KR20230106325A - 핵산 복합체를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
핵산 복합체를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 혈뇌장벽 투과능을 가지는 핵산 복합체 및 이를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및 이를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 NLRP3를 표적으로 하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 핵산 복합체는 혈뇌장벽 투과능을 가지며, NLRP3의 발현을 효율적으로 억제할 수 있어 퇴행성 뇌질환, 특히 파킨슨병의 예방 또는 치료에 유용하다.
Description
본 발명은 혈뇌장벽 투과능을 가지는 핵산 복합체 및 이를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및 이를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
파킨슨병은 선조체(striatum)와 흑질(substantia nigra) 부위에서 신경 전달 물질인 도파민(dopamine)의 감소로 발생하는 퇴행성 뇌질환으로 운동이상증, 안정시떨림, 경직 및 보행장애를 주된 증상으로 하는 질병이다. 퇴행성 뇌질환 중 유병률이 알츠하이머 질환에 이어 2위에 해당하는 질환으로서, 60세 이상의 인구 중에서 약 1% 정도가 이 질환으로 고통 받는 것으로 보고되어 있다(Ali Samii, et al., Lancet. 2004 May 29;363(9423):1783-93).
파킨슨병은 잘못 접힌(mis-folded) 형태의 알파-시누클레인(α-synuclein)으로 구성된 루이소체(Lewy body)의 축적 및 확산에 의한 도파민성 뉴런(neuron)의 손실이 나타나는 병리학적 특징을 보인다. 파킨슨병을 유발하는 주요 원인인 루이소체는 신경독성(neurotoxic) 물질이며, 뇌의 주변 영역으로 전파(propagation)되고 도파민성 퇴행을 유발한다(Werner Poewe, et al., Nat Rev Dis Primers. 2017 Mar 23;3:17013). 발병 초기의 파킨슨병 환자의 흑질 부위에서는 만성적인 미세아교세포(microglia) 신경염증이 발생하며, 사후에 확인한 파킨슨병 환자의 뇌에서도 이러한 특징은 두드러지게 나타나는 것으로 알려져 있다(Alexander Gerhard, et al., Neurobiol Dis. 2006 Feb;21(2):404-12). 도파민의 퇴행이 진행되는 동안 이러한 만성적인 신경염증은 지속해서 발생하며 병증을 악화시키는데 기여하지만, 알파-시누클레인과 도파민의 감소를 연결하는 명확한 기전은 아직 밝혀지지 않았다.
NLRP3(NLR family pyrin domain containing 3; NACHT, leucine-rich repeat, and pyrin domain(PYD)-containing protein 3(NALP3))은 단백질-코딩 유전자로서, 뉴클레오티드-결합 및 올리고머화 도메인-유사 수용체(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors; NLR)의 패밀리에 속한다. 인플라마좀(inflammasome)은 세포 내의 스트레스 및 환경에 반응하는 센서로 기능하며, 이 중 NLRP3 인플라마좀은 NLRP3 센서, 신호 어댑터인 ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD(caspase activation and recruitment domain)) 및 프로-카스파아제-1(pro-caspase-1)로 구성되어 있다. NLRP3 인플라마좀이 세포의 스트레스에 의해 활성화될 경우 카스파아제-1이 활성화되며, 염증성 사이토카인(cytokine)인 interleukin-1β(IL-1β) 및 IL-18의 방출을 유발하여 염증반응을 시작하게 된다(Shuo Wang, et al., Int Immunopharmacol. 2019 Feb;67:458-464).
최근 파킨슨병 환자의 뇌에서 NLRP3 인플라마좀의 활성화에는 잘못 접힌 알파-시누클레인 단백질의 축적 및 활성화된 미세아교세포가 원인이 될 수 있음이 확인되었다(Gaia Codolo, et al., PLoS One. 2013;8(1):e55375). 이는 잘못 응집된(aggregation) 불용성(insoluble) 알파-시누클레인이 NLRP3 인플라마좀을 활성화한다는 결과와 더불어 미세아교세포의 활성화에 의한 도파민의 감소와 직접적인 상관관계가 있음을 확인한 결과라 할 수 있다. 이러한 최근 연구를 통해 알파-시누클레인 응집으로 NLRP3 인플라마좀이 활성화되고, 미세아교세포의 염증반응 증가로 인해 도파민 퇴화가 유도된다는 것이 확인되었다(Richard Gordon, et al., Sci Transl Med. 2018 Oct 31;10(465):eaah4066).
뇌질환 치료제로 개발된 상당수의 약이 뇌혈관 장벽의 통과가 잘 이루어지지 않는 문제점을 갖고 있다. 이러한 혈뇌장벽의 투과 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았으며, 중추 신경계에 장애가 발생해도 약물을 중추 신경계의 목적으로 하는 영역에 도달시킬 수 없는 현실이며, 효과적인 치료 방법들은 아직 개발되지 않았다.
한편, 전통적인 약제와 다르게 핵산 약제는 표적 특이적 전령 RNA(messenger RNA, mRNA)의 발현을 억제하므로, 단백질을 표적으로 하는 기존 약제로 치료가 불가능 했던 연구 영역을 다룰 수 있게 되었다(Ryszard Kole, et al., Nat Rev Drug Discov. 2012 Jan 20;11(2):125-40). 약제로서의 성능 및 장점으로 인하여 핵산을 이용한 다양한 임상시험이 진행되고 있고, 증가하는 핵산 기반 치료제의 용도에도 불구하고 세포내 도입 또는 혈뇌장벽 투과를 위한 운반체의 사용은 극히 제한적이다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 세포 투과성(cell permeability)이 놀랍게 향상되며, 이를 이용하여 표적 유전자의 발현을 매우 효율적으로 조절할 수 있음을 확인하고, 이러한 세포 독성이 낮고, 생활성 핵산의 세포투과성 및 유전자 발현 조절능력이 향상된 새로운 구조체에 대한 특허를 등록 받은 바 있다(대한민국 등록특허 제10-1963885호). 또한, 본 발명자들은 상기 구조체의 기능에 대한 연구를 지속적으로 수행하여, 우수한 효율로 혈뇌장벽을 투과할 수 있는 능력을 가지는 새로운 구조체를 개발하게 되었다(대한민국 특허출원 제10-2019-0128465호).
이에, 본 발명자들은 혈뇌장벽 투과능이 우수한 핵산 복합체를 이용하여, 퇴행성 뇌질환 치료에 적용하고자 예의 노력한 결과, NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타냄을 규명하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 혈뇌장벽 투과능을 가지는 핵산 복합체 및 이를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 핵산 복합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 핵산 복합체의 사용을 제공한다.
본 발명에 따른 NLRP3를 표적으로 하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 핵산 복합체는 혈뇌장벽 투과능을 가지며, NLRP3의 발현을 효율적으로 억제할 수 있어 퇴행성 뇌질환, 특히 파킨슨병의 예방 또는 치료에 유용하다.
도 1은 LPS로 유도한 파킨슨병 유사 세포 모델에서 핵산 복합체의 표적 유전자 및 하위 유전자 발현 억제능을 확인한 도면이다.
도 2는 LPS로 유도한 파킨슨병 유사 세포 모델에서 핵산 복합체의 표적 유전자의 세포 내 발현 억제능을 확인한 도면이다.
도 3은 조직으로부터 분리한 일차 미세아교세포 모델에서 핵산 복합체의 효능을 확인한 도면이다.
도 4는 MPTP/P 파킨슨병 동물모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 동물 행동 개선능을 확인한 도면이다.
도 5는 MPTP/P 파킨슨병 동물모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위별 표적 유전자 발현 및 하위 유전자 발현 억제능을 확인한 도면이다.
도 6a는 MPTP/P 파킨슨병 동물 모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위 중 선조체(striatum)에서의 Tyrosine Hydroxylase(TH)의 발현 변화를 나타낸 도면이다.
도 6b는 MPTP/P 파킨슨병 동물 모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위 중 흑질(Substantia Nigra)에서의 Tyrosine Hydroxylase(TH)의 발현 변화를 나타낸 도면이다.
도 6c는 MPTP/P 파킨슨병 동물 모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위 중 선조체(striatum)에서의 α-Synuclein의 발현 억제능을 확인한 도면이다.
도 6d는 MPTP/P 파킨슨병 동물 모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위 중 흑질(Substantia Nigra)에서의 α-Synuclein의 발현 억제능을 확인한 도면이다.
도 6e는 MPTP/P 파킨슨병 동물 모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위 중 선조체(striatum)에서의 Ionized calcium-Binding Adapter molecule 1(IBA-1)의 발현 억제능을 확인한 도면이다.
도 6f는 MPTP/P 파킨슨병 동물 모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위 중 흑질(Substantia Nigra)에서의 Ionized calcium-Binding Adapter molecule 1(IBA-1)의 발현 억제능을 확인한 도면이다.
도 2는 LPS로 유도한 파킨슨병 유사 세포 모델에서 핵산 복합체의 표적 유전자의 세포 내 발현 억제능을 확인한 도면이다.
도 3은 조직으로부터 분리한 일차 미세아교세포 모델에서 핵산 복합체의 효능을 확인한 도면이다.
도 4는 MPTP/P 파킨슨병 동물모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 동물 행동 개선능을 확인한 도면이다.
도 5는 MPTP/P 파킨슨병 동물모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위별 표적 유전자 발현 및 하위 유전자 발현 억제능을 확인한 도면이다.
도 6a는 MPTP/P 파킨슨병 동물 모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위 중 선조체(striatum)에서의 Tyrosine Hydroxylase(TH)의 발현 변화를 나타낸 도면이다.
도 6b는 MPTP/P 파킨슨병 동물 모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위 중 흑질(Substantia Nigra)에서의 Tyrosine Hydroxylase(TH)의 발현 변화를 나타낸 도면이다.
도 6c는 MPTP/P 파킨슨병 동물 모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위 중 선조체(striatum)에서의 α-Synuclein의 발현 억제능을 확인한 도면이다.
도 6d는 MPTP/P 파킨슨병 동물 모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위 중 흑질(Substantia Nigra)에서의 α-Synuclein의 발현 억제능을 확인한 도면이다.
도 6e는 MPTP/P 파킨슨병 동물 모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위 중 선조체(striatum)에서의 Ionized calcium-Binding Adapter molecule 1(IBA-1)의 발현 억제능을 확인한 도면이다.
도 6f는 MPTP/P 파킨슨병 동물 모델에서 핵산 복합체 투여에 따른 뇌 부위 중 흑질(Substantia Nigra)에서의 Ionized calcium-Binding Adapter molecule 1(IBA-1)의 발현 억제능을 확인한 도면이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
파킨슨병의 발병 원인은 매우 다양하다. 전체 환자의 5% 정도가 유전적 요인에 의해서 나타나며, 염증과 산화적 스트레스와 같은 외부 환경적인 요인이 중요하게 작용한다. 파킨슨병은 도파민성 신경세포에 단백질의 비정상적인 응집 현상이 일어나 발병하는데, 알파-시뉴클레인 단백질의 응집이다. 이러한 단백질의 응집은 산화적 스트레스에 의해서 더 촉진된다. 지금까지 파킨슨병의 치료제로는 도파민 신경전달 물질을 보충하는 방법으로 이루어졌으나, 이는 파킨슨병의 근원적인 치료가 되지 못한다. 파킨슨병의 근본적 치료를 위해 질병을 수정하는 유전자를 직접적으로 표적하는 저분자 치료 약물, 유전자 치료, 단일클론항체, 관련 징후를 표적화한 면역요법, 줄기세포 및 유도만능줄기세포 등의 생물학적 제제 연구가 활발해지고 있다.
한편, 대한민국 내 파킨슨병 환자 현황으로는 2010년 6만 1,565명이였으며 연평균 8.7%로 성장하여 2014년 8만 5,888명으로 증가하였다. 2014년 환자의 경우 60세 이상 환자 비율이 95.7%로, 유병율은 환자의 나이와 상관관계를 보였으며, 성비율의 경우 남성이 3만 3,831명이고 여성은 5만 2,057명을 나타내었다(최근 5년 파킨슨병 환자·진료비 증가세, 청년의사, 2015년). 파킨슨병은 알츠하이머병에 비해 발병 시기가 60세 정도로 매우 빠른 편이며 이로 인해 질환의 진행이 20년 이상 지속되기에 조기 발견을 통한 질환 진행을 늦추는 치료법이 적극적으로 요구된다.
본 발명에서는 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 파킨슨병의 예방 및 치료에 활용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들의 대한민국 등록특허 제10-1963885호를 기반으로, NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 미세아교세포주에 처리한 경우에, 효과적으로 NLRP3 및 하위단계 유전자의 발현이 억제되는 것을 확인하였으며, 상기 핵산 복합체를 투여한 파킨슨병 동물모델에서 행동 장애, 운동기능 장애 및 감각 운동 장애가 개선됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드가 상보적으로 결합된 핵산 복합체는 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
구조식 (1)
[ A
≡ C
(+)
]
상기 구조식 (1)에 있어서,
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고,
‘≡’는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
A로 표시되는 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며,
C(+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며,
캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에서의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 역평행결합(anti-parallel binding) 또는 평행결합(parallel binding) 형태를 가질 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산의 상보적인 결합 형태는 생활성 핵산의 목적 서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리될 수 있다.
본 발명에 있어서, “생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)”은 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 표적 유전자, 및 이를 포함하는 염기서열과 결합하여 해당 유전자의 고유 기능(예를 들어, 전사체(transcript) 발현 또는 단백질 발현)을 활성화시키거나 또는 저해하거나, pre-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 조절(예를 들어, 엑손스키핑(exon skipping) 하는 등의 기능을 수행하며, 상기 염기서열은 유전자 조절부위(gene regulatory sequence) 또는 유전자 부위(gene coding sequence) 또는 스플라이싱 조절 부위(splicing regulatory sequence)인 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 상기 생활성 핵산은 발현을 감소시키고자 하는 목적하는 표적 유전자와 결합할 수 있는 상보적인 서열, 특히 그러한 목적하는 표적 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 상보적인 서열을 가지는 핵산으로, 해당 유전자의 발현을 억제하는 등의 유전자 발현조절에 관여하는 핵산을 의미하며, 발현을 감소시키고자 하는 표적 유전자에 상보적인 서열을 가지는 핵산일 수 있다.
따라서, 본 발명에서의 생활성 핵산은 파킨슨병의 관련 표적 유전자인 NLRP3(NLR family pyrin domain containing 3) 유전자의 안티센스 펩티드 핵산인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 서열로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 앱타머(aptamer), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), 리보자임(ribozyme) 및 DNAzyme로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid)로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, “캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)”은 생활성 핵산과 일부 혹은 전부의 염기가 상보적으로 결합하여 기능성을 부여하는 핵산을 의미하며, 본 발명에서 사용되는 캐리어 펩티드 핵산은 펩티드 핵산(PNA: Peptide Nucleic Acid) 뿐 아니라, 이와 유사한 변형된 핵산을 사용할 수 있으며, 펩티드 핵산이 바람직하지만, 이에 한정되는 의미는 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함하는 것이 바람직하며, 상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체가 음전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적인 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되도록 하는 것이 더욱 바람직하다.
특히, 본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 4 또는 서열번호 5의 서열로 표시되는 염기서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 “핵산 복합체”는 세포 외 처리를 통해 생활성 물질을 체내, 궁극적으로 세포 내로 침투시킬 수 있으며, 구체적으로는 세포 내로 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산을 전달할 수 있는 능력을 가진다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 서열번호 2의 서열로 표시되는 생활성 핵산; 및 서열번호 4 또는 5의 서열로 표시되는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 표적인 NLRP3 유전자와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 결합력은 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-방향성 및 3'-방향성에 따라 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)함으로써, 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자와의 결합력보다 낮게 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 더 포함하여 하기 구조식 (2)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
구조식 (2)
[ mA
≡ mC
(+)
]
상기 구조식 (2)에 있어서,
'm'은 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, “엔도좀 탈출을 도와주는 물질”은 엔도좀 내부의 삼투압을 증가시키거나, 엔도좀의 막을 불안정화 시키는 방법에 의하여 생활성 핵산의 엔도좀에서 탈출을 도와주는 것을 특징으로 할 수 있다. 생활성 핵산이 보다 효율적이고 빠르게 핵이나 세포질로 이동하여 표적 유전자를 만나 작용하도록 도와주는 것을 의미한다(Daniel W Pack, et al., Nat Rev Drug Discov. 2005 Jul;4(7):581-93).
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질로서 생활성 핵산에는 펩티드(GLFDIIKKIAESF, 서열번호 6)가 링커 매개로 연결될 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산에는 Histidine(10)을 링커 매개로 연결하는 방법으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 지질 나노물질(lipid nanoparticles)은 Lipid, phospholipids, acetyl palmitate, poloxamer 18, Tween 85, tristearin glyceride 및 Tween 80로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles)은 poly(amidoamine) 또는 polyethylenimine(PEI)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고분자 나노구(polymer nanospheres)는 polycaprolactone, poly(lactide-co-glycolide, polylactide, polyglycolide, poly(d,l-lactide), chitosan 및 PLGA-polyethylene glycol로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles)은 Fe2O3, Fe3O4, WO3 및 WO2.9로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles)은 1-(aminoethyl)iminobis[N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl)propionamide], N-alkylated derivative of PTA 및 3, 5-didodecyloxybenzamidine로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 고분자(cationic polymer)는 vinylpyrrolidone-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate acid copolymer diethyl sulphate, polyisobutylene 및 poly(N-vinylcarbazole)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)는 polyacids, poly(acrylic acid), poly(methacrylic acid) 및 hydrolyzed polyacrylamide로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 각각 2 내지 50개, 바람직하게는 5 내지 30개, 더욱 바람직하게는 10 내지 25개, 가장 바람직하게는 15 내지 17개의 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 생활성 핵산은 천연(natural) 핵산 염기 및/또는 변형된 핵산 단량체로 이루어져 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 생활성 핵산에 사용된 단량체가 PNA일 경우, 생활성 펩티드 핵산이라고 하며, 다른 단량체가 사용된 경우에도 동일한 방식으로 부른다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 포스포디에스테르(phosphodiester), 2' O-메틸(2' O-methyl), 2' 메톡시-에틸(2' methoxy-ethyl), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체 내의 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 각각은 전기적 특성이 전체적으로, 양전하(양성), 음전하(음성) 또는 중성 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체일 수 있다.
상기 전기적 특성의 표현에 있어, “전체적으로”의 의미는 개별 염기의 전기적 특성이 아닌 전체적인 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산 각각의 전하가 외부에서 볼 때 전체적인 전기적 특성을 의미하는 것으로, 예를 들어, 생활성 핵산 내의 일부 단량체가 양성을 가지더라도 음성을 가지는 단량체의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 생활성 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 음전하를 가지게 되는 것이며, 캐리어 펩티드 핵산 내의 일부 염기 및/또는 백본(backbone)이 음성을 가지더라도 양성을 가지는 염기 및/또는 백본의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 캐리어 펩티드 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 양전하를 가지게 되는 것이다.
이러한 관점에서, 본 발명의 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 음전하 또는 중성의 특성을 가지며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 양전하 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전기적 특성의 부여는 변형된 펩티드 핵산 단량체를 사용할 수 있고, 변형된 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하의 아미노산을 포함하고, 음전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 음전하의 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E) 또는 아미노산 유사체의 음전하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가지도록 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전하 부여를 위한 펩티드 핵산 단량체의 변형은 상기 backbone 변형 이외에도 nucleobase가 변형된 펩티드핵산 단량체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 전기적 양성을 가지도록 amine, triazole, imidazole moiety를 nucleobase에 포함하거나, 전기적 음성을 가지도록 carboxylic acid를 염기에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산의 변형 펩티드 핵산 단량체는 음전하를 backbone 혹은 nucleobase에 더 포함할 수 있지만, 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 단량체가 음전하를 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적으로 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것이 바람직하다.
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 핵산 복합체는 전체적으로 양의 전하를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 상기 핵산 복합체에 있어, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 또는 형광/발광 표지자 등으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 및 이미징을 위한 형광/발광 표지자 등으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질은 상기 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질과 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 단순 공유결합 또는 링커로 매개된 공유결합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 핵산 운반체에 결합된 세포투과, 용해도, 안정성, 운반 및 이미징 관련 물질(예컨대, 소수성 잔기 등)은 표적 유전자의 발현을 조절하는 생활성 핵산과 독립적으로 존재하게 된다.
본 발명에 있어서, 앞서 기술한 바와 같이, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 상보적인 결합 형태는 크게 역평행결합(antiparallel binding)과 평행결합(parallel binding)의 형태를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 상보적인 결합 형태는 생활성 핵산의 목적서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리되는 구조를 가진다.
상기 역평행결합과 평행결합은 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식에 있어, 5'-방향성과 3'-방향성에 따라 결정된다. 역평행 결합은 일반적인 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식으로, 본 발명에 따른 핵산 복합체를 예로 들어 설명하면, 생활성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 캐리어 펩티드 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다. 평행결합은 역평행결합에 비해서는 결합력이 다소 떨어지는 형태로, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 모두가 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 결합력은 융해온도, melting temperature 또는 Tm에 의해 결정된다.
상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮게 하기 위한 구체적인 방법의 예로는, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예로서 상기 캐리어 펩티드 핵산이 링커, 유니버설 염기(universal base) 및 생활성 핵산의 대응되는 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지는 펩티드 핵산 염기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드 핵산 염기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신(cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고, 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이노신 PNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 기능 조절을 위한 핵산들의 결합 형태와 전기적 성질 조합을 제공하고, 상기 핵산의 결합 형태와 전기적 성질 조합으로 입자 크기 및 작용 시점을 조절하고, 세포투과성, 용해도 및 특이도를 향상시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해, 목적 유전자의 존재 하에서, 생활성 핵산이 목적 서열과 결합되는 시점(생활성 핵산의 목적 서열로의 치환되는 시점, 표적 특이적 분리 및 결합 시점) 등의 조절이 가능하다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 생활성 핵산의 목적 유전자로의 치환(strand displacement) 시점, 표적 특이적 분리 및 결합(target specific release and bind) 시점의 조절은 복합체의 비특이 결합을 위한 캐리어 펩티드 핵산의 비특이 염기, 유니버설 염기 및 linker의 유무, 개수 및 위치에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 펩티드 복합체의 상보적인 결합의 형태인 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel) 형태의 결합 등과 상기 조건의 조합에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 입자 크기는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전하 밸런스(charge balance)를 조절함으로써 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로는 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 증가하면 입자의 크기가 작아지나, 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 일정 수준을 넘게 되면 입자의 크기가 커지는 특징을 가지게 된다. 또한, 입자 크기를 결정하는 다른 중요한 요소로 복합체를 이루는 생활성 핵산 전하에 따른 전반적인 캐리어 펩티드 핵산과의 적절한 전하 밸런스에 의해서 입자 크기가 결정된다.
본 발명에 따른 캐리어 펩티드 핵산의 양전하는 1개 내지 7개(양전하를 가지는 단량체가 1개 내지 7개 포함됨을 의미한다), 바람직하게는 2개 내지 5개, 가장 바람직하게는 2개 내지 3개이며, 생활성 핵산의 전하는 전하 밸런스의 넷 차지(net charge)가 음전하 0개 내지 5개, 바람직하게는 0개 내지 3개인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 적절한 조건에서 혼성화됨으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 “혼성화”는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 결합 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 혈뇌장벽 투과능을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 “혈뇌장벽” 또는 “BBB(Blood-Brain Barrier)”는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이는 혈액과 뇌 조직 간에 교환되는 것을 면밀히 조절하고 심하게 제한하는 뇌 조직을 통하여 순환되기 때문에 혈액 내에 존재하는 투과성 장벽을 지칭하기 위해 사용된다. 혈액 뇌 장벽 성분에는 모든 혈관의 가장 깊은 내막을 형성하는 내피 세포, BBB와 구조적으로 상관이 있는 인접한 내피 세포들 간의 조밀한 연접부, 내피 세포의 기저 막 및 혈관의 노출된 외부 표면의 거의 모두를 덮고 있는 가까운 성상세포의 확장된 족양 돌기(foot process)가 포함된다. BBB는 혈액 내의 대부분의 물질, 예를 들어 대부분의 대분자, 예를 들면 Ig, 항체, 보체, 알부민 및 약물 및 소분자가 뇌 조직 내로 유입되지 못하게 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 핵산 복합체를 마우스 미정맥에 투여한 결과, 뇌 조직 내 표적 유전자 및 하위 유전자 발현 억제능을 확인하였으며, 파킨슨병에서 나타나는 운동기능 상실을 개선하는 효과를 나타냄을 확인한 바, 상기 핵산 복합체는 BBB 투과능을 갖는 것을 시사한다.
본 발명의 “표적 유전자”는 활성, 억제 또는 표지하고자 하는 핵산 서열(염기서열)을 의미하며, 용어 “표적 핵산”과 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명에 있어서, 표적 유전자를 포함하는 표적 핵산(염기서열)이 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 상기 복합체와 접촉(결합)하게 되면, 캐리어 펩티드 핵산으로부터 생활성 핵산이 분리되어 생물학적 활성을 나타내게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체를 이용하여 예방, 치료할 수 있는 질병은, 상기 핵산 복합체 내의 생활성 핵산의 표적 유전자에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에서는 생활성 핵산의 표적 유전자는 NLRP3인 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 핵산 복합체를 이용하여 예방, 치료할 수 있는 질병은 바람직하게는 퇴행성 뇌질환(Degenerative Brain Disease)일 수 있으며, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 니만-피크 병(NiemannPick disease), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; 근위축성 측삭경화증), 다발성 경화증(multiple sclerosis) 또는 치매(dementia)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 “예방”은, 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물의 투여로 질환의 발병을 막거나, 이의 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 “치료”는, 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 증상의 경감 또는 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 핵산 복합체를 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 퇴행성 뇌질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
상기 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한 상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
용어 “담체(carrier)”는 세포 또는 조직 내로의 핵산 복합체의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 “희석제(diluent)”는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
본 발명에서의 핵산 복합체를 함유하는 물질은, 환자에게 그 자체로서 또는 병용 요법(combination therapy)에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 의약 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 의약 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명의 핵산 복합체의 투여에 있어서, 당업계에 공지된 임의의 핵산 전달 방법이 사용될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 적합한 전달 시약은 예를 들어, Mirus Transit TKO lipophilic reagent, lipofectin, lipofectamine, cellfectin, polycations(예를 들어, polylysine), atelocollagen, nanoplexes 및 리포좀이 있다. 핵산 분자의 전달 운반체로서 아테로콜라겐(atelocollagen)의 사용은 Minakuchi et al. Nucleic Acids Res., 32(13):e109 (2004); Hanai et al. Ann NY Acad Sci., 1082:9-17 (2006); and Kawata et al. Mol Cancer Ther., 7(9):2904-12 (2008)에 기술되어 있다. 예시적인 간섭 핵산 전달 시스템은 미국 특허 제8,283,461호, 제8,313,772호, 제8,501,930호에 제공된다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 리포솜(liposome) 등의 전달체를 이용하여 투여할 수도 있다. 상기 리포솜은 림프 조직과 같은 특정 조직에 대해 상기 복합체를 표적화하거나, 감염 세포에 대해 선택적으로 표적화하는데 도움을 줄 수 있고, 또한 상기 복합체가 포함된 조성물의 반감기를 증가시키는데 도움을 줄 수 있다. 리포솜으로는 에멀션, 포움(foam), 마이셀(micelle), 불용성 단층, 액정, 인지질 분산물, 라멜라 층(lamellar layer) 등이 있다. 이러한 제제에 있어서, 송달되는 상기 복합체는, 단독으로 또는 특정 세포들을 대상으로, CD45 항원에 결합되는 모노클로날 항체와 같은 림프 세포 중 우세한 수용체에 결합하는 분자와 함께 또는 기타 치료 조성물과 함께, 리포솜의 일부로서 혼입시킨다. 따라서, 본 발명의 소정 복합체로 충진되거나 도포되어(decorated) 상기 핵산 복합체 조성물을 송달하는 리포솜은 림프 세포의 상기 부위로 지향될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 리포솜은 일반적으로 중성 및 음전하 인지질 및 콜레스테롤 등의 스테롤을 비롯한 표준 베시클(vesicle)-형성 지질로부터 형성된다. 일반적으로, 예를 들어 혈류 중의 리포솜의 안정성, 산 불안정성(acid lability) 및 리포솜의 크기 등을 고려하여 지질을 선택한다. 리포솜 제조에는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467, 1980), 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호]에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체의 사용에 관한 것이다.
본 발명에서, “개체”는 본 발명에 따른 핵산 복합체를 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
또한, 본 발명의 핵산 복합체의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다.
본 명세서에 기재되어 있는 핵산 복합체를 포함하는 조성물의 독성과 치료 효율성은, 예를 들어, LD50(군집의 50%에 대한 치사량), ED50(군집의 50%에 대해 치료 효과를 갖는 선량), IC50(군집의 50%에 대해 치료 억제 효과를 갖는 선량)을 결정하기 위하여, 세포 배양 또는 실험동물에서의 표준 제약 과정들에 의해 산정될 수 있다. 독성과 치료 효과 간의 선량 비가 치료 지수이고 이것은 LD50과 ED50(또는, IC50) 간의 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물들이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석에서 얻어진 데이터는 인간에 사용하는 선량의 범위를 산정하는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물들의 투여량(dosage) 또는 도포량은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 상태에서 ED50(또는, IC50)을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다.
본 발명의 용어 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1:
생활성
펩티드 핵산 및
캐리어
펩티드 핵산, 및 이들을 이용한 복합체의 제조
본 발명에서는 핵산 복합체의 파킨슨병에 대한 효과를 검정하기 위하여 표적 유전자로 NLRP3를 사용하였으며, 파킨슨병의 치료 효과를 확인하기 위하여 NLRP3에 대한 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)으로 안티센스 펩티드 핵산(antisense PNA)을 사용하였다.
본 발명의 대조군으로 사용한 생활성 핵산(antisense PNA)은 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하며, 파킨슨병 치료 효과를 확인하기 위하여 사용한 생활성 펩티드 핵산(antisense PNA)은 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함한다. 본 발명의 실시예에서 사용된 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 3 내지 5로 기재되는 서열로 구성되어 있다(표 1). 본 발명에서 사용된 모든 펩티드 핵산은 파나진(PANAGENE, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다.
| 구분 | 서열번호 | 염기서열 | 단량체 변형 |
| 생활성 핵산 |
1 | 5'-AC(-)CT(+)CTA(-)CGC(+)AAT(-)CC-O-K-3' | -+-+- |
| 2 | 5'-ACG(-)TGC(+)ATT(-)AT(+)CT(-)GA-O-K-3' | -+-+- | |
| 캐리어 펩티드 핵산 |
3 | 5'-TG(+)GAGAT(+)GCGTTA(+)GG-O-K-3' | +++ |
| 4 | 5'-TGC(+)ACGTAA(+)TAGA(+)CT-O-K-3’ | +++ | |
| 5 | 5'-K-O-TC(+)AGAT(+)AATGCA(+)CGT-3’ | +++ |
단량체의 변형은 전기적인 성질을 부여하기 위하여 펩티드 핵산의 backbone을 전기적 양성은 리신(Lysine, Lys, K, (+)로 표기)으로, 전기적 음성은 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E, (-)로 표기)으로 변형된 펩티드 backbone을 가지도록 제작하였다.
각각의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 조합은 DMSO 하에서 혼성화 되었으며, 그 결과 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 복합체가 제작되었다.
실시예
2: 핵산 복합체를 이용한 파킨슨병의 치료 효과 분석
실시예 1에 따라, 하기 표 2의 구조로 제조된 NLRP3를 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 이용하여 파킨슨병의 치료 효과를 분석하였다.
| 조합 | 핵산 복합체 |
| 1 | 서열번호 1 및 3 |
| 2 | 서열번호 2 및 4 |
| 3 | 서열번호 2 및 5 |
실시예
2-1: 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 유래 미세아교세포(HMC-3)를 MEM 배양 배지(웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다.
실시예
2-2:
웨스턴
블랏
분석(Western blot assay)을 이용한 유전자 발현의 분석
인간 유래 미세아교세포주를 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후, 면역 반응 유도를 위해 Lipopolysaccharide(LPS, Sigma, 미국)를 1μg/ml로 처리하였다. LPS 처리 4시간 뒤, 실시예 2-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하여 각각 24, 48, 72, 96, 120시간 배양하였고, RIPA buffer를 각 웰에 30μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit(Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 NLRP3(ABclonal, 미국), Pro Cas-1(abcam, 미국), Pro IL-1β(abcam, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit(Cell signaling Technology, 미국)을 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Fisher, 미국)를 처리하고 Image600(Amersham, 독일) 장비를 이용하여 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 서열번호 2와 5의 조합의 핵산 복합체(조합 3, PNA 3)를 처리한 군에서 표적 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현이 가장 많이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예
2-3: 면역 형광 염색(
Immunofluorescence
staining)을 이용한 유전자 발현의 분석
인간 유래 미세아교세포주를 8웰 플레이트에 3x103으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후, 면역 반응 유도를 위해 Lipopolysaccharide(LPS, Sigma, 미국)를 1μg/ml로 처리하였다. LPS 처리 4시간 뒤 실시예 2-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 각각 24, 72시간 배양하였고, 4% paraformaldehyde(sigma, 미국)로 세포를 고정하였다. 고정한 세포를 PBS에 녹인 0.1% 트리톤 X-100(sigma, 미국)으로 10분 동안 투과하였고, 1% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA, sigma, 미국)으로 1시간 동안 블로킹 한 후, 1차 항체인 NLRP3(ABclonal, 미국)를 1:100으로 처리하고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X PBS를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Alexa 488-goat Anti-Mouse(Abcam Technology, 미국)를 1:200으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. DAPI solution(Sigma, 미국)을 1x로 희석하여 10분 방치 후, 형광 현미경(Leica, 독일) 장비를 이용하여 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 LPS를 처리한 면역 유도군에서 표적 유전자인 NLRP3의 형광 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 이와 비교하였을 때 서열번호 2와 5의 핵산 복합체 조합(PNA 3)을 처리한 군의 형광 발현이 72시간까지 지속적으로 가장 많이 감소한 것을 확인하였다(도 2a). 해당 형광 세기를 ImageJ 프로그램을 사용하여 정량화한 결과, 면역 유도군과 대조군 핵산 복합체 처리군(조합 1, PNA 1) 대비 서열번호 2와 5의 조합의 핵산 복합체(PNA 3)의 형광 세기 정량 수치가 시간 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 2b).
실시예
3: 뇌 조직으로부터 분리한 일차 미세아교세포(primary cultured microglial cell)에서 핵산 복합체를 이용한 파킨슨병의 치료 효과 분석
실시예 2를 통하여 효과가 검증된 핵산 조합체를 선별한 후, 배양 상태가 체내와 가장 유사한 특징을 가진 신생 랫드(neonatal rat)에서 분리한 일차 미세아교세포를 이용하여 파킨슨병의 치료 효과를 분석하였다.
사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 3과 같다.
| 조합 | 핵산 복합체 |
| 1 | 서열번호 1 및 3 |
| 2 | 서열번호 2 및 5 |
실시예
3-1: 세포 배양
KCLB(Korean Cell Line Bank, 한국)로부터 입수한 인간 유래 신경아세포종(SH-SY5Y)을 DMEM 배양 배지(웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건에서 배양하였다.
실시예
3-2: 생쥐의 뇌 조직으로부터 일차 미세아교세포 분리 및 배양
일차 미세아교세포를 생쥐의 뇌 조직에서 분리하여 배양하기 위해, 1일령 신생아 SD 랫드(나라바이오텍, 한국)를 구입하여, 뇌 조직을 분리하였다. 수막과 다른 조직 부위를 제거한 피질(Cortex)을 iced 1x HBSS(gibco, 미국)가 담긴 페트리디쉬에 옮긴 후 파이펫을 사용하여 조직을 해리시키고, 1200rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액은 버리고 남은 pellet에 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖, GlutaMAX(Gibco, 미국) 0.1%를 첨가한 mixed glial cell 배양 배지를 넣어 세포를 풀어준 후, 전날 미리 PLL(Poly-L-lysine, Sigma, 미국)으로 코팅한 75T 플라스크에 세포를 씨딩하였다. 세포 배양 14일 후, mixed glial cell 배양 배지에 인슐린(Sigma, 미국) 5㎍/㎖를 첨가한 소교세포 배양 배지로 교체한 후 상기 플라스크를 2시간 동안 160rpm, 37℃의 조건에서 orbital shaker로 교반하고, 부유 세포만을 갖는 상층액을 수집하여 1200rpm에서 8분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건에서 배양하였다. 파킨슨병 유사 염증세포 모델을 만들기 위하여 LPS 100ng/mL 처리 4시간 후, 핵산 복합체 처리하여 배양하였다.
실시예
3-3:
웨스턴
블랏
분석(Western blot assay)을 이용한 유전자 발현의 분석
실시예 3-2의 배양 조건으로 배양된 일차 미세아교세포에 면역 반응 유도를 위해 Lipopolysaccharide(LPS, sigma, 미국) 100ng/ml을 처리하였다. LPS 처리 4시간 후 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하였으며, 각각 24, 48, 72시간 배양한 후 RIPA buffer를 각 웰에 30μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit(Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 NLRP3(ABclonal, 미국), Pro Cas-1(abcam, 미국), Pro IL-1β(abcam, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit(Cell signaling Technology, 미국)을 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Fisher, 미국)를 처리하고 Image600(Amersham, 독일) 장비를 이용하여 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 파킨슨병 유사 세포 모델에서 서열번호 2와 5의 조합의 핵산 복합체를 처리한 군(조합 2, PNA 2)이 표적 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현을 가장 많이 억제하는 것을 확인하였다(도 3a).
실시예
3-4:
MTT
분석(
MTT
assay)을 이용한 신경아세포종 세포주의 세포 생존율 분석
실시예 3-2의 배양 조건으로 배양된 일차 미세아교세포에 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 4시간 후, LPS 100ng/ml을 처리하여 각각 24, 48, 72시간 배양하였다. 각각의 배양 종료 시점에 얻어진 배양 배지를 주사기 필터(Millipore, 미국)를 사용하여 여과한 후 인간 유래 신경아세포종에 처리하였다. 인간 유래 신경아세포종은 96웰 플레이트에 2x104으로 씨딩하였으며, 24시간 후 일차 미세아교세포에서 얻어진 배지로 교체한 뒤 각각 24, 48, 72시간 동안 배양하였다. MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide, sigma, 미국) 용액은 1X PBS에 5mg/mL 농도로 제조되었으며, 웰당 20μL씩 처리하여 4시간 배양 후 OD(optical density)를 spectrophotometer로 측정하여 분석하였다.
본 실시예에서는 파킨슨병 유사 염증세포 모델인 LPS를 처리한 일차 미세아교세포주로부터 얻어진 배지에 의한 신경아세포종 생존율의 변화를 분석하였으며 사용한 핵산 복합체 조합은 상기 표 3과 동일하다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 면역 유도군(LPS)과 대조군 서열의 핵산 복합체(조합 1, PNA 1)의 배양 배지를 처리한 군에서는 음성 대조군(NC) 대비 세포 생존율이 감소한 반면, 서열번호 2와 5의 핵산 복합체(조합 2, PNA 2)를 처리한 일차 미세아교세포주에의 배양 배지에 의해 신경아세포종의 세포 생존율이 72시간까지 증가하는 것을 확인하였다(도 3b).
실시예
4:
MPTP
(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-
tetrahydropyridine
)/
프로베네시드(probenecid)로
유도한 마우스 모델에서 핵산 복합체를 이용한 파킨슨병 치료 효과 분석
본 실시예에서는 실시예 3의 결과를 바탕으로 검증된 핵산 복합체 조합의 파킨슨병 치료 효과를 동물모델에서 평가하기 위하여 도파민 신경세포의 사멸을 유도하는 MPP+의 전구체인 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)와 흡수율을 높이는 프로베네시드(probenecid)를 마우스에 투여한 파킨슨병 동물모델에서 신경세포 사멸에 따른 운동기능의 저하가 핵산 복합체에 의해 회복되는지 검증하였다.
실시예
4-1:
MPTP
/
프로베네시드
유도성 파킨슨병 동물모델 제작
MPTP/프로베네시드 파킨슨병 동물 모델에서 효능을 검증하기 위하여 7주령 수컷 C57BL/6 마우스(나라바이오텍, 한국)를 사용하였으며, 7일간 순화 후 실험에 사용하였다. 파킨슨병 유사 모델 구축을 위하여 MPTP 25mg/kg 그리고 프로베네시드 250mg/kg이 사용되었으며, 장기적 투여에 의한 손상 모델 제작을 위해 3.5일 간격으로 5주간 총 10회 복강내 주사를 진행하였다. MPTP와 프로베네시드의 4회 투여 이후 각 실험군당 10마리씩 무작위로 선별하여 사용하였으며, 핵산 복합체는 일주일에 두 번씩 4주간 마우스 미정맥에 투여하였다. 이때 양성 대조군에는 파킨슨병 환자의 표준 치료제로 사용되는 레보도파(Levodopa, sigma, 미국) 250mg/kg을 25mg/kg 칼비도파(carbidopa, sigma, 미국)와 혼합하여 핵산 복합체 투여 시작 시점부터 4주간 매일 경구 투여 진행하였다.
실시예
4-2:
로타로드
검사(
rotarod
test) 분석을 이용한 운동 기능 변화 분석
본 실시예에서는 핵산 복합체에 의해 파킨슨병 동물모델의 병변 특징인 운동 결손과 균형 유지를 개선하는 효과를 평가하기 위해 로타로드 검사(rotarod test)를 진행하였다.
운동성 검증을 위해 지름 7cm, 15cm 간격으로 60cm 높이의 칸막이를 사용하여 5개의 칸으로 구성된 회전이 가능한 원통형의 봉이 있는 로타로드 장치(정도비앤피, 한국)를 사용하였다. 검사 진행 전 모든 실험동물은 3일 동안 충분한 훈련을 진행하였으며, 핵산 복합체 투여 종료 후 본 실험을 진행하였다. 검사에 사용된 로타로드는 속도가 0-40rpm까지 일정하게 증가하도록 설정하였으며, 회전하는 봉 위에 실험동물을 올려놓고 낙하하기까지 걸린 머무름 시간(Latency time)을 측정하였다. 최대 측정시간은 300초로 제한하였으며, 세 번 반복 측정 후 평균값을 사용하여 핵산 복합체의 치료 효과를 분석하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 회전하는 봉 위에서 오랜 시간 버티지 못하고 낙하한 파킨슨병 유도 모델 대비, 2번 조합의 핵산 복합체(서열번호 2와 5, PNA 2)를 처리한 그룹의 봉 위에 머무르는 시간이 증가하며 행동 장애가 개선된 것을 확인하였다(도 4a).
실시예
4-3: 폴 검사(pole test) 분석을 이용한 운동 기능 변화 분석
실시예 4-1의 조건으로 제작된 파킨슨병 동물 질환 모델을 사용하여 무운동성과 경직반응 회복 여부를 평가하기 위해 폴 검사를 진행하였다.
폴 검사는 폭 0.8cm, 높이 55cm 막대기를 사용하여 마우스가 하늘을 향하도록 올려놓은 뒤 180° 회전하여 바닥에 도착하는 데까지 소요되는 총 시간을 측정하는 방식으로 진행하였다. 검사 진행 전 모든 실험 동물에 대해 동일한 횟수의 훈련을 진행하였으며, 본 실험은 핵산 복합체 투여 종료 후 진행하였다. 실험은 세 번 반복 진행되었으며, 결과 분석은 평균값을 사용하였다.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 파킨슨병을 유도한 MPTP/프로베네시드 동물 그룹은 지면 도착까지의 총 소요 시간이 정상 마우스에 비해(NC) 증가하였다. 반면 서열번호 2와 5의 핵산 복합체(PNA 2)를 처리한 그룹은 꼭대기에서 방향 회전 후 바닥에 도착하기까지의 시간이 감소하며 운동기능 장애가 개선된 것을 확인하였다(도 4b).
실시예
4-4: 실린더 검사(cylinder test) 분석을 이용한 운동 기능 변화 분석
실시예 4-1의 방법으로 파킨슨병 유도한 동물모델에서의 감각 운동기능 치료 효과를 확인하기 위해 실린더 검사를 진행하였다.
마우스는 새로운 환경에 놓이면 주변을 탐색하기 위해 앞발 두 개를 들어 벽을 짚는 행동을 취하는 것이 일반적이기 때문에 투명한 실린더에 마우스를 넣은 후 앞발 사용 횟수를 측정하였다. 실험은 핵산 복합체 투여 종료 다음 날 진행되었으며, 별도의 훈련 없이 실린더에서 3분 동안 앞발로 실린더 벽면을 짚는 횟수를 측정한 결과를 사용하였다.
그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이 신경 독성물질인 MPTP에 노출된 MPTP/프로베네시드만 투여한 동물 그룹은 앞발 사용 횟수가 정상 마우스 대비 감소하였으며, 이와 대조적으로 서열번호 2와 5의 조합의 핵산 복합체(PNA 2)를 처리한 그룹은 앞발 사용 횟수가 증가하며 파킨슨병 동물 모델에서의 감각 운동 장애 치료 효능을 확인하였다(도 4c).
실시예
5:
MPTP
/
프로베네시드(probenecid)를
이용한 파킨슨병 유도 동물 모델에서의 유전자 발현 분석
본 실시예에서는 실시예 4-1의 방법으로 유도한 파킨슨병 동물 모델에서 도파민 생성과 대사가 일어나는 뇌 조직의 선조체(striatum)와 흑질(substantia nigra) 부위에서 파킨슨병 관련 유전자의 발현 변화를 확인하였다.
실시예
5-1:
웨스턴
블랏
분석(Western blot assay)을 이용한 파킨슨병 동물 모델 조직에서의 유전자 발현 분석
실시예 4-1의 방법으로 실험 진행 후 종료일에 적출한 뇌 조직에서 선조체와 흑질을 분리하였으며, RIPA buffer를 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit(Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 NLRP3(ABclonal, 미국), Pro IL-1β(abcam, 미국), Tyrosine Hydroxylase(TH, abcam, 미국), 알파-시누클레인(α-synuclein, abcam, 미국)을 1:1000으로 처리하고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit(Cell signaling Technology, 미국)을 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Fisher, 미국)를 처리하고 Image600(Amersham, 독일) 장비를 이용하여 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
본 실시예에서는 파킨슨병 유도 동물 모델에서의 NLRP3 및 하위 단계 유전자 발현 변화 및 도파민성 신경세포와 알파-시누클레인의 발현 정도를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 상기 표 3과 동일하다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 실시예 4-1의 방법으로 진행된 실험에서 종료일에 적출한 뇌 조직의 선조체(striatum) 부위를 사용하여 발현 분석을 진행하였을 때, 2번 조합의 핵산 복합체(서열번호 2와 5 조합, PNA 2)를 처리한 군이 표적 유전자인 NLRP3 및 하위 경로 유전자인 IL-1β의 발현이 질환 동물군(MPTP/p) 대비 감소한 것이 확인되었다. 또한 도파민성 신경세포(TH, Tyrosine hydroxylase)는 MPTP/프로베네시드 유도 모델에서 가장 많이 감소하였으며, 2번 조합의 핵산 복합체를 처리한 군(PNA 2)에서는 증가되는 것을 확인하여 도파민성 신경 세포의 회복 현상을 확인하였다. 또한, MPTP/프로베네시드 유도군에서 증가하였던 파킨슨병의 병인 요인인 알파-시누클레인의 발현은 2번 조합의 핵산 복합체를 처리한 군에서는 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 5a).
흑질(substantia nigra) 부위에서의 발현은 도 5b에서 나타내었으며, 질환 유도군(MPTP/p)에서 증가된 표적 유전자인 NLRP3 및 하위 경로 유전자인 IL-1β의 발현이 2번 조합의 핵산 복합체(PNA 2)를 처리한 그룹에서 가장 많이 감소하였으며, 질환 모델에서 감소된 도파민성 신경세포는 2번 조합의 핵산 복합체를 처리한 군(서열번호 2와 5 조합, PNA 2)에서 발현이 증가하며 회복되는 것을 확인하였다. 또한, 알파-시누클레인의 발현은 2번 조합의 핵산 복합체 처리 후 감소하는 것을 통해 서열번호 2와 5 조합의 핵산 복합체에 의한 파킨슨병 치료 효능을 확인하였다(도 5b).
실시예
5-2: 면역염색을 이용한 파킨슨병 동물 모델에서의 조직 내 발현 변화 분석
실시예 4-1의 조건으로 실험 진행 후 종료일에 마우스 뇌 조직을 분리하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 30% 설탕 용액에 담가 3일 동안 탈수한 후, OCT(Leica, 미국) 용액에 포매(embedding) 하였다. 포매한 조직은 -20℃에서 보관하여 얼린 후, 동결절편기(Cryostat, Leica, 미국)를 사용하여 조직을 20μm로 섹션한 후 슬라이드 글라스에 마운팅(mounting)하였다. 마운팅한 조직은 1% BSA 용액을 사용하여 2시간 동안 블락킹하였으며, Tyrosine Hydroxylase(abcam, 미국), 알파-시누클레인(α-synuclein, abcam, 미국), IBA1(wako, 일본) 1차 항체를 처리한 후 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 이어서 1차 항체 용액을 제거하고 1X TBS로 씻어낸 후 2차 항체 용액 Goat Anti-Rabbit(Cell signaling Technology, 미국)을 1:2000으로 상온에서 2시간 처리하였다. 1X TBS를 사용하여 2차 항체 씻어낸 후 DAB 염색을 통해 발현을 분석하였다.
본 실시예에서는 파킨슨병 유도 동물 모델의 뇌 조직에서 도파민성 신경세포와 발병 요인인 알파-시누클레인 및 면역세포의 발현 정도를 분석하였으며, 발병에 중요한 뇌 영역인 선조체와 흑질 내에서 비교 분석하였다.
도파민성 신경세포의 변화를 분석한 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 선조체에서의 도파민성 신경세포를 나타내는 tyrosine hydroxylase의 발현은 MPTP/프로베네시드 파킨슨병 유도 모델에서 감소한 것을 확인하였으며, 2번 조합의 핵산 복합체(서열번호 2 및 5 조합, PNA 2)를 투여한 그룹에서는 발현이 증가한 것을 확인하였다(도 6a). 흑질 부위에서도 도 6b에서 나타낸 바와 같이 MPTP/프로베네시드만 투여한 그룹에서는 발현 정도가 감소한 것을 확인하였으며, 2번 핵산복합체를 투여한 그룹(PNA 2)에서는 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 6b).
병인 요인인 알파-시누클레인의 발현을 확인하였을 때, 선조체의 경우 파킨슨병 유도 모델(MPTP/p)에서 갈색 반응이 증가하여 발현이 증가한 것을 확인하였으며, 2번 조합의 핵산 복합체(PNA 2) 투여군에서는 알파-시누클레인의 갈색 반응이 현저하게 감소한 것이 관찰되었다. 이를 수치화해 비교하였을 때 양성 대조군을 처리한 그룹에 비해 2번 조합의 핵산 복합체를 투여한 그룹에서 알파-시누클레인의 발현이 감소하는 것이 나타났다(도 6c). 흑질에서의 알파-시누클레인 발현 정도를 비교한 결과에서도 선조체와 마찬가지로 MPTP/프로베네시드 질환 유도 그룹에서 증가하였던 갈색 반응이 2번 핵산 복합체를 투여 한 그룹에서는 현저히 감소하였다. 이를 수치화해 나타낸 그래프에서도 2번 조합 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 발현 정도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 6d).
마지막으로 뇌 면역 세포인 미세아교세포(microglia)의 마커(IBA1)의 발현을 확인한 결과, 도 6e에 나타낸 바와 같이 선조체 내에서 MPTP/프로베네시드 유도 그룹에서 갈색 반응이 현저히 증가하였으며, 2번 핵산 복합체를 투여한 그룹에서는 갈색 반응이 감소하여 면역 세포의 감소를 확인하였다. 이를 수치화한 그래프에서도 2번 조합 핵산 복합체를 투여한 그룹에서 IBA의 반응이 감소한 것이 나타났다(도 6e). 도 6f에 나타낸 흑질에서의 IBA1 발현을 확인한 결과에서도 선조체와 동일하게 2번 조합 핵산 복합체를 처리한 그룹의 갈색 반응이 다른 질환 유도군(MPTP/p) 대비 가장 많이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 수치화한 그래프에서도 가장 많이 감소한 것으로 나타났다(도 6f).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SEASUN THERAPEUTICS
<120> Composition for Preventing or Treating Degenerative Brain Disease
Comprising Nucleic Acid Complex
<130> P21-B284
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bioactive Nucleic Acid
<400> 1
acctctacgc aatcc 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bioactive Nucleic Acid
<400> 2
acgtgcatta tctga 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Carrier Peptide Nucleic Acid
<400> 3
tggagatgcg ttagg 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Carrier Peptide Nucleic Acid
<400> 4
tgcacgtaat agact 15
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Carrier Peptide Nucleic Acid
<400> 5
tcagataatg cacgt 15
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker
<400> 6
Gly Leu Phe Asp Ile Ile Lys Lys Ile Ala Glu Ser Phe
1 5 10
Claims (12)
- NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산은 서열번호 2의 서열로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 4 또는 서열번호 5의 서열로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
- 제4항에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
- 제5항에 있어서, 상기 펩티드는 GLFDIIKKIAESF(서열번호 6) 또는 Histidine(10)인 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 혈뇌장벽 투과능을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 니만-피크 병, 크로이츠펠트-야콥병, 헌팅턴병, 루게릭병, 다발성 경화증 또는 치매인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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