ES2909245T3 - Método para producir liposomas - Google Patents

Abstract

Un método para producir un liposoma, que comprende: una etapa de mezcla de una fase oleosa con al menos un lípido disuelto en un disolvente orgánico y una fase acuosa y de agitación de una solución acuosa que contiene los lípidos; y una etapa de evaporación de un disolvente orgánico de la solución acuosa que contiene liposomas obtenida en la etapa de agitación, caracterizado por que la solución acuosa que contiene liposomas obtenida en la etapa de agitación es una solución acuosa de tipo AC/A, el disolvente orgánico es un disolvente mixto de un disolvente orgánico soluble en agua que es etanol y un disolvente orgánico a base de éster que es acetato de etilo, una relación en masa de disolvente orgánico soluble en agua:disolvente orgánico a base de éster es de 90:10 a 30:70, el tamaño promedio de partícula del liposoma es de 2 a 200 nm, según lo medido por un método de dispersión de luz no se lleva a cabo un procesamiento de clasificación por tamaño, y por que la etapa de agitación imparte un cizallamiento a una velocidad circunferencial de 20 m/s o más a una solución acuosa que contiene lípidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir liposomas

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para producir un liposoma. De manera más específica, la presente invención se refiere a un método para producir un liposoma que puede ser utilizado preferentemente para aplicaciones farmacéuticas.

2. Descripción de la técnica relacionada

Un liposoma (en lo sucesivo, también denominado vesícula lipídica) es una vesícula cerrada formada por una membrana de bicapa lipídica constituida por lípidos, y que tiene una fase acuosa (fase acuosa interna) dentro del espacio de la vesícula cerrada. Los liposomas suelen estar presentes en un estado de dispersión en una solución acuosa (fase acuosa externa) fuera de la vesícula cerrada. Los liposomas se han estudiado para varias aplicaciones, tales como sensores inmunitarios, glóbulos rojos artificiales y vehículos de sistemas de administración de fármacos que aprovechan características tales como la capacidad de barrera, la capacidad de retención de compuestos, la biocompatibilidad, el grado de libertad para establecer el tamaño de partícula, la fácil biodegradabilidad, y las propiedades modificadoras de la superficie. En las aplicaciones de vehículo, los liposomas pueden encapsular compuestos solubles en agua, materiales lipófilos de bajo peso molecular, polímeros y una amplia gama de materiales.

En el caso de que los liposomas se utilicen particularmente como vehículo para un sistema de administración de fármacos, es necesario hacer que el tamaño de partícula sea de aproximadamente 200 nm o menos en términos de permeación a través de una membrana biológica. Asimismo, en un vehículo para un sistema de administración de fármacos, también es necesario tener liposomas que formen partículas que tengan una buena dispersabilidad en las condiciones de temperatura de aproximadamente 37 °C que es la temperatura corporal de un mamífero. En particular, con respecto a las partículas finas de tamaño nanométrico, se prefiere impartir estabilidad durante la conservación desde varios puntos de vista tales como agregación, precipitación y fuga de fármacos.

Como un vehículo para un sistema de administración de fármacos, en el caso de que se administre un fármaco (solución o similar que contiene liposomas que contienen un fármaco) mediante inyección intravenosa, se requiere una alta seguridad para un producto de inyección intravenosa. No son deseables aditivos como disolventes clorados, por ejemplo cloroformo, o coadyuvantes dispersantes cuyo uso no está permitido. Además, también es necesario impartir estabilidad como un producto farmacéutico y, en consecuencia, se requiere la supresión de la fuga farmacéutica, la descomposición de lípidos o similares tras el almacenamiento. Asimismo, también se requiere idoneidad para la filtración estéril con el fin de garantizar la esterilidad. Cuando se desea producir liposomas como producto farmacéutico a escala industrial, es necesario tener en cuenta los requisitos descritos anteriormente.

Por ejemplo, el método de producción de liposomas a escala industrial puede ser un método de emulsificación. El documento JP1994-65381B (JP-H06-65381B) divulga un método para producir un líquido de dispersión acuosa de vesículas lipídicas lamelares, que incluye una etapa de adición de una solución donde al menos un lípido se disolvió en al menos un disolvente orgánico a una temperatura de aproximadamente 35 °C a 55 °C a una fase acuosa, una etapa de agitación para dispersar la mezcla resultante, y además una etapa de evaporación del disolvente orgánico junto con una porción de agua en el disolvente. El disolvente orgánico es inmiscible con el agua, y una cantidad de cada una de las dos fases en este método se ajusta para que se obtenga un líquido de dispersión de aceite en agua (AC/A). Asimismo, cabe suponer que la formación de liposomas se logra a medida que la agitación se lleva a cabo vigorosamente de modo que la fase continua del líquido de dispersión es siempre una fase acuosa. Sin embargo, dado que el método descrito en el documento JP1994-65381B (JP-H06-65381B) emplea disolventes orgánicos clorados, tales como diclorometano y cloroformo, como disolventes orgánicos inmiscibles en agua, puede ser necesario hacer frente a los problemas de seguridad de las condiciones de trabajo y de los liposomas a producir. Asimismo, en este método, si se desea formar vesículas estables, puede ser necesario la adición de un estabilizador distinto de los lípidos o un proceso de clasificación por tamaño desde el punto de vista de conseguir un tamaño de partícula más fino.

El documento JP1996-24840B (JP-H08-24840B) divulga un método para preparar un liposoma de tamaño submicrónico por medio de la adición de lípidos anfifílicos disueltos en etanol a una fase acuosa mientras se agita la fase acuosa con un agitador magnético. De acuerdo con este método, es posible fabricar liposomas por medio de la adición de principios activos farmacológicos o precursores farmacológicos, reactivos biológicos o cosméticos a una fase acuosa o a una fase orgánica.

Sin embargo, los lípidos anfifílicos se limitan a aquellos que son solubles en etanol, y los fosfolípidos aplicables son solo lecitinas. Por tanto, es difícil preparar liposomas en los que se mezclan varios fosfolípidos en una relación arbitraria. Asimismo, dado que el tamaño de partícula aumenta con la eliminación de un disolvente en este método, se requiere un procesamiento utilizando un filtro de membrana que tenga poros uniformes o similares con el fin de alinear un tamaño de partícula.

El documento JP1995-68119B (JP-H07-68119B) divulga un método para formar un liposoma por medio de la disolución de fosfolípidos en un disolvente orgánico que puede mezclarse con un componente acuoso, tal como alcohol, mezcla y dispersión de los fosfolípidos en una cantidad suficiente del componente acuoso para preparar una fase única y luego evaporación del disolvente para formar una membrana fina lipídica, adición de un componente acuoso a la película fina lipídica y agitación de la mezcla resultante para formar un liposoma. Aunque se ha descrito que mediante este método se puede producir un liposoma estable adecuado para inyección, no hay descripción alguna sobre el tamaño de partícula ni sobre la estabilidad de la dispersión de los liposomas producidos.

Aunque el documento WO2011/062255A divulga un método para formar partículas finas mediante dos etapas de una etapa de emulsificación y una etapa de eliminación de disolvente utilizando un disolvente mixto que contiene al menos dos disolventes orgánicos, se utilizan dos grupos disolvente, es decir, el grupo disolvente A que consiste en hidrocarburos y el grupo disolvente B que consiste en éster, alcohol, éter, disolventes clorados tales como cloroformo, y similares en combinación. Se utilizan disolventes que conllevan un riesgo de causar efectos en el cuerpo humano, tales como hexano o cloroformo. Asimismo, también hay una descripción de que un dispersante indeseable como una inyección, tal como Pluronic, se utiliza a efectos de miniaturización. En el caso de que no se utilicen estos dispersantes, el tamaño de partícula es de aproximadamente 135 nm, lo que no puede decirse que sea suficiente para la formación de partículas finas de 100 nm o menos. Asimismo, no hay descripción alguna sobre la estabilidad durante la conservación requerida para los productos farmacéuticos.

Generalmente, los tensioactivos, tales como un dispersante (en la presente invención, el dispersante también incluye un coadyuvante de dispersión), reducen eficazmente la tensión interfacial y, por lo tanto, son útiles para la miniaturización en una etapa de emulsificación. Sin embargo, el dispersante está presente en al menos una superficie de las superficies hidrófilas e hidrófobas, y por tanto puede facilitar la fuga de un fármaco debido a la difusión de un fármaco encapsulado. Además, desde el punto de vista de la seguridad, solo se ha aprobado un pequeño material para el dispersante para uso como una inyección intravenosa.

Asimismo, en el caso de someter a los liposomas a un procesamiento de clasificación por tamaño, por ejemplo, el procesamiento de extrusión es un método para extruir una mezcla que contiene liposomas de los orificios finos de un filtro utilizando una extrusora para preparar de esta manera liposomas. Aunque los liposomas con un tamaño de partícula fino y una pequeña variación de tamaño se obtienen de acuerdo con este método, puede haber casos en los que se produzca la obstrucción del filtro de una extrusora, la deformación de los liposomas, o similares, y por lo tanto el procesamiento de clasificación por tamaño no es preferible para la producción eficiente de liposomas a escala industrial.

En todos los documentos mencionados anteriormente, no existe casi ningún informe que confirme la propiedad de conservación actual a largo plazo prácticamente requerida. No se ha establecido completamente un método para producir un liposoma que tenga seguridad y estabilidad, y se desean las correspondientes mejoras.

Sumario de la invención

La presente invención se ha realizado en vista de las circunstancias anteriores, y un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir un liposoma que tenga seguridad y estabilidad. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir un liposoma que tenga seguridad y estabilidad, un tamaño promedio de partícula específico y una distribución uniforme del tamaño de partícula.

Los presentes inventores han descubierto que un liposoma fino y homogéneo que encapsula un fármaco y que tiene una alta estabilidad durante la conservación puede prepararse sin utilizar disolventes orgánicos o aditivos que conlleven un riesgo de seguridad como una inyección, utilizando un método para producir un liposoma, que es como se define en la reivindicación 1. Las características del preámbulo son conocidas de Shrenik P. Shah et al.: "Liposomal Amikacin Dry Powder Inhaler: Effect of Fines on In Vitro Performance", AAPS PharmSciTech, 2004, 5 (4) Artículo 65, recuperado de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pcm/articles/PMC2750490/pdf/12249_2008_Article_5465.pdf.

De acuerdo con el método para producir un liposoma de la presente invención, es posible proporcionar un liposoma que no utilice un disolvente orgánico indeseable tal como cloroformo, cloruro de metileno, hexano o ciclohexano, o un aditivo tal como un coadyuvante de dispersión que no está aprobado para su uso en una inyección intravenosa en aplicaciones farmacéuticas, es particularmente adecuado para uso farmacéutico, y que tenga un tamaño promedio de partícula de 200 nm o menos, una distribución uniforme del tamaño de partícula, y una excelente estabilidad durante la conservación.

Asimismo, de acuerdo con otro aspecto del método de producción de la presente invención, es posible proporcionar un liposoma que tenga una buena idoneidad de producción (por ejemplo, idoneidad de esterilización por filtración), un diámetro promedio de partícula de 200 nm o menos, una distribución uniforme del tamaño de partícula, y también una excelente estabilidad durante la conservación.

Asimismo, de acuerdo con otro aspecto más del método de producción de la presente invención, es posible producir eficientemente un liposoma que es capaz de lograr la totalidad de un tamaño promedio de partícula y una distribución de tamaño de partícula, una idoneidad de producción (por ejemplo, producción de liposomas homogéneos y finos sin procesamiento de clasificación por tamaño, idoneidad de esterilización por filtración, o similares), y una estabilidad durante la conservación requerida para una formulación, que son adecuados para uso farmacéutico, a escala industrial.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico de una cantidad de filtración (g) y un tiempo (min).

La Fig. 2 es un gráfico de un tamaño de partícula (nm) de los liposomas y un porcentaje de acetato de etilo (%).

Descripción de las realizaciones preferidas

El término "etapa" como se utiliza en el presente documento no es solo una etapa independiente, sino también una etapa que puede no estar claramente separada de otra etapa, en la medida en que se pueda lograr un efecto esperado de la etapa.

Los intervalos de valores numéricos mostrados con "a" en la presente memoria descriptiva significa intervalos que incluyen los valores numéricos indicados antes y después de "a" como los valores mínimo y máximo, respectivamente.

En la presente invención, salvo que se indique lo contrario, % significa porcentaje en masa.

Al referirse en el presente documento al contenido de un componente en una composición, en un caso en donde existan varias sustancias correspondientes a un componente en la composición, el contenido significa, salvo que se indique lo contrario, la cantidad total de las diversas sustancias que existen en la composición.

En lo sucesivo en el presente documento, se describirá en detalle la presente invención.

La presente invención es un método para producir un liposoma, que incluye:

una etapa de mezcla de una fase oleosa con al menos un lípido disuelto en un disolvente orgánico y una fase acuosa y de agitación de una solución acuosa que contiene los lípidos;

una etapa de evaporación de un disolvente orgánico de la solución acuosa que contiene liposomas obtenida en la etapa de agitación, y en donde

la etapa de agitación imparte cizallamiento a una velocidad circunferencial de 20 m/s o más a una solución acuosa que contiene lípidos,

en la que el disolvente orgánico es un disolvente mixto de un disolvente orgánico soluble en agua y un disolvente orgánico a base de éster como se define en la reivindicación 1.

(Liposoma)

El liposoma es una vesícula cerrada formada por una membrana de bicapa lipídica constituida por lípidos, y que tiene una fase acuosa (fase acuosa interna) dentro del espacio de la vesícula cerrada. La fase acuosa interna contiene agua y similares. El liposoma habitualmente está presente en un estado de dispersión en una solución acuosa (fase acuosa externa) fuera de la vesícula cerrada. El liposoma puede ser monolamelar (que también se conoce como lamelar monocapa o unilamelar, y es una estructura que tiene una sola membrana bicapa) o lamelar multicapa (que también se conoce como multilaminar y es una estructura similar a una cebolla que tiene múltiples membranas bicapa donde las capas individuales están compartimentadas por capas acuosas). En la presente invención, desde el punto de vista de la seguridad y estabilidad en aplicaciones farmacéuticas se prefiere un liposoma monolamelar.

El liposoma no está particularmente limitado en términos de forma siempre que sea un liposoma capaz de encapsular un fármaco o similares. El "encapsulamiento" significa que un fármaco o similares adopta una forma tal como encapsulación, envoltura o deposición con respecto al liposoma. Por ejemplo, el liposoma puede ser una forma donde un fármaco o similares se envuelve dentro de un espacio cerrado formado por una membrana, una forma donde un fármaco o similares se encapsula en la propia membrana, una forma donde un fármaco se deposita en la superficie de un liposoma (por ejemplo, una forma donde un fármaco está presente en al menos una superficie de una membrana externa y una superficie de una membrana interna de una bicapa lipídica) o una combinación de las mismas.

El tamaño (tamaño medio de partícula) de un liposoma no está particularmente limitado y es de 2 a 200 nm, preferentemente de 5 a 150 nm, más preferentemente de 5 a 120 nm, y aún más preferentemente de 5 a 100 nm. En la presente invención, el "tamaño promedio de partícula" significa un valor medio de los diámetros de los liposomas medidos mediante un método de dispersión de luz.

El liposoma tiene preferentemente forma esférica o una morfología cercana a la misma.

El componente (componente de la membrana) que constituye la bicapa lipídica de un liposoma se selecciona de lípidos. Como el lípido, se puede utilizar cualquiera siempre que se disuelva en un disolvente mixto de un disolvente orgánico soluble en agua y un disolvente orgánico a base de éster. Los ejemplos específicos de lípidos incluyen fosfolípidos, lípidos distintos de los fosfolípidos, colesteroles y derivados de los mismos. Estos componentes pueden estar compuestos por un solo componente o múltiples componentes.

Los ejemplos de fosfolípido incluyen fosfolípidos naturales y sintéticos tales como fosfatidilcolina (lecitina), fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, y cardiolipina, o productos hidrogenados de los mismos (por ejemplo, fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC)). Entre estos, se prefiere un fosfolípido hidrogenado tal como fosfatidilcolina de soja hidrogenada o esfingomielina, y más preferido es la fosfatidilcolina de soja hidrogenada. En la presente invención, el "fosfolípido" también abarca un derivado de fosfolípido en donde el fosfolípido está modificado.

Los lípidos distintos de los fosfolípidos pueden ser lípidos que no contienen ácido fosfórico, y los ejemplos de los mismos incluyen, pero sin limitarse particularmente a, glicerolípido que no contiene un resto de ácido fosfórico en la molécula, y esfingolípido que no contiene un resto de ácido fosfórico en la molécula. En la presente invención, la expresión "lípidos distintos de los fosfolípidos" también abarca derivados de lípidos distintos de los fosfolípidos en los que se han realizado modificaciones en lípidos distintos de los fosfolípidos.

En el caso de que el lípido distinto del fosfolípido contenga un grupo funcional básico, por ejemplo, en el caso de que el lípido distinto del fosfolípido sea un material en donde un compuesto que tiene un grupo funcional básico esté unido a un lípido, el lípido se denomina un lípido cationizado. El lípido cationizado, por ejemplo, permite modificar la membrana del liposoma y por lo tanto puede mejorar la adhesividad a las células que son sitios diana.

Los ejemplos de los colesteroles incluyen colesterol. Cuando el tamaño promedio de partícula disminuye a 100 nm o menos, la curvatura de la membrana lipídica aumenta. Dado que la deformación de la membrana dispuesta en el liposoma también aumenta, un fármaco soluble en agua se vuelve más susceptible a fugas. Sin embargo, como medio para suprimir las propiedades de fuga, es eficaz añadir colesterol o similares con el fin de llenar la deformación de la membrana causada por el lípido.

Además de los componentes mencionados anteriormente, se puede añadir al liposoma un polímero hidrófilo o similar para mejorar la retención en sangre, ácido graso, fosfato de diacetilo o similar como un estabilizador de la estructura de la membrana, o a-tocoferol o similar como un antioxidante. En la presente invención, es preferible no utilizar aditivos tales como un coadyuvante de dispersión no autorizado para el uso en inyección intravenosa en aplicaciones farmacéuticas, por ejemplo, un tensioactivo.

El liposoma de la presente invención puede contener preferentemente productos modificados con polímeros hidrófilos de fosfolípidos, lípidos distintos de los fosfolípidos o colesteroles como fosfolípidos, lípidos distintos de los fosfolípidos, colesteroles y derivados de los mismos.

Los ejemplos de polímeros hidrófilos incluyen, pero sin limitarse particularmente a, polietilenglicoles, poligliceroles, polipropilenglicoles, poli(alcoholes vinílicos), un copolímero alterno de estireno-anhídrido maleico, polivinilpirrolidona y poliaminoácido sintético. Los polímeros hidrófilos mencionados anteriormente pueden usarse solos o en combinación de dos o más de los mismos.

Entre estos, desde el punto de vista de la retención en sangre de una formulación, se prefieren polietilenglicoles, poligliceroles o polipropilenglicoles, y más preferido es polietilenglicol (PEG), poliglicerol (PG) o polipropilenglicol (PPG). El polietilenglicol (PEG) es el más utilizado y es preferible debido a que tiene el efecto de mejorar la retención en sangre.

El peso molecular del PEG no está particularmente limitado. El peso molecular del PEG es de 500 a 10.000 daltons, preferentemente de 1.000 a 7.000 daltons y más preferentemente de 2.000 a 5.000 daltons.

En el liposoma de la presente invención, es preferible utilizar un lípido modificado por PEG (lípido modificado con PEG), junto con el lípido principal contenido en el liposoma. Los ejemplos del lípido modificado con PEG incluyen 1,2-diestearoil-3-fosfatidiletanolamina-polietilenglicol tal como 1,2-diestearoil-3-fosfatidiletanolamina-PEG2000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), 1,2-distearoil-3-fosfatidiletanolamina-PEG5000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) y diestearoil glicerol-PEG2000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.). Estos lípidos modificados con PEG se pueden añadir en una cantidad del 0,3 al 50 % en masa, preferentemente del 0,5 al 30 % en masa, y más preferentemente del 1 al 20 % en masa con respecto al contenido total de lípidos.

En el liposoma de la presente invención, se prefiere una combinación de lípidos de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (un lípido principal contenido en el liposoma), 1,2-diestearoil-3-fosfatidiletanolamina-polietilenglicol (un lípido usado en combinación con el lípido principal), y colesterol.

(Fármaco)

El liposoma de la presente invención puede contener al menos uno de un fármaco soluble en agua o un fármaco soluble en lípido como un fármaco.

En el caso de un fármaco soluble en lípido, existe la ventaja de que el fármaco pueda ser retenido con relativa facilidad en la membrana lipídica por interacciones hidrófobas o de que sea fácil preparar una formulación que no pierda un fármaco por no ser soluble en agua.

En el caso de un fármaco hidrosoluble, es ventajosa una forma que se retenga en la fase acuosa interna del liposoma, pero puede haber un caso en donde un fármaco se vuelva fácilmente susceptible a fugas porque la membrana de la bicapa lipídica es fina y blanda. Sin embargo, de acuerdo con el método para producir un liposoma de la presente invención, es posible producir un liposoma que tenga seguridad y estabilidad ya que el tamaño de partícula del liposoma puede hacerse de aproximadamente 200 nm o menos. Por lo tanto, en la presente invención, el fármaco que puede encapsularse en liposomas es preferentemente un fármaco soluble en agua.

El fármaco que es un principio activo capaz de ser encapsulado en liposomas no está particularmente limitado, y ejemplos específicos de los mismos incluyen materiales que tienen una actividad fisiológica o una actividad farmacológica tal como enzimas, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, compuestos de bajo peso molecular, azúcares (oligosacáridos y polisacáridos), y compuestos poliméricos. En el caso de que los liposomas se utilicen como vehículo para un sistema de administración de fármacos, el fármaco es preferentemente un compuesto de bajo peso molecular, y más preferentemente un compuesto de bajo peso molecular soluble en agua, desde el punto de vista de la estabilidad. El fármaco puede formularse en un fármaco soluble en agua o preparación farmacéutica soluble en lípido añadiendo opcionalmente aditivos o similares a un fármaco soluble en agua o fármaco soluble en lípido.

Los ejemplos específicos del fármaco compuesto de bajo peso molecular incluyen agentes anticancerosos tales como un agente anticanceroso a base de antraciclina tal como doxorrubicina, daunorrubicina o epirrubicina, un agente anticanceroso a base de cisplatino tal como cisplatino u oxaliplatino, un agente anticanceroso a base de taxano tal como paclitaxel o docetaxel, un agente anticanceroso a base de alcaloides de la vinca tal como vincristina o vinblastina, un agente anticanceroso a base de bleomicina tal como bleomicina, y un agente anticanceroso a base de sirolimus, tal como sirolimus, y antagonistas metabólicos tal como metotrexato, fluorouracilo, gemcitabina, citarabina y pemetrexed. Entre estos, se prefiere un fármaco soluble en agua, tal como doxorrubicina, gemcitabina, o pemetrexed.

(Método para producir un liposoma)

El método para producir un liposoma de acuerdo con la presente invención incluye una etapa de mezcla de una fase oleosa con al menos un lípido disuelto en un disolvente orgánico y de una fase acuosa y de agitación de una solución acuosa que contiene los lípidos (en lo sucesivo en el presente documento, a veces denominada etapa de agitación) y una etapa de evaporación de un disolvente orgánico de la solución acuosa que contiene liposomas obtenida en la etapa de agitación (en lo sucesivo en el presente documento, a veces denominada etapa de evaporación). El método para producir un liposoma puede incluir, si se desea, otras etapas, además de la etapa de agitación y la etapa de evaporación.

(Fase oleosa)

Como disolvente orgánico que actúa como fase oleosa, se utiliza una mezcla de disolvente orgánico soluble en agua y un disolvente orgánico a base de éster. En la presente invención, se prefiere que un disolvente orgánico tal como cloroformo, cloruro de metileno, hexano o ciclohexano no se utilice sustancialmente como disolvente orgánico, y se prefiere más que estos disolventes orgánicos no se utilicen en absoluto.

El disolvente orgánico soluble en agua es etanol.

El disolvente orgánico a base de éster es acetato de etilo.

La relación de mezcla de disolvente orgánico soluble en agua:disolvente orgánico a base de éster es de 90:10 a 30:70, preferentemente de 80:20 a 40:60, y más preferentemente de 80:20 a 70:30 en relación de masa. El disolvente mixto de un disolvente orgánico soluble en agua y un disolvente orgánico a base de éster puede contener además un disolvente acuoso que se describirá a continuación, tal como agua o tampón. El disolvente acuoso se puede añadir en un intervalo de, por ejemplo, 1 a 30 % en masa. El pH de la mezcla de disolventes no está particularmente limitado, y está preferentemente en el intervalo de aproximadamente 3 a 10, y más preferentemente de aproximadamente 4 a 9. Los disolventes orgánicos a base de ésteres pueden contener sustancias fisiológicamente activas o similares, tales como varios medicamentos que son solubles en estos disolventes.

La relación de mezcla de etanol:acetato de etilo es preferentemente de 80:20 a 70:30 en una relación de masa.

La concentración del lípido no está particularmente limitada y puede ajustarse apropiadamente, pero puede ser de 40 g/l a 250 g/l, preferentemente de 40 g/l a 200 g/l en términos de una solución donde una solución mixta de un disolvente orgánico soluble en agua y un disolvente orgánico a base de éster sirven como disolvente.

(Fase acuosa)

La fase acuosa significa una fase acuosa externa y una fase acuosa interna.

La fase acuosa externa, como se utiliza en el presente documento, significa una solución acuosa en la cual se dispersan los liposomas. Por ejemplo, en el caso de una inyección, una solución que ocupa la parte externa del liposoma de un líquido de dispersión de liposomas envasados y almacenados en un vial o jeringa precargada se convierte en una fase acuosa externa. También, de manera similar para un líquido que se va a dispersar en el momento de su uso cuando se administra mediante una solución de dispersión unida u otras soluciones, una solución que ocupa la parte externa del liposoma de un líquido de dispersión de liposomas se convierte en una fase acuosa externa.

La fase acuosa interna, como se utiliza en el presente documento, significa una fase acuosa en la vesícula cerrada con una membrana de bicapa lipídica entre ellas.

Como solución acuosa dispersante de liposomas (fase acuosa externa) cuando se producen liposomas, se usa preferentemente agua (agua destilada, agua para inyección, o similares), solución salina fisiológica, diversos tampones, una solución acuosa de azúcares o una mezcla de los mismos (disolvente acuoso). El tampón no se limita a soluciones tampón orgánicas e inorgánicas, y se usa preferentemente un tampón que tenga una acción tamponadora en las proximidades de un pH cercano al del fluido corporal y los ejemplos del mismo incluyen tampón fosfato, tampón Tris, tampón citrato, tampón acetato y tampón de Good. El pH de la fase acuosa no está particularmente limitado, y puede ser de 5 a 9, preferentemente de 7 a 8. Por ejemplo, se usa preferentemente un tampón fosfato (por ejemplo, pH = 7,4). La fase acuosa interna del liposoma puede ser una solución acuosa dispersante de liposomas cuando se producen liposomas, o puede ser agua, solución salina fisiológica, diversos tampones, una solución acuosa de azúcares o una mezcla de los mismos que se añaden nuevamente. El agua utilizada como fase acuosa externa o fase acuosa interna está preferentemente exenta de impurezas (polvo, productos químicos).

La solución salina fisiológica se refiere a una solución de sal inorgánica ajustada para ser isotónica con el fluido corporal humano, y además puede tener una función tampón. Los ejemplos de solución salina fisiológica incluyen solución salina que contiene 0,9 % p/v de cloruro de sodio, solución salina tamponada con fosfato (en lo sucesivo, también denominada PBS) y solución salina tamponada con Tris.

(Etapa de agitación)

En la etapa de agitación de los antecedentes de la técnica, se mezclan una fase oleosa donde al menos un lípido se ha disuelto en un disolvente orgánico y una fase acuosa y se agita la solución acuosa que contiene lípidos. Una fase oleosa donde los lípidos se han disuelto en un disolvente orgánico y una fase acuosa se mezclan y agitan para preparar de este modo una emulsión donde se emulsionan una fase oleosa y una fase acuosa en un tipo AC/A. Después de la mezcla, se forma un liposoma eliminando una parte o todo el disolvente orgánico derivado de la fase oleosa usando una etapa de evaporación que se describe a continuación. Como alternativa, una parte o la totalidad del disolvente orgánico en la fase oleosa se evapora en el transcurso de la emulsificación con agitación para formar un liposoma.

Como un método de agitación, se utilizan ondas ultrasónicas o fuerza de corte mecánica para la miniaturización de partículas. Además, el procesamiento en la extrusora por el cual se dejan pasar las partículas a través de un filtro que tiene un cierto diámetro de poro o el procesamiento en el microfluidizador puede llevarse a cabo para conseguir la uniformidad de tamaño de las partículas. Sin embargo, en el método de producción de la presente invención, se prefiere que no se lleve a cabo el procesamiento de clasificación por tamaño ya que los liposomas están miniaturizados.

En la presente invención, el tamaño promedio de partícula de un liposoma a preparar se puede controlar seleccionando arbitrariamente la velocidad y el tiempo de agitación. Con el objetivo de obtener un liposoma que tenga seguridad y estabilidad, es preferible proporcionar cizallamiento a una velocidad circunferencial de 20 m/s o superior a una solución acuosa que contiene lípidos. El cizallamiento no está limitado, y un ejemplo específico del mismo es preferentemente cizallamiento a una velocidad circunferencial de 20 m/s a 35 m/s, y más preferentemente cizallamiento a una velocidad circunferencial de 23 m/s a 30 m/s.

(Etapa de evaporación)

En la etapa de evaporación, se evapora un disolvente orgánico de la solución acuosa que contiene liposomas obtenida en la etapa de agitación. En la presente invención, la etapa de evaporación incluye al menos una de las etapas de eliminar por la fuerza una parte o la totalidad del disolvente orgánico derivado de la fase oleosa como una etapa de evaporación, y una etapa de evaporación natural de una parte o la totalidad del disolvente orgánico en la fase oleosa durante el transcurso de la agitación-emulsificación.

El método de evaporación de un disolvente orgánico en la etapa de evaporación no está particularmente limitado. Por ejemplo, se puede llevar a cabo al menos una de una etapa de calentamiento para evaporar un disolvente orgánico, una etapa de continuar el reposo o agitación lenta después de la emulsificación, o una etapa de realizar desgasificación al vacío.

En la presente invención, en la etapa de evaporación de un disolvente orgánico, se prefiere que la concentración de un disolvente orgánico contenido en una solución acuosa que contiene liposomas sea del 15 % en masa o menos dentro de los 30 minutos posteriores al inicio de una etapa de evaporación del disolvente orgánico.

La temperatura del líquido cuando se lleva a cabo el método de producción de la presente invención se puede ajustar apropiadamente, pero la temperatura del líquido en el momento de mezclar una fase oleosa y una fase acuosa es preferentemente superior o igual a la temperatura de transición de fase del lípido a ser usado. Por ejemplo, en el caso de que se utilice un lípido que tiene una temperatura de transición de fase de 35 °C a 40 °C, la temperatura del líquido se fija preferentemente en 35 °C a 70 °C.

La solución acuosa que contiene los liposomas preparados mediante una etapa de agitación y una etapa de evaporación puede someterse a un procesamiento posterior, tal como centrifugación, ultrafiltración, diálisis, filtración en gel o liofilización, para la eliminación de componentes que no se habían incluido en los liposomas, o para el ajuste de la concentración y la presión osmótica.

(Esterilización por filtración)

Para formular una solución acuosa que contiene liposomas, obtenida mediante el método para producir un liposoma de acuerdo con la presente invención, en un producto farmacéutico, es preferible realizar una esterilización por filtración. Con respecto al método de filtración, es posible eliminar materiales no deseados de la solución acuosa que contiene liposomas usando una membrana de fibra hueca, una membrana de ósmosis inversa, un filtro de membrana o similar. En la presente invención, la solución acuosa que contiene liposomas se filtra preferentemente por medio de un filtro que tiene un tamaño de poro estéril (preferentemente filtro estéril de 0,2 pm) aunque no existe ninguna limitación particular. Normalmente, la adsorción o agregación de liposomas en un filtro estéril puede ocurrir en la etapa de filtración. Sin embargo, la presente invención tiene efectos inesperados tales como poca influencia de la pérdida de presión o similares cuando se realiza la filtración, ya que se obtienen liposomas que tienen un tamaño promedio de partícula específico y una distribución uniforme del tamaño de partícula.

Para evitar un efecto de la deformación del liposoma sobre el tamaño promedio de partícula, la etapa de esterilización por filtración y la etapa de llenado aséptico descrita a continuación se llevan a cabo preferentemente a una temperatura inferior o igual a la temperatura de transición de fase del lípido que constituye el liposoma. Por ejemplo, en el caso de que la temperatura de transición de fase del lípido sea de alrededor de 50 °C, la etapa de esterilización por filtración y la etapa de llenado aséptico que se describen a continuación se llevan a cabo a una temperatura de preferentemente aproximadamente 0 °C a 40 °C, y más específicamente de aproximadamente 5 °C a 30 °C.

(Llenado aséptico)

La solución acuosa que contiene los liposomas obtenida después de la filtración estéril se llena preferentemente asépticamente para aplicaciones médicas. Pueden aplicarse métodos conocidos para el llenado aséptico. Puede prepararse una formulación liposomal adecuada para aplicaciones médicas llenando asépticamente la solución acuosa que contiene liposomas en un recipiente.

Un disolvente acuoso, un aditivo o similar se puede añadir apropiadamente a la solución acuosa que contiene los liposomas obtenida mediante la presente invención para preparar de ese modo una composición liposomal. En relación con la vía de administración, la formulación liposomal también puede contener al menos uno de un estabilizador, un antioxidante o un agente de ajuste del pH que sea farmacéuticamente aceptable.

El estabilizador no está particularmente limitado y los ejemplos del mismo incluyen azúcares tales como glicerol, manitol, sorbitol, lactosa y sacarosa.

El antioxidante no está particularmente limitado y sus ejemplos incluyen ácido ascórbico, ácido úrico, tocoferol u homólogos (por ejemplo, vitamina E, cuatro isómeros de tocoferol a, p, y, y 6), cisterna y EDTA. Los estabilizadores y antioxidantes pueden usarse respectivamente solos o en combinación de dos o más de los mismos.

Los ejemplos del agente de ajuste del pH incluyen hidróxido de sodio, ácido cítrico, ácido acético, trietanolamina, hidrogenofosfato de sodio y dihidrogenofosfato de sodio.

La composición liposomal de la presente invención puede contener un disolvente orgánico, colágeno, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, un polímero de carboxivinilo, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilato de sodio, alginato de sodio, dextrano soluble en agua, carboximetilalmidón sódico, pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, goma de xantano, goma arábiga, caseína, gelatina, agar, diglicerol, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina, parafina, alcohol estearílico, ácido esteárico, albúmina sérica humana (HSA), manitol, sorbitol, lactosa, PBS, cloruro de sodio, azúcares, un polímero biodegradable, un medio sin suero, cada uno de los cuales es farmacéuticamente aceptable, o un aditivo que es aceptable como un aditivo farmacéutico.

En particular, en el contexto de la presente invención, la formulación liposomal contiene preferentemente sulfato de amonio, L-histidina, sacarosa purificada, hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, o similares.

El recipiente en el que se llena una formulación liposomal no está particularmente limitado, y preferentemente está hecho de un material que tiene baja permeabilidad al oxígeno con el fin de evitar la oxidación o similares. Los ejemplos del recipiente incluyen un recipiente de plástico, un recipiente de vidrio y una bolsa hecha de una película laminada que tiene una lámina de aluminio, una película depositada de aluminio, una película depositada de óxido de aluminio, una película depositada de óxido de silicio, un poli(alcohol vinílico), un copolímero de etileno-alcohol vinílico, tereftalato de polietileno, naftalato de polietileno, poli(cloruro de vinilideno), o similares como una capa de barrera a los gases. Si es necesario, puede protegerse de la luz adoptando una bolsa o similar usando un vidrio coloreado, una hoja de aluminio, una película depositada de aluminio o similares.

En el recipiente en el que se llena una formulación liposomal, para evitar la oxidación por el oxígeno presente en el espacio del recipiente, es preferible reemplazar los gases en el espacio del recipiente y la solución de fármaco con gases inertes tales como el nitrógeno. Por ejemplo, una solución de inyección se burbujea con nitrógeno, de modo que el llenado de la solución de inyección en un recipiente se puede llevar a cabo bajo una atmósfera de nitrógeno.

El método de administración de una formulación liposomal es preferentemente la administración parenteral. Por ejemplo, se puede seleccionar una inyección intravenosa tal como goteo intravenoso, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal o inyección subcutánea. El método de administración específico de una formulación liposomal incluye, por ejemplo, una jeringa y la administración por goteo intravenoso.

La dosis de un fármaco contenido en la formulación liposomal se selecciona habitualmente en el intervalo de 0,01 mg a 100 mg/kg de peso corporal/día. Sin embargo, la formulación liposomal de la presente invención no se limita a dicha dosis.

(Método para medir el tamaño de partícula de liposomas)

En el método para producir un liposoma de la presente invención, es posible producir liposomas finos y homogéneos. Un ejemplo del método para medir un tamaño de partícula de liposomas incluye un método de dispersión dinámica de luz.

Con respecto al método de dispersión dinámica de luz, se sabe generalmente que se puede obtener un tamaño de partícula con buena precisión en una solución de concentración de partícula diluida. Es decir, en el caso de que la concentración de partícula en una solución sea alta, puede darse el caso de que no se pueda ignorar la influencia de dispersión múltiple (fenómeno donde la luz dispersada se dispersa de nuevo al chocar contra otras partículas). Sin embargo, la dilución de la solución acuosa que contiene liposomas obtenida en la presente invención puede dar lugar a un caso donde no se pueda obtener correctamente un valor de un tamaño de partícula en una solución actual. Además, tras la industrialización de una formulación, existe un caso en el que la presencia de ligeras partículas gruesas puede afectar significativamente a la eliminación de sustancias extrañas y a la permeabilidad del filtro en el momento de la esterilización por filtración, pero la dilución de la solución acuosa que contiene liposomas puede conducir a una dificultad en detectar dichas ligeras partículas gruesas en muchos casos.

Aunque la medición de un tamaño de partícula de los liposomas de acuerdo con la presente invención también puede emplear un aparato de medición de dispersión dinámica de luz de acuerdo con un interferómetro de Michelson, es preferible utilizar un aparato de medición de dispersión dinámica de luz de baja coherencia de acuerdo con un interferómetro de tipo Mach-Zehnder, que puede medir un tamaño de partícula actual y una distribución de tamaño de partícula de los liposomas con buena precisión incluso cuando una concentración de partículas es alta. Por consiguiente, se suprimen los efectos de la dispersión múltiple, por lo que el tamaño de partícula y la distribución de tamaño de partícula pueden medirse con buena precisión, sin diluir una solución que contiene liposomas. En particular, con respecto a la detección de partículas gruesas, es posible utilizar adecuadamente dicho método de medición con una sensibilidad muy alta. Por ejemplo, puede llevarse a cabo una medición haciendo referencia al documento JP5325679B.

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con el método para producir un liposoma de la presente invención, es posible proporcionar un liposoma que tiene un tamaño promedio de partícula de 200 nm o menos, y que también es excelente en cuanto a la estabilidad durante la conservación. Los liposomas obtenidos por el método para producir un liposoma de la presente invención son aplicables para productos farmacéuticos, cosméticos, productos alimenticios o similares, y son particularmente útiles para aplicaciones farmacéuticas.

[Ejemplos]

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, la presente invención no está limitada a dichos Ejemplos.

La proporción de mezcla en la composición del disolvente se refiere a una proporción de volumen. Por ejemplo, "etanol/acetato de etilo = 90/10" se refiere a etanol al 90 %/acetato de etilo al 10 % en una relación en volumen. (Ejemplo 1)

a) Preparación de la fase oleosa

Se mezcló fosfatidilcolina de soja hidrogenada, colesterol y N-(carbonil-metoxipolietilenglicol 2000)-1,2-distearoil-snglicero-3-fosfoetanolamina, sal de sodio (en lo sucesivo en el presente documento, también denominada DSPE-PEG) en una relación molar de 57/38/5, y a continuación se le añadió un disolvente orgánico (etanol/acetato de etilo=75/25), seguido de calentamiento hasta 70 °C y disolución de los lípidos para preparar una fase oleosa.

b) Preparación de la fase acuosa

Se prepararon 177 mM de una solución acuosa de sulfato de amonio para servir como fase acuosa.

c) Emulsificación

La fase acuosa preparada en b) se calentó hasta 70 °C y se añadió la fase oleosa preparada en a) de modo que se alcanzara una relación de volumen de fase acuosa/fase oleosa = 8/3, seguido de una agitación a una velocidad circunferencial de 30 m/s y una velocidad angular de 19.000 rpm durante 30 minutos.

d) Desolvatación

El disolvente orgánico se eliminó por soplado con nitrógeno mientras se calentaba la emulsión preparada en c) a una temperatura superior o igual a la temperatura de transición de fase de los lípidos. Después, se detuvo el soplado con nitrógeno, seguido de un calentamiento a una temperatura superior o igual a la temperatura de transición de fase de los lípidos durante 3 horas para obtener los liposomas.

(Ejemplo 2)

Se obtuvieron liposomas de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que la composición de un disolvente orgánico utilizado para la preparación de liposomas se cambió de (etanol/acetato de etilo=75/25) a (etanol/acetato de etilo=90/10).

(Ejemplo 3)

a) Preparación de la fase oleosa

Se mezcló fosfatidilcolina de soja hidrogenada, colesterol y DSPE-PEG en una relación molar de 76/19/5, y a continuación se le añadió un disolvente orgánico (etanol/acetato de etilo=75/25), seguido de calentamiento hasta 70 °C y disolución de los lípidos para preparar una fase oleosa.

b) Preparación de la fase acuosa

Se preparó un tampón fosfato 4 mM (pH 7,86) para servir como fase acuosa.

c) Preparación de liposomas no encapsulados en fármacos

La fase acuosa se calentó hasta 70 °C y se añadió la fase oleosa de modo que se alcanzara una relación de volumen de fase acuosa/fase oleosa=8/3, seguido de una agitación a una velocidad circunferencial de 20 m/s y 13.000 rpm durante 30 minutos. A partir de ahí, el disolvente orgánico se eliminó por soplado con nitrógeno mientras se calentaba a una temperatura superior o igual a la temperatura de transición de fase. Esto fue seguido además por una eliminación completa del disolvente orgánico sustituyendo la fase acuosa externa de liposomas con una solución acuosa de cloruro de sodio al 0,09 %, al tiempo que se concentraba la concentración de lípidos del líquido liposomal hasta un intervalo de 120 a 150 mM mediante filtración de flujo tangencial, obteniéndose así liposomas no encapsulados en fármacos. d) Preparación de liposomas encapsulados en fármacos

1) Preparación de PBS

Se disolvieron 81,63 g de cloruro de sodio, 29,01 g de hidrogenofosfato de disodio 12 hidrato y 2,29 g de dihidrogenofosfato de sodio dihidrato en 948 g de agua para inyección para preparar PBS.

2) Preparación del líquido liposomal encapsulado en gemcitabina

Se mezclaron 7,68 g de clorhidrato de gemcitabina, 31,99 g de PBS, 44,83 g de agua para inyección de la Farmacopea japonesa y 1,60 ml de hidróxido de sodio 8 M para preparar una solución farmacológica. Posteriormente, se mezclaron 17,64 ml de la solución farmacológica, 18,00 ml de liposomas no encapsulados en fármacos y 0,36 ml de hidróxido de sodio 8 M en cada uno de los cuatro viales. Esto fue seguido por calentamiento a aproximadamente 70 °C durante 30 minutos y luego enfriamiento a temperatura ambiente. Después, la mezcla liposomal farmacológica se filtró a través de un filtro de esterilización con un tamaño de poro de 0,2 pm, y la gemcitabina no encapsulada se eliminó mediante purificación dialítica de la mezcla liposomal farmacológica respecto a una solución acuosa de sacarosa al 9,4 %/histidina 10 mM mediante filtración de flujo tangencial. Después, los liposomas se filtraron a través de un filtro estéril con un tamaño de poro de 0,2 pm para obtener un líquido liposomal encapsulado en gemcitabina libre de gérmenes.

(Ejemplo comparativo 1)

Se obtuvieron liposomas de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que la composición de un disolvente orgánico utilizado para la preparación de una fase oleosa se cambió de (etanol/acetato de etilo=75/25) a (etanol/acetato de etilo=100/0).

(Ejemplo comparativo 2)

Aunque el procedimiento se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que la composición de un disolvente orgánico utilizado para la preparación de una fase oleosa se cambió de (etanol/acetato de etilo=75/25) a (etanol/acetato de etilo=0/100), fue imposible preparar liposomas debido a que los lípidos no pudieron disolverse completamente (no pudieron emulsionarse debido a la pobre solubilidad de los lípidos).

1. Medición del tamaño promedio de partícula

Se preparó una muestra para la medición diluyendo 13 veces el líquido liposomal con agua pura. El tamaño de partícula de la muestra preparada se midió utilizando un aparato de dispersión dinámica de luz (DLS) (FPAR-1000AS, fabricado por Otsuka Electronics Co., Ltd.). Se adoptó el tamaño promedio de partícula acumulado como valor representativo del tamaño de partícula.

Los resultados se muestran en la Tabla 1. El tamaño de partícula (nm) en la Tabla 1 muestra un tamaño de partícula según lo medido por un aparato de medición de dispersión dinámica de luz de acuerdo con un interferómetro de Michelson.

2. Medición de la filtrabilidad

El líquido liposomal se ajustó a una concentración total de lípidos de 25 a 30 mM y luego se mantuvo a 25 °C. El agua para inyección se pasó a 0,05 MPa a través de una extrusora (extrusora Thermobarrel, fabricada por Lipex) equipada con un filtro de 0,2 pm (Sartobran P, fabricado por Sartorius stedim) para lavar el filtro, y luego los liposomas mantenidos a 25 °C se filtraron por presión a 0,3 MPa. El filtrado se recogió y se pesó a varios intervalos de tiempo. La filtrabilidad se calculó a partir del tiempo necesario para filtrar 1 ml del filtrado. Los resultados se muestran en la Tabla 1 y en la Fig. 1. Con referencia a la filtrabilidad del filtro que se muestra en la Tabla 1, A: filtrable, B: filtrable pero se produjo una obstrucción, y C: no filtrable (no puede filtrar 1 ml). La Fig. 1 muestra los resultados de la evaluación de la filtrabilidad para una solución de muestra que contiene liposomas preparada cambiando la relación de etanol/acetato de etilo. En la Fig. 1, eta/ethacet se refiere a etanol/acetato de etilo, y el valor numérico se refiere a una relación (relación de volumen) para etanol/acetato de etilo. Además, con el fin de confirmar si el grado de filtrabilidad está asociado a la abundancia de partículas gruesas, se llevó a cabo una medición de dispersión dinámica de luz de baja coherencia (LC-DLS) con alto poder de detección de partículas gruesas. La medición LC-DLS se llevó a cabo de la siguiente manera utilizando un aparato de medición compuesto por un interferómetro de tipo Mach-Zehnder.

Aparato: fuente de luz SLD, longitud de onda 835± 22 nm, velocidad de conversión AD Max 1 ps/ch, y medición de inmersión mediante una sonda de fibra (las condiciones de medición son temperatura de 25 °C, frecuencia de modulación de 10 kHz, tiempo de muestreo de 20 ps, intervalo de 65536 puntos por integración, e integración de 300 veces).

El análisis se llevó a cabo mediante transformación de Fourier de las señales de las fluctuaciones de luz dispersa medidas, y extrayendo solo la señal modulada del espectro de potencia obtenido para calcular una función de autocorrelación. La función de autocorrelación calculada se convirtió en una distribución de tamaño de partícula mediante un método de histograma.

Las muestras a medir se midieron sin diluir sin ningún tipo de procesamiento tal como dilución. En particular, se midió una cantidad de materiales gruesos de orden micrométrico.

Los resultados se muestran en la Tabla 1. El porcentaje de partículas gruesas en la Tabla 1 indica una relación de abundancia de materiales gruesos de 500 nm o más.

3. Medición del contenido total de gemcitabina en la formulación

Utilizando una solución de muestra que se obtuvo disolviendo el líquido liposomal preparado en metanol, seguido de una filtración, y una solución estándar para curva de calibración que se preparó por dilución de clorhidrato de gemcitabina, se midió el contenido total de gemcitabina en la formulación mediante cromatografía líquida/detección de absorbancia UV-vis.

a) Preparación de la solución estándar para curva de calibración

Se pesaron aproximadamente 10 mg de clorhidrato de gemcitabina y se disolvieron en aproximadamente 10 ml de 1xPBS (fabricado por Gibco, Life Technology). Se añadió 1xPBS (fabricado por Gibco, Life Technology) y se preparó una solución que tenía una concentración de clorhidrato de gemcitabina de 0,1, 1,0, 5,0 o 10,0 pg/ml y utilizó como solución estándar para curva de calibración.

b) Preparación de la solución de muestra

(1) Se pesaron aproximadamente 50 pl de una muestra (solución de formulación liposomal) por MICROMAN, y se le añadieron aproximadamente 950 pl de metanol pesados por MICROMAN. Después de agitar durante aproximadamente 1 minuto, se confirmó visualmente que la solución se volvía transparente.

(2) Se pesaron 100 pl de la solución del punto anterior (1) por MICROMAN, y se le añadieron aproximadamente 950 pl de agua para inyección pesados con una micropipeta. Este líquido se agitó durante aproximadamente 1 minuto, se sometió a ultrasonidos durante aproximadamente 1 minuto y se agitó adicionalmente durante aproximadamente 10 segundos.

(3) La solución obtenida al filtrar la solución del punto anterior (2) a través de un filtro DISMIC (diámetro de poro: 0,45 pm) se utilizó como solución de muestra.

c) Medición

La medición se llevó a cabo en las siguientes condiciones mediante cromatografía líquida/detección de absorbancia UV-vis.

Longitud de onda de medición: 272 nm, columna: Waters Atlantis T394,6x150 mm, 5 pm

Temperatura de la columna: temperatura constante de alrededor de 40 °C

Ambas fases móviles A y B son una mezcla de agua/metanol/ácido trifluoroacético, y la alimentación de las fases móviles se llevó a cabo cambiando la relación de mezcla de las fases móviles A y B para controlar un gradiente de concentración.

Caudal: 1,0 ml/minuto, volumen de inyección: 10 pl, temperatura del automuestreador: temperatura constante de aproximadamente 25 °C.

4. Medición de la cantidad de gemcitabina en la fase acuosa externa

Utilizando una solución de muestra obtenida mediante la eliminación de liposomas de la solución diluida de una muestra (formulación liposomal) por ultrafiltración, y una solución estándar para curva de calibración que se preparó por dilución de clorhidrato de gemcitabina, se midió una cantidad de gemcitabina en la fase acuosa externa mediante cromatografía líquida/detección de absorbancia UV-vis.

a) Preparación de la solución de muestra

(1) Se pesaron aproximadamente 50 pl de una muestra (solución de formulación liposomal) por MICROMAN, y se le añadieron aproximadamente 450 pl de PBS pesados con una micropipeta, seguido de una mezcla suficiente invertida para preparar una solución homogénea.

(2) Se pesaron aproximadamente 100 pl de la solución del punto anterior (1) con una micropipeta, y se añadieron gota a gota sobre una membrana de ultrafiltración previamente lavada que luego se centrifugó. La centrifugación se llevó a cabo en las condiciones de 7400xg, 30 minutos y 5 °C.

(3) La solución obtenida al agitar el filtrado en la operación del punto anterior (2) durante 10 segundos se utilizó como solución de muestra.

b) Medición

3. La medición se llevó a cabo de la misma manera que en c).

5. Propiedad de conservación

La solución de muestra se almacenó a 5 °C durante 18 meses.

Utilizando la cantidad total de gemcitabina en la formulación medida en los puntos 3 y 4 anteriores y la cantidad de gemcitabina en la fase acuosa externa, se calculó la fuga de conservación mediante la siguiente ecuación.

Ecuación: Fuga de conservación (%)=100x(concentración farmacológica en la fase acuosa externa tras 18 meses de almacenamiento-concentración farmacológica en la fase acuosa externa inmediatamente después de la preparación de la formulación)/concentración farmacológica en la fase acuosa interna

Asimismo, el tamaño de partícula se midió de la misma manera que en el punto 1.

Los resultados se muestran en la Tabla 1.

'T l 11

A partir de los resultados mostrados en la Tabla 1, se descubrió que de acuerdo con el método de producción de la presente invención, es posible producir un liposoma que no utiliza disolventes orgánicos dañinos tales como cloroformo y cloruro de metileno y tiene un tamaño de partícula de 200 nm o menos y un único pico de dispersión. Asimismo, se descubrió que en el Ejemplo comparativo 1, el porcentaje de partículas gruesas aumenta, y por lo tanto la permeabilidad del filtro se deteriora significativamente. En el Ejemplo comparativo 2, se era incapaz de formar siquiera liposomas. Por lo tanto, se descubrió que de acuerdo con el método de producción de la presente invención, las partículas de liposomas que tienen un tamaño de partícula de 200 nm o menos también se pueden producir para tener la idoneidad de producción, tal como filtrabilidad.

(Ejemplos 4-1 a 4-7)

Los liposomas encapsulados en fármacos se prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 3, excepto que la relación de mezcla de los disolventes orgánicos se ajustó como se muestra en la Tabla 2.

El tamaño de partícula de los liposomas obtenidos en los Ejemplos 4-1 a 4-7 se midió mediante el método descrito a continuación.

Las muestras para la medición se prepararon diluyendo 100 veces el líquido liposomal con un líquido obtenido diluyendo 10 veces 1xPBS (fabricado por Gibco, Life Technology) con agua pura. El tamaño de partícula de las muestras preparadas se midió utilizando un aparato de dispersión dinámica de luz (DLS) (FPAR-1000AS, fabricado por Otsuka Electronics Co., Ltd.). Se adoptó el tamaño promedio de partícula acumulado como valor representativo del tamaño de partícula.

Los resultados se muestran en la Tabla 2.

A partir de los resultados mostrados en la Tabla 2, se descubrió que el método de producción de la presente invención es un método capaz de producir liposomas de forma muy estable, ya que casi no hay variación en el tamaño de partícula de las muestras liposomales de los Ejemplos 4-1 a 4-5 que tienen la misma composición de disolvente. Aunque hay una tendencia a que el tamaño de partícula aumente en los Ejemplos 4-6 y 4-7 que tienen un mayor porcentaje de acetato de etilo en la composición de disolvente, es posible producir partículas liposomales que tengan un tamaño de partícula de 200 nm o menos. Se puede observar que el método de producción de la presente invención es una invención que es capaz de producir partículas liposomales que tienen un tamaño de partícula de 200 nm o menos en un amplio intervalo de las relaciones de disolvente y que es excelente en cuanto a la versatilidad.

(Ejemplos 5-1 a 5-5)

a) Preparación de la fase oleosa

Se mezcló fosfatidilcolina de soja hidrogenada, colesterol y DSPE-PEG en una relación molar de 57/38/5, y a continuación se le añadió un disolvente orgánico, seguido de calentamiento hasta 70 °C y disolución de los lípidos para preparar una fase oleosa. La relación de un disolvente orgánico es la siguiente: Ejemplo 5-1; (etanol/ acetato de etilo=88/12), Ejemplo 5-1; (etanol/ acetato de etilo=79/21), Ejemplo 5-3; (etanol/ acetato de etilo=75/25), Ejemplo 5-4; (etanol/ acetato de etilo=70/30) y Ejemplo 5-5; (etanol/ acetato de etilo=63/37).

b) Preparación de la fase acuosa

Se prepararon 187 mM de una solución acuosa de sulfato de amonio para servir como fase acuosa.

c) Preparación del líquido liposomal por emulsificación

La fase acuosa preparada en b) se calentó hasta 70 °C y se añadió la fase oleosa preparada en a) de modo que se alcanzara una relación de volumen de fase acuosa/fase oleosa = 8/3, seguido de agitación a una velocidad circunferencial de 30 m/s y una velocidad angular de 19.000 rpm durante 30 minutos para obtener un líquido liposomal. El tamaño de partícula de los liposomas obtenidos en los Ejemplos 5-1 a 5-5 se midió mediante el método descrito a continuación.

Las muestras para la medición se ajustaron diluyendo 13 veces el líquido liposomal con agua pura. El tamaño de partícula de las muestras preparadas se midió utilizando un aparato de dispersión dinámica de luz (DLS) (FPAR-1000AS, fabricado por Otsuka Electronics Co., Ltd.). Se adoptó el tamaño promedio de partícula acumulado como valor representativo del tamaño de partícula.

Los resultados se muestran en la Tabla 3 y en la Fig. 2.

A partir de los resultados mostrados en la Tabla 3 y en la Fig. 2, se descubrió que de acuerdo con el método de producción de la presente invención, es posible producir partículas liposomales que tengan un tamaño de partícula de 200 nm o menos. De acuerdo con el método de producción de la presente invención, el acetato de etilo se encuentra preferentemente en el intervalo del 20 % al 30 % cuando se desea conseguir liposomas más finos en la medida de lo posible, aunque es posible producir liposomas finos en un amplio intervalo de relaciones de disolvente. Se considera que una pequeña cantidad de acetato de etilo da lugar a un aumento de la espumación en el momento de la emulsificación y a una pérdida de transferencia de la fuerza de cizallamiento en la emulsificación a una membrana lipídica, mientras que una gran cantidad de acetato de etilo da lugar a un aumento del tamaño de partícula debido a la combinación de gotas de aceite de acetato de etilo.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un liposoma, que comprende:

una etapa de mezcla de una fase oleosa con al menos un lípido disuelto en un disolvente orgánico y una fase acuosa y de agitación de una solución acuosa que contiene los lípidos; y

una etapa de evaporación de un disolvente orgánico de la solución acuosa que contiene liposomas obtenida en la etapa de agitación,

caracterizado por que

la solución acuosa que contiene liposomas obtenida en la etapa de agitación es una solución acuosa de tipo AC/A, el disolvente orgánico es un disolvente mixto de un disolvente orgánico soluble en agua que es etanol y un disolvente orgánico a base de éster que es acetato de etilo,

una relación en masa de disolvente orgánico soluble en agua:disolvente orgánico a base de éster es de 90:10 a 30:70,

el tamaño promedio de partícula del liposoma es de 2 a 200 nm, según lo medido por un método de dispersión de luz

no se lleva a cabo un procesamiento de clasificación por tamaño, y por que

la etapa de agitación imparte un cizallamiento a una velocidad circunferencial de 20 m/s o más a una solución acuosa que contiene lípidos.

2. El método para producir un liposoma de acuerdo con la reivindicación 1, en donde un contenido del disolvente orgánico a base de éster que es acetato de etilo en el disolvente orgánico es del 20 % al 30 % en peso.

3. El método para producir un liposoma de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde la etapa de evaporación de un disolvente orgánico evapora el disolvente orgánico por calentamiento.

4. El método para producir un liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la concentración de un disolvente orgánico contenido en una solución acuosa que contiene liposomas debe ser del 15 % en masa o menos dentro de los 30 minutos posteriores al inicio de una etapa de evaporación del disolvente orgánico.

5. El método para producir un liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el tamaño promedio de partícula del liposoma es de 5 a 100 nm, según lo medido por un método de dispersión de luz.