SE502569C2 - Användning av en immunologiskt inert matris av en sterol och saponiner som kan bilda sfäriska nanopartiklar med snäv storleksfördelning som läkemedelsbärare, partiklar, komposition samt kit - Google Patents

Description

502 569 substanser.

Läkemedelsbärare i form av injicerbara nanopartiklar har därför varit föremål för stort intresse, speciellt vad gäller läkeme- delstillförsel till tumörer, förlängd frisättning av läkemedel samt möjligheten att påverka läkemedelsdistributionen i kroppen efter intravenös injektion.

Trots att ett stort antal olika material har undersökts med avseende på användning som matrismaterial för partikulära läke- medelsbärare är det endast ett fåtal som visat sig kunna använ- das till partiklar av nanometerstorlek, nämligen vissa liposo- mer, lipoproteiner, speciellt Low Density Lipoproteins (LDL), och ett fåtal polymera material, främst polyalkylcyanoakrylat.

Användningen av dessa kända nanopartikulära bärare är dock förenad med många problem. Liposomer elimineras snabbt av RES och är dessutom fragila vilket ger instabila och svårhanterliga liposomberedningar. LDL är en bristvara som extraheras fram ur blod. Vidare är det endast mycket hydrofoba läkemedel som kan inkorporeras utan att först omvandlas till prodrugs. Polymera läkemedelsbärare elimineras snabbt av RES och erhålles dessutom i en bred storleksfördelning som försvårar styrningen av utlösningen av inkorporerat läkemedel.

Morein et al beskriver i WO 90/03184 en iscom-matris bestående av ett komplex mellan minst en lipid, såsom kolesterol, och en eller flera saponiner för användning som immunomodulerande medel. Denna matris, som har den karakteristiska iscomstruktu- ren, dvs en öppen sfärisk struktur med en diameter av omkring 40 nm uppbyggd av ringformiga subenheter med en diameter av omkring 12 nm, uppges ha adjuvanseffekt och är tänkt att användas tillsammans med ett eller flera antigen. I samma ansökan visas även att saponinerna i Quil A, ett extrakt från barken av Quillaja saponaria molina, kan uppdelas i olika substanser, bl.a. B2, B3 och B4b, varav en del uppvisar adju- vanseffekt och andra en strukturgivande effekt. I Morein et al, Nature, Vol. 308, No 5958, s 457-460 (1984) beskrives för första gången de immunostimulerande komplex, som nu allmänt 3 benämnes iscomer, som bildats mellan antígena determinanter med hydrofoba områden och glykosider, såsom triterpensaponiner och speciellt Quil A med adjuvanseffekt, och som ger en 10-100 gånger högre immunogen effekt än en vanlig blandning av antigen och Quil A.

Det har nu överraskande visat sig vara möjligt att använda en partikel av samma typ som tidigare använts som adjuvans, som bärare för administration av läkemedel. Den läkemedelsbärande partikeln enligt uppfinningen omfattar ej antigen eller anti- gena determinanter och har då visat sig vara immunologiskt inert. Vidare bör generellt vid användning som läkemedelsbärare adjuvansdelen separeras bort; en användning av bärare med adju- vanskomponent är dock ej utesluten under förutsättning att biverkningar ej uppstår. Det kan dock vara viktigt att adju- vanskomponenten avlägsnas i samband med läkemedel av protein- eller peptidtyp, då dessa kan tänkas ha epitoper som initierar och stimulerar till ett immunsvar.

Med adjuvans avses idealt en substans som hjälper till att höja immunsvaret mot en annan substans utan att initiera ett immun- svar mot sig själv. Vidare avses i denna beskrivning med: matris ett strukturgivande komplex mellan en eller flera = bärare saponiner och kolesterol som eventuellt också innehåller andra lipider, som kan vara immuno- logiskt inert eller immunostimulerande beroende på ingående saponiner, med formen av sfäriska nanopar- tiklar uppbyggda av ringformiga subenheter, iscom matris + antigen, ett immunostimulerande komplex med samma partikelstruktur som matrisen, delpha matris + läkemedel, en läkemedelsbärande partikel med samma struktur som matrisen.

Föreliggande uppfinning avser användning av en inert, struk- turgivande matris av ett komplex av en sterol, såsom koleste- rol, och en eller flera saponiner som bärare för administration av en läkemedelsaktiv substans, vilken matris har en ringformig grundstruktur som kan bilda sfäriska nanopartiklar med en snäv storleksfördelning. 502 569 _ ' 4 Enligt en föredragen utföringsform omfattar matrisen också en eller flera andra lipider, speciellt fosfolipider.

Bärarpartiklarna har lämpligen en storlek av 30-50 nm, spe- ciellt omkring 40 nm.

Genom användning av en bärarpartikel enligt uppfinningen uppnås - en snäv partikelstorleksfördelning , något som är av stor betydelse vid administration av läkemedel för erhållande av god reproducerbarhet och jämn dosering; - ökad uppehållstid i cirkulationen på grund av en hydrofil Yta; - hög stabilitet; - möjlighet att binda in amfifila och lipofila läkemedels- substanser som normalt är mycket svårlösliga och svårfor- mulerade.

Uppfinningen avser även en läkemedelsbärande partikel omfattan- de en inert strukturgivande matris av ett komplex av en sterol, såsom kolesterol, och en eller flera saponiner som bärare var- till bundits en läkemedelsaktiv substans, vilken partikel har en ringformig grundstruktur som kan bilda sfäriska nanopartik- lar med en snäv storleksfördelning.

Den läkemedelsbärande partikeln, delpha, har normalt en storlek av 30-50 nm, speciellt omkring 40 nm.

Det har visat sig att en sterol, såsom kolesterol, är nödvändig för att den önskade matrisen skall bildas. Användbara steroler är härvid de som binder till saponiner under bildande av den önskade matrisstrukturen, såsom prekursorer och derivat av kolesterol, liksom till exempel ß-sitosterol, stigmasterol och tiokolesterol, vilken sistnämnda speciellt kan användas för att binda ett läkemedel via tiolgruppen.

De saponiner som kommer i fråga för komplexbildningen är varje strukturbildande saponin med hydrofoba områden såsom de som beskrives i R. Tschesche och Wulf, Chemie Organischer Natur- stoffe, red. W. Herz, H. Grisebach, G.W. Kirby, volym 30 - lsoz Se9"' 5 (1973). Särskilt intressanta är mycket polära saponiner, lämpligen polära triterpensaponiner såsom polära sura bis-_ desmosider, t.ex. saponinextrakt från Quillajabark. Speciellt lämpliga är rena saponiner utan adjuvanseffekt, såsom de substanser som erhållits enligt WO 90/03184 av ett extrakt av Quillaja Saponaria Molina med 8-11 kolhydratgrupper, nämligen B4b med en molekylvikt av 1862, och eventuellt B2 med en molekylvikt av 1988.

Förutom sterolen är det lämpligt att matrisen omfattar en eller flera andra lipider. Som exempel på lipider kan nämnas fetter eller fettliknande substanser såsom triglycerider eller blanda- de triglycerider som innehåller fettsyror med upp till 50 kolatomer, t.ex. smörsyra, kapronsyra, kaprinsyra, kaprylsyra, laurinsyra, myristinsyra, palmitinsyra, stearinsyra, arachidin- syra, behensyra, lignocerinsyra, eller omättade fettsyror med upp till 30 kolatomer såsom hexadecensyra, omättade hydroxi- fettsyror; glyceroletrar, vaxer, dvs estrar mellan högre fettsyror och envärda alkoholer; fosfolipider såsom derivat av glycerolfosfat såsom derivat av fosfatidinsyror dvs lecitin, cefalin, inositolfosfatider, spingosinderivat med 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20 kolatomer; glykolipider, isoprenoider, sulfolipider, karotenoider, steroider, steroler, kolestanol, kaprostanol, fytosteroler t.ex. stigmasterol, sitosterol, mykosteroler, t.ex, ergosterol, gallsyror t.ex. cholsyra, deoxicholsyra, kenodeoxicholsyra, litocholsyra, steroidglykosi- der, estrar av vitamin A eller blandningar därav. Speciellt föredrages fosfolipider, såsom fosfatidyletanolamin, fosfa- tidylkolin.

Det är naturligtvis önskvärt att de för framställning av bärar- partiklarna använda utgångssubstanserna har en så låg toxicitet som möjligt. Dock gäller att den bildade matrisen på grund av sin stabilitet normalt uppvisar en betydligt lägre toxicitet än summan av de ingående komponenternas.

Såsom tidigare nämnts är strukturen av delpha identisk med strukturen av matrisen. Med negativt färgad elektronmikroskopi framstår en öppen sfärisk struktur med en diameter på 30-50 nm, 502 569 6 speciellt 35-42 nm, som är sammansatt av mindre ringformade enheter med en diameter av 10-12 nm. På bifogade elektron- mikroskopiska avbildningar visar Fig. 1, 3 och 6 olika bärar- matriser som kan användas enligt uppfinningen för administra- tion av en läkemedelsaktiv substans. Fig. 2, 4, 5 och 7 visar mindre väldefinierade komplex och Fig. 8 en definierad CoQlo-delpha. Härav framgår att samtliga bärarmatriser liksom den läkemedelsbärande partikeln uppvisar samma regelbundna struktur inom ett relativt snävt storleksintervall.

En typisk delpha består av kolesterol, en eller flera saponin- komponenter, såsom B4b eller en blandning av B4b och B2, en läkemedelsaktiv substans och en lipid, vanligen en fosfolipid.

En sådan typisk delpha med en partikelstorlek av 30-50 nm har ett molförhållande saponinzkolesterolzfosfolipid:läkemedel av 1:(0,1-10):(O-10):(0,1-50), varvid kvoten saponin består av 10-100 % B4b och resten B2 eller eventuellt andra saponiner. En vanlig delpha har en molär sammansättning av 1:l:O,5:0,5, varvid saponinen utgöres av B4b.

För framställning av en matris eller en delpha med ringformiga partiklar av en storlek av 10-12 nm i diameter kan förhållandet mellan de olika komponenterna saponin:ko1esterol:fosfolipid ändras.

Den som bärare använda strukturgivande matrisen, liksom delpha, kan framställas enligt WO 90/03184 genom solubilisering eller överföring i kolloidal form av sterolen i ett lösningsmedel, tillsats av saponinen eller saponinerna samt eventuella övriga tillsatser, speciellt en läkemedelsaktiv substans, varefter lösningsmedlet avlägsnas och komplexet överföres till en lösning vari dess komponenter ej är lösliga, exempelvis en vattenlösning. Detta kan ske genom affinitetskromatorafi, gel- filtrering eller centrifugering, ultrafiltrering, dialys eller elektrofores. Matrisen respektive delpha renas därefter från överskott av sterol och saponiner t.ex. genom gelfiltrering eller centrifugering genom en densitetsgradient. Som solubili- serande medel kan användas en detergent, såsom en nonjonisk eller jonisk, såsom katjonisk eller anjonisk eller zwitter- ' 9502 569 7 jonisk detergent såsom Zwittergent eller en detergent baserad på gallsyra som användes i överskott. Typiska exempel finns angivna i den ovan refererade WO 90/03184. Solubiliseringsmed- let avlägsnas då den läkemedelsaktiva substansen har till- räckligt hydrofoba egenskaper för att integreras i det bildade delphakomplexet. Vissa ytaktiva substanser underlättar avsevärt matrisbildningen. Dessa omfattar biologiska membranlipider med en polär huvudgrupp och en icke-polär alifatisk kedja, t.ex. fosfatidylkolin (negativt laddad) och fosfatidyletanolamin (positivt laddad). Det solubiliserande medlet kan också utgöras av lösningsmedlet i sig, såsom alkoholer, organiska lösnings- medel eller små amfifatiska molekyler såsom heptan-l,2,3-triol, hexan-1,2,3-triol, ättiksyra eller trifluoroättiksyra. Med fördel användes etylalkohol, dioxan, eter, kloroform, aceton, bensen, ättiksyra, koldisulfid, MEGA-10 (N-dekanoyl-N-metylglu- kamin) och ß-oktylglukosid.

Normalt gäller att det är nödvändigt att avlägsna det solubili- serande medlet från matrisen, vilket exempelvis kan ske genom dialys, ultrafiltrering eller kolonnkromatografisk teknik. I vissa fall kan det också vara möjligt att efter inbindning av önskad läkemedelsaktiv substans späda de erhållna läkemedels- bärande partiklarna till en koncentration som ger en fysiolo- giskt godtagbar lösning.

Den läkemedelsbärande partikeln enligt uppfinningen kan fram- ställas genom införlivande av en läkemedelsaktiv substans i bärarmatrisen genom hydrofob interaktion under bildandet av matriskomplexet enligt ovan, men även efter det att bärarmatri- sen bildats. Den läkemedelsaktiva substansen kan härvid, förutom genom hydrofob interaktion, bindas till bärarmatrisen genom kemisk koppling på i och för sig känt sätt till en lämplig funktionell grupp som integrerats i en tidigare formad matris.

Som exempel på funktionella grupper lämpade för inbindning av den läkemedelsaktiva substansen kan nämnas -NH2 -SH, -COOH, -OH. Ett flertal grupper och kopplingsmetoder finns beskrivna i Journal of Immunological Methods, 59 (1983), 129-143, 289-299; i Methods in Enzymology, volym 93, sid 280-333; samt i 502 569 8 Analytical Biochemistry 116, sid 402-407 (1981).

Läkemedelsaktiva substanser som kan införlivas i en bärarmatris enligt uppfinningen kan ha skiftande sammansättning och stor- lek. De kan antingen inkorporeras som solitära enheter eller i kombination med andra molekyler. Bindningen kan ske genom hydrofob växelverkan eller genom kovalenta bindning. Som exempel kan nämnas stora glykoproteiner med en molvikt på upp till 400 kd och oligopeptider med ett fåtal aminosyror som kan bindas in genom hydrofob växelverkan. Även nativa proteiner, triterpenoider och flaviner mm kan införlivas genom hydrofob växelverkan. Vissa substanser t.ex. a-interferon, y-interferon och ett antal proteiner, poly- och oligopeptider kan inkorpore- ras genom hydrofob växelverkan efter det att hydrofoba regioner exponerats genom olika behandlingar av denaturerande karaktär.

Icke hydrofoba molekyler kan inkorporeras i delphakomplex genom kovalenta bidningar till inkorporerade lipofila komponenter t.ex. fosfatidyletanolamin eller kovalenta bindningar till soc- ker, aldehyd etc.

Uppfinningen avser även en farmaceutisk komposition som om- fattar läkemedelsbärande partiklar enligt ovan i kombination med en farmakologiskt godtagbar vehikel. Många konventionella farmaceutiska vehiklar som normalt ingår i olika läkemedels- former kan användas. Delpha-partiklarna kan t ex vara suspende- rade i vattenlösningar eller vara frystorkade i beredningarna.

Som exempel på läkemedelsformer innehållande delpha kan nämnas: * injektionsvätskor, injektions- och infusionssubstanser samt implantabletter för parenteral administrering. * “lösningar“, geler, salvor och krämer för topikal administre- ring. * kapslar, tabletter, drageer och mixturer för oral administra- tion.

Koncentrationen av delpha i de olika läkemedelsformerna kan variera beroende på ingående läkemedel och administreringssätt.

Normalt kan 1 ml eller 1 g farmaceutisk beredning innehålla 0,01-100 mg delpha. f '5o2 še9" 9 Den läkemedelsbärande partikeln enligt uppfinningen, delpha, kan användas för peroral och parenteral administrering av i läkemedelssubstanser. Vidare kan delpha användas för topikal administstrering, t ex via öga, näsa och hud av läkemedelssubs- tanser avsedda att ge systemisk effekt. Även mycket svårlösliga läkemedelssubstanser kan inkorporeras i delpha. Exempel på en synnerligen svårlöslig sådan är koenzym QIO, liksom nifedipin, som idag ej finns tillgängligt på marknaden som injektion- svätska på grund av sin svårlöslighet. Andra svårlösliga sub- stanser finns inom grupperna kortikosteroider och steroidhormo- ner. Vidare är vissa cytostatika svårlösliga, t ex etoposid.

Delpha kan också användas för parenteral administrering av läkemedel med kort biologisk halveringtid. Dessa måste tillfö- ras genom upprepade injektioner eftersom oral administrering ej är möjlig pga enzymatisk nedbrytning. En fördröjd frisättning av dessa läkemedel från en delphapartikel skulle möjliggöra färre injektionstillfällen. Som exempel på läkemedelsaktiva substanser kan nämnas insulin, tillväxthormon, kalcitonin, GHRH (growth-hormone-releasing hormone).

Ett annat föredraget användningsområde för de läkemedelsbärande partiklarna enligt uppfinningen är för parenteral målstyrd administrering av läkemedel, speciellt cytostatika.

I den läkemedelsbärande partikeln, delpha, kan komponenter ingå i flera kombinationer med olika molekyler och därvid har visats att ingående komponenter tagits upp av testade celler (makrofa- ger och celler från cellinjen Wehei 110). Med immunofluorescens och elektronmikroskopi har komplexet kunnat följas in i cellen, medan miceller av motsvarande protein disintegrerats. Detta innebär således att delphapartiklarna är mycket stabila.

Upptagningen från injektionsstället är snabb och de komponenter som bundits till bärarmatrisen enligt uppfinningen transporte- ras till olika organ, såsom exempelvis dränerande lymfkörtlar.

Efter intraperitoneal administration återfinns förhållandevis mycket av komponenterna i mjälten. Andra organ är hjärta, lever, galla, mjälte, njurar, urinledare och -blåsa, lungor. En kombination av olika komponenter i samma partikel kan innebära 502 569 10 en synergism, eftersom olika komponenter kan ha olika upp- gifter; en komponent t ex kan fungera som målsökare till ett visst organ eller celltyp eller för penetration av mukus och en annan komponent kan påverka cellen. Komponenterna i ett sådant komplex kan tas upp av en och samma cell som skall påverkas.

Utmärkande för bärarmatrisen enligt uppfinningen liksom en därmed bildad delpha är att varken antikroppsförmedlad immuni- tet (AMI) eller cellförmedlad immunitet (CMI) framkallas mot de däri ingående komponenterna. I och med att immunsvar ej ut- vecklas mot bärarmatrisen kan denna användas som bärare för olika läkemedel vid upprepade tillfällen utan att immunologiska reaktioner förhindrar t.ex penetration av mukus vid lokal applikation i t.ex. näsan, konjunktivan eller per os, eller förhindrar adsorption och vidare fördelning av bäraren eller delpha och däri inkorporerade läkemdel i organismen vid paren- teral applikation. Immunologiska reaktioner som leder till biverkningar härigenom undvikes.

Uppfinningen åskådliggöres närmare genom följande exempel på framställning och användning av strukturgivande bärarmatris och läkemedelsbärande partiklar.

Exempel 1 Delpha-bärare En bärare för icke-hydrofoba farmaka tillverkas enligt föl- jande. 1000 pl lipid-mix, bestående av 10,0 mg kolesterol (+ spår av 3H-kolesterol), 10,0 mg fosfatidyletanolamin och 200 mg MEGA-10 (N-dekanoyl-N-metylglukamin) i H20 blandas med 500 mg Quil A (Spikosid, från Iscotec, Luleå) löst i H20 (10% vikt/vikt), volymen justeras till 5-10 ml med PBS (0,02M fosfatbuffrad salin, 150mM NaCl, pH 7,4). Blandningen inkuberas på skak i 4-24 timmar innan den dialyseras mot 5 X 5 l PBS (rumstemperatur 24-48 timmar, sedan +4°C).

De bildade bärarkomplexen renas från överskottsmaterial på en sackarosgradient, 10-50% (vikt/vikt), 18 timmar, 40.000 varv/min (rotor TST 41,14), 10°C. Gradienten tappas nedifrån i 17 fraktioner vilka var för sig analyseras med avseende på bärar-partiklar (3H-kolesterol och elektronmikroskopi, EM) "soz 569 " ll enligt nedanstående Tabell 1. Fraktioner innehållande bärarpar- tiklar poolas och den exakta koncentrationen av ingående komponenter (kolesterol, fosfatidyletanolamin och saponin) bestäms. Bärarpartiklarna kan koncentreras exempelvis genom pelletering (18 timmar, 40.000 varv/min (TST 41,14), 10°C).

Pelleterad bärare löses upp till önskad koncentration exempel- vis 10 mg/ml, i lämplig buffert och förvaras vid +4°C (< 1 mån) eller -70°C (långtidsförvaring) fram till användning.

Tabell 1 Fraktion nr CPM (3H-kolesterol) EM {matrisstruktur) 1 59 2 54 3 71 4 2562 ++ 5 22801 +++ 6 44101 +++ 7 17900 +++ 8 5717 +++ 9 2394 ++ 10 1471 + 11 970 12 732 13 513 14 676 15 408 16 353 17 690 Pig. 1 visar i en förstoring av 200.000 bärarmatrisen i fraktion 5, nämligen sfäriska associationskomplex med en storlek av 30-50 nm i diameter, uppbyggda av en ringformig grundstruktur med en ungefärlig diameter av 10 nm.

Samma effekt erhålles om i stället för Quil A användes 250 mg av vardera B2 och B4b eller 500 mg ren B4b.

Exempel 2 Delgha-bärare En bärarmatris för icke-hydrofoba farmaka tillverkas som i exempel 1 genom att 100 um av en lösning bestående av 1,0 mg 502 569 A « 12 stigmasterol och 20 mg MEGA-10 i H20 blandas med 5,0 mg Quil A.

Blandningen inkuberas på skak i 4-24 timmar innan den dialyse- ras mot PBS (rumstemperatur 24-48 timmar, sedan +4°C). Att bärarkomplex bildas verifieras genom EM. Bildade komplex renas på en sackarosgradient 10-50 % (vikt/vikt) i 18 timmar vid 40.000 varv/min (rotor TST 41.14) vid 10°C eller genom sedimen- tering genom 20 % (vikt/vikt) sackaros i 18 timmar vid 40.000 varv/min (rotor TST 41.14) vid 10°C. Sedimenterade komplex löses upp i PBS. På Fig. 2 visas i en förstoring av 75.000 den erhållna grundstrukturen, som här är partiellt associerad.

Om stigmasterol i ovanstående exempel utbytes mot ß-sitosterol erhålles monomera bärarpartiklar med en ringformig grundstruk- tur (10-12 nm), såsom framgår av Fig. 3. Om stigmasterol i stället ersättes med lanosterol erhålles grundstrukturen i en annan associationsform enligt fig. 4.

Exempel 3 Delpha-bärare En bärarmatris för icke-hydrofoba farmaka tillverkas enligt exempel 1 av 100 pl av en lösning bestående av 1,0 mg stigmas- terol, 1,0 mg fosfatidylkolin och 20 mg MEGA-10 i H20 som blandas med 5,0 mg Quil A. Blandningen inkuberas på skak i 4-24 timmar innan den dialyseras mot 5 x 51 PBS (rumstemperatur 24- 48 timmar, sedan +4°C). Att bärarkomplex bildas verifieras med EM. Bildade komplex renas på en sackarosgradient 10-50 % (vikt/vikt) i 18 timmar vid 40.000 varv/min (rotor TST 41.14) vid 10°C eller genom sedimentering genom 20 % (vikt/vikt) sackaros i 18 timmar vid 40.000 varv/min (rotor TST 41.14) vid 10°C. Sedimenterade komplex löses upp i PBS. Fig. 5 visar i en förstoring av 75.000 en elektronmikroskopisk bild av den erhållna bikakeliknande strukturen.

Om stigmasterol i ovanstående exempel utbytes mot ß-sitosterol erhålles däremot sfäriska bärarpartiklar enligt Fig. 6 med en struktur liknande den som visas i Fig. 1. Om stigmasterol i stället ersättes med lanosterol utfälles merparten av materia- let, se Fig. 7.

Em? 569 13 Dessa exempel visar att av de testade sterolerna stigmasterol gav den "bästa" preparationen, dvs en klar lösning utan fäll- ningar i frånvaro av fosfolipid. Lanosterol och ß-sitosterol gav upphov till en mindre fällning vid sidan av de komplex som visas på EM-bild. Då fosfolipid tillsattes blev lösningen med lanosterol resp stigmasterol opalescent, vilket tyder på att en stor mängd material inte bildade komplex med Quil A. ß-sitoste- rol däremot bildade en väldefinierad matris med Quil A och fosfolipid.

Exempel 4 CoQ1@-delpha 2 mg CoQlO löses upp i ca 25 pl kloroform och blandas med 400 ul lipid-mix, bestående av 4,0 mg kolesterol (+ spår av 3H- kolesterol), 4,0 mg fosfatidylkolin och 80 mg MEGA-10 i H20.

Kloroformen drivs bort med försiktig kvävgasbubbling under kraftig omrörning av blandningen. Temperaturen hålls vid 25- 35°C. Då kloroformen är avlägsnad tillsätts 10 mg Quil A (Spikosid) löst i H20 (10% vikt/vikt), volymen justeras till 2 ml med PBS (fosfatbuffrad (0,02M), l50mM NaCl, pH 7,4). Bland- ningen inkuberas på skak i 2-4 timmar (mörker), innan den dialyseras mot 3 X 5 l PBS (mörker, rumstemperatur).

De bildade CoQ1O-bärande partiklarna renas från överskotts- material på en sackarosgradient, 10-50% (vikt/vikt), 18 timmar, 40.000 varv/min TST 41,14), 10°C. Gradienten tappas nerifrån i 17 fraktioner vilka var för sig analyseras med avseende på CoQ10 (A330) och delpha-partiklar (3H-kolesterol och elektron- mikroskopi). Fraktioner innehållande CoQ1o-delpha poolas och den exakta koncentrationen av CoQlO bestäms. 3H-kolestorol bestämmes genom att 50 pl prov tas från varje fraktion i gradienten, blandas med 4 ml scintvätska (optiphase Hisafe II, Pharmacia-LKB) och räknas i 60 sekunder i en ß-räknare (Rackbe- ta, LKB). Resultatet framgår av följande Tabell 2. 502 569 - 14 Tabell 2 Frakt. nr CPM (3H-kolesteroll A330 (CoQ10L EM (matrisstruktur) 1 22 0,055 - 2 23 0,056 - 3 32 0,053 - 4 30 0,081 - 5 25 0,080 - 6 1410 0,149 + 7 12120 0,653 +++ 8 9624 0,397 +++ 9 3600 0,167 ++ 10 1513 0,124 + 11 1578 0,289 + 12 1023 0,382 (+) 13 507 0,357 - 14 408 0,213 - 15 437 0,384 - 16 275 0,499 - 17 294 1,225 - Fig. 8 visar i en förstoring av 1:75.000 en elektronmikrosko- pisk bild av den i fraktion 7 erhållna delphastrukturen, 30-50 nm, liknande den i Fig. 1.

Samma resultat erhålles om i stället för Quil A användes 5 mg av vardera B2 och B4b.

Exempel 5 a-interferon-delpha 1 mg nypreparerad a-interferon i 0,5 till 1,0 ml buffert blandas med 100 ul lipid-mix, bestående av 1,0 mg kolesterol (+ spår av 3H-kolesterol), 1,0 mg fosfatidylkolin och 20 mg Mega-10 i H20. Därefter tillsätts 5 mg Quil A (Spikosid eller 2,5 mg av vardera komponent B2 och B4b) löst i H20 (10% vikt/- vikt) och volymen justeras till 2 ml med PBS (fosfatbuffrad salin (0,02M), 150mM NaCl, pH 7,4). Blandningen inkuberas på skak i 2-4 timmar, innan den dialyseras mot 3 X 5 1 PBS (rumstemperatur). 15 502 569 De bildade a-interferon-bärande partiklarna, a-interferon- delpha, renas från överskottsmaterial på en sackarosgradient, 10-50% (vikt/vikt), 18 timmar, 40.000 rpm (TST 41,14), 10°C.

Gradienten tappas nerifrån i 17 fraktioner vilka var för sig analyseras med avseendepå a-interferon aktivitet och delpha- partiklar (3H-kolesterol och elektronmikroskopi). Fraktioner innehållande a-interferon-delpha poolas och den exakta kon- centrationen av a-interferon bestäms.

Exempel 6 Insulin-delpha 2 mg insulin i ca 1,5 ml PBS (fosfatbuffrad salin (0,02M), 150 mM NaCl, pH 7,4) blandas med 200 ul lipid-mix, bestående av 2,0 mg kolesterol (+ spår av 3H-kolesterol), 2,0 mg fosfatidylkolin och 40 mg MEGA-10 i H20. 5 mg Quil A (Spikosid eller 2,5 mg av vardera komponent B2 och B4b) löst i H20 (10% vikt/vikt), vol- ymen justeras till 2 ml med PBS. Blandningen inkuberas på skak i 2-4 timmar, innan den dialyseras 4 timmar mot 0,5 liter 0,1 M ättiksyra, pH 2,70, samt över natt mot 1 liter 0,1 M acetat pH 5,00. Insulin-delpha-partiklarna isoleras och renas från över- skottsmaterial på en sackarosgradient, 10-50% vikt/vikt, 18 timmar, 40.000 varv/min (TST 41,14), 1o°c. Gradienten tappas nerifrån i 17 fraktioner vilka var för sig analyseras med av- seende på insulin (proteinmängdsbestämning enligt Bradford et al, Analyt. Biochem 72, 1976, 248-254) och delpha-partiklar (3H-kolesterol och elektronmikroskopi). Fraktioner innehållande insulin-delpha poolas och den exakta koncentrationen av insulin bestäms.

Exempel 7 LHRH-delpha LHRH (luteinizing hormone releasing hormone) konjugeras till bärarmatrisen enligt de principer för konjugering via cystein med hjälp av maleidohexanoyl-N-hydroxi-succinimidester (MHS), som beskrivs av Lee et al, Molecular Immunology, Vol 17, s. 749-756 (1980).

Peptiden reduceras enligt följande. 1 mg peptid löses i 400 pl 0,1 M natriumfosfatbuffert pH 8,0. Ett 250 x molärt överskott ditiotreitol (DTT) tillsätts och blandningen inkuberas vid rumstemperatur under 30-60 minuter. Peptiden separeras från DTT 502 569 p « 16 genom gelfiltrering på Sephadex G-10 (Pharmacia, Uppsala) jäm- viktad med urluftad N2-mättad 0,1 M natriumfosfatbuffert pH 6,66, innehållande 0,1 M EDTA.

Bärarmatrisen MHS-modifieras enligt följande: 2,0 mg bärare i 450 pl 0,1 M natriumfosfatbuffert, pH 6,66, blandas med 10-100 x molärt överskott MMS (i 50 ul DMSO) mot fosfatidyletanolamin.

Reaktionsblandingen omrörs försiktigt vid rumstemperatur under 1 timme. överskott av MHS och andra reaktionsprodukter renas bort genom gelfiltration på Sephadex G-25 (Pharmacia, Uppsala) jämviktad med urluftad N2-mättad 0,1 M fosfatbuffert, pH 6,66, innehållande 0,1 M EDTA. Lösningen med reducerad peptid blandas med MHS aktiverad bärare i ett 5 x molärt överskottsförhållande av peptid mot fosfatidylamin. Konjugeringen får fortskrida under omröring 18-24 timmar.

LHRH-delpha renas från överskottsmaterial på en sack- arosgradient, 10-50% (vikt/vikt), 18 timmar, 40.000 varv/min (TST 41,14), 10°C. Gradienten tappas nerifrån i 17 fraktioner vilka var för sig analyseras med avseende på LHRH och delpha- partiklar (3H-kolesterol och elektronmikroskopi). Fraktioner innehållande LHRH-delpha-partiklar poolas och koncentrationsbe- stäms.

Exempel 8 Biotin-delpha 1 mg (2,0 mg/ml) bärare (tillverkad enligt exempel 1) i 0,1 M karbonatbuffert, pH 8,8, blandas med N-hydroxi-succinimidbiotin (10 mg/ml i DMSO) i ett överskottsförhållande 10 X 1 mot fos- fatidyletanolamin. Blandningen inkuberas i 15 min vid rums- temperatur. Biotin-delpha-partiklarna renas från överskottsma- terial på en sackarosgradient, 10-50% (vikt/vikt), 18 timmar, 40.000 varv/min (TST 41,14), 10°C. Gradienten tappas nerifrån i 17 fraktioner vilka var för sig analyseras med avseende på delpha-partiklar (3H-kolesterol och elektronmikroskopi), se Tabell 3 nedan, och biotin. Fraktioner innehållande biotin-delpha-partiklar poolas och mängdbestäms.

I "soz še9 17 Tabell 3 Fraktion nr CPM (3H-kolesterol) §M_1mg§;i§§L;ggLgrl 1 45 “ 2 22 _ 3 41 - 4 24 - 5 1314 + 6 14993 ++ 7 26315 _ +++ 8 8239 ++ 9 3644 ++ 10 1704 + 11 1024 12 673 13 523 14 321 15 230 16 170 17 154 En pool bestående av fraktionerna 5-10 analyseras med avseende på biotin i en ELISA.

Coat: mus-antibiotin (monoklonalt) 10 g/ml i 50 mM karbo- natbuffert, pH 9,6, 4°c över natt.

Provspädningar (pool samt icke-biotinylerad matris): 1/so. 1/150, 1/450 etc i Pßs Tween (o,os %), 1 n, rums- temperatur, skak.

Konjugat: avidin-HRP (horse-raddish peroxidase) 1/2000 i PBS Tween (0,05 %), 1 h, rumstemperatur, skak.

Framkallning: TMB (tetrametylbensidin) 0,10 mg/ml och HZO2 (0,006 %) i 0,1 M acetat, pH 6,0. 502 569 18 Tabell 4 Provspädning ABS (pool) ABS (kontrollmatris) 1/50 1,997 0,097 1/150 2,107 0,078 1/450 1,874 0,106 1/1350 1,201 0,099 1/4050 0,816 0,100 1/12150 0,206 0,089 1/36450 0,096 0,090 1/109350 0,103 0,115 Följande försök visar på fördelningen av läkemedel i kroppen vid administration med hjälp av en delpha enligt uppfinningen.

Administrering av CoQ10-delpha till mus Isoprenkedjans längd hos coenzym Q (CoQ) varierar hos olika djurarter. CoQ9 innehåller således 9 isoprenenheter i kedjan och CoQlO innehåller 10 enheter. Människan producerar enbart CoQ10 under det att råtta och mus producerar omkring 95 % CoQ9 och 5 % CoQ10. På grund av den låga endogena koncentrationen av CoQ10 valdes mus som försöksdjur i följande test: 15 st 19,20g 1 0,90 g NMRI möss (honor) sprutades subkutant med 14,6 pg CoQ1o-delpha (0,8 mg/kg), dvs med 0,2 ml av en be- redning som innehåller 73 pg/ml CoQ10. Vid T = O, 0,5, 1, 3, 5 och 8 timmar togs blodprov och vid T = 0, 0,5, 3 och 8 timmar togs dessutom organ (hjärta, lever, njurar och mjälte). För att mäta den endogena nivån sprutades en kontrollgrupp, 6 st, med tomma delpha-komplex, dvs enbart bärare i motsvarande mängd.

Blodprov och organ togs från denna kontrollgrupp vid T = 0,5 och 7 timmar. Som jämförelse togs serum och organ även från 3 st obehandlade möss. Blodet centrifugerades och plasma och organ förvarades vid -20°C till dess de analyserades. De kemiska analyserna av CoQl0 utfördes med vätskekromatografi enligt en metod beskriven av P-O Englund i J. Chromatogr. 425- (1988), 87-97. Prov , 1 ml, från vätskefasen blandas med 8 ml scintvätska (Ophphase Hisafe II, Pharmacia LKB) och räknas i 2000 sek i en ß-räknare (Rackbeta, LKB). Organproverna homogeniserades med en Potter-S homogenisator i 10 volymdelar 1-propanol innehållande intern standard. Vätskefasen *5o2 S69 19 injicerades i vätskekromatografen. De kemiska analyserna visade en ökning av halten CoQ1O i serum och hjärta, se tabell 5. Vid mätning av radioaktiviteten i organproverna (3H-kolesterol) registrerades en tydlig radioaktivitet endast i prov från levern.

Följande slutsatser har dragits av experimentet: * eftersom halten COQIO ökar kontinuerligt i serum under 8 timmar, och troligen längre, har delpha-komplexen inte omedel- bart eliminerats av RES * delpha-komplexet kan antas ha levererat CoQl0 till hjärtat eftersom COQIO i hjärtat tenderar att öka utan att spår av i komplexen ingående kolesterol påträffas * delpha-komplexen och/eller ingående kolestorol elimineras sannolikt via levern som uppvisade mest radioaktivitet. 20 502 569 H@~_o O@w_>H o~>_~ oow.HH o~H.> o.w HN ww~.o oow\«< owH_H oow_HH oß>_æ o.w HN wo~_o @ow_o« o~o_« oøw\HH omo.w o.w NN >«~_o o@m.H« o«ß_H omm_m o«H.> o.m HN wwH_o oo>.@« om@_~ ooH_HH o«~_> o_m ON oom_m« o>o_H ooH_HH oo~_w o_m QH H~H_o oow~>H @mH_H OOHHHH owo\> o_~ wH «wH.o oo«.m« o>w_~ ooo.HH o«~.w o.m >H mmH_o oo@~>H oom_~ oow_oH omH_w o.m wH mHo_o øo~.o« omw.H oo>.oH omH_> o_H mH owo_o o~m_m oHH_m oo~.HH oom.> o_H HH w«o.o oo~.HH o@H_H oow.øH oww.> o.H HH øHø.c oow.HH oH>_~ oom.oH. owm.@ m_o NH mHo.o ooH.m« o«H_H øo~_NH o>~_w m.o HH oom_~H o«~_H oom~HH ooH.> m_o øH o~o.o oo>_«H ooo_m øo@.oH om~_> | = m -o.o oow.oH ow>_~ oo«_HH o>~.> 1 = w m«o_o oo«_>« QHw_H oom.oH oßm_> | .Hucmnwno > mHo_o ooH_oH @HH_~ ooH.HH o~o_w o_> = w mHo_o @o«.HH o@>_~ @om_mH o«o_> o_> = m H«o.o oQ~_HH o@H_m oow_HH o~@.w o_> = H H~o.o oom.H~ omo.H o@>_m o~æ_w m_o = H vmo.o ocw_o« QH@_~ o°@_oH ooH_ß m_o = N >.@ m~o Huucozv H e\a= uHc: c\c1 u~: v\u= z pc Eøuww muummm .Hmšwq muøwz muflmnz “ÄB mHš m HHNQMB I.

'E02 569 21 Biologiskt test för att visa att bäraren är immunoloqiskt inert Administration av biotin till mus med hjälp av olika bärare.

För att verifiera att bärarmatrisen är immunologiskt inert vid användning som läkemedels-bärare gjordes ett jämförande försök med biotin administrerat som biotin-delpha och med hjälp av immunologiskt aktiva bärare. Möss immuniserades subkutant med biotin buren av immunologiskt aktiva bärare - iscom respektive micelle - innehållande ytproteiner från influensavirus. Efter en immunisering med 3 pg bärare-biotin hade alla mössen höga (iscom) eller medelhöga (micelle) serumtitrar mot biotin. Åtta veckor senare gavs mössen en "booster-dos" med biotin-delpha- partiklar. Två veckor senare togs serumprov och halten anti- kropp mot biotin före och efter administrering av biotin-delpha jämfördes. En kontrollgrupp av djur sprutades med biotin-delpha vid båda tillfällena. Som framgår av Tabell 6, så har admini- strering av biotin-delpha ingen effekt på antikroppssvaret mot biotin inte ens i de fall då djuren har grundimmuniserats mot biotin bunden till en immunologiskt aktiv bärare. Efter booster med aktiv bärare ökade serumtitrarna mot biotin 5-10 gånger (visas ej i Tabell 6).

Tabell 6 Primär administrering Sekundär adminstrerinq biotin- antikroppsvar biotin- antikroppsvar formulering mot biotin formulering mot biotin (arbiträr enhet) (arbiträr enhet) biotin-iscom 2999:46? biotin-delpha 3101:31? (33 möss) (1824-3781) (ll möss) (2301-3476) biotin-micelle 9731470) biotin-delpha 850-486 (33 möss) (291-1971) (11 möss) (398-1978) biotin-delpha 59:13 biotin-delpha 4915 (34 möss) (42-89) (11 möss) (42-57)

Claims (14)

22 502 569 PATENTKRAV

1. l. Användning av en immunologiskt inert, strukturgivande matris av ett komplex av en sterol, såsom kolesterol och en eller flera saponiner utan adjuvanseffekt, som bärare för ad- ministration av en läkemedelsaktiv substans, vilken matris har en ringformig grundstruktur som kan bilda sfäriska nanopartiklar med en snäv storleksfördelning.

2. Användning enligt krav 1, kännetecknad av att den läkemedelsaktiva substansen är icke-antigen.

3. Användning enligt krav 1 eller 2, kännetecknad av att matrisen också omfattar en eller flera andra lipider, speciellt fosfolipider.

4. Användning enligt något av kraven 1-3, kännetecknad av att bärarpartiklarna har en storlek av 30-50 nm, speciellt omkring 40 nm.

5. Användning enligt något av kraven l-4, kännetecknad av att matrisen är uppbyggd av kolesterol och saponinen B4b eventu- ellt i kombination med saponinen B2, och dessutom omfattar en fosfolipid.

6. Användning enligt något av kraven 2-5, kännetecknad av att fosfolipiden utgöres av fosfatidyletanolamin eller fosfati- dylkolin.

7. Användning enligt något av kraven 2-6, kännatecknad av att matrisen dessutom innehåller en eller flera adjuvansaktiva saponiner.

8. Läkemedelsbärande partikel omfattande en immunologiskt inert strukturgivande matris av ett komplex av en sterol, såsom kolesterol och en eller flera saponiner utan adjuvanseffekt som bärare, vartill bundits en icke-antigen läkemedelsaktiv sub- stans, vilken partikel har en ringformig grundstruktur som kan bilda sfäriska nanopartiklar med en snäv storleksfördelning.

9. Läkemedelsbärande partikel enligt krav 8, kännetecknad av att bärarmatrisen också omfattar en eller flera andra lipi- der, speciellt fosfolipider.

10. Läkemedelsbärande partikel enligt krav 8 eller 9, kännetecknad av att de sfäriska partikeln har en storlek av 3o-so mn, speciellt 'omkring 40 nm.

11. ll. Läkemedelsbärande partikel enligt något av kraven 8-10, 23 _ 502 569 kännetecknad av att den läkemedelsaktiva substansen bundits till matrisen genom kovalenta eller hydrofoba bindningar.

12. Läkemedelsbärande partikel enligt något av kraven 8-ll, kännetecknad av att den läkemedelsaktiva substansen utgöres av CoQ10.

13. Farmaceutisk komposition omfattande läkemedelsbärande partiklar enligt något av kraven 7-ll i kombination med en farmakologiskt godtagbar vehikel.

14. Kit för framställning av en farmaceutisk komposition omfattande separata förpackningar av partiklar av en strukturgi- vande matris enligt något av kraven 1-7 eventuellt i kombination med en ytaktiv substans, en icke-antigen läkemedelsaktiv sub- stans för bindning til matrisen, samt en farmakologiskt godtag- bar vehikel.