JPWO2006137377A1

JPWO2006137377A1 - 神経再生促進剤

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Publication number: JPWO2006137377A1
Application number: JP2007522283A
Authority: JP
Inventors: 真久山田; 瑠奈新家; 治夫岸田; 健太朗小暮; 原島　秀吉; 秀吉原島; 裕司三品
Original assignee: Hokkaido University NUC; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Hokkaido University NUC; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2005-06-22
Filing date: 2006-06-20
Publication date: 2009-01-22
Also published as: WO2006137377A1; US20100292454A1

Abstract

本発明の目的は、新規な神経再生促進剤、特に、グリア瘢痕形成の阻害作用を有する神経再生促進剤を提供することである。本発明によれば、骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の阻害剤を有効成分として含む、神経再生促進剤が提供される。

Description

本発明は、神経再生促進剤に関する。具体的には、本発明は、ＢＭＰ受容体の機能の抑制剤を用いた神経再生促進剤に関する。

神経細胞は、生体において分裂能を持たない組織であるため、障害を受けると長期にわたってその障害が持続する。特に、脳や脊髄等の中枢神経系では再生能がない。そのため、脊髄損傷等の外因性傷害、並びにアルツハイマー病又はパーキンソン病等の神経変性疾患に対する有効な治療方法は未だ存在しない。一方、末梢神経は再生能を有しているが、再生には数ヶ月から１年以上の時間を要し、更に再生に長期間を要するために、その間に神経細胞が死滅し、機能回復に至らない場合がある。この回復期にアストロサイトと呼ばれる神経系細胞が反応性アストロサイトという増殖盛んな細胞に変化し、組織内にグリア瘢痕を形成する。これが、障害となって再生神経軸索の再投射を妨げる。従って、グリア瘢痕形成を阻害できる新規な薬剤の開発が望まれている。

グリア瘢痕形成の阻害は、神経組織再生技術の確立に必須である。現在、Ｘ線照射による細胞増殖の抑制、並びに幹細胞移植などの技術がある。Ｘ線照射は、その照射量に限界があり、人への応用は技術的問題がある。また、幹細胞移植は、動物実験までは有効であるが、人への応用は様々な問題がある。胚性幹（ＥＳ）細胞は、受精卵のクローニングによって得られるが、受精卵の入手の困難性が問題となる。さらに、ＥＳ細胞の使用に関しては、特にヒトでは倫理上の問題がある。また、ＥＳ細胞に代わる成体幹細胞としては、骨髄の未分化間葉系幹細胞（ＭＳＣ）がある。ＭＳＣは、骨、軟骨、筋肉、脂肪、血管、さらには神経にも分化することが判明しており、また患者本人からの採取が可能であることから、ＭＳＣの臨床上の価値は、ＥＳ細胞よりも高いと考えられている。しかし、ＭＳＣには、成体内に微量しか存在しないこと、特に、加齢に伴いこの傾向が激しくなることなどの問題点がある。

一方、骨形成因子（ＢｏｎｅＭｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃＰｒｏｔｅｉｎ）は、異所性の骨形成を引き起こす骨基質に存在する蛋白質として命名されたものであり、その遺伝子配列も解明され、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーであることが明らかになっている。また、骨形成因子の受容体についてもこれまで幾つかの報告がある（ＭｉｓｈｉｎａＹ．（２００３）Ｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｉｇｎａｌｉｎｇｄｕｒｉｎｇｍｏｕｓｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＦｒｏｎｔＢｉｏｓｃｉ．８，８５５−８６９）。骨形成因子の受容体の遺伝子はクローニングされており、その塩基配列は、データベースに登録されている（ＭｏｕｓｅＢＭＰＲ１Ａ：ＮＭ＃００９７５８；ＲａｔＢＭＰＲ１Ａ：ＮＭ＃０３０８４９；及び、ＨｕｍａｎＢＭＰＲ１Ａ：ＮＭ＃００４３２９）。

本発明は、新規な神経再生促進剤、特に、グリア瘢痕形成の阻害作用を有する神経再生促進剤を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、骨形成因子１Ａ型受容体を特異的に抑制することによって、グリア瘢痕の形成を阻害できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の阻害剤を有効成分として含む、神経再生促進剤が提供される。

好ましくは、骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の阻害剤は、骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の発現を阻害する物質である。
さらに好ましくは、骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の発現を阻害する物質は、骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の発現をＲＮＡｉにより阻害する物質である。
特に好ましくは、骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の発現をＲＮＡｉにより阻害する物質は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するｓｉＲＮＡである。

好ましくは、本発明の神経再生促進剤は、グリア瘢痕形成を阻害することによって神経再生を促進する。

本発明の別の側面によれば、骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の阻害剤の治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む、神経再生を促進する方法が提供される、

本発明のさらに別の側面によれば、神経再生促進剤の製造のための、骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の阻害剤の使用が提供される。

以下、本発明の実施の形態について説明する。
神経系組織において、グリア瘢痕の形成に顕著の阻害効果を示し、神経細胞へ細胞死などの副作用の影響が無いことが望まれていた。骨形成因子（ＢＭＰ）には神経突起を伸長させる効果があると報告されていることから、神経細胞への影響が少なく、グリア細胞の増殖を抑制する効果の高い物質の開発が望まれていた。ＢｏｎｅＭｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃＰｒｏｔｅｉｎｔｙｐｅＩＡｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＢＭＰＲ１Ａ）遺伝子を神経細胞とグリア細胞で破壊することが可能なマウスの作製から、ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子がこの効果があることが分かった。そこで、本発明者らは、ｓｉＲＮＡなどＢＭＰＲ１Ａ遺伝子を特異的に制御する物質やＢＭＰＲ１Ａ特異的な拮抗剤がグリア瘢痕形成に阻害効果を持つ可能性を見出し、ｓｉＲＮＡを用いた実施例を示した。

また、ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡは、本発明者らが開発した「エンベロープ型ナノ構造リポソーム」（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌｕｍｅ９８，Ｉｓｓｕｅ２，１１Ａｕｇｕｓｔ２００４，Ｐａｇｅｓ３１７−３２３，″Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎｏｎ−ｖｉｒａｌｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｔｙｐｅｎａｎｏｄｅｖｉｃｅｂｙａｎｏｖｅｌｌｉｐｉｄｆｉｌｍｈｙｄｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ″；及び特願２００５−６１６８７号明細書を参照）中に封入することも可能である。この「エンベロープ型ナノ構造リポソーム」による遺伝子導入法は従来の方法に比べ、細胞毒性が少なく、さらに高効率の遺伝子導入が可能である。増殖細胞にのみ遺伝子を導入できることから、遺伝子導入の目標細胞を限定することが可能となった。従って、増殖するグリア細胞の核へ遺伝子導入されて、グリア瘢痕形成を阻害することが可能である。

ウイルス遺伝子ベクターは、病原性・免疫原性等、生体に用いるには危険性が大きすぎる。そのため非ウイルス性の遺伝子ベクターが望まれている。従来の非ウイルス性遺伝子ベクター（主にリポプレックス）は、１）カチオン脂質のために毒性が高い、２）エンドサイトーシス経路で取り込まれるため分解されやすい、３）導入細胞が不均一である、等の問題があった。しかし、本発明で用いるベクター（エンベロープ型ナノ構造リポソーム）は、エンベロープ型ウイルスを模倣した構造を有しており、表面に多機能性ペプチドであるアルギニン８重合体が配置されており、このような特殊な構造によって、１）カチオン脂質を用いていないため毒性が低い、２）非エンドサイトーシス経路で取り込まれるため分解されにくく効率よく細胞質・核に送達される、３）他の実験から７０％以上の細胞に遺伝子導入が可能、等の利点を有しており、従来のものと大きく異なる。

本発明による神経再生促進剤を適用できる神経疾患の具体例としては、脊髄損傷等の外因性傷害、並びにアルツハイマー病又はパーキンソン病等の神経変性疾患などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）は、骨形成因子の受容体の１種であり、その遺伝子の塩基配列はすでに報告されている（ＭｏｕｓｅＢＭＰＲ１Ａ：ＮＭ＃００９７５８；ＲａｔＢＭＰＲ１Ａ：ＮＭ＃０３０８４９；及び、ＨｕｍａｎＢＭＰＲ１Ａ：ＮＭ＃００４３２９）。ヒト、マウス及びラットのＢＭＰ受容体ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号２〜４に示す。

本発明で用いる骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の阻害剤としては、ＢＭＰＲ１Ａの発現を阻害する物質、ＢＭＰＲ１Ａに作用してＢＭＰＲ１Ａの活性及び機能を阻害する物質、又はＢＭＰＲ１ＡとＢＭＰとの会合を阻害する物質等が含まれる。本明細書において、「阻害」との用語は、抑制又は低減との意味を含む。

ＢＭＰＲ１Ａの発現を阻害する物質としては、ＲＮＡｉ、アンチセンス法又はリボザイム法を利用した物質等が挙げられ、特に限定されないが、ＲＮＡｉを利用したｓｉＲＮＡｓが好ましい。ＢＭＰＲ１Ａに作用してＢＭＰＲ１Ａの活性及び機能を阻害する物質としては、低分子化合物及び抗体等が挙げられる。ＢＭＰＲ１ＡとＢＭＰとの会合を阻害する物質としては、低分子化合物、抗体、又はペプチドなどを用いることができる。

抗体としては、例えば、ＢＭＰＲ１Ａの全長又は部分配列を有するペプチドを免疫源として作製した抗体を用いることができる。全長のＢＭＰＲ１Ａとしては、例えば組み換えＢＭＰＲ１Ａ等を用いることができる。抗体の作製は慣用の方法に従って行えばよい。抗体はモノクローナル抗体が好ましい。ペプチドとしては、例えば、ＢＭＰＲ１Ａの部分配列を有するペプチド等が挙げられる。

ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、細胞に導入された２本鎖ＲＮＡが、同じ配列を持つ遺伝子の発現を抑制する現象を言う。ＲＮＡｉによりＢＭＰＲ１Ａの発現を阻害する物質の具体例としては、下記に説明するようなｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ等が挙げられる。

ｓｉＲＮＡとはｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡの略称であり、約２１〜２３塩基程度の長さの二本鎖ＲＮＡをいう。ｓｉＲＮＡはＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよく、例えば、化学合成もしくは生化学的合成、又は生物体内の合成で得られたｓｉＲＮＡ、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡ等であればよい。ｓｉＲＮＡの配列と、ＢＭＰＲ１ＡのｍＲＮＡの部分配列とは１００％一致することが好ましいが、必ずしも１００％一致していなくてもよい。

ｓｉＲＮＡの塩基配列と、ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。相同性を有する配列は、ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、７０塩基離れていることがより好ましい。相同性を有する配列としては、例えば、ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の３’末端付近の配列でもよい。

ＲＮＡｉによりＢＭＰＲ１Ａの発現を阻害する物質としては、ｓｉＲＮＡを生成する約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ等を用いてもよい。例えば、ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の核酸配列の一部に対して約７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する配列を含む、二本鎖部分を含むＲＮＡ又はその改変体を使用することができる。相同性を有する配列部分は、通常は、少なくとも１５ヌクレオチド以上であり、好ましくは約１９ヌクレオチド以上であり、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド以上であり、さらに好ましくは２１ヌクレオチド以上である。

ＲＮＡｉによりＢＭＰＲ１Ａの発現を阻害する物質としては、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）を使用することもできる。ｓｈＲＮＡとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことである。また、ｓｈＲＮＡとしては３’突出末端を有するのが好ましい。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは２０ヌクレオチド以上である。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のＤＮＡであり、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチドのＤＮＡである。

ＲＮＡｉによりＢＭＰＲ１Ａの発現を阻害する物質は、人工的に化学合成してもよいし、センス鎖及びアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロでＲＮＡを合成することによって作製してもよい。インビトロで合成する場合は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及びＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンス及びセンスのＲＮＡを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、ＲＮＡｉが引き起こされ、ＢＭＰＲ１Ａの発現が抑制される。細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ等）を用いた方法等により行うことができる。

ＲＮＡｉによりＢＭＰＲ１Ａの発現を阻害する物質としては上述のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いてもよい。さらに該発現ベクターを含む細胞を用いてもよい。上記した発現ベクターや細胞の種類は特に限定されないが、既に医薬として用いられている発現ベクターや細胞が好ましい。

本発明の神経再生促進剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与等）のいずれの投与経路により投与してもよい。経口投与に適する製剤形態としては、固形又は液体の形態が挙げられ、非経口投与に適する製剤形態としては、注射剤、点滴剤、坐剤、外用剤、点眼剤、点鼻剤等の形態が挙げられる。本発明の神経再生促進剤は徐放剤の製剤形態であってもよい。本発明の神経再生促進剤は、その製剤形態により必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤が加えられていてもよい。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、着色剤、矯味剤、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤及び／又は薬学的アジュバント等が挙げられる。

経口用の固形製剤形態の本発明の神経再生促進剤は、例えば、有効成分であるＢＭＰＲ１Ａ阻害剤に賦形剤を加え、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、又は矯味剤などの製剤用添加物を加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤として調製することができる。経口用の液体製剤形態の本発明の神経再生促進剤は、有効成分であるＢＭＰＲ１Ａ阻害剤に矯味剤、安定化剤、又は保存剤など製剤用添加物の１種又は２種以上を加え、常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等として調製することができる。

本発明の神経再生促進剤を液体製剤として処方するために使用される溶媒は、水性又は非水性のいずれでもよい。液体製剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、注射剤は、生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水等の溶剤に溶解した後、フィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプル等）に充填することにより調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。また、非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法を用いてもよい。本発明で用いることができるキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、又は血清アルブミンを含む生理食塩水等が挙げられる。

１型骨形成タンパク質受容体のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターなど遺伝子送達の種類に関しては、グリア瘢痕阻害剤が適用される動物の神経組織内で１型骨形成タンパク質受容体のｓｉＲＮＡをコードするＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターの発現を得る限り特に方法は限定されるものではなく、例えば、ウイルスベクター、リポソームを用いた遺伝子導入を用いる事が可能である。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、シンリンセムリキウイルス等の動物ウイルスが挙げられる。

毒性が少なくウイルス並に高い遺伝子導入効率を有する非ウイルス性遺伝子ベクターとして「エンベロープ型ナノ構造リポソーム」（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌｕｍｅ９８，Ｉｓｓｕｅ２，１１Ａｕｇｕｓｔ２００４，Ｐａｇｅｓ３１７−３２３，″Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎｏｎ−ｖｉｒａｌｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｔｙｐｅｎａｎｏｄｅｖｉｃｅｂｙａｎｏｖｅｌｌｉｐｉｄｆｉｌｍｈｙｄｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ″；及び特願２００５−６１６８７号明細書を参照）を用いることが望ましい。この方法は、安全で簡便・安価に神経損傷部位のグリア瘢痕への遺伝子導入を行うことが可能と考えられる。

以下、エンベロープ型ナノ構造リポソームについて説明する。エンベロープ型ナノ構造リポソームは、連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを表面に有していることが好ましい。

エンベロープ型ナノ構造リポソームは、脂質二重層膜構造を有する閉鎖小胞である限り、脂質二重層膜の数は特に限定されるものではなく、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であってもよいし、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌｕｎｉｌａｍｅｌｌａｖｅｈｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅｕｎｉｌａｍｅｌｌａｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔｕｎｉｌａｍｅｌｌａｖｅｈｉｃｌｅ）等の一枚膜リポソームであってもよい。

一枚膜リポソームについてはリポソーム膜の外表面がリポソームの表面であり、多重膜リポソームについては最外層のリポソーム膜の外表面がリポソームの表面である。リポソームは、表面以外の部分（例えば、リポソーム膜の内表面）にペプチドを有していてもよい。

リポソームのサイズは特に限定されるものではないが、直径５０〜８００ｎｍであることが好ましく、直径２５０〜４００ｎｍであることがさらに好ましい。

リポソーム膜を構成する脂質の種類は特に限定されるものではなく、その具体例としては、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン等のリン脂質又はこれらの水素添加物；スフィンゴミエリン、ガングリオシド等の糖脂質が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を用いることができる。リン脂質は、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン等）、合成脂質又は半合成脂質のいずれであってもよい。なお、リポソーム膜に含有される脂質量は、リポソーム膜を構成する総物質量の通常７０〜１００％（モル比）、好ましくは７５〜１００％（モル比）、さらに好ましくは８０〜１００％（モル比）である。

リポソーム膜には、リポソーム膜を物理的又は化学的に安定させたり、リポソーム膜の流動性を調節したりするために、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロール；グリセロール、シュクロース等の糖類；トリオレイン、トリオクタノイン等のグリセリン脂肪酸エステルのうち、１種又は２種以上を含有させることができる。その含有量は特に限定されるものではないが、リポソーム膜を構成する総脂質に対して５〜４０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましい。

リポソームの表面に存在するペプチドに含まれる連続したアルギニン残基の個数は複数個である限り特に限定されるものではないが、通常４〜２０個であり、好ましくは６〜１２個、さらに好ましくは７〜１０個である。上記ペプチドを構成するアミノ酸残基の個数は複数個である限り特に限定されるものではないが、通常４〜３５個であり、好ましくは６〜３０個、さらに好ましくは８〜２３個である。上記ペプチドは、連続した複数個のアルギニン残基のＣ末端及び／又はＮ末端の任意のアミノ酸配列を含むことができるが、ペプチドを構成する全てのアミノ酸残基がアルギニン残基であることが好ましい。

連続した複数個のアルギニン残基のＣ末端又はＮ末端に付加されるアミノ酸配列は、剛直性を有するアミノ酸配列（例えば、ポリプロリン）であることが好ましい。ポリプロリンは、柔らかくて不規則な形をとっているポリエチレングリコールと異なり、直線的で、ある程度の堅さを保持している。また、連続した複数個のアルギニン残基のＣ末端又はＮ末端に付加されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基は酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基であることが好ましい。負電荷を有する酸性アミノ酸残基が、正電荷を有するアルギニン残基と静電的に相互作用し、アルギニン残基の効果を減弱させる可能性があるためである。

リポソームの表面に存在するペプチドの量は、リポソーム膜を構成する総脂質に対して通常０．１〜３０％（モル比）、好ましくは１〜２５％（モル比）、さらに好ましくは２〜２０％（モル比）である。

本発明で用いるリポソームにおいては、リポソーム膜はカチオン性脂質及び非カチオン性脂質のいずれか一方で構成されていてもよいし、両方で構成されていてもよい。但し、カチオン性脂質は細胞毒性を有するので、本発明のリポソームの細胞毒性を低減させる点からは、リポソーム膜に含まれるカチオン性脂質の量をできる限り少なくすることが好ましく、リポソーム膜を構成する総脂質に対するカチオン性脂質の割合は０〜４０％（モル比）であることが好ましく、０〜２０％（モル比）であることがさらに好ましい。

カチオン性脂質としては、例えば、ＤＯＤＡＣ（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＤＡＢ（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ＤＭＲＩＡ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＯＳＰＡ（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）等が挙げられる。

非カチオン性脂質とは、中性脂質又はアニオン性脂質を意味し、中性脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド等が挙げられ、アニオン性脂質としては、例えば、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸等が挙げられる。

リポソームの好ましい態様としては、ペプチドが疎水性基で修飾されており、疎水性基が脂質二重層に挿入され、ペプチドが脂質二重層から露出しているリポソームを例示することができる。なお、本態様において、「ペプチドが脂質二重層から露出している」には、ペプチドが脂質二重層の外表面又は内表面のいずれか一方から露出している場合、両方から露出している場合が含まれる。

疎水性基は、脂質二重層に挿入され得る限り特に限定されるものでない。疎水性基としては、例えば、ステアリル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸基、コレステロール残基等のステロール残基、リン脂質残基、糖脂質残基、長鎖脂肪族アルコール残基（例えば、ホスファチジルエタノールアミン残基等）、ポリオキシプロピレンアルキル基、グリセリン脂肪酸エステル残基等が挙げられるが、これらのうち特に炭素数１０〜２０の脂肪酸基（例えば、パルミトイル基、オレイル基、ステアリル基、アラキドイル基等）が好ましい。

リポソームは、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて作製することができる。

水和法によるリポソームの製造例を以下に示す。
リポソーム膜の構成成分である脂質と、疎水性基で修飾されたペプチドとを有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；メタノール、エタノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、ペプチドを表面に有するリポソームを製造する。

また、水和法による別の製造例を以下に示す。
脂質二重層の構成成分である脂質を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得、この脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することによりリポソームを製造する。次いで、このリポソームの外液に、疎水性基で修飾されたペプチドを添加することにより、リポソームの表面にペプチドを導入することができる。

リポソームを所定のポアサイズのフィルターで通過させることにより、一定の粒度分布を持ったリポソームを得ることができる。また、公知の方法に従って、多重膜リポソームから一枚膜リポソームへの転換、一枚膜リポソームから多重膜リポソームへの転換を行うことができる。

ＲＮＡｉによりＢＭＰＲ１Ａの発現を阻害する物質は、生体の器官や組織等に直接注入してもよい。

本発明の神経再生促進剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分であるＲＮＡｉによりＢＭＰＲ１Ａの発現を阻害する物質の種類等を考慮して、当業者が決定することができる。本発明の神経再生促進剤の投与量は、有効成分がＲＮＡｉによりＢＭＰＲ１Ａの発現を阻害する物質である場合、例えば、有効成分量として、成人一人当たり、約０．１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｎｇ〜約１０ｍｇであり、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターとして投与される場合は、通常、０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１ｍｇである。

本発明の神経再生促進剤の投与頻度は、例えば、一日一回〜数ヶ月に１回であればよい。ＲＮＡｉによりＢＭＰＲ１Ａの発現を阻害する物質を用いる場合は一般に投与後１〜３日間効果が見られるので、毎日〜３日に１回の頻度で投与することが好ましい。発現ベクターを用いる場合には１週間に１回程度の投与が適する場合もある。

実施例１
＜実験方法＞
全部で２Ｘ１０^５個のマウス初代培養アストロサイトをコラーゲンで被覆した６穴プレート上にプレートし、その翌日、細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ^ＴＭ２０００Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて添付の説明書に従ってトランスフェクションした。簡単に言うと、８０ｐｍｏｌのＢＭＰＲ１ＡｓｉＲＮＡ（ＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＵＣＵＡＧＡＵＡＧＵＡ：配列番号１）（配列番号３の塩基配列の６５〜８５番目に相当）又はＬａｍｉｎＡ／ＣｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）と混合し、４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ^ＴＭ２０００Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。２０分間インキュベート後、ｓｉＲＮＡ−ｌｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を、８００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと一緒に各ウェルに適用した。

トランスフェクションの３日後、６穴プレート上のコンフルエントに培養された細胞から、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。その後、ｔｏｔａｌＲＮＡ２μｇを用いて、ＴａｑＭａｎｒｅａｌｔｉｍｅＲＴ−ＰＣＲを行った。表１は、４サンプルの平均値を示す。

表１の結果から、マウスアストロサイト初代培養系において、ＢＭＰＲ１ＡｓｉＲＮＡによりＢＭＰＲ１ＡｍＲＮＡの発現量が約１６％まで抑えられていることが示された。

実施例２：
＜実験方法＞
ＢＭＰＲ１Ａ受容体の遺伝子発現を抑制する効果をもつｓｉＲＮＡをコンフルエントに培養されたアストロサイトにリポフェクションにより遺伝子導入を行った。３日後、針でアストロサイトをスクラッチして、グリア瘢痕形成実験をおこなった。細胞の核染色（青）と増殖細胞を示すＢｒｏｍｏ−２−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ；赤）、およびＧＦＰ標識されたｓｉＲＮＡ（緑）の蛍光染色により、アストロサイト増殖の阻害活性を測定した。実験方法を以下の（１）〜（４）に示す。

（１）初代マウスグリア細胞の培養
分離した大脳皮質細胞の初代アストログリア細胞培養物を、Ｅ１７マウス（ＩＣＲ：日本ＳＬＣ）の脳より調製した。大脳皮質由来の組織片を、０．２５％のトリプシン（ＧＩＢＣＯ）及びＤＮａｓｅＩ（１００ｕｎｉｔｓ；ベーリンガーマンハイム）を含むＣａ^２＋及びＭｇ^２＋フリーのＰＢＳ（５ｍｌ）中において３７℃で１５分間インキュベーションした。ピペッティングにより機械的に分離した後、細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に再懸濁した。分離した細胞をポリエチレンイミンで被覆したフラスコ上に置いて、７日間培養した後、細胞をポリエチレンイミンで被覆したディッシュ上に３×１０^４細胞／ｃｍ^２の最終細胞密度で再度プレーティングし、２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中でさらに６日間培養した。

（２）ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
全部で５×１０^４個の細胞をコラーゲンで被覆した４８穴プレート上にプレートし、その翌日、細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて添付の説明書に従ってトランスフェクションェンした。簡単に言うと、２０ｐｍｏｌのＢＭＰＲ１ＡｓｉＲＮＡ（ＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＵＣＵＡＧＡＵＡＧＵＡ：配列番号１）又はＬａｍｉｎＡ／ＣｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）及び１０ｐｍｏｌのＢＬＯＣＫ−ｉＴ^ＴＭＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＯｌｉｇｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）と混合し、０．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００Ｒｅａｇｅｎｔを添加し、２０分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ−ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を、２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと一緒に各ウエルに適用した。

（３）細胞増殖アッセイ
トランスフェクションの３日後、４８穴プレート上のコンフルエントに培養された細胞を、２．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で０．１％（Ｖ／Ｖ）の標識試薬（Ｌａｂｅｌｌｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ）（ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＫＩＴ，ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりスクラッチングすることにより損傷させた。翌日、細胞を固定し、免疫染色を行った。

（４）免疫染色
免疫細胞化学分析のために、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、９０％エタノール、５％酢酸で３０分間処理し、それから２％Ｈ_２Ｏ_２（メタノール中）中で３０分間インキュートした。５％正常ヤギ血清（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．）及び０．０１％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳでブロッキングした後、細胞を抗ブロモデオキシウリジン抗体（マウスモノクローナル抗体、ＲＰＮ２０２，ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と一緒にインキュベートした。本実験では、Ａｌｅｘａ５４６を結合させた抗マウス抗体（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を二次抗体として使用した。洗浄後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８に露出し、非共焦点の蛍光顕微鏡（ＩＸ７１，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて分析した。

＜実験結果＞
実験結果を図１に示す。図１の結果から、ＢＭＰＲ１Ａに特異的なｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合は、ブロモデオキシウリジン陽性細胞の比率が低下したことから、アストロサイト増殖が阻害されることが示された。上記の実験結果から、ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏにおけるグリア瘢痕形成を有意に阻害することが実証された。

図１は、非特異的なｓｉＲＮＡ又はＢＭＰＲ１Ａに特異的なｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合におけるアストロサイト増殖の阻害活性を測定した結果を示す。

本発明により、グリア瘢痕形成の阻害作用を有する新規な神経再生促進剤が提供される。

Claims

骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の阻害剤を有効成分として含む、神経再生促進剤。
骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の阻害剤が、骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の発現を阻害する物質である、請求項１に記載の神経再生促進剤。
骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の発現を阻害する物質が、骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の発現をＲＮＡｉにより阻害する物質である、請求項２に記載の神経再生促進剤。
骨形成因子１Ａ型受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の発現をＲＮＡｉにより阻害する物質が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するｓｉＲＮＡである、請求項３に記載の神経再生促進剤。
グリア瘢痕形成を阻害することによって神経再生を促進する、請求項１から４の何れかに記載の神経再生促進剤。