ES2836772T3 - Composición liposomal y método para producirla - Google Patents

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Abstract

Una composicion liposomal, que comprende: liposomas, cada uno de los cuales tiene una fase acuosa interna y una solucion acuosa que constituye una fase acuosa externa y en la cual estan dispersados los liposomas, en donde el contenido de colesteroles es del 15 % en moles al 25 % en moles con respecto a la cantidad total de componentes lipidicos en la composicion liposomal, y cada uno de los liposomas encapsula un farmaco en estado disuelto, y la presion osmotica de la fase acuosa interna es de 2 a 8 veces con respecto a la presion osmotica de la fase acuosa externa, en donde los lipidos que constituyen el liposoma incluyen al menos fosfatidilcolina de soja hidrogenada, 1,2- diestearoil-3-fosfatidiletanolamina-polietilenglicol y colesterol, y en donde un tamano promedio de particula de los lisosomas es de 5 nm a 100 nm.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición liposomal y método para producirla
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a una composición liposomal y a un método para producir la misma. La presente invención se refiere a una composición liposomal que se puede usar preferentemente para aplicaciones farmacéuticas y un método para producir la misma.
2. Descripción de la técnica relacionada
Un liposoma (en lo sucesivo, también denominado vesícula lipídica) es una vesícula cerrada formada por una membrana de bicapa lipídica constituida por lípidos, y que tiene una fase acuosa (fase acuosa interna) dentro del espacio de la vesícula cerrada. Los liposomas suelen estar presentes en un estado de dispersión en una solución acuosa (fase acuosa externa) fuera de la vesícula cerrada. Los liposomas se han estudiado para varias aplicaciones, tales como sensores inmunitarios, glóbulos rojos artificiales y vehículos de sistemas de administración de fármacos que aprovechan características tales como la capacidad de barrera, la capacidad de retención de compuestos, la biocompatibilidad, el grado de libertad para establecer el tamaño de partícula, la fácil biodegradabilidad, y las propiedades modificadoras de la superficie. En las aplicaciones de vehículo, los liposomas pueden encapsular compuestos solubles en agua, materiales lipófilos de bajo peso molecular, polímeros y una amplia gama de materiales.
En el caso de que los liposomas se utilicen particularmente como vehículo para un sistema de administración de fármacos, es necesario hacer que el tamaño de partícula sea de aproximadamente 200 nm o menos en términos de permeación a través de una membrana biológica. Asimismo, en un vehículo para un sistema de administración de fármacos, también es necesario tener liposomas que formen partículas que tengan una buena dispersabilidad en las condiciones de temperatura de aproximadamente 37 °C que es la temperatura corporal de un mamífero. En particular, con respecto a las partículas finas de tamaño nanométrico, se prefiere impartir estabilidad durante la conservación desde varios puntos de vista tales como agregación, precipitación y fuga de fármacos.
Como un vehículo para un sistema de administración de fármacos, en el caso de que se administre un fármaco (solución o similar que contiene liposomas que contienen un fármaco) mediante inyección intravenosa, se requiere una alta seguridad para un producto de inyección intravenosa. No son deseables aditivos como disolventes clorados, por ejemplo cloroformo, o coadyuvantes dispersantes cuyo uso no está permitido. Además, también es necesario impartir estabilidad a un producto farmacéutico y, en consecuencia, se requiere la supresión de la fuga del fármaco, la descomposición de lípidos o similares. Asimismo, también se requiere idoneidad para la filtración estéril con el fin de garantizar la esterilidad. Cuando se desea producir liposomas como producto farmacéutico a escala industrial, es necesario tener en cuenta los requisitos descritos anteriormente.
El documento JP2006-522026A divulga una composición que contiene liposomas asociados de forma estable al menos una camptotecina soluble en agua y al menos una fluoropirimidina, en donde una relación molar camptotecina:fluoropirimidina tiene los efectos citotóxicos, citostáticos o biológicos deseados sobre células u homogeneizados de células cancerosas. Por otra parte, este documento divulga que los liposomas contienen colesterol que está presente en una cantidad inferior al 20 % en moles. Sin embargo, no hay ninguna descripción sobre una presión osmótica en una fase acuosa externa y una fase acuosa interna de los liposomas.
El documento JP2013-512262A divulga un liposoma que contiene irinotecán o clorhidrato de irinotecán, fosfolípidos neutros y colesterol, en donde una relación en peso de colesterol:fosfolípidos neutros es de 1:3 a 5. Además, se describe que el liposoma contiene clorhidrato de irinotecán, fosfatidilcolina de soja hidrogenada, 2000-diestearoilfosfatidiletanolamina y colesterol en una relación en peso de componentes de 1:3,4 a 3,8:0,34 a 0,38:0,8 a 0,95. Sin embargo, no existe una descripción clara sobre la presión osmótica en la fase acuosa externa y la fase acuosa interna del liposoma. Aunque dicho liposoma tiene un gradiente iónico, que está formado por un tampón, entre la fase acuosa interna y la fase acuosa externa del liposoma, existe la posibilidad de que la fase acuosa interna sea hiperosmótica en relación con la fase acuosa externa debido a la carga con un fármaco. Sin embargo, dado que se filtra una cierta cantidad de iones durante la carga de un fármaco, se puede suponer que la diferencia del gradiente iónico no es grande. Además, cuando dicha relación en peso de componentes se convierte con respecto a la cantidad total de componentes lipídicos en la composición liposomal, el contenido de colesterol corresponde a una cantidad de 29 % en moles a 36 % en moles. De acuerdo con esta conversión, se calculó que el peso molecular de la fosfatidilcolina hidrogenada, polietilenglicol 2000-diestearoil-fosfatidiletanolamina y colesterol era 785, 2730 y 387, respectivamente. Cabe señalar que los valores convertidos son los porcentajes mínimo y máximo de colesterol que se pueden asumir en el intervalo de la relación en peso de los componentes individuales mencionado anteriormente.
El documento WO2007/005754A2 divulga una composición liposomal que comprende un gradiente osmótico de al menos 350 mOsm/kg después de la diafiltración, que es una presión osmótica 2 veces la de la fase acuosa interna con respecto a la presión osmótica de la fase acuosa externa.
En todos los documentos mencionados anteriormente, no se ha establecido completamente una composición liposomal que tenga prácticamente la estabilidad de conservación a largo plazo requerida y que también tenga una tasa de liberación adecuada y un método para producir la misma, y en consecuencia se desean mejoras.
Sumario de la invención
En un método de adsorción y retención de un fármaco en una membrana lipídica de un liposoma, la liberación del fármaco al exterior del liposoma es complicada debido a interacciones fuertes tales como interacciones hidrófobas e interacciones electrostáticas. Por lo tanto, se puede mantener la configuración de la composición liposomal después de la producción, por lo que es fácil asegurar la estabilidad de conservación a largo plazo.
En este caso, resulta difícil liberar un fármaco en un área afectada porque las interacciones son demasiado fuertes. Por lo tanto, lo ideal es encapsular un fármaco en un estado disuelto en una fase acuosa interna de un liposoma, y además conseguir que una composición liposomal tenga condiciones hiperosmóticas, promoviendo así la liberación del fármaco de la composición liposomal, de modo que sea posible realizar una administración del fármaco más adecuada. Sin embargo, el hecho de tener condiciones hiperosmóticas da como resultado una rápida fuga del fármaco de la composición liposomal, por lo que es difícil asegurar la estabilidad durante la conservación a largo plazo.
Asimismo, en el caso de que se desee administrar eficazmente un fármaco a un área afectada, es preferible que los liposomas sean partículas finas que tengan un tamaño medio de partícula de 100 nm o menos. Sin embargo, la microparticulación contribuye a un aumento de la curvidad (curvatura) de la membrana de un liposoma, lo que da como resultado la dificultad de encapsular un fármaco.
En otro aspecto, en el caso de que el fármaco contenido en un liposoma sea un agente anticanceroso, existen agentes anticancerosos cuyo ataque a las células cancerosas se ve muy afectado por el tiempo de exposición del fármaco. Por ejemplo, dado que un fármaco como un antagonista metabólico que inhibe la síntesis de ADN ataca solo a algunas de las células en la fase de síntesis de ADN, no se pueden obtener propiedades citocidas eficaces si el tiempo de exposición es corto. En un fármaco de este tipo, en muchos casos no se obtiene la eficacia esperada del fármaco, ya que no se puede lograr un tiempo de exposición suficiente en los tumores si el metabolismo en el cuerpo después de la administración es rápido.
Además, aunque también existe un método de administración para lograr una exposición prolongada mediante un goteo intravenoso de una concentración diluida de un agente anticanceroso con el fin de obtener un tiempo de exposición suficiente, es desfavorable desde el punto de vista de la calidad de vida (CV), como un paciente que está inmovilizado durante el tiempo de goteo intravenoso.
La presente invención se ha realizado en vista de las circunstancias anteriores, y un objetivo de la presente invención es proporcionar una composición liposomal que tenga prácticamente la estabilidad de conservación a largo plazo requerida, y que sea capaz de controlar apropiadamente la capacidad de liberación de un fármaco haciendo que la fase acuosa interna sea hiperosmótica y un método para producir la misma.
Como resultado de estudios intensivos, los presentes inventores han descubierto una composición liposomal que es capaz de controlar apropiadamente la capacidad de liberación de un fármaco incluso cuando una fase acuosa interna es hiperosmótica, estableciendo una cantidad de colesteroles en los lípidos de la composición liposomal en un intervalo óptimo de 10 a 35 % en moles, y un método para producir la misma. La presente invención se ha completado basándose en este descubrimiento.
Es decir, de acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición liposomal, que comprende:
liposomas, cada uno de los cuales tiene una fase acuosa interna y una solución acuosa que constituye una fase acuosa externa y en la cual se dispersan los liposomas,
en donde el contenido de colesteroles es del 10 % en moles al 35 % en moles con respecto a la cantidad total de componentes lipídicos en la composición liposomal, y
cada uno de los liposomas encapsula un fármaco en estado disuelto, y la presión osmótica de la fase acuosa interna es de 2 a 8 veces con respecto a la presión osmótica de la fase acuosa externa.
En la composición liposomal de la presente invención, se prefieren los siguientes aspectos.
Preferentemente, el liposoma es una única lamela.
Preferentemente, una tasa de liberación de un fármaco de la composición liposomal en el plasma sanguíneo de un mamífero es del 20 % en peso/24 h o más con respecto a la cantidad de encapsulación inicial en la composición liposomal.
Preferentemente, los lípidos que constituyen el liposoma incluyen al menos fosfatidilcolina de soja hidrogenada, 1,2-diestearoil-3-fosfatidiletanolamina-polietilenglicol y colesterol.
Preferentemente, un tamaño promedio de partícula de los liposomas es de 5 nm a 100 nm.
La presente invención es una composición farmacéutica que comprende la composición liposomal descrita anteriormente.
La presente invención es un método para la producción de una composición liposomal, que comprende:
una etapa de emulsificación de emulsificación de lípidos disueltos en un disolvente orgánico para formar liposomas, sin una etapa de secado y solidificación;
una etapa de carga de fármaco para encapsular un fármaco soluble en agua en los liposomas obtenidos en la etapa de emulsificación; y una etapa de ajuste de la presión osmótica para reemplazar una solución acuosa de fármaco sin encapsular con una solución hipoosmótica para ajustar la presión osmótica de una fase acuosa interna para que sea hiperosmótica en relación con la presión osmótica de una fase acuosa externa,
en donde la etapa de emulsificación de emulsificación de los lípidos para formar los liposomas ajusta el contenido de colesteroles del 10 % en moles al 35 % en moles con respecto a la cantidad total de los componentes lipídicos en la composición liposomal, y
la etapa de ajuste de la presión osmótica ajusta la presión osmótica de la fase acuosa interna del liposoma de 2 a 8 veces con respecto a la presión osmótica de la fase acuosa externa.
En el método para la producción de una composición liposomal de acuerdo con la presente invención, se prefieren los siguientes aspectos.
Preferentemente, los liposomas obtenidos después de la etapa de emulsificación se utilizan en una etapa siguiente sin procesamiento de extrusión.
Preferentemente, la etapa de carga del fármaco y la etapa de ajuste de la presión osmótica se llevan a cabo simultáneamente.
De acuerdo con la composición liposomal de la presente invención, es posible proporcionar una composición liposomal que tenga la estabilidad de conservación a largo plazo requerida para el uso práctico y que sea capaz de controlar apropiadamente la liberación de un fármaco (preferentemente, que sea capaz de controlar la liberación de un fármaco del orden de varias decenas de horas) incluso cuando una fase acuosa interna sea hiperosmótica, estableciendo una cantidad de colesteroles en los lípidos de la composición liposomal en un intervalo óptimo de 10 a 35 % en moles, y un método para producir la misma.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un gráfico de una relación entre una cantidad de colesterol y un porcentaje de la fase acuosa externa. La Fig. 2 es un gráfico de una relación entre la cantidad de colesterol y el porcentaje de la fase acuosa externa. La Fig. 3 es un gráfico de una relación entre un tiempo y una tasa de liberación.
La Fig. 4 es un gráfico de una relación entre un tiempo de incubación y el porcentaje de la fase acuosa externa.
Descripción de las realizaciones preferidas
El término "etapa" como se utiliza en el presente documento no es solo una etapa independiente, sino también una etapa que puede no estar claramente separada de otra etapa, en la medida en que se pueda lograr un efecto esperado de la etapa.
Los intervalos de valores numéricos mostrados con "a" en la presente memoria descriptiva significa intervalos que incluyen los valores numéricos indicados antes y después de "a" como los valores mínimo y máximo, respectivamente. En la presente invención, salvo que se indique lo contrario, % significa porcentaje en masa.
Al referirse en el presente documento al contenido de un componente en una composición, en un caso en donde existan varias sustancias correspondientes a un componente en la composición, el contenido significa, salvo que se indique lo contrario, la cantidad total de las diversas sustancias que existen en la composición.
La "tasa de encapsulación" se refiere a una relación (relación de masa o relación molar) entre un fármaco encapsulado en un liposoma y un fármaco incorporado (cantidad cargada), cuando los constituyentes del liposoma y un fármaco se incorporan para formar un vehículo de fármaco encapsulado.
La "liberación" significa que el fármaco encapsulado en un liposoma pasa a través de la membrana lipídica que constituye el liposoma y a continuación sale al exterior del liposoma.
La "tasa de liberación" se refiere a una relación (relación en peso o relación molar) entre un fármaco que sale al exterior de un liposoma en el cual están encapsulados los constituyentes del liposoma y un fármaco y un fármaco encapsulado en el liposoma.
La "tasa de liberación es lenta" significa que la cantidad de fármaco que sale al exterior de un liposoma por unidad de tiempo es pequeña.
La "retención en sangre" significa una propiedad (estado) en el cual un fármaco en estado de encapsulado en un liposoma está presente en la sangre, en una diana ("sujeto" o "individuo", preferentemente un mamífero tal como un ser humano (paciente), un ratón, un mono o un animal doméstico) al que se le ha administrado una composición liposomal (o una composición farmacéutica que contiene la composición liposomal).
El "tumor" (que se usa indistintamente con "cáncer" en la presente invención) incluye específicamente tumores sólidos tales como cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de hígado, cáncer de laringe, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer de ovario y sarcoma de Kaposi, y tumores líquidos tales como leucemia. Los sitios donde ocurre un tumor son células, tejidos, órganos o intestinos y su interior.
En lo sucesivo en el presente documento, se describirá en detalle la presente invención.
La presente invención es una composición liposomal, que incluye:
liposomas, cada uno de los cuales tiene una fase acuosa interna y una solución acuosa que constituye una fase acuosa externa y en la cual se dispersan los liposomas,
en la cual el contenido de colesteroles es del 10 % en moles al 35 % en moles con respecto a la cantidad total de componentes lipídicos en la composición liposomal, y
cada uno de los liposomas encapsula un fármaco en un estado disuelto, la presión osmótica de la fase acuosa interna es de 2 a 8 veces con respecto a la presión osmótica de la fase acuosa externa.
(Liposoma)
El liposoma es una vesícula cerrada formada por una membrana de bicapa lipídica constituida por lípidos, y que tiene una fase acuosa (fase acuosa interna) dentro del espacio de la vesícula cerrada. La fase acuosa interna contiene agua y similares. El liposoma habitualmente está presente en un estado de dispersión en una solución acuosa (fase acuosa externa) fuera de la vesícula cerrada. El liposoma puede ser monolamelar (que también se conoce como lamelar monocapa o unilamelar, y es una estructura que tiene una sola membrana bicapa) o lamelar multicapa (que también se conoce como multilaminar y es una estructura similar a una cebolla que tiene múltiples membranas bicapa donde las capas individuales están compartimentadas por capas acuosas). En la presente invención, desde el punto de vista de la seguridad y estabilidad en aplicaciones farmacéuticas se prefiere un liposoma monolamelar.
El liposoma no está particularmente limitado en términos de forma siempre que sea un liposoma capaz de encapsular un fármaco. El "encapsulamiento" significa adoptar una forma en la cual un fármaco está contenido en una fase acuosa interna y una membrana propiamente dicha con respecto al liposoma. Por ejemplo, el liposoma puede ser una forma en donde un fármaco se encapsula dentro de un espacio cerrado formado por una membrana, una forma en donde se incluye un fármaco en la propia membrana o una combinación de los mismos.
El tamaño (tamaño medio de partícula) de un liposoma no está particularmente limitado y es de 2 a 200 nm, preferentemente de 5 a 150 nm, más preferentemente de 5 a 120 nm, y aún más preferentemente de 5 a 100 nm. En la presente invención, el "tamaño promedio de partícula" significa un valor medio de los diámetros de los liposomas medidos mediante un método de dispersión de luz.
El liposoma tiene preferentemente forma esférica o una morfología cercana a la misma.
El componente (componente de la membrana) que constituye la bicapa lipídica de un liposoma se selecciona de lípidos. Como el lípido, se puede utilizar cualquiera siempre que se disuelva en un disolvente mixto de un disolvente orgánico soluble en agua y un disolvente orgánico a base de éster. Los ejemplos específicos de lípidos incluyen fosfolípidos, lípidos distintos de los fosfolípidos, colesteroles y derivados de los mismos. Estos componentes pueden estar compuestos por un solo componente o múltiples componentes.
Los ejemplos de fosfolípido incluyen fosfolípidos naturales y sintéticos tales como fosfatidilcolina (lecitina), fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, y cardiolipina, o productos hidrogenados de los mismos (por ejemplo, fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC)). Entre estos, se prefiere un fosfolípido hidrogenado tal como fosfatidilcolina de soja hidrogenada o esfingomielina, y más preferido es la fosfatidilcolina de soja hidrogenada. En la presente invención, el "fosfolípido" también abarca un derivado de fosfolípido en donde el fosfolípido está modificado.
Los lípidos distintos de los fosfolípidos pueden ser lípidos que no contienen ácido fosfórico, y los ejemplos de los mismos incluyen, pero sin limitarse particularmente a, glicerolípido que no contiene un resto de ácido fosfórico en la molécula, y esfingolípido que no contiene un resto de ácido fosfórico en la molécula. En la presente invención, la expresión "lípidos distintos de los fosfolípidos" también abarca derivados de lípidos distintos de los fosfolípidos en los que se han realizado modificaciones en lípidos distintos de los fosfolípidos.
En el caso de que el lípido distinto del fosfolípido contenga un grupo funcional básico, por ejemplo, en el caso de que el lípido distinto del fosfolípido sea un material en donde un compuesto que tiene un grupo funcional básico esté unido a un lípido, el lípido se denomina un lípido cationizado. El lípido cationizado, por ejemplo, permite modificar la membrana del liposoma y por lo tanto puede mejorar la adhesividad a las células que son sitios diana.
Los ejemplos de colesteroles incluyen colesterol que contiene ciclopentahidrofenantreno como un esqueleto básico cuyos átomos de carbono están parcial o completamente hidrogenados y derivados del mismo. Los ejemplos específicos de colesteroles incluyen, pero sin limitarse particularmente a, colesterol. Cuando el tamaño promedio de partícula disminuye a 100 nm o menos, la curvatura de la membrana lipídica aumenta. Dado que la deformación de la membrana dispuesta en el liposoma también aumenta, un fármaco soluble en agua se vuelve más susceptible a fugas. Sin embargo, como medio para suprimir las propiedades de fuga, es eficaz añadir colesterol o similares con el fin de llenar la deformación de la membrana causada por el lípido (efecto estabilizante de la membrana).
Se espera que la adición de colesteroles en las composiciones liposomales actúen para reducir la fluidez de membrana liposomal, o similar. Generalmente, ha sido deseable que el contenido de colesteroles en los liposomas sea habitualmente una cantidad de hasta aproximadamente el 50 % en moles de los moles totales de componentes lipídicos (lípido total). En relación con una composición liposomal que tiene una presión osmótica alta, hasta ahora se desconocía la relación entre las condiciones de presión osmótica alta de la composición liposomal y la cantidad de colesteroles. Sin embargo, la presente invención ha descubierto un efecto inesperado de que la tasa de liberación de un fármaco en un mamífero puede ajustarse controlando la cantidad de colesteroles en un intervalo óptimo, en condiciones de alta presión osmótica de una composición liposomal. En la presente invención, en moles totales de componentes lipídicos en la composición liposomal (lípido total contenido en la composición liposomal), el contenido de colesteroles es del 10 al 35 % en moles, preferentemente del 15 al 25 % en moles y más preferentemente del 17 al 21 % en moles.
Además de los componentes mencionados anteriormente, se puede añadir al liposoma un polímero hidrófilo o similar para mejorar la retención en sangre, ácido graso, fosfato de diacetilo o similar como un estabilizador de la estructura de la membrana, o a-tocoferol o similar como un antioxidante. En la presente invención, es preferible no utilizar aditivos tales como un coadyuvante de dispersión no autorizado para el uso en inyección intravenosa en aplicaciones farmacéuticas, por ejemplo, un tensioactivo o similar.
El liposoma de la presente invención contiene preferentemente productos modificados con polímeros hidrófilos de fosfolípidos, lípidos distintos de los fosfolípidos o colesteroles como fosfolípidos, lípidos distintos de los fosfolípidos, colesteroles y derivados de los mismos.
Los ejemplos de polímeros hidrófilos incluyen, pero sin limitarse particularmente a, polietilenglicoles, poligliceroles, polipropilenglicoles, poli(alcoholes vinílicos), un copolímero alterno de estireno-anhídrido maleico, polivinilpirrolidona y poliaminoácido sintético. Los polímeros hidrófilos mencionados anteriormente pueden usarse solos o en combinación de dos o más de los mismos.
Entre estos, desde el punto de vista de la retención en sangre de una formulación, se prefieren polietilenglicoles, poligliceroles o polipropilenglicoles, y más preferido es polietilenglicol (PEG), poliglicerol (PG) o polipropilenglicol (PPG). El polietilenglicol (PEG) es el más utilizado y es preferible debido a que tiene el efecto de mejorar la retención en sangre.
El peso molecular del PEG no está particularmente limitado. El peso molecular del PEG es de 500 a 10.000 daltons, preferentemente de 1.000 a 7.000 daltons y más preferentemente de 2.000 a 5.000 daltons.
En el liposoma de la presente invención, es preferible utilizar un lípido modificado por PEG (lípido modificado con PEG), junto con el lípido principal contenido en el liposoma. Los ejemplos del lípido modificado con PEG incluyen 1,2-diestearoil-3-fosfatidiletanolamina-polietilenglicol tal como 1,2-diestearoil-3-fosfatidiletanolamina-PEG2000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), 1,2-distearoil-3-fosfatidiletanolamina-PEG5000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) y diestearoil glicerol-PEG2000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.). Estos lípidos modificados con PEG se pueden añadir en una cantidad del 0,3 al 50% en masa, preferentemente del 0,5 al 30 % en masa, y más preferentemente del 1 al 20 % en masa con respecto al contenido total de lípidos.
En el liposoma de la presente invención, se prefiere una combinación de lípidos de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (un lípido principal contenido en el liposoma), 1,2-diestearoil-3-fosfatidiletanolamina-polietilenglicol (un lípido usado en combinación con el lípido principal), y colesterol.
La composición liposomal de la presente invención preferentemente no contiene un polímero aniónico (polianión). En la presente invención, dado que es posible controlar la capacidad de liberación por medio de una presión osmótica de una fase acuosa interna, existen ventajas en el sentido de que la versatilidad general es excelente y los fármacos que pueden usarse en liposomas no están limitados.
(Fármaco)
El liposoma de la presente invención puede contener al menos uno de los fármacos solubles en agua como un fármaco.
En el caso de un fármaco hidrosoluble, es ventajosa una forma que se retenga en la fase acuosa interna del liposoma, pero puede haber un caso en donde un fármaco se vuelva fácilmente susceptible a fugas porque la membrana de la bicapa lipídica es fina y blanda. Sin embargo, de acuerdo con el método para producir un liposoma de la presente invención, es posible producir un liposoma que tenga seguridad y estabilidad incluso cuando el tamaño de partícula del liposoma se establezca en aproximadamente 100 nm o menos.
El fármaco abarcado por el fármaco puede ser cualquier fármaco soluble en agua que pueda encapsularse en liposomas, y los ejemplos específicos del mismo incluyen, pero sin limitación, materiales solubles en agua que tengan una actividad fisiológica o farmacológica, tales como enzimas, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos (ADN, ARNm, ARNip, miARN), compuestos de bajo peso molecular, azúcares (oligosacáridos y polisacáridos), compuestos poliméricos, agentes antitumorales, agentes antimicrobianos, agentes de contraste, antioxidantes, agentes antiinflamatorios, agentes blanqueadores, humectantes, y agente para el crecimiento del cabello. En el caso de usar un liposoma como un vehículo para un sistema de administración de fármacos, el fármaco soluble en agua es preferentemente un compuesto de bajo peso molecular desde el punto de vista de la estabilidad.
Los ejemplos específicos del fármaco soluble en agua incluyen agentes anticancerosos tales como un agente contra el cáncer a base de antraciclina tales como doxorrubicina, daunorrubicina o epirrubicina, un agente anticanceroso a base de cisplatino tal como cisplatino u oxaliplatino, un agente anticanceroso a base de taxano tal como paclitaxel o docetaxel, un agente anticanceroso a base de alcaloides de la vinca tal como vincristina o vinblastina, un agente anticanceroso a base de bleomicina tal como bleomicina, y un agente anticanceroso a base de sirolimus, tal como sirolimus, y antagonistas metabólicos tal como metotrexato, fluorouracilo, gemcitabina, citarabina y pemetrexed. Entre estos, se prefiere un fármaco soluble en agua, tal como doxorrubicina, gemcitabina, o pemetrexed.
(Fármaco soluble en agua encapsulado en estado disuelto)
El fármaco soluble en agua encapsulado en el liposoma de la presente invención está presente en un estado disuelto en la fase acuosa interna del liposoma. En el presente documento, con respecto al estado disuelto, se considera que ha sido encapsulado en un estado disuelto cuando la cantidad de fármaco llenado con respecto al volumen del liposoma es inferior a la solubilidad de saturación del fármaco en la composición líquida de la fase acuosa interna. Asimismo, incluso cuando la cantidad de fármaco incluida está por encima de la solubilidad de saturación del fármaco, un caso en donde mediante Cryo-TEM no se observan los cristales de fármaco y los patrones de difracción atribuibles a la red cristalina no se observan mediante la medición de XRD indica que la mayor parte del fármaco se disuelve debido a la aceleración de la disolución por el entorno fisicoquímico creado por la membrana lipídica, la incorporación parcial del fármaco en la membrana lipídica o similar y se considera que ha sido encapsulado en un estado disuelto. Asimismo, un caso en el cual se encapsula mediante un método de carga para encapsular un fármaco mediante la formación de un sólido dentro del liposoma no es el estado disuelto al que se hace referencia en la presente invención, incluso cuando el fármaco sea un fármaco altamente soluble en agua.
El fármaco soluble en agua que se va a encapsular en un estado disuelto tiene preferentemente una solubilidad en agua de 1 mg/ml o más, y más preferentemente una solubilidad en agua de 10 mg/ml o más.
(Método para producir la composición liposomal)
El método para producir un liposoma de acuerdo con la presente invención es un método para producir una composición liposomal que incluye:
una etapa de emulsificación de emulsificación de los lípidos disueltos en un disolvente orgánico para formar un liposoma, sin una etapa de secado y solidificación;
una etapa de carga de fármaco para encapsular un fármaco soluble en agua en el liposoma obtenido en la etapa de emulsificación; y
una etapa de carga de fárma
veces con respecto a la presión osmótica de una fase acuosa externa.
El método para producir una composición liposomal puede incluir, si se desea, otras etapas tales como una etapa de evaporación del disolvente orgánico utilizado en la etapa de emulsión.
La etapa de emulsificación de emulsificación de los lípidos disueltos en un disolvente orgánico para formar un liposoma, sin una etapa de secado y solidificación, no está limitada siempre que sea una etapa de emulsificación, pero preferentemente es una etapa de aplicación de una fuerza de cizallamiento elevada y realización de una microparticulación con una etapa de emulsificación incluyendo un disolvente orgánico. Si es necesario, se puede llevar a cabo la evaporación (desolvatación) del disolvente orgánico usado en la etapa de emulsificación para formar un liposoma.
(Etapa de emulsificación)
En la etapa de emulsificación, se mezclan una fase oleosa en donde al menos un lípido se ha disuelto en un disolvente orgánico y se mezcla una fase acuosa para preparar una solución acuosa que contiene lípidos, que a continuación se emulsiona con agitación. Se mezclan una fase oleosa en donde los lípidos se han disuelto en un disolvente orgánico y una fase acuosa, se agitan y emulsionan para preparar de este modo una emulsión en donde se emulsionan una fase oleosa y una fase acuosa en un tipo O/W. Después de la mezcla, se forma un liposoma eliminando una parte o todo el disolvente orgánico derivado de la fase oleosa usando una etapa de evaporación que se describe a continuación. Como alternativa, una parte o la totalidad del disolvente orgánico en la fase oleosa se evapora en el transcurso de la emulsificación con agitación para formar un liposoma.
Como un método de agitación, se utilizan ondas ultrasónicas o fuerza de corte mecánica para la miniaturización de partículas. Además, el procesamiento en la extrusora por el cual se dejan pasar las partículas a través de un filtro que tiene un cierto diámetro de poro o el procesamiento en el microfluidizador puede llevarse a cabo para conseguir la uniformidad de tamaño de las partículas. El uso de una extrusora o similar puede dar como resultado la descomposición de liposomas multivesiculares formados de forma secundaria en liposomas univesiculares. En la presente invención, se prefiere desde el punto de vista de la simplificación del proceso de producción que un liposoma en un estado de fármaco no cargado se utilice en la siguiente etapa sin proceso de extrusión.
En la presente invención, el tamaño promedio de partícula de un liposoma a preparar se puede controlar seleccionando arbitrariamente la velocidad y el tiempo de agitación. Con el objetivo de obtener un liposoma que tenga seguridad y estabilidad, es preferible proporcionar cizallamiento a una velocidad circunferencial de 20 m/seg o superior a una solución acuosa que contiene lípidos. El cizallamiento no está limitado, y un ejemplo específico del mismo es preferentemente cizallamiento a una velocidad circunferencial de 20 m/seg a 35 m/s, y más preferentemente cizallamiento a una velocidad circunferencial de 23 m/s a 30 m/s.
(Fase oleosa)
Como disolvente orgánico que actúa como fase oleosa, se utiliza una mezcla de disolvente orgánico soluble en agua y un disolvente orgánico a base de éster. En la presente invención, se prefiere que un disolvente orgánico tal como cloroformo, cloruro de metileno, hexano o ciclohexano no se utilice sustancialmente como disolvente orgánico, y se prefiere más que estos disolventes orgánicos no se utilicen en absoluto.
El disolvente orgánico soluble en agua no está particularmente limitado, y preferentemente es un disolvente orgánico que tiene una propiedad que es opcionalmente miscible con agua. Los ejemplos específicos del disolvente orgánico soluble en agua incluyen alcoholes tales como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, y tbutanol; glicoles, tales como glicerol, etilenglicol y propilenglicol; y polialquilenglicoles tales como polietilenglicol. Entre estos, se prefieren los alcoholes. El alcohol es preferentemente al menos uno seleccionado de etanol, metanol, 2-propanol, o t-butanol, más preferentemente al menos uno seleccionado de etanol, 2-propanol o t-butanol, y aún más preferentemente etanol.
El disolvente orgánico a base de éster no está particularmente limitado, y es preferentemente un éster obtenido de la reacción de ácidos orgánicos y alcoholes. Específicamente, el disolvente orgánico a base de éster es preferentemente al menos uno seleccionado de acetato de etilo, acetato de metilo, acetato de isopropilo, acetato de t-butilo o propionato de metilo, más preferentemente acetato de etilo, acetato de isopropilo, o propionato de metilo, y aún más preferentemente acetato de etilo.
La relación de mezcla de disolvente orgánico soluble en agua:disolvente orgánico a base de éster no está particularmente limitada y puede ser de 90:10 a 30:70, preferentemente de 80:20 a 40:60, y más preferentemente de 80:20 a 70:30 en relación de masa. El disolvente mixto de un disolvente orgánico soluble en agua y un disolvente orgánico a base de éster puede contener además un disolvente acuoso que se describirá a continuación, tal como agua o tampón. El disolvente acuoso se puede añadir en un intervalo de, por ejemplo, 1 a 30 % en masa. El pH de la mezcla de disolventes no está particularmente limitado, y está preferentemente en el intervalo de aproximadamente 3 a 10, y más preferentemente de aproximadamente 4 a 9. Los disolventes orgánicos a base de ésteres pueden contener sustancias fisiológicamente activas o similares, tales como varios medicamentos que son solubles en estos disolventes.
En el caso de que se utilice etanol como el disolvente orgánico soluble en agua y acetato de etilo como disolvente orgánico a base de éster, la relación de mezcla de etanol:acetato de etilo no está particularmente limitada, y es preferentemente de 80:20 a 70:30 en una relación de masa.
La concentración del lípido no está particularmente limitada y puede ajustarse apropiadamente, pero puede ser de 40 g/l a 250 g/l, preferentemente de 100 g/l a 200 g/l en términos de una solución donde una solución mixta de un disolvente orgánico soluble en agua y un disolvente orgánico a base de éster sirven como disolvente.
(Fase acuosa)
La fase acuosa significa una fase acuosa externa y una fase acuosa interna.
La fase acuosa externa, como se utiliza en el presente documento, significa una solución acuosa en la cual se dispersan los liposomas. Por ejemplo, en el caso de una inyección, una solución que ocupa la parte externa del liposoma de un líquido de dispersión de liposomas envasados y almacenados en un vial o jeringa precargada se convierte en una fase acuosa externa. También, de manera similar para un líquido que se va a dispersar en el momento de su uso cuando se administra mediante una solución de dispersión unida u otras soluciones, una solución que ocupa la parte externa del liposoma de un líquido de dispersión de liposomas se convierte en una fase acuosa externa.
La fase acuosa interna, como se utiliza en el presente documento, significa una fase acuosa en la vesícula cerrada con una membrana de bicapa lipídica entre ellas.
Como solución acuosa dispersante de liposomas (fase acuosa externa) cuando se producen liposomas, se usa preferentemente agua (agua destilada, agua para inyección, o similares), solución salina fisiológica, diversos tampones, una solución acuosa de azúcares o una mezcla de los mismos (disolvente acuoso). El tampón no se limita a soluciones tampón orgánicas e inorgánicas, y se usa preferentemente un tampón que tenga una acción tamponadora en las proximidades de un pH cercano al del fluido corporal y los ejemplos del mismo incluyen tampón fosfato, tampón Tris, tampón citrato, tampón acetato y tampón de Good. El pH de la fase acuosa no está particularmente limitado, y puede ser de 5 a 9, preferentemente de 7 a 8. Por ejemplo, se usa preferentemente un tampón fosfato (por ejemplo, pH = 7,4). La fase acuosa interna del liposoma puede ser una solución acuosa dispersante de liposomas cuando se producen liposomas, o puede ser agua, solución salina fisiológica, diversos tampones, una solución acuosa de azúcares o una mezcla de los mismos que se añaden nuevamente. El agua utilizada como fase acuosa externa o fase acuosa interna está preferentemente exenta de impurezas (polvo, productos químicos o similares).
La solución salina fisiológica se refiere a una solución de sal inorgánica ajustada para ser isotónica con el fluido corporal humano, y además puede tener una función tampón. Los ejemplos de solución salina fisiológica incluyen solución salina que contiene 0,9 % p/v de cloruro de sodio, solución salina tamponada con fosfato (en lo sucesivo, también denominada PBS) y solución salina tamponada con T ris.
(Etapa de evaporación)
En la presente invención, se puede proporcionar una etapa de evaporación si es necesario. En la etapa de evaporación, se evapora un disolvente orgánico de la solución acuosa que contiene los liposomas obtenidos en la etapa de emulsificación. En la presente invención, la etapa de evaporación incluye al menos una de las etapas de eliminar por la fuerza una parte o la totalidad del disolvente orgánico derivado de la fase oleosa como una etapa de evaporación, y una etapa de evaporación natural de una parte o la totalidad del disolvente orgánico en la fase oleosa durante el transcurso de la agitación-emulsificación.
El método de evaporación de un disolvente orgánico en la etapa de evaporación no está particularmente limitado. Por ejemplo, se puede llevar a cabo al menos una de una etapa de calentamiento para evaporar un disolvente orgánico, una etapa de continuar el reposo o agitación lenta después de la emulsificación, o una etapa de realizar desgasificación al vacío.
En la presente invención, en la etapa de evaporación de un disolvente orgánico, se prefiere que la concentración de un disolvente orgánico contenido en una solución acuosa que contiene liposomas sea del 15 % en masa o menos dentro de los 30 minutos posteriores al inicio de una etapa de evaporación del disolvente orgánico.
La temperatura del líquido cuando se lleva a cabo el método de producción de la presente invención se puede ajustar apropiadamente, pero la temperatura del líquido en el momento de mezclar una fase oleosa y una fase acuosa es preferentemente superior o igual a la temperatura de transición de fase del lípido a ser usado. Por ejemplo, en el caso de que se utilice un lípido que tiene una temperatura de transición de fase de 35 °C a 40 °C, la temperatura del líquido se fija preferentemente en 35 °C a 70 °C.
La solución acuosa que contiene los liposomas preparada mediante una etapa de emulsificación puede someterse a un procesamiento posterior, tal como centrifugación, ultrafiltración, diálisis, filtración en gel o liofilización, para la eliminación de componentes que no se habían incluido en los liposomas, o para el ajuste de la concentración y la presión osmótica.
Los tamaños de partícula de los liposomas resultantes pueden uniformarse usando diálisis, filtración, procesamiento por extrusión, o similares. En el método para la producción de una composición liposomal de acuerdo con la presente invención, se prefiere preparar liposomas vacíos en un estado en donde no se carga un fármaco, sin someterlo a un procesamiento de extrusión. Por otra parte, si se desea separar el fármaco encapsulado en liposomas del fármaco no encapsulado en liposomas, se puede utilizar centrifugación, diálisis, filtración en gel o similares.
(Procesamiento de extrusión)
El procesamiento de extrusión implica una etapa en la que se hacen pasar liposomas a través de un filtro que tiene un poro fino para aplicar una fuerza de cizallamiento física, realizando de este modo la microparticulación. Cuando se pasan los liposomas, se puede lograr una microparticulación rápida incubando el líquido de dispersión de liposomas y el filtro a una temperatura superior o igual a la temperatura de transición de fase de la membrana que constituye el liposoma.
(Etapa de carga del fármaco)
En la etapa de carga del fármaco de la presente invención, en el caso de encapsulación de un fármaco hidrosoluble en liposomas, el fármaco puede encapsularse en la fase acuosa interna del liposoma mediante un método de disolución del fármaco en un medio acuoso capaz de conseguir la hidratación y el hinchamiento, seguido de calentamiento a una temperatura superior o igual a la temperatura de transición de fase, y sonicación o extrusión. Un fármaco también puede encapsularse en una fase acuosa interna disolviendo el fármaco en la fase acuosa en el momento de la emulsificación de los lípidos.
(Etapa de ajuste de la presión osmótica)
En la presente invención, resulta fácil liberar un fármaco haciendo que la fase acuosa interna de los liposomas sea hiperosmótica (diferencia de presión) mediante una etapa de ajuste de la presión osmótica. La tasa de liberación se puede controlar ajustando la presión osmótica. La etapa de ajuste de la presión osmótica no está particularmente limitada y puede emplearse un método tal como la diálisis después de la etapa de carga del fármaco. Esto permite ajustar la presión osmótica. En la presente invención, es preferible llevar a cabo la etapa de carga de fármaco y la etapa de ajuste de la presión osmótica (preferentemente ajuste de la presión osmótica de una fase acuosa interna) al mismo tiempo, desde el punto de vista de la eficiencia de la producción.
En la presente invención, mediante el control de la liberación, por ejemplo, en el caso de usar el liposoma de la presente invención como un sistema de administración de fármacos, es posible liberar la cantidad requerida de fármaco que se necesita en un área afectada objetivo. Sin embargo, en un liposoma hiperosmótico es fácil liberar un fármaco, aunque también es fácil que se produzca una fuga del fármaco durante el almacenamiento, por lo que es difícil lograr tanto una buena capacidad de liberación como una estabilidad durante la conservación. De acuerdo con la composición liposomal de la presente invención, esta tiene un efecto inesperado capaz de lograr tanto la liberación fácil como la estabilidad durante la conservación de un fármaco el ajustar la presión osmótica de la fase acuosa interna de 2 a 8 veces con respecto a la presión osmótica de la fase acuosa externa, para los liposomas que tienen una fase acuosa interna obtenida a partir de los lípidos emulsionados.
En general, como método para hacer que una fase acuosa interna sea hiperosmótica, por ejemplo, existe un método para producir una fase acuosa interna y una fase acuosa externa de un liposoma en el cual no se ha encapsulado un fármaco para obtener una presión osmótica alta, y a continuación disminuir la presión osmótica de la fase acuosa externa mediante diálisis o similar. En ese caso, en una etapa de carga de fármaco subsiguiente a realizar, puede darse el caso de que se escape el fármaco contenido en la fase acuosa interna y también se reduzca la presión osmótica de la fase acuosa interna.
Por lo tanto, en la presente invención, junto con la carga de un fármaco, se reemplaza una fase acuosa interna con una solución de alta presión osmótica, y a continuación la eliminación del fármaco en una fase acuosa externa y la reducción de la presión osmótica de la fase acuosa externa se lleva a cabo simultáneamente mediante diálisis, por lo que es posible obtener una composición liposomal capaz de lograr tanto la liberación fácil como la estabilidad de conservación de un fármaco.
En el liposoma de la presente invención, la presión osmótica de la fase acuosa interna es de 2 a 8 veces, preferentemente de 2,5 a 6 veces, más preferentemente de 3 a 5 veces, con respecto a la presión osmótica de la fase acuosa externa. Al establecer que sea el doble o superior, se sabe que la membrana de la bicapa lipídica del liposoma muestra una estructura tal como una estructura de doble membrana o una estructura interdigitada. Cuando la presión osmótica de la fase acuosa interna es el doble o superior con respecto a la fase acuosa externa, el liposoma comienza a cambiar de una estructura de doble membrana a una estructura interdigitada. La estructura de dicha membrana doble se puede ajustar mediante el tipo o la relación de composición de lípidos individuales, pero en la presente invención, es posible obtener una composición liposomal capaz de lograr tanto la liberación fácil como la estabilidad de conservación de un fármaco estableciendo el porcentaje de colesterol en 10 % en moles a 35 % en moles para obtener una estructura lipídica adecuada.
En el líquido obtenido después de la etapa final de carga del fármaco, se homogeneizan los solutos de la fase acuosa externa y la fase acuosa interna, y la presión osmótica en ese momento puede definirse como la presión osmótica de una fase acuosa interna de la composición liposomal a completar. Sin embargo, en una etapa posterior de ajuste de la presión osmótica de reemplazo mediante diálisis de la fase acuosa externa, una operación de calentamiento se limita solo a un caso en donde los solutos de la fase acuosa interna se retienen suficientemente, tal como cuando están suprimidos por debajo de la transición de fase de un lípido. Además, la presión osmótica de la fase acuosa externa se puede definir como la presión osmótica de un líquido de diálisis utilizado en la etapa final de diálisis. Sin embargo, esto se limita solo a un caso en donde la fase acuosa externa se reemplazó suficientemente con un líquido de diálisis. Asimismo, para la solución final de una composición liposomal, también es posible obtener la presión osmótica de la fase acuosa interna y la fase acuosa externa cuantificando la concentración de la composición del soluto en la fase acuosa externa y la concentración de la composición del soluto en la fase acuosa interna usando centrifugación o ultrafiltración, y midiendo la presión osmótica del líquido de la composición.
La medición de una presión osmótica puede realizarse de acuerdo con un método de medición de la osmolalidad descrito en la decimosexta Farmacopea Japonesa revisada. Específicamente, es posible determinar la osmolalidad midiendo el grado de depresión del agua del punto de congelación (punto de hielo). Además, el grado de depresión del punto de congelación del agua se define en términos de concentración molar de soluto, y también es posible determinar la osmolalidad a partir de la concentración molar de soluto.
La presión osmótica de la fase acuosa externa en la presente invención tiene un efecto significativo sobre el organismo vivo tras la administración. En el caso de que la presión osmótica de la fase acuosa externa esté lejos de la presión osmótica de un fluido corporal, se produce hemólisis o dolor causado por el movimiento de la humedad en los tejidos individuales. Por lo tanto, la presión osmótica de la fase acuosa externa en la presente invención es preferentemente de 200 a 400 mOsmol/l, más preferentemente de 250 a 350 mOsmol/l, y lo más preferentemente isotónica con el fluido corporal.
(Esterilización por filtración)
Para formular una solución acuosa que contiene liposomas, obtenida mediante el método para la producción de una composición liposomal de acuerdo con la presente invención, en una composición farmacéutica, es preferible realizar una esterilización por filtración. Con respecto al método de filtración, es posible eliminar materiales no deseados de la solución acuosa que contiene liposomas usando una membrana de fibra hueca, una membrana de ósmosis inversa, un filtro de membrana o similar. En la presente invención, la solución acuosa que contiene liposomas se filtra preferentemente usando un filtro que tiene un tamaño de poro estéril (preferentemente filtro estéril de 0,2 |jm) aunque no existe ninguna limitación particular. Normalmente, la adsorción o agregación de liposomas en un filtro estéril puede ocurrir en la etapa de filtración. Sin embargo, la presente invención tiene efectos inesperados tales como poca influencia de la pérdida de presión o similares cuando se realiza la filtración, ya que se obtienen liposomas que tienen un tamaño promedio de partícula específico y una distribución uniforme del tamaño de partícula.
Para evitar un efecto de la deformación del liposoma sobre el tamaño promedio de partícula, la etapa de filtración estéril y la etapa de llenado aséptico descrita a continuación se llevan a cabo preferentemente a una temperatura inferior o igual a la temperatura de transición de fase de los lípidos que constituyen el liposoma. Por ejemplo, en el caso de que la temperatura de transición de fase del lípido sea de alrededor de 50 °C, la etapa de esterilización por filtración y la etapa de llenado aséptico que se describen a continuación se llevan a cabo a una temperatura de preferentemente aproximadamente 0 °C a 40 °C, y más específicamente de aproximadamente 5 °C a 30 °C.
(Llenado aséptico)
La solución acuosa que contiene los liposomas obtenida después de la filtración estéril se llena preferentemente asépticamente para aplicaciones médicas. Pueden aplicarse métodos conocidos para el llenado aséptico. Puede prepararse una composición liposomal adecuada para aplicaciones médicas llenando asépticamente la solución acuosa que contiene liposomas en un recipiente.
Un disolvente acuoso, un aditivo o similar se puede añadir apropiadamente a la solución acuosa que contiene los liposomas obtenida mediante la presente invención para preparar de ese modo una composición farmacéutica que contiene una composición liposomal. En relación con la vía de administración, la composición farmacéutica puede contener también al menos uno de un agente de tonicidad, un estabilizante, un antioxidante o un agente de ajuste del pH que sea farmacéuticamente aceptable.
El agente de tonicidad no está particularmente limitado y sus ejemplos incluyen sales inorgánicas tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, hidrogenofosfato sódico, dihidrogenofosfato de potasio e dihidrogenofosfato de potasio; polioles tales como glicerol, manitol y sorbitol; y azúcares tales como glucosa, fructosa, lactosa y sacarosa.
El estabilizador no está particularmente limitado y los ejemplos del mismo incluyen azúcares tales como glicerol, manitol, sorbitol, lactosa y sacarosa.
El antioxidante no está particularmente limitado y sus ejemplos incluyen ácido ascórbico, ácido úrico, tocoferol u homólogos (por ejemplo, vitamina E, cuatro isómeros de tocoferol a, p, y, y 5), cisterna y EDTA. Los estabilizadores y antioxidantes pueden usarse respectivamente solos o en combinación de dos o más de los mismos.
Los ejemplos del agente de ajuste del pH incluyen hidróxido de sodio, ácido cítrico, ácido acético, trietanolamina, hidrogenofosfato sódico, dihidrogenofosfato de sodio y dihidrogenofosfato de potasio.
La composición farmacéutica de la presente invención puede contener un disolvente orgánico, colágeno, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, un polímero de carboxivinilo, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilato de sodio, alginato de sodio, dextrano soluble en agua, carboximetilalmidón sódico, pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, goma de xantano, goma arábiga, caseína, gelatina, agar, diglicerol, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina, parafina, alcohol estearílico, ácido esteárico, albúmina sérica humana (HSA), manitol, sorbitol, lactosa, PBS, cloruro de sodio, azúcares, un polímero biodegradable, un medio sin suero, cada uno de los cuales es farmacéuticamente aceptable, o un aditivo que es aceptable como un aditivo farmacéutico.
En particular, en el contexto de la presente invención, la composición farmacéutica contiene preferentemente sulfato de amonio, L-histidina, sacarosa purificada, hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, o similares.
El recipiente en donde se llena una composición farmacéutica no está particularmente limitado, y preferentemente está hecho de un material que tiene baja permeabilidad al oxígeno. Los ejemplos del recipiente incluyen un recipiente de plástico, un recipiente de vidrio y una bolsa hecha de una película laminada que tiene una lámina de aluminio, una película depositada de aluminio, una película depositada de óxido de aluminio, una película depositada de óxido de silicio, un poli(alcohol vinílico), un copolímero de etileno-alcohol vinílico, tereftalato de polietileno, naftalato de polietileno, poli(cloruro de vinilideno), o similares como una capa de barrera a los gases. Si es necesario, puede protegerse de la luz adoptando una bolsa o similar usando un vidrio coloreado, una hoja de aluminio, una película depositada de aluminio o similares.
En el recipiente en donde se llena una composición farmacéutica, para evitar la oxidación por el oxígeno presente en el espacio del recipiente, es preferible reemplazar los gases en el espacio del recipiente y la solución de fármaco con gases inertes tales como el nitrógeno. Por ejemplo, una solución de inyección se burbujea con nitrógeno, de modo que el llenado de la solución de inyección en un recipiente se puede llevar a cabo bajo una atmósfera de nitrógeno.
El método de administración de una composición farmacéutica es preferentemente la administración parenteral. Por ejemplo, se puede seleccionar una inyección intravenosa tal como goteo intravenoso, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, inyección intraocular o inyección intratecal. El método de administración específico de una composición liposomal incluye, por ejemplo, una jeringa y la administración por goteo intravenoso.
La dosis de un fármaco contenido en la composición farmacéutica se selecciona habitualmente en el intervalo de 0,01 mg a 100 mg/kg de peso corporal/día. Sin embargo, la composición liposomal de la presente invención no se limita a dicha dosis.
(Tasa de liberación)
La tasa de liberación se refiere una cantidad del fármaco que sale al exterior de un liposoma por unidad de tiempo. En la presente invención, la tasa de liberación es preferentemente 10 % en masa/24 h a 70 % en masa/24 h, más preferentemente 20 % en masa/24 h a 60 % en masa/24 h y aún más preferentemente de 20 % en masa/24 h a 50 % en masa/24 h.
La tasa de liberación depende de la temperatura y, por lo tanto, se mide preferentemente en condiciones de temperatura constante. Por ejemplo, en el caso de un ser humano, la temperatura no está particularmente limitada, pero es preferible medir la tasa de liberación a una temperatura en el intervalo de la temperatura corporal (35 °C a 38 °C).
En el caso de que el fármaco contenido en el liposoma sea un agente anticanceroso, cuando la tasa de liberación sea menos de 15 % en masa/24 h, no se puede obtener un tiempo de exposición suficiente en el cuerpo como agente anticanceroso, por lo que en muchos casos no se logra la eficacia del fármaco esperada. Asimismo, los liposomas que contienen un agente anticanceroso permanecen en el cuerpo durante un tiempo innecesariamente largo en algunos casos, por lo que se puede expresar una toxicidad inesperada debido a la acumulación de los mismos en tejidos tales como la piel donde tales liposomas apenas se distribuyen naturalmente. Asimismo, cuando la tasa de liberación es superior al 70 % en masa/24 h, dado que la cantidad de fármaco expuesta por unidad de tiempo aumenta, la concentración máxima en sangre aumenta, aumentando de este modo la toxicidad, y también el fármaco filtrado se distribuye en tejidos distintos del área del tumor o sufre un metabolismo rápido, lo que provoca una disminución de la permanencia en la sangre, que por lo tanto es desfavorable.
El método de medir una tasa de liberación no está particularmente limitado. Por ejemplo, se administra un fármaco a un mamífero o sistema modelo de interés, se extrae sangre o plasma sanguíneo en cada unidad de tiempo del mamífero o sistema modelo y, si es necesario, se lleva a cabo un pretratamiento o similar. A continuación, el fármaco objetivo puede medirse mediante un método tal como la cromatografía líquida de alta resolución o la espectrometría de masas.
Además, cuando se mide la tasa de liberación de un fármaco, la dosificación del fármaco varía dependiendo del sujeto al que se administra, órgano diana, síntomas, el método de administración o similares. Por ejemplo, en el caso de una inyección, por ejemplo, para un ser humano (un paciente; que tiene un peso corporal de 60 kg), es preferible administrar una dosis de aproximadamente 0,01 a 30 mg/día, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 20 mg/día, y más preferentemente de aproximadamente 0,1 a 10 mg/día mediante inyección intravenosa. Para otras especies animales, se puede administrar una cantidad convertida en términos de peso corporal y área superficial con respecto a la dosis especificada anteriormente por peso corporal de 60 kg.
(Volumen tumoral)
En la presente invención, se puede trasplantar un tumor a un animal modelo (preferentemente, un ratón) para medir el volumen tumoral. En el caso de que la composición liposomal de la presente invención se administre a un sujeto tal como un mamífero, se puede observar el efecto de inhibición del crecimiento del volumen tumoral. La inhibición del crecimiento del volumen tumoral depende del fármaco que se utilice, de una combinación de los lípidos o similares que constituyen los liposomas y de la cantidad eficaz. La inhibición del crecimiento del volumen tumoral se refiere a al menos uno de entre la inhibición del crecimiento del tumor, la quiescencia del tumor y la regresión sustancial o completa del tumor.
En el caso de que la composición liposomal de la presente invención se administre a un sujeto tal como un mamífero, los animales modelo se asignan a un grupo de tratamiento y un grupo de control, y se puede iniciar el trasplante de células tumorales, por ejemplo, después de que las células tumorales hayan crecido hasta un tamaño de 100 a 1000 mm2 de modo que las células tumorales se hayan asentado. Puede administrarse una dosis de 0,01 a 100 mg/kg basada en el peso corporal al inicio del tratamiento. Por ejemplo, en el caso en el que el animal modelo es un ratón, los animales se pesaron diariamente como un todo hasta que los ratones de cada grupo alcanzaron el peso corporal más bajo, como una evaluación de la composición liposomal de la presente invención. A continuación, hasta el final del experimento, se midió el peso corporal de los animales de cada grupo. El tumor puede medirse con un calibre o similar hasta que se haga el sacrificio final durante la extracción de muestras, hasta que el tumor alcance 2000 mm3 o los animales mueran.
El volumen tumoral en un sujeto mamífero puede medirse usando cualquier método apreciado en la técnica. Por ejemplo, el volumen tumoral puede evaluarse según la ecuación: (axb2)x0,5 (donde "a" es un diámetro máximo y "b" es una longitud del eje menor), utilizando las medidas de un calibre. Asimismo, el volumen del tumor en un sujeto humano puede evaluarse mediante una técnica tal como la formación de imágenes de diagnóstico, Por ejemplo tomografía computarizada (TC) o resonancia magnética (RM).
Aplicabilidad industrial
De acuerdo con la composición liposomal y el método para producir la misma de la presente invención, es posible proporcionar una composición liposomal que tenga prácticamente la estabilidad de conservación a largo plazo requerida, y que sea capaz de controlar apropiadamente la capacidad de liberación de un fármaco convirtiendo una fase acuosa interna en hiperosmótica. La composición liposomal de la presente invención es aplicable para productos farmacéuticos, cosméticos, alimentos o similares, y es particularmente útil para aplicaciones farmacéuticas.
[Ejemplos]
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, la presente invención no está limitada a dichos Ejemplos.
La proporción de mezcla en la composición del disolvente se refiere a una proporción de volumen. Por ejemplo, "etanol/acetato de etilo = 90/10" se refiere a etanol al 90 %/acetato de etilo al 10 % en una relación en volumen.
(Ejemplo 1)
a) Preparación de la fase oleosa
Se mezclaron fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y colesterol en una proporción molar que se muestra en la Tabla 1 hasta un total de 6,38 mmol, y a continuación se añadieron 15 ml de un disolvente orgánico (etanol/acetato de etilo = 1/1), seguido de calentamiento hasta 70 °C y disolución de los lípidos para preparar una fase oleosa.
[Tabla 1]
Figure imgf000014_0002
b) Preparación de la fase acuosa
El clorhidrato de gemcitabina se disolvió a 8 mg/ml usando agua para inyección y 10xPBS (fabricado por GIBCO, Life Technologies). En ese momento, la presión osmótica se ajustó a 840 mOsmol/l mediante la proporción de agua para inyección: 10xPBS (fabricado por GIBCO, Life Technologies).
c) Etapa de encapsulación del fármaco realizada simultáneamente con la formación de partículas de liposomas por emulsificación
La fase acuosa preparada en b) se calentó a 70 °C, la fase oleosa se añadió de tal manera que se lograra una relación volumétrica fase acuosa/fase oleosa = 8/3, y a continuación se mezclaron usando una máquina de emulsificación de tipo agitación rotatoria (Excel Auto homogeneizer ED-3, fabricado por NIHONSEIKI KAISHA LTD.) a 3000 rpm durante 10 minutos, seguido de mezcla a 6000 rpm durante 10 minutos y a continuación 12000 rpm durante 10 minutos. Seguidamente, se añadieron 0,34 mmol de sal sódica de N- (carbonil-metoxipolietilenglicol 2000)-1,2-diestearoil-snglicero-3-fosfoetanolamina (en lo sucesivo, denominada DSPE-PEG) como una solución acuosa de tal manera que la relación molar de la suma de fosfatidilcolina de soja hidrogenada y colesterol: DSPE-PEG era 95/5. Posteriormente, el disolvente orgánico y el agua se evaporaron mediante agitación continua mientras se mantenía el calentamiento a 70 °C y se añadió agua correspondiente a la cantidad de agua evaporada. A esto le siguió el sellado, manteniendo a 70 °C durante 70 minutos y enfriando lentamente a temperatura ambiente. La presión osmótica de cada formulación en este momento es de 840 mOsmol/l. La presión osmótica en este momento se convierte en una presión osmótica de la fase acuosa interna del liposoma con el fármaco encapsulado a completar. Posteriormente, el dimensionado se llevó a cabo pasando secuencialmente las partículas de liposoma resultantes a través de un filtro de 0,2 |jm y un filtro de 0,05 jm utilizando una extrusora (Mini Extruder, fabricada por Avanti Polar Lipids) con calentamiento a una temperatura de 70 °C a 80 °C, preparando de este modo un líquido de liposoma con un fármaco encapsulado.
d) Elaboración de la composición liposomal mediante diálisis
Se preparó como líquido de diálisis 10xPBS (pH 7,4) (fabricado por NIPPON GENE CO., LTD.) diluido 10 veces (en volumen). La presión osmótica de este líquido fue 307 mOsm/l. La presión osmótica se convierte en una presión osmótica de la fase acuosa externa del liposoma con el fármaco encapsulado a completar. Utilizando este líquido de diálisis, se llevó a cabo la diálisis a temperatura ambiente para eliminar el clorhidrato de gemcitabina no encapsulado y los solutos individuales presentes en la fase acuosa externa del liposoma líquido con fármaco encapsulado, y la fase acuosa externa se reemplazó con el líquido de diálisis.
Medición del tamaño promedio de partícula
Se midió un tamaño promedio de partícula en volumen de una muestra diluida 1000 veces (en peso) con 1xPBS (fabricado por NIPPON GENE CO., LTD.) mediante un método de dispersión de luz dinámica usando un nano track UPA-UT (fabricado por Nikkiso Co., Ltd.). Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Figure imgf000014_0001
Medición del mantenimiento de la estabilidad durante la conservación del fármaco
Las composiciones liposomales de los Ejemplos 1-1 a 1-5 se almacenaron a 5 °C y 25 °C durante una semana, y a continuación se midió el rendimiento de retención de un fármaco en una fase acuosa interna cuantificando la cantidad de fármaco presente en una fase acuosa externa. Después de una semana desde el inicio del almacenamiento, se diluyeron 100 j l de la muestra 10 veces (en volumen) con agua, y a continuación se sometió a filtración centrífuga en las condiciones de 7400xg, 30 minutos a 4 °C, utilizando un filtro de ultrafiltración (Amicon Ultra-0,5 10kDa, fabricado por Merck Millipore Corporation). La cantidad de fármaco contenido en el filtrado recuperado se cuantificó mediante HPLC, y la proporción de abundancia (porcentaje de la fase acuosa externa) del fármaco presente en la fase acuosa externa se calculó mediante la siguiente ecuación.
Ecuación: Porcentaje de fase acuosa externa (%)=(concentración de fármaco en el filtradox10)/concentración de fármaco en la formulaciónx100
Los resultados se muestran en la Fig. 1.
Como se muestra en la Fig. 1, se encontró que una formulación que contiene colesterol en una cantidad de 10 a 38 % en moles retiene de manera estable un fármaco encapsulado y, sorprendentemente, el rendimiento de retención mejora significativamente en el Ejemplo 1-4 con un contenido de colesterol de 19 % en moles.
(Ejemplo 2)
a) Preparación de la fase oleosa
Se mezclaron fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y colesterol en una proporción molar que se muestra en la Tabla 3 hasta un total de 2,85 mmol, y a continuación se añadieron 15 ml de un disolvente orgánico (etanol/acetato de etilo=1/1), seguido de calentamiento hasta 70 °C y disolución de los lípidos para preparar una fase oleosa.
T l
Figure imgf000015_0001
b) Preparación de la fase acuosa
El clorhidrato de gemcitabina se disolvió a 8 mg/ml usando agua para inyección y 10xPBS (pH 7,4) (fabricado por NIPPON GENE CO., LTD). En ese momento, la presión osmótica se ajustó a 500 mOsmol/l mediante la proporción de agua para inyección: 10xPBS (pH 7,4) (fabricado por NIPPON GENE CO., LTD.).
c) Etapa de encapsulación del fármaco realizada simultáneamente con la formación de partículas de liposomas por emulsificación
La fase acuosa preparada en b) se calentó a 70 °C, la fase oleosa se añadió de tal manera que se lograra una relación volumétrica fase acuosa/fase oleosa = 8/3, y a continuación se mezclaron usando una máquina de emulsificación de tipo agitación rotatoria (Excel Auto homogeneizer ED-3, fabricado por NIHONSEIKI KAISHA LTD.) a 3000 rpm durante 10 minutos, seguido de mezcla a 6000 rpm durante 10 minutos y a continuación 12000 rpm durante 10 minutos. Seguidamente, se añadieron 0,15 mmol de DSPE-PEG como una solución acuosa de tal manera que la relación molar de la suma de fosfatidilcolina de soja hidrogenada y colesterol:DSPE-PEG era 95/5. Posteriormente, el disolvente orgánico y el agua se evaporaron mediante agitación continua mientras se mantenía el calentamiento a 70 °C, y la evaporación se interrumpió deteniendo el calentamiento y la agitación en el momento en que la presión osmótica alcanzó de 1090 a 1200 mOsmol/l. La presión osmótica en este momento se convierte en una presión osmótica de la fase acuosa interna del liposoma con el fármaco encapsulado a completar. Posteriormente, el dimensionado se llevó a cabo pasando secuencialmente las partículas de liposoma resultantes a través de un filtro de 0,2 |jm y un filtro de 0,05 jm utilizando una extrusora (Mini Extruder, fabricada por Avanti Polar Lipids) con calentamiento a una temperatura de 70 °C a 80 °C.
d) Elaboración de la composición liposomal mediante diálisis
Se preparó una solución acuosa de sacarosa 275 mM/histidina 10 mM como líquido de diálisis. La presión osmótica calculada a partir de la concentración molar de soluto de este líquido fue de 285 mOsm/l. La presión osmótica se convierte en una presión osmótica de la fase acuosa externa del liposoma con el fármaco encapsulado a completar. Utilizando este líquido de diálisis, se llevó a cabo la diálisis a temperatura ambiente para eliminar el clorhidrato de gemcitabina no encapsulado y los solutos individuales presentes en la fase acuosa externa del liposoma líquido con la carga de fármaco, y la fase acuosa externa se reemplazó con el líquido de diálisis.
Medición del tamaño promedio de partícula
El tamaño promedio de partícula se determinó midiendo un tamaño promedio de partícula acumulado de una muestra diluida 100 veces (en peso) con 1xPBS (fabricado por NIPPON Ge Ne CO., LTD.) mediante un método de dispersión de luz dinámica usando un FPAR1000AS (fabricado por Otsuka Electronics Co., Ltd.). Los resultados se muestran en la Tabla 4.
T l 41
Figure imgf000016_0001
Medición del mantenimiento de la estabilidad durante la conservación del fármaco
Las composiciones liposomales de los Ejemplos 2-1 a 2-6 se almacenaron a 5 °C y 25 °C durante una semana, y a continuación se midió un porcentaje de la fase acuosa externa de la misma manera que en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Fig. 2.
En la Fig. 2, se encontró que un contenido de colesterol del 19 % en moles es óptimo para el rendimiento de retención. Se sabe que la membrana de la bicapa lipídica muestra un cambio en el estado de fase de la membrana y una fluidez creciente a partir de la cual el contenido de colesterol es superior al 20 % en moles. En general, se ha considerado que, en la zona límite de un estado de fase de aproximadamente 20 % en moles, una estructura de membrana se vuelve inestable y resulta difícil de retener un fármaco encapsulado. Por lo tanto, los resultados anteriores de la presente invención son inesperados.
Medición de la tasa de liberación en el plasma sanguíneo
Se diluyeron 50 pl de cada una de las composiciones liposomales de los Ejemplos 2-1 a 2-620 veces (en volumen) con plasma sanguíneo de ratón, y se incubó a 37 °C durante 24 horas, seguido de la extracción de 100 pl a las 0, 1, 4, 9, y 24 horas. Posteriormente, se llevó a cabo la filtración centrífuga en las condiciones de 7400xg, 30 minutos a 4 °C, utilizando un filtro de ultrafiltración (Amicon Ultra-0,5 10kDa, fabricado por Merck Millipore Corporation). La cantidad de fármaco contenido en el filtrado recuperado se cuantificó mediante HPLC, y el porcentaje de la fase acuosa externa se calculó mediante la siguiente ecuación.
Ecuación: Porcentaje de fase acuosa externa (%)=(cantidad de fármaco en el filtrado en cada punto temporal de incubación-cantidad de fármaco en el filtrado antes de la incubación)x20/cantidad de fármaco contenido en la fase acuosa interna de la composición liposomalx100
Los resultados del cambio dependiente del tiempo que indica una tasa de liberación en el plasma sanguíneo se muestran en la Fig. 3. La Fig. 3 se proporciona con el número de ejemplo y el contenido de colesterol.
En la Fig. 3, puede verse que la liberación de fármaco en el plasma sanguíneo aumenta con un contenido de colesterol del 25 % en moles. Asimismo, el contenido de colesterol tuvo un efecto significativo sobre la estabilidad durante la conservación a 25 °C durante una semana como se muestra en la Fig. 2. El fármaco era estable, en particular, con un contenido de colesterol de 19 % en moles, pero no hubo un efecto significativo de tal contenido de colesterol sobre la estabilidad en el plasma sanguíneo. Esto demuestra que es posible mejorar la capacidad de retención durante el almacenamiento sin modificar la capacidad de liberación de un fármaco en el plasma sanguíneo, lo que, por lo tanto, se convertirá en un método de control muy útil para uso práctico.
(Ejemplo 3)
a) Preparación de la fase oleosa
Se preparó 1,79 g de fosfatidilcolina de soja hidrogenada y 0,22 g de colesterol en una relación molar de 76/19, y a continuación se añadieron a estos 15 ml de un disolvente orgánico (etanol/acetato de etilo=1/1), seguido de calentamiento hasta 70 °C y disolución de los lípidos para preparar una fase oleosa.
b) Preparación de la fase acuosa
El clorhidrato de gemcitabina se disolvió a 8 mg/ml usando agua para inyección y 10xPBS (fabricado por GIBCO, Life Technologies). En ese momento, la presión osmótica se ajustó al valor que se muestra en la Tabla 5 cambiando la proporción de agua para inyección: 10xPBS (fabricado por GIBCO, Life Technologies).
T l 1
Figure imgf000016_0002
c) Etapa de encapsulación del fármaco realizada simultáneamente con la formación de partículas de liposomas por emulsificación
La fase acuosa se calentó a 70 °C, la fase oleosa se añadió de tal manera que se lograra una relación volumétrica fase acuosa/fase oleosa = 8/3, y a continuación se mezclaron usando una máquina de emulsificación de tipo agitación rotatoria (Excel Auto homogeneizer ED-3, fabricado por NIHONSEIKI KAISHA LTD.) a 3000 rpm durante 10 minutos, seguido de mezcla a 6000 rpm durante 10 minutos y a continuación 12000 rpm durante 10 minutos. Seguidamente, se añadieron 0,41 g de DSPE-PEG como una solución acuosa de tal manera que la relación molar de fosfatidilcolina de soja hidrogenada:colesterol:DSPE-PEG era 76/19/5. Posteriormente, el disolvente orgánico y el agua se evaporaron mediante agitación continua mientras se mantenía el calentamiento a 70 °C, y la evaporación se interrumpió deteniendo el calentamiento y la agitación en el momento en el que se alcanzó la presión osmótica mostrada en la Tabla siguiente. La presión osmótica en este momento se convierte en una presión osmótica de la fase acuosa interna del liposoma con el fármaco encapsulado a completar. Posteriormente, el dimensionado se llevó a cabo pasando secuencialmente las partículas de liposoma resultantes a través de un filtro de 0,2 |jm y un filtro de 0,05 jm utilizando una extrusora (Mini Extruder, fabricada por Avanti Polar Lipids) con calentamiento a una temperatura de 70 °C a 80 °C.
Figure imgf000017_0001
d) Elaboración de la composición liposomal mediante diálisis
Se preparó como líquido de diálisis 10xPBS (pH 7,4) (fabricado por NIPPON GENE CO., LTD.) diluido 10 veces (en volumen) con agua. La presión osmótica calculada a partir de la concentración molar de soluto de este líquido fue de 307 mOsm/l. La presión osmótica se convierte en una presión osmótica de la fase acuosa externa del liposoma con el fármaco encapsulado a completar. Utilizando este líquido de diálisis, se llevó a cabo la diálisis a temperatura ambiente para eliminar el clorhidrato de gemcitabina no encapsulado y los solutos individuales presentes en la fase acuosa externa del liposoma líquido con la carga de fármaco, y la fase acuosa externa se reemplazó con el líquido de diálisis.
Medición de la tasa de liberación en el plasma sanguíneo
Se diluyeron 50 j l de la composición liposomal del Ejemplo 120 veces (en volumen) con plasma sanguíneo de ratón, y se incubó a 37 °C durante 24 horas, seguido de la extracción de 100 j l a las 0, 1,4, 9, y 24 horas. Posteriormente, se llevó a cabo la filtración centrífuga en las condiciones de 7400xg, 30 minutos a 4 °C, utilizando un filtro de ultrafiltración (Amicon Ultra- 0,5 10kDa, fabricado por Merck Millipore Corporation). La cantidad de fármaco contenido en el filtrado recuperado se cuantificó mediante HPLC, y el porcentaje de la fase acuosa externa se calculó mediante la siguiente ecuación.
Ecuación: Porcentaje de fase acuosa externa (%)=(cantidad de fármaco en el filtrado en cada punto temporal de incubación-cantidad de fármaco en el filtrado antes de la incubación)x20/cantidad de fármaco contenido en la fase acuosa interna de la composición liposomalx100
Los resultados del cambio dependiente del tiempo que indica una tasa de liberación en el plasma sanguíneo se muestran en la Fig. 4.
De los resultados de la Fig. 4, se encontró que la tasa de liberación en el plasma sanguíneo puede controlarse arbitrariamente ajustando la presión osmótica de la fase acuosa interna a la fase acuosa externa, en la proporción de colesterol de la presente invención.
Como puede verse a partir de los resultados mostrados anteriormente, es posible proporcionar una composición liposomal que encapsule un fármaco soluble en agua en un estado disuelto y que también presente una excelente estabilidad durante la conservación incluso en las condiciones en las que la presión osmótica de una fase acuosa interna es de 2 a 8 veces con respecto a la presión osmótica de una fase acuosa externa.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una composición liposomal, que comprende:
liposomas, cada uno de los cuales tiene una fase acuosa interna y una solución acuosa que constituye una fase acuosa externa y en la cual están dispersados los liposomas,
en donde el contenido de colesteroles es del 15 % en moles al 25 % en moles con respecto a la cantidad total de componentes lipídicos en la composición liposomal, y
cada uno de los liposomas encapsula un fármaco en estado disuelto, y la presión osmótica de la fase acuosa interna es de 2 a 8 veces con respecto a la presión osmótica de la fase acuosa externa,
en donde los lípidos que constituyen el liposoma incluyen al menos fosfatidilcolina de soja hidrogenada, 1,2-diestearoil-3-fosfatidiletanolamina-polietilenglicol y colesterol, y en donde un tamaño promedio de partícula de los lisosomas es de 5 nm a 100 nm.
2. La composición liposomal de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el liposoma es una única lamela.
3. La composición liposomal de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde una tasa de liberación de un fármaco de la composición liposomal en el plasma sanguíneo es del 10 % en peso/24 h o más con respecto a la cantidad de encapsulación inicial en la composición liposomal.
4. La composición inmunógena de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el fármaco es gemcitabina.
5. Una composición farmacéutica que comprende la composición liposomal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un método para producir una composición liposomal, que comprende:
una etapa de emulsificación de emulsificación de lípidos disueltos en un disolvente orgánico para formar liposomas, sin una etapa de secado y solidificación;
una etapa de carga de fármaco para encapsular un fármaco soluble en agua en los liposomas obtenidos en la etapa de emulsificación; y una etapa de ajuste de la presión osmótica para reemplazar una solución acuosa de fármaco sin encapsular con una solución hipoosmótica para ajustar la presión osmótica de una fase acuosa interna para que sea hiperosmótica en relación con la presión osmótica de una fase acuosa externa,
en donde la etapa de emulsificación de emulsificación de los lípidos para formar los liposomas ajusta el contenido de colesteroles del 15 % en moles al 25 % en moles con respecto a la cantidad total de los componentes lipídicos en la composición liposomal, y la etapa de ajuste de la presión osmótica ajusta la presión osmótica de la fase acuosa interna del liposoma de 2 a 8 veces con respecto a la presión osmótica de la fase acuosa externa, y en donde los lípidos que constituyen el liposoma incluyen al menos fosfatidilcolina de soja hidrogenada, 1,2-diestearoil-3-fosfatidiletanolamina-polietilenglicol y colesterol.
7. El método de producción de una composición liposomal de acuerdo con la reivindicación 6, en donde los liposomas obtenidos después de la etapa de emulsificación se utilizan en una etapa siguiente sin procesamiento de extrusión.
8. El método para la producción de una composición liposomal de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, en donde la etapa de carga del fármaco y la etapa de ajuste de la presión osmótica se llevan a cabo simultáneamente.
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