KR20240072308A - 개선된 펩티드 핵산 복합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생활성 펩티드 핵산와 캐리어 펩티드 핵산의 말단이 보호기로 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 안정성이 강화되고, 표적 유전자에 대한 저해 효과가 개선된 펩티드 핵산 복합체에 관한 것이다.

Description

개선된 펩티드 핵산 복합체{Improved Peptide Nucleic Acid Complex}
본 발명은 개선된 펩티드 핵산 복합체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 생활성 펩티드 핵산와 캐리어 펩티드 핵산의 말단이 보호기로 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 안정성이 강화되고, 표적 유전자에 대한 저해 효과가 개선된 펩티드 핵산 복합체에 관한 것이다.
핵산 약제는 전통적인 약제와 다르게 표적 특이적으로 mRNA의 발현을 억제하므로, 단백질을 표적으로 하는 기존 약제로 치료가 불가능했던 질병까지 치료할 수 있게 되었다.
유전자 발현 조절에 뛰어난 효과를 가지는 올리고 핵산을 기반으로 하는 핵산 약제는 핵산분해효소(nuclease) 등에 의한 손상의 위험이 있으며, 올리고 핵산의 전기적 성질(전하)과 크기로 인하여 수동 확산(passive diffusion)에 의한 세포막 투과가 불가능한 점 등의 문제가 있고, 이를 해결하기 위하여, 핵산의 변형을 통한 생물학적 안정성을 확보하려는 노력이 계속되고 있다.
변형된 인공핵산의 한 종류인 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)은 (2-아미노에틸)-글리신 펩티드 백본((2-aminoethyl)-glycine peptide backbone)이 도입된 인공 핵산으로, 상보적인 염기 서열을 가지는 RNA 및 DNA에 강하게 결합하는 성질을 가지고 있다. 특히, 상기 펩티드 핵산은 핵산분해효소에 대해 저항성이 있고, 생물학적 안정성이 높아 다양한 올리고 핵산을 기반으로 하는 치료제 관련 연구가 수행되고 있다. 하지만 상기 펩티드 핵산은 전기적 중성을 가지는 특성으로 세포 내 도입이 어려운 단점을 가지고 있다(Joergensen M. 등 Oligonucleotides 2011, 21; 29-37.).
약제로서의 성능 및 장점으로 인하여 핵산을 이용한 다양한 임상시험이 진행되고 있으며, 핵산 기반 치료제의 용도가 증가함에도 불구하고 세포 내 도입을 위한 운반체의 사용은 극히 제한적이다. 예를 들어, 나노입자(nanoparticle), 양성 리포좀(cationic liposome) 및 폴리머 나노입자(polymeric nanoparticle)룰 사용하는 올리고 핵산을 기반으로 하는 약제의 세포 또는 조직 내로의 운반 전략(방법)을 사용한 임상시험이 진행되고 있으나, 대다수의 경우 운반 시스템을 포함하지 않고, 비경구적인 방법인 근육주사, 안구(ocular) 투여, 피하주사 등의 투여 경로(administration route)로 핵산의 직접 도입이 주를 이루고 있다.
또한, 올리고 핵산 자체의 세포막 투과 능력은 상당히 낮으며, 특히 DNA 또는 RNA는 음전하를 띄고 있기 때문에, 세포의 소수성 인지질 이중막을 통과하지 못하므로 단순 확산을 통한 세포 내 전달이 어렵다. 레트로바이러스(Retrovirus) 혹은 AAV(adeno-associated virus) 등의 바이러스 운반체의 사용은 올리고 핵산의 세포 내 도입을 가능하게 하지만, 의도치 않은 면역 활성과 발암 유전자(oncogene)의 재조합 가능성 등의 위험성이 있다(Couto L. B. 등 Curr. Opin. Pharmacol. 2010, 5; 534-542.).
이러한 이유로 세포 독성이 적고, 면역 활성이 낮은 비-바이러스성 올리고 핵산을 기반으로 하는 핵산 운반체 개발의 중요성이 더욱 커지고 있으며, 그 결과로 양전하성 지질(cationic lipid), 리포좀(liposome, 안정된 핵산 지질 입자(stable nucleic acid lipid particle, SNALP), 폴리머 및 세포-투과 입자(cell-penetrating peptide)를 이용한 세포 도입 기법이 개발되고 있다(Zhi D. 등 Bioconjug. Chem. 2013, 24; 487-519., Buyens K. 등 J. Control Release, 2012, 158; 362-70., ROSSI, J. J. 등 Gene Ther. 2006, 13: 583-584., Yousefi A. 등 J. Control Release, 2013, 170; 209-18., Trabulo S. 등 Curr. Pharm. Des. 2013, 19; 2895-923.).
이러한 핵산 전달 기법은 기능성 잔기를 직접적인 결합으로 가지고 있으며, 복합체 형성을 위한 단계를 포함하고, 리포좀(liposome) 구조의 앤도좀 에스케이프(endosome escape) 효율 및 생체 독성 등의 문제점을 가지고 있어, 올리고 핵산 도입 기능의 향상과 제조 절차 및 부작용과 관련된 문제점의 해소가 필요하다.
한편, 일반적으로 생활성 핵산은 막수용체 세포 내재화(receptor-mediated endocytosis)를 통해 엔도좀(endosome)이라는 세포 소기관을 형성하여 세포 내로 유입되며, 생활성 핵산이 효과를 나타내기 위해서는 엔도좀 내부에 유입된 생활성 핵산이 탈출하여 세포질에서 그 기능을 수행할 수 있어야 한다. 이러한 엔도좀에서 세포질로 탈출하는 과정, “엔도좀 탈출(endosome escape)”이 필수적이다(Pack, D.W. 등, Nat. Rev. Drug. Discov., 4;81-593 (2005)). 이러한 엔도좀 탈출 효율을 높이기 위해서는 엔도좀 탈출을 도와주는 펩타이드를 결합하는 것이 일반적이나, 펩티드 핵산에 결합할 수 있는 펩타이드가 한정적이라는 한계가 있다.
또한, 엔도좀 탈출의 작용기전은 엔도좀 막의 pore 형성, 수소 이온 흡수 효과, 엔도좀 막과의 퓨전, 엔도좀 막의 파괴의 총 4가지 작용기전을 통해 이루어지는데, 이 중 수소 이온 흡수 효과를 통해 엔도좀 내에 수소 이온을 흡수하여 pH를 낮춤으로써 엔도좀 탈출 효율을 증가시킬 수 있으며, 그 대표적인 예로 3차 아민기를 소수성 체인에 결합하여 엔도좀 내 수소 이온을 증가시킴으로써 엔도좀 막을 융해하여 엔도좀 탈출 효율을 증가시키는 방법이 있다(Miller, D. K. 등, J. Cell Biol., 97;1841-1851, 1983; Varkouhi, A. K. 등, Journal of Controlled Release, 151;220-228, 2011)
이와 관련하여, 본 발명자들은 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 세포 투과성(cell permeability)이 놀랍게 향상되며, 이를 이용하여 표적 유전자의 발현을 매우 효율적으로 조절할 수 있음을 확인하고, 이러한 세포 독성이 낮고, 생활성 핵산의 세포 투과성 및 유전자 발현 조절 능력이 향상된 새로운 구조체에 대한 특허 및 지속적인 연구를 통한 상기 구조체에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질을 상기 구조체에 결합하여 상기 구조체에 포함된 생활성 핵산의 세포 내에서의 활성이 현저하게 향상되는 것을 규명한 특허를 출원 및 등록한 바 있다(대한민국 등록특허 제2,262,260호).
한편, 펩티드 핵산의 합성 과정은 보호기 도입, 보호기 제거 반응이 필수적이며, 보호기를 제거하는 반응을 통해 최종 산물인 펩티드 핵산을 얻게 된다. 보호기를 제거하는 과정에서 Trifluoroacetic acid(TFA)를 과량 사용하게 되며, 그에 따라 펩티드 핵산은 대부분 TFA 염을 과량 함유한 형태를 띠게 된다. 이는 펩티드 핵산 구조체 내부에 아민기와 염 형태로 결합하고 있어 반응성이 갖지 않지만, 염 함량을 변화시키는 경우, 1차 아민은 반응성을 갖게 되어 분자 내 아실 이동 (intramolecular acyl migration) 혹은 염기 탈락 (base elimination) 및 분자 내 고리화 (intramolecular cyclization)이 발생할 수 있다(Stephen, A. T. 등, Tetrahedron, 51(22);6179-6194).
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체에 있어서, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질을 추가 도입하지 않아도, 세포 독성이 낮고, 생활성 핵산의 세포투과성 및 유전자 발현 조절 능력이 향상된 새로운 구조체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 핵산 복합체의 염 함량 변화를 통해 구조체 내 결합하고 있는 3차 아민기가 수소 이온을 증가시키는 경우, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질의 결합이 없이도 엔도좀 탈출 효율을 증가시킬 수 있으며, 염 함량 변화에 의해 구조체의 안정성이 떨어지는 현상을 구조체의 말단에 보호기를 결합하여 안정성을 획기적으로 증가시킬 수 있어, 생활성 핵산의 세포 내에서의 활성이 현저하게 향상되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 엔도좀 탈출을 도와주는 물질을 추가 도입하지 않아도, 세포 독성이 낮고, 생활성 핵산의 세포투과성 및 유전자 발현 조절 능력이 향상된 새로운 펩티드 핵산 복합체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열, 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산(Bioacitve Peptide Nucleic Acid); 및 상기 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체에 있어서,
상기 생활성 펩티드 핵산 및/또는 상기 캐리어 펩티드 핵산의 말단이 아미노기를 보호할 수 있는 보호기로 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 4 또는 서열번호 5의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 12의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 14의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 건성 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 15 내지 서열번호 17에서 선택되는 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 18 내지 서열번호 20에서 선택되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 21의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 22의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 24의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 26의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머성 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 28 또는 서열번호 29의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 31 또는 서열번호 32의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 파킨슨 병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 33의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 34의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체는 엔도좀 탈출을 도와주는 물질의 결합이 없이도 엔도좀 탈출 효율을 증가시킬 수 있으며, 염 함량 변화에 의해 구조체의 안정성이 떨어지는 현상을 구조체의 말단에 보호기를 결합하여 안정성을 획기적으로 증가시킬 수 있어, 생활성 핵산의 세포 내에서의 활성이 현저하게 향상되는 효과가 있다.
도 1a는 표 2의 핵산복합체의 세포투과성 및 엔도좀 탈출능을 acridine orange 염색방법으로 확인한 결과를 나타낸 것으로, 핵산복합체 처리 후 16시간 경과 후를 공초점 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 표 2의 핵산복합체의 세포투과성 및 엔도좀 탈출능을 acridine orange 염색방법으로 확인한 결과를 나타낸 것, 핵산복합체 처리 후 24시간 경과 후를 confocal 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 A549 세포 및 ARPE-19세포에 표 2의 핵산복합체를 처리한 후, VEGF 및 p-Akt1의 발현을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 PNA 복합체 1~4를 함유하는 안구점안액을 14일간 투여한 랫드의 망막 내 혈관의 강도를 Image J로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 PNA 복합체 4를 각각 30㎍, 10㎍ 및 5㎍ 함유하는 안구점안액을 14일간 투여한 랫드의 망막 내 혈관의 강도를 Image J로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 건성 황반변성 유사 모델에 NLRP3 활성 억제용 핵산 복합체를 4주간 투여 한 후, 안저 촬영을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 건성 황반변성 유사 모델에 NLRP3 활성 억제용 핵산 복합체를 4주간 투여 한 후, 적출한 망막조직을 H&E 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 KRAS, KRAS-G12D 및 Angiogenin 활성 억제를 위한 PNA 복합체를 췌장암 세포를 이식한 동물모델의 미정맥에 3주간 투여 한 후, 종양을 적출하여, 종양의 외형 및 크기를 확인하고, H&E 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 KRAS, KRAS-G12D 및 Angiogenin 활성 억제를 위한 PNA 복합체를 췌장암 세포를 이식한 동물모델의 미정맥에 3주간 투여 한 후, 종양을 적출하여 수득한 protein lysate를 이용하여, KRAS, RAS-G12D. p-ERK, HRAS 및 NRAS의 발현을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5c는 KRAS, KRAS-G12D 및 Angiogenin 활성 억제를 위한 PNA 복합체를 췌장암 세포를 이식한 동물모델의 미정맥에 3주간 투여 한 후, 적출한 종양 조직을 면역염색하여 KRAS 및 Angiogenin의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 TGFβ2 활성 억제를 위한 PNA 복합체를 인간 유래 교모세포종 세포 를 이식한 동물모델의 미정맥에 3주간 투여 한 후, 종양을 적출하여, 종양의 크기를 확인하고, H&E 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 TGFβ2 활성 억제를 위한 PNA 복합체를 인간 유래 교모세포종 세포 를 이식한 동물모델의 미정맥에 3주간 투여 한 후, 종양을 적출하여 수득한 protein lysate를 이용하여, TGF-β2 및 TGF-β2의 하위 유전자인 p-Smad3의 발현을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6c는 TGFβ2 활성 억제를 위한 PNA 복합체를 인간 유래 교모세포종 세포 를 이식한 동물모델의 미정맥에 3주간 투여 한 후, 적출한 종양 조직을 면역염색하여 TGF-β2 및 TGF-β2의 하위 유전자인 Ki67의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 알츠하이머성 치매 유사 염증 세포 모델에 NLRP3와 하위 유전자 발현 억제 효과 확인을 위한 PNA 복합체를 처리한 후, 수득한 protein lysate를 이용하여, NLRP3 및 하위 단계 유전자인 procaspase-1, pro-IL1β의 발현을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 미세아교세포 배양 배지를 처리한 뉴런 세포에 NLRP3와 하위 유전자 발현 억제 효과 확인을 위한 PNA 복합체를 처리한 후, 수득한 protein lysate를 이용하여, 알츠하이머성 치매 발병 유전자인 인산화된 타우의 발현을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 MPTP/프로베네시드 파킨슨병 동물모델에서 핵산 복합체의 파킨슨병 치료효과를 확인하기 위하여, 로타로드 검사, 폴 검사 및 실린더 검사를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 8b는 MPTP/프로베네시드 파킨슨병 동물모델에서 핵산 복합체를 투여한 후, 뇌 조직을 분리하고, 선조체(Striatum)와 흑질(substantia nigra) 부위의 protein lysate를 이용하여, NLRP3 및 하위 유전자의 발현을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8c는 MPTP/프로베네시드 파킨슨병 동물모델에서 핵산 복합체를 투여한 후, 뇌 조직을 분리하고, 선조체(Striatum)와 흑질(substantia nigra) 부위를 면역염색하여 티로신 하이드록실레이즈(Tyrosine Hydroxylase)의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8d는 MPTP/프로베네시드 파킨슨병 동물모델에 핵산 복합체를 투여한 후, 뇌 조직을 분리하고, 선조체(Striatum)와 흑질(substantia nigra) 부위를 면역염색하여알파-시누클레인(α-synuclein)의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 비알콜성 지방간염 동물모델에 핵산복합체를 투여한 후, 간조직을 분리하여 표현형 확인 및 H&E 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 9b는 비알콜성 지방간염 동물모델에 핵산복합체를 투여한 후, 간조직을 분리하여 표현형 확인 및 H&E 분석 후, NAFLD activity scoring을 통해 지방증(steatosis), 세포 풍선화(ballooning), 염증 세포 침윤(Lobular inflammation) 의 각 항목에 대해 특정 간 조직 부위를 점수화하여 수치화한 결과를 나타낸 것이다.
도 9c는 비알콜성 지방간염 동물모델에 핵산복합체를 투여한 후, 간조직을 분리하여 오일 레드 O(oil red O) 염색 및 시리우스 레드(sirius red) 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 9d는 비알콜성 지방간염 동물모델에 핵산복합체를 투여한 후, 간조직을 분리하여 수득한 protein lysate를 이용하여, NLRP3 및 하위 단계 유전자인의 발현을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 탈염 과정을 거처 염 함량이 0.5% 미만인 생활성 핵산과 펩티드 핵산을 DMSO 용액에 3개월 보존 한 후, HPLC를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 10b는 TFA 염 함량 0.5% 미만으로 탈염된 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 5'말단에 아세틸기를 수식한 펩티드 핵산을 DMSO에서 12개월간 보존한 후, HPLC를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에 따른 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 보호기로 아세틸기로 수식되는 경우의 위치를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 유전자 발현 조절에 뛰어난 효과를 가지는 올리고 핵산을 기반으로 하는 핵산 복합체에서 엔도좀 탈출 효율을 높이면서도, 구조적 안정성을 증가시켜 생활성 핵산의 세포 내에서의 활성을 향상시킬 수 있는 핵산 복합체를 개발하였다.
본 발명은 일 관점에서, 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열, 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산(Bioacitve Peptide Nucleic Acid); 및 상기 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체에 있어서,
상기 생활성 펩티드 핵산 및/또는 상기 캐리어 펩티드 핵산의 말단이 아미노기를 보호할 수 있는 보호기로 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 보호기는 일킬기(alkyl), 아실기(acyl) 및 황산기(sulfonyl)로 구성된 군에서 선택되는 것 일 수 있으며, 상기 알킬기는 메틸기, 에틸기, 프로필기 및 부틸기로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아실기는 아세틸기, 프로피오닐기, 말로닐기 및 벤조일기로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
본 발명에서 상기 보호기는 펩티드 핵산의 양말단에 수식될 수 있으며, 바람직 5' 말단에 수식될 수 있다.
본 발명에서, 상기 생활성 펩티드 핵산 및/또는 상기 캐리어 펩티드 핵산의 말단이 아미노기를 보호할 수 있는 보호기로 수식되어 있다는 것은 상기 생활성 펩티드 핵산과 상기 캐리어 펩티드 핵산이 모두 보호기로 수식되어 있거나, 상기 생활성 펩티드 핵산과 상기 캐리어 펩티드 핵산 중 어느 하나가 보호기로 수식되어 있다는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 펩티드 핵산의 합성 과정은 최종 산물인 펩티드 핵산을 얻기 위하여, 프로텍션 그룹을 제거하는 과정에서 Trifluoroacetic acid(TFA)를 과량 사용하게 되며, 그에 따라 펩티드 핵산은 대부분 TFA 염을 과량 함유한 형태를 띠게 된다. 이는 펩티드 핵산 구조체 내부에 아민기와 염 형태로 결합하고 있어 반응성이 갖지 않지만, 염 함량을 변화시키는 경우, 1차 아민은 반응성을 갖게 되어 분자 내 아실이동 (intramolecular acyl migration) 혹은 염기탈락 (base elimination) 및 분자 내 고리화 (intramolecular cyclization) 등이 발생할 수 있다(Stephen, A. T. 등, Tetrahedron, 51(22);6179-6194). 염기 탈락의 경우는 분자량 100 내외의 차이를 가지며, 고리화(Cyclization)의 경우는 분자량은 같지만 LC 분석에서 다르게 나타난다.
본 발명의 핵산 복합체를 구성하는 상기 생활성 펩티드 핵산 또는 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 TFA 염을 제거하기 위하여, 탈염처리를 수행할 수 있으며, 상기 탈염 처리된 펩티드 핵산은 TFA(Trifluoroacetic acid) 염을 1% 미만 바람직하게는 0.5% 미만으로 함유하게 된다.
본 발명의 상기 생활성 펩티드 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 VEGF-A를 표적으로하는 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산을 이용하여 탈염 및 보호기 수식에 의한 엔도좀 탈출능의 향상 및 표적 유전자 저해 활성을 확인하였으며, 엔도좀 탈출을 도와주는 링커 펩티드인 "GLFDIIKKIAESF" 또는 Histisine(10)을 포함하지 않는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 경우에도 탈염 및 5' 말단의 아세틸기 수식에 의하여 핵산 복합테의 엔도좀 탈출능과 표적 유전자의 저해활성이 현저히 향상되는 것을 확인하였다(도 1~도 3 참조).
본 발명의 핵산 복합체는 염 함량 변화를 통해 구조체 내 결합하고 있는 3차 아민기가 수소 이온을 증가시키는 경우, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질의 결합이 없이도 엔도좀 탈출 효율을 증가시킬 수 있으며, 염 함량 변화에 의해 구조체의 안정성이 떨어지는 현상을 구조체의 말단에 보호기를 결합하여 안정성을 획기적으로 증가시킬 수 있어, 생활성 핵산의 세포 내에서의 활성이 현저하게 향상된다.
본 발명에 있어서, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드가 상보적으로 결합된 핵산 복합체는 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
구조식 (1)
[ A ≡ C (+) ]
상기 구조식 (1)에 있어서,
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고,
'≡'는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
A로 표시되는 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며,
C(+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며,
캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에서의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 역평행결합(anti-parallel binding) 또는 평행결합(parallel binding) 형태를 가질 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산의 상보적인 결합형태는 생활성 핵산의 목적서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함하는 것이 바람직하며, 상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체가 음전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적인 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되도록 하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서, "생활성 핵산"은 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 표적 유전자, 및 이를 포함하는 염기서열과 결합하여 해당 유전자의 고유 기능(예를 들어, 전사체(transcript) 발현 또는 단백질 발현)을 활성화시키거나 또는 저해하거나, pre-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 조절(예를 들어, 엑손스키핑 (exon skipping) 하는 등의 기능을 수행하며, 상기 염기서열은 유전자 조절부위(gene regulatory sequence) 또는 유전자 부위(gene coding sequence) 또는 스플라이싱 조절 부위 (splicing regulatory sequence)인 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 상기 생활성 핵산은 발현을 감소시키고자 하는 목적하는 표적 유전자와 결합할 수 있는 상보적인 서열, 특히 그러한 목적하는 표적 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 상보적인 서열을 가지는 핵산으로, 해당 유전자의 발현을 억제하는 등의 유전자 발현조절에 관여하는 핵산을 의미하며, 발현을 감소시키고자 하는 표적 유전자에 상보적인 서열을 가지는 핵산일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 포스포디에스테르(phosphodiester), 2'0-메틸(2'0-methyl), 2' 메톡시-에틸(2' methoxy-ethyl), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 결합력은 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-방향성 및 3'-방향성에 따라 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)함으로써, 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자와의 결합력보다 낮게 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 각각 2 내지 50개, 바람직하게는 5 내지 30개, 더욱 바람직하게는 10 내지 25개, 가장 바람직하게는 15 내지 17개의 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 생활성 핵산은 천연(natural) 핵산 염기 및/또는 변형된 핵산 단량체로 이루어져 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 생활성 핵산에 사용된 단량체가 PNA일 경우, 생활성 핵산이라고 하며, 다른 단량체가 사용된 경우에도 동일한 방식으로 부른다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 포스포디에스테르(phosphodiester), 2' 0-메틸(2' 0-methyl), 2' 메톡시-에틸(2' methoxy-ethyl), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 핵산 복합체 내의 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 각각은 전기적 특성이 전체적으로, 양전하(양성), 음전하(음성) 또는 중성 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체일 수 있다.
상기 전기적 특성의 표현에 있어, "전체적으로"의 의미는 개별 염기의 전기적 특성이 아닌 전체적인 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산 각각의 전하가 외부에서 볼 때 전체적인 전기적 특성을 의미하는 것으로, 예를 들어, 생활성 핵산 내의 일부 단량체가 양성을 가지더라도 음성을 가지는 단량체의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 생활성 핵산은 "전체적으로" 전기적 특성을 볼 때 음전하를 가지게 되는 것이며, 캐리어 펩티드 핵산 내의 일부 염기 및/또는 백본(backbone)이 음성을 가지더라도 양성을 가지는 염기 및/또는 백본의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 캐리어 펩티드 핵산은 "전체적으로" 전기적 특성을 볼 때 양전하를 가지게 되는 것이다.
이러한 관점에서, 본 발명의 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것이 바람직하다. 상기 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 음전하 또는 중성의 특성을 가지며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 양전하 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전기적 특성의 부여는 변형된 펩티드 핵산 단량체를 사용할 수 있고, 변형된 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하의 아미노산을 포함하고, 음전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 음전하의 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E) 또는 아미노산 유사체의 음전하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가지도록 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전하 부여를 위한 펩티드 핵산 단량체의 변형은 상기 backbone 변형 이외에도 nucleobase가 변형된 펩티드핵산 단량체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 전기적 양성을 가지도록 amine, triazole, imidazole moeity를 nucleobase에 포함하거나, 전기적 음성을 가지도록 carboxylic acid를 염기에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산의 변형 펩티드 핵산 단량체는 음전하를 backbone 혹은 nucleobase에 더 포함할 수 있지만, 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 단량체가 음전하를 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적으로 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것이 바람직하다.
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 핵산 복합체는 전체적으로 양의 전하를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 상기 핵산 복합체에 있어, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 또는 형광/발광 표지자 등으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 및 이미징을 위한 형광/발광 표지자 등으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질은 상기 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질과 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 단순 공유결합 또는 링커로 매개된 공유결합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 핵산 운반체에 결합된 세포투과, 용해도, 안정성, 운반 및 이미징 관련 물질(예컨대, 소수성 잔기 등)은 표적 유전자의 발현을 조절하는 생활성 핵산과 독립적으로 존재하게 된다.
본 발명에 있어서, 앞서 기술한 바와 같이, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 상보적인 결합 형태는 크게 역평행결합(antiparallel binding)과 평행결합(parallel binding)의 형태를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 상보적인 결합 형태는 생활성 핵산의 목적서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리되는 구조를 가진다.
상기 역평행결합과 평행결합은 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식에 있어, 5'-방향성과 3'-방향성에 따라 결정된다. 역평행 결합은 일반적인 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식으로, 본 발명에 따른 핵산 복합체를 예로 들어 설명하면, 생활성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 캐리어 펩티드 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다. 평행결합은 역평행결합에 비해서는 결합력이 다소 떨어지는 형태로, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 모두가 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 결합력은 융해온도, melting temperature 또는 Tm에 의해 결정된다.
상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮게 하기 위한 구체적인 방법의 예로는, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예로서 상기 캐리어 펩티드 핵산이 링커, 유니버설 염기(universal base) 및 생활성 핵산의 대응되는 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지는 펩티드 핵산 염기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드 핵산 염기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고, 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이노신 PNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 기능 조절을 위한 핵산들의 결합 형태와 전기적 성질 조합을 제공하고, 상기 핵산의 결합 형태와 전기적 성질 조합으로 입자 크기 및 작용 시점을 조절하고, 세포투과성, 용해도 및 특이도를 향상시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해, 목적 유전자의 존재 하에서, 생활성 핵산이 목적 서열과 결합되는 시점(생활성 핵산의 목적 서열로의 치환되는 시점, 표적 특이적 분리 및 결합 시점) 등의 조절이 가능하다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 생활성 핵산의 목적 유전자로의 치환(strand displacement) 시점, 표적 특이적 분리 및 결합(target specific release and bind) 시점의 조절은 복합체의 비특이 결합을 위한 캐리어 펩티드 핵산의 비특이 염기, 유니버설 염기 및 linker의 유무, 개수 및 위치에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 펩티드 복합체의 상보적인 결합의 형태인 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel) 형태의 결합 등과 상기 조건의 조합에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 입자는 5 nm 내지 300 nm, 바람직하게는 10 nm 내지 200 nm, 가장 바람직하게는 15 nm 내지 100 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 입자 크기는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전하 밸런스(charge balance)를 조절함으로써 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로는 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 증가하면 입자의 크기가 작아지나, 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 일정 수준을 넘게 되면 입자의 크기가 커지는 특징을 가지게 된다. 또한, 입자 크기를 결정하는 다른 중요한 요소로 복합체를 이루는 생활성 핵산 전하에 따른 전반적인 캐리어 펩티드 핵산과의 적절한 전하 밸런스에 의해서 입자 크기가 결정된다.
본 발명에 따른 캐리어 펩티드 핵산의 양전하는 1개 내지 7개(양전하를 가지는 단량체가 1개 내지 7개 포함됨을 의미한다), 바람직하게는 2개 내지 5개, 가장 바람직하게는 2개 내지 3개이며, 생활성 핵산의 전하는 전하 밸런스의 넷 차지(net charge)가 음전하 0개 내지 5개, 바람직하게는 0개 내지 3개이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 적절한 조건에서 혼성화됨으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 "혼성화"는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 결합 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 "목적 유전자"는 활성, 억제 또는 표지하고자 하는 핵산 서열(염기서열)을 의미하며, 용어 "표적 유전자" 또는 "표적 핵산"과 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명에 있어서, 표적 유전자를 포함하는 표적 핵산(염기서열)이 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 상기 복합체와 접촉(결합)하게 되면, 캐리어 펩티드 핵산으로부터 생활성 핵산이 분리되어 생물학적 활성을 나타내게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체를 이용하여 예방, 치료할 수 있는 질병은, 상기 핵산 복합체 내의 생활성 핵산의 표적 유전자에 따라 결정될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 4 또는 서열번호 5의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 혈관신생관련 질환은 나이 관련 황반변성, 당뇨병성 황반변성, 당뇨병성 황반부종, 증식성 망막병증, 신생혈관 녹내장, 종양 또는 암, 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 망막부종, 정맥류, 죽상 동맥경화증 및 만성 관절 류마티스로 구성된 군에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 12의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 14의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 건성 황반변성, 알츠하이머성 치매, 자가면역 질환, 비알콜성 지방간염 및 염증성질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 15 내지 서열번호 17에서 선택되는 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 18 내지 서열번호 20에서 선택되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 또는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 21의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 22의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 24의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 26의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머성 치매, 건성 황반변성, 자가면역 질환, 비알콜성 지방간염 및 염증성질환으로 구성된 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 28 또는 서열번호 29의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 31 또는 서열번호 32의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 파킨슨 병 또는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 33의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 34의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염, 알츠하이머성 치매, 건성 황반변성, 자가면역 질환 및 염증성질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
한편, 본 발명에 있어서, 용어 "치료용 조성물"은 "의약(약제학적, 약학적) 조성물(pharmaceutical composition)"과 혼용될 수 있으며, 본 발명의 생활성 핵산 및 상기 핵산과 결합하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 유효성분으로 포함하며, 추가적으로 상기 핵산 복합체에 목적하는 질환을 치료하기 위한 치료용 약물이 결합된 형태일 수 있다.
상기 약학 조성물이 제형화되어 투여될 경우, 통상적인 방법에 의해 생성된 제제의 형태로서 투여될 수 있다.
투여되는 제제의 형태는 예를 들어 점안제(eye drop), 안 연고, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 주사제, 연고 등일 수 있으며, 바람직한 것은 점안액 또는 피부 전달 형태의 제제이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 제제는 해당 분야의 일반적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 안과적 국소 투여 형태로서, 점적, 스프레이 또는 겔 형태가 가능하며, 또 다른 방법으로 리포좀을 이용하여 눈에 투여할 수 있다. 또한, 펌프-카테테르(pump-catheter) 시스템을 통해 눈물막에 주입될 수 있다. 부가적인 구체예로서, 눈 위의 콘택트렌즈에 포함될 수 있으며, 그에 의해 운반되거나 그에 부착될 수 있다. 다른 구현예로, 안구 표면에 가해질 수 있는 스펀지 또는 면봉에 함유된 형태가 이용될 수 있으며, 안구 표면에 가해질 수 있는 액체 스프레이도 이용될 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 조성물은 점안액, 수성액, 겔, 연고, 크림, 로션, 페이스트, 도말제 또는 패치 형태로 제형화될 수 있다.
가장 바람직하게는 수성액의 형태로 제형화될 수 있고, 이때 수성액은 증류수 및 버퍼 용액의 형태가 사용될 수 있다.
이들 제형은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는, 예를 들어, 안구 또는 피부에 적용될 수 있는 형태의 제형에 적합한 담체, 부형제, 보조제 또는 희석제 등의 첨가물을 함유할 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 멸균 주사 용액 등의 형태일 수 있다.
용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 핵산 복합체의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
본 발명에서의 핵산 복합체를 함유하는 물질은, 환자에게 그 자체로서 또는 병용 요법(combination therapy)에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 의약 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 의약 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 세포 투과성 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여(또는 도포)로 질환의 발병을 막거나, 이의 진행을 억제시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "개선"이란 상기 세포 투과성 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여(또는 도포)로 질환의 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 세포 투과성 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여(또는 도포)로 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 핵산 복합체의 투여(또는 도포)에 있어서, 당업계에 공지된 임의의 핵산 전달 방법이 사용될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 적합한 전달 시약은 예를 들어, Mirus Transit TKO lipophilic reagent, lipofectin, lipofectamine, cellfectin, polycations(예를 들어, polylysine), atelocollagen, nanoplexes 및 리포좀이 있다. 핵산 분자의 전달 운반체로서 아테로콜라겐(atelocollagen)의 사용은 Minakuchi et al. Nucleic Acids Res., 32(13):e109 (2004); Hanai et al. Ann NY Acad Sci., 1082:9-17 (2006); and Kawata et al. Mol Cancer Ther., 7(9):2904-12 (2008)에 기술되어 있다. 예시적인 간섭 핵산 전달 시스템은 미국 특허 제8,283,461호, 제8,313,772호, 제8,501,930호에 제공된다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 핵산 복합체는 리포솜(liposome) 등의 전달체를 이용하여 투여(또는 도포)할 수도 있다. 상기 리포솜은 림프 조직과 같은 특정 조직에 대해 상기 복합체를 표적화하거나, 감염 세포에 대해 선택적으로 표적화하는데 도움을 줄 수 있고, 또한 상기 복합체가 포함된 조성물의 반감기를 증가시키는데 도움을 줄 수 있다. 리포솜으로는 에멀션, 포움(foam), 마이셀(micelle), 불용성 단층, 액정, 인지질 분산물, 라멜라 층(lamellar layer) 등이 있다. 이러한 제제에 있어서, 송달되는 상기 복합체는, 단독으로 또는 특정 세포들을 대상으로, CD45 항원에 결합되는 모노클로날 항체와 같은 림프 세포 중 우세한 수용체에 결합하는 분자와 함께 또는 기타 치료 조성물과 함께, 리포솜의 일부로서 혼입시킨다. 따라서, 본 발명의 소정 복합체로 충진되거나 도포되어(decorated) 상기 핵산 복합체 조성물을 송달하는 리포솜은 림프 세포의 상기 부위로 지향될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 리포솜은 일반적으로 중성 및 음전하 인지질 및 콜레스테롤 등의 스테롤을 비롯한 표준 베시클 (vesicle)-형성 지질로부터 형성된다. 일반적으로, 예를 들어 혈류 중의 리포솜의 안정성, 산 불안정성(acid lability) 및 리포솜의 크기 등을 고려하여 지질을 선택한다. 리포솜 제조에는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467, 1980), 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호]에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 안구 위 점안, 망막 내 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명의 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid) 및 캐리어 펩티드 핵산, 및 이들을 이용한 복합체의 제조
본 발명에 따른 염 함량 조절 및 안정성 증가에 따른 핵산 복합체의 효능 검증을 위하여, 표적 유전자로 혈관내피세포성장인자 A(Vascular Endothelial Growth Factor A, VEGF-A)를 사용하였다. 혈관내피세포성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)는 혈관 신생과 혈관 투과성을 증가시키는 중요한 인자로 알려져 있으며, 혈관, 림프관의 발생과 항상성 유지에 관여한다. 이러한 VEGF는 수용체인 VEGFR1, 2, 3에 결합하지만, VEGFR2를 통해 내피세포의 증식, 이동, 투과성을 유도하는 신호를 전달하며, VEGF 수용체의 리간드인 VEGF-A는 VEGFR2와 결함하는 주요 리간드이기 때문에(Zheng H. 등, J. Biol. Chem., 276;26969-26976 (2001); Doonyapat, S. 등, Int. J. Mol. Sci., 13;14845-14864 (2012)), 신생혈관형성을 제어하여, 신생혈관 관련 질환을 치료할 수 있다.
본 발명의 대조군으로 사용한 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 1 내지 2로 구성되어 있으며, 엔도좀 탈출 효율 및 신생혈관생성 치료효과를 확인하기 위해 사용한 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 3 내지 5번으로 기재되는 서열로 구성되어 있다.
본 실시예 1에서 사용된 펩티드 핵산 기반 생활성 핵산은 엔도좀 탈출능을 돕기 위한 펩타이드를 5' 말단에 결합한 형태, 펩티드 핵산 합성 과정에서 생성되는 트리클로로아세트산염(Tri-Fluoro Acetic Acid salt, TFA salt)을 현저히 줄인 형태, 5’말단에 보호기를 결합하여 펩티드 핵산의 안정성을 증가시킨 형태로 염기 서열, 단량체 변형 및 구조는 표 1과 같다.
VEGF-A 활성 억제를 위한 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형 비고
생활성
핵산		 1 5‘-GLFDIIKKIAESF-O-GC(-)CT(+)CCT(-)AC(+)GTT(-)ATC-O-K-3’ -+-+- 음성대조군
2 5’-GC(-)CT(+)CCT(-)AC(+)GTT(-)ATC-O-K-3’ -+-+- 음성대조군
3 5’-GLFDIIKKIAESF-O-AT(-)GA(+)TTC(-)TG(+)CCC(-)TCC-O-K-3’ -+-+- 양성대조군
4 5’-AT(-)GA(+)TTC(-)TG(+)CCC(-)TCC-O-K-3’ -+-+- 탈염
5 5’-P-AT(-)GA(+)TTC(-)TG(+)CCC(-)TCC-O-K-3’ -+-+- 탈염+보호기 수식
캐리어
펩티드
핵산		 6 5’-HHHHHHHHHH-O-CGG(+)AGGAT(+)GCA(+)ATAG-O-K-3’ +++ 음성대조군
7 5’-CGG(+)AGGAT(+)GCA(+)ATAG-O-K-3’ +++ 음성대조군
8 5’-HHHHHHHHHH-O-TAC(+)TAAGA(+)CGG(+)GAGG-O-K-3’ +++ 양성대조군
9 5’-TAC(+)TAAGA(+)CGG(+)GAGG-O-K-3’ +++ 탈염
10 5’-P-TAC(+)TAAGA(+)CGG(+)GAGG-O-K-3’ +++ 탈염+보호기 수식
단량체의 변형은 전기적인 성질을 부여하기 위하여 펩티드핵산의 backbone을 전기적 양성은 리신(Lysine, Lys, K, (+)로 표기)을 전기적 음성은 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E, (-)로 표기)로 변형된 펩티드 backbone을 가지도록 제작하였다.
"P"는 보호기를 나타내며, 본 실시예에서는 서열번호 5의 생활성 펩티드와 서열번호 10의 캐리어 펩티드는 아미노산의 보호기로 아세틸기를 사용하여, 5' 말단에 결합시켜 사용하였다.
5'말단에 아세틸기를 결합하기 위해 펩티드 핵산을 DMF에 녹인 후 acetic anhydride를 사용하여 결합시켰다.
본 발명에서 PNA의 염 함량 조절은 합성한 PNA를 역상 HPLC에 주입하여 황산암모늄((NH4)2SO4를 이용하여 탈염(salting out) 기법을 사용하여 염을 제거하였다.
본 실시예에서는 서열번호 4 및 서열번호 5의 생활성 펩티드와 서열번호 9 및 서열번호 10의 캐리어 펩티드에 대하여, 상기 방법으로 탈염하여 사용하였다.
본 발명에서 사용한 모든 펩티드 핵산은 파나진(PANAGENE, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다.
인간 유래 자궁암 세포주에서의 엔도좀 탈출 효율 및 VEGF-A와 하위 유전자 발현 억제 효과 비교 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체 비고
PNA1 서열번호 1 및 서열번호 6 음성대조군
PNA2 서열번호 3 및 서열번호 8 양성대조군
PNA3 서열번호 4 및 서열번호 9 탈염군
PNA4 서열번호 5 및 서열번호 10 탈염 + 보호기(아세틸기) 수식 군
실시예 2: 핵산 복합체를 사용한 인간 유래 자궁암 세포에서의 엔도좀 탈출 효율 변화 및 표적 유전자 발현 확인
생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 염 함량 변화 혹은 5' 말단의 보호기 결합으로 인해 엔도좀 탈출 효율을 증가시키는지 확인하기 위해 표 2에 나타낸 핵산 복합체의 엔도좀 탈출 효율을 비교 분석하였다.
또한, VEGF-A 및 하위 단계 단백질 p-Akt의 발현을 억제하는지 확인하기 위해 각 핵산 복합체의 단백질 발현을 비교 분석하였다.
실시예 2-1: 세포 배양
ATCC (American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 유래 자궁암 세포(HeLa, CCL-2TM), 인간 유래 폐암 세포(A549, CCL-185) 및 인간 유래 망막소상피세포(ARPE-19, CRL-2302)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국), DMEM/F-12 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium/F-12, 웰진, 한국)에 10% (v/v) 소태아혈청, 페니실린 100 units/mL, 스트렙토마이신 100 μg/mL을 첨가하고, 37℃, 5% (v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다.
실시예 2-2: 웨스턴 블락 분석 (Western Blot Assay)
실시예 2-1에서 배양된 세포주로부터 총 단백질을 추출하여 BCA 정량법(Bicinchoninic acid assay)을 사용하여 단백질을 정량하였으며, 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 상에서 단백질 크기 별로 분리하고, 분리된 겔상의 단백질을 멤브레인에 옮긴 다음, 항-VEGF 항체(Abclonal, 미국), 항-p-Akt(Cell signaling, 미국) 토끼 유래 항체를 1차 반응시키고, 2차 반응으로 항-토끼 항체(SantaCruz, 미국)를 이용하여 반응시킨 후 ECL(Enhanced chemiluminescence, Amersham, 미국) 용액을 처리하였다. 항체 처리 및 세정과정이 끝난, 상기 멤브레인은 LAS 하에서 VEGF 및 하위 경로(downstream) 유전자인 p-Akt 단백질 발현 양상을 확인하였다.
실시예 2-3: Acridine Orange 염색을 이용한 핵산 복합체의 엔도좀 탈출의 변화 확인
실시예 2-1에서 배양된 세포 중 인간 유래 자궁암 세포주 (HeLa, CCL-2TM)를 8 well 플레이트에 웰 당 5x103 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 16, 24 시간 간격으로 배양한 다음, 처리 시간 경과 후 acridine orange 염색 방법으로 핵산 복합체의 세포 투과성 및 엔도좀 탈출의 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 탈염 및 보호기로 말단이 수식된 핵산 복합체 4번(PNA 4)이 핵산 복합체 조합 2번 및 3번에 비해 16시간 조건에서 엔도좀 탈출이 먼저 일어나 24시간까지 유지되는 것을 확인하였다.
실시예 2-4: 웨스턴 블럿 분석(Western Blot Assay)으로 유전자 발현의 분석
핵산 복합체의 혈관내피 성장 인자 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 2-1의 조건과 동일하게 배양된 A549 세포와 ARPE-19세포를 각각 6-웰 플레이트에 웰 당 1x105 cells를 배양하고, 표 2의 복합체 처리 후 24, 48, 72시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 항-VEGF 항체(SantaCruz, 미국), 항-p-Akt1 (Cell signaling, 미국)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 탈염 및 보호기로 말단이 수식된 핵산 복합체 조합 4번(PNA 4)이 실시예 2-3의 엔도좀 탈출 효율 비교 분석 결과와 동일하게 인간 유래 폐암 세포(A549 세포)와 인간 유래 망막소상피 세포(ARPE-19세포)에서 VEGF와 p-Akt의 발현을 1일차부터 효과적으로 억제하여 3일차까지 유지되는 것을 확인하였다.
실시예 3: 핵산 복합체의 혈관 내피 성장인자 억제에 의한 신생혈관 치료 효과 확인
노인성 황반변성의 원인으로 알려진 혈관 내피세포 성장인자인 VEGF-A를 표적으로 하는 실시예 2에서 사용한 다양한 핵산 복합체를 이용하여 쥐의 발달 과정에서 안구 점안액으로 처리하여 혈관 생성을 억제하는지 확인하였다.
실시예 3-1:Isolectin B4 (IB4)를 이용한 면역 형광 염색법
쥐의 눈을 분리하여 4% 포르말린 용액에 한 시간 고정하고 망막을 분리한 다음 70% 에탄올에 20분간 처리한다. PBS에 용해시킨 1% Triton X-100(sigma, 미국)용액으로 조직을 투과화 시킨다. PBS로 5분씩 2회 세척하고 Alexa 400-conjugaed isolection-IB4를 0.2% BSA가 포함된 PBS에 1:1000 비율로 희석하여 4℃에서 하루 동안 처리하였다. 이어서 PBS로 5분씩 2회 세척한 다음 형광 현미경으로 관찰하였다.
실시예 3-2: 여러 핵산 복합체 조합에 따른 생쥐의 망막 혈관 생성 억제 효과 비교 분석
임신한 랫드(나라바이오텍, 한국)에서 태어난 지 14일 된 쥐에 핵산 복합체 2 내지 4를 함유하는 안구 점안액을 30 μg / 1 drop 으로 14일 간 투여 후 망막을 분리하여 실시예 3-1과 동일하게 수행하여 형광 현미경으로 분석하였다. 망막 내 혈관의 강도를 Image J로 측정하여 수치화하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 안구 점안액을 이용한 핵산 복합체에 의해 망막의 혈관 생성이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 도 1 및 도 2에서 확인한 엔도좀 탈출 효율 및 표적 단백질 발현 분석 결과와 동일하게 탈염 및 보호기로 말단이 수식된 PNA 4 조합에서 망막 내 신생 혈관 생성 억제 효과가 탁월한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 3b에 나타난 바와 같이, PNA 4 조합을 5 μg, 10 μg, 30 μg / 1 drop / day의 여러 농도에서 실시예 3-2와 동일하게 수행한 결과, 5 μg / 1 drop / 1day는 대조군 대비 미미한 효과를 나타내었으나, 10 μg / 1 drop / 1day와 30 μg / 1 drop / 1day 에서는 망막 내 신생 혈관 생성 억제 효과가 탁월한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 핵산 복합체를 이용한 건성 황반변성 유사 NaIO 3 유도 동물모델에서의 치료 효과 분석
본 실시예에서는 표적유전자로 NLRP3를 사용하였다. NLRP3 단백질과 관련된 caspase-1 활성화 복합 단백질 복합체인 인플라마좀은 건성 황반변성에서 습성 황반변성으로 진행되는데 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Alexander G. Marneros, 9445-958, 2013; Lucia Celkova, et. al., Journal of Clinical Medicine 4(1), 172-192, 2015; Yerramothu, P., et al., Eye 32, 491-505, 2018).
실시예 3에서 효과가 검증된 안정성을 증가시킨 형태의 5' 말단에 보호기로 아세틸기가 결합되고, 염을 제거하여, 염 함량을 조절한 핵산 복합체 조합을 동일하게 적용한 NLRP3 표적 핵산 복합체를 이용하여 NaIO3 유도 건성 황반변성 유사 동물 모델에서?????? 효과를 검증하기 위해 표현형 및 조직학적 소견을 분석하였으며, 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열을 표 3에 나타내었으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 4와 같다.
NLRP3 활성 억제를 위한 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성
핵산		 서열번호 11 5‘-P-AC(-)CT(+)CTA(-)CGC(+)AAT(-)CC-O-K-3’ -+-+-
서열번호 12 5’-P-TCG(-)AT(+)CAT(-)TA(+)GCG(-)TG-O-K-3’ -+-+-
캐리어
펩티드
핵산		 서열번호 13 5’-P-TGGA(+)GATG(+)CGTT(+)AGG-O-K-3’ +++
서열번호 14 5’-P-AGC(+)TAGTA(+)ATCGC(+)AC-O-K-3’ +++
건성 황반변성 유사 NaIO3 유도 동물모델에서의 치료 효과 분석 및 NLRP3와 하위 유전자 발현 억제 효과 비교 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA5 서열번호 11 및 서열번호 13
PNA6 서열번호 12 및 서열번호 14
실시예 4-1:NaIO 3 유도 건성 황반변성 유사 동물 모델 구축
5주령 male B6 mouse를 일주일 동안 순화한 후 NaIO3(sigma, 미국) 35 mg/kg를 정맥 주사하여 3주 동안 유도하였다. 3주 유도 후 안저 촬영을 통해 망막색소상피세포의 변성 및 손상 여부를 확인하고 유도가 확인된 개체만으로 그룹을 분리하였다.
실시예 4-2: NaIO 3 유도 건성 황반변성 유사 동물 모델에서의 핵산복합체의 건성 황반변성 치료 효과 확인을 위한 안저 촬영 (Fundus Angiography) 및 H&E (Hematoxylin & Eosin) 염색
실시예 4-1에서의 실험 조건으로 표 4의 핵산 복합체 PNA 6을 포함하는 안구 점안액을 10 μg / 1 drop 로 하루에 한 번씩 4주간 투여한 뒤 Micron Ⅳ(Phoenix Research Laboratories, 미국)으로 안저 촬영을 실시하였으며, 부검하여 안구를 적출한 후, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 고정시키고 파라핀으로 포매하여 슬라이드 절편을 제작하였다. 슬라이드 절편은 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색하여 광학현미경 하에서 망막 조직을 평가하였다.
그 결과, 도 4a에서 나타낸 바와 같이, 안저 촬영을 통해 NaIO3 투여로 인해 드루젠의 축적과 맥락막 위축이 나타나는 것을 확인하였으며, 안구 점안액을 이용한 핵산 복합체 투여군（PNA6)를 통해 드루젠의 축적 및 맥락막 위축이 완화되는 것을 확인하였다. 또한 H&E 염색법을 이용하여 NaIO3 투여로 인하여 망막색소상피세포가 손상되고 광수용체 세포의 핵들이 밀집되어 있는 외과립층(outer nuclear layer)과 내과립층(inner nuclear layer)에서 층의 명확한 구분이 없어지거나 휘어지거나 붕괴되는 것을 관찰하였으며, 안구 점안액을 이용한 핵산 복합체를 처리한 군（PNA6)에서 망막색소상피세포의 손상이 억제될 뿐 아니라, 외과립층과 내과립층이 붕괴되는 현상이 완화되는 것을 관찰할 수 있었다(도 4b).
실시예 5: 인체 유래 췌장암 세포 PANC-1을 사용한 마우스 동소 이식 동물 모델 (mouse orthotopic model)에서의 핵산 복합체의 췌장암 치료 효과 확인
실시예 3에서 효과가 검증된 안정성을 증가시킨 형태의 5’ 말단 보호기 결합 및 염 함량을 조절한 핵산 복합체 조합을 동일하게 적용한 KRAS 및 KRAS-G12D, Angiogenin 표적 핵산 복합체를 이용하여 인체 유래 췌장암 동소 이식 마우스 모델에서의 효과를 검증하기 위해 표현형 및 조직 및 분자생물학적 소견을 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 5와 같다.
KRAS, KRAS-G12D 및 Angiogenin 활성 억제를 위한 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성
핵산		 서열번호 15 5‘-P-ACT(-)TG(+)CTT(-)CCT(+)GTA(-)GG-O-K-3' -+-+-
서열번호 16 5‘-P-AT(-)CAG(+)CT(-)CCA(+)ACT(-)AC-O-K-3' -+-+-
서열번호 17 5‘-P-T(-)CCA(+)TGT(-)AGC(+)TTG(-)CA-O-K -+-+-
캐리어
펩티드
핵산		 서열번호 18 5’-P-TGA(+)ACGAA(+)GGACAT(+)CC-O-K-3’ +++
서열번호 19 5‘-K-O-GT(+)AGTTGG(+)AGCTG(+)AT-3’ +++
서열번호 20 5’-K-O-TG(+)CA(+)A-3’ ++
인간 유래 췌장암 세포 PANC-1 세포를 사용한 마우스 동소이식 모델에서의 치료 효과 분석 및 KRAS, KRAS-G12D, Angigogenin과 하위 유전자 발현 억제 효과 비교 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA7 서열번호 15 및 서열번호 18
PNA8 서열번호 16 및 서열번호 19
PNA9 서열번호 17 및 서열번호 20
실시예 5-1: 인간 유래 췌장암 세포 PANC-1을 사용한 마우스 동소 이식 동물 모델 (mouse orthotopic model) 구축
동소 이식 동물 모델에서 효능을 검증하기 위하여 5주령 암컷 누드 마우스(오리엔트바이오, 한국)를 사용하였다. 종양 모델 생성을 위해 쥐의 복부 측면을 개복하여 췌장을 일부 노출한 후 췌장의 꼬리 부분에 인체 유래 췌장암 세포 PANC-1(CRL-1469TM, ATCC)을 1 x 106/50μL 만큼 주사하였다. 주사한 쥐를 수초한 후 종양이 증식하도록 1-2주간 계류 후 각 실험군 당 여섯 마리의 쥐를 사용하여 군 분리를 하였다.
실시예 5-2: 인체 유래 췌장암 세포 PANC-1을 사용한 마우스 동소이식 모델 (orthotopic mouse model)에서의 췌장암 치료 효과 표현형 분석
실시예 5-1을 통해 구축된 동물모델에서 핵산 복합체의 효능을 검증하기 위해 핵산 복합체 투여군은 일주일에 두 번씩 미정맥을 투여하였고, 3주간 총 6회 투여 후 부검하여 종양을 적출한 뒤 종양의 외형 및 크기의 차이점을 관측하고, 적출한 조직을 4% 포름알데히드에 고정하고 파라핀 포매하여 H&E 염색을 통해 종양의 크기 변화를 분석하였다.
그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, 핵산 복합체 처리군에서 대조군 대비 종양의 크기가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었으며, H&E 분석을 통해서도 정상 췌장 조직 부위가 핵산 복합체 처리군에 의해 많이 회복되어 있는 것을 확인할 수 있었다. image J 프로그램을 이용하여 췌장 조직 내 암의 분포를 수치화하여 바그래프로 표시하였다(도 5a 하단).
실시예 5-3: 웨스턴 블럿 분석(Western Blot assay)으로 유전자 발현 변화 분석
실시예 5-1의 조건으로 실험을 진행하여 생검한 마우스 종양 조직의 일부를 RIPA buffer를 200 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 KRAS (abcam, 영국), KRAS-G12D (cell signaling technology, 미국), Angiogenin (abcam, 영국), p-Akt (cell signaling technology, 미국), p-EGFR (abcam, 미국), p-ERK (cell signaling technology, 미국), HRAS (abcam, 영국), NRAS (abcam, 영국) 를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Mouse Anti-Goat (Santa cruz Biotechnology, 미국) 를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 췌장암 조직에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 대조군 대비 각 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 핵산 복합체 7 내지 8의 경우, HRAS 및 NRAS의 발현 변화 없이 KRAS, KRAS G12D의 발현 및 하위 경로 유전자 p-ERK의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한 핵산 복합체 9의 경우, 표적 유전자인 Angiogenin의 발현 및 하위 경로 유전자인 p-EGFR, p-Akt의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 5b 하단).
실시예 5-4: 면역염색으로 췌장암 동소이식 동물 모델에서의 조직 내 KRAS 및 Angiogenin 발현 변화 분석
실시예 5-1의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 세포주 접종 부위 종양 조직을 떼어내어 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 0.5% BSA 용액에 1시간 동안 블락킹하고, KRAS 1차 항체(Abcam, 영국) 및 Angiogenin 1차 항체(abcam, 영국)을 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 이어서 1차 항체 용액을 제거하고 1X TBS로 씻어낸 후 2차 항체 용액 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국)을 1:2000 으로 상온에서 2시간 처리한 후 DAB 염색을 통해 분석하였다.
도 5c에서 나타난 바와 같이, 대조군에서 증가된 갈색 반응이 각 핵산 복합체 조합을 처리한 군에서 현저히 감소되는 것을 확인하였으며, image J 프로그램을 이용하여 이를 수치화하였다.
실시예 6: 인간 유래 교모세포종 세포 U87MG를 이용한 동소 이식 마우스 동물 모델 (Orthotopic mouse model)에서의 교모세포종 치료 효과 분석
실시예 3에서 효과가 검증된 안정성을 증가시킨 형태의 5’ 말단 보호기 결합 및 염 함량을 조절한 핵산 복합체 조합을 동일하게 적용한 TGFβ2 표적 핵산 복합체를 이용하여 인체 유래 교모세포종 동소 이식 마우스 모델에서의 효과를 검증하기 위해 표현형 및 조직 및 분자생물학적 소견을 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표와 같다.
TGFβ2 활성 억제를 위한 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 21 5‘-P-AAC(-)TG(+)GT(-)CCA(+)TAT(-)CG-O-K-3’ -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 22 5’-K-O-CG(+)ATATGG(+)ACCA(+)GTT-3’ +++
인간 유래 교모세포종 세포 U87MG를 이용한 마우스 동소 이식 동물 모델에서의 치료 효과 분석 및 TGFβ2와 하위 유전자 발현 억제 효과 비교 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA10 서열번호 21 및 서열번호 22
실시예 6-1:인간 유래 교모세포종 세포 U87MG를 사용한 마우스 동소 이식 동물 모델 (mouse orthotopic model) 구축
동소 이식 동물 모델에서 효능을 검증하기 위하여 7주령 암컷 누드 마우스(오리엔트바이오, 한국)를 사용하였다. 종양 모델 생성을 위해 마우스는 Avertin (5mg/kg)으로 마취하여 소동물용 뇌정위고정기 (Stereotaxic instruments, Stoelting Co, 미국)에 고정 후 3x105의 세포 수로 인간 유래 교모세포종 세포 U87MG 세포(HTB-14™, ATCC)를 해밀턴 주사기를 이용하여 주입하였다. 주입 좌표는 AP +0.5mm, ML +2.0mm DV -3mm 이다. 종양이 증식하도록 10일 계류한 후, 각 실험군 당 여섯 마리의 쥐를 사용하여 군 분리를 하였다.
실시예6-2: 동소 이식 동물 모델 (Orthotopic mouse model) 에서의 교모세포종 표현형 효과 분석
실시예 6-1을 통해 구축된 동물모델에서 핵산 복합체의 효능을 검증하기 위해 핵산 복합체 투여군은 일주일에 두 번씩 미정맥을 투여하였고, 양성 대조군(PC)의 경우 TGF-β receptor 억제제인 galunisertib (MedChemexpress, 미국)을 75mg/kg의 용량으로 매일 경구투여하였다. 3주간 총 6회 투여 후 마우스 뇌 조직을 생검하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 30% 설탕 용액에 담가 3일 동안 탈수한 후, OCT 용액에 포매 (embedding) 하였다. 포매한 조직은 -20℃에서 보관하여 얼린 후, 동결절편기 (Cryostat, Leica, 미국)에서 조직을 20μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 Hematoxylin:Eoin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 현미경으로 종양의 크기 변화를 분석하였다.
도 6a에 나타난 바와 같이, 종양이식 대조군 vehicle 군 대비 핵산 복합체 처리군에서 종양의 크기가 현저히 감소한 것을 확인하였고, 양성 대조군 (Positive contorl, PC)보다 더 종양의 크기가 감소한 것을 확인하였다. 종양의 크기는 image J 프로그램을 사용하여 정량적으로 나타내었다.
실시예 6-3: 웨스턴 블럿 분석(Western Blot assay)으로 유전자 발현의 분석
실시예 6-1의 조건으로 실험을 진행하여 생검한 마우스 뇌 조직에 생성된 종양 조직 일부를 RIPA buffer를 각 조직에 200 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 TGF-β2 (SantaCruz Biotechnology, 미국), p-Smad3 (Cell signaling technology, 미국) 를 1:1000으로 처리하고 4℃ 에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Anti-Mouse (Santa cruz Biotechnology, 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 마우스 뇌 조직에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 6b에 나타난 바와 같이, 핵산 복합체 처리군에서 대조군에 비해 표적 유전자인 TGF-β2 와 하위 유전자인 p-Smad3의 발현이 억제된 것을 확인하였다.
실시예 6-4: 면역염색으로 동소이식 동물 모델에서의 조직 내 TGFβ2 발현 변화 및 세포 증식 억제 효능 분석
실시예 6-1의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 세포주를 접종부위 종양 조직을 떼어내어 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 0.5% BSA 용액에 1시간 동안 블락킹하고, TGFβ2 및 Ki67 1차 항체(Abcam, 영국)을 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 이어서 1차 항체 용액을 제거하고 1X TBS로 씻어낸 후 2차 항체 용액 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국)을 1:2000 으로 상온에서 2시간 처리한 후 DAB 염색을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 6c에서 나타난 바와 같이, 대조군 조직 내 갈색으로 염색된 TGFβ2 및 Ki67 발현이 확인되었으며, 핵산 복합체 처리군에서 TGFβ2 및 Ki67 발현이 감소한 것이 관찰되었다. 이를 수치화하여 비교하였을 때에 양성 대조군 대비 핵산 복합체 처리군에 의해 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 7: 핵산 복합체의 알츠하이머성 치매 유사 세포 모델에서의 치료 효과 확인
실시예 3에서 효과가 검증된 안정성을 증가시킨 형태의 5’말단 보호기 결합 및 염 함량을 조절한 핵산 복합체 조합을 동일하게 적용한 NLRP3 표적 핵산 복합체를 이용하여 알츠하이머성 치매 유사 세포 모델에서의 효과를 검증하기 위해 표현형 및 분자생물학적 소견을 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표와 같다.
NLRP3 활성 억제를 위한 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성
핵산		 서열번호 23 5‘-P-AC(-)CT(+)CTA(-)CGC(+)AAT(-)CC-O-K-3’ -+-+-
서열번호 24 5’-P-ACG(-)TGC(+)ATT(-)AT(+)CT(-)GA-O-K-3’ -+-+-
캐리어
펩티드
핵산		 서열번호 25 5’-P-TG(+)GAGAT(+)GCGTTA(+)GG-O-K-3’ +++
서열번호 26 5’-P-TGC(+)ACGTAA(+)TAGA(+)CT-O-K-3’ +++
알츠하이머성 치매 유사 세포모델에서의 치료 효과 분석 및 NLRP3와 하위 유전자 발현 억제 효과 비교 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA11 서열번호 23 및 서열번호 25
PNA12 서열번호 24 및 서열번호 26
실시예 7-1: 생쥐의 뇌 조직으로부터 일차 미세아교세포 분리 및 배양
일차 미세아교세포를 생쥐의 뇌 조직에서 분리하여 배양하기 위해, 1일령 신생아 SD 랫드 (나라바이오텍, 한국)를 구입하여, 뇌 조직을 분리하였다. 수막과 다른 조직 부위를 제거한 피질 (Cortex)을 iced 1x HBSS (gibco, 미국)가 담긴 페트리디쉬에 옮긴 후 파이펫을 사용하여 조직을 해리시키고, 1200rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액은 버리고 남은 pellet에 DMEM 배양배지 (Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖, GlutaMAX (Gibco, 미국) 0.1%를 첨가한 mixed glial cell 배양 배지를 넣어 세포를 풀어준 후, 전날 미리 PLL (Poly-L-lysine, Sigma, 미국)로 코팅한 75T 플라스크에 세포를 씨딩하였다. 세포 배양 14일 후, mixed glial cell 배양 배지에 인슐린 (Sigma, 미국) 5㎍/㎖를 첨가한 소교세포 배양 배지로 교체한 후 상기 플라스크를 2시간 동안 160rpm, 37℃의 조건에서 orbital shaker로 교반하고, 부유 세포만을 갖는 상층액을 수집하여 1200rpm에서 8분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다. 알츠하이머성 치매 유사 염증 세포 모델을 만들기 위해 표 10의 핵산 복합체 처리 4시간 후, LPS 100 ng/ml과 ATP 5mM 처리하여 배양하였다.
실시예 7-2: 웨스턴 블럿 분석 (Western Blot assay)으로 유전자 발현의 분석 확인
실시예 7-1의 배양 조건으로 실험을 진행하여 표 10의 NLRP3 활성 억제를 위한 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 4시간 후, LPS 100 ng/ml과 ATP 5mM 처리하여 각각 24, 48, 72시간 배양하였고, RIPA buffer를 각 웰에 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 NLRP3 (abcam, 미국), procaspase-1, caspase-1 (SantaCruz Biotechnology, 미국), proIL-1beta, IL-1beta (Abcam, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃ 에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Anti-Mouse (Santa cruz Biotechnology, 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 7a에서 나타난 바와 같이, 양성 대조군으로 사용한 NLRP3 억제제인 MCC950 (sigma, 미국) 대비 핵산 복합체 처리군 (PNA 12)에서 NLRP3 및 하위 단계 유전자인 procaspase-1, pro-IL1β의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 7-3: 뇌 조직에서의 뉴런 세포 분리 및 배양
본 실시예에서는 체내에서 미세아교세포가 염증 반응을 일으킴으로 인해 발생할 수 있는 뉴런 세포의 알츠하이머성 치매의 발병 유전자 (타우, 타우 인산화) 발현 변화를 확인하였다 (Ising, C., Venegas, C., Zhang, S. et al., 2019).
실시예 7-1의 조건으로 신생아 랫드에서 일차 미세아교세포를 분리하고 배양 7일 차에 신생아 랫드를 구입하여, 뇌 조직에서 뉴런 세포를 분리하여 배양하였다. 분리한 뇌 조직에서 해마 (Hippocampus)를 실체 현미경 (Leica, 미국) 하에서 분리한 후, 0.25% Tripsin (Gibco, 미국)와 10μM DNase (Roche, 스위스)를 넣고 37℃에서 15분 동안 방치하였다. 파이펫을 이용하여 조직을 균질화 (homogenization) 한 후 3,000rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상층액은 버리고 남은 pellet에 Neurobasal-A 배양배지(Gibco, 한국)에 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖, 2% B-27 supplement (Gibco, 미국)를 첨가한 NM1 배양 배지를 넣어 세포를 풀어준 후, 전날 미리 PLL (Poly-L-lysine, Sigma, 미국)로 코팅한 6웰 플레이트에 각각 그룹별로 1 x 105 세포를 씨딩하였다. 분리한 뉴런 세포의 DIV3 (Days of in vitro)에 5μM Ara-c를 첨가한 NM1 배양 배지로 교체하여 glial 세포가 자라지 않도록 막아준 후, DIV7에 뉴런 세포만 플레이트에서 배양되는 것을 현미경 하에서 확인하였다.
실시예 7-4: 미세아교세포 염증 활성화 및 뉴런 세포 컨디셔닝
미세아교세포에서 알츠하이머성 치매 유사 염증 모델을 만들기 위해 6웰 플레이트에 6웰 플레이트에 1 x 105 세포를 씨딩하고 24시간 후, 각각 LPS 100 ng/ml 3시간 또는 6시간, ATP 5mM 30분을 처리하여 배양하였다. 1x PBS (phosphate buffer saline, Welgene, 한국)로 1번 워시한 후, 뉴런 세포 배양 배지인 NM1 배지를 2ml씩 넣고, 24시간 배지 컨디셔닝 (media conditioning)을 진행하였다. 컨디셔닝 24시간 후, 배지는 필터링하고 B-27 supplement 첨가하여 다시 뉴런 세포에 처리하여 24시간 배양하였다.
실시예 7-5: 웨스턴 블럿 분석(Western Blot assay)으로 유전자 발현의 분석 확인
실시예 7-4의 조건으로 배양된 미세아교세포와 뉴런 세포에 RIPA buffer를 각 웰마다 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 p-Tau(AT8) (Thermo Fisher, 미국), Tau (Thermo Fisher, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Anti-Mouse (Santa cruz Biotechnology, 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 쥐의 미세아교세포에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, LPS를 처리하여 면역 반응을 활성화시킨 미세아교세포 배양 배지를 처리한 뉴런 세포에서 알츠하이머성 치매 발병 유전자인 인산화된 타우의 발현이 시간이 지남에 따라 증가하고 핵산 복합체 처리군(PNA12)에서 양성 대조군인 MCC950 대비 인산화가 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 7b).
실시예 8: 핵산 복합체의 MPTP (1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridine)/프로베네시드(Probenecid)로 유도한 파킨슨병 동물 모델에서의 핵산 복합체의 치료 효과 확인
실시예 3에서 효과가 검증된 안정성을 증가시킨 형태의 5’ 말단 보호기 결합 및 염 함량을 조절한 핵산 복합체 조합을 동일하게 적용한 NLRP3 및 TLR2 표적 핵산 복합체를 이용하여 알츠하이머성 치매 유사 세포 모델에서의 효과를 검증하기 위해 마우스의 운동능력 개선 여부를 확인하기 위해 행동 평가 및 조직 *?* 분자생물학적 소견을 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표와 같다.
NLRP3 및 TLR2 활성 억제를 위한 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성
핵산		 서열번호 27 5‘-P-AC(-)CT(+)CTA(-)CGC(+)AAT(-)CC-O-K-3’ -+-+-
서열번호 28 5’-P-ACG(-)TGC(+)ATT(-)AT(+)CT(-)GA-O-K-3’ -+-+-
서열번호 29 5‘-P-A(-)TGT(+)AGG(-)TG(+)ATCC(-)TGTT-O-K -+-+-
캐리어
펩티드
핵산		 서열번호 30 5’-P-TG(+)GAGAT(+)GCGTTA(+)GG-O-K-3’ +++
서열번호 31 5’-K-O-TC(+)AGAT(+)AATGCA(+)CGT-3’ +++
서열번호 32 5'-K-O-A(+)ACAGGA(+)TCACCT(+)ACAT-3’ +++
MPTP(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridine)/프로베네시드(Probenecid)로 유도한 파킨슨병 동물 모델에서의 치료 효과 분석 및 NLRP3 및 TLR2와 하위 유전자 발현 억제 효과 비교 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA13 서열번호 27 및 서열번호 30
PNA14 서열번호 28 및 서열번호 31
PNA15 서열번호 29 및 서열번호 32
실시예 8-1: MPTP/프로베네시드 유도성 파킨슨병 동물 모델 제작
MPTP/프로베네시드 파킨슨병 동물모델에서 핵산 복합체의 파킨슨병 치료 효능을 검증하기 위하여 7주령 수컷 C57BL/6 마우스(나라바이오텍, 한국)를 사용하였으며, 7일간 순화 후 실험에 사용하였다. 파킨슨병 유사 모델 구축을 위하여 MPTP 25 mg/kg 그리고 프로베네시드 250 mg/kg이 사용되었으며, 장기적 투여에 의한 손상 모델 제작을 위해 3.5일 간격으로 5주간 총 10회 복강내 주사를 진행하였다. MPTP와 프로베네시드의 4회 투여 이후 각 실험군당 10마리씩 무작위로 선별하여 사용하였으며, 표 12의 핵산 복합체를 일주일에 두 번씩 4주간 마우스 미정맥에 투여하였다. 이때 양성 대조군에는 파킨슨병 환자의 표준 치료제로 사용되는 레보도파 (Levodopa, sigma, 미국) 250 mg/kg을 25 mg/kg 칼비도파 (carbidopa, sigma, 미국)와 혼합하여 핵산 복합체 투여 시작 시점부터 4주간 매일 경구투여를 진행하였다.
실시예 8-2: 로타로드 검사 (rotarod test)를 이용한 운동 기능 변화 분석
본 실시예에서는 핵산 복합체에 의해 파킨슨병 동물모델의 병변 특징인 운동 결손과 균형 유지를 개선하는 효과를 평가하기 위해 핵산 복합체 투여 종료 후, 로타로드 검사 (rotarod test)를 진행하였다.
로타로드 (정도비앤피, 한국)는 지름 7cm, 15cm 간격으로 60cm 높이의 총 5개의 칸으로 구성된 회전이 가능한 원통형의 봉이 있는 제품이며, 회전하는 봉 위에서 마우스의 운동성 검증을 위해 사용되는 동물 행동 검사용 장비이다. 운동성 검사 진행 전 모든 실험동물은 3일 동안 회전하는 봉에 대한 훈련을 진행하였다. 검사에 사용된 로타로드는 속도가 0-40 rpm 까지 일정하게 증가하도록 설정하였으며, 회전하는 봉 위에 실험동물을 올려놓고 총 300초 동안 낙하하기까지 걸린 머무름 시간(Latency time)을 세 번의 반복 실험 후 평균값을 사용하여 핵산 복합체의 치료 효과를 분석하였다.
그 결과, 도 8a 첫번째(Rotarod)에서 나타낸 바와 같이, 파킨슨병 유도 모델 (MPTP/p)은 회전하는 봉 위에서 오랜 시간 버티지 못하고 낙하한 반면, 핵산 복합체 14(PNA 14)와 핵산 복합체 15(PNA 15)를 처리한 그룹의 봉 위에 머무르는 시간이 증가하며 파킨슨병의 운동성 행동 장애가 개선된 것을 확인하였다.
실시예 8-3: 폴 검사 (pole test)를 이용한 운동 기능 변화 분석
실시예 8-1의 조건으로 제작된 파킨슨병 동물 질환 모델을 사용하여 핵산 복합체 투여에 의한 무운동성과 경직반응 회복 여부를 평가하기 위해 폴 검사를 진행하였다.
폴 검사는 폭 0.8cm, 높이 55cm 막대기를 사용하여 마우스가 하늘을 향하도록 올려놓은 뒤 180° 회전하여 바닥에 도착하는 데까지 소요되는 총시간을 측정하는 방식으로 진행하였다. 검사 진행 전 모든 실험동물에 대해 동일한 횟수의 훈련을 진행하였으며, 본 실험은 핵산 복합체 투여 종료 후 진행하였다. 실험은 세 번 반복 진행되었으며, 결과 분석은 평균값을 사용하였다.
그 결과, 도 8a 가운데(Pole test)에서 나타낸 바와 같이 파킨슨병을 유도한 MPTP/프로베네시드 동물 그룹은 운동성 저하 및 경직반응으로 인해 정상 마우스 (NC) 대비 지면에 닿는 총 시간이 증가하였다. 반면 핵산 복합체 14(PNA 14)와 핵산 복합체 15(PNA 15)를 처리한 그룹은 꼭대기에서 방향 회전 후 바닥에 도착하기까지의 시간이 감소하며 정상 마우스 수준으로 운동기능 장애와 경직반응 등이 개선된 것을 확인하였다.
실시예 8-4: 실린더 검사 (cylinder test)를 이용한 운동 기능 변화 분석
실시예 8-1의 방법으로 파킨슨병 유도한 동물 모델에서의 핵산 복합체 투여에 의한 감각 운동기능 치료 효과를 확인하기 위해 실린더 검사를 진행하였다.
마우스는 새로운 환경에 놓이면 주변을 탐색하기 위해 앞발 두 개를 들어 벽을 짚는 행동을 취하는 것이 일반적이나 파킨슨병 동물모델에서는 이러한 감각성 운동 기능이 저하되는 것이 특징이다. 이를 검증하기 위해 투명한 실린더에 마우스를 넣은 후 앞발 사용 횟수를 측정하였다. 실험은 핵산 복합체 투여 종료 다음 날 진행되었으며, 별도의 훈련 없이 실린더에서 3분 동안 앞발로 실린더 벽면을 짚는 횟수를 측정한 결과를 사용하였다.
그 결과, 도 8a 세번째(Cylinder test)에서 나타낸 바와 같이, 신경 독성물질인 MPTP에 노출된 MPTP/프로베네시드만 투여한 동물 그룹은 앞발 사용 횟수가 정상 마우스 대비 감소하였으며, 이와 대조적으로 핵산 복합체 14(PNA 14)와 핵산 복합체 15(PNA 15)를 처리한 그룹은 앞발 사용 횟수가 증가하며 파킨슨병 동물 모델에서의 감각 운동 장애 치료 효능을 확인하였다.
실시예 8-5: 웨스턴 블럿 분석(Western Blot assay)을 이용한 유전자 발현 분석 확인
실시예 8-1의 방법으로 실험 진행 후 종료일에 적출한 뇌 조직에서 선조체와 흑질을 분리하였으며, RIPA buffer를 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 NLRP3 (abcam, 영국), IL1β (abcam, 영국), TLR2 (abcam, 영국), p-p65 (Cell signaling, 미국), Tyrosine Hydroxylase (TH, abcam, 영국), 알파-시누클레인 (α-synuclein, abcam, 영국)을 1:1000으로 처리하고 4 ℃ 에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국)을 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
본 실시예에서는 파킨슨병 유도 동물모델의 뇌 조직 중에서도 발병에 중요한 뇌 영역인 선조체와 흑질 내에서 비교 분석하였다.
그 결과, 도 8b에서 나타낸 바와 같이, 선조체(Striatum)와 흑질(substantia nigra) 부위의 유전자 발현 분석을 확인하였을 때 NLRP3 표적 핵산 복합체 14(PNA 14)의 경우, NLRP3 및 하위 유전자인 IL1β의 발현을 대조군인 레보도파 대비 효과적으로 억제하였으며, TLR2 표적 핵산 복합체 15의 경우도 TLR2와 하위 유전자인 p-p65의 발현을 양성 대조군 대비 효과적으로 억제하였다. 두 핵산 복합체 조합 모두 파킨슨병에서 나타나는 알파시누클레인의 과발현을 억제할 뿐만 아니라 TH의 발현 감소를 회복시키는 효과를 나타내었다.
실시예 8-6: 면역염색법을 이용한 파킨슨병 동물 모델에서의 조직 내 발현 변화 분석
실시예 8-1의 조건으로 실험 진행 후 종료일에 마우스 뇌 조직을 분리하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 30% 설탕 용액에 담가 3일 동안 탈수한 후, OCT (Leica, 미국) 용액에 포매 (embedding) 하였다. 포매한 조직은 -20℃에서 보관하여 얼린 후, 동결절편기 (Cryostat, Leica, 미국)를 사용하여 조직을 20μm로 섹션한 후 슬라이드 글라스에 마운팅(mounting)하였다. 마운팅한 조직은 1 % BSA 용액을 사용하여 2시간 동안 블락킹하였으며, 티로신 하이드록실레이즈(Tyrosine Hydroxylase, abcam, 미국), 알파-시누클레인 (α-synuclein, abcam, 미국), IBA1 (wako, 일본) 1차 항체를 처리한 후 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 이어서 1차 항체 용액을 제거하고 1X TBS로 씻어낸 후 2차 항체 용액 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국)을 1:2000으로 상온에서 2시간 처리하였다. 1X TBS를 사용하여 2차 항체 씻어낸 후 DAB 염색을 통해 발현을 분석하였다.
본 실시예에서는 파킨슨병 유도 동물모델의 뇌 조직에서 도파민성 신경세포와 발병 요인인 알파-시누클레인 및 면역세포의 발현 정도를 분석하였으며, 발병에 중요한 뇌 영역인 선조체와 흑질 내에서 비교 분석하였다.
파킨슨병 동물모델에서 도파민성 신경세포의 변화를 분석한 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이 선조체에서의 도파민성 신경세포의 마커인 TH (tyrosine hydroxylase)가 MPTP/프로베네시드 파킨슨병 유도 모델에서 감소하여 갈색 반응이 적게 나타난 것을 확인하였다. 반면 핵산 복합체 14와 15를 투여한 그룹에서는 갈색 반응의 TH 마커 발현이 증가된 것을 확인하였다. 흑질 부위에서의 분석도 선조체와 동일한 마커를 사용하여 분석하였다. 그 결과, MPTP/프로베네시드만 투여한 그룹에서는 도파민성 신경세포의 발현 정도가 감소한 것을 확인하였으며, 핵산 복합체 14와 15를 투여한 그룹에서는 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 8c).
파킨슨병의 또 다른 병인 요인인 알파-시누클레인의 발현을 확인한 결과, 파킨슨병 유도 모델 (MPTP/p)군에서 선조체와 흑질 조직 내 갈색 반응이 증가하여 마커 발현이 증가한 것을 확인하였으며, 핵산 복합체 14(PNA 14)와 핵산 복합체 15(PNA 15) 투여군에서는 알파-시누클레인의 갈색 반응이 현저하게 감소한 것이 관찰되었다(도 8d). 갈색 반응이 나타난 마커들을 수치화해 비교하였을 때 양성 대조군을 처리한 그룹에서 증가한 마커의 발현에 비해 핵산 복합체 14(PNA 14)와 핵산 복합체 15(PNA 15)를 투여한 그룹에서 알파-시누클레인의 발현은 정상 마우스 (NC)와 유사한 수준으로 감소하는 것이 나타났다(도 8d).
실시예 9: 메티오닌/콜린 결핍 식이를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (MCD mouse model) 에서의 핵산 복합체의 비알콜성 지방간염 치료 효과 분석
본 실시예에서는 비알콜성 지방간염 질환과 유사한 표현형을 보이는 동물 모델 중, MCD (Methionine-Choline Deficient diet) 식이요법을 이용한 동물 모델을 사용하였으며, 해당 식이는 자당과 지방 함유량이 높으면서 간 베타-산화와 VLDL (very low density lipoprotein) 생성에 필수적인 메티오닌과 콜린이 결핍되어 있다. 이 식이요법을 진행한 동물 모델은 간 내 지질 축적 및 VLDL 합성 감소를 초래하는 것으로 알려져 있으며, 2-4주까지 식이 진행 시, 설치류에서 빠른 기간 내에 간 지방증 (주로 거대수포성 지방증)을 유발할 뿐만 아니라 이후 섬유증까지 진행되는 것으로 보고되어 있다. 다만, MCD 식이를 이용한 동물 모델이 비알콜성 지방간염에서 나타나는 질환의 대표적인 표현형은 나타나는 것으로 알려져 있으나, 체중 감소나 인슐린 저항성을 갖지 않는 특징을 보여 비만과 인슐린 저항성을 가지는 실제 NASH 환자의 표현형과는 다소 차이를 보일 수 있다 (Anstee et al., Int J Exp Pathol, 2006).
또한, 실시예 3에서 효과가 검증된 안정성을 증가시킨 형태의 5’ 말단 보호기 결합 및 염 함량을 조절한 핵산 복합체 조합을 동일하게 적용한 NLRP3 표적 핵산 복합체를 이용하여 비알콜성 지방간염 동물 모델에서의 효과를 검증하기 위해 표현형 및 조직·분자생물학적 소견을 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 13 및 표 14와 같다.
NLRP3 활성 억제를 위한 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 33 5‘-P-ACG(-)TGC(+)ATT(-)AT(+)CT(-)GA-O-K-3’ -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 34 5’-K-O-TC(+)AGAT(+)AATGCA(+)CGT-3’ +++
비알콜성 지방간염 동물 모델에서의 치료 효과 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA16 서열번호 33 및 서열번호 34
실시예 9-1: 메티오닌/콜린 결핍 식이를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 구축
MCD 식이를 이용한 비알콜성 지방간염 동물 모델에서 효능을 검증하기 위하여 7주령 수컷 마우스(코아텍, 한국)를 사용하였다. 일주일 동안 계류 후, 비알콜성 지방간염 모델 유도를 위해 메티오닌/콜린 결핍 식이(두열바이오텍, 한국)를 진행하였으며, 섭취 4주 후 각 실험군 당 여섯 마리를 사용하여 일주일에 두 번씩 핵산 복합체를 피하 주사로 투여하였다. 표 14의 핵산 복합체를 2주간 총 4회 투여하였고 이후 모든 동물은 안락사 수행하였다.
실시예 9-2: 메티오닌/콜린 결핍 식이를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델에서의 간 형상 및 H&E 염색을 이용한 표현형 분석
실시예 9-1의 조건으로 진행한 동물 실험에서 실험 종료 후 간을 적출하여 외형을 비교해 차이점을 관측하였다.
그 결과, 도 9a 윗 부분 도면에서 나타난 바와 같이, 위축된 간의 형태를 나타내는 MCD 유도군 대비 핵산 복합체를 처리한 군(PNA16)에서 간의 위축이 회복되고, 건강한 간에서 나타나는 붉은 색의 형상이 회복되는 것을 확인하였다.
간의 형태학적인 소견을 확인하기 위해 실시예 9-1의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 분리한 간 조직을 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 파라핀 포매하였고, 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 마운팅한 조직을 Hematoxylin & Eosin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 현미경으로 분석하였다.
그 결과, MCD 식이에 의해 유도된 비알콜성 지방간염에서 나타나는 질환 표현형(지방증, 세포 풍선화, 염증세포 침윤 등)이 MCD 유도군 대비 핵산 복합체를 처리한 군(PNA16)에서 감소하여 병변이 개선되는 것을 확인하였다(도 9a 하단).
H&E 염색을 통해 나타나는 질환 표현형을 NAFLD activity scoring(Elizabeth, M.B. 등, Hepetology, 53(3);810-820, (2011))을 통해 지방증(steatosis), 세포 풍선화(ballooning), 염증 세포 침윤(Lobular inflammation) 등의 각 항목에 대해 특정 간 조직 부위를 점수화하여 수치화한 결과, 핵산 복합체 투여군(PNA16)에서 NAS score가 개선되는 것을 확인하였다(도 9b).
실시예 9-3: ORO 염색을 이용한 메티오닌/콜린 결핍 식이를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (MCD mouse model)에서의 간 내 지질 침착 억제 효과 분석
실시예 9-1의 조건으로 실험을 진행한 후 생검한 마우스의 간 조직을 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 30% sucrose 용액에 24시간 수분 제거하여 OCT compound 포매하였다. 이를 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 마운팅한 조직을 Oil red O 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 형태학적인 소견을 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 9c 상단에서와 같이 MCD 식이에 의해 유도된 간 조직 내 붉은색 방울로 염색된 형태의 지질 침착이 질환 유도군 (MCD)에서 확인되었고, 유도군 대비 핵산 복합체를 처리한 그룹(PNA16)에서 붉은색으로 염색된 지방 방울의 분포나 크기가 감소한 것을 확인하였다.
실시예 9-4: picrosirius red 염색을 이용한 메티오닌/콜린 결핍 식이를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (MCD mouse model)에서의 간 섬유화 억제 효과 분석
실시예 9-3과 동일한 조건으로 고정, 파라핀 포매 및 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅한 조직을 picrosirius red 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 형태학적인 소견을 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 9c 하단에서와 같이 MCD 식이에 의해 붉게 염색된 간 섬유화의 특징들이 대조군 대비 핵산 복합체를 처리한 그룹(PNA16)에서 감소한 것을 확인하였다.
실시예 9-5: 웨스턴 블럿 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
실시예 9-1의 조건으로 실험을 진행한 후, 생검한 마우스 간 조직의 일부를 RIPA buffer를 200 ㎕씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 ㎍을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 NLRP3 (Abcam, 영국), α-SMA (abcam, 영국), IL-1β (Abcam, 영국) 를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Mouse Anti-Goat (Santa cruz Biotechnology, 미국) 를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 간 조직에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 9d와 같이 대조군 대비 핵산 복합체를 처리한 그룹(PNA16)에서 NLRP3 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자 IL-1β의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 특히 간 섬유화 마커인 α-SMA가 핵산 복합체 조합을 처리한 군에서 감소한 것을 확인하였다.
실시예 10: 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 탈염(slting out) 및 보호기 수식에 따른 안정성 변화
펩티드 핵산의 합성과정에서 사용되는 TFA(Trifluoroacetic acid)를 제거하는 탈염 공정을 수행한 후, 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩타이드 핵산의 TFA 함량을 표 15에 나타내었다.
본 발명에서는 펩타이드 핵산에 대하여 황산암모늄((NH4)2SO4)을 이용한 탈염을 수행하였으며, 표 15에 나타난 바와 같이, 탈염과정 수행 후, TFA염 함량이 현저히 감소하였다.
탈염 과정을 거처 염 함량이 0.5% 미만인 생활성 핵산과 펩티드 핵산을 DMSO 용액에 3개월 보존 한 후, HPLC를 수행하여, 안정성을 확인하였으며, TFA 염 함량 0.5% 미만으로 탈염된 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 5'말단에 아세틸기를 수식한 펩티드 핵산을 DMSO에서 12개월간 보존한 후, HPLC를 수행하여 안정성을 확인하였다.
그 결과, 도 10a에 나타난 바와 같이, 탈염된 펩티드 핵산의 경우, 생활성 핵산과 캐리어 핵산이 분해되어 보관안정성이 현저히 떨어지는 것을 확인하였다.
반면, 도 10b에 나타난 바와 같이, TFA 염 함량 0.5% 미만으로 탈염된 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 5'말단에 아세틸기를 수식하여 반응성을 제거한 경우, DMSO 용액에서 12개월 이상 보관하더라도 안정성이 유지되는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 보호기로 아세틸기로 수식되는 경우의 위치를 도 11에 나타내었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (24)

  1. 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산(Bioacitve Peptide Nucleic Acid); 및
    상기 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체에 있어서,
    상기 생활성 펩티드 핵산 및/또는 상기 캐리어 펩티드 핵산의 말단이 아미노기를 보호할 수 있는 보호기로 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 보호기는 일킬기(alkyl), 아실기(acyl) 및 황산기(sulfonyl)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 알킬기는 메틸기, 에틸기, 프로필기 및 부틸기로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 아실기는 아세틸기, 프로피오닐기, 말로닐기 및 벤조일기로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 보호기는 펩티드 핵산의 5' 말단에 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산 또는 상기 캐리어 펩티드 핵산은 탈염처리 되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산 또는 상기 캐리어 펩티드 핵산은 TFA(Trifluoroacetic acid) 염을 0.5% 미만으로 함유하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
    구조식 (1)
    [ A ≡ C (+) ]

    상기 구조식 (1)에 있어서,
    A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)이고,
    C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고,
    '≡'는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
    A로 표시되는 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며,
    C(+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며,
    캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
  10. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 4 또는 서열번호 5의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 12의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 14의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  12. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 15 내지 서열번호 17에서 선택되는 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 18 내지 서열번호 20에서 선택되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  13. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 21의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 22의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  14. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 24의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 26의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  15. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 28 또는 서열번호 29의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 31 또는 서열번호 32의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  16. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 33의 서열을 가지고, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 34의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  17. 제10항의 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 혈관신생관련 질환은 나이 관련 황반변성, 당뇨병성 황반변성, 당뇨병성 황반부종, 증식성 망막병증, 신생혈관 녹내장, 종양 또는 암, 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 망막부종, 정맥류, 죽상 동맥경화증 및 만성 관절 류마티스로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  19. 제11항의 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 건성 황반변성, 자가면역 질환, 알츠하이머성 치매, 비알콜성 지방간염 및 염증성질환으로 구성된 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  20. 제12항의 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 또는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  21. 제13항의 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  22. 제14항의 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머성 치매, 건성 황반변성, 자가면역 질환, 비알콜성 지방간염 및 염증성질환으로 구성된 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  23. 제15항의 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 파킨슨 병 또는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  24. 제16항의 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염, 알츠하이머성 치매, 건성 황반변성, 자가면역 질환 및 염증성질환으로 구성된 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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