CN1960732A - 用吉西他滨和egfr－抑制剂治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于制备治疗肿瘤或肿瘤转移的药物的方法，其特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨，同时使用或不使用另外的药剂或治疗，如其它抗癌药或放射疗法。本发明还涵盖药物组合物，其包含EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合，结合以药用载体。可用于实施本发明的优选的EGFR激酶抑制剂实例是化合物盐酸埃洛替尼(也已知为TarcevaTM)。

Description

用吉西他滨和EGFR-抑制剂治疗
发明背景
本发明涉及意欲治疗癌症的组合物和制备药物的方法。具体地，本发明涉及用于制备含有吉西他滨和表皮生长因子受体(EGFR)激酶抑制剂的药物的方法。
癌症是各种各样的细胞恶性肿瘤的通用名，其特征为生长失控、缺少分化、和能够侵袭局部组织并转移的能力。这些恶性肿瘤以不同的发病率影响体内的每种组织和器官。
在过去的几十年中已经开发了多种用于治疗各种类型癌症的治疗剂。最常用的抗癌剂类型包括：DNA烷化剂(例如环磷酰胺，异环磷酰胺)，抗代谢物(例如氨甲蝶呤，叶酸拮抗剂，和5-氟尿嘧啶，嘧啶拮抗剂)，微管破坏剂(例如长春新碱，长春碱，紫杉醇)，DNA插入剂(例如阿霉素，柔红霉素，顺铂)和激素疗法(例如他莫昔芬，氟他胺)。
根据国家癌症协会的信息，在美国肺癌是癌症死亡的唯一最大原因，并且在国家中造成近乎30％癌症死亡。根据世界健康组织的信息，每年全世界存在多于一百二十万病例的肺癌和支气管癌，导致每年约一百一十万死亡。NSCLC是肺癌最普遍的形式，占所有病例的约80％。对肺癌的治疗选择方案是外科手术，放射疗法和化学疗法，单独使用或组合使用，这取决于癌症的形式和阶段。对于晚期NSCLC，已经显示有效的药剂包括顺铂，卡铂，紫杉醇，多西他赛，托泊替康，伊立替康，长春瑞滨，吉西他滨(如gemzar)和EGFR激酶抑制剂gefitinib和埃洛替尼(erlotinib)。含顺铂和含卡铂的组合化学疗法方案已经显示产生目标应答率，其比用单一药剂化学疗法获得的要高(Weick，J.K et al.(1991)J.Clin.Oncol.9(7)：1157-1162)。已经报道紫杉醇在IV期患者中具有单一药剂活性，应答率在21％-24％(Murphy W.L.et al.(1993)J.Natl.Cancer Inst.85(5)：384-388)。紫杉醇组合已经显示相对高的应答率，显著的1年存活和肺癌症状的减轻(Johnson D.H.et al.(1996)J.Clin.Oncol.14(7)：2054-2060)。利用紫杉醇加上卡铂疗法，应答率在27％-53％，32％-54％的1年存活率。然而，这种治疗的效力是这样的以致于目前没有特定的疗法可以被认为是标准疗法。。
表皮生长因子受体(EGFR)激酶或其配体TGF-α的过表达与许多癌症时常相关，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、直肠结肠癌和头颈癌(SalomonD.S.，等(1995)Crit.Rev.Oncol.Hematol.19：183-232；Wells，A.(2000)Signal，1：4-11)，并且据信其还对这些肿瘤的恶性生长起作用。也已经发现在EGFR基因中的特定缺失-突变增加了细胞致瘤性(Halatsch，M-E.等(2000)J.Neurosurg.92：297-305；Archer，G.E.等(1999)Clin.Cancer Res.5：2646-2652)。EGFR刺激的信号途径的活化促进了多个可能促进癌症的进程，例如增殖，血管生成，细胞迁移和侵袭，减少的细胞凋亡，和诱导药物抗性。将直接抑制EGFR激酶活性的化合物用作抗肿瘤制剂的开发，以及将通过阻断EGFR活化而降低EGFR激酶活性的抗体用作抗肿瘤制剂，是研究的热点(de Bono J.S.and Rowinsky，E.K.(2002)Trends in Mol.Medicine 8：S19-S26；Dancey，J.and Sausville，E.A.(2003)Nature Rev.DrugDiscovery 2：92-313)。一些研究已经证实或者公开：当与某些其它抗癌剂或者化疗剂或治疗并用的时候，一些EGFR激酶抑制剂可以改善杀伤肿瘤细胞或者瘤。(例如Raben，D.等(2002)Semin.Oncol.29：37-46；Herbst，R.S.等(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1：719-732；Magne，N等(2003)Clin.Can.Res.9：4735-4732；Magne，N.等(2002)British Journal of Cancer86：819-827；Torrance，C.J.等(2000)Nature Med.6：1024-1028；Gupta，R.A.and DuBois，R.N.(2000)Nature Med.6：974-975；Tortora，等(2003)Clin.Cancer Res.9：1566-1572；Solomon，B.et al(2003)Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.55：713-723；Krishnan，S.等(2003)Frontiers in Bioscience 8，e1-13；Huang，S等(1999)Cancer Res.59：1935-1940；Contessa，J.N.等(1999)Clin.Cancer Res.5：405-411；Li，M.等Clin.(2002)Cancer Res.8：3570-3578；Ciardiello，F.等(2003)Clin.Cancer Res.9：1546-1556；Ciardiello，F.等(2000)Clin.Cancer Res.6：3739-3747；Grunwald，V.and Hidalgo，M.(2003)J.Nat.Cancer Inst.95：851-867；Seymour L.(2003)Current Opin.Investig.Drugs 4(6)：658-666；Khalil，M.Y.等(2003)Expert Rev.AnticancerTher.3：367-380；Bulgaru，A.M.等(2003)Expert Rev.AnticancerTher.3：269-279；Dancey，J.and Sausville，E.A.(2003)Nature Rev.DrugDiscovery 2：92-313；Kim，E.S.等(2001)Current Opinion Oncol.13：506-513；Arteaga，C.L.and Johnson，D.H.(2001)Current Opinion Oncol.13：491-498；Ciardiello，F.等(2000)Clin.Cancer Res.6：2053-2063；专利公开号：US2003/0108545；US 2002/0076408；和US 2003/0157104；以及国际专利公开号：WO 99/60023；WO01/12227；WO 02/055106；WO 03/088971；WO01/34574；WO 01/76586；WO 02/05791；和WO 02/089842)。
抗瘤药物应该理想地选择性杀伤癌细胞，具有相对于其对非恶性肿瘤细胞毒性而言更为宽泛的治疗指数。即使延长暴露于该药物，其同样保留针对恶性肿瘤细胞的效力。遗憾的是，没有一种目前的化疗具有这种理想的特性。相反，多数具有非常窄的治疗指数。此外，癌细胞暴露于轻微亚致死浓度的化疗剂通常会形成对该药剂的抗性，形成对一些其它抗瘤制剂的交叉抗性也是很常见的。
因此，需要治疗瘤形成和其它增生疾病的更有效的疗法。用于提高目前药物治疗效力的策略涉及改变它们的给药时间表，以及与其它抗癌剂或者生化调节剂结合使用。众所周知的联合治疗是一种这样的方法：其可以产生相对于单独使用每一种治疗性相关剂量的制剂更好的效力和减少的副作用。在一些情况下，药物组合的效力是加成性的(组合的效力基本上等于每种药物单独效力的总和)，但在其他情形中，效力是增效性的(组合的效力大于每种药物单独给药效力的总和)。
然而，仍急需对肺癌和其它癌症的改善治疗。本发明提供了抗癌组合疗法，其降低了效力所需的每种组分的剂量，从而降低了与每种药剂相关的副作用，而同时保持或者增加了治疗价值。在此描述的本发明提供了新的药物组合，和使用该药物组合来治疗肺癌和其它癌症的方法。
发明简述
本发明提供了一种用于制备治疗肿瘤或者肿瘤转移的药物的方法，其特征在于使用EGFR激酶抑制剂和吉西他滨。优选地，意欲同时或者先后给予患者治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨的组合，并使用或者不使用另外的药剂或者疗法，例如其它的抗癌药物或者放射疗法。
本发明还包括药物组合物，其包括结合有药用载体的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合。
可用于实施本发明的优选EGFR激酶抑制剂实例是化合物盐酸埃洛替尼(erlotinib HCl)(也称为TarcevaTM)。
附图说明
图1：随时间的埃洛替尼的血浆浓度：(A)剂量依赖的血浆浓度(B)肿瘤药物浓度和血浆药物浓度之间的关系。对具有肿瘤的小鼠每日给予0、6.3、12.5、25.0、100.0或150.0mg/kg口服剂量的埃洛替尼，持续21天。在肿瘤植入后的第28天，在给药后的第1和第6小时收集血液(来自后眼窝窦(retro-orbital sinus))和肿瘤样品。利用LC-MS/MS确定埃洛替尼的浓度。数值是平均值±SD，n＝5。
图2：在H460a NSCLC异种移植模型中埃洛替尼对平均肿瘤体积的影响。将H460a NSCLC细胞植入小鼠。当建立可触知的肿瘤时，将动物随机化以使得每组具有100-150mm3的平均起始肿瘤体积。对小鼠每日给予0、6.3、12.5、25或100mg/kg口服剂量的埃洛替尼，持续21天。每周测量肿瘤大小三次。数值是平均值，n＝10。
图3：埃洛替尼和吉西他滨单独使用和组合使用对H460a NSCLC异种移植模型中平均肿瘤体积的影响。将H460a NSCLC细胞植入小鼠。当建立可触知肿瘤时，将动物随机化以使得每组具有100-150mm3的平均起始肿瘤体积。用下述物质分别处理小鼠21天：赋形剂，单独口服给药埃洛替尼25或100mg/kg/天，单独腹膜内给药吉西他滨30或120mg/kg/3天，或将25mg/kg/天埃洛替尼与30mg/kg/每3天吉西他滨联合给药。每周测量3次肿瘤大小。数值是平均值，n＝10。
图4：埃洛替尼和吉西他滨单独使用和组合使用对A549 NSCLC异种移植模型中平均肿瘤体积的影响。将A549 NSCLC细胞植入小鼠。当建立可触知肿瘤时，将动物随机化以使得每组具有100-150mm3的平均起始肿瘤体积。用下述物质分别处理小鼠21天：赋形剂，单独口服给药埃洛替尼25或100mg/kg/天，单独腹膜内给药吉西他滨30或120mg/kg/3天，或将25mg/kg/天埃洛替尼与30mg/kg/每3天吉西他滨联合给药。每周测量3次肿瘤大小。数值是平均值，n＝10。
图5：在给药埃洛替尼的小鼠中的皮肤损伤。在验尸时，将皮肤样品固定在10％缓冲的福尔马林中，包埋在石蜡中，以5μ切片，并用苏木精和伊红染色。在给药21天100mg/kg/天埃洛替尼的小鼠中，皮肤损伤整体表现为变红和易脱落的。在组织学上，损伤包括弥散，轻度至中度表皮棘层增厚，表皮角化，局部焦痂(escharosis)和大多数急性炎性细胞在真皮中的浸润。损伤是暂时的并且随着持续治疗而消散。
图6：在异种移植模型中NSCLC的免疫组织化学染色的光学显微照片。对于抗原Ki67将来自裸鼠的肿瘤切片染色以检测在对照小鼠(A)和用100mg/kg/天埃洛替尼处理12天的小鼠(B)中细胞增殖情况。黑色区域表示Ki67染色，表明增殖活性。
表格简述：
表1：在无肿瘤的雌性nu/nu无胸腺小鼠中20和100mg/kg埃洛替尼的单剂量药代动力学。
表2：对无肿瘤的无胸腺裸鼠(n＝5)治疗14天的最大耐受剂量评估。
发明详述
术语“癌”在动物中指的是存在这样的细胞，该细胞具有致癌细胞的典型特性，例如增殖失控，永生化，转移潜能，快速生长和增殖率，和某些形态学特性。通常，癌细胞的形式是肿瘤，但是这样的细胞可以单独存在于动物中，或者作为独立的细胞在血液中循环，如白血病细胞。
除非其它指明，本发明使用的“不正常细胞生长”指的是细胞生长独立于正常的调控机制(例如丧失接触抑制)。其包括下列情况的不正常生长：1.肿瘤细胞(肿瘤)，其通过表达突变的酪氨酸激酶或者过表达酪氨酸激酶受体而增殖；2.其它增殖疾病的良性和恶性细胞，其中发生异常的酪氨酸激酶活化；4.任何通过受体酪氨酸激酶而增殖的肿瘤；5.任何通过异常丝氨酸/苏氨酸激酶活化而增殖的肿瘤；和6.其它增殖疾病的良性和恶性细胞，其中发生异常的丝氨酸/苏氨酸激酶活化。
除非其它指明，本发明使用的术语“治疗”表示：在患者中部分或者全部逆转、减轻、抑制进程、或者预防肿瘤生长、肿瘤转移或者其它致癌细胞或致肿瘤细胞。本发明使用的术语“治疗”，除非其它指明，指的是治疗的行为。
当短语“治疗方法”或其等效语应用于例如癌症时，其指的这样的行动的步骤或者过程，该行动经过设计以在动物中降低或者消除癌细胞的数量，或者缓解癌症的症状。癌症或者其它增殖疾病的“治疗方法”不必定意味着所述的癌细胞或者其它疾病事实上会被消除了；所述细胞的数量或者疾病事实上会被降低；或者癌症或者其它疾病的症状事实上会被缓解。通常，即使成功可能很小，也会进行癌症的治疗方法，然而考虑到动物的用药史和预计的生存期，所述方法就其总体的作用过程来说对该动物是有益的。
术语“治疗有效的药剂”指的是这样的组合物，其将会诱导被研究者、兽医、医生或者其它临床医师所研究的组织、系统、动物或者人的生物或者医学应答。
术语“制备药物的方法”涉及制备用于如本文所述的适应症、特别是用于肿瘤、肿瘤转移或通常的癌症的药物。该术语涉及在指定的适应症中的所谓的“瑞士类型”的权利要求形式。
术语“治疗有效量”或者“有效量”指的是将会诱导被研究者、兽医、医生或者其它临床医师所研究的组织、系统、动物或者人的生物或者医学应答的受试化合物或者组合的量。
以下实施例中给出的数据证实：共同给药吉西他滨和EGFR激酶抑制剂对于治疗晚期癌症如结肠直肠癌有效。因此，本发明提供了一种制备用于在患者中治疗肿瘤或者肿瘤转移的药物的方法，其特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合。优选地，该组合意欲同时或者先后给药于患者。在一个实施方案中，所述的要被治疗的肿瘤或者肿瘤转移是结肠直肠肿瘤或者肿瘤转移。
优选地，意欲将这些物质同时或者先后给药于患者。因此，本发明还提供了一种用于制备治疗肿瘤或者肿瘤转移的药物的方法，其特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨并且意欲将其同时或者先后给药于患者。优选地，此外，使用一种或者多种其它细胞毒性的、化疗的或者抗癌剂，或者使用增强这些药剂效果的化合物。
在本发明的上下文中，额外的其它细胞毒性的、化疗的或者抗癌药剂或者增强这些药剂效果的化合物包括，例如烷化剂或者具有烷化作用的制剂如环磷酰胺(CTX；如cytoxan)，苯丁酸氮芥(CHL；如leukeran)，顺铂(Cisp；如platinol)，白消安(如myleran)，美法仑，卡莫昔汀(BCNU)，链脲霉素，曲他胺(TEM)，丝裂霉素C等；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤(MTX)，依托泊苷(VP16；如vepesid)，6-巯嘌呤(6MP)，6-thiocguanine(6TG)，阿糖胞苷(Ara-C)，5-氟尿嘧啶(5-FU)，卡培他滨(如Xeloda)，达卡巴嗪(DTIC)，等等；抗生素类例如放线菌素D，多柔比星(DXR；如adriamycin)，柔红霉素(daunomycin)，博来霉素，普卡霉素等等；生物碱类，例如长春花生物碱类例如长春新碱(VCR)，长春碱，等等；和其它抗肿瘤药剂例如紫杉醇(如taxol)和紫杉醇衍生物，细胞增殖抑制剂(cytostatic agents)，糖皮质激素如地塞米松(DEX；如decadron)和皮质甾类例如波尼松，核苷酶抑制剂例如羟基脲，氨基酸耗竭酶(amino acid depleting enzymes)例如天冬酰胺酶，甲酰四氢叶酸(leucovorin)，亚叶酸(folinic acid)，和其它叶酸衍生物，和类似的不同的抗肿瘤剂。还可以将下列药剂用作附加药剂：arnifostine(如ethyol)，放线菌素D，mechlorethamine(氮芥)，链佐星，环磷酰胺，lornustine(CCNU)，多柔比星脂(如doxil)，柔红霉素脂(如daunoxome)，丙卡巴肼，丝裂霉素，多西他赛(如taxotere)，阿地白介素，卡铂，克拉屈滨，喜树碱，CPT11(伊立替康)，10-羟基7-乙基-喜树碱(SN38)，氟尿苷，氟达拉滨，异环磷酰胺，伊达比星，美钠，干扰素α，干扰素β，米托蒽醌，托泊替康，亮丙立德，甲地孕酮，美法仑，巯嘌呤，普卡霉素，米托坦，培门冬酶，喷司他丁，哌泊溴烷，普卡霉素，他莫昔芬，替尼泊苷，睾内酯，硫鸟嘌呤，塞替派，尿嘧啶氮芥，长春瑞滨，苯丁酸氮芥。
同样更优选的是一种用于制备治疗肿瘤或者肿瘤转移的药物的方法，其特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合并且意欲将该组合同时或者先后给药于患者，其中另外使用一种或者多种抗-激素剂。如本文所用，术语“抗-激素剂”包括天然的或者合成的有机或者肽化合物，其调节或者抑制激素对肿瘤的作用。
抗激素剂包括例如：类固醇受体拮抗剂，抗雌激素类例如他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酶抑制4(5)-咪唑，其它芳香酶抑制剂，42-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬，keoxifene，LY 117018，奥那斯酮，和托瑞米芬(如Fareston)；抗雄激素类例如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及上述任何制剂的药用盐、酸或者衍生物；糖蛋白激素的激动剂和/或拮抗剂例如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)和LHRH(促黄体激素释放激素)；LHRH激动剂戈舍瑞林醋酸酯，可作为Zoladex(AstraZeneca)商购；LHRH拮抗剂D-丙氨酰胺N-乙酰基-3-(2-萘基)-D-丙氨酰-4-氯-D-苯丙氨酰-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酰-L-丝氨酰-N6-(3-吡啶基羰基)-L-赖氨酰-N6-(3-吡啶基羰基)-D-赖氨酰-L-亮氨酰-N6-(1-甲基乙基)-L-赖氨酰-L-脯氨酸(如Antide，Ares-Serono)；LHRH拮抗剂醋酸加尼瑞克；甾体抗雄激素类醋酸环丙孕酮(CPA)和醋酸甲地孕酮，可以作为Megace(Bristol-Myers Oncology)商购；非甾体抗雄激素氟他胺(2-甲基-N-[4，20-硝基-3-(三氟甲基)苯丙酰胺]，可以作为Eulexin(Schering Corp.)商购；非甾体抗雄激素尼鲁米特，(5，5-二甲基-3-[4-硝基-3-(三氟甲基-4′-硝基苯基)-4，4-二甲基-咪唑烷-二酮]；和其它非许可受体的拮抗剂，例如RAR，RXR，TR，VDR等等的拮抗剂。
化疗方案中使用上述细胞毒性和其它抗癌剂在癌症治疗领域已经被很好的表征，并且其在这里的应用也要考虑对耐药性和效果的监测以及考虑对给药途径和剂量的控制，进行一定程度的调节。例如，细胞毒性剂的实际剂量可以是变化的，这要取决于通过使用组织培养方法确定的患者的培养细胞应答。通常，相比于在没有额外其它制剂时使用的量，所述的剂量将减少。
有效细胞毒性制剂的典型的剂量可以在制备商推荐的范围内，并且当通过体外应答或者动物模型中的应答表明时，其可以被降低达大约一个数量级的浓度或者量。因此，实际的剂量将取决于医师的判断，患者的情况，和治疗方法的效果，所述的治疗方法基于初级培养的恶性肿瘤细胞或者组织培养的组织样品的体外应答，或者在适当动物模型中观察到的应答。
在本发明的上下文中，在上述的另外细胞毒性的、化疗的或者抗癌剂中，优选化合物顺铂和卡铂。
同样更优选的是用于制备治疗肿瘤或者肿瘤转移的药物的方法，其特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合并且意欲将其同时或者先后给药于患者，其中另外使用一种或者多种血管生成抑制剂。
抗血管生成制剂包括例如：VEGFR抑制剂如SU-5416和SU-6668(Sugen Inc.of South San Francisco，Calif.，USA)，或者如这里所描述的例如国际申请号WO 99/24440，WO 99/62890，WO 95/21613，WO 99/61422，WO 98/50356，WO 99/10349，WO 97/32856，WO 97/22596，WO 98/54093，WO 98/02438，WO 99/16755，和WO 98/02437，和美国专利号5,883,113，5,886,020，5,792,783，5,834,504和6,235,764；VEGF抑制剂例如IM862(Cytran Inc.of Kirkland，Wash.，USA)；angiozyme，一种来自核酶的合成的核酶(Boulder，Colo.)；和VEGF的抗体，例如贝伐单抗(如AvastinTMGenentech，South San Francisco，CA)，VEGF的重组人源化抗体；整合蛋白受体拮抗剂和整合蛋白拮抗剂，例如αvβ3，αvβ5和αvβ6整合蛋白，及其亚型，例如西仑吉肽(EMD 121974)，或者抗整合蛋白抗体例如诸如αvβ3特异的人源化抗体(如Vitaxin)；因子如IFN-α(美国专利号41530,901，4,503,035，和5,231,176)；血管抑素(angiostatin)和纤维蛋白溶酶原片段(例如kringle 1-4，kringle 5，kringle 1-3(O’Reilly，M.S.等(1994)Cell 79：315-328；Cao等(1996)J.Biol.Chem.271：29461-29467；Cao等(1997)J.Biol.Chem.272：22924-22928)；内皮他丁(O’Reilly，M.S.等(1997)Cell 88：277；和国际专利公开号.WO 97/15666)；血小板反应蛋白(TSP-1；Frazier，(1991)Curr.Opin.Cell Biol.3：792)；血小板因子4(PF4)；纤维蛋白溶酶原激活剂/尿激酶抑制剂；尿激酶受体拮抗剂；肝素酶；烟曲霉素类似物如TNP-4701；苏拉明和苏拉明类似物；血管抑素类固醇；bFGF拮抗剂；flk-1和flt-1拮抗剂；抗血管生成剂如MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂和MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂。有用的基质金属蛋白酶抑制剂的实例描述在国际专利公开号WO 96/33172，WO 96/27583，WO98/07697，WO 98/03516，WO 98/34918，WO 98/34915，WO 98/33768，WO98/30566，WO 90/05719，WO 99/52910，WO 99/52889，WO 99/29667，和WO 99/07675，欧洲专利公开号818,442，780,386，1,004,578，606,046，和931,788；英国专利公开号9912961，和美国专利号5,863,949和5,861,510中。优选的MMP-2和MMP-9抑制剂是具有很少或者没有MMP-1抑制活性的那些。更优选地，是相对于其它基质-金属蛋白酶(即MMP-1，MMP-3，MMP-4，MMP-5，MMP-6，MMP-7，MMP-8，MMP-10，MMP-11，MMP-12，和MMP-13)选择性抑制MMP-2和/或MMP-9的那些。
同样更优选的是用于制备治疗肿瘤或者肿瘤转移的药物的方法，其特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合并且意欲将其同时或者先后给药于患者，其中另外使用一种或者多种肿瘤细胞促凋亡剂或者凋亡刺激制剂。
同样更优选的是用于制备治疗肿瘤或者肿瘤转移的药物的方法，其特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合并且意欲将其同时或者先后给药于患者，其中另外使用一种或者多种信号传导抑制剂。
信号传导抑制剂包括如erbB2受体抑制剂，例如有机分子，或者结合到erbB2受体的抗体如曲妥单抗(如Herceptin)；其它蛋白酪氨酸激酶抑制剂如imitinib(如Gleevec)；ras抑制剂；raf抑制剂；MEK抑制剂；mTOR抑制剂；周期素依赖性蛋白激酶抑制剂；蛋白激酶C抑制剂；和PDK-1抑制剂(见Dancey，J.和Sausville，E.A.(2003)Nature Rev.DrugDiscovery 2：92-313，描述了这些抑制剂的一些实例，和它们在治疗癌症的临床试验中的应用)。
ErbB2受体抑制剂包括例如ErbB2受体抑制剂诸如GW-282974(Glaxo Wellcome plc)，单克隆抗体例如AR-209(Aronex PharmaceuticalsInc.of The Woodlands，Tex.，USA)，和描述在以下国际公开号中的erbB2抑制剂：WO 98/02434，WO 99/35146，WO 99/35132，WO 98/02437，WO97/13760，和WO 95/19970，以及美国专利号5,587,458，5,877,305，6,465,449和6,541,481。
同样更优选的是用于制备治疗肿瘤或者肿瘤转移的药物的方法，其特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合并且意欲将其同时或者先后给药于患者，其中另外使用抗HER2抗体或者其免疫治疗活性片段。
同样更优选的是用于制备治疗肿瘤或者肿瘤转移的药物的方法，其特在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合并且意欲将其同时或者先后给药于患者，其中另外使用一种或者多种额外的抗增殖剂。
额外的抗增殖剂包括例如酶法呢基(farnesyl)蛋白转移酶的抑制剂和受体酪氨酸激酶PDGFR的抑制剂，包括在美国专利号6,080,769，6,194,438,6,258,824，6,586,447，6,071,935，6,495,564，6,150,377，6,596,735和6,479,513，以及国际专利公开WO01/40217中公开和要求保护的那些。
同样更优选的是用于制备治疗肿瘤或者肿瘤转移的药物的方法，其特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合并且意欲将其同时或者先后给药于患者，其中另外使用COX II(环加氧酶II)抑制剂。有用的COX-II抑制剂的实例包括alecoxib(如CelebrexTM)，伐地考昔，和罗非考昔。
同样更优选的是用于制备治疗肿瘤或者肿瘤转移的药物的方法，其特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合并且意欲将其同时或者先后给药于患者，其中另外使用放射性药物。或者另外地，不是增加放射性药物，而是进行辐射治疗。
辐射源对被治疗患者来说可以是外部或者内部的。当辐射源对患者是外部的时候，该治疗被称为外部光束放射疗法(EBRT)。当辐射源对患者是内部时，该治疗被称为近距放射治疗法(BT)。在本发明上下文中使用的放射性原子可以选自包含但不仅限于下列物质的组：镭，铯-137，铱-192，镅-241，金-198，钴-57，铜-67，锝-99，碘-123，碘-131，和铟-111。当本发明的EGFR激酶抑制剂为抗体时，用这样的放射性同位素标记该抗体也是可能的。
放射疗法是用于控制无法切除或者不宜手术的肿瘤和/或肿瘤转移的标准治疗。当将放疗与化疗联合时已经观察到了改善的结果。放疗基于这样的原理：将高剂量的放射递送到靶区域会导致肿瘤和正常组织中繁殖细胞的死亡。放射剂量方案通常以放射吸收剂量(Gy)、时间和分级来定义，并且必须由肿瘤学家仔细定义。患者接受的放射量取决于不同的考虑，但是最重要的两个考虑是肿瘤相对于其它身体重要结构和器官的位置，和肿瘤扩展的程度。患者所要经历的放射治疗的典型疗程为在1周-6周时间的治疗计划，给予的患者全部剂量为10-80Gy，每一天为约1.8-2.0Gy的单一部分，一周5天。在本发明的优选实施方案中，当用本发明的治疗与放射治疗联合治疗人类患者的肿瘤的时候，会产生协同效果。换句话说，当联合放射疗法，任选另外联合化学或抗癌剂，通过含有本发明组合的药剂增强了对肿瘤生长的抑制。辅助放射治疗的参数在，例如，国际专利公开WO99/60023中。
同样更优选的是用于制备治疗肿瘤或者肿瘤转移的药物的方法，其特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合并且意欲将其同时或者先后给药于患者，其中另外使用一种或者多种能够增强抗肿瘤免疫应答的药剂。
能够增强抗肿瘤免疫应答的药剂包括例如：CTLA4(细胞毒性淋巴细胞抗原4)抗体(如MDX-CTLA4)，和其它能够阻断CTLA4的药剂。具体能应用于本发明的CTLA4抗体包括美国专利号6,682,736中描述的那些。
同样更优选的是制备用于降低由治疗肿瘤或者肿瘤转移所引起的副作用的药物的方法，其特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合并且意欲将其以这样的剂量同时或者先后给药于患者，所述剂量有效产生加成的、或者超加成的或协同抗肿瘤效果，并有效抑制肿瘤生长。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法，包括给予需要这种治疗的患者以i.第一个有效量的EGFR激酶抑制剂，或其药用盐；和ii.第二个有效量的吉西他滨。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法，包括给予需要这种治疗的患者以i.第一个低于治疗量(sub-therapeutic first amount)的EGFR激酶抑制剂埃洛替尼，或其药用盐；和ii.第二个低于治疗量(sub-therapeutic secondamount)的吉西他滨。
另外，本发明提供了药用载体中的含有EGFR抑制剂和吉西他滨的药物组合物。
本发明还提供了特别用于癌症的药物组合物，其包含i.第一个有效量的EGFR激酶抑制剂，或其药用盐；和ii.第二个有效量的吉西他滨。该组合物任选地含有药用载体和/或赋形剂。
本发明还提供了特别用于癌症的药物组合物，其包含i.第一个低于治疗量的EGFR激酶抑制剂埃洛替尼，或其药用盐；和ii.第二个低于治疗量的吉西他滨。该组合物任选地含有药用载体和/或赋形剂。
优选地，所述的EGFR激酶抑制剂是埃洛替尼。
本发明使用的术语“患者”优选指的是因任何目的需要EGFR激酶抑制剂治疗的人，更优选需要该治疗来治疗癌症、或者癌前状态或者损害的人。但是，该术语“患者”也可以指非人动物，其中，优选哺乳动物如狗，猫，马，牛，猪，绵羊，以及非人灵长类动物，这些动物需要EGFR激酶抑制剂治疗。
在一个优选的实施方案中，患者是需要治疗癌症，或者前癌病症或损伤的人。所述的癌症优选是任何可通过给予EGFR激酶抑制剂部分或者全部治疗的癌症。所述的癌症可以是例如肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管细胞肺癌(bronchioloalviolar cell lung cancer)，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或者眼球内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，肠癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织癌，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌(biliary cancer)，慢性或者急性白血病，淋巴细胞淋巴瘤，中枢神经系统(CNS)瘤，脊椎瘤，脑干胶质瘤，多形性成神经胶质细胞瘤，星形细胞瘤，schwanomas，室管膜细胞瘤，成神经管细胞瘤，脑脊膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤，包括任何上述癌症的顽疾，或一种或者多种上述癌症的组合。癌前病症或者损伤包括例如由下列组成的组：口腔白斑，光化性角化病(日光性角化病)，结肠或者直肠的癌前息肉，胃上皮发育不良，腺瘤发育不良，遗传性息肉结肠癌综合征(HNPCC)，巴雷特食管，膀胱发育不良，和前癌颈病(precancerous cervical conditions)。优选地，所述的癌症是结肠癌，并且最优选为结肠直肠癌。还优选地，所述癌症是肺癌，最优选非小细胞肺癌(NSCL)。
在本发明中“共给药”和“共给予”吉西他滨和EGFR激酶抑制剂(此后将这两种组分称为两种活性剂)指的是当将所述两种活性剂作为被设计以获得组合治疗疗效的合适剂量方案的一部分，上述两种活性剂分开或者一起地任一种地给予。因此，可以将这两种活性剂或者作为相同药物组合物的部分或者作为分开的药物组合物给予。吉西他滨可以先于、同时或者后于EGFR激酶抑制剂的给予，或者以其某种组合给予。当以重复的间隔将EGFR激酶抑制剂给予患者时，例如在一个标准疗程中，可以将吉西他滨先于、同时、或者后于EGFR激酶抑制剂的每次给予，或者以其某种组合，或者以相对于EGFR激酶抑制剂治疗的不同间隔，或者以单一剂量先于、在期间的任何时间、或者后于EGFR激酶抑制剂疗程给予。
通常将EGFR激酶抑制剂以这样的剂量方案给予患者，该方案提供了对待治疗患者最有效的癌症的治疗(同时从效力和安全角度考虑)，如本领域已知的和例如国际专利公开号WO01/34574所公开。在进行本发明治疗方法的时候，EGFR激酶抑制剂可以以任何本领域已知的有效方式进行给予，例如经口，局部，静脉内，腹膜内，肌肉内，关节内，皮下，鼻内，眼内，阴道，直肠或者真皮内途径，这取决于所要治疗癌症的种类，所使用EGFR激酶抑制剂的类型(例如小分子，抗体，RNAi，或者反义构建体)，处方医生的医学判断依据，如基于，例如，已经公开的临床研究结果。
给予的EGFR激酶抑制剂和给予EGFR激酶抑制剂的时机取决于被治疗患者的类型(种类，性别，年龄，重量，等等)和状态，被治疗疾病或者病症的严重度，和给药途径。例如，可以以剂量范围0.001-100mg/kg体重每天或者每周以单独或者分开的剂量，或者通过连续输液将小分子EGFR激酶抑制剂给予患者(见例如国际专利公开号WO01/34574)。特别是，可以以5-200mg每天或者100-1600mg每周的单独或者分开的剂量范围，或者通过连续输液将盐酸埃洛替尼给予患者。优选剂量是150mg/天。可以以0.1-100mg/kg体重每天/或者每周的单独或者分开的剂量范围，或者通过连续输液将基于抗体EGFR激酶抑制剂，或者反义、RNAi或者核酶构建体给予患者。在一些情况下，低于前述剂量范围下限的剂量水平可以是足够的，而在另一些情况下，可以使用更大的剂量而不引起任何有害的副作用，条件是这些更大的剂量在全天给予前首先被分成几个小剂量。
EGFR激酶抑制剂和吉西他滨可以分别或者同时以相同或者不同的路径、以广泛种类的各种剂型给予。例如EGFR激酶抑制剂优选口服或者肠胃外给予，而吉西他滨优选肠胃外给予。当EGFR激酶抑制剂是盐酸埃洛替尼(TarcevaTM)的时候，优选口服给予。
EGFR激酶抑制剂可以与多种药用惰性载体以下列形式给予：片剂、胶囊、糖锭、锭剂、硬糖、粉末、喷雾剂、乳膏剂、油膏、栓剂、胶冻、凝胶、糊剂、洗剂、软膏、酏剂、糖浆等等。这些剂型的给予可以以单一或多个剂量进行。载体包括固体稀释剂或者填充剂，无菌水性介质和各种非毒性有机溶剂等等。口服药物组合物可以是适当甜化和/或者增香化的。
EGFR激酶抑制剂和吉西他滨可以连同各种药用惰性载体以下列各种形式结合：喷雾剂、乳膏剂、油膏、栓剂、胶冻、凝胶、糊剂、洗剂、软膏等等。这样的剂型可以以单个或者多个剂量给予。载体包括固体稀释剂或者填充剂，无菌水性介质和各种非毒性有机溶剂等等。
应该对所有含有蛋白EGFR激酶抑制剂的制剂进行选择以避免所述抑制剂变性和/或降解和丧失生物活性。
制备包含EGFR激酶抑制剂的药物组合物的方法在本领域是已知的，并描述在例如国际专利公开号WO01/34574。制备包含吉西他滨的药物组合物的方法在本领域也是已知的。鉴于本发明的教导，从上述引用的出版物和从其他已知的参考文献的教导，如Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，第18版(1990)，制备包含EGRF激酶抑制剂和吉西他滨的药物组合物的方法是明显的。
对于口服给予EGFR激酶抑制剂，含有一种或者全部所述活性剂的片剂与各种赋形剂结合，赋形剂例如微晶纤维素，柠檬酸钠，碳酸钙，磷酸氢钙和甘氨酸，以及各种崩解剂例如淀粉(并且优选玉米、马铃薯或者木薯淀粉)，藻酸和某些复合硅酸盐，以及粒化粘合剂例如聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖，明胶和阿拉伯胶。另外，润滑剂例如硬脂酸镁，月桂硫酸钠，和滑石通常对于片剂化目的是有用的。类似类型的固体组合物还可以被用作明胶胶囊的填充剂；在这一点，优选的材料还包括半乳糖或者乳糖以及高分子量的聚乙二醇。当口服给予需要水性悬液和/或酏剂的时候，EGFR激酶抑制剂可以与多种甜化或者增香化制剂，着色物质或者染料结合使用，如果需要，也有乳化和/或悬浮剂，连同稀释剂如水、乙醇、丙二醇、甘油和其各种可能的组合。
对于肠胃外给予任何一种或者全部所述的活性剂，可以使用芝麻油或者花生油中的溶液，或者使用水性丙二醇中的溶液，以及含有所述活性剂或其相应的水溶性盐的无菌水性溶液。该无菌水性溶液被优选适当地缓冲并还优选赋予等渗，例如，用充足的盐水或者葡萄糖。这些特别的水性溶液特别适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内注射用。油性溶液适用于关节内、肌肉内和皮下注射用。所有这些溶液在无菌条件下的制备通过本领域技术人员熟知的标准制药技术可以很容易地实现。应该对任何给予蛋白EGFR激酶抑制剂的肠胃外制剂进行选择以避免所述抑制剂变性和丧失生物活性。
另外，依照标准制药实践，可以通过以下方式局部给予一种或者全部所述的活性剂：例如乳膏剂、洗剂、胶冻、凝胶、糊剂、油膏、软膏等等。例如，可以制备含有大约0.1％(w/v)-大约5％(w/v)浓度的EGFR激酶抑制剂或者吉西他滨的局部制剂。
为兽医用途，可以将所述的活性剂以上述任何形式和任何途径分别或者一起给予动物。在一个优选的实施方案中，以胶囊、丸剂、片剂，浸液的形式通过注射或者作为植入物给予EGFR激酶抑制剂。作为备选，可以将EGFR激酶抑制剂与动物饲料一起给予，为此目的，可以制备浓缩的饲料添加剂或者预混和物以用于正常动物饲养。吉西他滨优选通过注射或者作为植入物以浸液(liquid drench)形式给予。依照标准的兽医实践，以常规方法制备这样的制剂。
本发明还提供了含有单一容器的试剂盒，所述容器包含EGFR激酶抑制剂和吉西他滨两者。本发明还提供了这样的试剂盒，其含有第一容器和第二容器，所述第一容器包含EGFR激酶抑制剂，所述第二容器含有吉西他滨。在优选的实施方案中，所述的试剂盒容器还可以进一步包括药用载体。该试剂盒还可以包含无菌稀释剂，其被优选储存在一个单独的附加容器中。所述试剂盒还可以包括一个包装说明书，其包含打印的的说明书，用于指导将组合治疗用作治疗癌症的方法。
本发明使用的术语“EGFR激酶抑制剂”指的是任何目前在本领域熟知的或者将来会被鉴定的EGFR激酶抑制剂，并且包括任何在给药于患者时导致患者中与EGF受体活化相关的生物活性抑制的化学个体，其包括任何另外产生自其天然配体结合EGFR的下游生物学效应。这样的EGFR激酶抑制剂包括任何可以阻断EGFR活化的试剂或者任何与在患者中治疗癌症相关的EGFR活化的下游生物学效应。这样的抑制剂可以通过直接结合到受体的细胞内结构域和抑制其激酶活性而发挥作用。或者，这样的抑制剂可以通过占据EGFR受体的配体结合位点或者部分、从而使得受体难以接近其天然配体从而阻止或者降低了其正常生物学活性而发挥作用。或者，该抑制剂可以通过调节EGFR多肽的二聚化、EGFR多肽与其它蛋白质的相互作用、或者增强EGFR的泛化作用和细胞内降解而起作用。EGFR激酶抑制剂包括但不限于低分子量抑制剂、抗体或者抗体片段、反义构建体、小抑制性RNAs(即dsRNA的RNA干扰；RNAi)，和核酶。在一个优选的实施方案中，EGFR激酶抑制剂是特异结合到人EGFR的小的有机分子或者抗体。
EGFR激酶抑制剂包括例如喹唑啉EGFR激酶抑制剂，吡啶并-嘧啶EGFR激酶抑制剂，嘧啶并-嘧啶EGFR激酶抑制剂，吡咯并-嘧啶EGFR激酶抑制剂，吡唑并-嘧啶EGFR激酶抑制剂，苯基氨基-嘧啶EGFR激酶抑制剂，羟吲哚EGFR激酶抑制剂，吲哚并咔唑EGFR激酶抑制剂，酞嗪EGFR激酶抑制剂，异黄酮EGFR激酶抑制剂，quinalone EGFR激酶抑制剂和tyrphostin EGFR激酶抑制剂，如描述在下述专利出版物中的那些，和它们的所有药用盐和溶剂化物：国际专利公开号WO 96/33980，WO96/30347，WO 97/30034，WO 97/30044，WO 97/38994，WO 97/49688，WO 98/02434，WO 97/38983，WO 95/19774，WO 95/19970，WO 97/13771，WO 98/02437，WO 98/02438，WO 97/32881，WO 98/33798，WO 97/32880，WO 97/3288，WO 97/02266，WO 97/27199，WO 98/07726，WO 97/34895，WO 96/31510，WO 98/14449，WO 98/14450，WO 98/14451，WO 95/09847，WO 97/19065，WO 98/17662，WO 99/35146，WO 99/35132，WO 99/07701，和WO 92/20642；欧洲专利申请号EP 520722，EP 566226，EP 787772，EP 837063，和EP 682027；美国专利号5,747,498，5,789,427，5,650,415，和5,656,643；以及德国专利申请号DE 19629652。其它低分子量EGFR激酶抑制剂的非限制性实例包括Traxler，P.，1998，Exp.Opin.Ther.Patents8(12)：1599-1625中描述的那些。
具体优选的、可以依照本发明使用的低分子量EGFR激酶抑制剂的实例包括[6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺(也叫做OSI-774，埃洛替尼，或者TarcevaTM(盐酸埃洛替尼)；OSIPharmaceuticals/Genentech/Roche)(美国专利号5,747,498；国际专利公开号WO 01/34574，和Moyer，J.D.等(1997)Cancer Res.57：4838-4848)；CI-1033(先前已知为PD183805；Pfizer)(Sherwood等，1999，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.40：723)；PD-158780(Pfizer)；AG-1478(University ofCalifornia)；CGP-59326(Novartis)；PKI-166(Novartis)；EKB-569(Wyeth)；GW-2016(也叫作GW-572016或者lapatinib ditosylate；GSK)；和gefitinib(也叫作ZD1839或者IressaTM；Astrazeneca)(Woodburn等，1997，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.38：633)。可以依照本发明使用的特别优选的低分子量EGFR激酶抑制剂是[6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺(即埃洛替尼)，其盐酸盐(即盐酸埃洛替尼，TarcevaTM)，或者其它盐形式(例如甲磺酸埃洛替尼)。
基于抗体的EGFR激酶抑制剂包括任何能够部分或者全部阻断EGFR被其天然配体活化的抗EGFR抗体或者抗体片段。基于抗体的EGFR激酶抑制剂的非限制性实例包括在Modjtahedi，H.，等，1993，Br.J.Cancer 67：247-253；Teramoto，T.，等，1996，Cancer 77：639-645；Goldstein等，1995，Clin.Cancer Res.1：1311-1318；Huang，S.M.，等，1999，Cancer Res.15：59(8)：1935-40；和Yang，X.，等，1999，Cancer Res.59：1236-1243.中描述的那些。因此EGFR激酶抑制剂可以是单克隆抗体Mab E7.6.3(Yang，X.D.等(1999)Cancer Res.59：1236-43)，或者Mab C225(ATCC登记号HB-8508)，或者其具有结合特异性的抗体或者抗体片段。合适的单克隆抗体EGFR激酶抑制剂包括但不限于，IMC-C225(也叫作cetuximab或者ErbituxTM；Imclone Systems)，ABX-EGF(Abgenix)，EMD 72000(Merck KgaA，Darmstadt)，RH3(York Medical Bioscience Inc.)，和MDX-447(Medarex/Merck KgaA)。
额外的基于抗体的EGFR激酶抑制剂可以通过将适当抗原或者表位给予宿主动物而根据已知的方法而产生，所述的宿主动物选自例如猪，牛，马，兔，山羊，绵羊，和小鼠及其他。各种本领域已知的佐剂可以被用于提高抗体生产。
尽管实践本发明的有用抗体可以是多克隆的，优选单克隆抗体。针对EGFR的单克隆抗体可以使用任何技术制备和分离，所述的技术通过连续细胞系培养提供抗体分子制备。用于制备和分离的技术包括但不限于最初由Kohler和Milstein(Nature，1975，256：495-497)描述的杂交瘤技术；人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983，Immunology Today 4：72；Cote等，1983，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 80：2026-2030)；和EBV杂交瘤技术(Cole et al，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
或者，描述单链抗体生产的技术(见例如美国专利号4,946,778)可以被修改来生产抗EGFR单链抗体。在实践本发明中有用的基于抗体的EGFR激酶抑制剂还包括抗EGFR抗体片段，包括但不限于F(ab′)2片段，其是由胃蛋白酶消化完整的抗体分子产生的，和Fab片段，其是通过还原F(ab′)2片段的二硫桥而产生的。或者可以构建Fab和/或scFv表达文库(见例如，Huse等，1989，Science 246：1275-1281)以容许快速鉴定对EGFR具有所需特异性的片段。
用于制备和分离单克隆抗体和抗体片段的技术在本领域为人熟知，并且描述在Harlow和Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，和在J.W.Goding，1986，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，London.中。人源化抗EGFR抗体和抗体片段也可以通过已知的技术制备，所述技术如那些描述在Vaughn，T.J.等，1998，Nature Biotech.16：535-539及其引用的文献中的那些，并且这些抗体或其片段在本发明实践中同样有用。
本发明使用的EGFR激酶抑制剂可备选地基于反义寡核苷酸构建体。包括反义RNA分子和反义DNA分子的反义寡核苷酸可以通过结合其上来直接阻断EGFR mRNA的翻译，并从而防止蛋白翻译或者增加mRNA降解，因而减少了EGFR激酶蛋白质水平，和因此减少其在细胞内的活性。例如可以通过如传统的磷酸二酯键技术合成至少约15个碱基的反义寡核苷酸，其互补于编码EGFR的mRNA转录序列的独特区域，通过例如静脉内注射或者输液给药。使用反义技术用来特异抑制其序列已知的基因的基因表达的技术为本领域熟知。(例如见美国专利号6,566,135；6,566,131；6,365,354；6,410,323；6,107,091；6,046,321；和5,981,732)。
小抑制性RNAs(siRNAs)也可以作为EGFR激酶抑制剂用于本发明。EGFR基因表达可以通过用小双链RNA(dsRNA)、或者引起小双链RNA产生的载体或构建体来接触肿瘤、受试者或者细胞而降低，从而EGFR的表达被特别地抑制(即RNA干扰或者RNAi)。对于序列已知的基因，选择合适dsRNA或者dsRNA-编码载体的方法在本领域为人熟知。(例如见Tuschi，T.，等(1999)Genes Dev.13(24)：3191-3197；Elbashir，S.M.等(2001)Nature 411：494-498；Hannon，G.J.(2002)Nature 418：244-251；McManus，M.T.and Sharp，P.A.(2002)Nature Reviews Genetics 3：737-747；Bremmelkamp，T.R.等(2002)Science 296：550-553；美国专利号6,573,099和6,506,559；和国际专利公开号WO 01/36646，WO 99/32619，和WO01/68836)。
核酶也可以作为EGFR激酶抑制剂用于本发明。核酶是能够催化RNA特异切割的酶RNA分子。核酶作用的机理涉及核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，而后被核酸内解切割。特异并有效地催化EGFRmRNA序列的核酸内解切割的工程化的锤头基序核酶分子因此在本发明的范围内有用。任何可能RNA靶中的特殊核酶切割位点通过扫描靶分子找寻核酶切割位点而被最初鉴定，其通常包括下列序列：GUA，GUU，和GUC。一旦鉴定出来后，可以评价相应于含有切割位点的靶基因区域的大约15-20个核糖核苷酸的短RNA序列的预测结构特征，例如二级结构，这可以导致寡核苷酸序列不合适。也可以通过测试其与互补寡核苷酸的杂交可接近性来评价候选靶的合适性，例如使用核酶保护测试。
可以通过已知的方法来制备用作EGFR激酶抑制剂的反义寡核苷酸和核酶。这些包括用于化学合成的技术例如诸如固相phosphoramatide化学合成。或者，可以通过体外或者体内转录编码RNA分子的DNA序列来产生反义RNA分子。这样的DNA序列可以被整合到各种各样的载体内，所述载体整合合适RNA聚合酶启动子如T7或者SP6聚合酶启动子。作为一种增加细胞内稳定性和半衰期的手段，可以引入对本发明寡核苷酸的多种修饰。可能的修饰包括但不限于将核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸的侧翼序列加到所述分子的5’和/或3’末端，或者在寡核苷酸骨架中使用硫代磷酸酯(phosphorothioate)或者2′-O-甲基而不是磷酸二酯酶键。
本发明还包含药物组合物，其含有结合有药用载体的EGFR激酶抑制剂和吉西他滨组合。
优选的所述组合物含有药用载体和非毒性的治疗有效量的EGFR激酶抑制剂化合物和吉西他滨组合(包括其每种组分的药用盐)。
此外，在该优选的实施方案中，本发明包括用于治疗疾病的药物组合物，该组合物的使用产生对瘤细胞生长、良性或者恶性肿瘤，或者转移的抑制，其包含药用载体和非毒性的治疗有效量的EGFR激酶抑制剂化合物和吉西他滨组合(包括其每种组分的药用盐)。
术语“药用盐”指的是从药用非毒性的碱或者酸制备出的盐。当本发明的化合物是酸性的时候，其相应的盐可以从药用非毒性碱中方便地制备，包括无机碱和有机碱。从这样的无机碱衍生的盐包括铝、铵、钙、铜(铜和亚铜)、铁、亚铁、锂、镁、锰(锰和亚锰)，钾、钠、锌等盐。特别优选的是铵、钙、镁、钾和钠盐。衍生自药用有机非毒性碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，以及环胺和取代的胺如天然存在的和合成取代的胺的盐。其它可以形成盐的药用有机非毒性碱包括离子交换树例如诸如精氨酸，甜菜碱，咖啡碱，胆碱，N′，N′-二苄乙二胺，二乙胺，2-二乙氨基乙醇，2-二甲氨基乙醇，乙醇胺，二乙胺，N-乙基吗啉，N-乙基哌啶，葡糖胺，氨基葡糖，组氨酸，哈胺(hydrabamine)，异丙胺，赖氨酸，甲基葡糖胺，吗啉，哌嗪，哌啶，聚胺树脂，普鲁卡因，嘌呤，可可碱，triethylameine，三甲胺，三丙胺，氨基丁三醇(tromethamine)等等。
当本发明的化合物是碱性时，其相应的盐可以很方便地从药用非毒性酸来制备，所述酸包括无机和有机酸。这样的酸包括例如乙酸，苯磺酸，安息香酸，樟脑磺酸，柠檬酸，乙磺酸，富马酸，，葡糖酸，谷氨酸，氢溴酸，氢氯酸，羟乙磺酸，乳酸，马来酸，苹果酸，扁桃酸，甲磺酸，粘酸，硝酸，pamoic，泛酸，磷酸，琥珀酸，硫酸，酒石酸，p-甲苯磺酸等等。特别优选的是柠檬酸，氢溴酸，氢氯酸，马来酸，磷酸，硫酸和酒石酸。
本发明的药物组合物含有作为活性成分的EGFR激酶抑制剂化合物和吉西他滨组合(包括其每种组分的药用盐)，药用载体，和任选的其它治疗组分或者助剂。其它的治疗剂可以包括如上列出的那些细胞毒性的、化疗的或者抗癌剂，或者提高这些药剂的效果的试剂。所述的组合物包括适用于口服、直肠、局部和肠胃外给药(包括皮下、肌肉内和静脉内)的组合物，尽管任何给定情况中最合适的途径将取决于特定的宿主，以及活性成分将被给药针对的疾病的性质和严重程度。所述的药物组合物可以以单位剂型方便地给出，并且以制药领域所熟知的任何方法制备。
在实践中，依照常规药物组合技术，可以将本发明的由EGFR激酶抑制剂化合物和吉西他滨组合(包括其每种组分的药用盐)代表的化合物作为活性组分与药物载体紧密掺合。该载体可以采取广泛种类的形式，这取决于需要给药的制剂的类型，例如经口或者肠胃外(包括静脉内)。因此，本发明的药物组合物可以呈现为适于口服的离散单位如胶囊，扁囊剂或者片剂，每种都含有预定量的活性成分。此外，所述的组合物可以呈现为粉末、颗粒、溶液、水性液体中的悬液、非水性液体，水包油乳剂，或者油包水液体乳剂。除了上面举出的常规剂型外，EGFR激酶抑制剂化合物和吉西他滨组合(包括其每种组分的药用盐)还可以通过缓释方式和/或者递送装置给药。可以通过任何一种药学方法制备组合组合物。通常，这样的方法包括将活性成分与组成一种或者多种必需组分的载体相关联的步骤。通常，通过均匀化和紧密掺合活性组分与液体载体或细碎的固体载体或两者来制备所述的组合物。随后可以将产品方便地定型成所需的形式。
因此，本发明的药物组合物可以含有药用载体和EGFR激酶抑制剂化合物和吉西他滨组合(包括其每种组分的药用盐)。EGFR激酶抑制剂化合物和吉西他滨组合(包括其每种组分的药用盐)也可以与一种或者多种其它治疗活性化合物被包含在药物组合物中。其它的治疗活性化合物可以包括如上面列出的那些细胞毒性的、化疗的或者抗癌剂，或者增强这些药剂效果的制剂。
因此本发明的一个实施方案中，药物组合物可以含有组合以抗癌剂的EGFR激酶抑制剂化合物和吉西他滨，其中所述的抗癌剂是一种选自由下列各项组成的组的成员：烷基化剂，抗代谢物，微管抑制剂，鬼臼毒素，抗生素，亚硝基脲，激素治疗，激酶抑制剂，肿瘤细胞凋亡活化剂，和抗血管生成剂。
使用的药物载体可以是例如固体、液体、或者气体。固体的实例包括乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、和硬脂酸。液体载体的实例是糖浆、花生油、橄榄油和水。气体载体的实例包括二氧化碳和氮气。
在制备用于口服剂型的组合物中，可以使用任何方便的药物介质。例如水，二元醇，油，醇类，增香剂，防腐剂，着色剂等等可以被用于形成口服液体制剂例如悬液，酏剂和溶液，而载体例如淀粉，糖，微晶纤维素，稀释剂，粒化剂，润滑剂，粘合剂，崩解剂等可以被用于形成口服固体制剂例如粉末、胶囊和片剂。因为其容易给药，片剂和胶囊是优选的口服剂型，从而使用固体药物载体。任选地，片剂可以用标准的水性或者非水性技术包衣。
含有本发明组合物的片剂可以任选地与一种或者多种附属组分或者助剂通过压制或者成型来制备。压缩片剂可以通过用合适的机器通过压缩制备，其活性组分为自由流动形式如粉末或颗粒，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性成分或者分散剂混和。成型片剂可以通过在合适的机器中成型，粉化化合物的混合物用惰性液体稀释剂湿润。每种片剂优选含有大约0.05mg到大约5g的活性组分，并且每个扁囊剂或者胶囊优选含有大约0.05mg到大约5g的活性组分。
例如，用于口服给药于人的制剂可以含有大约0.5mg到5g的活性剂，与合适的和便捷量的、可能从大约5％-大约95％全部组合物变化的载体物质混合。单位剂型通常含有从大约1mg到大约2g的活性组分，通常为25mg，50mg，100mg，200mg，300mg，400mg，500mg，600mg，800mg，或者1000mg。
本发明适用于肠胃外给药的药物组合物可以被制备为在水中的活性化合物的溶液或者悬液。可以包括合适的表面活性剂例如诸如羟丙基纤维素。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其在油中的混和物中来制备。另外，防腐剂可以被加入其中以防止微生物的有害生长。
本发明的适合注射用的药物组合物包括无菌的水性溶液或者分散体。此外，所述的组合物可以以无菌粉末的形式用于临时制备这样的无菌可注射溶液或者分散体。在所有情况下，最终的可注射形式必须是无菌的并且必须是有效的流体以方便注射。所述的药物组合物必须在制备和储存条件下是稳定的；因此，其优选应该以防止微生物如细菌和真菌的污染作用的方式保存。所述的载体可以是溶剂或者分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇)，植物油及其适当的混合物。
本发明的药物组合物可以以适用于局部使用的方式存在，例如诸如气溶胶，乳膏剂，油膏，洗剂，撒粉，等。此外，所述的组合物可以是适用于经皮装置的形式。这些制剂可以利用本发明的EGFR激酶抑制剂化合物和吉西他滨组合(包括其每种组分的药用盐)，经由传统方法制备。作为实例，通过混和亲水物质和水，以及大约5重量％到大约10重量％的所述化合物来制备乳膏剂或者油膏，以制备具有所需稠度的乳膏剂或者油膏。
本发明的药物组合物可以是适于直肠给药的形式，其中的载体是固体。优选混和物形成单位剂量栓剂。合适的载体包括可可脂和其它本领域常用的物质。所述的栓剂可以通过首先将所述组合物与软化的或者融化的载体混和并在模具中冷却和成型来方便地形成。
除了上述的载体组分外，上面描述的药物制剂，如果合适，可以包含一种或者多种另外的载体组分例如稀释剂、缓冲剂，增香剂，粘合剂，表面活性剂，增稠剂，润滑剂，防腐剂(包括抗氧化物)等等。另外，可以包括其它的助剂来使得所述制剂与目的受体的血液等渗。含有EGFR激酶抑制剂化合物和吉西他滨组合(包括其每种组分的药用盐)的组合物也可以制备成粉末或者液体浓缩形式。
本发明组合的化合物剂量水平可以近似地如本文所述，也可以如本领域对这些化合物的描述那样。但是应该理解的是，对于任何具体患者的特定剂量水平将取决于许多因素，包括年龄、体重、综合健康、性别、饮食、给药时间、给药路径、排泄率、药物组合以及受治疗的具体疾病的严重性。
经过以下的实验细节将会更好的理解本发明。但是，本领域的技术人员应该清楚的理解：所讨论的具体的方法和结果仅仅是为了阐述本发明，而后附的权利要求会更完全地概括本发明，这些实验细节不能被认为以任何方式限制了本发明。
实验细节
介绍
癌细胞特异性的表皮生长因子受体(HER1/EGFR)是在癌症治疗中有价值的分子靶目标(Ciardiello，F and Tortora G.(2002)Expert Opin.Investig.Drugs 11：755-768)。很多癌症过表达HER1/EGFR：头和颈鳞状细胞癌(70-100％)，非小细胞肺癌(NSCLC)(50-90％)，前列腺癌(40-70％)，神经胶质瘤(10-50％)，胃癌(30-60％)，乳腺癌(35-70％)，结肠直肠癌(45-80％)，胰腺癌(30-50％)和卵巢癌(35-60％)(Ciardiello，F and Tortora G.(2002)Expert Opin.Investig.Drugs11：755-768)；Salomon D.S.，et al.(1995)Crit.Rev.Oncol.Hematol.19：183-232)。Salomon等还强调过表达HER1/EGFR与具有晚期疾病、转移和较差预后的患者之间的关系。
NSCLC是最常见的肺癌。依照疾病的程度，治疗方案是不同的。对于疾病早期，外科手术是唯一的治愈方式，以化学/放射疗法处理的多峰方案可产生改善的效果。在疾病晚期，化学疗法是主要的选择，其在整体存活方面提供较小的改善。因此，在NSCLC的情形中，在医学方面高度需要寻找更有效并更耐受的方案。已经使用许多传统的细胞毒性剂在NSCLC中用作单一疗法，包括长春地辛，卡铂，依托泊苷，异环磷酰胺，环磷酰胺，长春新碱和丝裂霉素和吉西他滨(Rajkumar S.V.，and Adjei AA.(1998)Cancer Treat Rev.24：35-53)。用这些药物的单一疗法仅产生了很小的改善，但用吉西他滨的组合疗法在随机实验中减轻了患者的疾病，并且改善了他们的生命质量(Bunn P.A.Jr，and Kelly K.(1998)Clin Cancer Res.4(5)：1087-1100)。
吉西他滨于1990年被开发，其抑制核糖核酸酶还原酶。吉西他滨单一疗法具有比标准的吉西他滨/依托泊苷化学疗法更大的肿瘤应答可能性，并且改善了患者的生命质量(在减少的头发损失、恶心和呕吐，和食欲减少方面)(ten Bokkel W.W.，等(1999)Lung Cancer 26(2)：85-94)。
研究和治疗癌症的欧洲组织(EORTC)进行了组合试验以比较吉西他滨和替尼泊苷与吉西他滨和紫杉醇的疗效(Giaccone G，et al.，(1998)JClin.Oncol.16：2133-2141)。由于后种组合对晚期NSCLC提供更好的减轻作用(即使未出现明确的存活益处)，对于晚期NSCLC患者，其已被推荐作为一种标准的治疗方案。另外，吉西他滨和吉西他滨的组合已经显示在体外协同作用，并且至少在体内是累加的(Peters G.J.et al.(1995)Semin.Oncol.22(4Suppl.11)：72-79)。在II期试验阶段，对吉西他滨和吉西他滨的应答率是47％，平均存活57周，1年的存活率是48％(Bunn P.A.Jr and Kelly K.(1998)Clin Cancer Res.4(5)：1087-1100)。
对于癌症的新治疗方案采取癌细胞特异性方案，其保证比较老的细胞毒性药物更少的毒性。由于癌细胞特异性靶目标仅仅是疾病病原的一部分，结合靶药物和常规药物的治疗可能具有协同效应。最佳的NSCLC治疗可能是包括结合传统化学疗法的EGFR抑制剂。
埃洛替尼(TarcevaTM，OSI-774)是一种选择性的、可口服利用的HER1/EGFR酪氨酸激酶结构域的小分子抑制剂。其在头和颈以及外阴癌症的临床前动物模型中具有有效的抗肿瘤活性(Pollack V.A.，et al.，(1999)J.Pharmacol.Exp.Ther.291：739-48)。埃洛替尼诱导体外细胞凋亡，并且在体内有效对抗各种表达EGFR的人肿瘤异种移植物(Moyer J.D.etal.(1997)Cancer Res.57：4838-4848)。在公开的标记(open-label)中，对基于铂的化学疗法失败的NSCLC患者的II期研究中(Perez-Soler R.et al.(2001)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.20：310a(Abstract 1235)，埃洛替尼具有鼓舞人心的活性。
在该研究中，我们研究了是否埃洛替尼组合顺铂或吉西他滨在具有NSCLC异种移植物模型的无胸腺裸鼠中对于抑制肿瘤生长以协同或对抗的方式起作用。选自H460a和A549NSCLC肿瘤模型，原因在于它们明确地表达EGFR，每个细胞具有约70000-80000个结合位点(Bianco，C.etal.(2002)Clin.Cancer Res.8(10)：3250-3258；Lee，M.et al.(1992)J Natl.Cancer Inst.Monogr.(13)：117-123)。A549缓慢生长，H460a更具有侵袭性并且更快生长。
材料和方法
动物
雌性、无胸腺，nu/nu-nuBR裸鼠(Charles River Lab，Wilmington，USA)，年龄约为10-12周，使用时重量为23-25克。每天通过观察和分析取自置于共用隔板架上的标记动物(sentinel animal)的血液样品来确定小鼠的健康情况。容许所有动物一周的时间从运输相关的紧张中适应和缓解。
随意提供高压灭菌水和辐射处理的食物(5058-ms Pico Lab(小鼠)breed chow，Purina，Mills，Richmond，IN)，而且将动物保持在12小时的白天夜间循环中。笼子、草垫和水瓶使用前高压灭菌并每周更换。所有动物实验依照Roche Animal Care and Use Committee认可的方案实施。细胞培养和动物研究
将H460a细胞(由Dr Jack Roth，MD，Anderson提供)培养在补充以10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s Modified Eagle Media(DMEM)。将A549细胞(American Type Culture Collection[Manassas，VA]培养在Rosewll ParkMemorial Institue medium(RPMI)1640+10％FBS中。对于移植物而言细胞的浓度是1×107细胞/0.2ml的H460a和7.5×106细胞/0.2ml的A549。
将细胞悬浮在磷酸盐缓冲液中，并皮下移植到每只小鼠的右侧。一旦建立可触知的肿瘤，将动物随机化以使得所有的组具有100-150mm3的相似的起始平均肿瘤体积。每周三次测量肿瘤和小鼠重量。在整个实验中单个监测动物。
测试制剂和药物治疗
将埃洛替尼(OSI Pharmaceuticals，Uniondale，NY)与羧甲基纤维素钠和吐温80在水中配制成微悬浮液用于注射。用1ml注射器和18规格管饲针经口给药埃洛替尼(0.2ml/动物)。每日处理所有的组，持续3周。
依照标签说明，用无菌盐水溶液将冻干的吉西他滨(GemzarTM，LillyResearch Center Ltd)配制在预先包装的小瓶中，得到含38mg/ml活性化合物的溶液。对于每一剂量组，取小瓶储液的等份试样，其由整个研究所需的药物组成，并用无菌盐水进一步稀释，得到对于每只动物而言0.5ml给药体积的溶液。利用3ml注射器和26规格针将吉西他滨腹膜内(i.p.)给予。每3天处理所有组，持续3周(总共6次注射)。
计算和统计分析
使用下面的公式，将重量减轻计算为平均组体重的百分变化：
           ((W-W0)/W0)×100
其中‘W’代表在特定一天被治疗组的平均体重。‘W0’代表在治疗初始时相同组的平均体重。最大重量减轻也可以使用上面的公式计算，并且表明对于特定的组在整个实验过程中的任何时间的最大百分比体重减轻。通过肿瘤生长抑制来评估治疗效力。使用下面的公式，将治疗组的肿瘤体积表示为对照组肿瘤体积的百分比(％T/C)：
           100×((T-T0)/(C-C0))
其中’T’代表在实验期间的特定一天被治疗组的平均肿瘤体积。‘T0’代表在治疗第一天时相同组的平均肿瘤体积，C代表实验的特定一天的对照组的肿瘤体积，C0表述在治疗第一天时相同组的平均肿瘤体积。
使用下述公式计算肿瘤生长抑制：
           100-％T/C
使用椭球公式(ellipsoid formula)计算肿瘤体积(mm3)：
           (D×(d2))/2
其中‘D’代表肿瘤的大直径，‘d’代表小直径。在一些情况下，使用下面的公式计算肿瘤消退和/或肿瘤体积的百分变化：
          ((T-T0)/T0)×100
其中‘T’代表在特定一天被治疗组的平均肿瘤体积，‘T0’代表在治疗初始时相同被治疗组的平均肿瘤体积。
通过秩和检验和单向变量分析(ANOVA)和post-hoc Bonferroni t-检验(SigmaStat，version 2.03，Jandel Scientific，San Francisco，CA)来进行统计学分析。当p≤0.05时为显著水平。
药代动力学分析
对于单一剂量药代动力学(PK)，通过心脏穿刺在给药后5，15，30，60分钟和2，4，8，16，24小时的每个时间点收集三只小鼠的血液样品。对于长期治疗的动物，通过后眼窝窦在1和6小时的每个时间点收集2或3只小鼠的血液样品。收集管含有乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂。将样品保存在-70℃。利用液相色谱和串联质谱分析(LC-MS/MS)方法以1ng/mL的定量界线确定埃洛替尼的血浆浓度。利用PK评估程序WinNonlin PRO，3.1版本(Pharsight Inc)通过非区室分析评估PK参数。在一个研究中，利用选择性LC-MS/MS方法，以1ng/g组织的定量界线确定埃洛替尼肿瘤(H460a)浓度。
病理学/尸检
在研究的结尾，从所有的剩余组中对5只小鼠/治疗进行完全尸检。同样从这些小鼠中收集全血用于血液学和临床化学。
通过浸渍在10％锌福尔马林中固定肿瘤样品，并随后在Tissue-TekVIP(Sakura)中处理，并包埋入石蜡。将用于免疫组织化学的切片切割成5μ。将免疫前的兔或山羊血清(Dako Ltd)用作阴性对照。将切片浸渍在Target Retrieval溶液(Dako Ltd)中并在蒸笼(Black &Decker)中加热至94℃，持续20分钟。用6％H2O2的甲醇溶液对内源性过氧化酶活性进行淬灭15分钟。
为了阻断非特异的组织结合位点，用来自产生第二抗体的物种的10％正常血清封闭切片。将切片在室温于在Ultra-V(Lab Vision)中制备的血清中温育20分钟。
对于血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1，CD31)抗原和EGFR抗原，将切片于室温与在抗体稀释剂(Dako Ltd)中稀释1∶800的多克隆山羊抗PECAM-1 IgG(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)或与在抗体稀释剂(Dako Ltd)中稀释1∶50的多克隆兔抗EGFR IgG(BioGenex，San Ramon，CA)过夜温育。将切片与Vectastain Elite ABC-过氧化物酶(Vector Laboratories)于室温温育45分钟。
对于Ki-67抗原，将切片与在抗体稀释剂(Dako Ltd)中稀释1∶2000的多克隆抗Ki-67 IgG(NeoMarkers，Fremont，CA)于室温温育1小时，接着加入辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白(strepavidin)复合物30分钟。
为了检测细胞凋亡，依照制造厂商的推荐使用TUNEL TdT-FragELTMDNA片段化检测试剂盒(Oncogene Research Products，San Diego，CA)。对于所有四种抗原，载体Nova Red(Vector Laboratories)是最终的色原和苏木精进行核复染。
结果和讨论
结果
在NSCLC异种移植物中EGFR免疫组织化学染色
通过免疫组织化学检测H460a和A549肿瘤中EGFR表达图谱。两种细胞系具有相似的EGFR膜染色图谱(数据未显示)。这证实过去显示EGFR在这两种肿瘤系中的同等表达的结果(Bianco，C.et al.(2002)Clin.Cancer Res.8(10)：3250-3258；Lee，M.et al.(1992)J Natl.Cancer Inst.Monogr.(13)：117-123)。
在无胸腺的裸鼠中埃洛替尼的单一和长期给药PK评估
在无肿瘤的小鼠中
通过管饲法对雌性、nu/nu无胸腺小鼠给予20和100mg/kg埃洛替尼。该剂量指具有91.5％活性药物(游离碱)含量的盐酸盐。制剂是分别含2.5mg/ml和12.5mg/ml埃洛替尼的羧甲基纤维素钠混悬液。在每个时间点对三只动物评估PK数据(参见图4)。
给予100mg/kg的小鼠被高度地全身性暴露于埃洛替尼，AUClast值约为196000h*ng/ml。给予20mg/kg的AUClast值约为33500h*ng/ml。暴露(AUC)是与剂量成比例的。在给予100mg/kg后的平均最大血浆浓度约为24000ng/ml，给予20mg/kg后为9100ng/ml。给药后最大血浆浓度为0.5-1.0小时。平均表观末端半衰期(apparent terminal half-life)是约4小时，平均残留时间是约7小时。
在具有肿瘤的小鼠中
将6.3、12.5、25.0、100.0和150.0mg/kg埃洛替尼口服给予nu/nu无胸腺小鼠后，在给药后1小时和6小时后血浆浓度分别高达16700ng/ml和8870ng/ml(图1a)。在相同时间点取样作为血浆样品，在口服给予150mg/kg后各自的平均肿瘤浓度是4800和3090ng/g组织。
血浆浓度的个体间变化是适度的，相对标准偏差(RSD)是约35-40％(范围：5.2-120％)。所述暴露是剂量依赖性的，并且升高剂量导致超过剂量-成比例的。在本研究中肿瘤浓度也与血浆浓度充分相关(图1b)。
在无胸腺的裸鼠中确定最大耐受剂量(MTD)
埃洛替尼MTD
埃洛替尼的MTD是100mg/kg(图6)。显示毒性迹象的小鼠全部具有相似的损伤。在皮肤和胃肠道中发现严重的毒性。在400mg/kg组中的一只小鼠死亡。在该组中的其余动物由于发病而被安乐死。给予200mg/kg的小鼠表现显著的体重减轻，并且全部被安乐死。然而，我们先前的功效研究已经显示在该制剂中150mg/kg的埃洛替尼也被充分耐受3周(作者，未公开的报告)。
吉西他滨MTD
在给予吉西他滨的裸鼠的2周MTD研究中，在任何治疗组中没有明显毒性的迹象(重量减轻或严重的临床迹象)。吉西他滨的主要毒性是髓抑制(myelosuppression)(Hoang，T.et al.(2003)Lung Cancer 42(1)：97-102；Philip PA.(2002)Cancer 95(4 Suppl)：908-911；Tripathy，D.(2002)ClinBreast Cancer 3(Suppl1)：8-11)。由于未取用于全血细胞计数的最后血液样品，因此不了解是否在任何给药组中存在髓抑制。
基于这些发现和在文献中发现的数据(Rajkumar S.V.，and Adjei AA.(1998)Cancer Treat Rev.24：35-53；Bunn P. A.Jr，and Kelly K.(1998)ClinCancer Res.4(5)：1087-1100；ten Bokkel W. W.，et al.(1999)Lung Cancer26(2)：85-94)，我们决定在之后的功效研究中将120mg/kg/3天的剂量用作最大剂量。我们谨慎使用更高剂量，原因在于对于具有肿瘤的动物显示了不同的灵敏度，并且耐受水平甚至可以是肿瘤-种系特异性的(Merriman，R.L.et al.(1996)Invest.New Drugs 14(3)：243-247)。
埃洛替尼对建立的NSCLC异种移植物的影响
在H460a中进行剂量应答研究
在H460a NSCLC异种移植物的研究结尾(肿瘤移植后28天)，埃洛替尼，作为单一疗法，具有显著的剂量依赖性效力。在100mg/kg组，存在61％的生长抑制(p≤0.001，相对于赋形剂对照)。
其它组具有下述的生长抑制：25mg/kg：46％(p≤0.001，相对于赋形剂对照)；12.5mg/kg：36％(p＝0.003，相对于赋形剂对照)；6.25mg/kg：28％(p＝0.014，相对于赋形剂对照)(图2)。不存在部分或全部的消退。
在H460a中埃洛替尼和吉西他滨的组合活性
在第28天终点时，100mg/kg埃洛替尼显著抑制71％肿瘤生长(p＝0.002)(图3)。25mg/kg埃洛替尼具有30％的不理想的功效。
在120mg/kg/3天的MTD和四分之一MTD，30mg/kg/3天检测吉西他滨单一疗法。120mg/kg/3天吉西他滨显著抑制肿瘤生长(93％，p≤0.001)。在四分之一MTD时，肿瘤生长抑制是64％(p≤0.001)。
120mg/kg/3天吉西他滨和口服100mg/kg埃洛替尼的组合疗法是致命的，在肿瘤移植后第5天出现毒性迹象。所有的小鼠在肿瘤移植后的25天死亡(肿瘤的第15天)。
30mg/kg/3天吉西他滨和25mg/kg埃洛替尼的组合疗法抑制86％肿瘤生长(p≤0.001，相对于赋形剂对照)。不存在部分或全部的消退。该抑制不是加成性的，原因在于其并未显著好于以25％MTD给予的单一吉西他滨或埃洛替尼。该组合也未显著好于100mg/kg埃洛替尼或120mg/kg吉西他滨。
在A549中埃洛替尼和吉西他滨的组合活性
在该研究的结尾(肿瘤移植后47天，处理的第19天)，100mg/kg埃洛替尼显著抑制87％肿瘤生长(p≤0.001)(图5)。存在两个部分消退(16％和7％)。在先前的研究中，25mg/kg埃洛替尼具有48％肿瘤生长抑制的不理想的功效(p＝0.004)。
120mg/kg吉西他滨显著抑制75％肿瘤生长(p≤0.001)，具有一个部分消退(5％)。30mg/kg吉西他滨抑制42％肿瘤生长(p＝0.001)。由于在先前研究中的毒性，不以高剂量组合吉西他滨和埃洛替尼。组合30mg/kg吉西他滨和25mg/kg埃洛替尼被所有小鼠充分耐受，没有显著的体重减轻或毒性的整体迹象。该组合显著抑制103％肿瘤生长(p≤0.001，相对于赋形剂对照)，具有6个部分消退(范围：5％-67％)。这种肿瘤生长抑制是加成的，原因在于其显著好于以四分之一MTD给予的吉西他滨或埃洛替尼(p≤0.05)。该组合未显著好于100mg/kg埃洛替尼和120mg/kg吉西他滨。
对正常和肿瘤组织的治疗相关影响
在给予单一疗法的动物中验尸
在给予埃洛替尼单一疗法的动物中，在血液学参数或临床化学参数中未发生变化(数据未显示)。在皮肤中存在治疗相关的肉眼可见的变化。小鼠具有口鼻皮肤相当大的变红和结痂症状(图7)，这是由于在皮肤中高水平表达EGFR。这些损伤是暂时的，并且随着持续的治疗而消散。治疗相关的抗肿瘤作用包括在两种NSCLC异种移植物肿瘤模型中100mg/kg埃洛替尼情形中Ki-67增殖指数适度减少(图8)。在被治疗的异种移植物中肿瘤细胞的细胞凋亡频率无显著差别，如通过对内皮细胞标记CD31进行免疫组织化学染色的微血管密度(MVD)所测量的那样发现对血管发生无显著影响。
在给予埃洛替尼/吉西他滨组合的动物中验尸
对于给予四分之一MTD的埃洛替尼和吉西他滨的小鼠，在组织学评估的主要器官系统中无显著发现。对血液学和血清化学参数的治疗相关影响是最小的。在本研究的条件下几乎没有治疗相关毒性的证据。因此，尽管25mg/kg埃洛替尼加上30mg/kg吉西他滨的组合具有确定的抗瘤作用，但其看来似乎未增加毒性。在组合的组别中对增殖的影响(通过Ki68染色评估)类似于在埃洛替尼单一疗法-治疗的小鼠中的那些影响(图8b)。
讨论
这些结果显示埃洛替尼，一种有效的、可口服利用和HER1/EGFR的选择性小分子抑制剂，作为单一疗法和与常规的化学疗法结合使用，在表达HER1/EGFR的近似成员的人NSCLC异种移植物模型中具有强效的抗肿瘤活性。
在异种移植物模型H460a中，其具有杰出的剂量—应答关系，并且肿瘤浓度与血浆浓度充分相关。
两种人NSCLC细胞系，当在无胸腺小鼠中作为皮下肿瘤生长时，具有不同的肿瘤生长动力学，对H460a有5天的倍增时间，对A549有10的倍增时间。埃洛替尼单一疗法在100mg/kg时显著抑制H460a异种移植物模型中的肿瘤生长。
在缓慢生长A549肿瘤中，以25％MTD给予，吉西他滨/埃洛替尼组合具有显著的肿瘤生长抑制和部分缓和(＞100％)。用埃洛替尼组合吉西他滨进行的肿瘤生长抑制与用埃洛替尼单一疗法相比显著增加(p≤0.05)。在更快生长的H460a肿瘤中，使用四分之一MTD的任一种化合物，用吉西他滨/埃洛替尼组合产生了相当大的肿瘤生长抑制(86％)。然而，用该组合的肿瘤生长抑制未显著不同于用单一疗法。A549缓慢生长，因此，设想更依赖于血管发生。认为埃洛替尼是间接的抗血管发生剂(Kerbel，R，and Folkman，J.(2002)Nat.Rev.Cancer 2(10)：727-39)，因此不惊讶其对A549具有更好的功效。埃洛替尼抑制腺苷三磷酸(ATP)结合HER1/EGFR的胞内细胞酪氨酸激酶结构域，阻断受体磷酸化和相关的下游信号传输(Moyer J.D.et al.(1997)Cancer Res.57：4838-4848)。结果是抑制与肿瘤生长和进展相关的细胞过程，如增殖，血管生成，转移和免于凋亡(Moyer J.D.et al.(1997)Cancer Res.57：4838-4848)。不幸地，在用埃洛替尼治疗的肿瘤中未通过MVD检测到抗血管发生作用，可能是由于检测不够灵敏。
在NSCLC模型中，吉西他滨(30mg/kg)与埃洛替尼(25mg/kg)，以四分之一MTD给予，被充分耐受，通过维持具有最小副作用风险的功效，导致不具有或具有不显著的体重减轻，提示对于患者而言可能显著的生命益处的品质。相反，在各自最大耐受剂量时，高剂量组合埃洛替尼和常规药剂未被耐受。这可能是与在临床前不能使用维持疗法的事实相关。
埃洛替尼组合吉西他滨和顺铂，或者组合卡铂和紫杉醇在具有NSCLC的人中的III期实验是令人失望的，原因在于未证实结论性的存活益处。然而，此处报道的临床前研究已明确显示埃洛替尼组合化学疗法对抑制肿瘤生长具有加成性作用。这些发现支持需要进一步检验埃洛替尼在各种临床环境如其与其它化疗剂的顺序使用，和在选择的患者种群中的影响。另外，HER1/EGFR在多数癌症中过表达，包括头颈癌，前列腺癌，神经胶质瘤，胃癌，乳腺癌，宫颈癌，胰腺癌和卵巢癌(Ciardiello，F andTortora G.(2002)Expert Opin.Investig.Drugs 11：755-768)；Salomon DS，etal.(1995)Crit.Rev.Oncol.Hematol.19：183-232)。因此，埃洛替尼组合吉西他滨在具有HER1/EGFR表达的实体细胞肿瘤的其它癌症中可以具有功效益处。
总之，在NSCLC中，埃洛替尼作为单一疗法或结合吉西他滨在具有EGFR表达相似水平的异种移植物肿瘤中的抗肿瘤活性是强固的。需要进一步的研究以在癌症治疗中完全评估这种有前途的新方法。
通过参考结合
所有的专利、公开的专利申请和本文公开的其它文献都通过参考特别结合于此。
等价物
本领域的技术人员使用不过是常规的实验就会认识到或者能够确定许多于此处具体描述的本发明的具体实施方案的等价物。下面的权利要求意欲将这些等价物包含其中。
表1.在无肿瘤的雌性nu/nu无胸腺小鼠中20和100mg/kg埃洛替尼的单剂量药代动力学
  20mg/kg   100mg/kg
  Cmax(ng/ml)   9100   24000
  Cmax/剂量([ng/ml]/[mg/kg])   455   240
  Tmax  (h)   0.5-1   0.5-1
  Tlast  (h)   8   24
  AUClast(h*ng/ml)   33500   196000
  AUClast/剂量([h*ng/ml]/[mg/kg])   1680   1960
  CL/F(ml/min/kg)   7.6   8.0
  λz(1/小时)   0.17   0.19
  T1/2(h)   4.1   4.0
  MRT(h)   5.6   8.2
  Vz/F(1/kg)   2.7   2.8
Cmax＝峰值血浆浓度；Tmax＝到峰值血浆浓度的时间；Tlast＝最后的可测量浓度的时间；AUC last＝从零时至最后可测量浓度的时间的血浆浓度-时间曲线下面积；CL/F＝表观清除率(apparent clearance)；λz＝消除速率常数；T1/2＝血浆末端半衰期；MRT＝平均停留时间；Vz/F＝分布的表观体积(apparent volume of distribution)。
表2.对无肿瘤的无胸腺裸鼠(n＝5)治疗14天的最大忍耐剂量评估
  化合物   剂量(mg/kg)   在研究末尾体重的变化(％)   死亡率
  赋形剂对照   0   0   0
  在CMC/吐温中的埃洛替尼   400   N/A   5
  在CMC/吐温中的埃洛替尼   200   N/A   5
  在CMC/吐温中的埃洛替尼   100   -1   0
  在CMC/吐温中的埃洛替尼   50   -1   0
  赋形剂对照   0   -1   0
  吉西他滨   150   -3   0
  吉西他滨   120   -1   0
  吉西他滨   90   -2   0
  吉西他滨   60   4   0
  吉西他滨   30   -3   0
N/A＝不可利用；在研究的结尾动物死亡。

Claims (36)

1.药物组合物，特别用于癌症，其在药用载体中包含EGFR激酶抑制剂和吉西他滨。
2.权利要求1的药物组合物，其中EGFR激酶抑制剂是埃洛替尼。
3.权利要求2的药物组合物，其中埃洛替尼在组合物中以盐酸盐的形式存在。
4.权利要求1-3任一项的药物组合物，其另外包含一种或多种其它抗癌剂。
5.一种制备治疗肿瘤或肿瘤转移的药物的方法，其特征在于使用EGFR激酶抑制剂和吉西他滨。
6.权利要求5的方法，其中所述药物用于癌症。
7.权利要求5或6的方法，其中EGFR激酶抑制剂和吉西他滨被包含在相同制剂中。
8.权利要求5或6的方法，其中EGFR激酶抑制剂和吉西他滨被包含在不同制剂中。
9.权利要求5-8任一项的方法，其中EGFR激酶抑制剂和吉西他滨是通过相同的途径被给药于患者。
10.权利要求5-9任一项的方法，其中EGFR激酶抑制剂和吉西他滨是通过不同的途径被给药于患者。
11.权利要求5-10任一项的方法，其中使用EGFR激酶抑制剂埃洛替尼。
12.权利要求5-11任一项的方法，其中埃洛替尼是通过胃肠外或口服给药的方式被给药于患者。
13.权利要求5-12任一项的方法，其中吉西他滨是通过胃肠外给药的方式被给药于患者。
14.权利要求5-13任一项的方法，其另外包含一种或多种其它抗癌剂。
15.权利要求5-14任一项的方法，其中所述其它抗癌剂选自烷化剂，环磷酰胺，苯丁酸氮芥，顺铂，白消安，美法仑，卡莫昔汀，链脲霉素，曲他胺，丝裂霉素C，抗代谢物，甲氨蝶呤，依托泊苷，6-巯嘌呤，6-thiocguanine，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶，卡培他滨，达卡巴嗪，抗生素类，放线菌素D，多柔比星，柔红霉素，博来霉素，普卡霉素，生物碱，长春碱，紫杉醇，糖皮质激素，地塞米松，皮质甾类，波尼松，核苷酶抑制剂，羟基脲，氨基酸耗竭酶，天冬酰胺酶，甲酰四氢叶酸和叶酸衍生物。
16.一种制备用于治疗患者肿瘤或肿瘤转移的药物组合物的方法，其包含将吉西他滨和EGFR激酶抑制剂结合。
17.依照权利要求16的方法，其中EGFR激酶抑制剂是埃洛替尼。
18.权利要求17的方法，其还包含将药用载体与吉西他滨和埃洛替尼结合。
19.一种试剂盒，其包含容器，所述容器包含吉西他滨和EGFR激酶抑制剂。
20.权利要求19的试剂盒，还包含无菌稀释剂。
21.权利要求19的试剂盒，其中EGFR激酶抑制剂是埃洛替尼。
22.权利要求19-21任一项的试剂盒，其还包含包装说明书，所述包装说明书包含打印的说明书，其指导将吉西他滨和埃洛替尼的联合治疗应用于患者以作为治疗患者的肿瘤、肿瘤转移或其它癌症的方法。
23.依照权利要求1的组合物，其另外包含一种或多种其它抗癌剂。
24.依照权利要求23的组合物，其中所述其它抗癌剂是选自由下述各项组成的组的成员：烷基化药物，抗代谢物，微管抑制剂，鬼臼毒素，抗生素，亚硝基脲，激素治疗，激酶抑制剂，肿瘤细胞凋亡活化剂，和抗血管生成剂。
25.一种治疗癌症的方法，其包含对需要这种治疗的受试者给予(i)第一个有效量的EGFR激酶抑制剂，或其药用盐；和(ii)第二个有效量的吉西他滨。
26.一种治疗癌症的方法，其包含对需要这种治疗的受试者给予(i)第一个低于治疗量的EGFR激酶抑制剂，或其药用盐；和(ii)第二个低于治疗量的吉西他滨。
27.依照权利要求25或26的治疗癌症的方法，其中EGFR激酶抑制剂是埃洛替尼。
28.权利要求5的方法，其中待治疗的肿瘤或肿瘤转移是结肠直肠肿瘤或肿瘤转移。
29.一种药物组合物，特别用于癌症，其包含(i)第一个有效量的EGFR激酶抑制剂，或其药用盐；和(ii)第二个有效量的吉西他滨。
30.一种药物组合物，特别用于癌症，其包含(i)第一个低于治疗量的EGFR激酶抑制剂，或其药用盐；和(ii)第二个低于治疗量的吉西他滨。
31.依照权利要求29或30的药物组合物，其中EGFR激酶抑制剂是埃洛替尼。
32.EGFR激酶抑制剂和吉西他滨，用作药物，特别用于癌症。
33.埃洛替尼和吉西他滨，用作药物，特别用于癌症。
34.EGFR激酶抑制剂和吉西他滨在制备治疗肿瘤或肿瘤转移的药物中的应用。
35.依照权利要求34的应用，其中EGFR激酶抑制剂是埃洛替尼。
36.如此处所描述的新化合物、工艺、药物组合物，方法和用途。
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