KR102630164B1 - 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 NLRP3 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 함유하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산 복합체는 우수한 세포 투과능 및 세포 내 활성을 가지며, NLRP3 유전자 및 그 하위 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있어, 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료에 유용하다.

Description

펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for Preventing or Treating Non-Alcoholic SteatoHepatitis Comprising Peptide Nucleic Acid Complex}
본 발명은 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 NLRP3 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 함유하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
비알콜성 지방간염은 간에 지방이 축적됨으로써 간에 염증과 세포 손상이 일어난 상태이며, 지속적인 간 손상으로 인해 병변이 악화되면 간 섬유화, 간경화 및 간암까지 진행할 수 있는 질환이다. 현재 우리나라뿐만 아니라 전 세계적으로 비알콜성 지방간염 유병률이 증가하여 보건, 사회, 경제적인 측면에서 큰 문제를 야기하고 있다 (Povero et al., Hepatol Commun. Vol. 4(9), pp. 1263-1278, 2020).
그러나 이러한 비알콜성 지방간염의 치료에 효과가 입증된 약물이나 치료법은 아직 없다. 따라서 지방간염을 일으키는 기저 질환의 치료가 대부분이며, 운동, 식이요법, 체중감량 등 생활습관의 변화가 필요하고, 그 외에 당뇨 및 인슐린 저항성 치료, 고지혈증 치료, 산화 스트레스의 예방 및 치료, 기타 간 보호 약제를 사용하여 치료하고 있는 실정이다.
대한민국특허 10-2177304호에서는 비알콜성 지방간염 치료에 효과적인 화합물을 기재하고 있으며, 대한민국특허 10-1837173호, 10-2239804호 등에서는 인삼 추출물을 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 조성물이 기재되어 있으나, 구체적인 분자 기작은 밝혀지지 않고, 단지 증상이 완화되는 것에 기초하고 있을 뿐이다.
NLRP3는 염증 활성을 유도하는 신호 물질로 비알콜성 지방간염 환자의 지방 세포에서 발현이 증가하여 있다고 알려졌으며, 또한 NLRP3 하위 유전자인 caspase-1의 발현 역시 인간 및 마우스 지방 조직에서 증가 되어있어 지방 세포 분화 및 비알콜성 지방간염을 심화시키는 것으로 보고되어 있다 (Claire H Wilson et al., Cell Death & Differentiation, Vol.25, pp. 1010-1024, 2018).
한편, 전통적인 약제와 다르게 핵산 약제는 표적 특이적 전령 RNA(messenger RNA, mRNA)의 발현을 억제하므로, 단백질을 표적으로 하는 기존 약제로 치료가 불가능 했던 연구 영역을 다룰 수 있게 되었다(Kole R. et al., Nature Rev. Drug Discov. 11;125, 2012., Wilson C. et al., Curr. Opin. Chem. Bio. 2006; 10:607, 2006). 약제로서의 성능 및 장점으로 인하여 핵산을 이용한 다양한 임상시험이 진행되고 있고, 증가하는 핵산 기반 치료제의 용도에도 불구하고 세포내 도입 또는 혈뇌장벽 투과를 위한 운반체의 사용은 극히 제한적이다.
따라서, 최근 약물의 보다 안전하고 효과적인 이용을 도모하기 위해, 약물에 적합한 제형뿐만 아니라 약물의 표적이 되는 생체 부위에 효율적으로 약물을 전달(drug delivery)하는 방법이 주목받고 있다. 특히, 약물을 필요한 때에, 필요한 양만큼, 필요한 장소로 효율적으로 운반하는 수송 시스템인 약물 전달 시스템(DDS; Drug Delivery System)의 실용화가 요구되고 있다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 세포 투과성(cell permeability)이 놀랍게 향상되며, 이를 이용하여 표적 유전자의 발현을 매우 효율적으로 조절할 수 있음을 확인하고, 이러한 세포 독성이 낮고, 생활성 핵산의 세포 투과성 및 유전자 발현 조절능력이 향상된 새로운 구조체에 대한 특허를 출원한 바 있다 (PCT/KR2017/008636). 또한, 본 발명자들은 상기 구조체의 기능에 대한 연구를 지속적으로 수행하여, 우수한 효율로 혈뇌장벽을 투과할 수 있는 능력을 가지는 새로운 구조체를 개발하게 되었다 (KR 10-2019-0128465).
이에, 본 발명자들은 세포 투과능이 우수한 핵산 복합체를 비알콜성 지방간염의 치료에 적용하고자 예의 노력한 결과, NLRP3 유전자를 표적하는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체는 우수한 세포 투과능 및 세포 내 활성을 가지며, NLRP3 유전자 및 그 하위 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있어, 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료에 유용하다.
도 1은 인간 간암 세포(HepG2)에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 각 조합별 NLRP3 표적 유전자 및 하위 경로 유전자의 시간에 따른 발현을 확인한 결과이다.
도 2의 (A)는 인간 간암 세포(HepG2)에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 각 조합별 시간에 따른 NLRP3 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 3은 STZ(streptozotocin)와 고지방 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 조합별로 체중(위 패널) 및 간 무게(아래 패널)를 확인한 결과이다.
도 4는 STZ(streptozotocin)와 고지방 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 조합별 NLRP3 유전자 및 하위 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 5a는 STZ(streptozotocin)와 고지방 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 간 조직의 조합별 H&E 염색 결과(A) 및 간 조직내 병변(지방증(B), 세포풍선화(C), 염증세포 침윤(D) 및 NAFLD 활성 점수(E))의 확인 결과이다.
도 5b는 STZ(streptozotocin)와 고지방 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 간 조직의 조합별 Oil red O (ORO) 염색 결과이다.
도 5c는 STZ(streptozotocin)와 고지방 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 간 조직의 조합별 picrosirius red 염색 결과로서, (A)는 현미경 사진이며, (B)는 섬유화 정도를 수치화한 그래프이다.
도 6a는 STZ(streptozotocin)와 고지방 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 NLRP3 유전자의 면역염색화학 결과(A) 및 이의 정량화 그래프(B)이다.
도 6b는 STZ(streptozotocin)와 고지방 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 NLRP3 유전자의 하위 경로 유전자인 IL-1β의 면역염색화학 결과(A) 및 이의 정량화 그래프(B)이다.
도 7은 MCD 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 간 조직의 사진(A) 및 체중 변화 그래프(B)이다.
도 8은 MCD 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 조합별 NLRP3 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 9a는 MCD 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 간 조직의 조합별 H&E 염색 결과(A) 및 간 조직내 병변(지방증(B), 세포풍선화(C), 염증세포 침윤(D) 및 NAFLD 활성 점수(E))의 확인 결과이다.
도 9b는 MCD 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 간 조직의 조합별 Oil red O (ORO) 염색 결과이다.
도 9c는 MCD 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 간 조직의 조합별 picrosirius red 염색 결과로서, (A)는 현미경 사진이며, (B)는 섬유화 정도를 수치화한 그래프이다.
도 10은 HFHC+F/G 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 조합별 간 조직의 사진(A), 체중 변화 그래프(B) 및 간 무게(C)이다.
도 11은 HFHC+F/G 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, ELISA를 이용해 수득한 조합별 간 기능 분석(ALT(A), AST(B) 및 TG(C)) 결과이다.
도 12는 HFHC+F/G 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 조합별 NLRP3 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 13a는 HFHC+F/G 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 간 조직의 조합별 H&E 염색 결과(A) 및 간 조직내 병변(지방증(B), 세포풍선화(C), 염증세포 침윤(D) 및 NAFLD 활성 점수(E))의 확인 결과이다.
도 13b는 HFHC+F/G 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 간 조직의 조합별 Oil red O (ORO) 염색 결과이다.
도 13c는 HFHC+F/G 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 간 조직의 조합별 picrosirius red 염색 결과로서, (A)는 현미경 사진이며, (B)는 섬유화 정도를 수치화한 그래프이다.
도 14는 HFHC+F/G 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 추가로 4주간 더 처리한 후, 수득한 조합별 간 조직의 사진(A), 체중 변화 그래프(B) 및 간 무게(C)이다.
도 15는 HFHC+F/G 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 추가로 4주간 더 처리한 후, ELISA를 이용해 수득한 조합별 간 기능 분석(ALT(A), AST(B) 및 TG(C)) 결과이다.
도 16은 HFHC+F/G 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 추가로 4주간 더 처리한 후, 수득한 조합별 NLRP3 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 17a는 HFHC+F/G 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 추가로 4주간 더 처리한 후, 수득한 간 조직의 조합별 H&E 염색 결과(A) 및 간 조직내 병변(지방증(B), 세포풍선화(C), 염증세포 침윤(D) 및 NAFLD 활성 점수(E))의 확인 결과이다.
도 17b는 HFHC+F/G 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 추가로 4주간 더 처리한 후, 수득한 간 조직의 조합별 Oil red O (ORO) 염색 결과이다.
도 17c는 HFHC+F/G 식이 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 추가로 4주간 더 처리한 후, 수득한 간 조직의 조합별 picrosirius red 염색 결과로서, (A)는 현미경 사진이며, (B)는 섬유화 정도를 수치화한 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 NLRP3 유전자를 표적하는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 투여할 경우, 비알콜성 지방간염의 예방 및 치료에 효과가 있는지 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 NLRP3 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 비알콜성 지방간염세포주 및 비알콜성 지방간염 세포주 동소 이식 모델에 투여할 경우, NLRP3 유전자와 그 하위 유전자의 발현을 효율적으로 억제하여 비알콜성 지방간염 치료효과가 뛰어난 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서, NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 생활성 핵산은 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드가 상보적으로 결합된 핵산 복합체는 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
[구조식 (1)]
[ A ≡ C (+) ]
상기 구조식 (1)에 있어서,
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열, 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고;
'≡는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
A로 표시되는 생활성 핵산은 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid)으로, 전체적으로 음전하를 가지며,
C (+) 로 표시되는 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지고,
A ≡ C(+) 로 표시되는 구조식 (1)의 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지며,
상기, 캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함하며, 상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체가 음전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적인 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, “생활성 핵산”은 발현을 감소시키고자 하는 목적하는 표적 유전자와 결합할 수 있는 상보적인 서열, 특히 그러한 목적하는 표적 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 상보적인 서열을 가지거나, 발현시키고자 하는 표적 유전자의 발현을 촉진하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 핵산으로, 해당 유전자의 발현을 억제하거나, 촉진하는 등의 유전자 발현조절에 관여하는 핵산을 의미하며, 발현을 감소 또는 증가시키고자 하는 표적 유전자에 상보적인 서열을 가지는 핵산이거나, pre-mRNA, miRNA, mRNA 등 단일가닥 RNA 서열에 상보적인 서열의 핵산일 수 있다.
특히, 본 발명에서의 “생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)”은 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 표적 유전자, 및 이를 포함하는 염기서열과 결합하여 해당 유전자의 고유 기능(예를 들어, 전사체(transcript) 발현 또는 단백질 발현)을 활성화시키거나 또는 저해하거나, pre-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 조절(예를 들어, 엑손스키핑 (exon skipping) 하는 등의 기능을 수행하며, 상기 염기서열은 유전자 조절부위(gene regulatory sequence) 또는 유전자 부위(gene coding sequence) 또는 스플라이싱 조절 부위 (splicing regulatory sequence)인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 조절부위는 프로모터, 전사 인핸서, 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 바이러스 팩키징 서열, 및 선택 마커에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 부위는 엑손 또는 인트론일 수 있으며, 상기 유전자 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 10, 5, 3, 또는 1kb 또는 500, 300, 또는 200bp 내에, 예를 들어, 개시 부위의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있을 수 있다. 또한, 상기 스플라이싱 조절부위는 exon skipping, cryptic splicing, pseudo-splice site activation, intron retention, alternative splicing deregulation 관련 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에서의 "생활성 펩티드 핵산(Bioactive Nucleic Acid)"은 비알콜성 지방간염 표적 유전자인 NLRP3의 안티센스 펩티드 핵산인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “캐리어 펩티드 핵산”은 생활성 핵산과 일부 혹은 전부의 염기가 상보적으로 결합하여 기능성을 부여하는 핵산을 의미하며, 본 발명에서 사용되는 캐리어 펩티드 핵산은 펩티드 핵산(PNA: Peptide Nucleic Acid) 뿐 아니라, 이와 유사한 변형된 핵산을 사용할 수 있으며, 펩티드 핵산이 바람직하지만, 이에 한정되는 의미는 아니다.
특히, 본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 4 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 서열로 표시되는 서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 "핵산 복합체"는 생활성 물질을 체내, 궁극적으로 세포 내로 침투시킬 수 있으며, 구체적으로는 혈뇌장벽을 통과하여 체내로 전달할 수 있는 능력을 가진다.
이에 따라 본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 혈뇌장벽 투과능을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 각각 2 내지 50개, 바람직하게는 5 내지 30개, 더욱 바람직하게는 10 내지 25개, 가장 바람직하게는 15 내지 17개의 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 서열번호 2의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산; 및 서열번호 4 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 (i) 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 4로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(ii) 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(iii) 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 6으로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체; 및
(iv) 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 7로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
로 구성된 군에서 선택되는 핵산복합체를 유효성분으로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 더 포함하여 하기 구조식 (2)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
구조식 (2)
[ mA ≡ mC (+) ]
상기 구조식 (2)에 있어서,
'm'은 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, “엔도좀 탈출을 도와주는 물질”은 엔도좀 내부의 삼투압을 증가시키거나, 엔도좀의 막을 불안정화 시키는 방법에 의하여 생활성 핵산의 엔도좀에서 탈출을 도와주는 것을 특징으로 할 수 있다. 생활성 핵산이 보다 효율적이고 빠르게 핵이나 세포질로 이동하여 표적 유전자를 만나 작용하도록 도와주는 것을 의미한다(D. W. Pack, A. S. Hoffman, S. Pun, P. S. Stayton, “and development of polymers for gene delivery,”Nat. Rev. Drug. Discov., Vol. 4, pp. 581-593, 2005).
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질로서 생활성 핵산에는 GLFDIIKKIAESF(서열번호 8)의 서열을 갖는 펩티드가 링커 매개로 연결될 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산에는 Histidine(10)을 링커 매개로 연결하는 방법으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 지질 나노물질(lipid nanoparticles)은 Lipid, phospholipids, acetyl palmitate, poloxamer 18, Tween 85, tristearin glyceride 및 Tween 80로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles)은 poly(amidoamine) 또는 polyethylenimine (PEI)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고분자 나노구(polymer nanospheres)는 polycaprolactone, poly(lactide-co-glycolide, polylactide, polyglycolide, poly(d,l-lactide), chitosan 및 PLGA-polyethylene glycol로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles)은 Fe2O3 Fe3O4, WO3 및 WO2.9로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles)은 1-(aminoethyl)iminobis[N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl)propionamide], N-alkylated derivative of PTA 및 3, 5-didodecyloxybenzamidine로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 고분자(cationic polymer)는 vinylpyrrolidone-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate acid copolymer diethyl sulphate, polyisobutylene 및 poly(N-vinylcarbazole)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)는 polyacids, poly(acrylic acid), poly(methacrylic acid) 및 hydrolyzed polyacrylamide로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산은 천연(natural) 핵산 염기 및/또는 변형된 핵산 단량체로 이루어져 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid), 앤티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 앱타머(aptamer), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), 리보자임(ribozyme) 및 DNAzyme로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid)로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어, 생활성 핵산에 사용된 단량체가 PNA일 경우, 생활성 펩티드 핵산이라고 하며, 다른 단량체가 사용된 경우에도 동일한 방식으로 부른다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 포스포디에스테르(phosphodiester), 2' 0-메틸(2' 0-methyl), 2' 메톡시-에틸(2' methoxy-ethyl), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체 내의 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 각각은 전기적 특성이 전체적으로, 양전하(양성), 음전하(음성) 또는 중성 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체일 수 있다.
상기 전기적 특성의 표현에 있어, “전체적으로”의 의미는 개별 염기의 전기적 특성이 아닌 전체적인 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산 각각의 전하가 외부에서 볼 때 전체적인 전기적 특성을 의미하는 것으로, 예를 들어, 생활성 핵산 내의 일부 단량체가 양성을 가지더라도 음성을 가지는 단량체의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 생활성 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 음전하를 가지게 되는 것이며, 캐리어 펩티드 핵산 내의 일부 염기 및/또는 백본(backbone)이 음성을 가지더라도 양성을 가지는 염기 및/또는 백본의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 캐리어 펩티드 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 양전하를 가지게 되는 것이다.
따라서, 본 발명의 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 음전하 또는 중성의 특성을 가지며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 양전하 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전기적 특성의 부여는 변형된 펩티드 핵산 단량체를 사용할 수 있고, 변형된 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하의 아미노산을 포함하고, 음전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 음전하의 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E) 또는 아미노산 유사체의 음전하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가지도록 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전하 부여를 위한 펩티드 핵산 단량체의 변형은 상기 backbone 변형 이외에도 nucleobase가 변형된 펩티드핵산 단량체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 전기적 양성을 가지도록 amine, triazole, imidazole moiety를 nucleobase에 포함하거나, 전기적 음성을 가지도록 carboxylic acid를 염기에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산의 변형 펩티드 핵산 단량체는 음전하를 backbone 혹은 nucleobase에 더 포함할 수 있지만, 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 단량체가 음전하를 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적으로 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 핵산 복합체에 있어, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 또는 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 및 이미징을 위한 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질은 상기 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질과 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 단순 공유결합 또는 링커로 매개된 공유 결합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 핵산 운반체에 결합된 세포 투과, 용해도, 안정성, 운반 및 이미징 관련 물질(예컨대, 소수성 잔기 등)은 표적 유전자의 발현을 조절하는 생활성 핵산과 독립적으로 존재하게 된다.
본 발명에 있어서, 앞서 기술한 바와 같이, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 상보적인 결합 형태는 크게 역평행결합(antiparallel binding)과 평행결합(parallel binding)의 형태를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 상보적인 결합 형태는 생활성 핵산의 목적서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리되는 구조를 가진다.
상기 역평행결합과 평행결합은 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식에 있어, 5'-방향성과 3'-방향성에 따라 결정된다. 역평행 결합은 일반적인 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식으로, 본 발명에 따른 핵산 복합체를 예로 들어 설명하면, 생활성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 캐리어 펩티드 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다. 평행결합은 역평행결합에 비해서는 결합력이 다소 떨어지는 형태로, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 모두가 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 결합력은 융해온도, melting temperature 또는 Tm에 의해 결정된다.
상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮게 하기 위한 구체적인 방법의 예로는, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예로서 상기 캐리어 펩티드 핵산이 링커, 유니버설 염기(universal base) 및 생활성 핵산의 대응되는 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지는 펩티드 핵산 염기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드 핵산 염기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고, 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이노신 PNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 기능 조절을 위한 핵산들의 결합 형태와 전기적 성질 조합을 제공하고, 상기 핵산의 결합 형태와 전기적 성질 조합으로 입자 크기 및 작용 시점을 조절하고, 세포 투과성, 용해도 및 특이도를 향상시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해, 목적 유전자의 존재 하에서, 생활성 펩티드 핵산이 목적 서열과 결합되는 시점(생활성 핵산의 목적 서열로의 치환되는 시점, 표적 특이적 분리 및 결합 시점) 등의 조절이 가능하다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 생활성 핵산의 목적 유전자로의 치환(strand displacement) 시점, 표적 특이적 분리 및 결합(target specific release and bind) 시점의 조절은 복합체의 비특이 결합을 위한 캐리어 펩티드 핵산의 비특이 염기, 유니버설 염기 및 linker의 유무, 개수 및 위치에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 펩티드 복합체의 상보적인 결합의 형태인 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel) 형태의 결합 등과 상기 조건의 조합에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "질환" 또는 "장애"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이는 기능의 수행을 방해하거나 혼란 시키고/시키거나 불쾌감, 기능이상, 곤란과 같은 증상을 유발시키거나 또는 심지어 병에 걸린 사람을 사망시키거나 이와 접촉한 사람을 사망에 이르게 하는, 신체 상태 또는 몇몇 기관 상의 모든 변경을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 “치료용 조성물”은 "의약(약제학적, 약학적) 조성물(pharmaceutical composition)"과 혼용될 수 있으며, 본 발명의 생활성 핵산 및 상기 핵산과 결합하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 유효성분으로 포함하며, 추가적으로 상기 핵산 복합체에 목적하는 질환을 치료하기 위한 치료용 약물이 결합된 형태일 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 특성을 의미한다.
용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 핵산 복합체의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
본 발명에서의 핵산 복합체를 함유하는 물질은, 환자에게 그 자체로서 또는 병용 요법(combination therapy)에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 의약 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 의약 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여로 질환의 발병을 막거나, 이의 진행을 억제시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 “개선”이란 상기 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여로 질환의 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 조성물은 비알콜성 지방간염을 치료하기 위하여 또는 비알콜성 지방간염의 증세를 억제(또는 완화)하기 위하여 의약으로 효과적인 양으로 적용될 수 있다. 비알콜성 지방간염의 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 적용 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 적용하거나 순차적으로 적용할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 적용될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 적용될 수 있다. 이러한 적용은 단일 또는 다중적으로 적용일 수 있다.
본 발명에서, "개체"는 본 발명에 따른 핵산 복합체를 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000㎎/일이고, 바람직하게는 0.01 ~ 500㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 명세서에 기재되어 있는 핵산 복합체를 포함하는 조성물의 독성과 치료 효율성은, 예를 들어, LD50(군집의 50%에 대한 치사량), ED50(군집의 50%에 대해 치료 효과를 갖는 선량), IC50(군집의 50%에 대해 치료 억제 효과를 갖는 선량)을 결정하기 위하여, 세포 배양 또는 실험동물에서의 표준 제약 과정들에 의해 산정될 수 있다. 독성과 치료 효과 간의 선량 비가 치료 지수이고 이것은 LD50과 ED50(또는, IC50) 간의 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물들이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석에서 얻어진 데이터는 인간에 사용하는 선량의 범위를 산정하는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물들의 투여량(dosage)은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 상태에서 ED50(또는, IC50)을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명의 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 1 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, NLRP3 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및/또는 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 NLRP3 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및/또는 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, NLRP3 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및/또는 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물을 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid) 및 캐리어 펩티드 핵산, 및 이들을 이용한 복합체의 제조
본 실시예에서는 간에서 발병하는 질환 중 간 내 지방 침착으로 인한 지방간, 간 경변에 이르는 일련의 과정을 모두 포함하는 용어로 알콜 섭취가 많지 않음에도 불구하고 알콜성 지방간염과 유사한 간 조직 형태인 비알콜성 지방간염 (Non-Alcoholic SteatoHepatitis, NASH)에 대한 효과를 검정하기 위하여 표적 유전자로 NLRP3를 사용하였으며, 비알콜성 지방간염의 치료 효과를 확인하기 위해 NLRP3에 대한 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)으로 안티센스 펩티드 핵산(antisense PNA)을 사용하였다.
본 발명의 대조군으로 사용한 생활성 펩티드 핵산 (antisense PNA)은 서열번호 1번으로 표시되는 서열로 구성되어 있으며, 비알콜성 지방간염 치료효과를 확인하기 위해 사용한 생활성 펩티드 핵산(antisense PNA)은 서열번호 2번으로 표시되는 서열로 구성되어 있다.
본 실시예에서 사용된 캐리어 펩티드 핵산은 모두 엔도좀 탈출능을 돕기 위한 펩타이드가 없는 형태로, 아래의 표에 기재된 서열로 구성되어 있다. 염기서열, 단량체 변형 및 구조는 하기 표 1과 같다.
본 발명에서 사용한 모든 펩티드 핵산은 파나진(PANAGENE, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다(표 1).
비알콜성 지방간염 치료 효과 검증을 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열
번호		 엔도좀탈출
펩타이드		 염기서열 단량체
변형
생활성 핵산 1 - 5'-AC(-)CT(+)CTA(-)CGC(+)AAT(-)CC-O-K-3' -+-+-
2 - 5'-ACG(-)TGC(+)ATT(-)AT(+)CT(-)GA-O-K-3' -+-+-

캐리어 펩티드
핵산		 3 - 5'-TG(+)GAGAT(+)GCGTTA(+)GG-O-K-3' +++
4 - 5'-TGC(+)ACGTAA(+)TAGA(+)CT-O-K-3' +++
5 - 5'-K-O-TC(+)AGAT(+)AATGCA(+)CGT-3' +++
6 - 5'-A(+)GA(+)CT-O-K-3' ++
7 - 5'-K-O-TC(+)AG(+)A-3' ++
상기 표 1 은 NLRP3를 표적으로 하는 비알콜성 지방간염 치료제로서의 효과를 확인하기 위해 사용된 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 및 대조군으로 사용된 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 서열 정보를 나타내었다.
단량체의 변형은 전기적인 성질을 부여하기 위하여 펩티드핵산의 backbone을 전기적 양성은 리신(Lysine, Lys, K, (+)로 표기)을 전기적 음성은 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E, (-)로 표기)로 변형된 펩티드 backbone을 가지도록 제작하였다.
각각의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 조합은 DMSO 하에서 혼성화 되었으며, 그 결과 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 복합체가 제작되었다.
실시예 2: Lipopolysaccharide(LPS)을 이용한 NLRP3 단백질 발현 분석
실시예 1에 따라, 하기 표 2의 구조로 제조된 NLRP3를 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 이용하여 비알콜성 지방간염 억제 효과를 분석하였다.
실시예 2-1: 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 간암 세포 HepG2 (ATCC, HB-8065)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국), 10%(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃5%(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다.
실시예 2-2: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
인간 간암 세포주 HepG2를 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후 실시예 2-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 LPS 2㎍/㎖(Sigma, 미국) 유도하여 24, 48, 72, 96, 120시간 배양한 후, RIPA buffer를 각 웰에 30㎕씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다.
Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30㎍을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 NLRP3 (Abcam, 영국), ASC (Cell signaling Technology, 미국), IL-1β(Abcam, 영국), Caspase-1 (Abcam, 영국)을 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다.
1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Mouse Anti-Goat (Santa cruz Biotechnology, 미국) 를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 인간 간암 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 2 와 같다.
인간 간암 세포주에서 유전자 발현 분석을 위한 핵산 복합체 조합
조합 핵산 복합체
1 서열번호 1 및 3
2 서열번호 2 및 4
3 서열번호 2 및 5
4 서열번호 2 및 6
5 서열번호 2 및 7
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, LPS로 염증이 유도된 HepG2 세포에서 서열번호 2번과 5번 조합의 핵산 복합체 (조합 3)이 96시간까지 표적 유전자인 NLRP3와 하위 유전자가 모두 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
실시예 2-3: 면역 세포 화학(immunocytochemistry)을 통한 단백질 발현 분석
인간 간암 세포주를 8웰 플레이트에 5x103으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후 실시예 2-2의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 4시간 후에 LPS 2㎍/㎖(Sigma, 미국) 처리하여 24, 72시간 동안 배양한 후, 4% 파라포름알데히드(parafomaldehyde)에 고정시킨 후, 0.1% 트리톤(Triton) X-100과 정상 당나귀 혈청(normal donkey serum)으로 블로킹(blocking)을 거치고 1차 항체인 NLRP3 (abcam, 미국)를 1:200으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다.
이후 2차 항체인 Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor®647) (abcam, 미국)를 1:200으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였고 DAPI가 포함된 마운팅제를 이용하여 고정시킨 후 현미경으로 결과를 확인하였다.
본 실시예에서는 LPS를 이용한 비알코올성 지방간염 세포 모델에서의 NLRP3 발현 변화를 면역 세포 화학 염색법을 통해 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 3과 같다.
인간 간암 세포주에서 단백질 발현 분석을 위한 핵산 복합체 조합
조합 핵산 복합체
1 서열번호 1 및 3
3 서열번호 2 및 5
5 서열번호 2 및 6
그 결과, 도 2 에 나타낸 바와 같이, LPS를 처리하여 면역 반응을 활성화시킨 인간 간암 세포주에서 서열번호 2과 서열번호 5의 핵산 복합체 조합 (조합 3)이 비알콜성 지방간염 세포 모델에서 NLRP3 단백질 발현이 시간에 따라 가장 많이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 3: 고지방식이와 STZ(streptozotocin)를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델에서의 비알콜성 지방간염 표현형 효과 분석
실시예 3에서 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델인 STAM mouse model은 1차 Streptozotocin (STZ)를 이용하여 당뇨병을 유발시킨 마우스이며, 2차 고지방 식이를 통해 비알콜성 지방간염을 유도한 동물 모델로 이를 통해 마우스의 간세포 지방 축적, 간세포 독성 유발, 간문맥 및 소엽의 염증성 침윤, 결절 형성이 있는 섬유증, 경화 및 일부 개체에서는 궁극적으로 간세포 암종을 갖는 등 NAFLD (Non-Alcoholic Fatty Liver Disease)에서 NASH (Non-Alcoholic SteatoHepatitis), HCC (Hepatocellular Carcinoma)로 진행되는 입증된 모델이다 (Takakura K et al., World j Gastroenterol. Vol. 24,18 pp. 1989-1994. 2018).
본 연구에서 사용한 STAM 모델은 출생 후 2일에 STZ(streptozotocin)를 단일 피하 주사(200㎍ / 20㎕)로 주사하고, 투여 4주 후 고지방식이를 급여하였다.
병변 유도 이후, 각 실험군 당 세 마리를 사용하여 일주일에 두 번씩 핵산 복합체를 피하 주사로 투여하였고, 양성 대조군의 경우 NLRP3 억제제인 MCC950 (Sigma, 미국)을 10mg/kg의 용량으로 매일 한 번씩 경구 투여하였다. 핵산 복합체와 양성대조군의 2주간 투여 후 모든 동물의 안락사를 수행하였다.
본 실시예에서는 효과가 검증된 핵산 조합체를 선별하여 고지방식이와 STZ(streptozotocin)를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델에서 조직학적 소견, NLRP3 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 4와 같다.
고지방식이와 STZ(streptozotocin)를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델에서 효과 분석을 위한 핵산 복합체 조합
조합 핵산 복합체
1 서열번호 1 및 3
3 서열번호 2 및 5
실시예 3-1: 고지방식이와 STZ(streptozotocin)를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (STAM mouse model)에서의 간 무게와 체중 변화 분석
상기 조건으로 동물 실험 진행 후 생검한 동물의 체중 및 간의 외형을 비교해 크기 및 무게의 차이점을 관측하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군(Scramble control, SC, PNA1, 조합 1, 1mg/kg) 그룹 대비 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체(PNA3, 조합 3)를 처리한 그룹에서 체중 및 간 무게가 감소한 것을 확인하였으며, 특히 간 무게의 경우 핵산 복합체 (조합 3, 1mg/kg)를 처리한 그룹과 양성 대조군 (MCC950)이 유사한 수치로 나타나는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 3-2: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
상기 조건으로 동물 실험을 진행한 후, 마우스 간 조직의 일부를 RIPA buffer를 200 ㎕씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 ㎍을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 NLRP3 (Abcam, 영국), ASC (Cell signaling Technology, 미국), caspase-1 (Abcam, 영국), IL-1β(Abcam, 영국) 를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다.
1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Mouse Anti-Goat (Santa cruz Biotechnology, 미국) 를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 간 조직에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 4와 같이 대조군 대비 핵산 복합체(PNA3, 조합 3)를 처리한 그룹에서 양성대조군 (MCC950)과 유사하게 NLRP3 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자 ASC, pro-caspase-1, pro-IL-1β의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 4).
실시예 3-3: H&E 염색을 이용한 고지방식이와 STZ(streptozotocin)를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (STAM mouse model)에서의 표현형 분석
상기 조건으로 실험을 진행한 동물 조직 중 간 일부분을 절단하여 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 파라핀 포매하여 조직을 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 슬라이드 글라스에 부착된 간 조직을 Hematoxylin:Eoin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세 한 후 현미경으로 형태학적 분석하였다.
비알콜성 지방간염 병리학적 분석은 괴사염증 활성도(necroinflammatory activity, grading) 및 섬유화와 관련된 구조적 이상(architectural alterationsrelated to fibrosis, staging)을 등급화하여 병리학적심화도를 판정하는 기준으로 처음 제시하였다 (Brunt et al., the Americal Journal of Gastroentrology 1999, 94(9).
Grade를 정하는 병리조직학적 기준은 모두 10가지 항목으로 1) 미세 수포성 지방증, 2) 간세포의 풍선화, 3) 소엽의 염증, 4) 간세동이 염증, 5) 말로리 유리질, 6) 호산 성체, 7) 쿠퍼세포, 8) 글리코겐화 핵, 9) 지방 육아종,10) 간세포 내 철 수치 등이다. 이러한 기준을 이용하여 2명의 병리의사가 환자의 정보와 과거 진단을 알지 못한 채, NASH와 단순 지방침착으로 분류하였으나, 2005년 제안된 NAS (NAFLD activiry score) 체계를 이용하여 2명의 병리의사는 다음의 세 가지 기준으로 재분류하였다 (Kleiner et al., Hepatology, 2005).
1) 지방증 (0: 5%이내, 1: 5～33%,2: 33～66%, 3: 66% 이상의 간세포에 침윤이 관찰될 때), 2) 소엽 내 염증 (0: No foci, 1: 4 fociper 200x field), 3) 풍선확장 (0: none, 1: few, 2:many cells/prominent ballooning). 세 가지 기준의 점수를 합산하여 5점 이상일 경우 NASH로, 3점 미만일 경우 NASH가 아니라고 하였으며 3, 4점은 borderline으로 하였다. 비알콜성 지방간염 점수 기준은 하기 표 5 와 같다.
비알콜성 지방간염 동물 모델 임상의 기준
Histologic feature score Definition
Seatosis 0 <5%
1 5-33%
2 34-66%
3 >66%
Hepatocyte ballooning 0 None
1 Few
2 many
Lobular inflammation 0 None
1 1-2 foci per 20 X field
2 2-4 foci per 20 X field
3 >4 foci per 20 X field
NAFLD activity score (NAS); range 0-8
fibrosis 0 <5%
1 5-33%
2 34-66%
3 >66%
그 결과, 도 5a 에서와 같이 STAM 마우스 모델을 통해 유도된 지방증, 세포풍선화, 염증세포 침윤 등 비알콜성 지방간염에서 나타나는 간 조직 내 병변이 대조군(PNA1, 조합 1) 대비 핵산 복합체(PNA3, 조합 3)를 처리한 그룹에서 감소하였으며, NLRP3 억제제인 양성대조군 (MCC950)과 동등한 효과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3-4: ORO 염색을 이용한 고지방식이와 STZ(streptozotocin)를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (STAM mouse model)에서의 간 내 지질 침착 억제 효과 분석
상기 조건으로 동물 실험을 진행한 이후 최종 실험 종료일에 간 조직을 분리하였다. 조직은 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 30% sucrose 용액에 24시간 수분 제거하여 OCT compound를 포매하였다. 이를 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. Oil red O 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 현미경으로 형태학적 분석 진행하였다.
그 결과, 도 5b 에서와 같이 STAM 마우스 모델을 통해 유도된 간 내 지질 침착의 분포와 크기가 대조군 (PNA1, 조합 1) 대비 핵산 복합체(PNA3, 조합 3)를 처리한 그룹에서 감소하였고, 양성대조군 (MCC950)과 유사하게 지방증이 감소한 것을 확인하여 핵산 복합체(PNA3, 조합 3)이 간 조직 내 지방축적을 억제시켜 비알콜성 지방간염 발병을 예방하거나 치료시킬 것으로 예상된다(도 5b).
실시예 3-5: picrosirius red 염색을 이용한 고지방식이와 STZ(streptozotocin)를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (STAM mouse model)에서의 간 섬유화 억제 효과 분석
상기 조건으로 동물 실험을 진행하여 분리한 간 조직은 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 파라핀 포매하여 조직을 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. collagen의 생성을 확인할 수 있는 picrosirius red 염색을 진행하였다. 마운팅한 조직을 picrosirius red 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 간 섬유화 억제 효과를 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 5c 에서와 같이 STAM 마우스 모델을 통해 유도된 간 조직 내 섬유화가 대조군 대비 핵산 복합체(PNA3, 조합 3)를 처리한 그룹에서 양성 대조군 (MCC950)과 유사한 수준으로 감소한 것을 확인하였다(도 5c).
실시예 3-6: 면역 염색을 이용한 고지방식이와 STZ(streptozotocin)를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (STAM mouse model)에서의 조직 내 NLRP3와 하위 단계 유전자인 IL-1β의 발현 변화 분석
상기 조건으로 동물 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 분리한 간 조직을 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 섬유화의 주요 요인인 NLRP3 Inflammasome을 확인하기 위하여 NLRP와 하위 유전자인 IL-1β발현 변화를 분석하였다. 마운팅한 조직을 0.5% BSA 용액에 1시간 동안 블로킹하고, NLRP3 (Abcam, 영국)와 IL-1β1차 항체(Abcam, 영국)을 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다.
이어서 1차 항체 용액을 제거하고 1X TBS로 씻어낸 후 2차 항체 용액 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국)을 1:2000으로 상온에서 2시간 처리한 뒤 DAB 염색을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 6a 및 b에 나타낸 바와 같이, 대조군 조직 내 갈색으로 염색된 NLRP3와 IL-1β의 발현이 확인되었으며, 핵산 복합체를 처리한 군(조합 3)에서 NLRP3와 IL-1β의 발현이 감소한 것이 모든 개체에서 관찰되었다. 이를 수치화하여 비교하였을 때에도 양성대조군과 비슷한 수준으로 각 유전자의 발현이 핵산 복합체(조합 3)에 의해 감소하는 것을 확인하였다(도 6a, b).
실시예 4: 메티오닌/콜린 결핍 식이를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (MCD mouse model) 에서의 비알콜성 지방간염 표현형 효과 분석
실시예 4에서는 비알콜성 지방간염 질환과 유사한 표현형을 보이는 동물 모델 중, MCD (Methionine-Choline Deficient diet) 식이요법을 이용한 동물 모델을 사용하였으며, 해당 식이는 자당과 지방 함유량이 높으면서 간 베타-산화와 VLDL (very low density lipoprotein) 생성에 필수적인 메티오닌과 콜린이 결핍되어 있다. 이 식이요법을 진행한 동물 모델은 간 내 지질 축적 및 VLDL 합성 감소를 초래하는 것으로 알려져 있으며, 2-4주까지 식이 진행 시, 설치류에서 빠른 기간 내에 간 지방증 (주로 거대수포성 지방증)을 유발할 뿐만 아니라 이후 섬유증까지 진행되는 것으로 보고되어 있다.
다만, MCD 식이를 이용한 동물 모델이 비알콜성 지방간염에서 나타나는 질환의 대표적인 표현형은 나타나는 것으로 알려져 있으나, 체중 감소나 인슐린 저항성을 갖지 않는 특징을 보여 비만과 인슐린 저항성을 가지는 실제 NASH 환자의 표현형과는 다소 차이를 보일 수 있다 (Anstee et al., Int J Exp Pathol, Vol. 87(1), pp. 1-16, 2006).
MCD 식이를 이용한 비알콜성 지방간염 동물 모델에서 효능을 검증하기 위하여 7주령 수컷 마우스(코아텍, 한국)를 사용하였다. 일주일 동안 계류 후, 비알콜성 지방간염 모델 유도를 위해 메티오닌/콜린 결핍 식이(두열바이오텍, 한국)를 진행하였으며, 섭취 4주 후 각 실험군 당 여섯 마리를 사용하여 일주일에 두 번씩 대조군(SC, 조합 1) 과 핵산 복합체 (조합 3-1: 0.5 mg/kg, 조합 3-2: 1 mg/kg, 조합 3-3: 2 mg/kg)를 피하 주사를 투여하였다.
양성대조군의 경우 NLRP3 억제제인 MCC950 (Sigma, 미국)을 10mg/kg의 용량으로 매일 한 번씩 경구 투여하였다. 핵산 복합체는 2주간 총 4회 투여하였고 이후 모든 동물의 안락사를 수행하였다.
본 실시예에서는 효과가 검증된 핵산 조합체를 선별하여 메티오닌/콜린 결핍 식이를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델에서 조직학적 소견, NLRP3 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 6와 같다.
메티오닌/콜린 결핍 식이를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델에서 효과 분석을 위한 핵산 복합체 조합
조합 핵산 복합체
1 서열번호 1 및 3
3 서열번호 2 및 5
실시예 4-1: 메티오닌/콜린 결핍 식이를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (MCD mouse model)에서의 체중 변화 분석
상기 조건으로 진행한 동물 실험에서 실험종료 후 체중 및 간의 외형을 비교해 크기 및 무게의 차이점을 관측하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 유도군 (MCD) 및 대조군(Scramble control, SC, 조합 1) 그룹 대비 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체(조합 3)를 처리한 그룹에서 외형상 간의 크기와 갈변 반응이 처리 농도가 높아짐에 따라 회복되었음을 확인하였으며, 특히 양성 대조군 (Gemcitabine, Positive control, PC)을 처리한 그룹보다 간이 붉은색으로 회복된 것을 확인할 수 있었다. MCD 식이 특성상 모델 유도군들은 음성 대조군 (negative control, NC) 대비 체중이 감소하는 패턴을 확인할 수 있는데, 핵산 복합체(조합 3) 투여군에서 대조군 대비 체중 감소에 대한 회복이 미세하게 나타난 것을 확인하였다(도 7).
실시예 4-2: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
상기 조건으로 동물 실험을 진행한 후, 생검한 마우스 간 조직의 일부를 RIPA buffer를 200 ㎕씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 ㎍을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 NLRP3 (Abcam, 영국), ASC (Cell signaling Technology, 미국), caspase-1 (Abcam, 영국), IL-1β(Abcam, 영국) 를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다.
1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Mouse Anti-Goat (Santa cruz Biotechnology, 미국) 를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 간 조직에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 8에 기재된 바와 같이 대조군 대비 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체(조합 3)를 처리한 그룹에서 NLRP3 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자 ASC, pro-caspase-1, pro-IL-1β의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 특히 핵산 복합체 조합 3-1, 3-2 및 3-3의 농도를 처리한 군에서 표적 유전자의 발현이 양성 대조군 (MCC950)과 유사하게 감소한 것을 확인하였다 (도 8).
실시예 4-3: H&E 염색을 이용한 메티오닌/콜린 결핍 식이를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (MCD mouse model)에서의 표현형 분석
상기 조건으로 동물 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 분리한 간 조직을 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 파라핀 포매하였고, 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 마운팅한 조직을 Hematoxylin:Eosin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 형태학적인 소견을 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 9a 에 기재된 바와 같이 MCD 식이에 의해 유도된 비알콜성 지방간염에서 나타나는 질환 표현형 (지방증, 세포풍선화, 염증세포 침윤 등)이 대조군 대비 핵산 복합체(조합 3)를 처리한 그룹에서 감소하여 병변이 개선된 것을 확인하였다. 실시예 3-3에 기재된 NAFLD activity score에서 특히 핵산 복합체 3-1 및 3-2의 농도를 처리한 군에서는 NLRP3 억제제인 양성대조군과 비슷한 수준으로 회복된 것을 확인하였다(도 9a).
실시예 4-4: ORO 염색을 이용한 메티오닌/콜린 결핍 식이를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (MCD mouse model)에서의 간 내 지질 침착 억제 효과 분석
상기 조건으로 실험을 진행한 후 생검한 마우스의 간 조직을 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 30% sucrose 용액에 24시간 수분 제거하여 OCT compound 포매하였다. 이를 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 마운팅한 조직을 Oil red O 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 형태학적인 소견을 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 9b 에 기재된 바와 같이 MCD 식이에 의해 유도된 간 조직 내 붉은색 방울로 염색된 형태의 지질 침착이 질환 유도군 (MCD)에서 확인되었고, 유도군 및 대조군 (PNA1, 조합 1) 대비 핵산 복합체(PNA3, 조합 3)를 처리한 그룹에서 붉은색으로 염색된 지방 방울의 분포나 크기가 감소한 것을 확인하였다(도 9b).
실시예 4-5: picrosirius red 염색을 이용한 메티오닌/콜린 결핍 식이를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (MCD mouse model)에서의 간 섬유화 억제 효과 분석
실시예 4-3과 동일한 조건으로 고정, 파라핀 포매 및 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅한 조직을 picrosirius red 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 형태학적인 소견을 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 9c 에 기재된 바와 같이 MCD 식이에 의해 붉게 염색된 간 섬유화의 특징들이 대조군 대비 핵산 복합체(PNA3, 조합 3)를 처리한 그룹에서 감소한 것을 확인하였으며, 핵산 복합체를 처리한 모든 농도 (PNA3-1, 3-2, 3-3)에서 NLRP3 억제제인 양성대조군과 동등한 효과를 나타난 것을 확인할 수 있었다(도 9c).
실시예 5: 고지방/고콜레스테롤 식이와 과당/포도당 음수를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (HFHC+F/G mouse model)에서의 비알콜성 지방간염 표현형 효과 분석
비알콜성 지방간염 질환과 유사한 표현형을 유도하기 위해 사용된 동물 모델인 HFHC+F/G (High Fat High Cholesterol + Fructose/Glucose) 식이요법은 설치류 모델에서 체중, 체지방을 증가시키고, 간의 지방을 빠르게 축적시킬 수 있을 뿐만 아니라, 간 인슐린 저항성도 증가시킬 수 있다(Liu, XJ. et al., Lab. Invest. Vol. 98, pp. 1184-1199, 2018).
HFHC+F/G 식이를 통한 비알콜성 지방간염 동물 모델에서 효능을 검증하기 위하여 7주령 수컷 마우스(코아텍, 한국)를 사용하였다. 비알콜성 지방간염 모델 유도를 위해 고지방/고콜레스테롤 식이(라온바이오, 한국)와 과당/포도당(sigma, 미국)을 16주 동안 섭취한 후 각 실험군 당 다섯 마리를 사용하여 일주일에 세 번씩 핵산 복합체를 피하 주사를 투여하였다. 양성 대조군의 경우 NLRP3 억제제인 MCC950 (Sigma, 미국)을 10mg/kg의 용량으로 매일 한 번씩 경구 투여하였다. 핵산 복합체와 양성대조군의 4주간 투여 종료 후 모든 동물의 안락사를 수행하였다.
본 실시예에서는 효과가 검증된 핵산 조합체를 선별하여 고지방 고콜레스테롤 식이와 과당/포도당 음수를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델에서 조직학적 소견, NLRP3 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 7과 같다.
고지방/고콜레스테롤 식이 및 과당/포도당 음수를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델에서 효과 분석을 위한 핵산 복합체 조합
조합 핵산 복합체
3 서열번호 2 및 5
실시예 5-1: 고지방/고콜레스테롤 식이와 과당/포도당 음수를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (HFHC+F/G mouse model)에서 간의 표현형 및 체중 변화 분석
상기 조건으로 진행한 동물 실험에서 실험종료 후 체중 및 간의 외형을 비교하기 위해 간 색깔을 관찰하고 크기와 무게를 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 간의 색을 육안으로 비교하였을 때, 매끈하고 붉은색을 띠는 정상적인 간에 비해 HFHC+F/G 식이로 유도한 비알콜성 지방간염 대조군과 양성대조군 (MCC950, Positive control, PC) 그룹은 색이 노랗게 변하고 비대해지는 것이 관찰되었다. 반면, 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체(조합3, 1mg/kg)를 처리한 그룹에서는 간의 크기와 무게가 대조군 대비 감소 되었으며 간의 색이 붉게 변화된 것이 관찰되었다. 또한, 핵산 복합체(조합3) 투여군에서 대조군 대비 통계적으로 유의한 체중 감소가 나타났다.
실시예 5-2: 효소결합면역흡착검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 분석을 이용한 간 기능 개선 효과 분석
상기 조건으로 실험을 진행하여 동물 실험 종료 이전에 혈액 채취 후 13000rpm, 4℃원심분리기를 이용하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 Alanine Aminotransferase (ALT or SGPT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit (biovision, 미국), Aspartate Aminotransferase (AST or SGOT) Activity Colorimetric Assay Kit (biovision, 미국), Triglyceride Assay Kit (Abcam, 영국), Cholesterol Assay Kit (Abcam, 영국)를 사용하여 OD (optical density)를 spectrophotometer로 측정하여 분석하였다.
그 결과, 도 11에 기재된 바와 같이 대조군 대비 핵산 복합체(조합3)를 처리한 그룹에서 급성 간 손상 마커인 ALT(Alanine Aminotransferase)와 중성지방 마커인 TG(Triglyceride)의 수치가 대조군과 양성대조군 대비 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 반면, AST(Aspartate Aminotransferase) 의 변화는 관찰되지 않았다.
실시예 5-3: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
상기 조건으로 진행한 동물 실험 종료 후 생검한 마우스 간 조직의 일부에 RIPA buffer 200 ㎕씩 첨가하여 얻어진 protein lysate는 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 정량하였다. 단백질 30 ㎍을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 NLRP3 (Abcam, 영국), ASC (Cell signaling Technology, 미국), caspase-1 (Abcam, 영국), IL-1β(Abcam, 영국) 를 1:1000으로 처리하여 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다.
1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Mouse Anti-Goat (Santa cruz Biotechnology, 미국) 를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 12에 기재된 바와 같이 모델 유도군 및 대조군 대비 핵산 복합체(조합3)를 처리한 그룹에서 NLRP3 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자 ASC, pro-caspase-1, pro-IL-1β의 발현이 모두 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 12).
실시예 5-4: 고지방/고콜레스테롤 식이와 과당/포도당 음수를 사용한 비알코올성 지방간염 동물 모델 (HFHC+F/G mouse model)에서 H&E 염색을 통한 표현형 분석
상기 조건으로 동물 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 간 조직을 분리하였다. 조직은 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 파라핀 포매하여 조직을 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 마운팅한 조직을 Hematoxylin:Eoin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 형태학적인 소견을 현미경으로 분석하였다.
도 13a 에 기재된 바와 같이 HFHC+F/G 식이로 나타나는 지방간염의 질환 표현형인 지방증, 세포풍선화, 염증세포 침윤 등을 실시예 3-3에 기재된 NAFLD activity score로 분석하였다. 그 결과, 대조군 대비 핵산 복합체(조합3)를 처리한 그룹에서 감소하였으며, NLRP3 억제제인 양성 대조군과 동등한 효과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5-5: ORO 염색을 이용한 고지방/고콜레스테롤 식이와 과당/포도당 음수를 사용한 비알코올성 지방간염 동물 모델 (HFHC+F/G mouse model)에서의 간 내 지질 침착 억제 효과 분석
상기 조건으로 동물 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 간 조직을 분리하였다. 조직은 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 30% sucrose 용액에 24시간 수분 제거하여 OCT compound 포매하였다. 이를 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 마운팅한 조직을 Oil red O 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 형태학적인 소견을 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 13b 에 기재된 바와 같이 HFHC+F/G 식이에 의해 유도된 간 조직 내 지질 침착이 붉은색으로 간 조직 전체에 분포되어 있는 것이 확인되었다. 핵산 복합체(조합3)를 처리한 그룹에서는 지질덩어리의 분포가 대조군 대비 드물게 관찰되며 양성 대조군과 비슷한 수준으로 감소된 효과가 확인되었다.
실시예 5-6: picrosirius red/fast green 염색을 이용한 고지방/고콜레스테롤 식이와 과당/포도당 음수를 사용한 비알코올성 지방간염 동물 모델 (HFHC+F/G mouse model)에서의 간 섬유화 억제 효과 분석
상기 조건으로 동물 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 간 조직을 분리하였다. 조직은 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 파라핀 포매하여 조직을 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 마운팅한 조직을 picrosirius red/fast green 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 형태학적인 소견을 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 13c 에 기재된 바와 같이 HFHC+F/G 식이에 의해 유도된 간 섬유화가 대조군 대비 핵산 복합체(조합3)를 처리한 그룹에서 감소하였으며, NLRP3 억제제인 양성 대조군과 동등한 효과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 고지방/고콜레스테롤 식이와 과당/포도당 음수를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (HFHC+F/G mouse model)에서의 투여 기간 증가에 따른 비알콜성 지방간염 표현형 효과 분석
비알콜성 지방간염과 유사한 표현형을 가지는 동물 모델로서 실시예 5에서 사용한 HFHC+F/G 식이 모델에서 핵산 복합체 (조합 3)을 4주간 투여한 후 효능을 검증한 결과, 비알콜성 지방간염에서 나타나는 표현형 및 표적 유전자의 발현을 효과적으로 억제하는 결과를 얻었으며, 이를 토대로 동일한 동물 모델에서 핵산 복합체 (조합 3)의 투여 기간을 8주로 연장하여 변경한 후 치료 효과를 검증하기 위하여 7주령 수컷 마우스(코아텍, 한국)를 사용하였다.
비알콜성 지방간염 모델 유도를 위해 고지방/고콜레스테롤 식이(라온바이오, 한국)와 과당/포도당(sigma, 미국)을 16주 동안 섭취한 후 각 실험군 당 다섯 마리를 사용하여 일주일에 세 번씩 핵산 복합체를 피하 주사를 투여하였다. 양성 대조군의 경우 NLRP3 억제제인 MCC950 (Sigma, 미국)을 10mg/kg의 용량으로 매일 한 번씩 경구 투여하였다. 핵산 복합체와 양성대조군의 8주간 투여 종료 후 모든 동물은 안락사 수행하였다.
본 실시예에서는 실시예 ５에서 검증한 핵산 복합체를 동일한 동물 모델 (HFHC+F/G mouse model)에 투여 기간을 늘렸을 시의 조직학적 소견, NLRP3 유전자 발현 변화 등 병변 개선 여부를 통해 효과를 검증하고자 하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 8과 같다.
고지방/고콜레스테롤 식이 및 과당/포도당 음수를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델에서 효과 분석을 위한 핵산 복합체 조합
조합 핵산 복합체
3 서열번호 2 및 5
실시예 6-1: 고지방/고콜레스테롤 식이와 과당/포도당 음수를 사용한 비알콜성 지방간염 동물 모델 (HFHC+F/G mouse model)에서 간의 표현형 및 체중 변화 분석
상기 조건으로 진행한 동물 실험에서 실험종료 후 체중 및 간의 외형을 비교하기 위해 간 색깔을 관찰하고 크기와 무게를 측정하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 간의 색을 육안으로 비교하였을 때, 매끈하고 붉은색을 띠는 정상적인 간에 비해 HFHC+F/G 식이로 유도한 비알콜성 지방간염 대조군과 양성대조군 (MCC950, Positive control, PC) 그룹은 색이 노랗게 변하고 비대해지는 것이 관찰되었다. 반면, 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체(PNA3, 조합 3)를 처리한 그룹에서는 간의 크기와 무게가 대조군에 대비 감소되었으며 간의 색이 붉게 변화된 것이 관찰되었다.
실시예 6-2: 효소결합면역흡착검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 분석을 이용한 간 기능 개선 효과 분석
상기 조건으로 실험을 진행하여 동물 실험 종료 이전에 혈액 채취 후 13000rpm, 4℃원심분리기를 이용하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 Alanine Aminotransferase (ALT or SGPT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit (biovision, 미국), Aspartate Aminotransferase (AST or SGOT) Activity Colorimetric Assay Kit (biovision, 미국), Triglyceride Assay Kit (Abcam, 영국), Cholesterol Assay Kit (Abcam, 영국)를 사용하여 OD (optical density)를 spectrophotometer로 측정하여 분석하였다.
그 결과, 도 15에 기재된 바와 같이 대조군 대비 핵산 복합체(조합8)를 처리한 그룹에서 급성 간 손상 마커인 ALT(Alanine Aminotransferase)와 만성 간 손상 마커인 AST(Aspartate Aminotransferase) 및 중성지방 마커인 TG(Triglyceride)의 수치가 대조군과 양성대조군 대비 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6-3: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
상기 조건으로 진행한 동물 실험 종료 후 생검한 마우스 간 조직의 일부에 RIPA buffer 200 ㎕씩 첨가하여 얻어진 protein lysate는 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 정량하였다. 단백질 30 ㎍을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 NLRP3 (Abcam, 영국), ASC (Cell signaling Technology, 미국), caspase-1 (Abcam, 영국), IL-1β(Abcam, 영국) 를 1:1000으로 처리하여 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다.
1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Mouse Anti-Goat (Santa cruz Biotechnology, 미국) 를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 16에 기재된 바와 같이 모델 유도군 및 대조군 대비 핵산 복합체(조합3)를 처리한 그룹에서 NLRP3 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자 ASC, pro-caspase-1, pro-IL-1β의 발현이 모두 감소한 것을 확인할 수 있었다 (도 16).
실시예 6-4: 고지방/고콜레스테롤 식이와 과당/포도당 음수를 사용한 비알코올성 지방간염 동물 모델 (HFHC+F/G mouse model)에서 H&E 염색을 통한 표현형 분석
상기 조건으로 동물 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 간 조직을 분리하였다. 조직은 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 파라핀 포매하여 조직을 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 마운팅한 조직을 Hematoxylin:Eoin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 형태학적인 소견을 현미경으로 분석하였다.
도 17a 에 기재된 바와 같이 HFHC+F/G 식이로 나타나는 지방간염의 질환 표현형인 지방증, 세포풍선화, 염증세포 침윤 등을 실시예 3-3에 기재된 NAFLD activity score로 분석하였다. 그 결과, 대조군 대비 핵산 복합체(조합3)를 처리한 그룹에서 감소하였으며, NLRP3 억제제인 양성 대조군과 동등한 효과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6-5: ORO 염색을 이용한 고지방/고콜레스테롤 식이와 과당/포도당 음수를 사용한 비알코올성 지방간염 동물 모델 (HFHC+F/G mouse model)에서의 간 내 지질 침착 억제 효과 분석
상기 조건으로 동물 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 간 조직을 분리하였다. 조직은 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 30% sucrose 용액에 24시간 수분 제거하여 OCT compound 포매하였다. 이를 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 마운팅한 조직을 Oil red O 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 형태학적인 소견을 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 17b 에 기재된 바와 같이 HFHC+F/G 식이에 의해 유도된 간 조직 내 지질 침착이 붉은색으로 간 조직 전체에 분포되어 있는 것이 확인되었다. 핵산 복합체(조합3)를 처리한 그룹에서는 지질 침착의 분포가 대조군 대비 드물게 관찰되며 양성 대조군과 비슷한 수준으로 감소된 효과가 확인되었다.
실시예 6-6: picrosirius red/fast green 염색을 이용한 고지방/고콜레스테롤 식이와 과당/포도당 음수를 사용한 비알코올성 지방간염 동물 모델 (HFHC+F/G mouse model)에서의 간 섬유화 억제 효과 분석
상기 조건으로 동물 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 간 조직을 분리하였다. 조직은 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 파라핀 포매하여 조직을 5 ㎛로 섹션하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 마운팅한 조직을 picrosirius red/fast green 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 형태학적인 소견을 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 17c 에 기재된 바와 같이 HFHC+F/G 식이에 의해 유도된 간 섬유화가 대조군 대비 핵산 복합체(조합3)를 처리한 그룹에서 감소하였으며, NLRP3 억제제인 양성 대조군과 동등한 효과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 토대로, 핵산 복합체 8의 투여 기간을 늘렸을 경우, HFHC+F/G 식이로 유도한 비알콜성 지방간염 대조군에서는 병변이 더 악화된 반면, 서열번호 2번과 5번의 핵산 복합체(PNA3, 조합 3)를 처리한 그룹에서는 간 섬유화 및 간 내 지질 침착 등 비알콜성 지방간염의 질환 표현형이 더 효과적으로 개선되는 것을 확인할 수 있었으며, 표적 유전자인 NLRP3의 발현 및 하위 유전자의 발현도 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SEASUN THERAPEUTICS <120> Composition for Preventing or Treating Non-Alcoholic SteatoHepatitis Comprising Peptide Nucleic Acid Complex <130> P21-B108 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control <400> 1 acctctacgc aatcc 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bioactive PNA <400> 2 acgtgcatta tctga 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 1 <400> 3 tggagatgcg ttagg 15 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 2 <400> 4 tgcacgtaat agact 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 3 <400> 5 tcagataatg cacgt 15 <210> 6 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 4 <400> 6 agact 5 <210> 7 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 5 <400> 7 tcaga 5 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> endosome escaping helper <400> 8 Gly Leu Phe Asp Ile Ile Lys Lys Ile Ala Glu Ser Phe 1 5 10

Claims (10)

  1. 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 생활성 펩티드 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 펩티드는 GLFDIIKKIAESF(서열번호 8) 또는 Histidine(10)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020210071431A 2021-06-02 2021-06-02 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 조성물 KR102630164B1 (ko)

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