WO2015166988A1 - リポソームの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
リポソームは、バリア能、化合物保持能、生体適合性、粒径設定の自由度、易分解性、表面修飾性等の特徴を生かして、免疫センサー、人工赤血球、薬物送達システムのキャリヤーなど多様な応用が検討されてきた。キャリヤーの用途において、リポソームは、水溶性化合物、脂溶性低分子、高分子と幅広い物質を内包することができる。
しかし、両親媒性脂質はエタノールに溶解するものに限定されており、適用できるリン脂質はレシチン類のみである。従って、各種リン脂質を任意の割合で混合したリポソームを作製することは困難である。また、この方法では脱溶剤すると粒子径が大きくなってしまうため、粒子径を揃えるためには一定細孔を有したメンブレンフィルターなどを用いた処理が必要になる。
少なくとも1種の脂質が有機溶媒に溶解している油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌する工程、及び
攪拌する工程で得られたリポソームを含む水溶液から有機溶媒を蒸発させる工程を含むリポソームの製造方法であって、
有機溶媒が水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒である、リポソームの製造方法を用いることによって、注射剤として安全性に懸念がある有機溶剤又は添加剤を使用することなく、薬剤を内包して高い保存安定性を有する微細、かつ、均質なリポソームを調製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
好ましくは、エステル系有機溶媒が酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル、酢酸t-ブチル、及びプロピオン酸メチルから選ばれる少なくとも1種である。
好ましくは、エステル系有機溶媒が酢酸エチルである。
好ましくは、水溶性有機溶媒がアルコール類である。
好ましくは、アルコールがエタノール、メタノール、2-プロパノール、及びt-ブタノールから選ばれる少なくとも1種である。
好ましくは、水溶性有機溶媒とエステル系有機溶媒との質量比が、90:10~30:70である。
好ましくは、攪拌する工程において、脂質を含む水溶液に周速20m/sec以上のせん断を与える。
好ましくは、有機溶媒を蒸発させる工程において、有機溶媒を加熱することにより蒸発させる。
また本明細書において「~」を用いて示された数値範囲は、「~」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本発明において、特にことわらない限り、%は、質量百分率を意味する。
少なくとも1種の脂質が有機溶媒に溶解している油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌する工程及び、
攪拌する工程で得られたリポソームを含む水溶液から有機溶媒を蒸発させる工程を含むリポソームの製造方法であって、
有機溶媒が水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒である、
リポソームの製造方法である。
リポソームとは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相(内水相)を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームは通常、閉鎖小胞外の水溶液(外水相)に分散した状態で存在する。リポソームはシングルラメラ(単層ラメラ又はユニラメラとも呼ばれ、二重層膜が一重の構造である。)であっても、多層ラメラ(マルチラメラとも呼ばれ、タマネギ状の形状の多数の二重層膜の構造である。個々の層は水様の層で仕切られている。)であってもよいが、本発明では、医薬用途での安全性及び安定性の観点から、シングルラメラのリポソームであることが好ましい。
リポソームは球状またはそれに近い形態をとることが好ましい。
本発明のリポソームは、薬剤として水溶性薬剤又は脂溶性薬剤の少なくとも一つを含むことができる。
本発明のリポソームの製造方法では、
少なくとも1種の脂質が有機溶媒に溶解している油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌する工程(以下、攪拌工程と呼ぶことがある)、及び
攪拌する工程で得られたリポソームを含む水溶液から有機溶媒を蒸発させる工程(以下、蒸発工程と呼ぶことがある)を含む。リポソームの製造方法は、必要に応じて、攪拌工程及び蒸発工程の他に、他の工程を含んでよい。
油相として用いられる有機溶媒として、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒を用いる。本発明では、有機溶媒として、クロロホルム、塩化メチレン、ヘキサン、又はシクロヘキサンといった有機溶剤を実質的に用いないことが好ましく、これらの有機溶剤を用いないことがより好ましい。
水相とは、外水相及び内水相を意味する。
本発明における外水相とは、リポソームを分散する水溶液を意味する。たとえば注射剤の場合においては、バイアル瓶やプレフィルドシリンジ包装されて保管されたリポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。また、添付された分散用液やその他溶解液により投与時に用時分散した液についても同様に、リポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。
本発明における内水相とは、脂質二重膜を隔てた閉鎖小胞内の水相を意味する。
リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液(外水相)としては、水(蒸留水、注射用水等)、生理食塩水、各種緩衝液、糖類の水溶液及びこれらの混合物(水性溶媒)が好ましく用いられる。緩衝液としては、有機系、無機系に限定されることはないが、体液に近い水素イオン濃度付近に緩衝作用を有する緩衝液が好適に用いられ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グッドバッファーなどがあげられる。水相のpHは特に限定されないが、5~9、好ましくは7~8であればよい。例えば、リン酸緩衝液(例えば、pH=7.4)を用いることが好ましい。リポソームの内水相は、リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液であってもよいし、新たに添加される、水、生理食塩水、各種緩衝液、糖類の水溶液及びこれらの混合物をあってもよい。外水相または内水相として用いる水は、不純物(埃、化学物質等)を含まないことが好ましい。
生理食塩水とは、人体と等張になるように調整された無機塩溶液を意味し、さらに緩衝機能を持っていてもよい。生理食塩水としては、塩化ナトリウムを0.9w/v%含有する食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(以下、PBSともいう)及びトリス緩衝生理食塩水などが挙げられる。
攪拌工程では、少なくとも1種の脂質が有機溶媒に溶解している油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌する。脂質が有機溶媒に溶解している油相及び水相を混合し撹拌することで、油相及び水相がO/W型に乳化した乳化液が調製される。混合後、油相由来の有機溶媒の一部又は全部を後述する蒸発工程によって除去することにより、リポソームが形成される。又は、油相中の有機溶媒の一部又は全部が撹拌・乳化の過程で蒸発して、リポソームが形成される。
蒸発工程では、攪拌する工程で得られたリポソームを含む水溶液から有機溶媒を蒸発させる。本発明において、蒸発工程とは、油相由来の有機溶媒の一部又は全部を蒸発工程として強制的に除去する工程、及び油相中の有機溶媒の一部又は全部が撹拌・乳化の過程で自然に蒸発する工程の少なくとも一つを含む。
本発明のリポソームの製造方法によって得られた、リポソームを含む水溶液を医薬品とするために、無菌ろ過を行うことが好ましい。ろ過の方法としては、中空糸膜、逆浸透膜、メンブレンフィルター等を用いて、リポソームを含む水溶液から不要な物を除去することができる。本発明では、特に限定されないが、滅菌できる孔径をもつフィルター(好ましくは0.2μmのろ過滅菌フィルター等)によってろ過することが好ましい。通常、ろ過工程において、ろ過滅菌フィルターへのリポソームが吸着又は凝集が発生することがある。しかし、本発明では、特定の平均粒子径及び均一な粒子径分布を有するリポソームが得られるため、ろ過を行う時に圧損などの影響が少ないという予想外の効果を有する。
無菌ろ過の後に得られたリポソームを含む水溶液は、医療用途として無菌充填することが好ましい。無菌充填の方法は公知のものが適用できる。容器に無菌的に充填することで医療用として好適なリポソーム製剤が調製できる。
本発明のリポソームの製造方法では、微細かつ均質なリポソームを作成することができる。リポソームの粒径の測定方法として、動的光散乱法を挙げることができる。
溶剤組成における混合比は容量比を意味する。例えば、「エタノール/酢酸エチル=90/10」は、容量比で90%エタノール/10%酢酸エチルを意味する。
a)油相の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール及びN-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンナトリウム塩(以下、DSPE-PEGともいう)を57/38/5のモル比となるように混合し、次いで有機溶媒(エタノール/酢酸エチル=75/25)を加えて70℃に加温して脂質を溶解し油相とした。
177mMの硫酸アンモニウム水溶液を調製し水相とした。
b)で調製した水相を70℃に加温し、水相/油相=8/3の容積比になるようにa)で調製した油相を添加した後、周速30m/s、角速度19000rpmにて30分間攪拌した。
c)で作製した乳化液を脂質の相転位温度以上に加温しながら窒素を送気することで有機溶媒を除去し、さらに窒素送気を停止して、脂質の相転位温度以上で3時間加温してリポソームを得た。
調製に用いる有機溶媒の組成を(エタノール/酢酸エチル=75/25)から(エタノール/酢酸エチル=90/10)に変更した以外、実施例1と同様にしてリポソームを得た。
a)油相の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール及びDSPE-PEGを76/19/5のモル比となるように混合し、次いで有機溶媒(エタノール/酢酸エチル=75/25)を加えて70℃に加温して脂質を溶解し油相とした。
4mMリン酸緩衝液(pH7.86)を調製し水相とした。
水相を70℃に加温し、水相/油相=8/3の容積比となるように油相を添加した後、周速20m/s、13000rpmにて30分攪拌した。その後、相転位温度以上に加温しながら窒素を送気することで有機溶剤を除去し、さらにタンジェンシャルフローフィルトレーションによりリポソーム液の脂質濃度を120~150mMの範囲で濃縮しながら、リポソームの外水相を0.09%塩化ナトリウム水溶液に置換することで有機溶剤を完全に除去し、薬剤未内包リポソームを得た。
1)PBSの調製
塩化ナトリウム81.63g、リン酸水素二ナトリウム十二水和物29.01g、リン酸二水素ナトリウム二水和物2.29gを注射用水948gで溶解し、PBSとした。
2)ゲムシタビン内包リポソーム液の調製
ゲムシタビン塩酸塩7.68g、PBS31.99g、日局注射用水44.83g、8M水酸化ナトリウム1.60mLを混合し、薬物溶液とした。つづいて、4つのバイアルにそれぞれ薬物溶液17.64mL、薬物未内包リポソーム18.00mL、8M水酸化ナトリウム0.36mLを混合した。混合後、約70℃で30分加温した後に室温まで冷却した。その後、薬剤リポソーム混液を孔径0.2μmの除菌用フィルターでろ過し、更にタンジェンシャルフローフィルトレーションにより薬剤リポソーム混液を9.4%スクロース/10mMヒスチジン水溶液で透析精製することで未内包のゲムシタビンを除去し、次にリポソームを孔径0.2μmの滅菌フィルターでろ過することで無菌のゲムシタビン内包リポソーム液を得た。
油相の調製に用いる有機溶媒の組成を(エタノール/酢酸エチル=75/25)から(エタノール/酢酸エチル=100/0)に変更した以外、実施例1と同様にしてリポソームを得た。
油相の調製に用いる有機溶媒の組成を(エタノール/酢酸エチル=75/25)から(エタノール/酢酸エチル=0/100)に変更した以外は実施例1と同様にして実施したが、脂質を完全に溶解することができない(脂質の溶解性が乏しいために乳化できない)ために、リポソームを調製することができなかった。
測定用の試料は、リポソーム液を純水で13倍に希釈して調製した。調製した試料の粒径は動的光散乱(DLS)装置(FPAR-1000AS、大塚電子株式会社製)を用いて測定した。キュムラント平均粒子径を粒径の代表値として採用した。
結果を表1に示す。表1における粒径(nm)は、マイケルソン型干渉計による動的光散乱測定装置による測定での粒径を示す。
リポソーム液の総脂質濃度が25~30mMになるように調整した後、25℃に保温した。エクストルーダー(Thermobarrel extruder、Lipex社製)に0.2μmフィルター(Sartobran P、Sartorius stedim社製)を設置し、注射用水を0.05MPaで通液することでフィルターを洗浄し、次に25℃に保温したリポソームを0.3MPaで加圧ろ過した。ろ液は種々の時間間隔で回収し、ろ液重量を測定した。1mLのろ過液をろ過するのに要する時間からろ過性を測定した。結果を表1及び図1に示す。表1のフィルターろ過性について、A:ろ過可能、B:ろ過可能であるが目詰まりを起こす、C:ろ過不可能(1mLろ過できず)をそれぞれ意味する。図1は、エタノール/酢酸エチルの比を変えて調製したリポソームを含む試料溶液に対するろ過性を評価した結果を示す。図1において、エタ/酢エチは、エタノール/酢酸エチルを意味して、数値はエタノール/酢酸エチルに対する比率(容量比)を意味する。また、ろ過性の程度が、粗大粒子の存在量と関連するか確認するため、粗大粒子の検出力が高い、低コヒーレンス動的光散乱(LC-DLS)測定を実施した。LC-DLS測定はマッハツエンダー型干渉計からなる測定装置を用い、以下のように実施した。
装置:光源SLD、波長835±22nm、AD変換速度Max 1μsec/ch、ファイバープローブによる液浸測定(測定条件は温度25℃、変調周波数10kHz、1回積算あたりのサンプリング時間20μsec間隔65536点、積算300回)。
解析法は測定した散乱光揺らぎの信号をフーリエ変換し、得られたパワースペクトルから変調信号のみを抜き出して自己相関関数を求めた。求められた自己相関関数をヒストグラム法により粒度分布に換算した。
測定する試料は希釈などの処理をすることなく、原液のまま測定した。特に、ミクロンオーダーの粗大物量を測定した。
結果を表1に示す。表1における粗大粒子比率は、500nm以上の粗大物の存在比率を示す。
調製したリポソーム液をメタノールに溶かしフィルターろ過した試料溶液、及びゲムシタビン塩酸塩を希釈調製した検量線標準溶液を用いて、液体クロマトグラフィー/紫外可視吸光度検出法により測定した。
ゲムシタビン塩酸塩約10mgを量り、約10mLの1×PBS(Gibco、Life Technology社製)に溶かした。この液に1×PBS(Gibco、Life Technology社製)を加えて、ゲムシタビン塩酸塩濃度0.1、1.0、5.0、又は10.0μg/mLの溶液を調製し、検量線標準液とした。
(1)試料(リポソーム製剤溶液)約50μLをマイクロマンで量りとり、これにマイクロマンで量りとった約950μLのメタノールを加えた。このとき、約1分間振とうし、溶液が透明になることを目視で確認した。
(2)上記(1)の溶液100μLをマイクロマンで量りとり、マイクロピペットで量りとった約950μLの注射用水を加えた。この液を約1分間振とうした後、約1分間超音波処理をし、さらに約10秒間振とうした。
(3)上記(2)の溶液をDISMICフィルター(穴径0.45μm)でろ過した溶液を試料溶液とした。
液体クロマトグラフィー/紫外可視吸光度検出法により以下の条件で測定した。
測定波長:272nm、カラム:Waters AtlantisT3φ4.6×150mm、5μm
カラム温度:40℃付近の一定温度
移動相A、Bはいずれも水/メタノール/トリフルオロ酢酸混液で、移動相の送液は移動相A及びBの混合比を変えて濃度勾配を制御した。
流量:毎分1.0mL、注入量:10μL、オートサンプラー温度:25℃付近の一定温度で測定を行った。
試料(リポソーム製剤)の希釈溶液から限外ろ過によりリポソームを取り除いた試料溶液、及びゲムシタビン塩酸塩を希釈調製した検量線標準溶液を用いて、液体クロマトグラフィー/紫外可視吸光度検出法により測定した。
(1)試料(リポソーム製剤溶液)約50μLをマイクロマンで量りとり、これにマイクロピペットで量りとった約450μLのPBSを加え、十分に転倒混和し均一な溶液とした。
(2)上記(1)の溶液を約100μLマイクロピペットで量り、あらかじめ洗浄した限外ろ過膜に滴下し遠心分離する。遠心分離は7400×g、30分間、5℃の条件で行った。
(3)上記(2)の操作のろ液を10秒間振とうした溶液を試料溶液とした。
b)測定
3.c)と同様に測定した。
試料溶液を5℃で18ケ月保存した。
上記3.及び4.で測定した製剤中の全ゲムシタビン量及び外水相中に存在するゲムシタビン量を用いて、保存性漏出を次の式により算出した。
式:保存性漏出(%)=100×(18ケ月保存後外水相薬剤濃度-製剤調製直後の外水相薬剤濃度)/内水相薬剤濃度
また、粒径を1.と同様に測定した。
結果を表1に示す。
有機溶媒の混合比率を表2のように調整した以外は、実施例3と同様に薬剤内包リポソームを調製した。
測定用の試料は、1×PBS(Gibco、Life Technology社製)を純水で10倍に希釈した液で、リポソーム液を100倍に希釈して調製した。調製した試料の粒径は動的光散乱(DLS)装置(FPAR-1000AS、大塚電子株式会社製)を用い測定した。キュムラント平均粒子径を粒径の代表値として採用した。
結果を表2に示す。
a)油相の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール及びDSPE-PEGを57/38/5のモル比となるように混合し、次いで有機溶媒を加えて70℃に加温して脂質を溶解し油相とした。有機溶媒の比率について、実施例5-1;(エタノール/酢酸エチル=88/12)、実施例5-1;(エタノール/酢酸エチル=79/21)、実施例5-3;(エタノール/酢酸エチル=75/25)、実施例5-4;(エタノール/酢酸エチル=70/30)、実施例5-5;(エタノール/酢酸エチル=63/37)に調製した。
187mMの硫酸アンモニウム水溶液を調製し水相とした。
b)で調製した水相を70℃に加温し、水相/油相=8/3の容積比になるようにa)で調製した油相を添加した後、周速30m/s、角速度19000rpmで30分間攪拌し、リポソーム液を得た。
測定用の試料は、リポソーム液を純水により13倍に希釈して調整した。調製した試料の粒径は動的光散乱(DLS)装置(FPAR-1000AS、大塚電子株式会社製)を用い測定した。キュムラント平均粒子径を粒径の代表値として採用した。
結果を表3及び図2に示す。
Claims (8)
- 少なくとも1種の脂質が有機溶媒に溶解している油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌する工程、及び
攪拌する工程で得られたリポソームを含む水溶液から有機溶媒を蒸発させる工程を含むリポソームの製造方法であって、
有機溶媒が水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒であるリポソームの製造方法。 - エステル系有機溶媒が酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル、酢酸t-ブチル、及びプロピオン酸メチルから選ばれる少なくとも1種である請求項1に記載の製造方法。
- エステル系有機溶媒が酢酸エチルである請求項1に記載の製造方法。
- 水溶性有機溶媒がアルコール類である請求項1から3のいずれか一項に記載の製造方法。
- アルコールがエタノール、メタノール、2-プロパノール、及びt-ブタノールから選ばれる少なくとも1種である請求項4に記載の製造方法。
- 水溶性有機溶媒とエステル系有機溶媒との質量比が、90:10~30:70である請求項1から5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 攪拌する工程において、脂質を含む水溶液に周速20m/sec以上のせん断を与える請求項1から6のいずれか一項に記載の製造方法。
- 有機溶媒を蒸発させる工程において、有機溶媒を加熱することにより蒸発させる請求項1から7のいずれか一項に記載の製造方法。
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