnije najmanje jedan odabran od etanola, 2-propanola ili t-butanola, a još poželjnije etanol.

[0073] Organski rastvarač na bazi estra nije posebno ograničen, i poželjno je estar dobijen reakcijom organskih kiselina i alkohola. Konkretno, organski rastvarač na bazi estra poželjno je najmanje jedan odabran od etil acetata, metil acetata, izopropil acetata, t-butil acetata, ili metil propionata, poželjnije etil acetata, izopropil acetata, ili metil propionata, a još poželjnije etil acetat.

[0074] Odnos mešanja organski rastvarač rastvorljiv u vodi: organski rastvarač na bazi estra nije posebno ograničen, i može biti 90:10 do 30:70, poželjno 80:20 do 40:60 i još poželjnije 80:20 do 70:30 maseni odnos. Mešani rastvarač organskog rastvarača rastvorljivog u vodi i organskog rastvarača na bazi estra može dalje sadržati vodeni rastvarač koji će biti opisan u nastavku, poput vode ili pufera. Vodeni rastvarač se može dodati u opsegu od, na primer, 1 do 30 mas%. pH mešanog rastvarača nije posebno ograničen, i poželjno je u opsegu od oko 3 do 10, i još poželjnije oko 4 do 9. Organski rastvarači na bazi estra mogu da sadrže fiziološki aktivne supstance ili slično, poput različitih lekova koji su rastvorljivi u ovim rastvaračima.

[0075] U slučaju kada se kao organski rastvarač rastvorljiv u vodi koristi etanol a etil acetat se koristi kao organski rastvarač na bazi estra, odnos mešanja etanol:etil acetat nije posebno ograničen, i poželjno je 80:20 do 70:30 maseni odnos.

[0076] Koncentracija lipida nije posebno ograničena i može se na odgovarajući način prilagoditi, ali može biti 40 g/L do 250 g/L, poželjno 100 g/L do 200 g/L u pogledu rastvora gde mešani rastvor organskog rastvarača rastvorljivog u vodi i organskog rastvarača na bazi estra služi kao rastvarač.

(Vodena faza)

[0077] Vodena faza označava spoljnu vodenu fazu i unutrašnju vodenu fazu.

[0078] Spoljna vodena faza kako se ovde koristi znači vodeni rastvor u kome su dispergovani lipozomi. Na primer, u slučaju injekcije, rastvor koji zauzima spoljnu stranu lipozoma disperzne tečnosti lipozoma upakovane i uskladištene u bočici ili napunjenom špricu postaje spoljna vodena faza. Takođe, slično za tečnost koja se disperguje u vreme upotrebe kada se administrira pomoću priloženog disperzionog rastvora ili drugih rastvora, rastvor koji zauzima spoljnu stranu lipozoma disperzione tečnosti lipozoma postaje spoljna vodena faza.

[0079] Unutrašnja vodena faza kako se ovde koristi označava vodenu fazu u zatvorenoj vezikuli sa dvoslojnom lipidnom membranom između njih.

[0080] Kao vodeni rastvor za dispergovanje lipozoma (spoljna vodena faza) pri dobijanju lipozoma, poželjno se koristi voda (destilovana voda, voda za injekcije, ili slično), fiziološki rastvor, razni puferi, vodeni rastvor šećera ili njihova smeša (vodeni rastvarač). Pufer nije ograničen na organske i neorganske rastvore pufera, a poželjno je da se koristi pufer koji ima pufersko dejstvo u blizini pH vrednosti telesne tečnosti i njihovi primeri uključuju fosfatni pufer, tris pufer, citratni pufer, acetatni pufer, i Good-ov pufer. pH vodene faze nije posebno ograničen, i može biti 5 do 9, poželjno 7 do 8. Na primer, poželjno je da se koristi fosfatni pufer (na primer, pH = 7.4). Unutrašnja vodena faza lipozoma može biti lipozom-dispergujući vodeni rastvor pri dobijanu lipozoma, ili može biti voda, fiziološki rastvor, razni puferi, vodeni rastvor šećera ili njihova smeša koja je sveže dodata. Voda koja se koristi kao spoljna vodena faza ili unutrašnja vodena faza poželjno je bez nečistoća (prašina, hemikalije, ili slično).

[0081] Fiziološki rastvor se odnosi na rastvor neorganske soli prilagođen da bude izotoničan sa tečnošću ljudskog tela, i može dalje da ima pufersku funkciju. Primeri fiziološkog rastvora uključuju slani rastvor koji sadrži 0.9 m/v% natrijum hlorida, slani rastvor puferovan fosfatom (u daljem tekstu, takođe poznat kao PBS), i slani rastvor puferovan tris-om.

(Korak isparavanja)

[0082] U predmetnom pronalasku, ako je neophodno može se obezbediti korak isparavanja. U koraku isparavanja, organski rastvarač se ispari iz vodenog rastvora koji sadrži lipozome dobijene u koraku emulgovanja. U predmetnom pronalasku, korak isparavanja uključuje najmanje jedan od koraka nasilnog uklanjanja dela ili celog organskog rastvarača dobijenog iz uljane faze kao korak isparavanja, i korak prirodnog isparavanja dela ili celog organskog rastvarača u uljanoj fazi tokom mešanja-emulgovanja.

[0083] Postupak isparavanja organskog rastvarača u koraku isparavanja nije posebno ograničen. Na primer, može se izvesti najmanje jedan od koraka zagrevanja da bi se ispario organski rastvarač, korak nastavka stajanja ili polaganog mešanja nakon emulgovanja, ili korak izvođenja vakumske degasifikacije.

[0084] U predmetnom pronalasku, u koraku isparavanja organskog rastvarača, poželjno je da koncentracija organskog rastvarača sadržanog u vodenom rastvoru koji sadrži lipozome bude 15 mas% ili manje u roku od 30 minuta od početka koraka isparavanja organskog rastvarača.

[0085] Тemperatura tečnosti tokom izvođenja proizvodnog postupka predmetnog pronalaska može se na odgovarajući način prilagoditi, ali temperatura tečnosti u vreme mešanja uljane faze i vodene faze je poželjno veća od ili jednaka temperaturi faznog prelaska lipida koga treba koristiti. Na primer, u slučaju kada se koristi lipid sa temperaturom faznog prelaza od 35°C do 40°C, temperatura tečnosti je poželjno podešena od 35°C do 70°C.

[0086] Vodeni rastvor koji sadrži lipozome pripremljen u koraku emulgovanja može biti podvrgnut naknadnoj obradi kao što je centrifugiranje, ultrafiltracija, dijaliza, gel filtracija, ili sušenje smrzavanjem, radi uklanjanja komponenti koje nisu bile uključene u lipozome, ili podešavanja koncentracije i osmotskog pritiska.

[0087] Veličine čestica nastalih lipozoma mogu se ujednačiti upotrebom diajlize, filtracije, obrade istiskivanjem ili slično. U postupku za proizvodnju lipozomske kompozicije prema predmetnom pronalasku, poželjno je da se prazni lipozomi pripremaju u stanju u kome lek nije napunjen, bez podvrgavanja procesu istiskivanja. Štaviše, ako se želi razdvajanje leka inkapsuliranog u lipozomima od leka koji nije inkapsuliran u lipozomima, može da se koristi centrifugiranje, dijaliza, gel filtracija ili slično.

(Obrada istiskivanjem)

[0088] Obrada istiskivanjem znači korak prolaska lipozoma kroz filter koji ima finu poru da bi se primenila fizička sila smicanja, čime se vrši mikropartikulacija. Kada se lipozomi propuste, brza mikrokapsulacija može da se postigne inkubacijom tečnosti za disperziju lipozoma i filtera na temperaturi koja je viša ili jednaka temperaturi faznog prelaza membrane koja čini lipozom.

(Korak punjenja leka)

[0089] U koraku punjenja leka predmetnog pronalaska, u slučaju inkapsuliranja u liposome leka rastvorljivog u vodi, lek se može inkapsulirati u unutrašnju vodenu fazu lipozoma postupkom rastvaranja leka u vodenom medijumu koji može da izvrši hidrataciju i bubrenje, praćeno zagrevanjem na temperaturi većoj ili jednakoj temperaturi faznog prelaza, i ultrazvučnom obradom ili istiskivanjem. Lek se takođe može inkapsulirati u unutrašnju vodenu fazu rastvaranjem leka u vodenoj fazi u vreme emulzifikacije lipida.

(Korak podešavanja osmotskog pritiska)

[0090] U predmetnom pronalasku, postaje lako osloboditi lek čineći unutrašnju vodenu fazu lipozoma hiper-osmotskom (razlika pritiska) kroz korak podešavanja osmotskog pritiska. Brzina oslobađanja može se kontrolisati podešavanjem osmotskog pritiska. Korak podešavanja osmotskog pritiska nije posebno ograničen, i može se primeniti postupak kao što je dijaliza nakon koraka punjenja leka. Ovo omogućava podešavanje osmotskog pritiska. U predmetnom pronalasku, poželjno je da se istovremeno izvrši korak punjenja leka i korak podešavanja osmotskog pritiska (poželjno podešavanje osmotskog pritiska unutrašnje vodene faze), sa stanovišta efikasnosti proizvodnje.

[0091] U predmetnom pronalasku, kontrolisanjem oslobađanja, na primer, u slučaju upotrebe lipozoma iz predmetnog pronalaska kao sistema za isporuku leka, moguće je oslobađanje potrebne količine leka koja je potrebna u pogođenom području koje se cilja. Međutim, hiper-osmotski lipozom lako oslobađa lek, ali postaje lako i curenje leka tokom skladištenja, tako da je teško postići i dobro otpuštanje i stabilnost očuvanja. Prema lipozomskoj kompoziciji predmetnog pronalaska, on ima neočekivani efekat sposoban da postigne i lako otpuštanje i stabilnost očuvanja leka podešavanjem osmotskog pritiska unutrašnje vodene faze na 2-struki do 8-struki u odnosu na osmotski pritisak spoljne vodene faze, za lipozome koji imaju unutrašnju vodenu fazu dobijenu iz emulgovanih lipida.

[0092] Generalno, kao postupak za činjenje unutrašnje vodene faze hiper-osmotskom, na primer, postoji postupak za pravljenje unutrašnje vodene faze i spoljne vodene faze lipozoma u kojoj lek nije inkapsuliran tako da ima visok osmotski pritisak, i zatim za snižavanje osmotskog pritiska spoljne vodene faze dijalizom ili slično. U tom slučaju, u sledećem koraku punjenja leka koji treba izvršiti, može doći do slučaja kada lek koji se nalazi u unutrašnjoj vodenoj fazi procuri, i takođe se smanji i osmotski pritisak unutrašnje vodene faze.

[0093] Prema tome, u predmetnom pronalasku, zajedno sa punjenjem leka, unutrašnja vodena faza se zamenjuje rastvorom visokog osmotskog pritiska, a zatim se uklanjanje leka u spoljnoj vodenoj fazi i snižavanje osmotskog pritiska spoljne vodene faze sprovodi istovremeno dijalizom, pri čemu je moguće dobiti lipozomsku kompoziciju sposobnu da postigne i lako otpuštanje leka i stabilnost očuvanja leka.

[0094] U lipozomu ovog predmetnog pronalaska, osmotski pritisak unutrašnje vodene faze je 2-struki do 8-struki, poželjno 2,5-struki do 6-struki, još poželjnije 3-struki do 5-struki, u odnosu na osmotski pritisak spoljne vodene faze. Postavljanjem da bude 2-struki ili višestruki, lipidna dvoslojna membrana lipozoma obično je poznata da pokazuje strukturu kao što je dvostruka membranska struktura ili interdigitovana struktura. Kada je osmotski pritisak unutrašnje vodene faze 2-struki ili višestruki u odnosu na spoljnu vodenu fazu, lipozom počinje da se menja iz dvostruke membranske strukture u interdigitovanu strukturu. Struktura takve dvostruke membrane može se prilagoditi tipovima ili odnosima mešanja pojedinačnih lipida, ali u predmetnom pronalasku, moguće je dobiti lipozomsku kompoziciju koja može postići i lako otpuštanje i stabilnost očuvanja leka podešavanjem procenta holesterola na 10 mol% do 35 mol% kako bi se dobila odgovarajuća lipidna struktura.

[0095] U tečnosti dobijenoj nakon završnog koraka punjenja leka, rastvorene supstance spoljne vodene faze i unutrašnje vodene faze se homogenizuju, a osmotski pritisak u to vreme može se definisati kao osmotski pritisak unutrašnje vodene faze lipozomske kompozicije koju treba završiti. Međutim, u narednoj zameni-koraku podešavanja osmotskog pritiska dijalizom spoljne vodene faze, postupak zagrevanja je ograničen samo na slučaj kada su rastvorene supstance unutrašnje vodene faze dovoljno zadržane, kao što je suzbijanje ispod faznog prelaza lipida. Pored toga, osmotski pritisak spoljne vodene faze može se definisati kao osmotski pritisak tečnosti dijalize koja se koristi u završnom koraku dijalize. Međutim, ovo je ograničeno samo na slučaj kada je spoljna vodena faza bila dovoljno zamenjena tečnošću za dijalizu. Dalje, za gotov rastvor lipozomske kompozicije, takođe je moguće dobiti osmotski pritisak unutrašnje vodene faze i spoljne vodene faze kvantifikovanjem koncentracije kompozicije rastvorene supstance u spoljnoj vodenoj fazi i koncentracije kompozicije rastvorene supstance u unutrašnjoj vodenoj fazi pomoću centrifugiranja ili ultrafiltracije, i merenja osmotskog pritiska tečne kompozicije.

[0096] Merenje osmotskog pritiska može se izvršiti prema postupku merenja osmolalnosti opisanom u šesnaestoj revidiranoj Japanskoj Famakopeji. Konkretno, osmolalnost je moguće odrediti merenjem stepena sniženja tačke mržnjenja (tačka leda) vode. Pored toga, stepen sniženja tačke mržnjenja vode definisan je u smislu molarne koncentracije rastvorene supstance, a takođe je moguće odrediti osmolalnost iz molarne koncentracije rastvorene supstance.

[0097] Osmotski pritisak spoljne vodene faze u predmetnom pronalasku ima značajan efekat na živo telo nakon administriranja. U slučaju kada je osmotski pritisak spoljne vodene faze daleko od osmotskog pritiska telesne tečnosti, javlja se hemoliza ili bol izazvani kretanjem vlage u pojedinim tkivima. Prema tome, osmotski pritisak spoljne vodene faze u predmetnom pronalasku je poželjno 200 do 400 mOsmol/L, još poželjnije 250 do 350 mOsmol/L, a najpoželjnije je izotoničan sa telesnom tečnošću.

(Sterilna filtracija)

[0098] Da bi se formulisao vodeni rastvor koji sadrži lipozome, dobijen postupkom za proizvodnju lipozomske kompozicije prema predmetnom pronalasku, u farmaceutskoj kompoziciji, poželjno je izvršiti sterilnu filtraciju. Što se tiče postupka filtracije, moguće je ukloniti neželjene materijale iz vodenog rastvora koji sadrži lipozome upotrebom membrane šupljih vlakana, membrane reverzne osmoze, membranskog filtera ili slično. U predmetnom pronalasku, vodeni rastvor koji sadrži lipozome poželjno se filtrira pomoću filtera koji ima sterilne pore veličine (poželjno 0.2 µm sterilni filter) iako nema posebnih ograničenja. Obično se u koraku filtracije može desiti adsorpcija ili agregacija lipozoma na sterilnom filteru. Međutim, predmetni pronalazak ima neočekivane efekate kao što je mali uticaj gubitka pritiska ili slično prilikom izvođenja filtracije, jer se dobijaju lipozomi koji imaju specifičnu prosečnu veličinu i ravnomernu raspodelu veličine čestice.

[0099] Da bi se sprečio efekat deformacije lipozoma na prosečnu veličinu čestice, korak sterilne filtracije i dole opisani korak aseptičnog punjenja poželjno se izvode na temperaturi nižoj ili istoj temperaturi faznog prelaska lipida koji čine lipozom. Na primer, u slučaju kada je temperatura faznog prelaska lipida oko 50°C, korak sterilne filtracije i dole opisani korak aseptičnog punjenja izvode se na temperaturi od poželjno oko 0°C do 40°C, i još specifičnije oko 5°C do 30°C.

(Aseptično punjenje)

[0100] Vodeni rastvor koji sadrži lipozome dobijen nakon sterilne filtracije je poželjno aseptično napunjen za medicinske primene. Za aseptično punjenje mogu da se primene poznati postupci. Lipozomska kompozicija pogodna za medicinske primene može se pripremiti aseptičnim punjenjem vodenog rastvora koji sadrži vodeni rastvor u kontejneru.

[0101] Vodeni rastvarač, aditiv, ili slično mogu se na odgovarajući način dodati vodenom rastvoru koji sadrži lipozome dobijene predmetnim pronalaskom da bi se na taj način pripremila farmaceutska kompozicija koja sadrži lipozomsku kompoziciju. U vezi sa načinom administriranja, farmaceutska kompozicija takođe može da sadrži najmanje jedan od agenasa za toničnost, stabilizator, antioksidans, ili sredstvo za podešavanje pH koje je farmaceutski prihvatljivo.

[0102] Agens toničnosti nije posebno ograničen i njegovi primeri uključuju neorganske soli kao što su natrijum hlorid, kalijum hlorid, natrijum hidrogen fosfat, natrijum dihidrogen fosfat i kalijum dihidrogen fosfat; poliole kao što je glicerol, manitol i sorbitol; i šećere kao što je glukoza, fruktoza, laktoza i saharoza.

[0103] Stabilizator nije posebno ograničen i njegovi primeri uključuju šećere kao što su glicerol, manitol, sorbitol, laktoza i saharoza.

[0104] Antioksidans nije posebno ograničen i njegovi primeri uključuju askorbinsku kiselinu, mokraćnu kiselinu, homologe tokoferola (na primer, vitamin E, četiri izomera tokoferola α, β, γ, i δ), cistein i EDTA. Stabilizatori i antioksidansi mogu da se koriste redom sami ili u kombinaciji od dva ili više njih.

[0105] Primeri agensa za podešavanje pH uključuju natrijum hidroksid, limunsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, trietanolamin, natrijum hidrogen fosfat, natrijum dihidrogen fosfat i kalijum dihidrogen fosfat.

[0106] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može da sadrži organski rastvarač, kolagen, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, karboksivinil polimer, natrijum karboksimetil celuloza, natrijum poliakrilat, natrijum alginat, dekstran rastvorljiv u vodi, natrijum karboksimetil skrob, pektin, metil celuloza, etil celuloza, ksantan gumu, arapsku gumu, kazein, želatin, agar, diglicerol, propilen glikol, polietilen glikol, vazelin, parafin, stearil alkohol, stearinsku kiselinu, humani serumski albumin (HSA), manitol, sorbitol, laktozu, PBS, natrijum hlorid, šećere, biorazgradiv polimer, medijum bez seruma, od kojih je svaki farmaceutski prihvatljiv, ili aditiv koji je prihvatljiv kao farmaceutski aditiv.

[0107] Konkretno, u kontekstu predmetnog pronalaska, farmaceutska kompozicija poželjno sadrži amonijum sulfat, L-histidin, prečišćenu saharozu, natrijum hidroksid, hlorovodoničnu kiselinu ili slično.

[0108] Posuda u kojoj se puni farmaceutska kompozicija nije posebno ograničena, i poželjno je da je napravljena od materijala koji ima malu propustljivost kiseonika. Primeri kontejnera uključuju plastični kontejner, stakleni kontejner, i kesu od laminatnog filma koja ima aluminijumsku foliju, film od nanesenog aluminijuma, film od nanesenog aluminijum oksida, film od nanesenog silicijum oksida, polivinil alkohol, kopolimer etilen-vinil alkohola, polietilen tereftalat, polietilen naftalat, poliviniliden hlorid, ili slično kao zaštitni sloj za gas. Ako je neophodno, zaštita od svetlosti može biti prihvatanjem u kesicu ili korišćenjem stakla u boji, aluminijumske folije, filma od nanesenog aluminijuma ili slično.

[0109] U kontejneru u kome je napunjena farmaceutska kompozicija, kako bi se sprečila oksidacija kiseonikom prisutnim u prostoru u kontejneru, poželjno je zameniti gasove u prostoru kontejnera i rastvor leka sa inertnim gasovima kao što je azot. Na primer, injekcioni rastvor je barbotiran azotom, pri čemu se punjenje injekcionog rastvora u kontejner može izvoditi u atmosferi azota.

[0110] Poželjno postupak administriranja farmaceutske kompozicije je parenteralna administracija. Na primer, mogu se odabrati intravenska injekcija kao što su intravenska kap po kap, intramuskularna injekcija, intraperitonealna injekcija, potkožna injekcija, intraokularna injekcija ili intratekalna injekcija. Specifičan postupak administriranja lipozomske kompozicije uključuje, na primer, špric, i administriranje intravenskim kapanjem.

[0111] Doza leka sadržana u farmaceutskoj kompoziciji obično se bira u opsegu od 0.01 mg do 100 mg/kg telesne težine/dan. Međutim, lipozomska kompozicija predmetnog pronalaska nije ograničena na takvu dozu.

(Brzina oslobađanja)

[0112] Brzina oslobađanja odnosi se na količinu leka koja izlazi na spoljnoj strani lipozoma po jedinici vremena. U predmetnom pronalasku, brzina oslobađanja je poželjno 10 mas%/24h do 70 mas%/24h, poželjnije 20 mas%/24h do 60 mas%/24h, i još poželjnije 20 mas%/24h do 50 mas%/24h.

[0113] Brzina oslobađanja zavisi od temperature i zbog toga se meri poželjno pod uslovima konstantne temperature. Na primer, u slučaju čoveka, temperatura nije posebno ograničena, ali je poželjno da se meri brzina oslobađanja na temperaturi u opsegu telesne temperature (35°C do 38°C).

[0114] U slučaju kada je lek sadržan u lipozomu antikancer agens, kada je brzina oslobađanja manja od 15 mas%/24h, ne može se dobiti dovoljno vreme izlaganja u telu kao sredstva protiv kancera, shodno tome očekivana efikasnost leka nije postignuta u mnogim slučajevima. Dalje, lipozomi koji sadrže antikancerogeni agens u nekim slučajevima ostaju u telu nepotrebno dugo, kao posledica može se ispoljiti neočekivana toksičnost usled nakupljanja istih u tkivima kao što je koža gde se takvi lipozomi teško prirodno distribuiraju. Dalje, kada je brzina oslobađanja veća od 70 mas%/24h, s obzirom da se povećava količina leka izložena u jedinici vremena, maksimalna koncentracija u krvi se povećava, povećavajući time toksičnost, i takođe se lek koji curi distribuira u tkivima koja nisu područje tumora ili se podvrgava brzom metabolizmu, što rezultira smanjenim zadržavanjem u krvi, što je stoga nepovoljno.

[0115] Metoda merenja brzine oslobađanja nije posebno ograničena. Na primer, lek se administrira sisarima ili model sistemu od interesa, krv ili krvna plaza su prikupljeni u svakoj jedinici vremena iz sisara ili model sistema, i ako je potrebno, vrši se predtretman ili slično. Zatim se ciljani lek može meriti metodom poput tečne hromatografije visokih performansi ili masenom spektrometrijom.

[0116] Pored toga, pri merenju brzine oslobađanja leka, doza leka varira u zavisnosti od subjekta kome se administrira, ciljnog organa, simptoma, metode administriranja ili slično. Na primer, u slučaju injekcije, na primer, za čoveka (pacijent; telesne težine 60 kg), poželjno je administriranje doze od oko 0.01 do 30 mg/dan, poželjno oko 0.1 do 20 mg/dan, i još poželjnije oko 0.1 do 10 mg/dan intravenoznom injekcijom. Za ostale životinjske vrste, može se administrirati, količina pretvorena u odnosu na telesnu težinu i površinu u odnosu na gore navedenu dozu po telesnoj težini od 60 kg.

(Volumen tumora)

[0117] U predmetnom pronalasku, tumor se može transplantirati u model životinju (poželjno, miša) da bi se izmerio volumen tumora. U slučaju gde se lipozomska kompozicija predmetnog pronalaska administrira subjektu kao što je sisar, može se uočiti efekat inhibicije rasta volumena tumora. Inhibicija rasta volumena tumora zavisi od leka koji se koristi, kombinacije lipida ili slično koji čine lipozome i efikasne količine. Iinhibicija rasta volumena tumora odnosi se na najmanje jednu od inhibicija rasta tumora, mirovanje tumora i značajnu ili potpunu regresiju tumora.

[0118] U slučaju kada se lipozomska kompozicija predmetnog pronalaska administrira subjektu kao što je sisar, model životinje su raspoređene u grupu koja se leči i kontrolnu grupu, i transplatacija tumorske ćelije može početi, na primer, nakon što su ćelije tumora porasle do veličine od 100 do 1000 mm<2>tako da se ćelije tumora slegnu. Doza od 0.01 do 100 mg/kg može se administrirati na osnovu telesne težine na početku lečenja. Na primer, u slučaju kada je model životinja miš, životinje su dnevno vagane u celini, sve dok miševi svake grupe ne postignu najnižu telesnu težinu, kao procena lipozomske kompozicije predmetnog pronalaska. Zatim je do kraja eksperimenta izmerena telesna težina životinja za svaku grupu. Tumor se može meriti šestarom ili slično dok se konačno žrtvovanje ne učini za vreme uzorkovanja, dok tumor ne dostigne 2000 mm<3>ili dok životinje ne uginu.

[0119] Volumen tumora kod sisara može se meriti bilo kojim postupkom koji je cenjen u oblasti. Na primer, volumen tumora može se proceniti prema Jednačini: (a×b<2>)×0.5 (gde je "a" maksimalni prečnik, i "b" je dužina male ose), korišćenjem šestara za merenje. Dalje se volumen tumora kod humanog subjekta može proceniti tehnikom kao što je dijagnostičko snimanje, na primer skeniranjem kompjuterizovanom tomografijom (eng. computed tomography (CT)) ili skeniranjem magnetnim rezonantnim snimanjem (eng. magnetic resonance imaging (MRI)).

Industrijska primenljivost

[0120] Prema lipozomskoj kompoziciji i postupku za njeno dobijanje prema predmetnom pronalasku, moguće je obezbediti lipozomsku kompoziciju koja ima praktično zahtevanu dugoročnu stabilnost očuvanja i koja je sposobna da na odgovarajući način kontroliše otpuštanje leka činjenjem unutrašnje vodene faze hiper-osmotskom. Lipozomska kompozicija predmetnog pronalaska primenljiva je za farmaceutske proizvode, kozmetičke proizvode, prehrambene proizvode, ili slično, a naročito je korisna za farmaceutske primene.

[PRIMERI]

[0121] U daljem tekstu, predmetni pronalazak će biti detaljno opisan sa pozivanjem na Primere. Međutim, predmetni pronalazak nije ograničen na takve Primere.

[0122] Odnos mešanja u sastavu rastvarača odnosi se na zapreminski odnos. Na primer, "etanol/etil acetat=90/10" se odnosi na zapreminski odnos 90% etanola/10% etil acetata.

(Primer 1)

a) Priprema uljane faze

[0123] Hidrogenizovani fosfatidilholin iz soje (HSPC) i holesterol pomešani su u molarnom odnosu prikazanom u Tabeli 1 da bi bilo ukupno 6.38 mmol, i zatim je tome dodato 15 mL organskog rastvarača (etanol/etil acetat=1/1), praćeno zagrevanjem do 70°C i rastvaranjem lipida radi pripreme uljane faze.

[Tabela 1]

b) Priprema vodene faze

[0124] Gemcitabin hidrohlorid je rastvoren do 8 mg/mL upotrebom vode za injekcije i 10×PBS (proizvodi ga GIBCO, Life Technologies). U to vreme, osmotski pritisak je podešen na 840 mOsmol/L u odnosu voda za injekcije:10×PBS (proizvodi ga GIBCO, Life Technologies).

c) Korak inkapsuliranja leka izveden istovremeno sa formiranjem čestice lipozoma emulgovanjem

[0125] Vodena faza pripremljena pod b) je zagrejana na 70°C, dodata je uljana faza tako da se postigne zapreminski odnos vodena faza /uljana faza=8/3, a zatim su dve faze pomešane korišćenjem mašine za emulgovanje tipa rotacione agitacije (Excel Auto homogenizator ED-3, proizvodi ga NIHONSEIKI KAISHA LTD.) na 3000 opm tokom 10 minuta, praćeno mešanjem na 6000 opm tokom 10 minuta a zatim na 12000 opm tokom 10 minuta. Posle toga, dodato je 0.34 mmol N-(karbonil-metoksipolietilen glikol 2000)-1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin natrijumove soli (u daljem tekstu, označen kao DSPE-PEG) kao vodeni rastvor na takav način da je molarni odnos zbira hidrogenizovanog fosfatidilholina soje i holesterol:DSPE-PEG bio 95/5. Posle toga, organski rastvarač i voda su ispareni neprekidnim mešanjem uz održavanje zagrevanja na 70°C, i dodata je voda koja odgovara količini isparene vode. Nakon toga je usledilo zaptivanje, održavanje zagrevanja na 70°C tokom 70 minuti, i hlađenje do sobne temperature. Osmotski pritisak svake formulacije u ovoj tački vremena (trenutku) je 840 mOsmol/L. Osmotski pritisak u ovom trenutku postaje osmotski pritisak unutrašnje vodene faze lipozoma sa inkapsuliranim lekom koji treba dovršiti. Posle toga, izvršeno je dimenzionisanje sekvencijalnim propuštanjem nastalih čestica lipozoma kroz filter od 0.2 µm i filter od 0.05 µm pomoću istiskivača (Mini Extruder, proizvodi ga Avanti Polar Lipids) pri zagrevanju od 70°C do 80°C, pri čemu se priprema tečnost lipozoma sa inkapsuliranim lekom.

d) Dovršavanje lipozomske kompozicije dijalizom

[0126] 10-struko (zapreminski) razblaženi 10×PBS (pH 7.4) (proizvodi ga NIPPON GENE CO., LTD.) je pripremljen kao tečnost za dijalizu. Osmotski pritisak ove tečnosti iznosio je 307 mOsm/L. Ovaj osmotski pritisak postaje osmotski pritisak spoljne vodene faze lipozoma sa inkapsuliranim lekom koji treba dovršiti. Korišćenjem ove tečnosti za dijalizu, dijaliza je sprovedena na sobnoj temperaturi da bi se uklonili nekapsulirani gemcitabin hidrohlorid i pojedinačne rastvorene supstance prisutne u spoljnoj vodenoj fazi lipozomske tečnosti sa inkapsuliranim lekom, i spoljna vodena faza je zamenjena tečnošću za dijalizu.

Merenje prosečne veličine čestice

[0127] Prosečna zapreminska veličina čestice uzorka razblaženog 1000-struko (težinski) sa 1×PBS-om (proizvodi ga NIPPON GENE CO., LTD.) izmerena je metodom dinamičkog rasejanja svetlosti pomoću nano traka UPA-UT (proizvodi ga Nikkiso Co., Ltd.). Rezultati su prikazani u Tabeli 2.

[Tabela 2]

Merenje stabilnosti očuvanja leka

[0128] Lipozomska kompozicije iz Primera 1-1 do 1-5 čuvani su na 5°C i 25°C tokom jedne nedelje, a zatim je izmeren učinak zadržavanja leka u unutrašnjoj vodenoj fazi kvantifikovanjem količine leka prisutnog u spoljnoj vodenoj fazi. Posle nedelju dana od početka skladištenja, 100 µL uzorkovanog uzorka je razblaženo 10-struko (zapreminski) vodom, i zatim podvrgnuto centrifugalnoj filtraciji pod uslovima 7400×g, 30 minuta, i 4°C, koristeći ultrafiltracioni filter (Amicon Ultra-0.5 10kDa, proizvodi ga Merck Millipore Corporation). Količina leka sadržana u oporavljenom filtratu je kvantifikovana HPLC-om, a odnos obilnosti (procenat spoljne vodene faze) leka prisutnog u spoljnoj vodenoj fazi izračunat je sledećom jednačinom.

[0129] Rezultati su prikazani na sl.1.

[0130] Kao što je prikazano na sl. 1, pronađeno je da formulacija koja sadrži holesterol u količini od 10 do 38 mol% stabilno zadržava inkapsuirani lek, i iznenađujuće zadržavanje je značajno poboljšano u Primeru 1-4 sa sadržajem holesterola od 19 mol%.

(Primer 2)

a) Priprema uljane faze

[0131] Hidrogenizovani fosfatidilholin iz soje (HSPC) i holesterol su pomešani u molarnom odnosu prikazanom u Tabeli 3 da bi bio ukupan iznos od 2.85 mmol, i tome je dodato 15 mL organskog rastvarača (etanol/etil acetat=1/1), praćeno zagrevanjem na 70°C i rastvaranjem lipida radi pripreme uljane faze.

[Tabela 3]

b) Priprema vodene faze

[0132] Gemcitabin hidrohlorid je rastvoren do 8 mg/mL upotrebom vode za injekcije i 10×PBS (pH 7.4) (proizvodi ga NIPPON GENE CO., LTD.). U to vreme, osmotski pritisak je podešen na 500 mOsmol/L odnosom vode za injekcije: 10×PBS (pH 7.4) (proizvodi ga NIPPON GENE CO., LTD.).

c) Korak inkapsuliranja leka izveden istovremeno sa formiranjem čestice lipozoma emulgovanjem

[0133] Vodena faza pripremljena pod b) je zagrejana na 70°C, uljana faza je dodata tako da se postigne zapreminski odnos vodene faze /uljane faze=8/3, a zatim su dve faze pomešane upotrebom mašine za emulgovanje tipa rotacione agitacije (Excel Auto homogenizator ED-3, proizvodi ga NIHONSEIKI KAISHA LTD.) na 3000 opm tokom 10 minuta, praćeno mešanjem na 6000 opm tokom 10 minuta i zatim na 12000 opm tokom 10 minuta. Posle toga, 0.15 mmol DSPE-PEG je dodato kao vodeni rastvor na takav način da je molarni odnos zbira hidrogenizovanog fosfatidilholina iz soje i holesterola:DSPE-PEG bio 95/5. Posle toga, organski rastvarač i voda su ispareni neprekidnim mešanjem uz održavanje zagrevanja na 70°C, i isparavanje je prekinuto zaustavljanjem zagrevanja i mešanja u trenutku kada je osmotski pritisak dostigao 1090 do 1200 mOsmol/L. Osmotski pritisak u ovom trenutku postaje osmotski pritisak unutrašnje vodene faze lipozoma sa inkapsuliranim lekom koji treba završiti. Posle toga, izvršeno je određivanje veličine tako što su nastale lipozomske čestice sekvencijalno propuštene kroz filter od 0.2 µm i filter od 0.05 µm pomoću istiskivača (Mini Extruder, proizvodi ga Avanti Polar Lipidi) pri zagrevanju od 70°C do 80°C.

d) Dovršavanje lipozomske kompozicije dijalizom

[0134] Vodeni rastvor od 275 mM saharoze/10 mM histidina je pripremljen kao tečnost za dijalizu. Osmotski pritisak izračunat iz molarne koncentracije rastvorene supstance ove tečnosti iznosio je 285 mOsm/L. Ovaj osmotski pritisak postaje, osmotski pritisak spoljne vodene faze lipozoma sa inkapsuliranim lekom koji treba dovršiti. Koristeći ovu tečnost za dijalizu, dijaliza je sprovedena na sobnoj temperaturi da bi se uklonili nekapsulirani gemcitabin hidrohlorid i pojedinačne rastvorene supstance prisutne u spoljnoj vodenoj fazi tečnosti za punjenje leka, i spoljna vodena faza zamenjena je tečnošću za dijalizu.

Merenje prosečne veličine čestice

[0135] Prosečna veličina čestice određena je merenjem kumulativne prosečne veličine čestice uzorka 100-struko razblaženog (težinski) sa 1×PBS (proizvodi ga NIPPON GENE CO., LTD.) metodom dinamičkog rasipanja svetlosti primenom FPAR1000AS (proizvodi ga Otsuka Electronics Co., Ltd.). Rezultati su prikazani u Tabeli 4.

[Tabela 4]

Merenje stabilnosti očuvanja leka

[0136] Lipozomske kompozicije iz Primera 2-1 do 2-6 čuvane su na 5°C i 25°C tokom jedne nedelje, a zatim je izmeren procenat spoljne vodene faze na isti način kao u Primeru 1. Rezultati su prikazani na sl.2.

[0137] Iz sl.2, je utvrđeno da je sadržaj holesterola od 19 mol% optimalan za učinak zadržavanja. Poznato je da lipidna dvoslojna membrana pokazuje promenu faznog stanja membrane i sve veću fluidnost odakle je sadržaj holesterola veći od 20 mol%. Generalno se smatra da u graničnoj zoni faznog stanja od oko 20 mol%, membranska struktura postaje nestabilna što dovodi do poteškoća u zadržavanju inkapsuliranog leka. Stoga su gornji rezultati ovog predmetnog pronalaska neočekivani.

Merenje brzine oslobađanja u krvnoj plazmi

[0138] 50 µL svake od lipozomskih kompozicija iz Primera 2-1 do 2-6 razblaženo je 20-struko (zapreminski) sa krvnom plazmom miša, i inkubirano na 37°C tokom 24 sata, praćeno sakupljanjem 100 µL na 0, 1, 4, 9, i 24 sata. Posle toga je izvršena centrifugalna filtracija pod uslovima od 7400xg, 30 minuta, i 4°C, koristeći ultrafiltracioni filter (Amicon Ultra-0.510kDa, proizvodi ga Merck Millipore Corporation). količina leka sadržana u oporavljenom filtratu je kvantifikovana pomoću HPLC-a, i procenat spoljne vodene faze je izračunat sledećom jednačinom.

[0139] Rezultati vremenski zavisne promene koja pokazuje brzinu oslobađanja u krvnoj plazmi su prikazani na sl.3. sl. 3 je data sa Primerom Br. i sadržajem holesterola.

[0140] Na sl. 3, može se videti da je oslobađanje leka u krvnoj plazmi povećana pri sadržaju holesterola od 25 mol%. Dalje, sadržaj holesterola imao je značajan uticaj na stabilnost očuvanja na 25°C tokom jedne nedelje kao što je prikazano na sl.2. Lek je bio stabilan, naročito, pri sadržaju holesterola od 19 mol%, ali nije bilo značajnog efekta takvog sadržaja holesterola na stabilnost u krvnoj plazmi. To pokazuje da je moguće poboljšati zadržavanje tokom skladištenja bez modifikovanja oslobađanja leka u krvnoj plazmi, što će stoga postati vrlo korisna kontrolna metoda za praktičnu upotrebu.

(Primer 3)

a) Priprema uljane faze

[0141] Uzeto je 1.79 g hidrogenizovanog fosfatidilholina iz soje i 0.22 g holesterola u molarnom odnosu od 76/19, a zatim je tome dodato 15 mL organskog rastvarača (etanol/etil acetat=1/1), praćeno zagrevanjem do 70°C i rastvaranjem lipida radi pripreme uljane faze.

b) Priprema vodene faze

[0142] Gemcitabin hidrohlorid je rastvoren do 8 mg/mL upotrebom vode za injekcije i 10×PBS (proizvodi ga GIBCO, Life Technologies). U to vreme, osmotski pritisak je prilagođen vrednosti prikazanoj u Tabeli 5 promenom odnosa vodA za injekcije: 10×PBS (proizvodi ga GIBCO, Life Technologies).

[Tabela 5]

c) Korak inkapsuliranja leka izveden istovremeno sa formiranjem čestice lipozoma emulgovanjem

[0143] Vodena faza je zagrejana na 70°C, dodata je uljana faza tako da se postigne zapreminski odnos vodena faza/uljana faza=8/3, a zatim su dve faze pomešane pomoću mašine za emulgovanje tipa rotacione agitacije (Excel Auto homogenizator ED-3, proizvodi ga NIHONSEIKI KAISHA LTD.) na 3000 opm tokom 10 minuta, praćeno mešanjem na 6000 opm tokom 10 minuta a zatim 12000 opm tokom 10 minuta. Posle toga dodato je 0.41 g DSPE-PEG-a kao vodeni rastvor na takav način da je molarni odnos hidrogenizovani fosfatidilholin iz soje:holesterol:DSPE-PEG bio 76/19/5. Posle toga, organski rastvarač i voda su isparavani neprekidnim mešanjem uz održavanje zagrevanja na 70°C, i isparavanje je prekinuto zaustavljanjem zagrevanja i mešanjem u trenutku kada su dostigli osmotski pritisak prikazan u Tabeli ispod. Osmotski pritisak u ovom trenutku postaje osmotski pritisak unutrašnje vodene faze lipozoma sa inkapsuliranim lekom koji treba dovršiti. Posle toga izvršeno je određivanje veličine tako što su nastale lipozomeske čestice sekvencijalno propuštene kroz filter od 0.2 µm i filter od 0.05 µm pomoću istiskivača (Mini Extruder, proizvodi ga Avanti Polar Lipidi) pod zagrevanjem od 70°C do 80°C.

[Tabela 6]

d) Dovršavanje lipozomske kompozicije dijalizom

[0144] 10×PBS (pH 7.4) (proizvodi ga NIPPON GENE CO., LTD.) razblažen je 10-struko (zapreminski) vodom pripremljenom kao tečnost za dijalizu. Osmotski pritisak izračunat iz molarne koncentracije rastvorene supstance ove tečnosti iznosio je 307 mOsm/L. Osmotski pritisak postaje osmotski pritisak spoljne vodene faze lipozoma sa inkapsuliranim lekom koji treba dovršiti. Korišćenjem ove tečnosti za dijalizu, dijaliza je sprovedena na sobnoj temperaturi radi uklanjanja nekapsuliranog gemcitabin hidrohlorida i pojedinačnih rastvorenih supstanci prisutnih u spoljnoj vodenoj fazi tečnosti za punjenje leka, a spoljna vodena faza je zamenjena tečnošću za dijalizu.

Merenje brzine oslobađanje u krvnoj plazmi

[0145] 50 µL lipozomske kompozicije iz Primera 1 razblaženo je 20-ostruko (zapreminski) krvnom plazmom miša, i inkubirano na 37°C tokom 24 sata, praćeno sakupljanjem 100 µL na 0, 1, 4, 9, i 24 sata. Posle toga je izvršena centrifugalna filtracija pod uslovima od 7400xg, 30 minuta, i 4°C, koristeći ultrafiltracioni filter (Amicon Ultra-0.5 10kDa, proizvodi ga Merck Millipore Corporation). Količina leka sadržana u oporavljenom filtratu je kvantifikovana HPLC-om, a procenat spoljne vodene faze je izračunat sledećom jednačinom.

[0146] Rezultati vremenski zavisne promene koja pokazuje brzinu otpuštanja u krvnoj plazmi prikazani su na sl.4.

[0147] Iz rezultata sa sl.4, pronađeno je da se brzina otpuštanja u krvnoj plazmi može proizvoljno kontrolisati podešavanjem osmotskog pritiska unutrašnje vodene faze prema spoljnoj vodenoj fazi, u udelu holesterola u predmetnom pronalasku.

[0148] Kao što se može videti iz gore prikazanih rezultata, moguće je obezbediti lipozomsku kompoziciju koja inkapsulira u vodi rastvorljiv lek u rastvorenom stanju i takođe pokazuje odličnu stabilnost očuvanja čak i u uslovima kada je osmotski pritisak unutrašnje vodene faze 2-struki do 8-struki u odnosu na osmotski pritisak spoljne vodene faze.

Claims (8)

Patentni zahtevi

1. Lipozomska kompozicija, koja sadrži:

lipozome od kojih svaki ima unutrašnju vodenu fazu i vodeni rastvor koji čini spoljnu vodenu fazu i u kojoj su lipozomi dispergovani,

pri čemu je sadržaj holesterola 15 mol% do 25 mol% u odnosu na ukupnu količinu lipidnih komponenti u lipozomskoj kompoziciji, i

svaki od lipozoma inkapsulira lek u rastvorenom stanju, a osmotski pritisak unutrašnje vodene faze je 2-struki do 8-struki u odnosu na osmotski pritisak spoljne vodene faze, pri čemu lipidi koji čine lipozom uključuju najmanje hidrogenizovani fosfatidilholin soje, 1,2-distearoil-3-fosfatidiletanolamin-polietilen glikol i holesterol, i

pri čemu je prosečna veličina čestice lipozoma 5 nm do 100 nm.

2. Lipozomska kompozicija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je lipozom pojedinačna lamela.

3. Lipozomska kompozicija prema patentom zahtevu 1 ili 2, pri čemu je brzina oslobađanja leka iz lipozomske kompozicije u krvnoj plazmi 10 tež%/24h ili više u odnosu na početnu količinu inkapsulacije u lipozomskoj kompoziciji.

4. Lipozomska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu je lek gemcitabin.

5. Farmaceutska kompozicija koja sadrži lipozomsku kompoziciju prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4.

6. Postupak za proizvodnju lipozomske kompozicije, koji obuhvata:

korak emulgovanja emulgujućih lipida rastvorenih u organskom rastvaraču da bi se formirali lipozomi, bez sušenja i koraka očvršćavanja;

korak punjenja leka za inkapsuliranje u vodi rastvorljivog leka u lipozome dobijene u koraku emulgovanja; i

korak podešavanja osmotskog pritiska za zamenu vodenog rastvora nekapsuliranog leka hipo-osmotskim rastvorom radi podešavanja osmotskog pritiska unutrašnje vodene faze da bude hiper-osmotski u odnosu na osmotski pritisak spoljne vodene faze,

pri čemu korak emulgovanja emulgujućih lipida da bi formirali lipozome prilagođava sadržaj holesterola na 15 mol% do 25 mol% u odnosu na ukupnu količinu lipidnih komponenti u lipozomskoj kompoziciji, i

korak podešavanja osmotskog pritiska podešava osmotski pritisak unutrašnje vodene faze lipozoma na 2-struki do 8-struki u odnosu na osmotski pritisak spoljne vodene faze, i pri čemu lipidi koji čine lipozom uključuju najmanje hidrogenizovani fosfatidilholin soje, 1,2-distearoil-3-fosfatidiletanolamin-polietilen glikol i holesterol.

7. Postupak za proizvodnju lipozomske kompozicije prema patentnom zahtevu 6, pri čemu se lipozomi dobijeni nakon koraka emulgovanja koriste u sledećem koraku bez obrade istiskivanjem.

8. Postupak za proizvodnju lipozomske kompozicije prema patentnom zahtevu 6 ili 7, pri čemu se korak punjenja leka i korak podešavanja osmotskog pritiska izvode istovremeno.