CN103491978A - 用于治疗成胶质细胞瘤的治疗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗诊断患有多形性成胶质细胞瘤(GBM)的动物的组合物和方法。

Description

用于治疗成胶质细胞瘤的治疗组合物

交叉引用相关申请

本专利申请要求获得2010年10月25日提交的美国临时申请号61/406,429的优先权益处，该申请清楚地通过引用并入本文。

发明背景

多形性成胶质细胞瘤(GBM)是人中常见类型的原发性脑肿瘤，且是非常侵袭性和毁灭性的癌症，存活中值约为一年。(Eramo等人, Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells, Cell Death and Differentiation (2006) 13, 1238-1241)。成胶质细胞瘤具有任何中枢神经系统恶性肿瘤中最差的预后。GBM的治疗是困难的，这是因为其在大脑中的生物位置。目前治疗可以包括化疗、放射、放射外科手术、糖皮质激素、抗血管生成治疗和外科手术。尽管开发了新的手术和放射技术且使用了多种抗肿瘤药物，但是却没有治愈恶性神经胶质瘤。(Eramo等人, Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells, Cell Death and Differentiation (2006) 13, 1238-1241)。成胶质细胞瘤细胞对于细胞毒性剂是耐受的，且在成胶质细胞瘤患者中很短时间期间内复发的高发病率提示肿瘤发生性细胞能够压倒治疗。

发明概述

本发明提供了抗肿瘤组合物，其包含纯化的成胶质细胞瘤GBM6-AD干细胞。在某些实施方案中，细胞是无血清培养基中的贴壁细胞系，其可用于产生抗肿瘤免疫应答。在某些实施方案中，本发明提供了成胶质细胞瘤干细胞系(GBM6-AD)，指定为ATCC^®专利保藏命名PTA-11498。在某些实施方案中，GBM6-AD细胞是裂解的。在某些实施方案中，GBM6-AD细胞是辐射的。在某些实施方案中，抗肿瘤组合物进一步包含生理上可接受的无毒媒介物。在某些实施方案中，抗肿瘤组合物进一步包含佐剂。在某些实施方案中，佐剂是咪喹莫特。在某些实施方案中，佐剂是toll样受体(TLR)配体，如CpG ODN、膜联蛋白A2、聚ICLC、或刺激免疫应答的非TLR配体。在某些实施方案中，组合物与载体如树突状细胞或巨噬细胞缀合。在某些实施方案中，组合物被包含在非细胞载体如脂质体中。

本发明提供了在需要其的动物中引发免疫应答的方法，其包括将上述抗肿瘤组合物施用于动物。在某些实施方案中，动物是哺乳动物，如人或非人哺乳动物。在某些实施方案中，该方法进一步包括将咪喹莫特施用于动物。在某些实施方案中，在施用抗肿瘤组合物之前施用咪喹莫特。在某些实施方案中，肠胃外如肌内、皮下、皮内、或静脉内施用抗肿瘤组合物。然而，其他的施用方式，如口服或鼻内或递送也是可接受的。在某些实施方案中，在多于一个时间点如在两个时间点施用抗肿瘤组合物。在某些实施方案中，以1 μg -100 mg的剂量范围施用抗肿瘤组合物。每个施用时间点的GBM6-AD细胞。在某些实施方案中，在每个施用时间点以2 x 10⁶ GBM6-AD细胞的剂量施用抗肿瘤组合物。在某些实施方案中，局部施用咪喹莫特。在某些实施方案中，在两个肩胛上注射部位局部施用咪喹莫特。

在某些实施方案中，该方法进一步包括将辐射治疗施用于动物。在某些实施方案中，在施用抗肿瘤组合物之前、期间或之后施用辐射治疗。在某些实施方案中，以小于6,000 cGY的剂量施用辐射治疗。在某些实施方案中，在多个时间点施用辐射治疗。在某些实施方案中，在三个时间点施用辐射治疗。在某些实施方案中，以5220 cGY的剂量、和随后的每个360 cGY的两个额外剂量施用辐射治疗。在某些实施方案中，在5220 cGY的剂量后10周施用360 cGY的第一额外剂量，并且在5220 cGY的剂量后14周施用360 cGY的第二额外剂量。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括将辐射敏化剂替莫唑胺施用于动物。在某些实施方案中，辐射敏化剂是“parp抑制剂”(parp是参与DNA修复的蛋白)。在某些实施方案中，辐射敏化剂是替莫唑胺。在某些实施方案中，在初始辐射治疗期间施用替莫唑胺。在某些实施方案中，以5-200mg/m²/天的剂量范围施用替莫唑胺组合物。在某些实施方案中，以75mg/m²/天的剂量施用替莫唑胺。在某些实施方案中，辐射治疗是以180cGy部分的5220 cGY的剂量。在某些实施方案中，经6至7周施用辐射治疗。在某些实施方案中，该方法进一步包括在初始辐射治疗后4周和第8周经连续两天以180cGy部分施用额外360 cGY部分。

在某些实施方案中，动物是哺乳动物，如人。

在某些实施方案中，该方法进一步包括将地塞米松施用于动物。在某些实施方案中，在诊断时施用地塞米松治疗。在某些实施方案中，到初始辐射治疗的第6周使动物断绝地塞米松。

在某些实施方案中，该方法进一步包括施用耗竭调节性T细胞或骨髓源性抑制细胞的化疗或药物。实例包括舒尼替尼(sunititib)、ontak、环磷酰胺、吉西他滨、维甲酸(retionoic acid)。

本发明提供了产生树突状细胞疫苗的方法，其包括用上述抗肿瘤组合物脉冲(pulse)树突状细胞。

本发明提供了在动物中引发免疫应答的方法，其包括将上述组合物引入动物中。

本发明提供了产生对GBM6-AD特异性的抗体的方法，其包括将上述组合物引入动物中，并且分离对GBM6-AD特异性的抗体。

本发明提供了与纯化的贴壁成胶质细胞瘤GBM6-AD干细胞特异性结合的纯化的抗体，这种纯化的粘附性成胶质细胞瘤GBM6-AD干细胞是ATCC^®专利保藏命名PTA-11498。在某些实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，抗体是单链Fv或scFv片段。

本发明提供了在需要其的患者中治疗原发性脑肿瘤的方法，其包括将上述抗肿瘤组合物或与纯化的粘附性成胶质细胞瘤GBM6-AD干细胞特异性结合的纯化的抗体施用于患者。在某些实施方案中，原发性脑肿瘤是星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤或室管膜细胞瘤。

附图概述

图1. 被用作肿瘤抗原来源的GBM6-AD细胞的流式细胞术数据。柱状图显示同种型染色以对照背景结合(灰色)和测试抗体染色(白色)。

图2. 在鼠GBM中咪喹莫特/肿瘤裂解物疫苗延长生存。用GL261神经胶质瘤细胞植入到C57BL/6小鼠的右侧纹状体。在肿瘤攻击后第3、10、17、24、和31天通过皮内注射施用以GL261裂解物的接种。每次将咪喹莫特膏剂施用于皮肤以覆盖接种部位。用盐水治疗的小鼠用作对照(N=5/组)。在接种组中生存明显延长(Log-排序；p=00.06)。

图3. 治疗方案。在辐射治疗(XRT)的前四周期间，一半患者接受替莫唑胺(tem+)且另一半没有接受替莫唑胺(tem-)。以180 cGy部分给予辐射。从第10至14周每两周、然后从16至52周每四周施用咪喹莫特/ BTIC疫苗。

图4. 从在两种氧张力中生长的人成胶质细胞瘤分离的原代细胞。将相同数量的神经胶质瘤细胞接种于由DMEM/F12, 20 ng/ml EGF和FGF和1X B27和N2补充物组成的完全干细胞培养基中。5天后捕捉代表性图像。

图5. 本图提供了在组织培养测定中GBM6裂解物脉冲的DC引发的肿瘤杀伤性T细胞的结果。该数据直接显示GBM6可以产生肿瘤杀伤性免疫应答。

图6A-6C. 在5％氧气中培养的原代GBM细胞系表达高水平的神经胶质瘤相关的和肿瘤起始蛋白。A，通过实时PCR分析5%或20% O₂中培养的三种神经胶质瘤细胞的mRNA水平(n=4/组)和B，通过流式细胞术分析蛋白水平(n=3-4/组)。C，通过western分析验证蛋白水平。* P < 0.05; ** P < 0.01。

图7A-7D. 来自5％氧气的脑TLs表现出优异的肿瘤杀伤性活性。以用来自5%或20% O₂的TL脉冲的DC刺激PBMC，且与A & B HLA-A2匹配的成胶质细胞瘤或C室管膜细胞瘤孵育。D，为了确定增加的肿瘤杀伤性应答是否是MHC-I依赖的，将抗-ABC阻断抗体在PBMC之前添加至靶细胞。数据代表两次独立实验。误差条，± SEM。* P < 0.05; ** P < 0.01。

图8A-8C. 来自5％氧气的肿瘤裂解物增加了CD8 T细胞引发。树突状细胞用5%或20% O₂中衍生的CFSE标记的TL脉冲，用α-HLA-DR染色，且A，通过流式细胞术分析(3次重复的代表)。CMV⁺ PBMC与用5%或20% O₂ TLs +/- pp65肽脉冲的DC共培养持续B ，48h，且分析分泌的IFNγ产生，C ，72h，以确定基于每个细胞的CD8⁺pp65五聚体⁺ IFNγ产生。误差条，± SEM. * P < 0.05; ** P < 0.01 。

图9. 自体外周血来源的dc治疗。

图10. 治疗之前和之后的肿瘤。第一小图时间= 0，第二小图显示两个月后的损伤，且第三小图显示后3个月后的损伤。第二个损伤在3个月后消失。

发明详述

抗肿瘤组合物

以前的研究已经显示，GBM是弥漫性内在脑桥胶质瘤(DIPG)的最常见组织学。相应地，已经表明，DIPG表达GBM相关的免疫原性蛋白，所述免疫原性蛋白是目前临床试验中正在靶向的，包括IL-13Rα2、Epha2、Her-2、和EGFRvIII (Wheeler CJ,等人. Vaccination elicits correlated immune and clinical responses in glioblastoma multiforme patients. Cancer Research. 2008;68:5955-5964; Okada H,等人. Expression of glioma-associated antigens in pediatric brain stem and non-brain stem gliomas. J Neurooncol. 2008;88:245-250; Sampson JH, Archer, G.E., Mitchell, D.A., Heimberger, A.B. & Bigner, D.D. Tumor-specific immunotherapy targeting the EGFRvIII mutation in patients with malignant glioma. Semin Immunol. 2008;20:267-275)。然而，由于DIPG不是外科手术易接近的肿瘤，所以产生细胞裂解物疫苗是困难的。本发明人已经建立了在无血清干细胞培养基中生长的BTIC细胞系GBM6，其可用于用裂解物疫苗治疗DIPG。

本发明也已经建立了亲本GBM6细胞系的变体，命名为GBM6-AD，当其在无血清干细胞培养基时中生长时是贴壁的。如本文所使用的，术语“贴壁细胞系”是指细胞系在完全无血清的条件下作为贴壁单层生长(即，细胞在培养基中作为在人工基质上的单层(贴壁培养)、而不是在培养基中自由漂浮地(悬浮培养)生长)。如本文所使用的，术语“贴壁细胞系”是指细胞甚至在没有用使之贴壁的试剂如纤连蛋白、基质胶或层粘连蛋白处理的标准组织培养瓶(例如，Falcon 75 cm²瓶，10 cm²皿等)上在无血清干细胞培养基中是贴壁的。因此，本细胞附着，甚至在固体基质没有预先处理的情况下附着于固体基质。这是该细胞系的非常罕见且独特的特性。该特征允许在相对于在无血清条件下不贴壁的细胞系更快且更便宜的临床条件下大规模制备细胞。

GBM6-AD比GBM6更广泛地传代，并且随着时间推移，从液氮中解冻后其生长动力学增加。这是相对于GBM6的显著优势，因为可能更快地制备大很多的量的疫苗，这是如果患者正在迅速死亡的重要考虑因素。GBM6还在5% O₂中生长延长的时间期间来产生GBM6-AD，这似乎使细胞变得贴壁，并且重要的是，免疫原性更强。

GBM6-AD在大学的分子和细胞治疗(MCT)设施在10,000级生产套件中在大学的医疗中心临床细胞治疗实验室(FACT-认可的，CAP #18060-01, CLIA #24D0688128)在良好生产规范(GMP)条件下建立的。流式细胞术数据表明，GBM6表达许多重要的DIPG抗原包括IL-13Rα2、Epha2、和Her-2(图1)。此外，GBM6-AD也表达关键的BTIC抗原，包括CD133、巢蛋白、和SOX-2(图1)。基于该数据，GBM6-AD裂解物的接种靶向在脑的其他部位不存在的大多数DIPG和GBM。

成胶质细胞瘤干细胞系GBM6-AD已经保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC^®保藏中心, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)且指定为ATCC^®专利保藏名称PTA-11498。该细胞系在2010年11月18日保藏。在本申请未定期间，专利和商标局局长和要求后由局长授权确定的人员将可获得该保藏物。该保藏物将在ATCC^®保藏中心(这是公共的保藏中心)保持30年、或最近要求后5年、专利可实施期间(其永远更长)，且如果它在此期间没有活力将进行替代。

在某些实施方案中，GBM6-AD细胞是操作的，如裂解的或辐射的。可以通过方法包括多个冻融循环或使用高压气泡(雾化)以“冲击”细胞中的孔而实现裂解。裂解物可以快速或使用速率控制向下冷冻(例如，每分钟1℃)至-80℃或更低的温度而冷冻裂解物用于储存。细胞在产生裂解物之前可以辐射，或可以辐射裂解物本身以确保完全的细胞死亡。可以从多种设备包括铯或钴辐射而递送辐射。

佐剂

疫苗通常含有两个组分：抗原和佐剂。抗原是由免疫应答针对的病原体或肿瘤编码的分子结构。为了激活抗原特异性免疫应答，抗原必须递呈在适当的免疫刺激微环境中。在某些实施方案中，佐剂通过刺激产生免疫激活分子如促炎性细胞因子而建立这种微环境。疫苗效力取决于抗原和佐剂的类型，以及如何施用它们。这些组分之间达到正确的平衡是引发保护性免疫的关键。

1. Toll 样受体

已经估计，大多数哺乳动物物种具有10至15之间的Toll样受体(TLR)类型。在人中已经鉴定了11种TLR(简单命名为TLR1至TLR11)，并且在其他哺乳动物物种中已经发现了许多这些等价形式。TLR作为二聚体起作用。尽管大多数TLR似乎作为同源二聚体起作用，但是TLR2与TLR1或TLR6形成异源二聚体，每种二聚体具有不同的配体特异性。TLRs在所有生物体中的功能似乎类似，足以使用单一作用模型。每种Toll样受体在识别存在于微生物上的特定的或特定组的分子决定簇中形成同源二聚体或异源二聚体。

TLR通过识别病原体相关分子模式和引发炎症而感受感染。因此，已经开发TLR配体作为疫苗佐剂。在某些实施方案中，TLR1至TLR11的配体可以用作佐剂。抗原的摄取和佐剂对TLR信号传递的激活是动态且极端脆弱的过程。理想地，吞噬抗原的抗原递呈细胞(APC)也将占用TLR配体，导致共刺激分子的增量调节、炎性细胞因子的分泌、和抗原递呈至T细胞。当APC加工病毒颗粒(其含有TLR配体(例如，dsRNA)和病毒蛋白)时，这肯定是事实。然而，在癌症疫苗的情况下，已经在混合物中施用抗原和TLR配体。这种方法可以在注射部位导致几种理论结果：吞噬仅抗原的APC、吞噬仅TLR配体的APC或吞噬TLR配体与抗原(期望的结果)的APC。因此，共同施用可以在获得的免疫应答中产生信噪比的问题。甚至当抗原和TLR配体由相同的APC吞噬时，时机是关键的。Nierkens等人最好地表明了这一点，其显示了相对于同时摄取，在抗原之前摄取TLR9配体显著降低了抗原交叉递呈至CTL (Nierkens S,等人, Cancer Res. 2008;68:5390-5396)。相应地，Ingale等人已经表明，相对于用每种组分的混合物接种，通过共价键将TLR2配体与抗原直接缀合使肿瘤反应性IgG的滴度增加了超过100,000倍(Ingale S, 等人, Nat Chem Biol. 2007;3:663-667)。同样，相对于两种组分分开地共同施用，抗原与TLR9配体的偶联使抗原特异性T细胞的数量增加了5至100倍 (Krishnamachari Y, Salem AK. Adv Drug Deliv Rev. 2009;61:205-217)。

咪唑喹啉是已经作为疫苗佐剂利用的双环有机分子。咪喹莫特是FDA批准的免疫应答调节剂，其作为霜剂施用在皮肤上用于治疗皮肤肿瘤。咪喹莫特在人中通过在浆细胞样树突状细胞和B细胞上表达的TLR7发挥其免疫刺激作用。咪喹莫特治疗引起促炎性细胞因子包括干扰素α、干扰素γ、和IL-12(其中所有对于在动物中引发与抗肿瘤和抗病毒活性相关的强大的T_h1免疫应答都是重要的)的释放。局部咪喹莫特已经用作疫苗佐剂，在靶向确定的肿瘤和病毒感染的许多研究中取得了适度成功。然而，通过仅仅依靠TLR7信号传递限制了咪喹莫特的效力，因为在最丰富的专用APC之一，即CD8α⁺TLR7^-髓样树突状细胞中不表达TLR7 (Edwards AD, 等人, Eur J Immunol. 2003;33:827-833) ，从而限制效力。出于这个原因，已经通过修饰咪喹莫特开发了其他化合物。

瑞喹莫特是有效的TLR7和TLR8双重配体(Wu JJ, 等人, Antiviral Res. 2004;64:79-83)。由于TL 8在CD8α⁺髓样树突状细胞中表达，所以它克服了咪喹莫特的限制之一 (Coffman RL, 等人, Immunity;33:492-503)。尽管如此，许多因素已经限制了瑞喹莫特和咪喹莫特的效力。一种最近鉴定的治疗失败的机制是，尽管这些药物诱导促炎性细胞因子，但是它们同时诱导高水平的抗炎性细胞因子如IL-10 (Gibson SJ, 等人, Cell Immunol. 2002;218:74-86; 和Lu H,等人, J Immunol;184:5360-5367)。在临床关联中，应用咪喹莫特霜剂在治疗的肿瘤上起作用，但对于远端肿瘤不起作用，提示全身免疫中的损伤 (Lu H,等人, J Immunol;184:5360-5367;和Gill VL,等人, Vet Comp Oncol. 2008;6:55-64)。事实上，显示在咪喹莫特治疗后阻断IL-10导致治疗的和远端(未治疗的)肿瘤的控制，表明目前使用的咪唑并喹啉诱导的自我调节的细胞因子应答的临床意义。因此，存在开发触发更理想的促炎性细胞因子与抗炎性细胞因子比例的新的基于咪喹并喹啉(imquidazolequinoline)的化合物的需要。在本发明的某些实施方案中，施用TLR-7和/或TLR-8(或TLR-7/8的组合)分子。

聚ICLC是由羧甲基纤维素、聚肌胞苷酸和聚-L-赖氨酸双链RNA组成的免疫刺激剂。它是toll样受体3(TLR3)的配体。

2. 膜联蛋白A2

膜联蛋白A2是在人中由ANXA2基因编码的蛋白。膜联蛋白2参与多种细胞过程，如细胞运动性(尤其是上皮细胞的运动性)，膜相关蛋白复合物与肌动蛋白细胞骨架的连接，细胞内吞作用，纤维蛋白溶解，离子通道形成，和细胞基质相互作用。它是钙依赖性磷脂结合蛋白，其功能是帮助组织细胞内的蛋白胞外分泌至胞外结构域。膜联蛋白2A是多效性蛋白，意味着其功能依赖于在机体中的位置和时间。

3. 寡核苷酸

术语“核酸”或“寡核苷酸”是指至少5个碱基长度的核苷酸的聚合形式。术语“寡核苷酸”包括核酸的单链和双链形式。本发明的核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或任一种核苷酸的修饰形式。通常，双链分子在体内更稳定，尽管单链分子当它们含有合成骨架时具有增加的活性。

如本文所使用的，“寡脱氧核糖核苷酸”(ODN)是约3-1000(或两者之间的任何整数)个碱基长度的脱氧核糖核酸序列。在某些实施方案中，ODN是约3至约50个碱基长度。淋巴细胞ODN摄取受细胞活化调节。例如，摄取CpG ODN的B细胞增殖和分泌增加量的免疫球蛋白。本发明基于下列发现：含有至少一个未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸的某些寡核苷酸激活免疫应答。

“CpG”或“CpG基序”是指具有通过磷酸酯键连接的胞嘧啶和随后的鸟嘌呤的核酸。术语“甲基化的CpG”是指在嘧啶环上、通常发生在嘧啶环的5-位置的胞嘧啶的甲基化。术语“未甲基化的CpG”是指在嘧啶环上的胞嘧啶不存在甲基化。本发明的寡核苷酸中的未甲基化的CpG基序的甲基化、部分除去或除去被认为降低其作用。寡核苷酸中的所有未甲基化的CpG基序的甲基化或除去明显降低其作用。如果该作用类似于不含有CpG基序的寡核苷酸的作用，那么CpG基序的甲基化或去除的作用是“明显的”。

在某些实施方案中，CpG寡核苷酸为约8-1000个碱基大小或约8-30个碱基大小的范围内。对于在本发明中的应用，可以利用本领域众所周知的多种方法之一从头合成核酸。例如，氰乙基亚磷酰胺法 (Beaucage, S. L.,和Caruthers, M. H., Tet. Let. 22:1859,1981); 核苷H-磷酸法(Garegg等人，Tet. Let. 27:4051-4054,1986; Froehler等人，Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407, 1986; Garegg等人，Tet. Let. 27:4055-4058, 1986, Gaffney等人，Tet. Let. 29:2619-2622,1988)。这些化学物可以通过可购得的多种自动寡核苷酸合成仪进行。

或者，CpG 二核苷酸可以在质粒中大规模产生(参见Sambrook, T.,等人， Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989), 它在对受试者施用后降解为寡核苷酸。可以利用已知技术，如使用限制性酶、外切核酸酶或内切核酸酶的技术，由现有的核酸序列(例如，基因组或cDNA)制备寡核苷酸。

本发明的CpG寡核苷酸是免疫刺激分子。“免疫刺激核酸分子”是指核酸分子，其含有未甲基化的胞嘧啶、鸟嘌呤二核苷酸序列(即，“CpG DNA”或含有胞嘧啶和随后的鸟嘌呤且由磷酸酯键连接的DNA)且刺激(例如，对树突状细胞具有促有丝分裂作用，或诱导或增加树突状细胞的细胞因子表达)树突状细胞。免疫刺激核酸分子可以是双链或单链的。通常，双链分子在体内更稳定，而单链分子具有增加的免疫活性。

“核酸”或“DNA”意味着多核苷酸(即，包含与磷酸酯基团和与可交换有机碱基连接的糖(例如，核糖或脱氧核糖)的分子，所述可交换有机碱基是取代的嘧啶(例如，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或取代的嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。如本文所使用的，该术语是指核糖核苷酸以及寡脱氧核糖核苷酸。该术语还应当包括多核苷(即多核苷酸减去磷酸酯)和任何其他含有有机碱基的聚合物。核酸分子可以从现有的核酸来源(如基因组或cDNA)获得，但优选是合成的(例如，通过寡核苷酸合成产生)。

CpG ODN

已经描述了在结构和表型上不同的三种主要类型的CpG ODN。每种类型的实例连同对类型特定的免疫效果和结构特点显示于Krieg中(Krieg, 2006, Nature Reviews Drug Discovery, 5, 471-484)。A类CpG ODN(也称为D型)是干扰素-α(IFNα)分泌(从浆细胞样树突状细胞)的有效诱导剂，但仅微弱刺激B细胞。A类ODN的结构在5'和/或3'末端包括聚-G基序(三个或更多的连续鸟嘌呤)，其能够形成非常稳定、但复杂的有序性更高的被称为G-四分体(G-tetrads)的结构，和含有以自身互补回文的一个或多个CpG基序的中央磷酸二酯区。这些基序引起A类ODN自我装配成纳米颗粒。B类ODN(也被称为K型)具有硫代磷酸酯骨架，通常不形成有序性更高的结构，并且是较强的B细胞刺激剂，但是IFNα分泌的弱诱导剂。但是，如果人工地以树枝状聚合物或用阳离子脂质转染迫使B类CpG ODN进入珠粒或微粒上有序性更高的结构，它们发挥与A类CpG ODN相同的免疫概况，从而将有序性更高结构的形成与生物活性连接起来。C类CpG ODN具有在A和B类之间中间的免疫特性，诱导B细胞活化和IFNα分泌。这些特性似乎由这些ODN具有一个或多个5'CpG基序和3'回文的独特结构所导致，这被认为允许在内体环境中形成双链体 (Krieg, 2006. Nature Reviews Drug Discovery, 5, 471-484; Takeshita F. 等人, 2004. Semin Immunol. 16(1):17-22; Verthelyi D, Zeuner RA., 2003. Trends Immunol. 24:519-522)。

CpG ODN是合成的寡核苷酸，其含有在特定的序列环境中未甲基化的CpG二核苷酸(CpG基序)。与哺乳动物DNA相比，在细菌DNA中CpG基序以20倍更高的频率存在。基于主要参与识别这些分子的免疫细胞的活化，它们诱导一组协调的免疫应答。基于其在CpG基序的关键传感器浆细胞样树突状细胞(PDC)上独特的活性，已经鉴定了两种类型的CpG ODN (Krug A.等人, 2001. Eur J Immunol, 31(7): 2154-63)。CpG-A是浆细胞样树突状细胞(PDC)中IFN-α的有效的诱导剂，而CpG-B是IFN-α的弱诱导剂，但是B细胞的有效活化剂。尽管小鼠和人之间的CpG基序不同，但是在这两个物种中，CpG ODN的识别主要通过TLR9介导(Bauer S.等人, 2001. Proc Natl Acad Sci U S A, 98(16):9237-42)。

最近已经鉴定了新的类型的CpG ODN，被称为CpG-C，其同时具有高PDC诱导和B细胞的活化 (Hartmann G.等人, 2003. Eur J Immunol. 33(6):1633-41)。CpG-C的序列组合CpG-A和CpG-B的元件。最有效的序列被称为M362，其含有具有CG二核苷酸的中央回文序列(CpG-A的特征性特点)，和在5'末端的“TCGTCG基序”(存在于CpG-B中)。

制剂

在某些实施方案中，抗肿瘤组合物制剂在媒介物中含有有效量的纯化的成胶质细胞瘤GBM6-AD干细胞(“活性成分”)，所述有效量由本领域技术人员容易地确定。活性成分，典型地，可以占此组合物的约1％到约95％(w/w)，如果合适的话或者甚至更高或更低。将要施用的量取决于各种因素，例如考虑接种的动物或人受试者的年龄、体重和身体状况。该量还取决于此动物的免疫系统合成抗体的能力以及所期望的保护程度。有效的剂量，可由本领域普通技术人员，通过确定剂量应答曲线的常规试验很容易地确定。通过单次或多次剂量施用生物膜肽或其片段免疫受试者。可以根据需要施用多个剂量。

在某些实施方案中，鼻内制剂包括既不引起对鼻粘膜的刺激也不明显妨碍纤毛功能的媒介物。稀释剂例如水、盐水溶液或其它已知物质能够和本发明一起使用。在某些实施方案中，鼻内制剂还含有防腐剂例如，但不限于氯代丁醇和氯化苄烷铵。在某些实施方案中，存在表面活性剂以提高通过鼻粘膜对本发明的蛋白的吸收。

在某些实施方案中，口服液体制剂是这样的形式，例如水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者是以干燥的在使用之前需要用水或其它合适的媒介物重构的片剂或产品给出。在某些实施方案中，此液体制剂含有常规的添加剂，例如悬浮剂、乳化剂、非水媒介物(可包括食用油)或防腐剂。

在某些实施方案中，为了制备抗肿瘤组合物，被纯化的GBM6-AD如上文所述进行分离、冻干和/或稳定化、裂解。然后将GBM6-AD细胞的量调整到合适的浓度，任选地与合适的佐剂组合，并包装供使用。合适的佐剂，包括但不限于：咪喹莫特；表面活性剂，例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、溴化二甲基二十八烷基铵、N,N-二十八烷基-N′-N-双(2-羟乙基-丙烷二胺)、甲氧基十六烷基-甘油和复合多元醇；聚阴离子，例如吡喃、硫酸右旋糖酐、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(poly IC)、聚丙烯酸、卡巴浦尔；多肽，例如胞壁酰基二肽、二甲基甘油(aimethylglycine)、特夫素、油类乳剂、明矾和它们的混合物。其它潜在的佐剂包括大肠杆菌热不稳定毒素的或霍乱毒素的B肽亚基。McGhee, J.R.,等人，"On vaccine development," Sem. Hematol., 30:3-15 (1993)。最后，可将免疫原性产物掺入到脂质体用于制剂中，或缀合至各种蛋白，例如匙孔 血蓝蛋白(KLH)或人血清白蛋白(HSA)或其它聚合物。

在某些实施方案中，组合物进一步含有一种或多种已知的TLR配体。具体而言，在某些实施方案中，组合物含有膜联蛋白A2(蛋白)或膜联蛋白A2的片段作为新的TLR2配体，其是重要佐剂。在某些实施方案中，TLR配体与GBM-AD中的蛋白通过共价键缀合。在某些实施方案中，TLR配体与GBM6-AD蛋白借助马来酰亚胺化学接头缀合。

施用模式

本发明的抗肿瘤组合物、GBM6-AD衍生疫苗、GBM6-AD反应的T细胞和抗-GBM6-AD抗体可配制成药物组合物并以与选择的施用途径相适应的各种形式施用于哺乳动物宿主，例如人患者，所述施用途径即，口服、鼻内、皮内或肠胃外，或通过静脉内、肌内、局部或皮下途径。

因此，本发明化合物可与药学上可接受的媒介物(例如惰性稀释剂或可吸收的可食用载体)相组合进行全身施用，例如口服施用。可将它们包入硬壳或软壳明胶胶囊中，可压缩成片剂，或可直接与患者饮食的食物直接并入。对于治疗性口服施用，活性化合物可与一种或多种赋形剂混合并以可吸收的片剂、口含片、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、薄片剂等形式使用。所述组合物和制剂应该含有至少0.1％的活性化合物。组合物和制剂的百分比当然是可以变化的，通常可方便地为给定单位剂型重量的约2％至约60％。在这类治疗有用的组合物中活性化合物的量应为能够获得有效剂量水平的量。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可含有以下物质：粘合剂，例如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸氢二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；以及甜味剂，例如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或调味剂，例如薄荷、冬绿油，或樱桃调味剂可以添加。单位剂型为胶囊时，除上述类型的物质外，其还可含有液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其他物质可以包衣形式存在，或用于以其他方式改变固体单位剂型的物理形态。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可用明胶、蜡、紫胶或糖等进行包衣。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、染料及调味剂例如樱桃或橙味调味剂。当然，制备任何单位剂型所用的所有物质应该是药学上可接受的并且在所使用的量下是基本上无毒的。此外，可将活性化合物引入持续释放的制剂和装置中。

活性化合物也可通过输注或注射进行静脉内或腹膜内施用。活性化合物或其盐的溶液可在水中制备，任选地与无毒的表面活性剂混合。分散剂也可在甘油、液态聚乙二醇、三乙酸甘油酯及其混合物中，以及油中制备。在常规贮存及使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

适于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液或分散剂，或者含有适于临时配制无菌可注射或可输注溶液或分散剂的活性成分的无菌粉末，其任选地被包封在脂质体中。在所有情况下，最终剂型在生产和贮存条件下均应该是无菌的、流动的并且稳定的。液体载体或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，包括例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、植物油、无毒的甘油酯、以及它们的合适的混合物。可例如通过形成脂质体、在分散剂情形下通过维持所需的粒度或通过使用表面活性剂从而保持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，防止微生物的作用。在许多情况下，还优选地含有等渗剂，例如糖类、缓冲剂或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，从而延长可注射组合物的吸收。

无菌注射溶液通过将所需量的活性化合物，根据需要与多种以上所列举的其他成分一起加入适当溶剂中，接着进行过滤灭菌来制备。在制备无菌可注射溶液用无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，该方法产生前述过滤灭菌溶液中存在的活性成分与任何其他所需成分的粉末。

对于局部施用，本发明化合物可以纯的形式施用，即，当它们是液体时。但是，通常希望将本发明化合物与皮肤学上可接受的载体相组合，以组合物或制剂形式施用至皮肤上，所述皮肤学上可接受的载体可为固体或液体。

可用的固体载体包括精细分散的固体，例如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。可用的液体载体包括水、醇或二醇或水-醇/二醇掺合物，本发明化合物可任选借助无毒的表面活性剂以有效水平溶解或分散于液体载体中。可添加辅剂例如芳香剂及其他抗微生物剂来优化针对给定用途的性质。得到的液体组合物可通过吸收衬垫施用，用于浸渍绷带及其他敷料，或用泵型喷雾器或气溶胶喷雾器喷洒在受影响的区域。

增稠剂例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐及酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料，也可与液体载体一起使用来形成可延展的膏剂、凝胶剂、软膏、皂剂等，用于直接应用至使用者的皮肤。

可用于将本发明化合物送递至皮肤的皮肤学上可用的组合物的实例为本领域已知的；例如参见Jacquet等人(U.S. Pat. No. 4,608,392), Geria (U.S. Pat. No. 4,992,478), Smith等人(U.S. Pat. No. 4,559,157)和Wortzman (U.S. Pat. No. 4,820,508)。

本发明化合物的可用剂量可通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性而确定。将小鼠及其他动物的有效剂量外推至人类的方法是本领域已知的；例如，参见U.S. Pat. No. 4,938,949。

通常，一种或多种本发明化合物在液体组合物例如洗剂中的浓度可为约0.1-25重量-％、优选约0.5-10重量-％。在半固体或固体组合物例如凝胶或粉末中的浓度可为约0.1-5重量-％，优选约0.5-2.5重量-％。

用于治疗所需的化合物或其活性盐或其衍生物的量，不仅随所选的具体的盐而变化，而且随施用途径、所治疗病况的性质及患者年龄及状况而变化，并最终应由治疗的内科医生或临床医生决定。

但是，通常的合适剂量为每天约0.1至约100mg/kg体重，例如约10至约75mg/kg体重的范围，例如每天3至约50mg/kg受治疗者体重，优选6至90mg/kg/天的范围，最优选15至60mg/kg/天的范围。

化合物通常方便地以单位剂型施用；例如，每单位剂型含有5至1000mg、通常10至750mg、最常用的为50至500mg的活性成分。

理想地，可施用活性成分以获得约0.5至约75μM，优选约1至50μM，最优选约2至约30μM的活性化合物峰值血浆浓度。这可以通过例如静脉内注射0.05至5％活性成分的溶液，任选其盐溶液而实现，或者通过口服含有约1-100mg活性成分的大丸剂进行施用。可通过连续输注提供约0.01-5.0mg/kg/h的活性成分，或通过间歇性输注含有约0.4-15mg/kg的活性成分，从而保持需要的血液水平。

所需剂量通常可以单剂量或以合适的时间间隔施用的分剂量提供，例如每天两次、三次、四次或更多次的亚剂量。所述亚剂量本身还可再分成例如多个不连续的松散间隔的施用；例如通过吹药器多次吸入或通过多次滴入眼中来施用。

治疗方法

可以多种方式治疗患者，包括以下：

疫苗#1: 通过递送将凋亡的GBM6-AD细胞(通过辐射和热休克诱导，所以细胞还活着但正在死亡，并且所有都注定死亡)与适当的佐剂施用至受试者中。

疫苗#2: 通过递送将GBM6-AD细胞裂解物(通过冻融或雾化诱导)与适当的佐剂施用至受试者中。

疫苗#3: 通过递送将用凋亡的GBM6-AD细胞(通过辐射和热休克诱导，所以细胞还活着但正在死亡，并且所有都注定死亡)脉冲的树突状细胞与适当的佐剂施用至受试者中。

疫苗#4: 通过递送将GBM6-AD细胞裂解物(通过冻融或雾化诱导)脉冲的树突状细胞与适当的佐剂施用至受试者中。

疫苗#5: 施用与GBM6-AD融合的树突状细胞与适当的佐剂(细胞融合疫苗)。

疫苗#6: 施用与GBM6-AD融合的B细胞与适当的佐剂(细胞融合疫苗)。

疫苗#7: 施用与源自GBM6-AD的表面的酸洗脱的肽与适当的佐剂。

疫苗#8: 一种或多种上述的任何组合。

在某些实施方案中，使用如上的剂量和佐剂皮内或皮下或淋巴结内注射疫苗持续多个周期。

在某些实施方案中，借助过继性细胞治疗治疗患者。在某些实施方案中，患者施用由GBM6-AD裂解物脉冲的树突状细胞引发的T细胞。

在某些实施方案中，通过施用对GBM6-AD抗原特异性的抗体而治疗患者。

GBM6-AD 抗体和GBM6-AD反应性T细胞和制备抗GBM6-AD抗体和GBM6-AD反应性T细胞的方法

在某些实施方案中，通过用自体GBM6-AD脉冲的树突状细胞引发和使用标准的组织培养方法在培养物中产生GBM6-AD反应性T细胞，并且施用于患者。总之，在某些实施方案中，GBM6-AD直接用作疫苗，或间接地用于产生抗体或T细胞，其随后用作直接治疗。

在某些实施方案中，克隆产生针对GBM6-AD的单克隆抗体的杂交瘤。如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指从一组基本均匀的抗体(换言之，其中除了以少量存在的天然存在的突变体以外构成该组的抗体是均匀的抗体组)获得的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，并且与单一抗原位点相互作用。此外，与通常含有针对不同抗原决定簇的各种抗体的常见多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体靶向抗原上的单一抗原决定簇(表位)。除其特异性以外，单克隆抗体是有利的，因为它们是从不被其他免疫球蛋白污染的杂交瘤培养物产生的。

形容词“单克隆”表明从基本上均匀的抗体组获得的抗体的特征，并且没有指定通过特定方法产生的抗体。例如，用于本发明中的单克隆抗体可以通过，例如杂交瘤方法(Kohler和Milstein，Nature 256:495, 1975)或重组方法(U.S. Pat. No. 4,816,567)产生。用于本发明中的单克隆抗体也可以从噬菌体抗体文库分离(Clackson等人, Nature 352:624-628, 1991; Marks等人, J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991 )。本发明的单克隆抗体尤其包含“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中，重(H)链和/或轻(L)链的部分衍生自特定物种或特定的抗体的类或子类，并且链的剩余部分衍生自另一物种或另一种抗体类或子类。此外，突变抗体和其抗体片段也包括在本发明中(U.S. Pat. No. 4,816,567; Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984)。

如本文所使用的，术语“突变抗体”是指包含变体氨基酸序列的抗体，其中一个或多个氨基酸残基已经改变。例如，抗体的可变区可以进行修饰以改进其生物特性如抗原结合。这样的修饰可以通过下列实现：定点诱变(参见Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985))，基于PCR的诱变，盒诱变，等。这样的突变体包含与抗体的重或轻链可变区的氨基酸序列至少70％相同，更优选至少75％，甚至更优选至少80％，还更优选至少85％，又更优选至少90％，和最优选至少95％相同的氨基酸序列。如本文所使用的，术语“序列同一性”被定义为在比对序列并且适当地引入缺口而使序列同一性必要地最大化之后确定的与抗体的初始氨基酸序列的残基相同的残基的百分比。

具体而言，一个核苷酸序列或氨基酸序列与另一个的同一性可以使用Karlin和Altschul的算法BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, 1993)来确定。基于该算法开发了程序如BLASTN和BLASTX(Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)。为了根据基于BLAST的BLASTN分析核苷酸序列，参数设定为，例如，评分= 100，和字长= 12。另一方面，用于通过基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列的参数包括，例如，评分= 50，和字长= 3。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时使用每个程序的默认参数。这种分析的特定技术是本领域已知的(参见国家生物技术信息中心(NCBI)的网站，Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

可以通过本领域技术人员已知的方法制备多克隆和单克隆抗体。例如，可以通过下述方法制备抗体。

用于免疫动物的GBM6-AD包括裂解和辐射的GBM6-AD细胞。作为用于免疫的抗原，可以在没有修饰的情况下，或者与载体分子缀合之后使用GBM6-AD细胞。当使用载体分子时，例如，将GBM6-AD细胞首先与载体分子偶联，然后向其中添加佐剂。这样的佐剂包括明矾、弗氏完全和不完全佐剂等，其中任何一个都可以组合在一起。

将如上所述制备的抗原给予哺乳动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、马、猴、兔、山羊、和绵羊。可以通过任何现有方法包括通常使用的静脉内注射、皮下注射和腹膜内注射进行这种免疫。关于免疫间隔不存在任何限制。可以以数天至数周、优选4至21天的间隔进行免疫。可以，例如，以10至100 μg (例如，20至40 μg)抗原蛋白的单一剂量免疫小鼠，但剂量不限于这些值。

在第一次免疫前，和第二次和随后的免疫后三至七天，从动物收集血液，并且分析血清的抗体滴度。为了促进免疫应答，优选使用聚集剂如明矾。通常，选择的哺乳动物抗体具有足够高的抗原结合亲和力。可以使用饱和结合测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)，或竞争性测定法(例如，放射免疫测定法)确定抗体亲和力。

可以通过常规的交联分析筛选多克隆抗体，如描述于下列中的方法："Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, Harlow and David Lane edit.(1988))." 。另一种方法是，例如，表位作图 (Champe等人, J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995))。用于确定多肽或抗体滴度的优选方法包括定量抗体结合亲和力。在其他实施方案中，除了或代替用于确定抗体结合亲和力的方法，还使用用于评价抗体的一种或多种生物特性的方法。这样的分析方法是特别有用的，因为它们表明了抗体的治疗效力。当抗体在这样的分析中显示出改进的特性时，其结合亲和力通常是，但不总是，增强的。

可以通过Milstein等人的方法获得用于制备单克隆抗体的杂交瘤 (Kohler, G., 和Milstein, C., Methods Enzymol. 1981, 73, 3-46)。待与产生抗体的细胞融合的骨髓瘤细胞可以是源自本领域技术人员通常可获得的任何各种动物的细胞系，所述动物如小鼠、大鼠、和人。待使用的细胞系是耐药性的，并且在非融合状态在选择性培养基(例如HAT培养基中)中不能存活，但在融合状态下可以存活。通常使用8-氮鸟嘌呤抗性细胞系，其缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并且不可以在次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基中生长。骨髓瘤细胞包括多种已知的细胞系，例如，P3x63Ag8.653(J. Immunol. (1979) 123: 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler, G.和Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H.等人, Cell (1976) 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M.等人, Nature (1978) 276: 269-270), F0 (de St. Groth, S. F.等人, J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21), S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313-323), R210 (Galfre, G. 等人, Nature (1979) 277: 131-133)，和P3U1 (J. Exp. Med. 1979, 150:580; Curr Top Microbiol. Immunol. 1978, 81:1)。人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系也可以用于产生人单克隆抗体 (Kozbar, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, 第51-63页 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。例如，从最后免疫后两至三天处死的动物，收集产生抗体的细胞。产生抗体的细胞包括脾细胞、淋巴结细胞和外周血细胞。通常使用脾细胞。具体而言，从上述各种动物切割或收集组织如脾脏或淋巴结。然后，将组织被压碎，并且将获得的材料悬浮在培养基或缓冲液如PBS、DMEM或RPMI1640中，随后用不锈网等过滤。然后将其离心以获得目的产生抗体的细胞。

然后将上述骨髓瘤细胞和产生抗体的细胞融合。通过在融合促进剂存在的情况下在30至37℃在用于动物细胞培养的培养基如MEM、DMEM和RPMI-1640中以1:1至1:20的比例将骨髓瘤细胞与产生抗体的细胞接触1至15分钟而实现细胞融合。为了促进细胞融合，可以使用商业上可获得的细胞融合装置，使用融合促进剂如聚乙二醇(平均分子量1,000至6,000 (Da))或聚乙烯醇或用于融合的病毒如仙台病毒融合产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞。

在细胞融合后从细胞选择目的杂交瘤。选择方法包括使用在选择性培养基中选择性扩增细胞的方法。具体而言，用适当的培养基稀释细胞悬浮液，并且然后将细胞铺板到微量滴定板中。将选择培养基(例如，HAT培养基)的等分试样加入到各孔中，并且然后培养细胞，同时适当地交换选择培养基。作为结果生长的细胞可以作为杂交瘤保存。

在另一个实施方案中，可以从通过使用McCafferty等人报道的技术产生的抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段 (Nature 348:552-554 (1990))。Clackson等人(Nature 352:624-628 (1991))和Marks等人 (J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)) 报道了从噬菌体文库各自分离小鼠和人抗体。也有报道描述了基于链改组(Marks等人, Bio/Technology 10:779-783 (1992))和组合感染和体内重组(这是用于构建大规模噬菌体文库的方法(Waterhouse等人, Nucleic Acids Res. 21:2265-2266 (1993)))产生高亲和力(nM范围)人抗体。这些技术也可以用于分离单克隆抗体，而不是使用用于产生单克隆抗体的常规杂交瘤技术。

本发明的抗体是提供成胶质细胞瘤的治疗的抗体。

从获得的杂交瘤制备单克隆抗体的方法包括标准的细胞培养方法和包括产生腹水的方法。在细胞培养方法中，在标准培养条件(例如，在37℃在5% CO₂空气)下，在用于动物细胞的培养基如含有10至20%胎牛血清的RPMI-1640或MEM或无血清培养基中培养杂交瘤2至14天，并且然后从培养上清液中制备抗体。在包括产生腹水的方法中，将杂交瘤施用于与衍生骨髓瘤细胞并且杂交瘤在其中大量增殖的物种相同的物种的哺乳动物个体的腹腔。然后一至四周后收集腹水或血清。为了增强腹水产生，例如，可以将姥鲛烷(2,6,10,14 -四甲基十五烷)可以预先施用于腹腔。

可以通过适当选自已知方法的方法纯化待用于本发明中的抗体，所述方法如蛋白A-琼脂糖法、羟基磷灰石层析法、用硫酸盐盐析法、离子交换层析、和亲和层析、或通过其组合使用。

本发明可以使用通过基因工程改造产生的重组抗体。从杂交瘤中分离编码通过上述方法获得的抗体的基因。将基因插入适当的载体中，然后引入到宿主 (参见，例如，Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, 由Macmillan Publishers Ltd 出版于United Kingdom, 1990)。本发明提供了编码本发明的抗体的核酸，和包含这些核酸的载体。具体而言，使用逆转录酶，从杂交瘤的mRNA合成编码抗体的可变区(V区)的cDNA。获得编码目的抗体的可变区的DNA后，将它们与编码期望的抗体的恒定区(C区)的DNA连接，并且将获得的DNA构建体插入表达载体中。可替代地，可以将编码抗体的可变区的DNA插入包含抗体C区的DNA的表达载体中。将这些插入表达载体中，使得基因在表达调控区例如增强子和启动子的调控下表达。然后，用表达载体转化宿主细胞以表达抗体。本发明提供了表达本发明的抗体的细胞。表达本发明的抗体的细胞包括用这样的抗体的基因转化的细胞和杂交瘤。

在本发明中，可以使用人工修饰以降低针对人的异源抗原性的重组抗体。实例包括嵌合抗体和人源化抗体。可以使用已知的方法产生这些修饰抗体。嵌合抗体包括包含彼此不同的物种的可变和恒定区的抗体，例如，包含非人哺乳动物如小鼠的抗体重链和轻链可变区和人的抗体重链和轻链恒定区的抗体。可以通过以下获得这样的抗体：(1)将编码小鼠抗体的可变区的DNA与编码人抗体的恒定区的DNA连接；(2)将其并入表达载体中；和(3)将载体并入宿主中用于产生抗体。

通过用人抗体的CDR取代非人哺乳动物如小鼠的抗体的H或L链互补性决定区(CDR)而获得也被称为重构人抗体的人源化抗体。用于制备这样的抗体的常规基因重组技术是已知的(参见，例如Jones等人, Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann等人, Nature 332: 323-329 (1988); Presta Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992))。具体而言，使用构建以便在其末端包含重叠部分的数种寡核苷酸，通过PCR合成设计用于将小鼠抗体的CDR与人抗体的构架区(FR)连接的DNA序列。可以通过以下获得人源化抗体：(1)将获得的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接；(2)将其并入表达载体中；和(3)将载体转染进宿主中以产生抗体(参见，欧洲专利申请号EP 239,400，和国际专利申请号WO 96/02576)。当CDR形成有利的抗原结合位点时，选择经由CDR连接的人抗体FR。人源化抗体可以包含一个或多个额外的氨基酸残基，所述额外的氨基酸残基既不包括在引入受体抗体的CDR中，也不包括在构架序列中。通常引入这样的氨基酸残基，以便更准确地优化抗体识别和结合抗原的能力。例如，根据需要，可以取代抗体可变区的构架区中的氨基酸，使得重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合位点 (Sato, K.等人, Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。

用于获得人抗体的方法也是已知的。例如，可以通过以下获得具有抗原结合活性的期望的人抗体：(1)用目的抗原或表达目的抗原的细胞在体外敏化人淋巴细胞；和(2)将敏化的淋巴细胞与人骨髓瘤细胞如U266融合 (见审查公开的日本专利申请号 (JP-B) Hei 1-59878)。可替代地，也可以使用抗原来免疫包含人抗体基因的部分或完整所有组成成分的转基因(Tg)动物而获得期望的人抗体 (参见Nature Genetics 7:13-21 (1994); Nature Genetics 15:146-156 (1997); Nature 368:856-859 (1994); 国际专利申请WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, 和WO 96/33735)。具体而言，如下生成这样的Tg动物：通过生成敲除动物或Tg动物，或交配这种动物而获得非人哺乳动物，其中内源免疫球蛋白的重和轻链的基因座已经破坏，并且相反，已经经由酵母人工染色体(YAC)载体等引入人免疫球蛋白重和轻链基因座。免疫球蛋白重链基因座可以在功能上失活，例如，通过在J区或C区(例如，Cμ区)的特定位点引入缺陷。免疫球蛋白轻链(例如，κ链)可以在功能上失活，例如，通过在J区或C区或包含J和C区的区域中的特定位点引入缺陷。

也可以通过使用基因工程改造技术来用编码抗体的重和轻链中每一条的cDNA、或优选包含这些cDNA的载体转化真核细胞，和然后培养产生重组人单克隆抗体的该转化细胞而从培养物上清液中获得这种人源化抗体。宿主是，例如，期望的真核细胞，优选哺乳动物细胞，如CHO细胞，淋巴细胞和骨髓瘤。

此外，通过用人抗体文库淘选获得人抗体的技术是已知的。例如，使用噬菌体展示方法，人抗体可变区表达为噬菌体表面上的单链抗体(scFv)，并且可以选择与抗原结合的噬菌体。通过分析选择的噬菌体的基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。如果鉴定了与抗原结合的scFv的DNA序列，那么可以构建包含这些序列的适当的表达载体，并且然后引入适当的宿主中并且表达以获得人抗体。这样的方法是已经众所周知的 (参见WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, 和WO 95/15388)。

当抗体基因已经分离并且导入适当的宿主中时，可以适当地组合使用宿主和表达载体以产生抗体。作为真核宿主细胞，可以使用动物细胞、植物细胞、和真菌细胞。动物细胞包括：(1)哺乳动物细胞如CHO、COS、骨髓瘤、幼仓鼠肾(BHK)、HeLa、和Vero细胞；(2)两栖类细胞如爪蟾卵母细胞；或 (3)昆虫细胞如sf9、sf21、和Tn5、或桑蚕。已知植物细胞包括来源于烟草属如烟草(Nicotiana tabacum)的细胞，可以对其愈伤组织培养。已知真菌细胞包括酵母如酵母菌属(Saccharomyces genus)、例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、和丝状菌如曲霉菌属、例如黑曲霉(Aspergillus niger)。原核细胞，还可以用在利用细菌细胞的生产系统中。已知细菌细胞包括大肠杆菌和枯草杆菌。可以通过使用转化将目的抗体基因转移至这些细胞中并且然后在体外培养转化的​​细胞而获得抗体。

本发明的抗体的同种型没有限制。同种型包括，例如，IgG (IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)、IgM、IgA (IgA1 和IgA2)、IgD、和IgE。本发明的抗体也可以是包含负责抗原结合的部分的抗体片段或其修饰片段。术语“抗体片段”是指全长抗体的部分，并且通常是指包含抗原结合结构域或可变区的片段。这种抗体片段包括，例如，Fab、F(ab')₂、Fv、包含用适当的接头偶联在一起的重链Fv和轻链Fv的单链Fv (scFv)、双抗体(多种双抗体)、线性抗体、和从抗体片段制备的多特异性抗体。以前，通过用蛋白酶消化天然抗体产生抗体片段；目前，用于使用基因工程改造技术将它们表达作为重组抗体的方法也是已知的 (参见Morimoto等人, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); Brennan等人, Science 229:81 (1985); Co, M. S. 等人, J. Immunol., 1994, 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymology, 1989, 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology, 1989, 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymology, 1989, 121, 663-669; Bird, R. E. 等人, TIBTECH, 1991, 9, 132-137)。

“Fv”片段是最小的抗体片段，并且含有完整的抗原识别位点和结合位点。该区域是二聚体(V_H-V_L二聚物)，其中通过非共价键强烈连接重链和轻链中每一条的可变区。每个可变区的3个CDR彼此相互作用以便在V_H-V_L二聚体的表面上形成抗原结合位点。换言之，来自重和轻链的总共6个CDR一起作为抗体的抗原结合位点发挥作用。然而，已知单独的可变区(或半Fv，其仅含有三个抗原特异性CDRS)能够识别和结合抗原，虽然其亲和力低于整个结合位点的亲和力。因此，本发明的优选的抗体片段是Fv片段，但不限于此。这种抗体片段可以是包含保守的且可以识别和结合抗原的重链或轻链CDR的抗体片段的多肽。

Fab片段(也称为F(ab))还含有轻链恒定区和重链恒定区(CH1)。例如，抗体的木瓜蛋白酶消化产生两种片段：抗原结合片段，被称为Fab片段，其含有重链和轻链的可变区，其充当单一抗原结合域；和剩余部分，其被称为“Fc”，因为它很容易结晶。Fab'片段与Fab片段的不同在于Fab'片段也具有源自重链CH1区的羧基末端的数个残基，其含有来自抗体的铰链区的一个或多个半胱氨酸残基。然而，Fab'片段在结构上等同于Fab，因为两者都是包含重链和轻链的可变区的抗原结合片段，其充当单一抗原结合区。在本文中，包含重链和轻链的可变区(其充当单一抗原结合区且等同于通过木瓜蛋白酶消化获得的那种)的抗原结合片段被称为“Fab样抗体”，甚至当它不同于通过蛋白酶消化产生的抗体片段时。Fab'-SH是在其恒定区具有游离的硫醇基团的一个或多个半胱氨酸残基的Fab'。通过裂解在F(ab')₂的铰链区的半胱氨酸残基之间的二硫键而产生F(ab')片段。其他化学交联的抗体片段对于本领域技术人员也是已知的。抗体的胃蛋白酶消化产生两个片段；一个是F(ab')₂片段，其包含两个抗原结合结构域且可以与抗原交叉反应，而另一个是剩余片段(被称为pFc')。在本文中，当其包含两个抗原结合结构域且可以与抗原交叉反应时，等同于通过胃蛋白酶消化获得的那种的抗体片段被称为“F(ab')₂-样抗体”。也可以，例如，通过基因工程改造产生这种抗体片段。也可以，例如，从上述抗体噬菌体文库分离这种抗体片段。可替代地，可以从宿主如大肠杆菌直接回收F(ab')₂-SH片段，并且然后通过化学交联允许形成F(ab')₂片段 (Carter等人, Bio/Technology 10:163-167 (1992))。在可替代的方法中，可以从重组宿主的培养物直接分离F(ab')₂片段。

术语“双抗体(Db)”是指通过基因融合构建的二价抗体片段 (例如，P. Holliger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP 404,097, WO 93/11161)。通常，双抗体是两条多肽链的二聚体。在每一条多肽链中，在相同链中的轻链可变区域(V_L)和重链可变区域(V_H)经由短接头、例如约5个残基的接头连接，使得它们不可以结合在一起。因为两者之间的接头太短，在相同多肽链中的V_L和V_H不能形成单链V区片段，但反而形成二聚体。因此，双抗体具有两个抗原结合结构域。当组合针对两种类型的抗原(a和b)的V_L和V_H区以便经由约5个残基的接头形成V_La-V_Hb和V_Lb-V_Ha且然后共表达时，它们作为双特异性Db分泌。本发明的抗体可以是这种Db。

可以通过连接抗体的重链V区和轻链V区而制备单链抗体(也称为“scFv”) (对于scFv的综述，参见Pluckthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" 第113卷，编辑 Rosenburg和Moore, Springer Verlag, N.Y., 第269-315页 (1994))。用于制备单链抗体的方法是本领域已知的(参见，例如，U.S. Pat. Nos. 4,946,778; 5,260,203; 5,091,513;和5,455,030)。在所述scFv中，重链V区和轻链V区经由接头(优选多肽接头)共同连接(Huston, J. S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1988, 85, 5879-5883)。scFv中重链V区和轻链V区可以来源于相同抗体或不同抗体。用于连接V 区的肽接头可以是任何单链肽，所述单链肽由12至19个残基组成。使用作为模板的整个DNA或编码期望氨基酸序列的部分DNA(其选自编码上述抗体的重链或重链的V区的DNA和编码上述抗体的轻链或轻链的V区的DNA)；和使用定义两个末端的引物对通过PCR扩增编码scFv的DNA。随后可以使用编码肽接头部分的DNA和定义用于与重和轻链分别连接的DNA的两个末端的引物对进行进一步扩增。构建编码scFv的DNA后，可以使用常规方法来获得包含这些DNA的表达载体，和通过这些表达载体转化的宿主。此外，可以根据常规方法使用获得的宿主获得scFv。可以通过获得编码抗体片段的基因且如上文所述表达这些而在宿主中产生这些抗体片段。可以使用与不同类型的分子如聚乙二醇(PEG)结合的抗体作为修饰的抗体。用于修饰抗体的方法是本领域中已经建立的。本发明中的术语“抗体”还包括上述抗体。

可以将获得的抗体纯化至均一。可以通过常规用来分离和纯化蛋白的方法分离和纯化抗体。可通过组合使用适当选自以下的一种或多种方法来分离和纯化抗体：例如，柱层析法、过滤、超滤、盐析、透析、制备聚丙烯酰胺凝胶电泳和等点聚焦 (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak等人编， Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。此方法不限于以上列出的那些。层析法包括亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析和吸附层析。这些层析法可以利用液相层析(如HPLC和FPLC)来实施。亲和层析中所用柱包括蛋白A柱和蛋白D柱。例如，蛋白A柱包括Hyper D、POROS、和Sepharose F. F. (Pharmacia)。抗体可以通过利用抗原结合，使用其上已经固定抗原的载体进行纯化。

可以根据标准方法配制本发明的抗体(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Science, 最新版, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A)，并且可以包含药学上可接受的载体和/或添加剂. 本发明涉及组合物(包括试剂和药物)，其包含本发明的抗体、和药学上可接受的载体和/或添加剂。示例性载体包括表面活性剂(例如，PEG和Tween)、赋形剂、抗氧化剂(例如，抗坏血酸)、着色剂、调味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂(例如，磷酸、柠檬酸和其他有机酸)、螯合剂(例如，EDTA)、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、和矫味剂。然而，可以用于本发明中的载体不限于此列表中。实际上，可以适当地采用其他常用载体：轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露糖醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯乙缩醛二乙氨基乙酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。组合物还可以包含其他低分子量多肽，蛋白如血清白蛋白、明胶、和免疫球蛋白，和氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸。当组合物作为注射用水溶液制备时，它可以包含等渗溶液，包含例如生理盐水、葡萄糖和其他佐剂(包括，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠)，所述溶液还包括合适的助溶剂，例如醇(例如乙醇)、多元醇 (例如丙二醇和PEG)、以及非离子性去污剂 (聚山梨醇80 和HCO-50)。

如果必要，本发明的抗体可以封装在微胶囊中(羟甲基纤维素、明胶、聚甲基丙烯酸甲酯等制成的微胶囊), 和制成胶体药物递送系统的组分 (脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒和纳米胶囊) (例如，参见 "Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980))。而且已知制备缓释药物的方法，且可以用本发明的抗体应用这些 (Langer等人，J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982); U.S. Pat. No. 3,773,919;欧洲专利申请号58,481; Sidman等人，Biopolymers 22: 547-556 (1983); EP: 133,988)。

上述本发明的抗体可以用于治疗患有成胶质细胞瘤的个体。

下列实施例用来说明但非限制本发明。

实施例1

本发明人已经开发了新的疗法，其利用用咪喹莫特和脑肿瘤起始细胞(BTIC)疫苗的免疫治疗用于治疗弥漫性内在脑桥胶质瘤(DIPG)，这是一种致命的脑肿瘤，主要发生在童年和年轻成年期间。大多数DIPG的组织学是多形性成胶质细胞瘤(GBM)，WHO IV级(Tsuchida T, Shimbo Y, Fukuda M,等人.Computed tomographic and histopathological studies of pontine glioma.Child ’s Nerv Syst.1985;1:223- 229)。过去的经验已经显示，DIPG对辐射治疗响应，但只是短暂的。大多数儿童受这种肿瘤折磨，在诊断两年内死亡。迄今为止用辅助化疗和/或同时辐射敏化剂显著改善效果的尝试都失败了(Frazier JL, Lee J, Ulrich WT,等人.Treatment of diffuse brainstem gliomas:failed approaches and future strategies.J Neurosurg Pediatrics.2009;3:259-269)。基于来自美国中央脑肿瘤登记处(The Central Brain Tumor Registry of the United State, CBTRUS)的统计，在0至19岁年龄组中脑干肿瘤的每年发病率在未来几年内预计超过450例。在这些中，超过360例将是具有恶性DIPG的儿童和年轻成人(美国中央脑肿瘤登记处。2009年7月16日从报告和表格网站获得：http://cbtrus.org/reports/2009-NPCR-04-05/CBTRUS-NPCR2004-2005-Report-.pdf. 2009)。预计这些年轻人中很少存活。这种治疗导致在受这种疾病折磨的年轻人中的存活增加。

树突状细胞(DC)在抗原递呈和引起适应性免疫应答中发挥了关键作用的发现打开了操作它们治疗GBM的可能性。Liau等人在2000年公开了首次使用肿瘤肽脉冲的DC接种用于神经胶质瘤患者；该研究记载了尽管疾病进展的肿瘤反应性T细胞(Liau LM,等人.Treatment of a patient by vaccination with autologous dendritic cells pulsed with allogeneic major histocompatibility complex class I-matched tumor peptides. Case Report. Neurosurg Focus.2000;9:e8)。从那时起，用肿瘤裂解物脉冲的自体DC对GBM患者接种能够引发抗原特异性CD8⁺ T细胞并且与接受标准治疗的历史对照患者中30周相比使中值存活增加至133周(Yu JS, 等人.Vaccination with tumor lysate-pulsed dendritic cells elicits antigen-specific, cytotoxic T-cells in patients with malignant glioma.Cancer Research.2004;64:4973-4979)。Yamanaka等人报道了在I/II期临床试验中在真皮下注射肿瘤裂解物脉冲的DC或同时瘤内和真皮下接种后类似的结果。四位患者显示临床响应，10位显示肿瘤稳定，并且10位具有肿瘤进展(Yamanaka R, 等人.Clinical evaluation of dendritic cell vaccination for patients with recurrent glioma: results of a clinical phase I/II trial. Clin Cancer Res. 2005;11:4160-4167)。在最近的II期研究中，CTL响应于DC接种而精细产生IFN-γ的能力与临床响应和总体存活显著相关(Wheeler CJ, 等人.Vaccination elicits correlated immune and clinical responses in glioblastoma multiforme patients. Cancer Research. 2008;68:5955-5964)。尽管存在这些有希望的结果，但是大多数患者最终屈服于他们的疾病。如果特异性设计针对耐辐射的脑肿瘤起始细胞，那么免疫治疗将更加成功。

脑肿瘤起始细胞：标记和对免疫治疗的意义

过去15年的研究表明，细胞的异质性群体构成肿瘤，并且它们中只有亚组能够自我更新、起始肿瘤和部分分化(Beachy PA, Karhadkar SS, Berman DM. Tissue repair and stem cell renewal in carcinogenesis. Nature. 2004;432:324-331中综述)。肿瘤起始细胞在1990年代牢固确立存在于急性骨髓性白血病中(Lapidot T, 等人. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 1994:367:645-648; Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 1997;3:730-737)，并且最近在原发性脑肿瘤如成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤中(Ignatova TN, 等人.Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia.2002;39:193-206; Singh SK, 等人.Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 2004;432:396-401; Singh SK, 等人.Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research.2003;63:5821-5828; Galli R, 等人.Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.Cancer Research.2004;64:7011-7021; Li MC, 等人.Isolation and characterization of brain tumor stem cells in human medulloblastoma. Ai Zheng.2006;25:241-246)是在造血和神经干细胞中表达的120-kDa跨膜糖蛋白，其已经用作脑肿瘤起始细胞(BTIC)的标记。Singh等人表明，少至100个CD133⁺神经胶质瘤细胞能够在免疫缺陷小鼠中形成肿瘤，而从移植的相同大肿瘤块分离的100,000个CD133^-肿瘤细胞但没有形成肿瘤。(Singh SK,等人. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 2004;432:396-401)。此外，在复发患者中肿瘤块中CD133⁺细胞的百分比增加，并且CD133表达现在已经用于预测低级别神经胶质瘤中的疾病进展 (Zeppernick F, 等人. Stem Cell Marker CD133 Affects Clinical Outcome in Glioma Patients. Clin Cancer Res. 2008;14:123-129)。然而，CD133不是仅有的BTIC的标记，因为来自神经胶质瘤的亚组的CD133^-细胞是肿瘤起始的 (Beier D,等人. CD133+ and CD133- Glioblastoma-Derived Cancer Stem Cells Show Differential Growth Characteristics and Molecular Profiles. Cancer Research. 2007;67:4010-4015)。Lee等人已经鉴定了符合BTIC的重要标准的从人GBM分离的巢蛋白⁺Sox-2⁺细胞 (以低细胞数的肿瘤起始) (Lee J, 等人. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 2006;9:391-403)。这些CD15⁺ BTIC在移植进小鼠脑部后形成非常侵袭性的肿瘤，并且它们的基因表达信号与原发性肿瘤中的基因表达信号非常相似 (Lee J, 等人. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 2006;9:391-403)。尽管CD133和Sox-2是有用的标记，但是它们不能总是自身预测肿瘤起始。然而，表达CD133的细胞似乎特别优先在辐射和化疗后存活，这使得通过免疫治疗来靶向它们非常重要。从本研究中出现的关键概念是，脑肿瘤由具有有限的肿瘤生成潜能的大块肿瘤细胞和BTIC构成的。BTIC可能只占总的肿瘤细胞的部分，但是可能是无情的肿瘤更新和疾病进展的来源。

使用辐射作为疫苗敏化剂的基本原理。Bao等人已经显示，CD133⁺细胞通过优先激活检查点激酶Chk1、Chk2而表现出相对于它们的CD133^-子细胞对电离辐射增加的耐受性 (Bao S, 等人. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 2006;444:756-760)。尽管CD133⁺和CD133^-细胞表现出类似的DNA损伤，但是相对于CD133^-细胞，CD133⁺细胞在每个剂量的辐射后修复损伤更迅速并且更富集 (Bao S, 等人. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 2006;444:756-760)。在精细的研究中，Gasser等人表明，DNA损伤通路调节NKG2D受体的固有免疫系统配体 (Gasser S, Orsulic, S., Brown, E.J. & Raulet, D.H. The DNA damage pathway regulates innate immune system ligands of the NKG2D receptor. Nature. 2005;436:1186-1190)。他们确定，辐射诱导的NKG2D配体表达的分子基础是诱导Chk1/2激活。此外，Chk1抑制的NKG2D配体增量调节的药理学抑制清楚地揭示，辐射通过检查点激酶途径增加细胞的免疫原性。然而，使用正常细胞和肉瘤细胞进行这些研究 (Gasser S, Orsulic, S., Brown, E.J. & Raulet, D.H. The DNA damage pathway regulates innate immune system ligands of the NKG2D receptor. Nature. 2005;436:1186-1190)。然而，如果这些结果适用于神经胶质瘤细胞，那么预计CD133⁺细胞用于在辐射治疗后存活的相同通路(通过Chk1的信号传递)通过增量调节NKG2D配体而优先使它们对自然杀伤或T细胞的细胞介导的裂解敏感。如果是真实的，这将代表CD133⁺细胞的“阿喀琉斯之踵”，其被定义为“尽管整体强大，但是具有致命弱点，实际或可能导致衰败。”在某些实施方案中，本发明使用辐射与BTIC靶向的免疫治疗的组合用于治疗DIPG。

靶向BTIC抗原：神经胶质瘤细胞的培养条件对于免疫治疗具有至关重要的意义。几十年来，为了理解神经胶质瘤生物学和研究潜在治疗进行的研究已经依赖于使用在血清中培养的神经胶质瘤细胞系。相应地，在最近的临床试验(其中GBM患者用肿瘤细胞裂解物或肽脉冲的DC接种)中，在血清中培养和扩增肿瘤细胞 (Yu JS, 等人. Vaccination with tumor lysate-pulsed dendritic cells elicits antigen-specific, cytotoxic T-cells in patients with malignant glioma. Cancer Research. 2004;64:4973-4979; Yamanaka R, 等人. Clinical evaluation of dendritic cell vaccination for patients with recurrent glioma: results of a clinical phase I/II trial. Clin Cancer Res. 2005;11:4160-4167; Yamanaka R, 等人. Vaccination of recurrent glioma patients with tumour lysate-pulsed dendritic cells elicits immune responses: results of a clinical phase I/II trial. Br J Cancer. 2003;89:1172-1179)。两个很好对照的研究最近已经表明，BTIC在血清中的培养引起分化，导致增强基因组不稳定性，加速遗传突变，并且导致与原发性肿瘤急剧不同的总体基因表达模式和表型 (Lee J, 等人. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 2006;9:391-403; Gunther HS, 等人. Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene. 2007)。相比之下，在用EGF和FGF补充的神经干细胞培养基中培养原代肿瘤细胞防止分化。这些神经球培养物当异种移植进小鼠脑部时概括了原发性肿瘤的基因型、基因表达模式和表型 (Lee J, 等人. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 2006;9:391-403; Gunther HS, 等人. Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene. 2007)。应当考虑这些最近的发现，因为进行了开发更有效的免疫治疗的尝试。当用肿瘤裂解物脉冲DC并且作为疫苗施用时，裂解物中的蛋白抗原在DC内加工并且递呈至MHC I和MHC II上以便引发对这样的抗原应答的原初T细胞。因此，可能到现在为止，裂解物脉冲的DC疫苗已经被偏向于仅仅靶向在初始肿瘤上表达的抗原亚组，并且可能这些中的很少(如果有的话)是BTIC特异性抗原，因为抗原来源在血清中培养。一项研究现在已经提供了支持这种假说的证据。Pellegata等人已经显示，与用血清培养的神经胶质瘤细胞裂解物脉冲的DC接种的小鼠相比，用神经球培养裂解物脉冲的DC接种的小鼠具有优异的治疗应答(Pellegatta S, 等人. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Research. 2006;66:10247-10252)。换言之，DC疫苗试验已经进行的方式可能产生信噪比的问题。在目前项目中，胶质瘤细胞培养物源自初始肿瘤，并且在神经干细胞培养基中培养以富集重要BTIC抗原的临床相关表型和表达。

咪喹莫特加上肿​​瘤细胞裂解物是有效的抗胶质瘤疫苗

咪喹莫特是FDA批准的免疫应答调节剂，其作为霜剂施用在皮肤上用于治疗皮肤肿瘤。咪喹莫特在人中通过在DC和B细胞上表达的toll样受体7(TLR7)发挥其免疫刺激作用。咪喹莫特治疗引起促炎性细胞因子包括干扰素α、干扰素γ、IL-12(所有对于在动物中引发与抗肿瘤活性相关的强大的Th1免疫应答都是重要的)的释放。局部咪喹莫特已经用作疫苗佐剂，在靶向确定的肿瘤和病毒感染的许多研究中取得了成功(Adams S, 等人. Immunization of malignant melanoma patients with full-length NY-ESO-1 protein using TLR7 agonist Imiquimod as vaccine adjuvant. J Immunol. 2008;181:776-784; Johnston D, Bystryn JC. Topical Imiquimod is a potent adjuvant to a weakly-immunogenic protein prototype vaccine. Vaccine. 2006;24:1958-1965; Craft N,等人. The TLR7 agonist Imiquimod enhances the anti-melanoma effects of a recombinant Listeria monocytogenes vaccine. J Immunol. 2005;175:1983-1990; Harrison CJ, Miller RL, Bernstein DI. Reduction of recurrent HSV disease using Imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine. Vaccine. 2001;19:1820-1826; Bernstein DI, Miller RL, Harrison CJ. Adjuvant effects of Imiquimod on a herpes simplex virus type 2 glycoprotein vaccine in guinea pigs. J Infect Dis. 1993;167:731-735)。基于这以前的工作，测试肿瘤细胞裂解物疫苗在小鼠模型中的效力。具有同源GL261胶质瘤的近交系C57BL/6小鼠通过用GL261细胞裂解物的真皮内接种进行处理，藉此在临注射前将咪喹莫特施加至接种部位。施用盐水作为对照。与对照相比，用咪喹莫特/肿瘤裂解物接种处理的小鼠明显存活更长，包括20％的长期存活(图2；p<0.01)。

处理模式。本处理模式(图3)基于上述数据，和关于辐射增加肿瘤细胞的免疫原性的已知信息。BTIC细胞系(GBM-6)被用作疫苗来源。经6至7周给予以180cGy部分的5220 cGy的剂量的共形辐射治疗用于诱导，以尝试实现微小残留病(minimal residual disease)。在初始辐射治疗结束后4周和8周，经连续两天将额外360 cGy部分以180cGy部分递送，作为诱导NKG2D配体增量调节的新的努力(从而使残留肿瘤对结合的淋巴​​细胞“敏化”)。因此，对于每位患者的总辐射剂量为5940 cGy。患者分为两组；对于佐剂抗肿瘤作用和辐射敏化，在辐射治疗的前四周过程中将替莫唑胺75mg/m²/天给予第1组。据预计，替莫唑胺将引起淋巴细胞减少。为了使免疫恢复向DIPG中表达的肿瘤抗原(如IL-13Rα2、Epha2、Her-2)特异性的T细胞偏斜，在该组患者中在随后淋巴细胞恢复过程中递送疫苗。最近的数据已经显示，T调节性细胞可能是在替莫唑胺恢复过程中延迟的主要淋巴细胞亚群，因此，第2组用无佐剂的替莫唑胺处理。在初始辐射治疗已经完成后，这些患者可能从其他机构转诊后呈现给我们。所有其他患者被随机分到替莫唑胺或无替莫唑胺组。通过对在疫苗治疗开始之前和之后收集的外周血单核细胞进行流式细胞术在两组之间比较T reg数量和免疫应答。在辐射治疗完成后第四周开始疫苗施用，且每两周给予，共4个剂量。随后每4周给予增强剂，且继续至从辐射治疗开始一年的最大量，至此时，基于历史数据，生存中值将已经通过。

注意上面的剂量指南，根据明尼苏达大学儿童医院的护理标准给予辐射治疗。所有患者用强度调节的辐射治疗(IMRT)或等同共形技术治疗。临床靶体积被定义为大体肿瘤体积(MRI上可见肿瘤的所有范围)加1 cm边缘。

在诊断时，大多数患者，如果不是所有患者，将被置于地塞米松治疗上。将做出努力以便至初始辐射治疗的第6周使所有患者戒掉地塞米松，以便使疫苗施用前免疫重建成为可能。

通过首先在两个肩胛上注射部位局部施用咪喹莫特而完成疫苗施用。然后在每个施用时间点以约2 x 10⁶裂解的γ-辐射的GBM6-AD细胞/每剂量以两个分开的剂量真皮内给予疫苗。

实施例2

树突状细胞(DC)接种是强大的癌症免疫治疗方法，其最近已经获得监管批准，并且肿瘤裂解物脉冲的DC疫苗正在临床试验中测试。经常从在大气氧(~20% O₂)中培养的细胞生成肿瘤细胞裂解物(TL)，所述大气氧高于原位肿瘤中的O₂张力。已经发现，在5% O₂中培养鼠肿瘤细胞深度增强了TL疫苗的效力。因此，本发明人力图确定在5% O₂中培养原代人脑胶质瘤细胞是否将增强DC功效和肿瘤抗原表达。不同于在20% O₂中培养的原代成胶质细胞瘤细胞，在5% O₂中培养显示向在亲本肿瘤原位的基因表达模式的部分回复。此外，5% O₂ TL被DC更有效地摄取，其表现出将抗原递呈至CD8 T细胞的优异能力。由5% O₂裂解物-脉冲的DC引发的CD8 T细胞相对于由20% O₂ TL引发的那些具有显著改进的肿瘤杀伤功能。本发明人的结果共同地表明，组织培养物O₂可以：i)使靶抗原的表达偏移以更好地反映原位肿瘤，ii)增加DC对于抗原递呈的功效，iii)增强CD8 T细胞的效应功能。这些结果对于增强TL-脉冲的DC疫苗的疗效具有广泛意义。基于这些数据，已经使用用在无血清条件下在5% O₂中扩增的胶质瘤细胞脉冲的DC起始临床试验。

利用用肿瘤相关抗原脉冲的树突状细胞(DCs)的治疗性接种是用于癌症免疫治疗的有希望的方法 (Ridgway D. The first 1000 dendritic cell vaccines. Cancer Invest 2003; 21: 873-86)。美国食品和药物管理局最近批准了肽脉冲的DC疫苗用于治疗去势耐受的前列腺癌 (DeFrancesco L. Landmark approval for Dendreon's cancer vaccine. Nat Biotechnol; 28: 531-2; Kantoff PW, Higano CS, Shore ND, 等人. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med; 363: 411-22)。肿瘤细胞经常用作用于DC疫苗的抗原的来源。使用肿瘤细胞和肿瘤细胞裂解物(TL)的疫苗具有多个优势，包括靶向多个患者特异性的肿瘤抗原。TL-脉冲的DC接种在许多恶性肿瘤的早期临床试验中已经表现出令人鼓舞的结果，但是明显需要额外的改进 (Le DT, Pardoll DM, Jaffee EM. Cellular vaccine approaches. Cancer J; 16: 304-10)。

仍然不清楚的是，组织培养可能如何影响肿瘤细胞疫苗诱发的抗肿瘤免疫应答。在含有血清的培养基中培养的原代成胶质细胞瘤细胞在基因和表型上非常不同于初始肿瘤，而相同细胞在无血清条件下的培养更紧密地反映初始肿瘤，并且富集癌干细胞表型 (Lee J, Kotliarova S, Kotliarov Y,等人. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell 2006; 9: 391-403)。当用于在小鼠模型中的TL-脉冲的DC疫苗时，与源自含有血清的培养基的那些相比，在无血清条件下生成的胶质瘤细胞裂解物更有效 (Pellegatta S, Poliani PL, Corno D,等人. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res 2006; 66: 10247-52)。传统地，肿瘤细胞疫苗源自在大气氧(~ 20.95%；此后为20% O₂)中保持的培养物，所述大气氧远不同于在原位成胶质细胞瘤中测量的小于6% O₂的平均氧张力(Evans SM, Judy KD, Dunphy I, 等人. Hypoxia is important in the biology and aggression of human glial brain tumors. Clin Cancer Res 2004; 10: 8177-84)。确立的是，氧影响基因表达、细胞代谢、增殖、生存 (van den Brenk HA, Moore V, Sharpington C, Orton C. Production of metastases by a primary tumour irradiated under aerobic and anaerobic conditions in vivo. Br J Cancer 1972; 26: 402-12; Sciandra JJ, Subjeck JR, Hughes CS. Induction of glucose-regulated proteins during anaerobic exposure and of heat-shock proteins after reoxygenation. Proc Natl Acad Sci U S A 1984; 81: 4843-7; Pouyssegur J, Dayan F, Mazure NM. Hypoxia signalling in cancer and approaches to enforce tumour regression. Nature 2006; 441: 437-43; Gordan JD, Simon MC. Hypoxia-inducible factors: central regulators of the tumor phenotype. Curr Opin Genet Dev 2007; 17: 71-7)，并且缺氧增加肿瘤干细胞标记CD133、巢蛋白和SOX2的表达 (Platet N, Liu SY, Atifi ME, 等人. Influence of oxygen tension on CD133 phenotype in human glioma cell cultures. Cancer Lett 2007; 258: 286-90; McCord AM, Jamal M, Shankavaram UT, Lang FF, Camphausen K, Tofilon PJ. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol Cancer Res 2009; 7: 489-97; Li Z, Bao S, Wu Q, 等人. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell 2009; 15: 501-13)。然而，氧对肿瘤细胞免疫原性的影响却知之甚少。

本结果表明，在20% O₂中培养原代神经胶质瘤细胞引起了基因表达远离初始肿瘤的总体偏移，这被在5% O₂培养细胞部分逆转。值得注意的是，已知引发T细胞应答的几种胶质瘤抗原的表达在5% O₂中增加。在5% O₂中生长的原代人胶质瘤细胞表现出固有的佐剂特性，如优异的DC摄取、抗原递呈和肿瘤杀伤性CD8 T细胞的引发所评价的。因此，在5% O₂在无血清培养基中生长的原代人胶质瘤细胞作为肿瘤细胞疫苗的演变中最新的改进而出现。

材料与方法

肿瘤细胞培养：将手术切除的胶质瘤(表1)酶分离，并且在神经干细胞培养基中培养 (Wu A, Oh S, Wiesner SM,等人. Persistence of CD133+ cells in human and mouse glioma cell lines: detailed characterization of GL261 glioma cells with cancer stem cell-like properties. Stem Cells Dev 2008; 17: 173-8)。

表1. 肿瘤鉴定、患者信息、和其中使用肿瘤的实验和细胞代数的表格。* 表明肿瘤在Mayo Clinic, Rochester MN切割；其他在University of Minnesota Medical Center, Fairview切割。GBM=多形性成胶质细胞瘤, Epd = 室管膜瘤，FC =流式细胞术，CTL = 细胞毒性测定。

除非明确规定，所有组织培养均保持在20% O₂。在如所述使用之前，通过在5% O₂维持至少30天从20% O₂培养物转化标记为“5% O₂”的培养物 (Olin MR, Andersen BM, Zellmer DM,等人. Superior efficacy of tumor cell vaccines grown in physiologic oxygen. Clin Cancer Res; 16: 4800-8)。

微阵列：从切割时突然冷冻的组织或来自5%或20% O₂的培养细胞分离总RNA。使用全基因组基因表达DASL测定(Illumina, San Diego, CA)分析18,401个基因的表达水平。

根据制造商说明使用RNEasy^® Plus Mini试剂盒(Qiagen^®, Valencia, CA)从在切割时突然冷冻的组织或在5%和20% O₂生长的细胞分离总RNA。用Agilent 2100生物分析仪(Santa Clara, CA.)进行质量对照。使用全基因组基因表达DASL测定(Illumina, San Diego, CA)来分析18,401个基因的表达水平。简而言之，使用混合的poly-T和随机九聚引物从来自每份样品的100 ng总RNA合成生物素化的cDNA。杂交生物素化的cDNA以测定寡核苷酸，其随后与链霉亲和素缀合的顺磁颗粒结合。延伸和连接寡核苷酸，生成模板，所述模板用随机的荧光引物扩增。荧光标记的产物与在Illumina HumanRef-8_V1 Expression BeadChip上每个微阵列上含有的24,631个寡核苷酸探针结合，并且用激光共聚焦显微镜分析。对于患者2的每种条件和来自患者1的组织，分析三个技术重复。对于源自患者1的细胞系进行两个技术复制。

如前所述分析阵列数据的质量对照 (Sarver AL. Toward understanding the informatics and statistical aspects of micro-RNA profiling. J Cardiovasc Transl Res; 3: 204-11)，分位数均一化，并且将每种基因的多个探针平均化。对于每组实验(肿瘤，20％和5％氧)，将每个实验值除以20% O₂培养物的平均值，以确定不依赖于不同肿瘤之间差异的状态之间的差异。使用两组t检验以及平均倍数变化来确定差异表达的基因。

定量RT-PCR：使用SYBR Green一步PCR母液混合物(Qiagen^®)通过实时RNA分析提取的RNA。以下条件用于在ABI PRISM 7500热循环仪中的PCR：95℃持续15 min; 94℃持续30s, 55℃持续30s, 68℃持续30s，总共40个循环；72℃持续10 min；和10℃，直到收集。使用2^{- △△Ct}方法计算基因表达的相对定量，并且均一化至GAPDH表达水平 (Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001; 25: 402-8)。引物列于表2中。

表2. 用来确定转录水平的引物列表。

流式细胞术：5 x 10⁵个细胞用下列染色：抗CD133/2 (Miltenyi Biotec)、EphA2、SOX2、巢蛋白、HER-2/neu (R&D Systems)、和IL13Rα2 (SantaCruz Biotechnology)。三次洗涤后，用二级抗小鼠-647染色CD133/2；用二级抗小鼠- PE连同它们各自的同种型染色IL13Rα2和EphA2，并且使用FACS Canto II分析。对于DC表型分析，用CD80-FITC、CD86-PE、CD83-PE、HLA-DR-APC、CCR7-FITC (eBioscience) 和HLA-ABC-FITC (BD Biosciences)染色5 x 10⁵个DC，在4℃孵育30分钟，洗涤，固定，然后在FACS Caliber上分析。根据制备商的方案(BD Biosciences)进行细胞内染色。

树突状细胞：使用CD14磁珠(Miltenyi Biotech)从健康HLA-A2⁺供体的外周血中纯化单核细胞，以24孔培养板中5 X 10⁵的浓度铺板，并且如前所述成熟 (Mailliard RB, Wankowicz-Kalinska A, Cai Q,等人. alpha-type-1 polarized dendritic cells: a novel immunization tool with optimized CTL-inducing activity. Cancer Res 2004; 64: 5934-7)；在第6天，用在5%或20% O₂中衍生的100 μg TL脉冲DC，并且在实验之前成熟。

CTL测定：将来自正常供体的1 X 10⁶ HLA-A2⁺ PBMC与50 U IL-2添加至成熟(第8天)的裂解物脉冲的DC，并且培养7天。对于再脉冲，将第二组脉冲的DC添加至共培养物持续四天。在第11天，将引发的PBMC与2 X 10⁴ CFSE标记的HLA-A2⁺胶质瘤细胞共培养6小时，然后如所述通过流式细胞术分析以确定细胞毒性 (Olin MR, Hwa Choi K, Lee J, Molitor TW. Gammadelta T-lymphocyte cytotoxic activity against Mycobacterium bovis analyzed by flow cytometry. J Immunol Methods 2005; 297: 1-11)。对于阻断测定，将抗HLA-ABC添加至靶细胞持续25分钟，洗涤，并且添加至效应细胞。

CMV测定：用100 μg 5%或20% O₂中衍生的肿瘤裂解物+/-10 μg pp65 HLA-A2-限制的CMV抗原(NLVPMVATV)脉冲5 X 10⁵ HLA-A2⁺ iDC，并且如方法部分中所述进行成熟。成熟之后，DC洗涤3次，并且将来自CMV血清阳性的供体的5X10⁵ PBMC添加至DC。CMV血清阴性的PBMC用作阴性对照。细胞孵育48小时，并且通过细胞计数珠粒阵列(BD Biosciences)关于IFNγ分析上清液。细胞孵育额外24小时，用抗CD8、pp65五聚体 (Prolmmune)染色，并且关于IFNγ产生进行细胞内染色。

肿瘤杀伤活性的增加不是由于共刺激分子的增加。为了研究在5% O₂培养中衍生的裂解物是否改变共刺激分子表达，DC用在5%或20% O₂条件下衍生的肿瘤裂解物脉冲，成熟，并且关于CD83、CD80/86、HLA-DR、HLA-ABC、和CCR7表达进行分析。在三个独立的实验中，在两种氧条件之间观察到共刺激标记的显著性差异。

统计学分析：通过ANOVA进行统计学比较，随后为使用2尾t检验(2-tailed t-test)进行事后比较。使用Prism 4软件(Graph Pad Software, Inc)进行所有测试。P 值<0.05 被认为是显著的。

结果与讨论

为了将组织培养物与原位原发性肿瘤进行比较，从两种成胶质细胞瘤和源自在5%和20% O₂中生长的相同肿瘤的培养细胞描述mRNA表达水平的概况。作为趋势，相对于20% O₂，当细胞在5% O₂中培养时，基因表达信号向在原位观察到的水平转移。在两位患者中，在20% O培养和原位肿瘤之间3,333个基因的表达有显著性差异。这些中，77个基因在5%和20% O₂培养之间差异表达。

通过PCR和流式细胞术分析选择的癌干细胞标记(CD133、巢蛋白、Sox2)和已知引发T细胞应答的TAA(EphA2、IL-13Rα2、HER-2/neu)。相对于20% O₂，在5% O₂中培养的细胞显著表达更多的编码CD133、EphA2、IL-13Rα2和HER-2/neu的mRNA(图6A)。SOX2和巢蛋白表现出相同的趋势，但没有达到统计学显著性。除表达HER-2/neu以外，蛋白表达遵循相同的趋势，CD133、EphA2、和IL13Rα2显著增加(图6B)。此外，CD133和IL13Rα2的western印迹显示类似的表达变化(图6C)。总体地，这些实验表明，在5% O₂中培养的细胞更好地反映原位肿瘤上的抗原表达，并且富集“干细胞性(stemness)”的标记和免疫原性TAA。

接着问，氧张力是否将改变TL引发培养的肿瘤杀伤性T细胞的能力。通过用源自三位不同胶质瘤患者的TL脉冲的自体DC引发来自正常供体的HLA-A2⁺ PBMC。评价引发的PBMC裂解用于引发的相同HLA-A2⁺胶质瘤细胞的能力。5% O₂ TL引发的PBMC表现出针对来自3/3患者的靶细胞的优异的肿瘤杀伤活性(图7A-C)。为了说明肿瘤细胞裂解是否需要引发CD8 T细胞，在效应细胞之前将抗HLA-ABC阻断抗体添加至肿瘤细胞。MHC I-TCR相互作用的阻断防止了肿瘤杀伤性应答，暗示细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在该测定中作为主要效应物(图7D)。

对于CTL引发增强的一个貌似可信的解释是5% O₂ TL改善DC成熟。在用来自20%或5% O₂的TL脉冲后，测定成熟DC上共刺激分子MHC分子和CCR7的表达。在CD83、CD80、CD86、或HLA-ABC、HLA-DR、或CCR7的表达中没有显著性差异。因此，5% O₂ TL的佐剂活性不太可能是由于增强DC成熟，提示存在其他机制。进行实验以确定用5% O₂ TL实现的优异的CTL引发是否是由于裂解物摄取的变化。用来自在5%或20% O₂中生长的CFSE-标记的胶质瘤细胞脉冲未成熟的DC。基于流式细胞术检测CFSE⁺HLA-DR⁺细胞(标记用裂解物上样的DC)显示，与在20% O₂中衍生的TL相比，5% O₂ TL被两倍数量的DC摄取(图8A)。因此，在5% O₂ TL中一种或多种未鉴定的因子增加了在组织培养物中吞噬肿瘤相关蛋白的DC的部分。

本发明人建立了确定TL是否从TL中不存在的确定抗原改变DC-介导的CD8 T细胞引发的测定。为了完成这一点，将TL与pp65肽(具有良好定义的CD8 T细胞应答的特异性标记抗原)混合。巨细胞病毒(CMV)衍生的pp65是HLA-A2限制的免疫显性表位，CMV血清阳性患者通常对其具有CD8 T细胞记忆应答 (综述见(Moss P, Khan N. CD8(+) T-cell immunity to cytomegalovirus. Hum Immunol 2004; 65: 456-64))。将来自血清阳性供体的PBMC与在有或没有pp65的情况下用TL脉冲的DC共培养。来自血清阴性供体的PBMC用作不依赖于pp65的CD8 T细胞活化的对照。将组织培养物上清液中的可溶性IFNγ定量，作为CD8 T细胞活化的量度。当在pp65不存在的情况下脉冲TL时，存在上清液中检测到的50-200 pg/ml IFNγ的背景，可能是由于无论pp65的T细胞或自然杀伤(NK)细胞的活化(图8B)。在未脉冲和裂解物脉冲的来自血清阳性供体的PBMC之间详细说明的IFNγ中没有显著性差异，排除了与裂解物中CMV抗原的反应性，表明TL中CMV抗原的表达可以忽略不计(Cobbs CS, Harkins L, Samanta M,等人. Human cytomegalovirus infection and expression in human malignant glioma. Cancer Res 2002; 62: 3347-50)。如期望地，来自仅用pp65(无TL)引发的血清阳性供体的PBMC显示出比背景高2-4倍的水平的IFNγ，而血清阴性供体PBMC对pp65没有响应。因此，血清阳性供体PBMC表现出与对CMV的免疫学记忆一致的表型，允许发明人测量TL可以如何改变对确定CD8 T细胞表位的响应。

与仅pp65相比，用与5% O₂ TL混合的pp65引发的PBMC表现出两倍的IFNγ量。明显对比的是，20% O₂ TL显著抑制pp65依赖的IFNγ分泌(图8B)。为了验证pp65特异性CD8 T细胞是IFNγ的主要来源，进行流式细胞术以评价在CD8⁺pp65-五聚体⁺细胞中IFNγ特异性表达(图8C)。与测量的可溶性IFNγ一致，相对于所有其他组，由5% O₂ TL加上pp65引发的CD8⁺pp65-五聚体⁺细胞基于每个细胞产生更多的IFNγ。综上所述，这些数据表明，5% O₂ TL具有固有的佐剂活性，其不依赖于表达的TAA量。值得注意的是，与这些发现平行的是，本发明人最近报道了使用更精确的小鼠免疫学试剂和建立的胶质瘤细胞系；即5% O₂ TL增加了外源性卵清蛋白在MHC I上的递呈并且增强了抗原特异性CD8 T细胞活化，而20% O₂ TL对于 CD8 T细胞引发是抑制性的并且可替代地促进抗体应答 (Olin MR, Andersen BM, Zellmer DM, 等人. Superior efficacy of tumor cell vaccines grown in physiologic oxygen. Clin Cancer Res; 16: 4800-8)。

综上所述，本数据表明，组织培养氧通过同时调控TAA和调节CD8 T 细胞的DC介导的引发的因子的表达而作为主要“免疫开关”发挥功能。通过选择在原位肿瘤中更丰富的TAA的表达，发明人显示，氧可以用于以对原位肿瘤中丰富的靶标的更高特异性引发CD8 T细胞。单独且同样重要的发现是，在生理氧中生长的肿瘤细胞通过不依赖于共刺激但涉及CD8 T细胞引发的增强的机制而固有地对CD8 T细胞的免疫原性更强。第三个考虑是，在几个以前研究中，在1-7% O₂中生长原代胶质瘤细胞增加了癌干细胞标记 (Platet N, Liu SY, Atifi ME,等人. Influence of oxygen tension on CD133 phenotype in human glioma cell cultures. Cancer Lett 2007; 258: 286-90; McCord AM, Jamal M, Shankavaram UT, Lang FF, Camphausen K, Tofilon PJ. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol Cancer Res 2009; 7: 489-97; Li Z, Bao S, Wu Q, 等人 Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell 2009; 15: 501-13)，显示引发的T细胞更适于根除原位癌干细胞。通过在生理氧中扩增原代肿瘤细胞制备的疫苗充当诱导临床上有用的抗肿瘤免疫应答的强大系统。

实施例3

可以生长GBM6-AD细胞以生成凋亡小体，以脉冲到自体树突状细胞上以制备疫苗。

树突状细胞的产生。使用确定的标准收集程序用FDA许可的血液分离仪器收集外周血单核细胞(MNC)。随后是无菌技术以防止收集的污染。以1.0E+05-1.5E_05的活接种密度将细胞接种在组织培养瓶或细胞工厂中，并且在37ºC, 5% CO₂培养，在第+3天，将补充IL-4和GM-CSF (1,000 IU/mL)的20％培养基总体积添加至细胞。在第+6天，通过添加GM-CSF (1,000 IU/mL)、IL1β(25 ng/mL) TNF-α(50 ng/mL)、IFN-α(10,000 IU/mL)、IFN-γ((1,000 IU/mL)、和Poly-IC (20 µg/mL)并且孵育(37ºC, 5% CO₂)直到第+8天而成熟细胞。还在第6天添加脑肿瘤凋亡小体(1个凋亡细胞/每iDC)。在第+8天使用TrypLE Select从培养物收获成熟的脉冲的α-1型极化的DC，并且在Plasmlyte-A，5％人血清白蛋白(HSA)，和DMSO(10％终浓度)中冷冻保存。

脑肿瘤干细胞处理：在接受进入MCT设施之前，测试源自患有多形性成胶质细胞瘤的成年患者的单一细胞系。测试包括支原体(PTC)和无菌；结果令人满意。然后细胞在37℃, 5% CO2,和5% O₂具有EGF (20 ng/mL终浓度)和bFGF (2 ng/mL终浓度)的无血清神经干细胞培养基(DMEM/F12, B-27补充剂，N-2补充剂)中扩增。当细胞在约3-5天形成球时用TrypLE Select和机械分离分裂培养物。细胞在具有EGF (20 ng/mL终浓度)/bFGF (2 ng/mL终浓度)的无血清神经干细胞培养基中重悬浮并且通过培养继续，直到扩增足量的细胞用于MCB。然后细胞在DPBS中洗涤，并且在冷冻保存介质(Plasmlyte-A，5％人血清白蛋白(HSA)，和DMSO(10％终浓度))中冷冻保存。

MCB的样品以与MCB一致的方式扩增，以建立使用控制速率冰箱冷冻的工作细胞团。然后将细胞团的部分解冻，并且进行雾化，并且将获得的块全细胞裂解物辐射(200 Gy)，并且调整至约2 mg/mL。然后将其以约1.2 mg/600 μL无菌转移至小瓶中。使用控制速率冰箱冷冻含有裂解物的小瓶，然后存储在< -150℃，直到分配用于施用。

实施例4

治疗计划。疫苗制备从白细胞分离术开始花费约4周时间。

白细胞分离术-自体树突状细胞来源。通过白细胞分离术从每位患者的外周血单核细胞(PBMC)获得自体DC。使用标准收集技术进行收集。使用具有粒细胞分离室和小体积收集室(SVCC)的Fenwal CS-3000® Plus血细胞分离机(#4R4538) (Fenwal Division, Baxter Healthcare, Deerfield, IL)收集PBMC。

立即将PBMC转移至明尼苏达大学分子和细胞疗法(MCT)设施(University of Minnesota Molecular and Cellular Therapy (MCT) Facility)用于处理。在达到计划的治疗结束之前疫苗供应耗尽的患者中，可以进行第二次白细胞分离术以获得用于额外疫苗产生的细胞。基于个体患者确定这种收集的需要和时机。

疫苗制备。将如图9中所概述处理自体PBMC。在分子和细胞治疗(MCT)设施维持源自多形性成胶质细胞瘤的脑肿瘤干细胞系，且作为同种异型肿瘤抗原的来源进行处理。将含有10⁷至10⁸个细胞的DC培养物暴露于来自4 x 10⁶个BTSCs的肿瘤裂解物。以个别等分试样冷冻脉冲的DC，直到使用。

树突状细胞 - 脑肿瘤干细胞接种/咪喹莫特。在前8周每2周、然后每4周(持续10次额外的接种)基于门诊患者施用接种疫苗。在临接种之前和24小时后再次在部位局部施用咪喹莫特。接种后持续30分钟或全身或注射部位局部观察患者的立即不良事件。

咪喹莫特施用。咪喹莫特作为250 mg 包中的5％Aldara霜剂进行销售，提供了12.5 mg/每包且足以覆盖20平方厘米的总剂量。1/2包的内容物作为薄膜施用以覆盖约10平方厘米的计划接种的皮肤面积。将咪喹莫特充分用力擦入。以用于每次施用的新包处理剩余的咪喹莫特。

24小时(+/- 2小时)后在接种部位以相同的方式重新施用咪喹莫特。

疫苗施用计划。在颈背附近的肩膀经由真皮内注射在0.5ml PBS中以指定的剂量施用疫苗，以促进DC运输到颈部淋巴结。如果在计划接种的当天患者具有> 101°F (38.3 ℃)的发热或正在接受类固醇，那么接种延迟1周。大于1周的延迟将导致患者停止进一步的接种。每次注射后持续30分钟或全身或注射部位局部观察患者的立即不良事件。每次疫苗后48小时(+/- 4小时)随访患者的不良事件。

图10是MRI扫描图，其显示用辐射的GBM6-AD凋亡小体脉冲的自体树突状细胞接种后的肿瘤消退。这表明本发明的概念在人受试者中的治疗验证，这对于同种异型神经胶质瘤细胞是新的。

所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文。尽管在上述说明书中已经关于本发明的某些实施方案描述了本发明且已经描述了许多细节用于说明的目的，但是对于本领域技术人员将显而易见的是，本发明易于具有额外的实施方案，且在不脱离本发明的基本原理的情况下本文描述的某些细节可能有相当大的变化。

在描述本发明的上下文中使用术语“一(a)”和“一(an)”和“该(the)”和类似参照对象被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有指明或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)，除非另有说明。除非本文另有说明，本文的值的范围的记载仅仅意在充当单独引用落入该范围内的每个单独值的简写方法，且每个单独值如同其在本文中单独记载地并入本说明书。本文描述的所有方法可以以任何适当的顺序进行，除非本文另有指明或与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅仅意在更好地说明本发明，并且不构成对本发明范围的限制，除非另外要求保护。说明书中的任何语言都不应理解为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

本文描述了本发明的实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。阅读上述说明书之后，这些实施方案中的变化对于本领域普通技术人员可能变得显而易见。本发明人期望技术人员酌情采用这种变化，且发明人也期望本发明以本文中具体描述的其他方式实施。相应地，如适用法律所允许的，本发明包括随附权利要求中所述的客体的所有修饰和等同内容。此外，本发明涵盖其所有可能的变化中的上述元素的任意组合，除非本文另有指明或与上下文明显矛盾。

Claims (64)

1.抗肿瘤组合物，其包含纯化的成胶质细胞瘤GBM6-AD干细胞。

2.权利要求1的抗肿瘤组合物，其中所述纯化的GBM6-AD干细胞是贴壁细胞。

3.权利要求2的抗肿瘤组合物，其中所述纯化的贴壁成胶质细胞瘤GBM6-AD干细胞是ATCC^®专利保藏名称PTA-11498。

4.权利要求1或权利要求2的抗肿瘤组合物，其中所述GBM6-AD细胞是裂解的。

5.权利要求1至4中任一项的抗肿瘤组合物，其中所述GBM6-AD细胞是辐射的。

6.权利要求1至5中任一项的抗肿瘤组合物，进一步包含药学上可接受的无毒媒介物。

7.权利要求1至6中任一项的抗肿瘤组合物，进一步包含佐剂。

8.权利要求7的抗肿瘤组合物，其中所述佐剂是CpG ODN、聚ICLC、膜联蛋白A2、或TLR配体。

9.权利要求8的抗肿瘤组合物，其中所述佐剂是TLR7、TLR8或TLR7/8配体。

10.权利要求9的抗肿瘤组合物，其中所述试剂是咪喹莫特。

11.权利要求7的抗肿瘤组合物，其中所述佐剂是刺激免疫应答的非TLR配体。

12.权利要求1至11中任一项的抗肿瘤组合物，其中所述细胞或细胞裂解物与载体缀合。

13.权利要求12的抗肿瘤组合物，其中所述载体是树突状细胞或巨噬细胞。

14.权利要求1至13中任一项的抗肿瘤组合物，其中所述组合物包含在非细胞载体中。

15.权利要求1至14中任一项的抗肿瘤组合物，其中所述组合物包含在脂质体中。

16.引发需要免疫应答的动物中的免疫应答的方法，其包括将权利要求1至15中任一项的抗肿瘤组合物施用于所述动物。

17.权利要求16的方法，其进一步包括将咪喹莫特施用于所述动物。

18.权利要求17的方法，其中在施用所述抗肿瘤组合物之前施用所述咪喹莫特。

19.权利要求16至18中任一项的方法，其中肠胃外施用所述抗肿瘤组合物。

20.权利要求19的方法，其中肌内、皮下、真皮内或静脉内施用所述组合物。

21.权利要求16至19中任一项的方法，其中口服或鼻内施用所述组合物。

22.权利要求16至21中任一项的方法，其中在多于一个时间点施用所述抗肿瘤组合物。

23.权利要求22的方法，其中在两个时间点施用所述抗肿瘤组合物。

24.权利要求16至23中任一项的方法，其中在每个施用时间点以100,000–100百万个GBM6-AD细胞的剂量施用所述抗肿瘤组合物。

25.权利要求24的方法，其中在每个施用时间点以2 x 10⁶个GBM6-AD细胞的剂量施用所述抗肿瘤组合物。

26.权利要求17的方法，其中局部、真皮内、皮下、和/或经由淋巴节内注射施用所述咪喹莫特。

27.权利要求17的方法，其中在两个肩胛上注射部位局部施用所述咪喹莫特。

28.权利要求16至27中任一项的方法，其进一步包括将辐射治疗施用于所述动物。

29.权利要求28的方法，其中在施用所述抗肿瘤组合物之前、期间或之后施用所述辐射治疗。

30.权利要求28或29的方法，其中以小于6,000 cGY的剂量施用所述辐射治疗。

31.权利要求28至30中任一项的方法，其中在多个时间点施用所述辐射治疗。

32.权利要求31的方法，其中在三个时间点施用所述辐射治疗。

33.权利要求28至32中任一项的方法，其中以5220 cGY的剂量、和随后的每个360 cGY的两个额外剂量施用所述辐射治疗。

34.权利要求33的方法，其中在5220 cGY的剂量后10周施用360 cGY的第一额外剂量，且在5220 cGY的剂量后14周施用360 cGY的第二额外剂量。

35.权利要求28至34中任一项的方法，其进一步包括将辐射敏化剂施用于所述动物。

36.权利要求35的方法，其中所述辐射敏化剂是parp抑制剂。

37.权利要求35的方法，其中所述辐射敏化剂是替莫唑胺。

38.权利要求37的方法，其中在初始辐射治疗期间施用所述替莫唑胺。

39.权利要求37的方法，其中以5-200mg/m²/天的剂量施用所述替莫唑胺。

40.权利要求37的方法，其中以75mg/m²/天的剂量施用所述替莫唑胺。

41.权利要求28至40中任一项的方法，其中所述辐射治疗是以180cGy的部分的5220 cGy的剂量。

42.权利要求41的方法，其中经6至7周施用所述辐射治疗。

43.权利要求41的方法，其进一步包括在所述初始辐射治疗后4周和8周经连续两天以180cGy部分施用额外360 cGY部分。

44.权利要求16至43中任一项的方法，其中所述动物是哺乳动物。

45.权利要求44的方法，其中所述哺乳动物是人。

46.权利要求16至45中任一项的方法，其进一步包括将地塞米松治疗施用于所述动物。

47.权利要求46的方法，其中在诊断时施用所述地塞米松治疗。

48.权利要求46的方法，其中到所述初始辐射治疗的第6周使所述动物断绝地塞米松。

49.权利要求16至48中任一项的方法，其进一步包括施用耗竭调节性T细胞或骨髓源性抑制细胞的化疗剂或药物。

50.权利要求49的方法，其中所述化疗剂是舒尼替尼(sunititib)、ontak、环磷酰胺、吉西他滨、和/或维甲酸。

51.引发动物中的免疫应答的方法，其包括将权利要求1至15中任一项的组合物引入所述动物中。

52.产生对GBM6-AD特异性的抗体的方法，其包括将权利要求1至15中任一项的组合物引入动物中，且分离对GBM6-AD特异性的抗体。

53.产生树突状细胞疫苗的方法，其包括用权利要求1至15中任一项的抗肿瘤组合物脉冲树突状细胞。

54.纯化的抗体，其与纯化的贴壁成胶质细胞瘤GBM6-AD干细胞特异性结合。

55.权利要求54的抗体，其中所述纯化的贴壁成胶质细胞瘤GBM6-AD干细胞是ATCC^®专利保藏名称PTA-11498。

56.权利要求54或55的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。

57.权利要求56的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。

58.权利要求56的抗体，其中所述抗体是完全人源化抗体。

59.权利要求56的抗体，其中所述抗体是单链Fv或scFv片段。

60.治疗需要治疗的患者中的原发性脑肿瘤的方法，其包括将权利要求1至15中任一项的抗肿瘤组合物或权利要求54-59中任一项的纯化的抗体施用于所述患者。

61.权利要求1至15中任一项的抗肿瘤组合物或权利要求54-59中任一项的纯化的抗体用于治疗癌症的用途。

62.权利要求1至15中任一项的抗肿瘤组合物或权利要求54-59中任一项的纯化的抗体用于癌症的预防或治疗性处理中的用途。

63.权利要求60的方法或权利要求61或62的用途，其中所述原发性脑肿瘤是星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤或室管膜细胞瘤。

64.权利要求63的方法，其中所述原发性脑肿瘤是多形性成胶质细胞瘤。

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