KR102574253B1 - 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 교모세포종 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 TGF-β유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 함유하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산 복합체는 우수한 세포 투과능 및 세포 내 활성을 가지며, TGF-β유전자 및 그 하위 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있어, 교모세포종의 예방 또는 치료에 유용하다.

Description

펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for Preventing or Treating Glioblastoma Comprising Peptide Nucleic Acid Complex}
본 발명은 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 교모세포종 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 TGF-β 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 함유하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
교모세포종 (glioblastoma)은 뇌의 교세포에서 발생한 종양 중 조직학적으로 핵의 비정형성, 유사분열상, 혈관내피세포의 증식, 괴사가 관찰되는 악성도가 가장 높은 종양이다. 교모세포종(glioblastoma)은 신경교종(glioma)의 대부분을 차지하며, 조직학적으로 두 번째로 빈번하게 발생하고, 5년 생존율이 5%에 불과한 뇌 및 중추신경계에서 가장 빈번한 악성 종양이며 (미국), 국내에서는 교모세포종이 전체 뇌 및 CNS 원암종의 15.1%를 차지하며, 전체 신경교종의 34.4%를 차지하는 가장 흔한 뇌상피종이다.
교모세포종은 매우 빠르게 성장하는 종양이며 이로 인해 뇌압이 급속히 상승하여 두통, 오심, 구토 등을 유발하고, 성인은 경련이 자주 발생한다. 이외에도 종양 자체 또는 종양에 동반되는 뇌 부종으로 인하여 인근 신경의 기능이 저하되어 사지 운동저하, 감각저하, 얼굴마비, 언어장애, 인지기능 저하, 좌-우 구분장애 등 다양한 증상이 나타날 수 있다. 이러한 신체 일부의 신경학적 결손은 종양의 발생 위치에 따라 매우 다양하여 어느 증상 하나만으로 진단을 내릴 수는 없다.
교모세포종이 발생하면 일반적으로 수술적 제거를 통해 최대한 종양을 절제하지만, 제거할 경우 심각한 합병증이 남을 수 있기 때문에 절제의 범위를 신중하게 결정해야 한다. 수술 후 떼어낸 조직을 통해 조직학적으로 교모세포종이 확진된 후에는 방사선 치료와 항암치료를 시행하게 된다.
교모세포종의 표준적인 1차 치료 방법은 수술적 요법과, 화학적 요법인 테모졸로마이드 (temozolomide; TMZ)와 방사선 치료(Radiation therapy; RT) 병합요법이다.
중추신경계 암에 관한 NCCN 지침에 따르면, 어린 연령에서 좋은 예후를 보이는 GBM 환자들에게는 알킬화 (메틸화)제인 TMZ가 현재 수술 후의 RT와 더불어 표준 치료법으로 알려져 있으나, 이러한 표준 치료법을 적용할 수 있는 환자군이 매우 한정적이며, 전체 교모세포종 환자의 5년 생존율이 5% 미만으로 나타날 만큼 치료 후 예후가 불량한 암이다.
또한, 수술, 방사선 요법 및 화학 요법을 포함한 치료에도 불구하고, 교모세포종은 교모세포종 줄기세포 (glioblastoma stem cell)라고 불리는 줄기세포 유사 암세포를 보유하고 있어, 치료 저항성이 매우 높아, 치료 후 예후가 좋지 못한 실정이다.
이러한 필요성에 따라 새로운 교모세포종 치료제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 국제특허공개 제2012-061120호에는 정제된 교모세포종 GBM6-AD 줄기 세포를 이용하여 교모세포종을 치료하는 방법이 개시되어 있고, 국제특허공개 제2012-104822호에는 마시텐탄을 투여하여 교모세포종을 치료하는 방법이 개시되어 있다.
TGF-β2는 Smad 하위 경로를 통해 종양의 미세환경을 조절하고, 종양의 증식과 이동 (migration) 및 침투 (invasion)에 중요한 종양 유전자 (oncogene)로 알려져 있다 (Joanna L. Birch et al., Cellular Signaling, 2020, Volume 72, 109638). 특히 교모세포종 환자에서 TGF-β2가 높게 발현되어 있고, 환자의 생존율과 유전자의 발현율이 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다(Roy LO, Poirier MB, Fortin D., Int. J. Mol. Sci., 2018, 19(4), 1113).
한편, 전통적인 약제와 다르게 핵산 약제는 표적 특이적 전령 RNA(messenger RNA, mRNA)의 발현을 억제하므로, 단백질을 표적으로 하는 기존 약제로 치료가 불가능 했던 연구 영역을 다룰 수 있게 되었다(Kole R. et al., Nature Rev. Drug Discov. 11;125, 2012., Wilson C. et al., Curr. Opin. Chem. Bio. 2006; 10:607, 2006). 약제로서의 성능 및 장점으로 인하여 핵산을 이용한 다양한 임상시험이 진행되고 있고, 증가하는 핵산 기반 치료제의 용도에도 불구하고 세포내 도입 또는 혈뇌장벽 투과를 위한 운반체의 사용은 극히 제한적이다.
따라서, 최근 약물의 보다 안전하고 효과적인 이용을 도모하기 위해, 약물에 적합한 제형뿐만 아니라 약물의 표적이 되는 생체 부위에 효율적으로 약물을 전달(drug delivery)하는 방법이 주목받고 있다. 특히, 약물을 필요한 때에, 필요한 양만큼, 필요한 장소로 효율적으로 운반하는 수송 시스템인 약물 전달 시스템(DDS; Drug Delivery System)의 실용화가 요구되고 있다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 세포 투과성(cell permeability)이 놀랍게 향상되며, 이를 이용하여 표적 유전자의 발현을 매우 효율적으로 조절할 수 있음을 확인하고, 이러한 세포 독성이 낮고, 생활성 핵산의 세포 투과성 및 유전자 발현 조절능력이 향상된 새로운 구조체에 대한 특허를 출원한 바 있다 (PCT/KR2017/008636). 또한, 본 발명자들은 상기 구조체의 기능에 대한 연구를 지속적으로 수행하여, 우수한 효율로 혈뇌장벽을 투과할 수 있는 능력을 가지는 새로운 구조체를 개발하게 되었다 (KR 10-2019-0128465).
이에, 본 발명자들은 세포 투과능이 우수한 핵산 복합체를 교모세포종의 치료에 적용하고자 예의 노력한 결과, TGF-β2 유전자를 표적하는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 교모세포종의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TGF-β2 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 교모세포종의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체는 우수한 세포 투과능 및 세포 내 활성을 가지며, TGF-β2 유전자 및 그 하위 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있어, 교모세포종의 예방 또는 치료에 유용하다.
도 1은 인간 교모세포종 세포(U87MG)에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 각 조합별 TGF-β표적 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현을 확인한 결과로서, (A)는 1 내지 5번 조합의 결과이며, (B)는 1번 및 6번 조합의 결과이다.
도 2의 (A)는 인간 교모세포종 세포(U87MG)에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 각 조합별 세포 이동을 확인한 결과이며, (B)는 이를 정량화한 결과이다.
도 3은 인간 교모세포종 세포(U87MG)를 동소 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 종양 조직의 표현형을 확인한 결과이다.
도 4는 인간 교모세포종 세포(U87MG)를 동소 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 농도별로 처리한 후, 수득한 종양 조직의 표현형을 확인한 결과이다.
도 5는 인간 교모세포종 세포(U87MG)를 동소 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 종양 조직에서 각 조합별 TGF-β표적 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현을 확인한 결과로서, (A)는 3번 조합의 결과이며, (B)는 6번 조합의 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 TGF-β2 유전자를 표적하는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 투여할 경우, 교모세포종의 예방 및 치료에 효과가 있는지 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 TGF-β2 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 교모세포종세포주 및 교모세포종 세포주 동소 이식 모델에 투여할 경우, TGF-β2 유전자와 그 하위 유전자의 발현을 효율적으로 억제하여 교모세포종 치료효과가 뛰어난 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서, TGF-β2 유전자를 표적으로 하는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 교모세포종의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 생활성 핵산은 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드가 상보적으로 결합된 핵산 복합체는 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
[구조식 (1)]
[ A ≡ C (+) ]
상기 구조식 (1)에 있어서,
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열, 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고;
'≡는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
A로 표시되는 생활성 핵산은 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid)으로, 전체적으로 음전하를 가지며,
C (+) 로 표시되는 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지고,
A ≡ C(+) 로 표시되는 구조식 (1)의 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지며,
상기, 캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함하며, 상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체가 음전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적인 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, “생활성 핵산”은 발현을 감소시키고자 하는 목적하는 표적 유전자와 결합할 수 있는 상보적인 서열, 특히 그러한 목적하는 표적 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 상보적인 서열을 가지거나, 발현시키고자 하는 표적 유전자의 발현을 촉진하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 핵산으로, 해당 유전자의 발현을 억제하거나, 촉진하는 등의 유전자 발현조절에 관여하는 핵산을 의미하며, 발현을 감소 또는 증가시키고자 하는 표적 유전자에 상보적인 서열을 가지는 핵산이거나, pre-mRNA, miRNA, mRNA 등 단일가닥 RNA 서열에 상보적인 서열의 핵산일 수 있다.
특히, 본 발명에서의 “생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)”은 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 표적 유전자, 및 이를 포함하는 염기서열과 결합하여 해당 유전자의 고유 기능(예를 들어, 전사체(transcript) 발현 또는 단백질 발현)을 활성화시키거나 또는 저해하거나, pre-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 조절(예를 들어, 엑손스키핑 (exon skipping) 하는 등의 기능을 수행하며, 상기 염기서열은 유전자 조절부위(gene regulatory sequence) 또는 유전자 부위(gene coding sequence) 또는 스플라이싱 조절 부위 (splicing regulatory sequence)인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 조절부위는 프로모터, 전사 인핸서, 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 바이러스 팩키징 서열, 및 선택 마커에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 부위는 엑손 또는 인트론일 수 있으며, 상기 유전자 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 10, 5, 3, 또는 1kb 또는 500, 300, 또는 200bp 내에, 예를 들어, 개시 부위의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있을 수 있다. 또한, 상기 스플라이싱 조절부위는 exon skipping, cryptic splicing, pseudo-splice site activation, intron retention, alternative splicing deregulation 관련 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에서의 "생활성 펩티드 핵산(Bioactive Nucleic Acid)"은 교모세포종 표적 유전자인 TGF-β2의 안티센스 펩티드 핵산인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “캐리어 펩티드 핵산”은 생활성 핵산과 일부 혹은 전부의 염기가 상보적으로 결합하여 기능성을 부여하는 핵산을 의미하며, 본 발명에서 사용되는 캐리어 펩티드 핵산은 펩티드 핵산(PNA: Peptide Nucleic Acid) 뿐 아니라, 이와 유사한 변형된 핵산을 사용할 수 있으며, 펩티드 핵산이 바람직하지만, 이에 한정되는 의미는 아니다.
특히, 본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 4 내지 7 및 9로 구성된 군에서 선택되는 서열로 표시되는 서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 "핵산 복합체"는 생활성 물질을 체내, 궁극적으로 세포 내로 침투시킬 수 있으며, 구체적으로는 혈뇌장벽을 통과하여 체내로 전달할 수 있는 능력을 가진다.
이에 따라 본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 혈뇌장벽 투과능을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 각각 2 내지 50개, 바람직하게는 5 내지 30개, 더욱 바람직하게는 10 내지 25개, 가장 바람직하게는 15 내지 17개의 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 서열번호 1의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산; 및 서열번호 4 내지 7 및 9로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 (i) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 4로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(ii) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(iii) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 6으로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(iv) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 7로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체; 및
(v) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 9로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
로 구성된 군에서 선택되는 핵산복합체를 유효성분으로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 더 포함하여 하기 구조식 (2)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
구조식 (2)
[ mA ≡ mC (+) ]
상기 구조식 (2)에 있어서,
'm'은 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, “엔도좀 탈출을 도와주는 물질”은 엔도좀 내부의 삼투압을 증가시키거나, 엔도좀의 막을 불안정화 시키는 방법에 의하여 생활성 핵산의 엔도좀에서 탈출을 도와주는 것을 특징으로 할 수 있다. 생활성 핵산이 보다 효율적이고 빠르게 핵이나 세포질로 이동하여 표적 유전자를 만나 작용하도록 도와주는 것을 의미한다(D. W. Pack, A. S. Hoffman, S. Pun, P. S. Stayton, “Design and development of polymers for gene delivery,”Nat. Rev. Drug. Discov., 4, 581-593 (2005)).
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질로서 생활성 핵산에는 GLFDIIKKIAESF(서열번호 10)의 서열을 갖는 펩티드가 링커 매개로 연결될 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산에는 Histidine(10)을 링커 매개로 연결하는 방법으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 지질 나노물질(lipid nanoparticles)은 Lipid, phospholipids, acetyl palmitate, poloxamer 18, Tween 85, tristearin glyceride 및 Tween 80로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles)은 poly(amidoamine) 또는 polyethylenimine (PEI)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고분자 나노구(polymer nanospheres)는 polycaprolactone, poly(lactide-co-glycolide, polylactide, polyglycolide, poly(d,l-lactide), chitosan 및 PLGA-polyethylene glycol로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles)은 Fe2O3 Fe3O4, WO3 및 WO2.9로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles)은 1-(aminoethyl)iminobis[N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl)propionamide], N-alkylated derivative of PTA 및 3, 5-didodecyloxybenzamidine로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 고분자(cationic polymer)는 vinylpyrrolidone-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate acid copolymer diethyl sulphate, polyisobutylene 및 poly(N-vinylcarbazole)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)는 polyacids, poly(acrylic acid), poly(methacrylic acid) 및 hydrolyzed polyacrylamide로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산은 천연(natural) 핵산 염기 및/또는 변형된 핵산 단량체로 이루어져 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid), 앤티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 앱타머(aptamer), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), 리보자임(ribozyme) 및 DNAzyme로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid)로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어, 생활성 핵산에 사용된 단량체가 PNA일 경우, 생활성 펩티드 핵산이라고 하며, 다른 단량체가 사용된 경우에도 동일한 방식으로 부른다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 포스포디에스테르(phosphodiester), 2' 0-메틸(2' 0-methyl), 2' 메톡시-에틸(2' methoxy-ethyl), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체 내의 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 각각은 전기적 특성이 전체적으로, 양전하(양성), 음전하(음성) 또는 중성 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체일 수 있다.
상기 전기적 특성의 표현에 있어, “전체적으로”의 의미는 개별 염기의 전기적 특성이 아닌 전체적인 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산 각각의 전하가 외부에서 볼 때 전체적인 전기적 특성을 의미하는 것으로, 예를 들어, 생활성 핵산 내의 일부 단량체가 양성을 가지더라도 음성을 가지는 단량체의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 생활성 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 음전하를 가지게 되는 것이며, 캐리어 펩티드 핵산 내의 일부 염기 및/또는 백본(backbone)이 음성을 가지더라도 양성을 가지는 염기 및/또는 백본의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 캐리어 펩티드 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 양전하를 가지게 되는 것이다.
따라서, 본 발명의 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 음전하 또는 중성의 특성을 가지며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 양전하 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전기적 특성의 부여는 변형된 펩티드 핵산 단량체를 사용할 수 있고, 변형된 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하의 아미노산을 포함하고, 음전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 음전하의 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E) 또는 아미노산 유사체의 음전하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가지도록 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전하 부여를 위한 펩티드 핵산 단량체의 변형은 상기 backbone 변형 이외에도 nucleobase가 변형된 펩티드핵산 단량체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 전기적 양성을 가지도록 amine, triazole, imidazole moiety를 nucleobase에 포함하거나, 전기적 음성을 가지도록 carboxylic acid를 염기에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산의 변형 펩티드 핵산 단량체는 음전하를 backbone 혹은 nucleobase에 더 포함할 수 있지만, 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 단량체가 음전하를 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적으로 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 핵산 복합체에 있어, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 또는 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 및 이미징을 위한 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질은 상기 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질과 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 단순 공유결합 또는 링커로 매개된 공유 결합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 핵산 운반체에 결합된 세포 투과, 용해도, 안정성, 운반 및 이미징 관련 물질(예컨대, 소수성 잔기 등)은 표적 유전자의 발현을 조절하는 생활성 핵산과 독립적으로 존재하게 된다.
본 발명에 있어서, 앞서 기술한 바와 같이, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 상보적인 결합 형태는 크게 역평행결합(antiparallel binding)과 평행결합(parallel binding)의 형태를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 상보적인 결합 형태는 생활성 핵산의 목적서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리되는 구조를 가진다.
상기 역평행결합과 평행결합은 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식에 있어, 5'-방향성과 3'-방향성에 따라 결정된다. 역평행 결합은 일반적인 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식으로, 본 발명에 따른 핵산 복합체를 예로 들어 설명하면, 생활성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 캐리어 펩티드 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다. 평행결합은 역평행결합에 비해서는 결합력이 다소 떨어지는 형태로, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 모두가 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 결합력은 융해온도, melting temperature 또는 Tm에 의해 결정된다.
상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮게 하기 위한 구체적인 방법의 예로는, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예로서 상기 캐리어 펩티드 핵산이 링커, 유니버설 염기(universal base) 및 생활성 핵산의 대응되는 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지는 펩티드 핵산 염기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드 핵산 염기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고, 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이노신 PNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 기능 조절을 위한 핵산들의 결합 형태와 전기적 성질 조합을 제공하고, 상기 핵산의 결합 형태와 전기적 성질 조합으로 입자 크기 및 작용 시점을 조절하고, 세포 투과성, 용해도 및 특이도를 향상시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해, 목적 유전자의 존재 하에서, 생활성 펩티드 핵산이 목적 서열과 결합되는 시점(생활성 핵산의 목적 서열로의 치환되는 시점, 표적 특이적 분리 및 결합 시점) 등의 조절이 가능하다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 생활성 핵산의 목적 유전자로의 치환(strand displacement) 시점, 표적 특이적 분리 및 결합(target specific release and bind) 시점의 조절은 복합체의 비특이 결합을 위한 캐리어 펩티드 핵산의 비특이 염기, 유니버설 염기 및 linker의 유무, 개수 및 위치에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 펩티드 복합체의 상보적인 결합의 형태인 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel) 형태의 결합 등과 상기 조건의 조합에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "혈뇌장벽" 또는 "BBB (Blood-Brain Barrier)"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이는 혈액과 뇌 조직 간에 교환되는 것을 면밀히 조절하고 심하게 제한하는 뇌 조직을 통하여 순환되기 때문에 혈액 내에 존재하는 투과성 장벽을 지칭하기 위해 사용된다. 혈액 뇌 장벽 성분에는 모든 혈관의 가장 깊은 내막을 형성하는 내피 세포, BBB와 구조적으로 상관이 있는 인접한 내피 세포들 간의 조밀한 연접부, 내피 세포의 기저 막, 및 혈관의 노출된 외부 표면의 거의 모두를 덮고 있는 가까운 성상세포의 확장된 족양 돌기 (foot process)가 포함된다. BBB는 혈액 내의 대부분의 물질, 예를 들어 대부분의 대분자, 예를 들면 Ig, 항체, 보체, 알부민 및 약물 및 소분자가 뇌 조직 내로 유입되지 못하게 한다.
본 발명의 용어 "질환" 또는 "장애"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이는 기능의 수행을 방해하거나 혼란 시키고/시키거나 불쾌감, 기능이상, 곤란과 같은 증상을 유발시키거나 또는 심지어 병에 걸린 사람을 사망시키거나 이와 접촉한 사람을 사망에 이르게 하는, 신체 상태 또는 몇몇 기관 상의 모든 변경을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 “치료용 조성물”은 "의약(약제학적, 약학적) 조성물(pharmaceutical composition)"과 혼용될 수 있으며, 본 발명의 생활성 핵산 및 상기 핵산과 결합하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 유효성분으로 포함하며, 추가적으로 상기 핵산 복합체에 목적하는 질환을 치료하기 위한 치료용 약물이 결합된 형태일 수 있다.
본 발명의 치료용 조성물은 표준 의약 실시에 따라 혈뇌장벽 내로 전달되는 형태의 제형으로 제형화될 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 형태의 제형에 적합한 담체, 부형제, 보조제 또는 희석제 등의 첨가물을 함유할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 특성을 의미한다.
용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 핵산 복합체의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
본 발명에서의 핵산 복합체를 함유하는 물질은, 환자에게 그 자체로서 또는 병용 요법(combination therapy)에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 의약 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 의약 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여로 질환의 발병을 막거나, 이의 진행을 억제시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 “개선”이란 상기 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여로 질환의 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 조성물은 교모세포종을 치료하기 위하여 또는 교모세포종의 증세를 억제(또는 완화)하기 위하여 의약으로 효과적인 양으로 적용될 수 있다. 교모세포종의 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 적용 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 적용하거나 순차적으로 적용할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 적용될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 적용될 수 있다. 이러한 적용은 단일 또는 다중적으로 적용일 수 있다.
본 발명에서, "개체"는 본 발명에 따른 핵산 복합체를 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000㎎/일이고, 바람직하게는 0.01 ~ 500㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 명세서에 기재되어 있는 핵산 복합체를 포함하는 조성물의 독성과 치료 효율성은, 예를 들어, LD50(군집의 50%에 대한 치사량), ED50(군집의 50%에 대해 치료 효과를 갖는 선량), IC50(군집의 50%에 대해 치료 억제 효과를 갖는 선량)을 결정하기 위하여, 세포 배양 또는 실험동물에서의 표준 제약 과정들에 의해 산정될 수 있다. 독성과 치료 효과 간의 선량 비가 치료 지수이고 이것은 LD50과 ED50(또는, IC50) 간의 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물들이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석에서 얻어진 데이터는 인간에 사용하는 선량의 범위를 산정하는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물들의 투여량(dosage)은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 상태에서 ED50(또는, IC50)을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명의 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 1 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, TGF-β 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및/또는 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 교모세포종 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 교모세포종 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 TGF-β 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및/또는 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, TGF-β 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및/또는 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물을 교모세포종 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid) 및 캐리어 펩티드 핵산, 및 이들을 이용한 복합체의 제조
본 발명의 핵산 복합체의 교모세포종에 대한 효과를 검정하기 위하여 표적 유전자로 TGF-β2를 사용하였으며, 교모세포종의 치료 효과를 확인하기 위해 TGF-β2에 대한 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)으로 안티센스 펩티드 핵산(antisense PNA)을 사용하였다.
본 발명에서 교모세포종 치료 효과를 확인하기 위해 사용한 생활성 펩티드 핵산(antisense PNA)은 서열번호 1 내지 2번으로 표시되는 서열로 구성되어 있으며, 대조군으로 사용한 생활성 핵산 (antisense PNA)은 서열번호 3번으로 표시되는 서열로 구성되어 있다.
본 실시예에서 사용된 펩티드 핵산 기반 생활성 핵산 중 서열번호 2 내지 3번은 엔도좀 탈출능을 돕기 위한 펩타이드 GLFDIIKKIAESF를 5'에 결합하였고, 서열번호 1번은 엔도좀 탈출능을 돕는 펩타이드가 없는 형태로 합성하였다. 본 실시예에서 사용된 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 9번을 제외하고 모두 엔도좀 탈출능을 돕기 위한 펩타이드를 5' 내지 3' 말단에 결합하였으며, 서열번호 4번 내지 8번으로 기재되는 서열로 구성되어 있다. 염기서열, 단량체 변형 및 구조는 하기 표 1과 같다. 본 발명에서 사용한 모든 펩티드 핵산은 파나진(PANAGENE, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다. (표 1).
교모세포종 치료 효과 검증을 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열
번호		 엔도좀탈출
펩타이드		 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 1 - 5'-AAC(-)TG(+)GT(-)CCA(+)TAT(-)CG-O-K-3' -+-+-
2 GLFDIIKKIAESF 5'-GLFDIIKKIAESF-O-AAC(-)TG(+)GT(-)CCA(+)TAT(-)CG-O-K-3' -+-+-
3 GLFDIIKKIAESF 5'-GLFDIIKKIAESF-O-T(-)ATA(+)TC(-)GG(+)TCTA(-)AGC-O-K-3' -+-+-

캐리어 펩티드
핵산		 4 Histidine(10) 5'-Histidine(10)-O-TTG(+)ACCA(+)GGTATA(+)GC-O-K-3' +++
5 Histidine(10) 5'-K-O-CG(+)ATATGG(+)ACCA(+)GTT-O-Histidine(10)-3 +++
6 Histidine(10) 5'-Histidine(10)-O-AT(+)AG(+)C-O-K-3' ++
7 Histidine(10) 5'-K-O-CG(+)AT(+)A-O-Histidine(10)-3' ++
8 Histidine(10) 5'-Histidine(10)-O-ATA(+)TAGCCA(+)GATT(+)CG-O-K-3' +++
9 - 5'-K-O-CG(+)ATATGG(+)ACCA(+)GTT-3' +++
상기 표 1 은 TGF-β2를 표적으로 하는 교모세포종 치료제로서의 효과를 확인하기 위해 사용된 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 및 대조군으로 사용된 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 서열 정보를 나타내었다.
단량체의 변형은 전기적인 성질을 부여하기 위하여 펩티드 핵산의 backbone을 전기적 양성은 리신(Lysine, Lys, K, (+)로 표기)을 전기적 음성은 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E, (-)로 표기)로 변형된 펩티드 backbone을 가지도록 제작하였다.
각각의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 조합은 DMSO 하에서 혼성화되었으며, 그 결과 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 복합체가 제작되었다.
실시예 2: 핵산 복합체를 이용한 교모세포종의 치료 효과 분석
실시예 1에 따라, 하기 표 2의 구조로 제조된 TGF-β2를 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 이용하여 교모세포종의 치료 효과를 분석하였다.
인간 교모세포종 세포에서 유전자 발현 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
1 서열번호 3 및 8 (대조군)
2 서열번호 2 및 4
3 서열번호 2 및 5
4 서열번호 2 및 6
5 서열번호 2 및 7
6 서열번호 1 및 9
실시예 2-1: 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 교모세포종 세포 (U87MG, ATCC No. HTB-14)를 RPMI-1640 배양 배지(웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다.
실시예 2-2: 펩티드 핵산 복합체 처리 세포의 유전자 발현 분석
인간 교모세포종 세포를 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후, 실시예 2-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 500nM씩 처리하고 각각 24, 48, 72, 96, 120시간 배양하였고, RIPA buffer를 각 웰에 30μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다.
protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 TGF-β2 (SantaCruz Biotechnology, 미국), p-Smad3 (Cell signaling technology, 미국) 를 1:1000으로 처리하고 4℃ 에서 하루 동안 방치하였다.
1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Anti-Mouse (Santa cruz Biotechnology, 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이 서열번호 2와 5번의 핵산 복합체 조합 및 서열번호 2번 및 7번의 핵산 복합체 조합을 처리한 군에서 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자의 발현이 72시간까지 가장 많이 억제되는 것을 확인하였다 (도 1a).
또한, 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체 (조합 3)에서 엔도좀 탈출능을 돕는 펩타이드가 없는 서열의 핵산 복합체 (서열번호 1과 9번, 조합 6)의 표적 유전자의 발현 억제 효율을 확인한 결과, 표적 유전자 (TGF-β2)와 하위 유전자 (p-Smad3)의 발현이 96시간까지 억제되는 것을 확인하였고, 엔도좀 탈출능을 돕는 펩타이드가 있는 핵산 복합체 조합 (서열번호 2와 5번, 조합 3)보다 더 길게 표적 유전자를 억제하는 효율을 확인하였다 (도 1b).
실시예 2-3: 펩티드 핵산 복합체 처리 세포의 세포 이동 (cell migration) 분석
24웰 플레이트에 세포배양용 인설트 (cell culture insert, BD, 미국)을 고정한 후 인간 교모세포종 세포를 소태아혈청이 없는 배지를 이용하여 1x104로 세포를 인설트 안쪽에 씨딩하고, 인설트 아래쪽 24웰 플레이트에 10% 소태아혈청이 포함된 배지를 추가하여 24시간 배양 후, 실시예 2-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 500nM씩 처리하였다. 세포는 각각 24, 48, 72시간 배양한 뒤, 4% PFA (paraformaldehyde)로 10분간 세포를 고정하였고, 0.1% crystalvioet 용액으로 30분간 염색한 후 인설트 안쪽에 남아있는 세포는 면봉으로 제거하고 염색 용액을 물로 세척하였다. 하루 정도 인설트 막 (membrane)을 말린 후, 현미경 하에서 이동한 세포의 수를 관찰하였다.
그 결과, 도 2에서 나타낸 바와 같이 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체 조합에서 세포의 이동 효율이 가장 많이 억제된 것을 확인하였고, 이 억제 효과는 72시간까지 지속적으로 나타나는 것을 확인하였다 (도 2a).
또한, 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체 (조합 3)에서 엔도좀 탈출능을 돕는 펩타이드가 없는 서열의 핵산 복합체 (서열번호 1과 9번, 조합 6)의 세포 이동 억제 효율을 확인하였을 때, 펩타이드가 없는 핵산 복합체를 처리한 군에서도 세포의 이동이 억제되는 것을 확인하였고, 펩타이드가 있는 핵산 복합체를 처리한 군 (조합 3)보다 더 억제 효율이 좋은 것을 확인하였다 (도 2a).
ImageJ 프로그램을 사용하여 이동한 세포를 정량적으로 확인한 결과, 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체 조합을 처리한 군 (조합 3)에서 72시간까지 대조군 대비 약 50% 이상 감소한 것을 확인하였고, 펩타이드가 없는 핵산 복합체는 처리한 군 (조합 6)은 대조군 대비 24시간부터 70% 이상 세포 이동이 감소하여 엔도좀 탈출능을 돕는 펩타이드가 있는 핵산 복합체 (서열번호 2와 5번, 조합 3)보다 빠르게 세포 억제 효율이 나타나는 것을 확인하였다 (도 2b).
실시예 3: 동소 이식 동물 모델 (Orthotopic mouse model) 에서의 교모세포종 표현형 효과 분석
동소 이식 동물 모델에서 효능을 검증하기 위하여 7주령 암컷 누드 마우스(오리엔트바이오, 한국)를 사용하였다. 종양 모델 생성을 위해 마우스는 Avertin (5mg/kg)으로 마취하여 소동물용 뇌정위고정기 (Stereotaxic instruments, Stoelting Co, 미국)에 고정 후 3x105의 세포 수로 U87MG 세포를 해밀턴 주사기를 이용하여 주입하였다. 주입 좌표는 AP +0.5mm, ML +2.0mm DV -3mm 이다. 종양이 증식하도록 10일 계류한 후, 일주일에 두 번씩 핵산 복합체를 꼬리 정맥으로 투여하였고, 양성 대조군의 경우 TGF-β receptor 억제제인 galunisertib (MedChemexpress, 미국)을 75mg/kg의 용량으로 매일 경구투여하였다. 투여 기간 동안 몸무게는 일주일에 두 번 측정하였으며, 3주간 6회 투여 후 모든 동물은 안락사 수행하였다.
본 실시예에서는 실시예 2를 통하여 효과가 검증된 핵산 조합체를 선별하여 U87MG 교모세포종 세포를 동소 이식한 동물 모델에서 조직학적 소견, TGF-β2의 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 3과 같다.
교모세포종 동소 이식 동물 모델에서 종양의 치료 효과 분석을 위한 핵산 복합체 조합
조합 핵산 복합체
3 서열번호 2 및 5
6 서열번호 1 및 9
실시예 3-1: H&E 염색을 이용한 교모세포종 동소 이식 동물 모델에서의 표현형 분석
실시예 3의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 마우스 뇌 조직을 생검하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 30% 설탕 용액에 담가 3일 동안 탈수한 후, OCT 용액에 포매 (embedding) 하였다. 포매한 조직은 -20℃에서 보관하여 얼린 후, 동결절편기 (Cryostat, Leica, 미국)에서 조직을 20μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 Hematoxylin:Eoin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 현미경으로 종양의 크기 변화를 분석하였다.
그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이 종양을 이식한 유도군 (DMSO) 대비 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체 조합 (조합 3)을 처리한 그룹에서 종양의 크기가 현저히 감소한 것을 확인하였고, 고농도 투여군 (PNA 3, 20mg/kg)의 경우 양성 대조군 (Positive control, PC)보다 더 종양의 크기가 감소한 것을 확인하였다 (도 3). 종양의 크기는 imageJ 프로그램을 사용하여 종양의 가로와 세로 길이를 측정한 후, 면적을 계산하여 정량적으로 나타내었다.
또한, 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체 (조합 3)에서 엔도좀 탈출능을 돕는 펩타이드가 없는 서열의 핵산 복합체 (서열번호 1과 9번, 조합 6)의 조직학적 종양 크기 변화를 확인한 결과, 종양 유도 대조군 (DMSO) 대비 펩타이드가 없는 핵산 복합체를 처리한 군에서 처리 농도가 높아질수록 종양의 크기가 감소하는 경향을 확인하였고, ImageJ 프로그램을 사용하여 종양의 면적을 측정하여 정량화하여 확인한 결과도 동일하게 핵산 복합체를 처리한 군에서 처리 농도에 따라 종양의 크기가 감소하는 것을 확인하였다 (도 4). 특히 펩타이드가 있는 핵산 복합체 (조합 3)에 비해 투여 용량을 절반으로 줄인 10mg/kg 투여군 (PNA 6, 10mg/kg)에서 종양의 크기가 현저히 감소하였고, 펩타이드가 있는 핵산 복합체의 고농도 처리군 (조합 3, 20mg/kg)과 비슷한 억제 효율을 확인하였다 (도 3, 4).
실시예 3-2: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
실시예 3의 조건으로 실험을 진행하여 생검한 마우스 뇌 조직에 생성된 종양 조직 일부를 RIPA buffer를 각 조직에 200 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 TGF-β2 (SantaCruz Biotechnology, 미국), p-Smad3 (Cell signaling technology, 미국) 를 1:1000으로 처리하고 4℃ 에서 하루 동안 방치하였다.
1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Anti-Mouse (Santa cruz Biotechnology, 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 마우스 뇌 조직에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 5에서와 같이 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체 (조합 3)를 처리한 군에서 종양 유도군들에 비해 표적 유전자인 TGF-β2 와 하위 유전자인 p-Smad3의 발현이 억제된 것을 확인하였고, 고농도 처리군 (PNA 3, 20mg/kg)에서 n=3에 대해서 모두 표적 유전자와 하위 유전자의 발현이 억제된 것을 확인하였다 (도 5a).
또한, 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체 (조합 3)에서 엔도좀 탈출능을 돕는 펩타이드가 없는 서열의 핵산 복합체 (서열번호 1과 9번, 조합 6)처리군에서 종양 유도군에 비해 표적 유전자가 억제된 것을 확인하였고, 특히 두 가지의 고농도 처리군 (PNA 6, 5mg/kg 및 10mg/kg)에서 n=3에 대해 표적 유전자와 하위 유전자의 발현이 다른 종양 유도군들에 비해 억제된 것을 확인하였다 (도 5b).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SEASUN THERAPEUTICS, INC <120> Composition for Preventing or Treating Glioblastoma Comprising Peptide Nucleic Acid Complex <130> P20-B325 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bioactive 1 <400> 1 aactggtcca tatcg 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bioactive 2 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> GLFDIIKKIAESF <400> 2 aactggtcca tatcg 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bioactive 3 <400> 3 tatatcggtc taagc 15 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 1 <400> 4 ttgaccaggt atagc 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 2 <400> 5 cgatatggac cagtt 15 <210> 6 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 3 <400> 6 atagc 5 <210> 7 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 4 <400> 7 cgata 5 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 5 <400> 8 atatagccag attcg 15 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 6 <400> 9 cgatatggac cagtt 15 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> endosome escaper <400> 10 Gly Leu Phe Asp Ile Ile Lys Lys Ile Ala Glu Ser Phe 1 5 10

Claims (11)

  1. TGF-β유전자를 표적으로 하고;
    (i) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 4으로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    (ii) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    (iii) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 6으로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    (iv) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 7로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체; 및
    (v) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 9로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 교모세포종의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 펩티드는 GLFDIIKKIAESF(서열번호 10) 또는 Histidine(10)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 혈뇌장벽 투과능을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
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