MX2013004679A - Composicion terapeutica para el tratamiento de glioblastoma. - Google Patents

Composicion terapeutica para el tratamiento de glioblastoma.

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Michael Raymond Olin
Walter Low
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Abstract

La presente invención está dirigida a composiciones y métodos para tratar a un animal al que se le ha diagnosticado Glioblastoma multiforme (GBM).

Description

COMPOSICION TERAPEUTICA PARA EL TRATA IENTO DE GLIOBLASTOMA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud de patente reclama el beneficio de prioridad de la solicitud de E.U.A. Serie No. 61/406,429, presentada el 25 de octubre, 2010, cuya solicitud se incorpora aquí para referencia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION El Glioblastoma multiforme (GBM) es un tipo común de tumor cerebral primario en seres humanos y es un cáncer muy agresivo y devastador, con una supervivencia media de aproximadamente un año. (Eramo y otros, Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells, Cell Death and Differentiation (2006) 13, 1238-1241). El glioblastoma tiene el peor pronóstico de cualquier afección del sistema nervioso central. La terapia para GBM es difícil debido a su ubicación biológica en el cerebro. Los tratamientos actuales pueden involucrar quimioterapia, radiación, radiocirugía, corticoesteroides, terapia anti-angiogénica, y cirugía. A pesar del desarrollo de nuevas técnicas quirúrgicas y de radiación y el uso de múltiples fármacos antineoplásicos, no existe una cura para los gliomas malignos. (Eramo y otros, Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells, Cell Death and Differentiation (2006) 13, 1238-1241). Las células de glioblastoma son resistentes a agentes citotóxicos, y la alta incidencia de recurrencia en un periodo muy corto de tiempo en pacientes con glioblastoma sugiere que las células tumorigénicas son capaces de sobrepasar los tratamientos.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona una composición antitumoral que comprende una célula madre GBM6-AD de glioblastoma purificada. En ciertas modalidades, la célula es una línea de célula adherente en medios libres de suero que es útil para generar respuestas inmunes antitumorales. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona una línea de célula madre de glioblastoma (GBM6-AD), asignada PTA-11498 de designación de depósito de patente ATCC®. En ciertas modalidades, las células GB 6-AD son Usadas. En ciertas modalidades, Las células GBM6-AD se irradian. En ciertas modalidades, la composición antitumoral además comprende un vehículo no tóxico fisiológicamente aceptable. En ciertas modalidades, la composición antitumoral además comprende un adyuvante. En ciertas modalidades, el adyuvante es Imiquimod. En ciertas modalidades, el adyuvante es un ligando de receptor de tipo toll (TLR), tal como CpG ODN, Anexina A2, Poli ICLC, o ligandos no TLR que estimulan respuestas inmunes. En ciertas modalidades, la composición es conjugada a un portador tal como una célula dendrítica o un macrófago. En ciertas modalidades, la composición está contenida en un portador no célula, tal como un liposoma.
La presente invención proporciona un método para provocar una respuesta inmune en un animal que lo necesita, que comprende administrar al animal la composición antitumoral descrita anteriormente. En ciertas modalidades, el animal es un mamífero, tal como un ser humano o mamífero no ser humano. En ciertas modalidades, el método además comprende administrar Imiquimod al animal. En ciertas modalidades, el Imiquimod se administra antes de la administración de la composición antitumoral. En ciertas modalidades, la composición antitumoral se administra parenteralmente, tal como intramuscular, subcutánea, intradérmica, o intravenosamente. Sin embargo, otros modos de administración, tales como oral o intranasal o suministro, también son aceptables. En ciertas modalidades, la composición antitumoral se administra en más de un punto d e tiempo, t al como en dos puntos de t iempo. En ciertas modalidades, la composición antitumoral se administra a un rango de dosis de 1 g - 100 mg de células GBM6-AD en cada punto de tiempo de administración. En ciertas modalidades, la composición antitumoral se administra a una dosis de células 2 x 106 GBM6-AD en cada punto de tiempo de administración. En ciertas modalidades, el Imiquimod se administra tópicamente. En ciertas modalidades. El Imiquimod se administra tópicamente en dos sitios de inyección supraescapular.
En ciertas modalidades, el método además comprende administrar una terapia de irradiación al animal. En ciertas modalidades, la terapia de irradiación se administra antes, durante o después de la administración de la composición antitumoral. En ciertas modalidades, la terapia de irradiación se administra a una dosis de menos de 6,000 cGY. En ciertas modalidades, la terapia de irradiación se administra durante múltiples puntos de tiempo. En ciertas modalidades, la terapia de irradiación se administra durante tres puntos de tiempo. En ciertas modalidades, la terapia de irradiación se administra a una dosis de 5220 cGY, seguido por dos dosis adicionales de 360 cGY cada una. En ciertas modalidades, la primera dosis adicional de 360 cGY se administra 10 semanas después de la dosis de 5220 cGY, y la segunda dosis adicional de 360 cGY se administra 14 semanas después de la dosis de 5220 cGY.
En ciertas modalidades, el método además comprende administrar una temozolomida de sensibilizador de radiación al animal. En ciertas modalidades, el sensibilizador de radiación es un "inhibidor de parp" (parp es una proteína involucrada en la reparación de ADN). En ciertas modalidades, el sensibilizador de radiación es temozolomida. En ciertas modalidades, la temozolomida se administra durante la terapia de radiación inicial. En ciertas modalidades, la composición de temozolomida se administra en un rango de dosis de 5-200 mg/m2/día. En ciertas modalidades, la temozolomida se administra a una dosis de 75 mg/m2/día. En ciertas modalidades, la terapia de radiación está a u na dosis de 5220 cGy en fracciones de 180 cGy. En ciertas modalidades, la terapia de radiación se administra durante 6 a 7 semanas. En ciertas modalidades, el método además comprende administrar fracciones de 360 cGy adicionales en fracciones de 180 cGy durante dos días consecutivos a 4 y 8 semanas después de la terapia de radiación inicial.
En ciertas modalidades, el animal es un mamífero, tal como un ser humano.
En ciertas modalidades, el método además comprende administrar una terapia de dexametasona al animal. En ciertas modalidades, la terapia de dexametasona se administra al momento del diagnóstico. En ciertas modalidades, el animal es destetado de dexametasona por la semana 6 de terapia de radiación.
En ciertas modalidades, el método además comprende administrar una quimioterapia o fármaco que vacía la célula regulatoria T o células supresoras derivadas de mieloide. Los ejemplos incluyen sunititib, ontak, ciclofosfamida, gemcitabina', ácido retinoico.
La presente invención proporciona un método para producir una vacuna de célula dendrítica, que comprende pulsar células dendríticas con la composición antitumoral descrita anteriormente.
La presente invención proporciona un método para provocar una respuesta inmune en un animal que comprende introducir al animal la composición descrita anteriormente.
La presente invención proporciona un método para generar anticuerpos específicos para GBM6-AD, que comprende introducir en el animal la composición descrita anteriormente, y aislar anticuerpos específicos para GB 6-AD.
La presente invención proporciona un anticuerpo purificado que se une específicamente a una célula madre GBM6-AD de glioblastoma adherente purificada, tal como una célula madre GBM6-AD de glioblastoma adherente purificada que es PTA-11498 de Designación de Depósito de Patente ATCC®. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un Fv de cadena individual o un fragmento scFv.
La presente invención proporciona un método para tratar un tumor cerebral primario en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente la composición antitumoral o anticuerpos purificados que se unen específicamente a una célula madre GBM6-AD de glioblastoma adherente purificada como se describe anteriormente. En ciertas modalidades. El tumor cerebral primario es un astrocitoma, glioblastoma multiforme, meduloblastoma o ependimoma.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Datos de citometría de flujo de células GBM6-AD que se van a utilizar como una fuente de antígeno de tumor. Los histogramas muestran tinción de isotipo para controlar la unión de fondo (gris sólido) y tinción de anticuerpo de prueba (blanca).
Figura 2. La vacuna de Imiquimod/lisado de tumor extiende la supervivencia en GBM murino. Se implantaron células de glioma GL261 a ratones C57BL/6 en el estrato derecho. La vacunación con Usado de GL261 se administró por inyección intradérmica en los días 3, 10, 17, 24, y 31 después de ataque de tumor. Se aplicó crema de Imiquimod a la piel cubriendo el sitio de vacunación cada vez. Se utilizaron ratones tratados con solución salina como controles (N = 5/grupo). La supervivencia se prolongó significativamente en el grupo vacunado (rango de registro; p = 00.06).
Figura 3. Esquema de tratamiento. La mitad de los pacientes reciben temozolomida (tem + ) y la otra mitad no (tem-) durante las primeras cuatro semanas de terapia de radiación (XRT). La radiación se proporciona e n fracciones de 180 cGy. Se administra vacuna de Imiquimod/BTIC cada dos semanas de las semanas 10 a 14, luego cada cuatro semanas de las semanas 15 a 52.
Figura 4. Células primarias aisladas de un glioblastoma humano crecido en dos tensiones de oxígeno. Se sembró el número idéntico de células de glioma en medios de célula madre completos que consisten de DMEM/F12, 20 ng/ml de EGF y FGF, y suplemento de 1X B27 y N2. Se capturaron imágenes representativas cinco días después.
Figura 5. Esta figura proporciona los resultados de células T tumoricidas cebadas con DC pulsados por lisado de GBM6 en un ensayo de cultivo de tejido. Estos datos muestran directamente que GB 6 puede generar respuestas inmunes tumoricidas.
Figuras 6A-6C. Las líneas de célula GBM primarias cultivadas en 5% de oxígeno expresan altos niveles de proteínas asociadas con glioma y que inician tumor. A, células de tres gliomas cultivados en 5% o 20% de 02 se analizaron para niveles ARNm mediante PCR de tiempo real (n = 4/grupo) y B, niveles de proteína por citometría de flujo (n = 3-4/grupo). C, se validaron niveles de proteína por análisis western. *P<0.005; **P<0.01.
Figuras 7A-7D. TLs cerebrales de 5% de oxígeno exhiben actividad tumoricida superior. Se estimularon PBMC con DC pulsados de TL de 5% o 20% de 02 y se incubaron con A y B, glioblastomas objetivo coincidentes con HLA-A2 o C, un ependimoma. D, para determinar si la respuesta tumoricida aumentada fue dependiente de MHC-I, el anticuerpo de bloqueo anti-ABC se agregó a células objetivo antes de PBMC. Los datos representan dos experimentos separados. Las barras de error, ± SEM. *P<0.05; **P<0.01.
Figuras 8A-8C. Lisados de tumor de 5% de oxígeno aumentan la iniciación de célula T CD8. Se pulsaron células dendríticas con TLs etiquetados con CFSE derivados en 5% o 20% 02, teñidos con a-HLA-DR y A, analizados por citometría de flujo (representati o de 3 réplicas): CMVPBMC se cultivaron conjuntamente c on DC pulsadas con 5% o 20% de 02 TL +/- péptido pp65 para B, 48h y se analizaron para introducción de IFNy secretado, C, 72h para determinar la producción de IFNy de pentámero+ +CD8 + pp65 en una base por célula. Barras de error, ± SEM. *P<0.05; **P<0.01.
Figura 9. Procesamiento de derivado de sangre periférica autólogo.
Figura 10. Tumores antes y después de tratamiento. Primer panel en el tiempo = 0, segundo panel muestra las lesiones después de dos meses, y tercer panel muestra lesiones después de tres meses. La segunda lesión se fue después de tres meses.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Composiciones Antitumorales Estudios previos han mostrado que GBM es la histología más común de Glioma Pontino Intrínseco Difuso (DIPG). Por consiguiente, se ha demostrado que DIPG expresa proteínas inmunogénícas asociadas con GBM que se han apuntado actualmente en pruebas clínicas de vacuna incluyendo IL-13Ra2, Epha2, Her-2, y EGFRvIll (Wheeler CJ, et al. Vaccination elicits correlated immune and clinical responses in glioblastoma multiforme patients. Cáncer Research. 2008;68:5955-5964; Okada H, et al. Expression of glioma-associated antigens in pediatric brain stem and non-brain stem gliomas. J Neurooncol. 2008;88:245-250; Sampson JH, Archer, G E., Mitchell, D.A., Heimberger, A.B. & Bigner, D.D. Tumor-specif ic immunotherapy targeting the EGFRvIll mutation in patients with malignant glioma. Semin Immunol. 2008;20:267-275). Sin embargo ya que D IPG no es un tumor quirúrgicamente accesible, la generación de vacunas lisado de célula ha sido difíciles. Los presentes inventores han establecido una línea BTIC, GBM6, desarrollada en medios de célula madre libres de suero que pueden utilizarse para tratar DIPG con una vacuna de lisado.
Los inventores también han establecido una variante de la línea GBM6 padre, llamada GBM6-AD que es adherente cuando crece en medios de célula madre libres de suero. Como se utiliza aquí el término "línea de célula adherente" significa que el crecimiento de líneas de célula como una monocapa adherente en condiciones completamente libres de suero (es decir, las células crecen en cultivo, como monocapas sobre un substrato artificial (cultivo adherente) en lugar de flotar libres en el medio de cultivo (cultivo de suspensión)). Como se utiliza aquí, el término "línea de célula adherente" significa que las células son adherentes en medios de célula madre libres de suero incluso en un matraz de cultivo de tejido estándar (por ejemplo, matraz Falcon de 75 cm2, placa de 10 cm2, etc.) que no se trataron con un reactivo para hacerlos adherirse, tal como fibronectina, matrigel, o laminina. De esa forma, las presentes células se adhieren a un substrato sólido incluso en ausencia del substrato sólido que se está pre-tratando. Esto es una propiedad muy rara y única de esta línea de célula. Esta característica permite la fabricación de célula a gran escala bajo condiciones clínicas mucho más rápido y mucho más barato con relación a líneas de célula que no son adherentes bajo condiciones libres de suero.
GBM6-AD pasó más extensivamente que GBM6 y con el tiempo su cinética de crecimiento después de descongelar de nitrógeno líquido aumentó. Esto es una ventaja significativa con relación a GBM6 debido a que es posible hacer cantidades mucho mayores de vacunas más rápido, que es una consideración importante si el paciente está muriendo rápidamente. El GBM6 también ha crecido en 5% de 02 durante un periodo de tiempo extendido para generar GBM6-AD, que parece hacer que las células se vuelvan adherentes, y más importante, más inmunogénicas.
GBM6-AD se estableció bajo condiciones de buena Practica de Fabricación (GMP) en el Laboratorio de Terapia Celular Clínica del Centro Médico de la Universidad (acreditado FACT, CAP #18060-01, CLIA #24D0688128) en una habitación de producción de clase 10,000 en la instalación de Terapia Molecular y Celular (MCT) de la Universidad. Los datos de citometría de flujo demuestran que GBM6 expresa muchos antígenos DIPG importantes incluyendo IL-13Ra2, Epha2, y Her-2 (Figura 1). Además, GBM6-AD también expresa antígenos BTIC clave incluyendo CD133, nestina, y Sox-2 (Figura 1). Basado en estos datos, la vacunación de lisado GBM6-AD apunta la mayoría de DIPG y GBM que no ocurren en otras partes del cerebro.
GBM6-AD de línea de célula madre de glioblastoma se ha depositado con el Depósito de Colección de Cultivo de Tipo Americano (deposito ATCC®, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 E.U.A.) y se asignó PTA-11498 de la Designación de Depósito de Patente ATCC®. La línea de célula se depositó el 18 de noviem'bre, 2010. El acceso a este depósito estará disponible durante la espera de la solicitud del Comisionado de Patentes y Marcas Registradas y personas determinadas por el Comisionado para tener derecho a esto con solicitud. Los depósitos se mantendrán en el Deposito ATCC®, que es un depósito público, durante un período de 30 años, o 5 años después de la solicitud más reciente, o durante la vida válida de la patente, cualquiera que sea mayor, y se reemplazará si se vuelve no viable durante ese periodo.
En ciertas modalidades se manipulan células GBM6-AD, tales como Usadas o irradiadas. La lisis puede lograrse mediante métodos que incluyen ciclos de congelación-descongelación múltiple o utilizando burbujas de gas a alta presión (nebulización) para "perforar" orificios en la célula. Los Usados pueden congelarse rápidamente o utilizando una congelación de velocidad de control (por ejemplo, 1 grado centígrado por minuto) hacia abajo a -80°C o más frío para almacenamiento. Las células pueden irradiarse antes de generar un Usado, o el mismo Usado puede irradiarse para asegurar una muerte celular completa. La irradiación puede suministrarse desde múltiples dispositivos incluyendo un irradiador de. cesio o cobalto.
Adyuvantes Las vacunas comúnmente contienen dos componentes: antigeno y adyuvante. El antigeno es la estructura molecular codificada por el patógeno o tumor contra el cual se dirige la respuesta inmune. Para activar una respuesta inmune especifica de antigeno, el antigeno debe presentarse en el microambiente inmunoestimulante apropiado. En ciertas modalidades, los adyuvantes establecen tales microambientes al estimular la producción de moléculas de activación inmune tales como citocinas pro-inflamatorias. La eficacia de vacuna depende de los tipos de antígeno y adyuvante, y de cómo se administran. Golpear el balance derecho entre estos componentes es clave para provocar inmunidad productiva. 1. Receptores se tipo Toll Se ha estimado que la mayoría de las especies humanas están entre diez y quince tipos de receptores de tipo Toll (TLR). Once TLR (llamados simplemente TLR1 a TLR11) han sido identificados en seres humanos, y las formas equivalentes de muchos de éstos se han encontrado en otras especies mamíferas. Los TLR funcionan como un dímero. Aunque la mayoría de los TLR parecen funcionar como homodímeros, el TLR2 forma heterod ímeros con TLR1 o TLR6, cada dímero teniendo diferente especificidad de ligando. La función de TLR en todos los organismos parece ser lo suficientemente similar para utilizar un modelo individual de acción. Cada receptor de tipo Toll forma ya sea un homodímero o heterodímero en el reconocimiento de uno específico o un grupo de determinantes moleculares específicos presentes en microorganismos.
Los TLR perciben la infección al reconocer patrones moleculares asociados con patógeno e inflamación de activación. Por lo tanto los ligandos TLR han sido desarrollados como adyuvantes de vacuna. En ciertas modalidades, un ligando TLR1 a través de TLR11 puede utilizarse como un adyuvante. La captación de antígeno y activación de señalización de TLR por adyuvantes son procedimientos dinámicos, extremadamente tenues. Idealmente, las células de presentación de antígeno (APC) que afectan completamente el antigeno también captarán el ligando TLR, que resulta e n la regulación ascendente de moléculas co-estimuladoras, secreción de citocinas inflamatorias, y presentación de antígeno a células T. Esto es ciertamente el caso cuando las APC procesan partículas virales, que contienen tanto ligandos TLR (por ejemplo, ARNds) como proteínas virales. Sin embargo, en el caso de vacunas de cáncer, el antígeno y el ligando TLR se han administrado en la mezcla. Este aspecto puede resultar en varios resultados teóricos en el sitio de inyección: APC que afectan completamente el antígeno solo, el ligando TLR solo, o ligando TLR con antígeno (el resultado deseado). De esa forma, la co-admínístración puede crear un problema de señal a ruido en la respuesta inmune resultante. Incluso cuando el antígeno y el ligando TLR se han afectado completamente por la misma APC, el tiempo es crítico. Esto se demostró mejor por Nierkens y otros, quien mostró que la captación de ligando TLR9 antes de antígeno específicamente redujo la presentación cruzada de antígeno a CTL con relación a captación concurrente (Nierkens S, y otros, Cáncer Res. 2008;68:5390-5396). Por consiguiente, Ingale y otros han demostrado que la conjugación directa de ligandos TLR2 a antígeno a través de un enlace covalente aumentó la titulación de IgG reactivo de tumor por 100,000 veces con relación a la vacunación con una mezcla de cada componente (Ingale S. y otros, Nat Chem Biol. 2007;3-663-667). Similarmente, el antígeno de acoplamiento a ligandos TLR6 aumenta el número de células T específicas de antígeno 5 a 100 veces con relación a coadministración de los dos componentes separadamente (Krishnamachari Y, Salem AK. Adv Drug Deliv Rev. 2009;61:205-217).
La imidazoquinolina es una molécula orgánica cíclica doble que ha sido explotada como un adyuvante de vacuna. Imiquimod es un modificador de respuesta inmune aprobado por la FDA administrado como una crema sobre la piel para el tratamiento de tumores cutáneos. Imiquimod ejerce sus efectos inmunoestimulantes a través de TLR7 expresado sobre células dendríticas plasmacitoides y células B en seres humanos. El tratamiento Imiquimod causa la liberación de citocinas pro-inflamatorias que incluyen interferóna, ¡nterferóny, e IL-12, todos estos son importantes para la iniciación de la respuesta inmune Th1 robusto asociado con actividad antitumoral y anti-viral en animales. El Imiquimod tópico ha sido utilizado como un adyuvante de vacuna con éxito moderado en numerosos estudios que apuntan a tumores establecidos e infección viral. Sin embargo, la eficacia de Imiquimod está restringida al confiar únicamente en la señalización de TLR7 debido a que TLR7 no se expresa en uno de las APC profesionales más abundantes, las células dendríticas mieloides TLR7* CD8a+ (Edwards AD, y otros, Eur J Immunol. 2003;33:827-833), limitando consecuentemente la eficacia. Por esta razón se han desarrollado otros compuestos por modificación de Imiquimod.
Resiquimod es un ligando TLR7 y TLR8 doble potente (Wu JJ, y otros, Antiviral Res. 2004;64:79-83). Ya que TL 8 se expresa en células dendríticas mieloides CD8a+, ha superado una de las limitaciones de Imiquimod (Coffman RL, y otros, Immunity; 33:492-503). Sin embargo, muchos factores han limitado la eficiencia de resiquimod e Imiquimod. Un mecanismo recientemente identificado para falla de tratamiento es que aunque estos fármacos inducen citocinas pro-inflamatorias, concurrentemente inducen altos niveles de citocinas anti-inflamatorias tales como IL-10 (Gibson SJ, y otros, Cell Immunol. 2002;218:74-86; y Lu H, y otros, J lmmunol;184:5360-5367). De relevancia clínica, la aplicación de crema de Imiquimod funciona sobre el tumor tratado, pero no tumores distales, sugiriendo un deterioro en inmunidad sistémica (Lu H y otros., J Immunol; 184:5360-5367; y Gilí VL, y otros, Vet Comp Oncol. 2008;6:55-64). De hecho el bloqueo de IL-10 después del tratamiento de Imiquimod mostró que resultar en un control de tumores tratados y distales (no tratados), que demuestran la importancia clínica de la respuesta ' de citosina de auto-regulación inducida por Imidazoquinolinas actualmente utilizadas. De esa forma, existe una necesidad de desarrollar compuestos basados en Imiquidazolquinolina novedosos que activan una relación más deseable de citocinas pro- a anti-inflamatorio. En ciertas modalidades de la presente invención, se administra molécula TLR-7 y/o TLR-8 (o combinación de TLT-7/8).
Poli ICLC es un inmunoestimulante que consiste de carboximetilcelulosa, ácido polinosínico-policitidílico, y ARN de doble cadena de poli-L-lisina. Es un ligando para receptor-3 de tipo Toll (TLR3). 2. Anexina A2 Anexina A2 es una proteína que en seres humanos está codificada por el gen ANXA2. Anexina 2 está involucrada en diversos procedimientos celulares tales como motilidad celular (especialmente la de células epiteliales), enlaces de complejos de proteína asociados con membrana al citoesqueleto de actina, endocitosis, fibrinólisis, formación de canal de ion, e interacciones de matriz celular. Es una proteína de unión de fosfolípido dependiente de calcio cuya función es ayudar a organizar exocitosis de proteínas intracelulares al dominio extracelular. La anexina 2A es una proteína pleiotrópica que significa que su función depende del lugar y tiempo en el cuerpo. 3. Oligonucleótidos El término "ácido nucleico" u "oligonucleótido" se refiere a una forma polímérica de nucleotidos al menos de cinco bases de longitud. El término "oligonucleótido" incluye tanto formas de cadena individual como doble de ácido nucleico. Los nucleotidos de la invención pueden ser desoxiribonucleótidos, ribonucleótidos, o formas modificadas de cualquier nucleótido. Generalmente, las moléculas de cadena doble son más estables in vivo, aunque las moléculas de cadena individual tienen actividad aumentada cuando contienen una estructura de base sintética.
Un "oligodesoxirribonucleótido" (ODN) como se utiliza aquí es una secuencia de ácido desoxirribonucleico de aproximadamente 3-1000 (o cualquier integrador entre ellos) de bases de longitud. En ciertas modalidades, el ODN es de aproximadamente 3 a aproximadamente 50 bases de longitud. La captación de ODN de linfocito se regula por la activación de célula. Por ejemplo, células B que captan ODN CpG proliferan y segregan cantidades aumentadas de inmunoglobulina. La presente invención se basa en el hallazgo que ciertos oligonucleótidos que contienen al menos un dinucleótido de citosina-guanina no metilada (CpG) activa la respuesta inmune.
Una "CpG" o "motivo de CpG" se refiere a un ácido nucleico que tiene una citosina seguida por una guanina enlazada por un enlace de fosfato. El término "CpG metilada" se refiere a la metilación de la citosina en el anillo de pirimidina, que usualmente ocurre en la posición 5 del anillo de pirimidina. El término "CpG no metilada" se refiere a la ausencia de metilación de la citosina en el anillo de pirimidina. La metilación, remoción parcial, o remoción d e un motivo CpG no metilada en un oligonucleotido de la invención se cree que reduce su efecto. La metilación o remoción de todos los motivos de CpG no metilada en un oligonucleotido reduce substancialmente su efecto. El efecto de metilación o remoción de un motivo CpG es "substancial" si el efecto es similar al de un oligonucleótido que no contiene un motivo CpG.
En ciertas modalidades, el oligonucleótido CpG está en el rango de aproximadamente 8 a 1000 bases de tamaño, o aproximadamente 8 a 30 bases de tamaño. Para usarse en la presente invención, los ácidos nucleicos pueden sintetizarse de novo utilizando cualquiera de un número de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el método de cianoetil fosforamidita (Beaucage, S.L., y Caruthers, M. H., Tet. Let. 22:1859,1981 ); método de H-fosfanoato de nucleósido (Garegg y otros, Tet. Let. 27:4051-4054,1986; Froe' ler y otros., Nucí. Acid. Res. 14:5399-5407,1986; Garegg y otros, Tet. Let. 27:4055-4058, 1986, Gaffney y otros., Tet. Let. 29:2619-2622, 1988). Estas químicas pueden realizarse por una variedad de sintetizadores de oligonucleótido automatizados disponibles en el mercado.
Alternativamente, los dinucleótidos de CpG pueden producirse a gran escala en plásmidos, (ver Sambrook, T., y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989), que después de haberse administrado a un sujeto, se degrada en los oligonucleótidos. Los oligonucleótidos pueden prepararse a partir de secuencias de ácido nucleico existentes (por ejemplo, genómicas o ADNc) utilizando técnicas conocidas, tales como aquellas que emplean enzimas de restricción, exonucleasas o endonucleasas.
Los oligonucleótidos de CpG de la invención son moléculas inmunoestimulantes. Una "molécula de ácido nucleico ¡nmunoestimulante" se refiere a una molécula de ácido nucleico, que contiene una citosina no metilada, secuencia de d i n ucleótido de guanina (es decir, "CpG ADN" o ADN que contiene una citosina seguida por guanosina y enlazada por un enlace de fosfato) y estimula (por ejemplo, tiene un efecto mitogénico sobre, o induce o aumenta la expresión de citosina por) una célula dendrítica. Una molécula de ácido nucleótido ¡nmunoestimulante puede ser de cadena doble o cadena individual. Generalmente, las moléculas de cadena doble son más estables in vivo, mientras que las moléculas de cadena individuales tienen actividad inmune aumentada.
Un "ácido nucleico" o "ADN" significa múltiples nucleótidos (es decir, moléculas que comprenden un azúcar (por ejemplo, ribosa o desoxiribosa) enlazada a un grupo de fosfato y a una base orgánica intercambiable que es pirimidina sustituida (por ejemplo citosina (C), tiamina (T) o uracilo (U)) o una purina sustituida (por ejemplo, adenina (A) o guanina (G)). Como se utiliza aquí, el término se refiere a ribonucleótidos así como oligodesoxirribonucleótidos. El término también debe incluir polinucleósidos (es decir, un polinucleótido menos el fosfato) y cualquier otro polímero que contiene una base orgánica. Las moléculas de ácido nucleico pueden obtenerse de fuentes de ácido nucleico existentes (por ejemplo genómico o ADNc), pero son preferiblemente sintéticas (por ejemplo, producidas por la síntesis oligonucleótido).
ODN CpG Se han descrito tres clases mayores de ODN CpG que son estructural y fenotípicamente distintas. Ejemplos de cada clase se muestran en Krieg (Frieg, 2006, Nature Review Drug Discovery, 5, 471-484) junto con los efectos inmunes y características estructurales que son específicas para la clase. El ODN CpG clase A (también denominado como tipo D) son potentes inductores de secreción de interferón- (IFNa) (de células dendríticas de plasmacitoide) , pero únicamente estimulan débilmente células B. Las estructuras de ODN clase A incluyen motivos de poli-G (tres o más guaninas consecutivas) en los extremos 5' y/o 3' que son capaces de formar estructuras muy estables pero de orden más alto complejas conocidas como G-tetrad, y una región de fosfodiéster central que contiene uno o más motivos CpG en un palíndromo auto-complementario. Estos motivos hacen que ODN clase A se auto-ensamble en nanopartículas. ODN clase B (también denominado como tipo K) tiene una estructura de base fosforotioato, no forman típicamente estructuras de orden superior, y son estimuladores de célula B fuertes pero inductores débiles de secreción de IFNa. Sin embargo, si ODN CpG clase B se fuerzan específicamente en estructuras ordenadas más altas en perlas o micropartículas, en dendrímeros o con transfección de lípido catiónico, ejercen el mismo perfil inmune que ODN CpG clase A, enlazando consecuentemente la formación de estructuras de orden superior a actividad biológica. El ODN CpG clase C tiene propiedades inmunes intermedias entre las las clases A y B, induciendo tanto activación de célula B como secreción de IFNa. Estas propiedades parecen resultar de la estructura única de este ODN, con uno o más motivos CpG 5' y un palíndromo 3 ' que se piensa que p ermite la formación doble dentro del ambiente endosómico (Krieg, 2006. Nature Review Drug Discovery, 5, 471-484; Takeshita F. y otros, 2004. Semin Immunol. 16( 1 ): 17-22; Verthelyi D, Zuener RA., 2003. Trends Immunol. 24:519-522).
ODN CpG son oligonucleótidos sintéticos que contienen dinucleótidos CpG no metilados en contextos de secuencias particulares (motivos CpG). Los motivos CpG están presentes en una frecuencia 20 veces mayor en ADN bacteriano comparado con ADN de mamífero. Inducen un grupo coordinado de respuestas inmunes basadas en la activación de células inmunes principalmente involucradas en el reconocimiento de estas moléculas. Se han identificado dos tipos de ODN CpG basados en su actividad distinta en células dendríticas plasmacitoides (PDC), sensores clave de los motivos CpG (Krug A. et al., 2001. Eur J Immunol, 31(7); 2154-63). CpG-A es un potente inductor de IFN-a en células dendríticas plasmacitoides (PDC), mientras que CpG-B es un inductor débil de IFN-a pero un potente activador de células B. Aunque los motivos de CpG difieren entre ratones y seres humanos, en ambas especies el reconocimiento de ODN CpG es mediado principalmente por TLR9 (Bauer S. y otros, 2001. Proc Nati Acad Sci E.U.A., 98( 16) : 9237-42) .
Un nuevo tipo de ODN CpG ha sido identificado recientemente, denominado CpG-C, tanto con alta inducción de PDC como activación de células B (Hartmann G. y otros, 2003. Eur J Immunol. 33(6): 1633-41). La secuencia de CpG-C combina elementos tanto CpG-A como CpG-B. La secuencia más potente es llamada M362, que contiene una secuencia palíndromo central con dinucleótidos CG, un aspecto característico de CpG-A, y un "motivo TCGTCG" en el extremo 5', presente en CpG-B.
Formulaciones En ciertas modalidades, las formulaciones de composición antitumoral contienen una cantidad efectiva de las células madre GBM6-AD de glioblastoma purificadas (el "ingrediente activo") en un vehículo, la cantidad efectiva se determina radialmente por un experto en la técnica. El ingrediente activo puede variar típicamente de aproximadamente 1% a aproximadamente 95% (p/p) de la composición, o incluso superior o inferior si es apropiado. La cantidad que se va a administrar depende de factores tales como la edad, peso y condición física del animal o el sujeto humano considerado para vacunación. La cantidad también depende de la capacidad del sistema inmune del animal para sintetizar anticuerpos, y el grado de protección deseado. Las dosis efectivas pueden establecerse fácilmente por un experto en la técnica a través de pruebas de rutina que establecen curvas de respuesta de dosis. El sujeto es inmunizado mediante la administración del péptido de biopelícula o fragmento del mismo en una o más dosis. Pueden administrarse múltiples dosis según se requiera.
En ciertas modalidades, las formulaciones intranasales incluyen vehículos que no causan irritación a la mucosa nasal ni interrumpen significativamente la función ciliar. Los diluyentes tales como agua, solución salina acuosa u otras substancias conocidas pueden emplearse con la invención en cuestión. En ciertas modalidades, las formulaciones nasales también contienen conservadores tales como pero no limitados a clorobutanol y cloruro de benzalconio. En ciertas modalidades, un agente tensoactivo está presente para mejorar la absorción en las proteínas en cuestión por la mucosa nasal.
En ciertas modalidades, las preparaciones líquidas orales están en la forma de, por ejemplo, suspensión, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires acuosos o aceitosos, o se presentan secos en forma de tableta o un producto para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de uso. En ciertas modalidades, tales preparaciones líquidas contienen aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsificantes, vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles) o conservador.
En ciertas modalidades, para preparar una composición antitumoral, el GBM6-AD purificado, se aisla, liofiliza y/o estabiliza, lisado como se describió anteriormente. La cantidad de células GBM6-AD entonces se ajusta a una concentración apropiada, opcionalmente combinadas con un adyuvante adecuado, y se empaca para uso. Los adyuvantes adecuados incluyen pero no están limitados a Imiquimod; agentes tensoactivos, por ejemplo, hexadecilamina, octadecilamina, lisolecítina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, N,N-dioctadecil-N'-N-bis(2-hidroxietil-propan-di-amina), metoxihexadecil-glicerol, y polioles plurónicos; polaniones, por ejemplo, pirano, sulfato de dextrana, poli IC, ácido poliacrílico, carbopol; péptidos, por ejemplo, dipéptido de muramilo, ametilglicina, tuftsina, emulsiones de aceite, alum, y mezclas de los mismos. Otros adyuvantes potenciales incluyen las subunidades de péptido B de toxinas lábiles al calor de E. coli o la toxina de cólera. McGhee, J.R., y otros, "On vaccine development", Sem. Hematol., 30:3-15 (1993). Finalmente, el producto inmunogénico puede incorporarse en liposomas para usarse en una formulación, o puede conjugarse a proteínas tales como hemocianina de ojo de cerradura (KLH) o albúmina de suero humano (HSA) u otros polímeros.
En ciertas modalidades, la composición además contiene uno o más de los ligandos TLR conocidos. Específicamente, en ciertas modalidades, la composición contiene Anexina A2 (una proteína) o fragmentos de Anexina"A2 como un ligando TLR2 novedoso que es un gran auxiliar. En ciertas modalidades, los ligandos TLR se conjugan a proteínas en el GB -AD a través de enlaces covalentes. En ciertas modalidades, el ligando TLR se conjuga a una proteína GBM6-AD por medio de un enlazador químico de malemida.
Modos de Administración Las composiciones antitumorales, vacunas derivadas de GBM6-AD, células T reactivas de GBM6-AD y anticuerpos anti-GBM6-AD de la invención pueden formularse como composiciones farmacéuticas y administrarse a un huésped mamífero, tal como un paciente humano, en una variedad de formas adaptadas a la ruta de administración elegida, es decir, oral, intranasal, intradérmica o parenteralmente, mediante rutas intravenosas, intramusculares, tópicas o subcutáneas.
De esa forma, los compuestos de la presente pueden administrarse sistémicamente, por ejemplo, oralmente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina de cubierta dura o suave, pueden comprimirse en tabletas, o pueden incorporarse directamente con la comida de la dieta del paciente. Para administración terapéutica oral, el compuesto activo puede combinarse con uno o más excipientes y utilizarse en la forma de tabletas ¡ngeribles, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos 0.1% del compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones por supuesto, pueden variar y puede estar convenientemente de entre aproximadamente 2 a aproximadamente 60% del peso de una forma de dosis de dosis unitaria dada. La cantidad del compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá un nivel de dosis efectivo.
Las tabletas, pastillas, pildoras, cápsulas, y similares también pueden contener lo siguiente: aglutinantes tales como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente desintegrador tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; pueden agregarse un lubricante tal como estearato de magnesio, un agente edulcorante tal como sacarosa, fructosa, lactosa o aspartamo o un agente saborizante tal como menta, aceite de gaulteria, o saborizante de cereza. Cuando la forma de dosis unitaria es una cápsula, ésta puede contener, además de materiales del tipo anterior, un portador líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilen glicol. Varios otros materiales pueden estar presentes como revestimientos o de otra forma modificar la forma física de la forma de dosis unitaria sólida. Por ejemplo, las tabletas, pildoras, o cápsulas pueden revestirse con gelatina, cera, laca o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa o fructosa como un agente edulcorante, metil y propilaparabenes como conservadores, un colorante y saborizante tal como sabor cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado para preparar cualquier forma de dosis unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y substancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo puede incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida.
El compuesto activo también puede administrarse intravenosa o íntraperitonealmente por infusión o inyección. Pueden prepararse soluciones del compuesto activo o sus sales en agua, mezclarse opcionalmente con un agente tensoactivo no tóxico. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilen glicoles líquidos, triacetina, y mezclas de los mismos en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Las formas de dosis farmacéuticas adecuadas para inyección o infusión pueden incluir soluciones o dispersiones acuosas estériles o polvos estériles que comprenden el ingrediente activo que se adaptan para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables o infunibles estériles, opcionalmente encapsuladas en liposomas. En todos los casos, la forma de dosis final debe ser estéril, fluida y estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. El portador o vehículo líquido puede ser un solvente o medio de dispersión líquido que comprende, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo glicerol, propilen glicol, polietilen glicol líquidos, y similares), aceites vegetales, ésteres de g I i ce r i I o no tóxicos, y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, a través de la formación de liposomas, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones o por el uso de agentes tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede obtenerse mediante varios agentes antimicrobianos y antif úngicos, por ejemplo, parabenes, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, reguladores de pH o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede obtenerse a través del uso en las composiciones de a gentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Se preparan soluciones inyectables estériles al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiere, seguido por esterilización de filtro. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y las técnicas de secado por congelación, que generan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional presente en las soluciones filtradas previamente estériles.
Para administración tópica, los compuestos de la presente pueden aplicarse en forma pura, es decir, cuando son líquidos. Sin embargo, generalmente será deseable adminístralos a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un portador dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un líquido.
Los portadores sólidos útiles incluyen sólidos finamente divididos tales como talco, arcilla, celulosa microcristalina, sílice, alúmina y similares. Los portadores líquidos útiles incluyen agua, alcoholes o glicoles o mezclas de alcohol de agua/glicol, en donde los compuestos de la presente pueden disolverse o dispersarse a niveles efectivos, opcionalmente con la ayuda de agentes tensoactivos no tóxicos. Pueden agregarse adyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos a dicionales para optimizar las propiedades para un uso dado. Las composiciones líquidas resultantes pueden aplicarse de almohadillas absorbentes, utilizadas para impregnar vendajes u otros apositos, o rociarse dentro del área afectada utilizando rociadores de tipo bomba o rociadores de aerosol .
También pueden emplearse espesantes tales como polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales y ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados con portadores líquidos para formar pastas, geles, ungüentos, jabones dispersables, y similares, para aplicación directamente a la piel del usuario.
Ejemplos de composiciones dermatológicas útiles que pueden utilizarse para suministrar los compuestos de la presente invención a la piel son conocidos para la técnica; por ejemplo ver Jacquet y otros. (Patente de E.U.A. No. 4,608,392), Geria (Patente de E.U.A. 4,992,478), Smith y otros (Patente de E.U.A. 4,559,157) y Wortzman (Patente de E.U.A. 4,820,508).
Dosis útiles de los compuestos de la presente invención pueden determinarse al comparar su actividad in vitro, y actividad in vivo en modelos de animal. Los métodos para la extrapolación de dosis efectivas en ratones, y otros animales, a seres humanos se conocen en la técnica; por ejemplo, ver Patente de E.U.A. No. 4,938,949.
Generalmente, la concentración del compuesto(s) de la presente invención en una composición líquida, tal como una loción, será de aproximadamente 0.1-25% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0.5-10% en peso. La concentración en una composición semi-sólida o sólida tal como un gel o un polvo será aproximadamente 0.1-5% en peso, preferiblemente aproximadamente 0.5-2.5% en peso.
La cantidad del compuesto, o una sal o derivado activo del mismo, requerida para usarse en el tratamiento variará no únicamente con la sal particular seleccionada sino que también con la ruta de administración, la naturaleza de la condición que se trata y la edad y condición del paciente y finalmente será a discreción del médico o personal clínico que atiende.
En general, sin embargo, una dosis adecuada estará en el rango de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 75 mg/kg del peso corporal por día, tal como de 3 a aproximadamente 50 mg por kilogramo del peso corporal del receptor por día, preferiblemente en el rango de 6 a 90 mg/kg/día, muy preferiblemente en el rango de 15 a 60 mg/kg/día.
El compuesto se administra convenientemente en forma de dosis unitaria; por ejemplo, conteniendo de 5 a 1000 mg, convenientemente de 10 a 750 mg, muy c onvenientemente, de 50 a 500 mg de ingrediente activo por forma de dosis unitaria.
Idealmente, el ingrediente activo debe administrarse para lograr concentraciones pico en plasma del compuesto activo de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 75 µ?, preferiblemente de 1 a 50 µ , muy preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 µ?. Esto puede lograrse, por ejemplo, a través de la inyección intravenosa de una solución de 0.05% a 5% del ingrediente activo, opcionalmente en solución salina, o administrarse oralmente como un bolo que contiene aproximadamente 1-100 mg del ingrediente activo. Los niveles deseables en sangre pueden mantenerse a través de infusión continua para proporcionar aproximadamente 0.01-5.0 mg/kg/hr o por infusión intermitente que contiene aproximadamente 0.4-15 mg/kg del ingrediente(s) activo.
La dosis deseada puede presentarse convenientemente en una dosis individual o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más sub-dosis por día. La misma sub-dosis además puede dividirse, por ejemplo en un número de administraciones ligeramente espaciadas distintas; tal como múltiples inhalaciones de un insuflador o por aplicación de una pluralidad de gotas en el ojo.
Método de Tratamiento Los pacientes pueden ser tratados en una variedad de formas, incluyendo las siguientes: Vacuna #1: Administración de células GBM6-AD apoptóticas (inducidas por irradiación y golpe de calor, para que las células estén vivas incluso muriendo y todas destinadas a la muerte) por suministro a un sujeto con un adyuvante apropiado.
Vacuna #2: Vacunación de lisados de célula GBM6-AD (inducidos por congelación-descongelación o nebulización) por suministro a un sujeto con un adyuvante apropiado.
Vacuna #3: Administración de células Dendríticas pulsadas con células GBM6-AD apoptóticas (inducidas por irradiación y golpe de calor, para que las células estén vivas incluso muriendo y todas destinadas a morir) por suministro a un sujeto con un adyuvante apropiado.
Vacuna #4: Administración de células dendríticas pulsadas con lisados de célula GBM6-AD (inducidos por congelación-descongelación o nebulización) por suministro a un sujeto con un adyuvante apropiado.
Vacuna #5: Administración de células dendríticas fusionadas a GBM6-AD con adyuvante apropiado (vacuna de fusión de célula).
Vacuna #6: Administración de células B fusionadas a GBM6-AD con adyuvante apropiado (vacuna de fusión de célula).
Vacuna #7: Administración de péptidos eluídos de ácido derivados de la superficie de GBM6-AD con adyuvante apropiado.
Vacuna #8: Cualquier combinación de uno o más de los anteriores.
En ciertas modalidades, la vacuna se inyecta intradérmicamente o subcutánea o intralinfonodalmente utilizando dosis y adyuvantes como antes para múltiples ciclos.
En ciertas modalidades, el paciente es tratado por medio de terapia de célula a doptiva. En ciertas modalidades, a los pacientes se les administran células T cebadas por células dendríticas pulsadas de lisado GBM6-AD.
En ciertas modalidades, el paciente es tratado por la administración de anticuerpos específicos para antígenos GBM6-AD.
Anticuerpos GBM6-AD y células T reactivas a GB 6-AD, y Métodos para hacer Anticuerpos Anti-G BM6-AD y células T reactivas a GBM6-AD En ciertas modalidades, las células T reactivas a GBM6-AD se generan en cultivo al cebar con células dendríticas pulsadas GBM6-AD autólogas y expansión utilizando métodos de cultivo de tejido estándares y se a dministran a un paciente. En resumen, en ciertas modalidades, se utiliza GBM6-AD directamente como una vacuna, o se utiliza indirectamente para generar anticuerpos o células T que se utilizan subsecuentemente como la terapia directa.
En ciertas modalidades, se clonan hibridomas que producen anticuerpos monoclonales contra GBM6-AD. Como se utiliza aquí, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de un grupo de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, un grupo de anticuerpos en donde los anticuerpos que constituyen el grupo son homogéneos excepto para mutantes de existencia natural que existen en una pequeñá cantidad. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos e interactúan con un sitio antigénico individual. Además, cada anticuerpo monoclonal apunta a un antigénico individual (epítopo) en un antígeno, cuando se compara con preparaciones de anticuerpo policlonal comunes que típicamente contienen varios anticuerpos contra diversos determinantes antigénicos. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que se producen de cultivos de hibridoma no contaminados con otras inmunoglobulinas.
El adjetivo "monoclonal" indica una característica de anticuerpos obtenidos de un grupo substancialmente homogéneo de anticuerpos, y no especifica anticuerpos producidos por un método particular. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que se va a utilizar en la presente invención puede producirse, por ejemplo, mediante m étodos de hibridoma (Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975) o métodos de recombinación (Patente de E.U.A. No. 4,816,567). Los anticuerpos monoclonales utilizados en la presente invención también pueden aislarse de una biblioteca de anticuerpo de fago (Clarkson y otros, Nature 352:624-628, 1991; Marks y otros, J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991). Los anticuerpos monoclonales de la presente invención particularmente comprenden anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas), en donde una parte de una cadena pesada (H) y/o cadena ligera (L) se deriva de una especie específica o una clase o subclase de anticuerpo específico, y la porción restante de la cadena se deriva de otras especies, u otra clase o subclase de anticuerpo. Además, los anticuerpos mutantes y fragmentos de anticuerpo de los mismos también están comprendidos en la presente invención (Patente de E.U.A. No. 4,816,567; Morrison y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 81:6851-6855, 1984).
Como se utiliza aquí, el término "anticuerpo mutante" se refiere a un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácido variante en donde uno o más residuos de aminoácido han sido alterados. Por ejemplo, la región variable de un anticuerpo puede modificarse para mejorar sus propiedades biológicas, tales como unión de antígeno. Tales modificaciones pueden lograrse mediante mutagénesis dirigida a sitio (ver Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 82: 488 (1985)), mutagénesis basada en PCR, mutagénesis de cartucho, y similares. Tales mutantes comprenden una secuencia de aminoácido que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de una región variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo, más preferiblemente al menos 75%, incluso más preferiblemente al menos 80%, incluso más preferiblemente al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, y muy preferiblemente al menos 95% idéntica. Como se utiliza aquí, el término "identidad de secuencia" se define como el porcentaje de residuos idénticos a aquellos en la secuencia de aminoácido original del anticuerpo, determinada después que las secuencias son alineadas y se introducen apropiadamente espacios para maximizar la identidad de secuencia según sea necesario.
Específicamente, la identidad de una secuencia de nucleótido o secuencia de aminoácido a otra puede determinarse utilizando el algoritmo BLAST, por Karlin y AltschuI (Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 90: 5873-5877, 1993). Se desarrollaron programas tales como BLASTN y BLASTNX con base en este algoritmo (AltschuI y otros, J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Para analizar secuencias de nucleótido de acuerdo con BLASTN basado en BLAST, se establecieron parámetros, por ejemplo, una ca lif icació n = 100 y longitud de palabra = 12. Por otro lado, los parámetros utilizados para el análisis de secuencias de aminoácido por BLASTX basado en BLAST incluyen, por ejemplo, calificación = 50 y longitud de palabra = 3. Se utilizaron parámetros predeterminados para cada programa cuando se utilizan programas BLAST y BLAST separado. Técnicas especificas para tales análisis se conocen en la técnica (ver el sitio web del Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI), Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Pueden prepararse anticuerpos policlonales y monoclonales mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden prepararse mediante los métodos descritos a continuación.
GBM6-AD que se va a utilizar para la inmunización de animales incluye células GBM6-AD lisadas e irradiadas. Como el antígeno para la inmunización, las células GBM6-AD pueden . utilizarse sin modificación, o después de haber sido conjugadas con una molécula portadora. Cuando se utiliza una molécula portadora, por ejemplo, la célula GBM6-AD primero se acopla con la molécula portadora, y luego se agrega un adyuvante a ésta. Tales adyuvantes incluyen Alumbre, adyuvantes completos e incompletos de Freund y similares, cualquiera de los cuales puede combinarse.
Un antígeno preparado como se describió anteriormente se proporciona a un mamífero, tal como un ratón, rata, hámster, conejillo de indias, caballo, mono, conejo, cabra, y borrego. Esta inmunización puede ser realizada mediante cualquier método existente, incluyendo inyecciones intravenosas, inyecciones subcutáneas, e inyecciones intraperitoneales típicamente utilizadas. No existen restricciones en cuanto a los intervalos de inmunización. La inmunización puede llevarse a cabo en intervalos de varios días a varias semanas, preferiblemente cuatro a 21 días, Un ratón puede inmunizarse, por ejemplo, a una dosis individual de 10 a 100 pg (por ejemplo, 20 a 40 pg) de la proteína de antígeno, pero la dosis no está limitada a estos valores.
Antes de la primera inmunización, y tres a siete días después de la segunda y subsecuentes inmunizaciones, se recolecta sangre de los animales, y los sueros se analizan para titulación de anticuerpo. Para promover una respuesta inmune, un agente de agregación tal como alumbre se utiliza preferiblemente. En general, los anticuerpos de mamífero seleccionados tienen afinidad de unión de antígeno suficientemente alta. La afinidad de anticuerpo puede determinarse utilizando un ensayo de unión de saturación, un ensayo con inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), o un ensayo competitivo (por ejemplo, radioinmunoensayo).
Los anticuerpos policlonales pueden filtrarse por un análisis de entrelazamiento convencional, tal como el descrito en "Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, Harlow y David Lañe Edit. (1998))". Un método alternativo es, por ejemplo, trazado de epítopo (Champe y otros, J. Biol. Chem. 270:1388-1694 (1995)). Un método preferido para determinar titulaciones de polipéptido o anticuerpo comprende cuantificar la afinidad de unión de anticuerpo. En otras modalidades, también se utilizan métodos para valorar una o más propiedades biológicas de un anticuerpo además de o en lugar de los métodos para determinar l a afinidad de unión de anticuerpo. Tales métodos analíticos son particularmente útiles debido a que demuestran la efectividad terapéutica de anticuerpos. Cuando un anticuerpo exhibe una propiedad mejorada en tal análisis, su afinidad de unión es generalmente, pero no siempre, mejorada.
Los hibridomas que se utilizan para preparar anticuerpos monoclonales pueden obtenerse, por ejemplo, a través del método de Milstein y otros. (Kohler, G., y ilstein, C, Methods Enzymol. 1981, 73, 13-46). Las células de mieloma que pueden fusionarse con células que producen anticuerpos pueden ser líneas de célula derivadas de cualquiera de los varios animales, tales como ratones, ratas, y seres humanos, que están generalmente disponibles para aquellos expertos en la técnica. Las líneas celulares que se van a utilizar son resistente a fármaco, y no pueden sobrevivir en un medio selectivo (por ejemplo, medio HAT) en un estado no fusionado, pero pueden sobrevivir en un estado fusionado. Generalmente se utilizan líneas celulares resistentes a 8 -azaguanina, que son deficientes en hipoxantina-guanina-fosforibosil transferasa y no pueden crecer en un medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). Las células de mieloma incluyen una variedad de líneas de célula conocidas, por ejemplo, P3x63 Ag8.653 (J. Immunol. (1979) 123: 1548-1550), P3x63 Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler, G. y Milstein, C, Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. y otros, Cell (1976) 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M. y otros, Nature (1978) 276: 269-270), FO (de St. Groth, S.F. y otros, J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313-323), R210 (Galfre, G. y otros, Nature (1979) 277: 131-133), y P3U1 (J. Exp. Med. 1979, 150:580; Curr Top Microbiol. Immunol. 1978, 81:1 ). Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano de ratón pueden utilizarse para reproducir anticuerpos monoclonales humanos (Kozbar, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Prodction Techniques and Application, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)). Se recolectaron células que producen anticuerpos, por ejemplo, de animales sacrificados dos a tres días después de la inmunización final. Las células que producen anticuerpos incluyen células de bazo, células de nodo linfático, y glóbulos rojos periféricos. Las células de bazo generalmente son utilizadas. Específicamente, tejidos tales como nodos de bazo y de linfoma se extirpan o recolectan de los varios animales descritos anteriormente. Entonces, los tejidos se trituran y el material resultante se suspende e n un medio o regulador de pH, tal como PBS, DMEM, o RPMI1640, seguido por filtración con una malla inoxidable, o similares. Esto entonces se centrifuga para obtener células que producen el anticuerpo de interés.
Las células de mieloma descritas anteriormente y células que producen anticuerpos entonces se fusionan. La fusión celular se logra al contactar las células de mieloma con las células que producen anticuerpo en una relación de 1:1 a 1:20 en un medio para cultivo de célula animal, tal como MEM, DMEM, y RPM 1-1640, de 30 a 37°C durante uno a 15 minutos en presencia de un agente promotor de fusión. Para promover la fusión celular, las células que producen anticuerpo y las células de mieloma pueden fusionarse utilizando un dispositivo de fusión celular comercialmente disponible, que utiliza un agente promotor de fusión, tal como polietilen glicol (peso molecular de 1,000 a 6,000 (Da)) o alcohol polivinílico, o un virus para fusión, tal como virus Sendai.
Los hibridomas de interés se seleccionan de las células después de fusión celular. Los métodos de selección incluyen métodos que utilizan propagación selectiva de células en un medio selectivo. Específicamente, una suspensión celular se diluye con un medio apropiado, y entonces las células se colocan en placas sobre placas microtitulación. Una alícuota de medio de selección (por ejemplo, medio HAT) se agrega a cada cavidad, y entonces las células se cultivan mientras el medio de selección se intercambia apropiadamente. Las células que crecieron como un resultado pueden guardarse como hibridomas.
En otra modalidad, pueden aislarse anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de una biblioteca de fago de anticuerpo, producida al utilizar la técnica reportada por McCafferty y otros, (Nature 348:552- 554 (1990)). Clarckson y otros (Nature 352:624-628 (1991)) y Marks y otros (J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)) reportado en el aislamiento respectivo de anticuerpos de ratón y humano de bibliotecas de fago. Estos también son reportes que describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) basados en cambio de cadena (Mark y otros), Bio/Technology 10:779-783 (1992)), e infección combinatoria y recombinación in vivo, que son métodos para construir bibliotecas de fago a gran escala (Waterhouse y otros, Nucleic Acids Res. 21:2265-2266 (1993)). Estas tecnologías también pueden utilizarse para aislar anticuerpos monoclonales, en lugar de utilizar tecnología de hibridoma convencional para la producción de anticuerpo monoclonal.
Los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos que proporcionan terapia para glioblastoma.
Los métodos para preparar anticuerpos monoclonales de hibridomas obtenidos incluyen métodos de cultivo de célula estándares y métodos que comprenden I a producción de a scitis. En métodos de cultivo celular, se cultivan hibridomas durante dos a 14 días bajo condiciones de cultivo estándares (por ejemplo, a 37°C a 5% de atmósfera de C02), en un medio de cultivo de células animales, tal como RPMI-1640 o MEM conteniendo de 10 a 20% de suero de cabra fetal, o medio libre de suero, y entonces se prepararon anticuerpos del sobrenadante de cultivo. En el método que comprende producción de ascitis, se administraron hibridomas a las cavidades perifonéales de individuos mamíferos de las mismas especies como aquellas de las que se derivaron las células de mieloma, y los hibridomas proliferan en cantidades demasiado grandes. Entonces se recolectaron ascitis o sueros de una a cuatro semanas. Para mejorar producción de ascitis, por ejemplo, puede pre-administrarse pristano (2,6,10,14-tetrametilpentadecano) a la cavidad peritoneal.
Los anticuerpos que se van a utilizar en la presente invención pueden purificarse mediante un método apropiadamente seleccionado de métodos conocidos, tal como el método de proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxiapatita, método de desalación con sulfato, cromatografía de intercambio de ion, y cromatografía de afinidad, o a través del uso combinado de los mismos.
La presente invención puede utilizar anticuerpos recombinantes, producidos por ingeniería de gen. Los genes que codifican los anticuerpos obtenidos por un método descrito anteriormente son aislados de los hibridomas. Los genes se insertan en un vector apropiado, y luego s e introducen en un huésped (ver, por ejemplo, Cari, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick. Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado e n el Reino Unidos por Macmillan Publishers Ltd., 1990). La presente invención proporciona los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la presente invención, y vectores que comprenden estos ácidos nucleicos. Específicamente, al utilizar transcriptasa inversa, los ADNcs que codifican las regiones variables (regiones V) de los anticuerpos se sintetizan de los ARNm de hibridomas. Después de obtener los ADN que codifican las regiones variables de anticuerpos de interés, se ligan con ADN que codifican regiones constantes deseadas (regiones C) de los anticuerpos, y las construcciones de ADN resultantes se insertan en vectores de expresión. Alternativamente, los ADN que codifican las regiones variables de los cuerpos pueden insertarse dentro de vectores de expresión que comprenden los ADN de las regiones de anticuerpo C. Estos se insertan en vectores de expresión para que los genes se expresen b ajo la regulación de una región regulatoria de expresión, por ejemplo, un potenciador y promotor. Entonces, se transforman células de anfitrión con los vectores de expresión para expresar los anticuerpos. La presente invención proporciona células que expresan anticuerpos de la presente invención. Las células que expresan anticuerpos de la presente invención incluyen células e hibridomas transformados con un gen de tal anticuerpo.
En la presente invención, pueden utilizarse anticuerpos recombinantes artificialmente modificados para reducir antigenicidad heteróloga contra humanos. Ejemplos incluyen anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Estos anticuerpos modificados pueden producirse utilizando métodos conocidos. Un anticuerpo quimérico incluye un anticuerpo que comprende regiones variables y constantes de especies que son diferentes entre si, por ejemplo, un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo de un mamífero no humano tal como un ratón, y las regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo de un ser humano. Tal anticuerpo puede obtenerse al (1) ligar un ADN que codifica una región variable de un anticuerpo de ratón a un ADN que codifica una región constante de un anticuerpo humano; (2) incorporar esto dentro en un vector de expresión; y (3) introducir el vector en un anfitrión para la producción del anticuerpo.
Un anticuerpo humanizado, que también se denomina un anticuerpo humano reformado, se obtiene al s ustituir una región de determinación complementaria de cadena H o L (CDR) de un anticuerpo de un mamífero no humano tal como un ratón, con la CDR de un anticuerpo humano. Se conocen técnicas de recombinación genéticas convencionales para la preparación de tales anticuerpos (ver, por ejemplo, Jones y otros, Nature 321: 522-525 (1996); Reichman y otros, Nature 332: 323-329 (1988); Presta Curr. Op. Strct. Biol. 2: 593-596 (1992)). Específicamente, una secuencia de ADN designada para ligarse a CDR de un anticuerpo de ratón con las regiones de estructura (FR) de un anticuerpo humano se sintetiza mediante PCR, utilizando varios oligonucleótidos construidos para comprender porciones que se traslapan en sus extremos. Un anticuerpo humanizado puede obtenerse al (1) ligar el ADN resultante a un ADN que codifica una región constante de anticuerpo humano; (2) incorporar esto en un vector de expresión; y (3) transferir el vector en u n huésped para producir el anticuerpo (ver, Solicitud de Patente Europea No. EP 239,400, y Solicitud de Patente Internacional No. WO 96/02576). Se seleccionan FR de anticuerpo humano que están ligadas a través de la CDR en donde la CDR forma un sitio de unión de antígeno favorable. El anticuerpo humanizado puede comprender un residuo(s) de aminoácidos adicional que no está incluido en las CDR introducidas en el anticuerpo receptor, ni en las secuencias de estructura. Tales residuos de aminoácidos usualmente se introducen para optimizar de forma más precisa la capacidad del anticuerpo para reconocer y unirse a un antígeno. Por ejemplo, según sea necesario, los aminoácidos en la región de estructura de una región variable de anticuerpo pueden sustituirse para que la CDR de un anticuerpo de humano reformado forme un sitio de unión de antígeno apropiado (Sato, K. y otros, Cáncer Res. (1993) 53, 851-856).
También se conocen métodos para obtener anticuerpos humanos. Por ejemplo, los anticuerpos humanos deseados con actividad de unión de antígeno se pueden obtener al (1) sensibilizar linfocitos humanos con antígenos de interés o células que expresan antígenos de interés in vitro; y (2) fusionar los linfocitos sintetizados con células de mieloma humano tales como U266 (ver Solicitud de Patente Japonesa Publicada Examinada No. (JP-B) Heí 1-59878). Alternativamente, el anticuerpo humano deseado también puede obtenerse al utilizar un antígeno para inmunizar un animal transgénico (Tg) que comprende un repertorio parcial o completo de genes de anticuerpo humano (ver Nature Genetics 7:13-21 (1994); Nature Genetics 15:146-156 (1997); Nature 368:856-859 (1994); Solicitud de Patente Internacional WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, y WO 96/33735).
Específicamente, tales animales Tg se crearon como a continuación: un mamífero no humano en el cual se han interrumpido lugares de cadenas pesadas y ligeras de una inmunoglobulina endógena, y más bien, los lugares de cadenas pesadas y ligeras de una inmunoglobulina humana han sido introducidos a través de vectores de cromosoma artificial de levadura (TAC) y similares, se obtienen para crear animales knockout (animales modificados por ingeniería genética) o animales Tg, o cruzando tales animales. Los lugares de cadena pesada de inmunoglobulina pueden desactivarse funcionalmente, por ejemplo, al i ntroducir un defecto en cierto sitio en una región J o región C (por ejemplo, región ?µ). Las cadenas ligeras de inmunoglobulina (por ejemplo, cadena k) pueden desactivarse funcionalmente, por ejemplo, al ¡ntroducir un defecto en cierto sitio en una región J o región C, o una región que comprende las regiones J y C.
Dicho anticuerpo humanizado también puede obtenerse de un sobrenadante de cultivo, al utilizar tecnología de ingeniería genética para transformar células eucarióticas con ADNcs que codifican cada una de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, o preferiblemente vectores que comprenden estos ADNcs, y entonces cultivar las células transformadas que producen el anticuerpo monoclonal humano recombinante. Los huéspedes son, por ejemplo, células eucarióticas deseadas, preferiblemente células mamíferas, tales como células CHO, línfocitos, y mielomas.
Además, se conocen técnicas para obtener anticuerpos humanos con una biblioteca de anticuerpo humana. Por ejemplo, la región variable de un anticuerpo humano se expresa como un anticuerpo de cadena individual (scFv) sobre la superficie de un fago, utilizando el método de presentación de fago, y los fagos que se unen al anticuerpo pueden seleccionarse. Al analizar los genes de fagos seleccionados, las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de anticuerpos humanos que se unen al antígeno pueden determinarse. Si las secuencias de ADN de scFv que se unen al antígeno se identifican, pueden construirse vectores de expresión apropiados que comprenden estas secuencias, y entonces introducirse en los huéspedes apropiados y expresarse para obtener anticuerpos humanos. Tales métodos ya son bien conocidos (ver WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, y WO 95/15388).
Cuando los genes de anticuerpo han sido aislados e introducidos en un huésped apropiado, los huéspedes y vectores de expresión pueden utilizarse en combinación apropiada para producir los anticuerpos. Como células huésped eucarióticas, pueden utilizarse células de animal, células de planta, y células fúngicas. Las células de animal incluyen: (1) células de mamífero tales como células CHO, COS, mieloma, riñon de hámster bebé (BHK), HeLa, y Vero; (2) células de anfibio tales como oocitos de Xenopus; o (3) células de insecto tales como sf9, sf21, y Tn5, o gusanos de seda. Las células de planta conocidas incluyen células derivadas del género de Nicotiana tal como Nicotiana tabacum, que pueden ser callos cultivados. Las células fúngicas conocidas incluyen levaduras tales como el género Saccharomyces, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, y hongos filamentosos tales como el género Aspergillus, por ejemplo Aspergillus niger. Las células procarióticas también pueden utilizarse en sistemas de producción que utilizan células bacterianas. Células bacterianas conocidas incluyen E. coli y Bacillus subtilis. Los anticuerpos pueden obtenerse al t ransferir los genes de anticuerpo de interés en estas células utilizando transformación, y luego cultivando las células transformadas in vitro.
Los isotipos de los anticuerpos de la presente invención no están limitados. Los isotipos incluyen, por ejemplo, IgG ( I gG 1 , lgG2, lgG3, e lgG4), IgM, I g A ( I g A 1 e I g A2) , IgD, e IgE. Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser fragmentos de anticuerpo que comprenden una porción responsable de unión de antígeno, o un fragmento modificado del mismo. El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo de longitud completa, y generalmente a un fragmento que comprende un dominio de unión de antígeno o una región variable. Tales fragmentos de anticuerpo incluyen, por ejemplo, Fab, F(ab')2, Fv, Fv de cadena individual (scFv) que comprende una Fv de cadena pesada y un Fv de cadena ligera acoplados juntos con un enlazador apropiado, diacuerpo (diacuerpos), anticuerpos lineales, y anticuerpos multiespecíficos preparados de fragmentos de anticuerpo. Previamente, los fragmentos de anticuerpo se produjeron al digerir anticuerpos naturales con una proteasa; actualmente, también son conocidos métodos para expresarlos como anticuerpos recombinantes utilizando técnicas de ingeniería genética (ver Morimoto y otros, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); Brennan y otros, Science 229:81 (1985); Co, M.S. y otros, J. Immunol., 1994, 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A.H., Methods in Enzymology, 1989, 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology, 1989, 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymology, 1989, 121, 663-669; Bird, R.E. y otros, TIBTECH, 1991, 9, 132-137).
Un fragmento "Fv" es el fragmento de anticuerpo más pequeño, y contiene un sitio de reconocimiento de antígeno completo y un sitio de unión. Esta región es un dímero (dímero VH-VL) en donde cada una de las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera están conectadas fuertemente por un enlace no covalente. Las tres CDR de cada una de las regiones variables interactúan con la otra para formar un sitio de unión de antígeno sobre la superficie del dímero de VH-VL. En otras palabras, un total de seis CDR de las cadenas pesadas y ligeras funcionan juntas como un sitio de unión de antígeno de anticuerpo. Sin embargo, una región variable (o Fv medio, que . contiene únicamente tres CDRS específicas de antígenos) solo también se sabe que es capaz de reconocer y unirse a un antígeno, aunque su afinidad es más baja que la afinidad del sitio de unión completo. De esa forma, un fragmento de anticuerpo preferido de la presente invención es un fragmento Fv, pero no está limitado a esto. Tal fragmento de anticuerpo puede ser un polipéptido que comprende un fragmento de anticuerpo de CDR de cadena pesada o ligera que se conservan, y que pueden reconocer y unirse a su antígeno.
Un fragmento Fab (también denominado como F(ab)) también contiene una región constante de cadena ligera y región constante de cadena pesada (CH1). Por ejemplo, la digestión de papaína de un anticuerpo produce los dos tipos de fragmentos: un fragmento de unión de antígeno, llamado un fragmento Fab, que contiene las regiones variables de una cadena pesada y cadena ligera, que sirven como un dominio de unión de antígeno individual; y la porción restante, que se llama un "Fe" debido a que se cristaliza fácilmente. Un fragmento Fab' es diferente de un fragmento Fab en cuanto a que un fragmento Fab' también tiene varios residuos derivados del termino carboxilo de una región de CH1 de cadena pesada, que contiene uno o más residuos de cisteína de la región de gozne de un anticuerpo. Un fragmento Fab', sin embargo, es estructuralmente equivalente a Fab en cuanto a que ambos fragmentos de unión de antígeno comprenden las regiones variables de una cadena pesada y cadena ligera, que sirven como un dominio de unión de antígeno individual. Aquí, un fragmento de unión de antígeno que comprende las regiones variables de una cadena pesada y cadena ligera que sirven como un dominio de unión de antígeno individual, y que es equivalente al obtenido por digestión de papaína, se denomina como un "anticuerpo de tipo Fab", incluso cuando no es idéntico a un fragmento de anticuerpo producido por digestión de proteasa. F ab'- SH es Fab' con uno o más residuos de cisteína que tienen grupos tiol libres en su región constante. Un fragmento F(ab') se produce al separar el enlace de disulfuro entre los residuos de cisteína en la región de gozne de F(ab')2. Otros fragmentos de anticuerpo entrelazados también se conocen por aquellos expertos en la técnica. La digestión de pepsina de un anticuerpo genera dos fragmentos; uno es un fragmento F(ab')2 que comprende dos dominios de unión de antígeno y puede reaccionar en forma cruzada con antígenos, y el otro es el fragmento restante (denominado como pFc'). Aquí, un fragmento de anticuerpo equivalente al obtenido por digestión de pepsina se denomina como un "anticuerpo de tipo F(ab')2" cuando comprende dos dominios de unión de antígeno y puede reaccionar de manera cruzada con antígenos. Tales fragmentos de anticuerpo también pueden producirse, por ejemplo, a través de ingeniería genética. Tales fragmentos de anticuerpo también pueden aislarse, por ejemplo, de la biblioteca de fago aquí descrita. Alternativamente, los fragmentos de F(ab')2-SH pueden recuperarse directamente de huéspedes, tales como E. coli, y entonces se dejan formar fragmentos F(ab')2 por entrelazamiento químico (Cárter y otros, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En un método alternativo. los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de un cultivo de huéspedes recombinantes.
El término "diacuerpo (Db)" se refiere a un fragmento de anticuerpo bivalente construido por fusión de gel (por ejemplo, P. Holliger y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 90: 6444-6448 (1993), EP 404,097, WO 93/11161). En general, un diacuerpo es un dímero de dos cadenas de polipéptido. En cada una de las cadenas de polipéptido, una región variable cadena ligera (VL), y una región variable de cadena pesada (VH) en una cadena idéntica se conectan a través de un enlazador corto, por ejemplo, un enlazador de aproximadamente cinco residuos, para que no puedan enlazarse. Debido que en el enlazador entre los dos es demasiado corto, la VL y VH en la misma cadena de polipéptido no pueden formar un fragmento de región V de cadena individual, sino más bien forma un dímero. De esa forma, un diacuerpo tiene dos dominios de unión de antígeno. En donde las regiones VL y VH contra los dos tipos de antígenos (a y b) se combinan para formar VLa-VHa y VLb-VHa a través de un enlazador de aproximadamente cinco residuos, y entonces se expresan conjuntamente, se segregan como Dbs biespecíficos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser tales Dbs.
Un anticuerpo de cadena individual (también denominado como "scFv") puede prepararse al enlazar una región V de cadena pesada y una región V de cadena ligera de un anticuerpo (para una revisión de scFv de Pluckthun "The Pharmacology of onoclonal Antibodies" Vol. 113, eds. Rosenburg y Moore, Springer Verlag, N.Y., pp. 269-315 (1994)). Los métodos para preparar anticuerpos de cadena individual son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 4,946,778; 5,260,203; 5,091,513; y 5,455,030). En tales scFv, la región V de cadena pesada y la región V de cadena ligera están enlazadas juntas a través de un enlazador, preferiblemente un enlazador de polipéptido (Houston, J.S. y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 198, 85, 5879-5883). La región V de cadena pesada y la región V de cadena ligera en un scFv pueden derivarse del mismo anticuerpo, o de anticuerpos diferentes. En enlazador de péptido utilizado para ligar las regiones V puede ser cualquier péptido de cadena individual que consista de 12 a 19 residuos. Un ADN que codifica un scFv puede amplificarse por PCR utilizando, como una plantilla, cualquier ADN completo, o un ADN parcial que codifica una secuencia de aminoácido deseada, seleccionada de un ADN que codifica la cadena pesada o la región V de la cadena pesada del anticuerpo anterior, y un ADN que codifica la cadena ligera o la región V de la cadena ligera del anticuerpo anterior; y utilizando un par de iniciador que define los dos extremos. Amplificaciones adicionales pueden conducirse subsecuentemente utilizando una combinación del ADN que codifica la porción de enlazador de péptido, y el par de iniciador que define ambos extremos del ADN para ligarse a la cadena pesada y ligera respectivamente. Después de construir ADN que codifica scFv, pueden utilizarse métodos convencionales para obtener vectores de expresión que comprenden estos ADN, y huéspedes transformados por estos vectores de expresión. Además, los scFv pueden obtenerse de acuerdo con métodos convencionales utilizando huéspedes resultantes. Estos fragmentos de anticuerpo pueden producirse en huéspedes al obtener genes que codifican los fragmentos de anticuerpo y que expresan estos como se definió anteriormente. Los anticuerpos unidos a varios tipos de moléculas, tales como polietilen glicoles (PEG) pueden utilizarse como anticuerpos modificados. Los métodos para modificar anticuerpos ya se establecieron en la técnica. El término "anticuerpo" en la presente invención también abarca los anticuerpos descritos anteriormente.
Los anticuerpos obtenidos pueden purificarse a homogeneidad. Los anticuerpos pueden aislarse y purificarse por un método comúnmente utilizado para aislar y purificar proteínas. Los anticuerpos pueden aislarse y purificarse mediante el uso combinado de una o más métodos apropiadamente seleccionados de cromatografía de columna, filtración, ultrafiltración, desalación, diálisis, electroforesis de gel de poliacrilamida preparativa, e ¡soelectro-enfoque, por ejemplo (Estrategias para purificación de proteína y caracterización: un manual de curso de laboratorio, Daniel R. Marshak y otros, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow-y David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Tales métodos no están limitados a aquellos listados anteriormente. Los métodos cromatográficos incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de ion, cromatografía hidrófoba, filtración de gel, cromatografía de fase inversa, y cromatografía de absorción. Estos métodos cromatográficos pueden practicarse utilizando cromatografía de fase líquida, tal como HPLC y FPLC. Las columnas que se van a utilizar en la cromatografía de afinidad incluyen columnas de proteina A y columnas de proteína G. Por ejemplo, las columnas de proteína A incluyen H yper D, POROS, y Sefarosa F.F. (Pharmacia). Los anticuerpos también pueden purificarse al utilizar unión de antígeno, utilizando portadores en los cuales se han inmovilizado los antígenos.
Los anticuerpos de la presente invención pueden formularse de acuerdo con métodos estándares (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, última edición, Mark Publishing Company, Easton, E.U.A.), y pueden comprender portadores y/o aditivos farmacéuticamente aceptables. La presente invención se refiere a composiciones (que incluyen reactivos y farmacéuticos) que comprenden los anticuerpos de la invención, y portadores y/o aditivos farmacéuticamente aceptables. Los portadores ilustrativos incluyen agentes tensoactivos (por ejemplo, PEG y Tween), excipientes, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico), agentes colorantes, agentes saborizantes, conservadores, estabilizadores, agentes reguladores de pH (por ejemplo, ácido fosfórico, ácido cítrico, y otros ácidos orgánicos), agentes quelatadores (por ejemplo, EDTA), agentes de suspensión, agentes de isotonización, aglutinantes, desintegradores, lubricantes, promotores de fluidez, y correctores. Sin embargo, los portadores que pueden emplearse en la presente invención no están limitados a esta lista. De hecho, otros portadores comúnmente utilizados pueden emplearse apropiadamente: ácido silícico anhídrido ligero, lactosa, celulosa cristalina, manitol, almidón, calcio de carmelosa, sodio de carmelosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilacetaldietilaminoacetato, polivinilpir rol ¡dona, gelatina, triglicérido de ácido graso de cadena media, aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno 60, sacarosa, carboximetilcelulosa, almidón de maíz, sal inorgánica, y así sucesivamente. La composición también puede comprender otros poiipéptidos de peso molecular bajo, proteínas tales como albúmina de suero, gelatina, e ¡nmunoglobulina, y aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina, y lisina. Cuando la composición se prepara como una solución acuosa para inyección, puede comprender una solución isotónica que comprende, por ejemplo, solución salina fisiológica, dextrosa, y otros adyuvantes, que incluyen, por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol, y cloruro de sodio, que también puede contener un agente de solubilización apropiado, por ejemplo, alcohol (por ejemplo, etanol), polialcohol (por ejemplo, propilen glicol y PEG), y detergente no iónico (polisorbato 80 y HCO-50).
Si es necesario, los anticuerpos de la presente invención pueden encapsularse en microcápsulas (microcápsulas hechas de hidroxicelulosa, gelatina, polimetilmetacrilato, y similares) y hacerse en componentes de sistemas se suministro de fármaco coloidal (liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, y nanocápsulas) (por ejemplo, ver "Remington's Pharmaceutical Science, 16° edición", Oslo Ed. (1980)). Además, se conocen métodos para hacer fármacos de liberación, sostenida, y éstos pueden fabricarse para los anticuerpos de la presente invención (Langer y otros, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982); Patente de E.U.A. No. 3,773,919; Solicitud de Patente EP No. 58,481; Sidman y otros, Biopolymers 22: 547-556 (1983); EP: 133,988).
Los anticuerpos de la presente invención descritos anteriormente pueden utilizarse en un tratamiento de un individuo que tiene glioblastoma.
El siguiente ejemplo está hecho para ilustrar pero no limitar la invención.
EJEMPLO 1 Los inventores de la presente han desarrollado una terapia novedosa que utiliza inmunoterapia con Imiquimod y vacuna de célula de iniciación de tumor cerebral (BTIC) para el tratamiento de Glioma Pontino intrínseco Difuso (DIPG), un tumor cerebral mortal que ocurre principalmente durante la niñez y los años adultos jóvenes. La histología de la gran mayoría de DIPG es glioblastoma multiforme (GBM), WHO grado IV (Tsuchida T, Shimbo Y, Fukuda M, y otros Computed tomographic and histolpathological studies of potine gliome. Child's New Syst. 1985; 1:223-229). La experiencia pasada ha mostrado que DIPG responde a terapia de radiación, pero únicamente de forma transitoria. La mayoría de los niños que sufren este tumor mueren dentro de 2 años del diagnóstico. Los intentos para mejorar significativamente los resultados con quimioterapia adyuvante y/o agentes radio-sensibilizados concurrentes han fallado hasta la fecha (Frazier JL, Lee J, Ulrich WT, y otros Treatment of diffuse brainstem gliomas: failed approaches and future strategies. J Neurosurg Pediatrics. 2009;3:259-269). Basado en estadísticas del Registro de Tumor Cerebral Central de los Estados Unidos (CBTRUS), la incidencia anual de tumores de tallo cerebral en el grupo de 0 a 19 años de edad se espera que sea superior a 450 en los años futuros. De estos, más de 360 serán niños y adultos jóvenes con DIPG maligno (Registro de tumor cerebral central de los Estados Unidos. Recuperado el 16 de julio, 2009, del sitio web de reportes y cuadros: http://cbtrus.org/reports/2009- PCR-04-05/CBTRUS-NPCR2004-2005-Report-.pdf. 2009). Pocas de estas personas jóvenes se espera que sobrevivan. Esta terapia resulta en supervivencia aumentada entre la gente joven que sufre esta enfermedad.
El descubrimiento que células dendríticas (DC) juegan un papel principal en la presentación de antígeno y evocan respuestas inmunes adaptables ha abierto la posibilidad de manipularlos para tratar GBM. Liau y otros publicaron el primer uso de vacunación DC pulsada de péptido de tumor para un paciente de glioma en el 2000; este estudio documentó células T reactivas de tumor a pesar del progreso de la enfermedad (Liau LM, y otros Treatment of a patient by vaccination with autologous dendritic cells pulsed with allogeneic major histocompatibility complex class l-matched tumor peptides. Case Report. Neurosurg Focus. 2000;9:e8). Desde entonces, la vacunación de pacientes con GBM con DC autólogo pulsado de lisado de tumor fue capaz de provocar células T CD8+ específicas de antígeno y aumentar la supervivencia media a 133 semanas comparado con 30 semanas en pacientes de control histórico que recibieron terapia estándar (Yu SJ y otros. Vaccination with tumor lysate-pulsed dendritic cells elicits antigen-specific, cytotoxic T-cells ¡n patients with malignant glioma. Cáncer Research. 2004;64:4973-4979). Yamanaka y otros reportaron resultados similares en una prueba clínica de fase l/ll después de inyección sub-dérmica de DC pulsados de lisado de tumor o vacunación intratumoral y sub-dérmica concurrente. Cuatro pacientes mostraron una respuesta clínica, diez mostraron estabilización de tumor, y diez tuvieron progreso de tumor (Yamanaka R, y otros. Clinical evaluation of dendritic cell vaccination for patients with recurrent glioma: results of a clinical phase l/ll trial. Clin Cáncer Res. 2005; 11:4160-4167). En un estudio de fase II reciente, la capacidad de CTL para elaborar IFN-? en respuesta a vacunaciones DC se correlacionó significativamente con la respuesta clínica y supervivencia general (Wheeler CJ, y otros. Vaccination elicits correlated immune and clinical responses in glioblastoma multiforme patients. Cáncer Research. 2008;68: 5955-5964). A pesar de estos resultados prometedores, la mayoría de los pacientes finalmente sucumben a esta enfermedad. La inmunoterapia será más exitosa si se designa específicamente a células de iniciación de tumor cerebral, resistentes a radiación.
Células de iniciación de tumor cerebral: marcadores e implicaciones para inmunoterapia La investigación durante los últimos 15 años sugiere que las poblaciones heterogéneas de células comprenden un tumor, y únicamente un subgrupo de ellas es capaz de auto-renovación, inicio de tumor, y diferenciación parcial (revisado en Beachy PA, Karhadkar SS, Berman DM. Tissue repair and stem cell renewal in carcinogenesis. Nature. 2004;432:324-331). La existencia de células que inician tumor se estableció firmemente en la década de los noventas en leucemia mielógena aguda (Lapidot T, y otros. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 1994:367:645-648; Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 1997;3:730-737) y muy recientemente en tumores cerebrales primarios tales como glioblastoma y meduloblastoma (Ignatova y otros. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 2002;39: 93-206; Singh SK, et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 2004;432:396-401 ; Singh SK, et al. Identification of a cáncer stem cell in human brain tumors. Cáncer Research. 2003;63:5821-5828; Galli R, et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cáncer Research. 2004;T>4:7011-7021 ; Li MC, et al. Isolation and characterization of brain tumor stem cells in human medulloblastoma.
Ai Zheng. 2006;25:241 -246) e s una glicoproteína de transmembrana 120 kDa expresada en células madre hematopoyéticas y neurales que se ha utilizado como un marcador para células que inician tumor cerebral (BTIC). Singh y otros demostraron q ue tan poco como 100 células de glioma CD133+ fueron capaces de formación de tumor en ratones inmunodeficientes, mientras que 100,000 células de tumor CD133' aisladas de la misma masa de tumor a granel se injertaron pero no formaron tumores. (Singh SK y otros. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 2004;432:396-401). Además, el porcentaje de células CD133+ en la masa de tumor aumentó en pacientes recurrentes, y la expresión de CD133 ahora se ha utilizado para predecir el progreso de enfermedad en gliomas de grado bajo (Zeppernick F, y otros. Stem Cell arker CD133 Affects Clinical Outcome in Glioma Patients. Clin Cáncer Res. 2008;14:123- 29). Sin embargo CD133 no es el único marcador para BTIC ya que las células CD133" de un subgrupo de gliomas son células que inician tumor (Beier D, y otros, CD133+ and CD 133- Glioblastoma-Derived Cáncer Stem Cells Show Differential Growth Characteristics and Molecular Profiles. Cáncer Research. 2007;67:4010-4015). Lee y otros han identificado células de +SOC-2+ de nestina aisladas de GBM humano que satisfacen criterios importantes para BTIC (inicio de tumor a un bajo número de célula) (Lee J y otros, Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cáncer Cell. 2006;9:391 -403). Estos de BTIC CD 15+ formaron tumores muy invasivos con la trasplantación en cerebro de ratón y su firma de expresión de gen se parece mucho a la del tumor primario (Lee J, y otros, Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cáncer Cell. 2006;9:391-403). Aunque CD133 y Sox-2 son marcadores útiles, no pueden predecir siempre por sí mismos el inicio de tumor. Sin embargo, las células que expresan CD133 en particular parecen sobrevivir preferencialmente a r adiación y quimioterapia, haciendo la focalización de ellas por inmunoterapia muy importante. El concepto clave que surge de esta investigación es que los tumores cerebrales están compuestos de células de tumor a granel con potencial tumorigénico limitado y BTIC. Los BTIC pueden representar una fracción total de células de tumor, pero son la fuente probable de renovación de tumor y progreso de enfermedad continua.
Razonamiento para utilizar radiación como un sensibilizador de vacuna. Bao y otros han mostrado que las células CD133 + exhiben resistencia mejorada a radiación ionizante con relación a sus células hijas CD133" por cinasas de punto de revisión de activación preferencial Chk1, Chk2 (BAO S, y otros. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 2006;444:756-760). Aunque las células CD133+ y CD133" exhibieron daño de ADN similar, las células CD133+ repararon el daño más rápidamente y se enriquecieron después de cada dosis de radiación relativa a células CD133' (Bao S, y otros, Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 2006;444:756-760). En un estudio elegante, Gasser y otros demostraron que la trayectoria de daño de ADN regula ligandos del sistema inmune innatos del receptor NKG2D (Gasser S, Orsulic, S., Brown, E.J. & Raulet, D.H. The DNA damage pathway regulates innate immune system ligands of the NKG2D receptor. Nature. 2005;436: 1186-1190). Determinaron que la base molecular para expresión de ligando NKG2D inducida por radiación fue la inducción de activación de Chk1/2. Además, la inhibición farmacológica de Chk1 inhibió la regulación ascendente de ligando NKG2D, que revela claramente que la radiación aumenta la inmunogenicidad celular a través de la trayectoria de cinasa de punto de revisión. Sin embargo, estos estudios se condujeron utilizando células normales y células de sarcoma (Gasser S, Orsulic, S., Brown, E.J. & Raulet, D.H. The DNA damage pathway regulates innate immune system ligands of the NKG2D receptor. Nature. 2005;436:1186-1190). Sin embargo, estos resultados se aplican a células de glioma, entonces la misma trayectoria utilizada por células CD133+ para sobrevivir a terapia a radiación (que señala a través de Chk1) se espera que las sensibilice preferencialmente a asesino natural o lisis mediada por célula T por regulación ascendente de ligandos NKG2D. Si es verdadero, esto representaría un "talón de Aquiles" para las células CD133 + , que se define como "una debilidad fatal a pesar de la resistencia general, llevando real o potencialmente a colapso". En ciertas modalidades, la presente invención utiliza la combinación de radiación con inmunoterapia dirigida a BTIC para tratar DIPG.
Activación de antígenos BTIC: condiciones de cultivo de células de glioma tienen implicaciones cruciales para inmunoterapia. Por décadas, la investigación hecha para entender la biología de glioma e investigar terapias potenciales ha confiado en el uso de líneas celulares de glioma cultivadas en suero. Por consiguiente, en pruebas clínicas recientes en donde se vacunaron pacientes con GBM con Usado de célula de tumor o DC pulsado de péptido, las células de tumor se cultivaron y expandieron en suero (Yu JS y otros. V accination with tumor lysate-pulsed dendritic cells elicits antigen-specific, cytotoxic T-cells in patients with malignant glioma. Cáncer Research. 2004;64:4973-4979; Yamanaka R, y otros. Clinical evaluation of dendritic cell vaccination for patients with recurrent glioma: results of a clinical phase l/ll trial. Clin Cáncer Res. 2005; 11:4160-4167; Yamanaka R, y otros. Vaccination of recurrent glioma patients with tumour lysate-pulsed dendritic cells elicits immune responses: results of a clinical phase l/ll trial. Br J Cáncer. 2003;89:1172-1179). Dos estudios bien controlados han mostrado recientemente que el cultivo de BTIC en suero causa diferenciación, llevando a inestabilidad genómica mejorada, acelerando la mutación genética y llevando a patrones de expresión de gen globales y fenotipos que son drásticamente diferentes del tumor primario (Lee J y otros, Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cáncer Cell. 2006;9:391-403; Gunther HS, y otros, Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene. 2007). En contraste, el cultivo de las células de tumor primario en medios de célula madre neural complementados con EGF y FGF previene diferenciación. Estos cultivos de neuroesfera recapitulan el genotipo, patrón de expresión de gen, y fenotipo del tumor primario cuando so xenoinjertados en cerebro de ratón (Lee J y otros, Tumor stem ce! I s derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cáncer Cell. 2006;9:391-403; Gunther HS, y otros, Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene . 2007). Uno debe considerar estos hallazgos recientes como intentos que se hacen para desarrollar una inmunoterapia más efectiva. Cuando se pulsan los DC con un Usado de tumor y se administran con una vacuna, los antígenos de proteína en el Usado se procesan dentro de DC y presentado en MHC I y MHC II para iniciar células T naturales que responden a tres antígenos. Por lo tanto, es probable que hasta ahora, las vacunas de DC pulsado de Usado hayan sido desviadas para apuntar únicamente un subgrupo de antígenos expresado en el tumor primario, y probablemente pocos (si hay algunos) de estos fueron antígenos específicos de BTIC ya que la fuente de antígeno se cultivó en suero. Un estudio ha proporcionado ahora evidencia que soporta esta hipótesis. Pellegata y otros han mostrado que los ratones vacunados con DC pulsados con lisado cultivado de neuroesfera tuvieron respuesta terapéutica superior comparado con ratones vacunados con DC pulsados con lisado de célula de glioma cultivado en s uero (Pellegatta S, y otros, Neurospheres enriched in cáncer stem-like cells are highiy effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cáncer Research. 2006;66:10247-10252). En otras palabras, la forma en la que se condujeron las pruebas de vacuna DC puede crear un problema de señal a ruido. En el proyecto actual se derivaron cultivos de célula de glioma de tumor primario y se cultivaron en medios de célula madre neural para enriquecimiento para fenotipo clínicamente relevante y expresión de antígenos BTIC importantes.
Imiquimod más lisado de célula de tumor es una vacuna anti-glioma potente Imiquimod es un modificador de respuesta inmune aprobado por la FDA administrado como una crema sobre la piel para el tratamiento de tumores cutáneos. Imiquimod ejerce sus efectos inmunoestimulantes a través del receptor de tipo Toll 7 (TLR7) expresado sobre DC y células B en seres humanos. El tratamiento con Imiquimod causa la liberación de citocinas pro-inflamatorias incluyendo interferóna, i nterferóny IL-12, todos importantes para la iniciación de respuesta inmune Th1 resistente asociada con actividad antitumoral en animales. El Imiquimod tópico ha sido utilizado como un adyuvante de vacuna con éxito en numerosos estudios que apuntan a tumores establecidos e infección viral (Adams S, y otros, Immunization of malignant melanoma patients with full-length NY-ESO-1 protein using TLR7 agonist Imiquimod as vaccine adjuvant. J. Immunol. 2008;181 : 776-784; Johnston D, Bystryn JC, Topical Imiquimod is a potent adjuvant to a weakly-immunogenic protein prototype vaccine. Vaccine. 2006;24:1958-1965; Craft N, y otros, The TLR7 agonist Imiquimod enhances the anti-melanoma effects of a recombinant Listeria monocytogenes vaccine. J Immunol. 2005;175:1983-1990; Harrison CJ, Miller RL, Bernstein DI. Reduction of recurrent HSV disease using Imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine. Vaccine. 2001;19:1820-1826; Bernstein DI, Miller RL, Harrison CJ. Adjuvant effects of Imiquimod on a herpes simplex virus type 2 glycoprotein vaccine ¡n guinea pigs, J Infecí Dis. 1993;167:731-735). Con base en este trabajo, la eficiencia de una vacuna de Usado de célula de tumor en un modelo de murino se probó. Los ratones C57BL/6 innatos que portan gliomas GL261 singenésicos se trataron mediante vacunaciones intradérmicas con Iisados de célula GL261 por lo cual se aplicó Imiquimod al sitio de vacunación inmediatamente antes de inyección. Se administró solución salina como un control. Los ratones tratados con Imiquimod/vacunación de Usado de tumor sobrevivieron significativamente más que los controles, incluyendo 20% de supervivencia a largo plazo (Figura 2; p<0.01).
Esquema de tratamiento. El esquema de tratamiento actual (Figura 3) se basa en los datos anteriores, y lo que se conoce sobre la radiación que aumenta la inmunogenicidad de células de tumor. La línea celular BTIC (GBM-6) se utiliza como la fuente de vacuna. La terapia de radiación conforme a una dosis de 5220 cGy en fracciones de 180 cGy se proporciona durante 6 a 7 semanas para inducción en un intento para lograr enfermedad residual mínima. Se suministraron fracciones de 360 cGy adicionales en fracciones de 180 cGy durante 2 días consecutivos 4 y 8 semanas después del final de la terapia de radiación inicial en un esfuerzo novedoso para inducir la regulación ascendente de ligando NKG2D ("sensibilizando" consecuentemente el tumor residual al linfocito anexado). Por lo tanto, la dosis de radiación total para cada paciente es de 5940 cGy. Los pacientes se asignaron a dos grupos; temozolomida 75 mg/m2/día se proporciona a un grupo 1 durante las primeras cuatro semanas de terapia de radiación para efecto antitumoral y radiosensibilización de adyuvante. Se espera que la temozolomida cause linfopenia. La vacuna se suministra durante la subsecuente recuperación de linfocito en este grupo de pacientes con el fin de favorecer la recuperación inmune hacia células T específicas para antígenos de tumor expresados en DIPG tales como IL-13Ra2, Epha2, Her-2. Los datos recientes han mostrado que las células regulatorias T pueden ser el subgrupo de linfocito predominante que se retrasa durante la recuperación con temozolomida, por lo tanto, el grupo 2 se trata sin temozolomida adyuvante. Estos pacientes pueden presentarse a nosotros con referencia de otras instituciones después que se ha completado la terapia de radiación inicial. Todos los otros pacientes se asignaron aleatoriamente a la temozolomida o sin brazos de temozolomida. Los números T reg y la respuesta inmune se compararon entre los dos grupos por citometría de flujo en células mononucleares de sangre periférica recolectadas antes y después que inicia la terapia de vacuna. La administración de vacuna comienza en la semana 4 después del término de la terapia de radiación y se proporciona cada dos semanas para cuatro dosis. Se proporcionan refuerzos cada cuatro semanas subsecuentes y continúan a un máximo de un año después del inicio de terapia de radiación, durante ese tiempo la supervivencia media se habrá pasado basada en datos históricos.
La terapia de radiación se proporciona de acuerdo con el estándar de cuidado de la Universidad del Hospital de Niños de Minnesota, con atención a la guía de dosificación anterior. Todos los pacientes fueron tratados con Terapia de Radiación de Intensidad Modulada (IMRT) o una técnica de conformación equivalente. El volumen objetivo clínico se define como el volumen de tumor bruto (extensión completa del tumor visible en MRI) más un margen de 1 cm.
La mayoría, sino es que todos los pacientes se colocaron en terapia con dexametasona al momento de diagnóstico. Se hizo un esfuerzo para quitar dexametasona a todos los pacientes por la semana 6 de terapia de radiación inicial, de nuevo permitiendo la reconstitución inmune antes de administración de vacuna.
La administración de la vacuna se realizó al aplicar primero el Imiquimod tópicamente en dos sitios de inyección supraescapular. La vacuna entonces se proporciona intradérmicamente en dos dosis divididas que se aproximan a 2 x 106 células GBM6-AD irradiadas gama Usadas por dosis en cada punto de administración.
EJEMPLO 2 La vacunación de célula dendrítica (DC) es un aspecto poderoso para ínmunoterapia de cáncer que ha obtenido recientemente aprobación regulatoria, y las vacunas de DC pulsadas de Usado de tumor se están probando en pruebas clínicas. Los Usados de célula de tumor (TL) se generan frecuentemente de células cultivadas en oxigeno atmosférico (~20% de 02), que es superior a la tensión de 02 en el tumor in situ. Se ha descubierto que cultivar células de tumor de murino en 5% de 02 profundamente mejoró la eficacia de vacunas TL. Los inventores de esa forma buscaron determinar sí cultivar las células de glioma humanas primarias en 5% de 02 mejoraría la potencia de DC y la expresión de antígeno de tumor. Diferente a células de glioblastoma primario cultivadas en 20% de 02, los cultivos en 5% de 02 mostraron una reversión parcial hacia los patrones de expresión de gen en el tumor parental in situ. Adicionalmente, se tomaron TL de 5% de 02 más eficientemente por DC, que exhibieron una capacidad superior para presentar el antígeno a células T CD8. Las células T CD8 cebados por DC pulsadas por Usado de 5% de 02 tuvieron función tumoricida significativamente mejorada con relación a aquellas cebadas por TL de 20% de 02. Colectivamente los resultados de los inventores demuestran que el 02 de cultivo de tejidos puede: i) desviar la expresión de antígenos objetivo para reflejar mejor tumores ¡n situ, ii) aumentar la potencia de DC para presentación de antígeno, iii) mejorar la función de efector de células T CD8. Estos resultados tienen amplias implicaciones para mejorar la eficacia de vacunas mayúsculas DC pulsadas de TL. Con base en estos datos se ha iniciado una prueba clínica utilizando DC pulsadas con células de gliomas expandidas en 5% de 02 en condiciones libres de suero.
La vacunación terapéutica que utiliza células dendríticas (DC) pulsadas con antígenos asociados con tumor es un aspecto prometedor para inmunoterapia de cáncer (Ridway D. The first 1000 dendritic cell vaccines. Cáncer Invest 2003; 21: 873-86). La Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos recientemente aprobó una vacuna DC pulsada de péptido para el tratamiento de cáncer de próstata resistente a castración (DeFrancesco L. Landmark a pproval for Dendreon's cáncer vaccine. Nat Biotechnol; 28: 531-2; Kantoff PW, Higano CS, Shore ND, et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cáncer. N Engl J Med; 363: 411-22). Las células de tumor se utilizan frecuentemente como una fuente de antígeno para vacunas DC. Las vacunas que u tilizan células de tumor y Usados de célula de tumor (TL) tienen varias ventajas incluyendo objetivo a múltiples antígenos de tumor específicos de paciente. La vacunación con DC pulsadas por TL ha demostrado alentar resultados en pruebas clínicas de etapa temprana en numerosas afecciones, pero existe claramente una necesidad de mejoras adicionales (Le DT, Pardoll DM, Jaffee E . Cellular vaccine approaches. Cáncer J; 16: 304-10).
Permanece poco claro cómo el cultivo de tejido p uede afectar respuestas inmunes antitumorales evocadas por vacunas de célula de tumor. Las células de glioblastoma primario cultivadas en medios que contienen suero fueron genética y fenotípicamente muy diferentes del tumor primario, mientras que el cultivo de las mismas células en condiciones libres de suero se reflejan de forma más cercana al tumor primario y enriquecido para un fenotipo de célula madre de cáncer (Lee J, Kotliarova S, Kotliarov Y, y otros, Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell Unes. Cáncer Cell 2006; 9: 391-403). Los lisados de célula de glioma generados en condiciones libres de suero fueron más efectivos que aquellos derivados de medios que contienen suero cuando se emplearon para vacunas DC pulsadas por TL en un modelo de murino (Pellegatta S, Poliani PL, Corno D, y otros, Neurospheres enriched in cáncer stem-like cells are highly effective in elíciting a dendritic cell-mediated ¡mmune response against malignant gliomas. Cáncer Res 2006; 66: 10247-52). Tradicionalmente, se derivaron vacunas de célula de tumor de cultivos mantenidos en oxígeno atmosférico (-20.95%; en lo sucesivo 20% de 02), lejos de la tensión de oxígeno promedio menor que 6% de 02 medido en glioblastomas in situ (Evans SM, Judy KD, Dunphy I, y otros, Hypoxia is important in the biology and aggression of human glial brain tumors. Clin Cáncer Res 2004; 10: 8177-84). Se estableció que el oxígeno influencia la expresión de gen, metabolismo celular, proliferación, supervivencia (van den Brenk HA, Moore V, Sharpington C, Orton C. Production of metastases by a primary tumour irradiated under aerobio and anaerobio conditions in vivo. Br J Cáncer 1972; 26: 402-12; Sciandra JJ, Subjeck JR, Hughes CS. Induction of glucose-regulated proteins during anaerobio exposure and of heat-shock proteins after reoxygenation. Proc Nati Acad Sci U S A 1984; 81: 4843-7; Pouyssegur J, Dayan F, Mazure N . Hypoxia signalling in cáncer and approaches to enforce tumour regression. Nature 2006; 441 : 437-43; Gordan JD, Simón MC. Hypoxia-inducible factors: central regulators of the tumor phenotype. Curr Opin Genet Dev 2007; 17: 71-7), y la hipoxia aumenta la expresión de marcadores de célula madre de tumor CD133, Nestina, and SOX2 (Platet N, Liu SY, Atifi ME, y otros, P!atet N, Liu SY, Atifi ME, et al. Influence of oxygen tensión on CD133 phenotype in human glíoma cell cultures. Cáncer Lett 2007; 258: 286-90; McCord AM, Jamal M, Shankavaram UT, Lang FF, Camphausen K, Tofilon PJ. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol Cáncer Res 2009; 7: 489-97; Li Z, Bao S, Wu Q, et al. Hypoxia-inducible factors regúlate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cáncer Cell 2009; 15: 501-13). Sin embargo, el efecto de oxígeno en inmunogenicidad de célula de tumor se entiende de manera deficiente.
Los resultados actuales indicaron que cultivar células de glioma primario en 20% de 02 causó un cambio global en la expresión de gen iejos del tumor primario, lo que se invirtió parcialmente al cultivar las células a 5% de 02. Notablemente, ¡a expresión de varios antígenos de glioma conocidos por provocar respuestas de célula T se incrementó en 5% de 02. Las células de glioma humanas primario desarrolladas en 5% de 02 exhibieron propiedades adyuvantes intrínsecas como se valoró por la captación superior de DC, presentación antígeno e iniciación de células T CD8 tumoricidas. De esa forma, las células de glioma humanas primario desarrolladas en medios libres de suero a 5% de 02 emergen como la mejora más reciente en la evolución de vacunas de célula de tumor.
Materiales y Métodos Cultivo de célula de tumor: gliomas quirúrgicamente divididos (Cuadro 1) se disociaron enzimáticamente y se cultivaron en medios de célula madre neural (Wu A, Oh S, Wiesner S , y otros; Persistence of CD 133+ cells in human and mouse glioma ce II lines: detailed characterization of GL261 glioma cells with cáncer ste celi-l.ike properties. Stem Cells Dev 2008; 17: 173-8).
Cuadro 1 Número de Paciente Id Tumor Experimento Pasaje Paciente 1 *BT130 GBM Microdisposición 12 Paciente 2 *BT132 GBM Microdisposición 12 Paciente 3. GBM6 GBM ARNm y Fe, CTL 8 Paciente 4 MNBT110 GBM ARNm, Fe, Westerns, CTL 14 Paciente 5 MNBT112 Epd CTL 12 Paciente 6 MNBT113 GBM ARNm, Fe Western 14 Paciente 7 MNBT124 GBM ARNm, Fe 15 Cuadro 1. Cuadro de la identificación de tumor, información de paciente, y el experimento en el cual se utilizó el tumor, y número de pasaje de las células. * Indica que el tumor se cortó en Mayo Clinic, Rochester MN; otros se cortaron en la Universidad del Centro médico de Minnesota, Fairview.
GBM = glioblastoma multiforme, Epd = Ependimoma, FC = Citometría de flujo, CTL = ensayo de Citotoxicidad.
A menos que se mencione explícitamente, todos los cultivos de tejidos se mantuvieron a 20% de 02. Los cultivos etiquetados como "5% de 02" se convirtieron de cultivos de 20% de 02 por mantenimiento a 5% de 02 durante al menos 30 días antes de uso como se describe (Olin MR, Andersen BM, Zellmer DM, y otros, Superior efficacy of tumor cell vaccines grown in physiologic oxygen. Clin Cáncer Res; 16: 4800-8).
Microdisposición: se aisló el ARN total de tejido congelado en resección, o células cultivadas de 5% a 20% de 02. Los niveles de expresión de 18,401 genes se analizaron utilizando un Ensayo DASL de expresión de genoma completo (ilumina, San Diego, CA).
El ARN total se aisló de tejido congelado en el tiempo de resección, y de células desarrolladas en 5% y 20% de 02 utilizando el mini-equipo RNEasy® Plus Mini Kit (Qiagen®, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó un control de calidad con un bio-analizador Agilent 2100 (Santa Clara, CA). El Ensayo de DASL de expresión de genoma completo (ilumina, San Diego, CA) se utilizó para analizar niveles de expresión de 18,401 genes. Brevemente, se sintetizó ADNc biotinilado de 100 ng de ARN total de cada muestra utilizando poli-T e iniciadores de nanómero aleatorios mezclados. El ADNc biotinilado se hibridizó para analizar oligonucleótidos, que se enlazaron subsecuentemente a partículas paramagnéticas conjugadas a estreptavidina. Se extendieron y se ligaron oligos, creando plantillas que se amplificaron con iniciadores aleatorios, fluorescentes. Los productos fluorescentemente etiquetados se enlazaron a 24,631 sondas de oligonucleótido contenidas en cada microdisposición de Hlumina-HumanRef-8_V1 Expression BeadChip, y se analizaron con microscopía confocal láser. Se analizaron tres réplicas técnicas para cada condición para el paciente 2 y tejido del paciente 1. Se realizaron dos réplicas técnicas para líneas celulares derivadas del paciente 1.
Se analizaron datos de disposición para control de calidad como se describió previamente (Sarver AL. Toward understanding the ¡nformatics and statistica I aspects of micro-RNA profiling. J Cardiovasc Transí Res; 3: 204-11), sondas normalizadas cuantiles, y múltiples para cada gen se promediaron. Para cada grupo de experimentos (tumor, 20% y 5% de oxígeno) cada valor experimental se dividió por el promedio del cultivo de 20% de 02 para determinar las diferencias entre estados independientes de las diferencias entre los tumores diferentes. Dos pruebas t de grupo así como el cambio de veces promedio se utilizaron para determinar genes expresados de manera diferente.
RT-PCR Cuantitativa: Se analizó ARN e xtraído mediante P CR de tiempo real utilizando una mezcla maestra de PCR de un paso de SYBR Green (Qiagen®). Se utilizaron las siguientes condiciones para PCR en un termociclador ABI PRISM 7500: 95°C durante 15 minutos; 94°C durante 30s, 55°C durante 30s, 68°C durante 30s en un total de 40 ciclos; 72°C durante 10 minutos; y 10°C hasta que se recolectó. La cuantificación relativa de la expresión de gen se calculó y se normalizó a niveles de expresión GAPDH utilizando el método 2"??0' (Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001; 25:402-8). En el Cuadro 2 se enlistaron iniciadores.
Cuadro 2 Antígeno Secuencia de Cebador CD133 Delantero-5-TCG TAC TCG GCT CCC TGT TG-3 (SEC ID NO:1) Inverso 5-ATT CAC GCG GCT GTA CCA CA-3 (SEC ID NO:2) SOX2 Delantero 5- CCC CCG GCG GCA ATA GCA-3 (SEC ID NO: 3) Inverso 5- TCG GCG CCG GGG AGA TAC AT-3 (SEC ID NO:4) NESTINA Delantero 5-AGG TAG AGG AGC TGG CAA GGC GAC-3 (SEC ID NO:5) Inverso 5-TTT TCA GTA GCC CGC AGC CG-3 (SEC ID NO:6) EPHA2 Delantero 5-CTG GCC TTC CAG GAT ATC GG-3 (SEC ID NO:7) Inverso 5- TGC ACA GTG CAT ACG GGG CT-3 (SEC ID NO: 8) IL3Ra2 Delantero 5-CTG ATA AGC ACA ACA TTT GGC TCT-3 (SEC ID NO:9) Inverso 5- TGA TGG TCT TCC ATG TTT CAC TAC C-3 (SEC ID NO: 10) HER2/Neu Delantero 5-CTG CAG CTT CGA AGC CTC ACA A-3 (SEC ID NO:11 ) Inverso 5-ATG GCA GCA GTC AGT GGG CAG T-3 (SEC ID NO: 12) GAPDH Delantero 5-GTC GGA GTC AAC GGA TTT GGT-3 (SEC ID NO: 13) Inverso 5-GGG ATT TCC ATT GAT GAC AAG CT-3 (SEC ID NO: 14) Cuadro 2. Lista de iniciadores utilizados para determinar niveles de transcripción.
Citometría de flujo: se tiñeron 5 x 105 células con: anti-CD133/2 (Miltenyi Biotec), EphA2, SOX2, Nestina, HER-2/neu (R&D Systems), e IL13Ra2 (SantaCruz Biotechnology) . Después de tres lavados, CD133/2 se tiñó con un anti-ratón-647 secundario; IL13Ra2 y EphA2 se tiñeron con anti-ratón-PE secundario junto con su isotipo respectivo y se analizaron utilizando FACS Canto II. Para la fenotipificación de DC, se tiñeron 5 x 105 DC con CD80-FITC, CD86- PE, CD83-PE, HLA-DR-APC, CCR7-FITC (eBioscience) y HLA-ABC-FITC (BD Biosciences), se incubaron a 4°C durante 30 minutos, se lavaron, se fijaron, y luego se analizaron en un calibrador FACS Caliber. La mancha intracelular se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (BD Biosciences).
Células Dendríticas: Se purificaron monocitos utilizando perlas magnéticas CD14 (Miltenyi Biotech) de sangre periférica de donantes HLA-A2* saludables, colocados en placas a una concentración de 5 X 105 en placas de 24 cavidades y madurados como se describió previamente (Mailliard RB, Wankowicz-alinska A, Cai Q, y otros alpha-type-1 polarized dendritic ce 11 s : a novel immunization tool with optimized CTL-inducing activity. Cáncer Res 2004; 64: 5934-7); en el día 6, DC se pulsaron con 100 pg de TL derivados ya sea en 5% o 20% de 02, y madurados antes de los experimentos.
Ensayos CTL: Se agregaron 1 X 106 HLA-A2+ PBMCs de donantes normales a DC pulsadas de Usado ( día 8) maduradas con 50 U IL-2 y se incubaron 7 días. Para re-estimulación, se agregó un segundo grupo de DC pulsadas al co-cultivo durante 4 días. En el día 11, los PBMC cebados se co-cultivaron con 2 X 104 células de glioma HLA-A2+ etiquetadas con CFSE durante 6h, después se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la citotoxicidad como se describió (Olin MR, Hwa Choi K, Lee J, Molitor TW. Gammadelta T-lymphocyte cytotoxic activity against Mycobacterium bovis analyzed by flow cytometry. Immunol Methods 2005; 297: 1-11). Para el ensayo de bloqueo, se agregó antl-HLA-ABC a células objetivo durante 25 minutos, se lavó, y se agregaron a células de efector.
Ensayos CMV: se pulsaron 5 X 105 HLA-A2+ iDCs con 100 de lisados de tumor derivados en 5% o 20% de 02 +/- 10 µg de antígenos CMV restringidos a pp65 HLA-A2 (NL VPMVATV) y se maduraron como se describió en la sección de métodos. Después de la maduración, las DC se lavaron 3 veces, y se agregaron 5X105 PBMCs de donantes seropositivos a CMV a las DC. Se utilizaron PBMC seronegativo a CMV como un control negativo. Las células se incubaron durante 48 horas, y el sobrenadante se analizó m ediante disposición de perla citométrica (BD Biosciences) para IFNy. Se cultivaron células durante 24 horas adicionales, se tiñeron con pentámero pp65, anti-CD8 (Prolmmune), y se tiñeron intracelularmente para producción de IFNy.
El aumento en la actividad tumoricida no se debe a un aumento en moléculas co-estimulantes. Para investigar si los lisados derivados e n cultivo de 5% de 02 a Iteraron I a expresión de moléculas co-estimulantes, se pulsaron DC con lisados de tumor derivados en condiciones de 5% o 20% de 02, madurados, y se analizaron por expresión de CD83, CD80/86, HLA-DR, HLA-ABC, y CCR7. En tres experimentos separados, no se observaron diferencias significativas en marcadores de co-estimulación entre las dos condiciones de oxígeno.
Análisis estadístico: se hicieron comparaciones estadísticas mediante ANOVA, seguido por comparaciones post hoc utilizando una prueba t de 2 colas. Todas las pruebas se realizaron con software Prism 4 (Graph Pad Software, Inc). Los valores p<0.05 se consideraron significativos.
Resultados y Discusión Con el fin de comparar cultivos de tejido al tumor primario in situ, se perfilaron niveles de expresión de ARNm de dos glioblastomas y células cultivadas derivadas del mismo tumor desarrolladas en 5% y 20% de 02. Como una tendencia, la firma de expresión de gen cambio hacia los niveles observados in situ cuando las células se cultivaron en 5% de 02 con relación a 20% de 02. Hubo una diferencia significativa en la expresión de 3,333 genes entre el cultivo de 20% de 02 y el tumor in situ en ambos pacientes. De estos, 77 genes se expresaron diferencialmente entre los cultivos de 5% y 20% de 02.
Los marcadores de célula madre de cáncer seleccionados (CD133, Nestina, Sox2) y TAA conocidos por provocar respuestas de célula T (EphA2, IL-13Ra2, HER-2/neu) se analizaron mediante PCR y citometría de flujo. Con relación al 20% de 02, las células cultivadas en 5% de 02 expresaron significativamente más ARNm que codifica para CD133, EphA2, IL-13Ra2 y HER-2/neu (Figura 6A). SOX2 y Nestina d emostraron la misma tendencia pero fallaron para alcanzar importancia estadística. Con la excepción de HER-2/neu. la expresión de proteína siguió la misma tendencia con aumentos significativos en CD133, EphA2, e IL13Ra2 (Figura 6B). Además, la tinción western para CD133 e l L13Rc2 reveló cambios similares en expresión (Figura 6C). Colectivamente, estos experimentos demostraron que las células cultivadas en 5% de 02 reflejan mejor la expresión de antígeno en el tumor in situ y se enriquecieron para marcadores de "origen" y TAA inmunogénico.
Se preguntó primero si la tensión de oxígeno alteraría la capacidad de TL p ara c ebar células T tumoricidas e n el cultivo. Se cebaron HLA-A2+ PBMC de donantes por DC autólogas pulsadas con TL derivados de tres pacientes diferentes con glioma. Los PBMC cebados se valoraron por su capacidad para lisar las mismas células de glioma HLA-A2+ que se utilizaron para la iniciación. Los PBMC cebados por TL de 5% de 02 demostraron actividad tumoricida superior contra células objetivo de 3/3 pacientes (Figura 7A-C). Para conocer si la lisis de célula tumoral requirió la iniciación de células T CD8, se agregó un anticuerpo de bloqueo anti-HLA-ABC a células de tumor antes de células de efector. El bloqueo de interacciones de MHC l-TCR evitó una respuesta tumoricida, implicando linfocitos T citotóxicos (CTL), como los efectores principales en este ensayo (Figura 7D).
Una e xplicación plausible para la mejora en iniciación de CTL sería la mejora de la maduración de DC por TL de 5% de 02. La expresión de moléculas co-estimulantes, moléculas MHC, y CCR7 en DC maduras se midió después de pulsar con TL de 20% o 5% de 02. No hubo diferencias significativas en la expresión de CD83, CD80, CD86, o H LA- ABC, HLA-DR, o CCR7. Por lo tanto, la actividad de adyuvante de TL de 5% de 02 no fue probable debido a la mejora de la maduración de DC, sugiriendo otros mecanismos. Se condujeron experimentos para determinar si la iniciación de CTL superior lograda con TL de 5% de 02 podría ser debido a cambios en la captación de lisado. Las DC inmaduras se pulsaron con TL de células de glioma etiquetadas con CFSE desarrolladas en 5% o 20% de 02. La detección basada en citometría de flujo de células CFSE + HLA-DR + (que marcan DC cargadas con lisados) revelaron que los TL de 5% de 02 se captaron por dos veces el número de DC comparado con TL derivados en 20% de 02 (Figura 8A). De esa forma, factor(es) no identificado en los TL d e 5% de 02 aumentó I a fracción de DC que afectó las proteínas asociadas con tumor en cultivo de tejido.
Los inventores establecieron un ensayo para determinar si los TL alteraron la iniciación de célula T CD8 mediada por DC de un antígeno definido no presente en los T L. Para realizar esto, los TL se mezclaron con péptido pp65, un antígeno de marcador específico con respuestas de célula T CD8 bien definidas. El pp65 derivado de citomegalovirus (CMV) es un epítopo inmunodominante restringido a HLA-A2 para el cual los pacientes seropositivos CMV típicamente tienen respuestas de memoria de célula T CD8 (revisado por Moss P, Khan N. CD8( + ) T-cell Immunity to citomegalovirus. Hum Immunol 2004; 65: 456-64)). Los PBMC de donantes seropositivos se co-cultivaron con DC que han sido pulsadas con TL con o sin pp65. Los PBMC de donantes seronegativos se utilizaron para control para activación de célula T CD8 independiente de pp65. IFNy soluble en el sobrenadante de cultivo de tejido se cuantificó como una medida de activación de célula T CD8. Hubo un fondo de 50-200 pg/ml de IFNy detectado en el sobrenadante cuando los TL se pulsaron en ausencia de pp65, posiblemente debido a activación de las células T de células asesinas naturales (NK) sin importar pp65 (Figura 8B). No hubo diferencia significativa en IFNy elaborado entre los PBMC no pulsados y pulsados con lisado d e donantes seropositivos , rigiendo la reactividad de antíg.enos CMV en el lisado, demostrando una expresión imperceptible de antígenos CMV en TL (Cobbs CS, Harkins L, Samanta M, y otros. Human citomegalovirus infection and expression en human malignant glioma. Cáncer Res 2002; 62. 3347-50). Como se esperó, los PBMC de donantes seropositivos se cebaron con pp65 sólo (sin TL) de IFNy elaborado a niveles 2-4 veces sobre el fondo, mientras que los PBMC de donantes seronegativos n o respondieron a pp65. De esa forma, los PBMC d e donantes seropositivos presentaron un fenotipo consistente con memoria inmunológica para CMV, permitiendo que los inventores midan cómo los TL pueden cambiar la respuesta a un epítopo de célula T CD8 definido.
Los PBMC cebados con pp65 mezclados con TL de 5% de 02 elaboraron dos veces la cantidad de IFNy comparado con pp65 sólo. En un contraste marcado, los TL de 20% de 02 suprimieron significativamente la secreción de IFNy dependiente de pp65 (Figura 8B). Con el fin de confirmar que la células T CD8 específicas de pp65 fueron la fuente principal de IFNy, se condujo citometría de flujo para valorar la expresión de IFNy específicamente en células de pentámero" CD8 + pp65 (Figura 8C). Consistente con IFNy soluble medido, las células de pentámero+ CD8 + pp65 cebadas por TL de 5% 02 más pp65 produjeron más I F ?? en una base por célula con - relación a otros grupos. En conjunto, estos datos demuestran que los TL de 5% de 02 tienen actividad de adyuvante intrínseca, independiente de la cantidad de TAA expresado. Es notable que estos hallazgos en paralelo con lo que reportaron recientemente los inventores utilizando reactivos de inmunología de ratón más precisos y líneas celulares de glioma establecidas; principalmente que TL de 5% de 02 aumentaron la presentación de ovoalbúmina exógena en MHC I y mejoraron la activación de célula T CD8 específica, mientras que los TL de 20% de 02 fueron supresores a la iniciación de célula T CD8 y alternativamente promovieron respuestas de anticuerpo (Olin MR, Andersen BM, Zellmer DM, y otros, Superior efficacy of tumor cell vaccines grown in physiologic oxygen. Clin Cáncer Res; 16: 4800-8).
En resumen, los datos actuales demuestran que el oxígeno de cultivo de tejido funciona como un "interruptor inmunológico" maestro al regular simultáneamente la expresión de TAA y factores que modulan la iniciación mediada por DC de células T CD8. Al seleccionar para expresión de TAA que. son más abundantes en el tumor in situ, los inventores muestran que el oxígeno puede explotarse para cebar células T CD8 con mayor especificidad para objetivos abundantes en el tumor in situ. Un hallazgo separado e igualmente importante es que las células de tumor desarrolladas en oxígeno fisiológico son inherentemente más inmunogénicas a células T CD8 a través de un mecanismo que es independiente de coestimulación pero involucra mejora de la iniciación de célula T CD8. Una tercera consideración es que las células de glioma primario en desarrollo en 1-7% de 02 incrementó los marcadores de célula madre de cáncer en varios estudios previos (Platet N, Liu SY, Atifi ME, y otros, Influence of oxygen tensión on CD133 phenotype in human glioma cell cultures. Cáncer Lett 2007; 258: 286-90; McCord AM, Jamal M, Shankavaram UT, Lang FF, Camphausen K, Tofilon PJ. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like propertíes of CD133+ human glioblastoma ce 11 s in vitro. Mol Cáncer Res 2009; 7: 489-97; Li Z, Bao S, Wu Q, et al. Hypoxia-inducible factors regúlate tumorigenic capacity of glioma stem ce 11 s . Cáncer Cell 2009; 15: 501-13), que muestran las células T cebadas son más adecuadas para erradicar células madre cancerosas in situ. Las vacunas hechas por la expansión de células de tumor primario en oxígeno fisiológico sirven como un sistema poderoso para inducir respuestas inmunes antitumorales clínicamente útiles.
EJEMPLO 3 Se desarrollaron células GBM6-AD para generar anticuerpos apoptóticos para pulsar sobre células dendríticas autólogas para hacer una vacuna.
Producción de Células Dendríticas. Se recolectaron células mononucleares de sangre periférica (MNC) con un instrumento de aféresis con licencia de la FDA utilizando procedimientos de recolección establecidos, estándares. Se siguió una técnica estéril para prevenir la contaminación de la colección. Las células se sembraron en un matraz de cultivo de tejido o fábrica de célula a una densidad de sembrado viable d e 1.OE + 05-1.5E_05 y se incubaron a 37°C, 5% C02, en el día +3, 20% volumen total de suplementos de medio de cultivo con IL-4 y GM-CSF (1,000 lU/ml) se agregó a las células. En el día +6 las células maduraron al agregar GM-CSF (1,000 lU/ml), ILIbeta (25 ng/ml) TNF-alfa (50 ng/ml), IFN-alfa (10,000 lU/ml), IFN-gamma ((1,000 lU/ml), y Poli-IC (20 pg/ml) y se incubaron (37°C, 5% de C02) hasta el día +8. Un cuerpo apoptótico de tumor cerebral (una célula apoptótica por iDC) se agregó también en el día 6. Las DC polarizadas tipo 1 alfa pulsadas, maduras se cosecharon del cultivo utilizando selección TrypLE en el día +8 y se crio-conservaron en Plasmlite-A, 5% de albúmina de suero humano (HSA) y DMSO (10% de concentración final).
Procesamiento de Célula Madre de Tumor Cerebral. Una línea celular individual derivada de un paciente adulto con glioblastoma multiforme se probó antes de la aceptación en la instalación MCT. La prueba incluyó micoplasma (PTC) y esterilidad; los resultados fueron satisfactorios. Las células después se expandieron en un medio de célula madre neural libre de suero (DMEM/F12 suplemento B-27, suplemento N-2) con EGF (concentración final de 20 ng/ml) y bFGF (concentración final 2 ng/ml) a 37°C, 5% de C02, y 5% de 02. El cultivo se dividió como esferas formadas de células en aproximadamente 3-5 días utilizando Selección TrypLE y disociación mecánica. La células se volvieron a suspender en el medio de célula madre neural libre de suero con EGF (concentración final de 20 ng/ml)/bFGF (concentración final de 2 ng/ml) y continuó a través de cultivo hasta que se expandió una cantidad suficiente de células para el MCB. La células luego se lavaron en DPBS y se crio-conservaron en un medio de crio-conservación (Plasmlyte-A, 5% de albúmina de suero humano (HSA), y DMSO (concentración final de 10%)).
Las muestras del MCB se expandieron en una forma consistente con el MCB para establecer una masa de célula funcional que se congela utilizando un congelador de velocidad controlada. Después una porción de la masa se descongeló y se sometió a nebulización, y el lisado de célula completo a granel resultante se irradió (200 Gy) y se ajustó a aproximadamente 2 mg/ml. Después se transfirió asépticamente en frascos a aproximadamente 1.2 mg en 600 µ?. Los frascos conteniendo los Usados se congelaron utilizando un congelador de velocidad controlada y luego se almacenaron a < - 150°C hasta distribución para administración.
EJEMPLO 4 Plan de Tratamiento. La preparación de vacuna toma aproximadamente cuatro semanas desde el momento de leucoféresis.
Leucoféresis-Fuente de Célula Dendrítica Autóloga. Las DC autólogas se obtuvieron de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para cada paciente por leucoféresis. La colección se realizó utilizando técnicas de colecciones estándares. Las PBMC se recolectaron utilizando un separador de glóbulos rojos Fenwal CS-3000® Plus (#4R4538) con cámara de separación de granulocito y cámara de recolección de volumen pequeño (SVCC) (Fenwal División, Baxter Healthcare, Deerfield, IL).
Las PBMC se transportaron inmediatamente a la Instalación de la Universidad de Terapia Molecular y Celular de Minnesota (MCT) para procesamiento. En pacientes en donde se agotó el suministro de vacuna antes que se llegue al fin del tratamiento planeado, puede hacerse una segunda leucoféresis para obtener células para producción de vacuna adicional. La necesidad de y el tiempo de esta colección se determina en una base de paciente individual.
Preparación de Vacuna. Las PBMC autólogas se procesarán como se resume en la Figura 9. Una línea de célula madre de tumor cerebral derivada de un glioblastoma multiforme se mantiene en la Instalación de Terapia Molecular y Celular (MCT) y se procesa como una fuente de antígeno de tumor alogeneico. Los cultivos de DC que contienen 107 a 108 células se expusieron al Usado de tumor de 4 x 106 BTC. Las DC pulsadas se congelaron en alícuotas individuales hasta uso.
Vacunación de Célula Madre de Tumor Cerebral de Célula Dendrítica/lmiquimod. La vacunación se administró en una base de paciente externo cada 2 semanas durante las primeras 8 semanas, luego cada 4 semanas durante 10 vacunaciones adicionales. Se aplicó Imiquimod tópicamente en el sitio justo antes de la vacunación y de nuevo 24 horas después. Se observó a los pacientes durante 30 minutos después de la vacunación para eventos adversos inmediatos, ya sea sistémicos o locales en los sitios de inyección.
Aplicación de Imiquimod. Se comercializó Imiquimod como crema Aldara al 5% en paquetes de 250 mg, que proporciona una dosis total de 12.5 mg por paquete y suficiente para cubrir 20 cm!. Se aplicó el contenido de 1/2 de un paquete como una película delgada para cubrir aproximadamente 10 cm2 de la piel en el área de la vacunación planeada. El Imiquimod se frotó bien. El Imiquimod restante se desechó con un nuevo paquete utilizado para cada aplicación.
Se volvió a aplicar Imiquimod en una forma idéntica en el sitio de vacunación 24 horas (+/- 2 horas) después.
Plan de Administración de Vacuna. La vacuna se administró en la dosis asignada a través de inyecciones intradérmicas en 0.5 mi de PBS en los hombros cerca de la parte trasera del cuello para facilitar el tráfico de las DC a los nodos linfáticos cervicales. La vacunación se retrasó por 1 semana sí en el día de la vacunación planeada el paciente tuvo fiebre de >38.3°C o está recibiendo esferoides. Un retraso de más de una semana resultará en que el paciente discontinúe vacunaciones adicionales. Los pacientes se observaron durante 30 minutos después de cada inyección para eventos adversos inmediatos, ya sea sistémicos o locales en el sitio de inyección. Se hizo seguimiento a los pacientes a 48 horas (+/- 4 horas) después de cada vacunación para eventos adversos.
La Figura 10 es un escaneo de MRI que muestra regresión de tumor después de la vacunación con células dendríticas autólogas pulsadas con anticuerpos apoptóticos GBM6-AD irradiados. Esto demuestra prueba terapéutica de concepto en un sujeto humano, que es novedosa para célula de glioma alogeneico.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes se incorporan aquí para referencia. Aunque en la especificación anterior esta invención ha sido descrita con relación a ciertas modalidades de la misma, y muchos detalles se han establecido para propósitos de ilustración, será evidente para aquellos expertos en la técnica que la invención es susceptible a modalidades adicionales y que ciertos detalles aquí descritos pueden variar considerablemente sin apartarse de los principios básicos de la invención.
El uso de los términos "un", "uno", "una" y "el", "la" y referencias similares en el contexto de describir la invención se van a construir para cubrir tanto singular como plural, a menos que se indique de otra forma aquí o se contradiga claramente por contexto. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye", y "que contiene" se van a interpretar como términos de extremo abierto (es decir, que significan "que incluye, pero no está limitado a") a menos que se observe de otra forma. La mención de rangos de valores aquí simplemente pretende servir como un método de atajo para hacer referencia individualmente a cada valor separado que cae dentro del rango, a menos que se indique aquí de otra forma, y cada valor separado se incorpora en la especificación como si se mencionará aquí individualmente. Todos los métodos aquí descritos pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otra forma aquí o se contradiga claramente por contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") aquí proporcionado, pretende simplemente iluminar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se reclame de otra forma. Ningún lenguaje en la especificación debe ser construido como indicando cualquier elemento no reclamado como esencial a la práctica de la invención.
Las modalidades de esta invención se describen aquí, incluyendo el mejor modo conocido para los inventores para llevar a cabo la invención. Las variaciones de estas modalidades pueden volverse evidentes para aquellos expertos en la técnica al leer la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos en la técnica empleen tales variaciones según sea apropiado, y los inventores pretenden que la invención se practique de otra forma a la específicamente aquí descrita. Por consiguiente, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes del tema mencionado en las reivindicaciones anexas según se permita por la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las posibles variaciones de las mismas se abarca por la invención a menos que se indique claramente aquí o se contradiga claramente de otra forma por contexto.

Claims (64)

REIVINDICACIONES
1.- Una composición antitumoral que comprende una célula madre GBM6-AD de glioblastoma purificada.
2.- La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula madre GBM6-AD purificada es una célula adherente.
3. - La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la célula madre GBM6-AD de glioblastoma adherente purificada es PTA-11498 de designación de depósito de patente ATCC®.
4. - La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde las células GBM6-AD son Usadas.
5. - La composición antitumoral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las células GBM6-AD son irradiadas.
6. - La composición antitumoral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende un vehículo no tóxico, farmacéuticamente aceptable.
7.- La composición antitumoral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que además comprende un adyuvante.
8.- La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el adyuvante es un CpG ODN, Poli ICLC, Anexina A2, o un ligando TLR.
9.- La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el adyuvante es un ligando TLR7, TLR8 o TLR7/8.
10. - La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el adyuvante es Imiquimod.
11. - La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el adyuvante es un ligando no TLR que estimula una respuesta inmune.
12. - La composición antitumoral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la célula o Usado de célula se conjuga a un portador.
13.- La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el portador es una célula dendrítica o un macrófago.
14. - La composición antitumoral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la composición está contenida en un portador de no célula.
15. - La composición antitumoral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la composición está contenida en un liposoma.
16. - Un método para producir una respuesta inmune en un animal que lo necesita, que comprende administrar al animal la composición antitumoral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
17. - El método de acuerdo con la reivindicación 16, que además comprende administrar Imiquimod al animal.
18.- El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el Imiquimod se administra antes de la administración de la composición antitumoral.
19. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde la composición antitumoral se administra parenteralmente.
20. - El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la composición se administra intramuscular, subcutánea, intradérmica o intravenosamente.
21. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en donde la composición se administra oral o intranasalmente.
22. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en donde la composición antitumoral se administra a más de un punto de tiempo.
23.- El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la composición antitumoral se administra en dos puntos de tiempo.
24. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en donde la composición antitumoral se administra a una dosis de 100,000-100 millones de células GBM6-AD en cada punto de tiempo de administración.
25. - El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la composición antitumoral se administra a una dosis de 2 x 106 células GBM6-AD en cada punto de tiempo de administración.
26. - El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el Imiquimod se administra tópica, intradérmica, subcutáneamente, y/o a través de inyecciones de nodo intra-linfático.
27.- El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el Imiquimod se administra tópicamente en dos sitios de inyección supraescapular.
28.- El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 27, que además comprende administrar terapia de irradiación al animal.
29. - El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde la terapia de irradiación se administra antes, durante o después de la administración de la composición antitumoral.
30. - El método de acuerdo con la reivindicación 28 ó 29, en donde la terapia de irradiación se administra a una dosis de menos de 6,000 cGY.
31. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en donde la terapia de irradiación se administra durante múltiples puntos de tiempo.
32. - El método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la terapia de irradiación se administra durante tres puntos de tiempo.
33. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, en donde la terapia de irradiación se administra a una dosis de 5220 cGY, seguido por dos dosis adicionales de 360 cGY cada una.
34. - El método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la primera dosis adicional de 360 cGY se administra 10 semanas después de la dosis de 5220 cGY, y la segunda dosis adicional de 360 cGY se administra 14 semanas después de la dosis de 5220 cGY.
35. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34, que además comprende administrar un sensibilizador de radiación al animal.
36. - El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el sensibilizador de radiación es un inhibidor de parp.
37. - El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el sensibilizador de radiación es temozolomida.
38.- El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde la temozolomida se administra durante terapia de radiación inicial.
39. - El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde la temozolomida se administra a una dosis de 5-200 mg/m2/día.
40. - El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde la temozolomida se administra a una dosis de 75 mg/m2/día.
41. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 40, en donde la terapia de radiación es a una ¦ dosis de 5220 cGy en fracciones de 180 cGy.
42. - El método de acuerdo con la reivindicación 41, en donde la terapia de radiación se administra durante 6 a 7 semanas.
43. - El método de acuerdo con la reivindicación 41, que además comprende administrar fracciones de 360 cGy adicionales en fracciones de 180 cGy durante dos días consecutivos a 4 y 8 semanas después de la terapia de radiación inicial.
44.- El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 43, en donde el animal es un mamífero.
45. - El método de acuerdo con la reivindicación 44, en donde el mamífero es un ser humano.
46. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 45, que además comprende administrar terapia de dexametasona al animal.
47. - El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde la terapia de dexametasona se administra en el tiempo de diagnóstico.
48. - El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde al animal se le corta el suministro de dexametasona por la semana 6 de terapia de radiación inicial.
49. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 48, que además comprende administrar una quimioterapia o fármaco que vacía la célula T r egulatoria o células de supresor derivadas de mieloide.
50. - El método de acuerdo con la reivindicación 49, en donde la quimioterapia es sunititib, ontak, ciclofosfamida, gemcitabina, y/o ácido retinoico.
51. - Un método para producir una respuesta inmune en un animal, que comprende introducir en el animal la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
52. - Un método para generar anticuerpos específicos para GBM6-AD, que comprende introducir en un animal la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y aislar anticuerpos específicos para GB 6-AD.
53. - Un método para producir una vacuna de célula dendrítica, que comprende pulsar células dendríticas con la composición antitumoral de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
54. - Un anticuerpo purificado que se une específicamente a una célula madre GBM6-AD de glioblastoma adherente purificada.
55. - El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 54, en donde la célula madre GBM6-AD de glioblastoma adherente purificada es PTA-11498 de Designación de Depósito de Patente ATCC®.
56.- El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 54 o 55, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.
57.- El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 56, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
58.- El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 56, en donde el anticuerpo es un anticuerpo completamente humanizado.
59.- El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 56, en donde el anticuerpo es un Fv de cadena individual o un fragmento de scFv.
60.- Un método para tratar un tumor cerebral primario en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente la composición antitumoral de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el anticuerpo purificado de cualquiera de las reivindicaciones 54-59.
61.- Un uso de la composición antitumoral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el anticuerpo purificado de cualquiera de las reivindicaciones 54-59 para tratar cáncer.
62. - Un uso de la composición antitumoral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el anticuerpo purificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 54-59 para usarse en el tratamiento profiláctico o terapéutico de cáncer.
63. - El método de acuerdo con la reivindicación 60 o el uso de acuerdo con la reivindicación 61 o 62, en donde el tumor cerebral primario es un astrocitoma, glioblastoma multiforme, meduloblastoma o ependimoma.
64. - El método de acuerdo con la reivindicación 63, en donde el tumor cerebral primario es glioblastoma multiforme.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112013010136A2 (pt) 2010-10-25 2019-09-24 Univ Minnesota vacina, composição terapêutica e métodos para o tratamento ou inibição de gliblastoma
US10765654B2 (en) * 2011-07-19 2020-09-08 University Of Vermont And State Agricultural College Methods and compounds for treating cancer
US10028997B2 (en) * 2014-06-04 2018-07-24 Geisinger Health System Systems and methods for attracting and trapping brain cancer cells
EP3209382B1 (en) 2014-10-24 2020-11-25 Calidi Biotherapeutics, Inc. Combination immunotherapy approach for treatment of cancer
WO2016161309A1 (en) * 2015-04-01 2016-10-06 Colorado State University Research Foundation Optimized cancer stem cell vaccines
EP3328495A4 (en) * 2015-07-31 2019-01-16 Swedish Health Services METHODS AND COMPOSITIONS FOR CHARACTERIZING MULTIPLE-FORM GLIOBLASTOMA TUMORS AND CANCER STEM CELLS
CN115212301A (zh) 2015-08-11 2022-10-21 卡利迪生物治疗有限公司 用以癌症治疗的天花疫苗
CA2998472A1 (en) 2015-09-15 2017-03-23 Swedish Health Services Methods and panels of compounds for characterization of glioblastoma multiforme tumors and cancer stem cells thereof
CN113271955A (zh) 2018-11-06 2021-08-17 卡利迪生物治疗有限公司 用于细胞介导的溶瘤病毒疗法的增强的系统
KR102574253B1 (ko) 2020-12-15 2023-09-07 주식회사 시선테라퓨틱스 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 또는 치료용 조성물

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
JPS58201994A (ja) 1982-05-21 1983-11-25 Hideaki Hagiwara 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4559157A (en) 1983-04-21 1985-12-17 Creative Products Resource Associates, Ltd. Cosmetic applicator useful for skin moisturizing
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
LU84979A1 (fr) 1983-08-30 1985-04-24 Oreal Composition cosmetique ou pharmaceutique sous forme aqueuse ou anhydre dont la phase grasse contient un polyether oligomere et polyethers oligomeres nouveaux
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4820508A (en) 1987-06-23 1989-04-11 Neutrogena Corporation Skin protective composition
US4992478A (en) 1988-04-04 1991-02-12 Warner-Lambert Company Antiinflammatory skin moisturizing composition and method of preparing same
US4938949A (en) 1988-09-12 1990-07-03 University Of New York Treatment of damaged bone marrow and dosage units therefor
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
EP0656941B1 (en) 1992-03-24 2005-06-01 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
AU690171B2 (en) 1993-12-03 1998-04-23 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
KR100261941B1 (ko) 1994-07-13 2000-07-15 나가야마 오사무 사람의 인터루킨-8에 대한 재구성 사람항체
EP0822984A4 (en) 1995-04-27 2000-05-03 Human Genome Sciences Inc TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTORS IN MEN
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP4703567B2 (ja) * 2003-05-23 2011-06-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド 膠細胞起源の腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
BR112013010136A2 (pt) 2010-10-25 2019-09-24 Univ Minnesota vacina, composição terapêutica e métodos para o tratamento ou inibição de gliblastoma

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