TW201916875A - 用於鼻黏膜之奈米級乳液免疫載劑及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種奈米級乳液免疫載劑及其製備方法，其係由下列組成成份所組成：一含有H2O分子的一連續水相；含有油脂的一油相物質；以及用於穩定連續水相和油相界面之一乳化系統，且該乳化系統為乳化劑混合物，該免疫載劑之特徵在於，該乳化系統不含離子型乳化劑，且該乳液之粒徑大小係介於20奈米至200奈米之間。透過該奈米級乳液免疫載劑，其可有效避免離子型乳化劑對人體細胞帶來之毒性及可能的危害，同時提供能誘導高度免疫反應之疫苗製劑。

Description

用於鼻黏膜之奈米級乳液免疫載劑及其製備方法
本發明係關於一種免疫載劑及其製備方法，尤其是指一種奈米級乳液免疫載劑及其製備方法，伴隨抗原並經由鼻黏膜給予之後，能夠增強該抗原之免疫效價。
乳劑係一種於藥物劑型開發中相當廣泛使用的分散系統(dispersed system)類型，其目的係為了將不易溶解於水之固體藥物或與水不互溶之液體藥物能以細小液滴的形式分散於分散媒(medium)之中，以利進行藥物的遞送。乳劑主要是由內相(internal phase)及外相或連續相(external or continuous phase)所組成，且依據不同的內外相組成，而分類成不同的乳劑類型，包含水相溶液做為內相而油相溶液做為連續項之油包水(W/O)乳劑型、油相溶液做為內相而水相溶液做為連續項之水包油(O/W)乳劑型以及油相溶液包覆水相溶液後做為內相而水相溶液做為連續項之水包油包水(W/O/W)乳劑型。乳劑的給藥途徑相當多元，依據不同的材料及乳劑型選用，可廣泛應用於多種體外使用及體內使用之使用方法，包含皮下或肌肉使用之針劑、口服使用之乳劑、塗佈於皮膚之上，或用於黏膜給予之外用型乳劑。其中，用於黏膜給予之乳劑更是近年來乳劑開發的主要課題。
鼻腔與口腔具有大面積的黏膜組織，分布 有相當密集之微血管，相較於人體其他給藥途徑具有藥物難以穿透之生物屏障，透過黏膜組織密集分布之微血管進行給藥不僅可快速的吸收進人體血液系統加快藥物給藥後的起效時間，亦能避免藥物受到胃腸道的酵素降解作用或是藥物在肝門靜脈系統通過腸黏膜和肝臟時被代謝失活的影響，提高藥物的生物利用度，另一方面，由於黏膜組織有相當密集之微血管，因此它是生物體內免疫系統反應發生最多的部分，也是發生局部特異性免疫反應的主要部位，因此黏膜免疫在生物體的免疫系統中具有相當重要地位，是生物體抵抗病原體人侵的第一道屏障，因此，越來越多的免疫製劑，即是以黏膜組織做為主要之給予標的。
近年來，醫藥組成物經由黏膜組織進行給藥之發展日益漸進，一般而言，抗原對黏膜免疫系統有效的刺激是疫苗產生有效免疫的必要條件，然而，要對黏膜免疫系統進行有效刺激仍需要合適的黏膜免疫相關載體或佐劑，目前，已發現了數種具有黏膜免疫載體和佐劑活性的物質，例如說，使用離子型乳化劑所製備而成的小粒徑的乳劑即是一種很有發展潛力的非病毒基因載體，其能和去氧核醣核酸(DNA)、抗原、抗體、蛋白質或其他小分子，通過溶液混合的方式組裝形成粒徑同樣微小的複合物，這種小粒徑的複合物更容易通過細胞膜被細胞攝取，若加上其帶有的電荷特性，能與帶有負電荷的細胞膜相互吸引，使複合物更容易靠近細胞膜而被細胞攝取，並提供充足的藥物穩定性使成份在到達靶組織之前避免在體內遭受破壞。
而在乳劑應用於免疫載劑之用途時，需面臨到的一個問題是，乳劑當中用以平衡油水二相之乳化劑，是否能被人體所代謝吸收且不會對人體造成危害。 依現有製備技術所製備而成之免疫載劑，其多數都使用了離子型的乳化劑，其不僅會增加人體的代謝負擔，另一方面，抗原中的膜糖蛋白如長期與離子型乳化劑接觸，可能導致其發生變性作用，或可能導致溶血現象。
另一方面，目前在微小粒徑等級的非離子型乳劑製備上遭遇到相當程度之瓶頸。由於其親水基團的親水性較弱，需要藉由足夠數量的親水基才能使整個分子具有水溶性；此外，由於非離子型之乳化劑於溶液系統不會離子化，因此在分散系統中的親脂性基團或親水性基團大多帶有電荷的環境下，無法有效提供電荷相斥的效應以增強分散相液滴之排斥力，或是無法於分散相外圍形成吸附層，導致液滴之間的排斥力較一般離子型乳化劑來得低，容易有分散效果不彰的情況，其穩定溶液系統之能力與一般離子型之乳化劑相比較為不足。在現階段進行微小粒徑等級乳劑的製備主要仍係以水性液體及油性液體進行混合後進行均質化為主的情況下，藉由上述製備方法所獲得之乳劑，其粒徑等級約為微米等級至次微米等級，除了無法提供更為微小的微粒以外，整體分散系統之安定性在此一製備方法下亦較為不足。
因此，如何設計一種奈米級乳液免疫載劑及其製備方法，使該奈米級乳液能有效率地遞送至鼻黏膜內誘發免疫反應，且不會增加人體的代謝負擔，同時達到促進免疫效應及藥物輸送效率的目的，即成為相關領域中亟需解決之課題。
本發明之主要目的，係提供一種奈米級乳液免疫載劑，其不含離子型乳化劑而不對人體造成毒性， 並透過將抗原與該免疫載劑結合可提供一誘導高度免疫反應之疫苗製劑，進行鼻腔黏膜接種疫苗之劑型選擇。
本發明之又一目的，係提供一種奈米級乳液免疫載劑，藉由將腫瘤抗原與該免疫載劑混合後，可提供一抑制腫瘤生長之腫瘤疫苗製劑，做為一種癌症疫苗製劑之劑型選擇。
本發明之又一目的，係提供一種奈米級乳液免疫載劑及其製備方法，藉由此一方法，可有效且穩定的製備出內含高度均一性奈米脂質微粒之奈米級乳劑，且充分掌握所述奈米脂質微粒之粒徑大小(particle size)。
為了達到上述之目的，本發明揭示一種奈米級乳液免疫載劑，伴隨抗原並經由鼻黏膜給予之後，能夠增強該抗原之免疫效價，係由一含有H2O分子的連續水相、一含有油脂的油相物質及一用於穩定連續水相和油相界面且由乳化劑混合物所組成之乳化系統，其中，該乳化系統不含離子型乳化劑，且該乳液之粒徑大小係介於20奈米至200奈米之間。
於本發明之一實施例中，其亦揭露該奈米級乳液免疫載劑之組成成份係不含免疫刺激物質，包含類鐸受體(TLR)激動劑或短鏈抗菌胜肽，如CpG的寡脫氧核苷酸(TLR-9)、宿主防禦肽(TLR-4)、皂苷(TLR-2、TLR-4)、單磷酰脂質A(TLR-4)、鞭毛蛋白(TLR-5)。
於本發明之一實施例中，其亦揭露該乳化系統係不含陽離子型乳化劑，所述該陽離子型乳化劑係包含：鹵化十六烷基吡啶(cetylpyridinium halides)、氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)、鹵化十六烷基三甲基(cetyltrimethylammonium halides)、鹵化十六烷基二甲基乙銨(cetyldimethylethylammonium halides)、鹵化 十六烷基二甲基苄基氯化銨(cetyldimethylbenzylammonium halides)、鹵化十六烷基三丁基(cetyltributylphosphonium halides)、鹵化十二烷基三甲銨(dodecyltrimethylammonium halides)或十四烷基三甲基鹵化铵(tetradecyltrimethylammonium halides)。
於本發明之一實施例中，其亦揭露該連續水相為純水溶液、磷酸鹽水溶液、檸檬酸鹽水溶液碳酸鹽水溶液、重碳酸鹽水溶液、氯化鉀水溶液、氯化鈉水溶液葡萄糖水溶液或乳酸林格溶液。
於本發明之一實施例中，其亦揭露該油相係為一身體可代謝之油脂或脂肪酸。
於本發明之一實施例中，其亦揭露該身體可代謝之油脂係選自於動物油、植物油、天然油、合成油及半合成衍生物所組成之群組中之一者或其任意之組合。
於本發明之一實施例中，其亦揭露該油相溶液係進一步具有分散在該油相溶液或該油相溶液所形成之油殼內之至少一水相初乳微滴，形成一複合型乳劑。
於本發明之一實施例中，其亦揭露該組成成份包含有：含量大於重量百分比99%的連續水相；含量小於重量百分比1%的油相物質；以及含量介於重量百分比0.01%至重量百分比0.2%之乳化系統。
為了達到前述之目的，本發明亦揭示一種製備奈米等級乳液之方法，能夠增強該抗原之免疫效價，該方法包含下列步驟：取一乳化系統之組成乳化劑，並將其溶解於第一水相溶液中，以獲得第一水相混合物；取一乳化系統之組成乳化劑，並將其溶解於油相溶液中，以獲得油相混合物；將該第一水相混合物與油相混合物 摻混，以獲得油水混合物；將該油水混合物進行均質，形成一儲存溶液；將該儲存溶液以一第二水相溶液進行稀釋之後，形成一稀釋溶液；將該稀釋溶液以加壓之方式通過具有選定奈米孔徑之一薄膜，以獲得奈米等級之乳液。
於本發明之一實施例中，其亦揭露該加壓過薄膜之步驟，係將具有所選定奈米孔徑之該薄膜設置於一雙向加壓裝置之間，並將該雙向加壓裝置分成兩側，當該稀釋溶液自該雙向加壓裝置之一側以加壓之方式通過該薄膜至該雙向加壓裝置之另一側後，該稀釋溶液可再從該雙向加壓裝置之另一側加壓通過該薄膜至該雙向加壓裝置之原側。
於本發明之一實施例中，其亦揭露該該來回加壓過薄膜之步驟係重覆進行至少一次，直至該稀釋溶液中乳液粒子之粒徑大小與該薄膜之孔徑相符，且其粒徑分佈均勻為止。
於本發明之一實施例中，其亦揭露該於該加壓過薄膜之步驟之後，係將該薄膜更換為孔徑較小之另一薄膜，並重覆進行該加壓過薄膜之步驟。
於本發明之一實施例中，其亦揭露該該雙向加壓裝置係為製備微脂體所用之標準擠壓器。
本發明所提供之彩色圖式(第7圖)係為了明確表彰本發明所提供之技術內涵及發明精神所採之必要之主張，特此聲明。
第1圖：其係為本發明之一較佳實施例之奈米級乳液 之製備方法步驟流程圖；第2圖：其係為本發明之另一較佳實施例之奈米級乳液之製備方法步驟流程圖；第3圖：其係為本發明之另一較佳實施例之奈米級乳液之製備方法步驟流程圖；第4A圖及第4B圖：其係為本發明之一較佳實施例之奈米級PELC乳液(nanoPELC)及奈米級SLACL乳液(nanoSLACL)之粒徑分布示意圖；第5A圖至第5C圖：其係為本發明之一較佳實施例之奈米級乳液做為鼻腔給藥疫苗載體於鼻腔黏膜及全身性之B細胞免疫反應結果示意圖；第6A圖至第6F圖：其係為本發明之一較佳實施例之奈米級乳液做為鼻腔給藥疫苗載體之T細胞免疫反應結果示意圖，其包含細胞存活之結果、細胞激素分泌量及RNA表現量之結果；及第7圖：其係為本發明之一較佳實施例之奈米級乳液做為黑色素瘤疫苗之鼻腔給藥載體，其小鼠肺臟感染癌症情況之示意圖。
為使 貴審查委員對本發明之特徵及所達成之功效有更進一步之瞭解與認識，謹配合詳細之說明並佐以較佳之實施例，詳加說明如後：本說明書中使用的術語通常在此技術領域中、本發明的範圍內，以及特定的情境下有其既定的含義。以下說明及說明書其他地方使用之部分術語，可使施作者進一步瞭解本發明。本說明書中所討論之示例及使用之術語均係為例示之用，並非用以限制本發明或 示例用術語的範圍和含義。同樣地，本發明並不限於本說明書中所舉出的實施例。
除非另有定義，本文使用的技術和科學術語的含義為本發明所屬領域之普通技術人員所熟知。在含義有衝突的情況下，以本文件及其它界定的含義為準。
在此所稱之「乳化劑組合物」是指一種具有親水基之頭端和親油基之尾端結構之物質，當其一端親近於水相且一端親近於油相時，其可位於兩相之交界處，藉由降低表面之張力以穩定整體溶液相之物理化學性質。
在此所稱之「離子型乳化劑」是指一種分子溶於水後，會藉由解離產生正離子親水基團或負離子親水基團的一類乳化劑，並透過該些離子親水基團達到降低表面之張力以穩定整體溶液相之功效。
在此所稱之「非離子型乳化劑」是指一種分子溶於水後，不會產生解離的一類乳化劑，於此類乳化劑當中，達成降低表面之張力以穩定整體溶液相之功效的部分，並非離子態之官能基。
在此所稱之「可生物降解的」一般應指大分子聚合材料降解後分散在體內(這一定義排除了環境、真菌或細菌降解)。生物降解的聚合系統可能因受到生物分子的攻擊而使其大分子系統的完整性受到影響，分解出片段或其他降解之副產品。產生的片段可能離開作用位點但不一定在體內消失。
在此所稱之「生物可吸收的」一般應指聚合物本體降解並在體內進一步被吸收，亦即，聚合物因降解的副產物能經自然途徑代謝消除。生物再吸收因此反映了體外異物及副產品(低分子化合物)在沒有副作用的情形下的本體降解，進而完全消除的概念。
在此所稱之「生物活性劑係該包含一免疫刺激物，藉由誘導活化或增加的任何組組成物之活性，以刺激免疫系統的物質。
在本發明中，針對現有技術下多數乳液型免疫載劑多數都使用了離子型的乳化劑，增加人體的代謝負擔，且可能導致其發生其他不良反應的狀況，提供一種非離子型乳化劑的奈米級乳液免疫載劑，並針對其因為乳化劑為非離子型而導致穩定溶液系統之能力較一般離子型之乳化劑不足，而不易製備生成奈米級微粒乳劑的情況，提供一種新穎的製備方法，藉以提供一種具有高誘發免疫反應效率且對人體無不良影響之奈米級乳液免疫載劑。
因此，本發明提供一種奈米級乳液免疫載劑及其製備方法，其乳化系統不含離子型乳化劑，並藉由於外部添加壓力之方式將懸浮乳液通過具有奈米孔徑之一薄膜，使懸浮乳液內部之脂質微粒可隨薄膜之孔徑調整其粒徑大小，藉以克服一般以超音波震盪或均質機均質化處理時所具有之次微米等級限制，且能獲得較上述方法更為均一化之奈米脂質微粒，能有效提升奈米級乳劑之劑型品質及藥物輸送效率。
基於上述方針，以下針對本發明所提供之奈米級乳液免疫載劑中，所使用之材料、材料性質及其製備方式進行進一步之說明：本發明提供之一種奈米級乳液免疫載劑，係伴隨抗原並經由鼻黏膜給予之後，能夠增強該抗原之免疫效價，係由一含有H2O分子的連續水相、一含有油脂的油相物質及一用於穩定連續水相和油相界面且由乳化劑混合物所組成之乳化系統，其中，該乳化系統不含離子型乳化劑，且該乳液之粒徑大小係介於20奈米至 200奈米之間。
於一較佳之實施例當中，該奈米級乳液免疫載劑之成分組成比例係由含量大於重量百分比99%的連續水相；含量小於重量百分比1%的油相物質；以及含量介於重量百分比0.01%至重量百分比0.2%之乳化系統所組成。
其中，該連續水相係用於分散該內之可分散介質，所述之可分散介質包含具可溶性之化合物、油相物質或經由油相溶液所包埋之任何物質等。基於前述之原則，本發明所提供之該第一水相溶液可係為一純水溶液或一化合物水溶液，其中，於一較佳之實施例當中，該化合物水溶液之化合物可係為一磷酸鹽化合物、一檸檬酸鹽化合物、一(重)碳酸鹽化合物、一氯化鉀、一氯化鈉，或各式醫療用輸液如一葡萄糖水溶液、一乳酸林格溶液。
其中，該油相物質於該乳液系統當中係屬於一分散相，為一種醫藥可接受之油性物質，且為使該奈米級乳液免疫載劑得以在身體內順利進行藥理作用，於一較佳實施例當中，所述之該油相物質係為身體可代謝之油脂或脂肪酸。基於上述之原則，本發明所提供之該油相物質係選自於動物油、植物油、天然油、合成油及半合成衍生物所組成之群組中之一者或其任意之組合。
其中，該乳化系統係由乳化劑組合物所組成，該乳化劑(Emulsifying Agents)組合物係用以使互不相容的油水兩相彼此相互混溶，以協助溶液環境形成均勻的分散體或乳化體之物質，就其選擇上需與乳液當中的其他成分相容且不可影響乳劑中相關物質之安定性及有效性。於本發明所提供之奈米級乳液免疫載劑，由於該 乳化劑組合物係將油相物質穩定於該連續水相之中，因此一般而言需要較高之親水性，且該親水性乳化劑之親水-親脂平衡數值(Hydrophilic-lipophilic balance,HLB)係介於8至18之間。基於上述之原則，本發明所提供之該乳化劑可選自於聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂油酸衍生物、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物、聚氧丙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯(5EO)羊毛醇醚、失水山梨醇月桂酸酯、失水山梨醇月桂酸酯、聚氧乙烯脂肪酸、聚氧乙烯氧丙烯油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蠟衍生物、四乙二醇單月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯(4EO)失水山梨醇單硬脂酸酯、六乙二醇單硬脂酸酯、聚氧丙烯(5PO)羊毛醇醚、聚氧乙烯(5EO)失水山梨醇單油酸酯、混合脂肪酸和樹脂酸的聚氧乙烯酯類、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯(20EO)失水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯(20EO)失水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯氧丙烯油酸酯、聚氧乙烯羊毛脂衍生物、聚氧乙烯單油酸酯、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯單油酸酯、聚氧乙烯單油酸酯、聚氧乙烯單棕櫚酸酯、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯(10EO)油醇醚、聚氧乙烯單月桂酸酯、聚氧乙烯烷基酚、聚氧乙烯(10EO)乙醯化羊毛脂衍生物、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯單月桂酸酯、聚氧乙烯單月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯植物油、聚氧乙烯(4EO)失水山梨醇單月桂酸酯、混合脂肪酸和樹脂酸的聚氧乙烯酯類、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物、聚氧乙烯(24EO)膽固醇醚、聚氧丙烯(20PO)羊毛醇醚、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯、 聚氧乙烯(20EO)失水山梨醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯(20EO)油醇醚、聚氧乙烯(20EO)甲基葡萄糖苷倍半油酸酯、聚氧乙烯(16EO)羊毛醇醚、聚氧乙烯(25EO)羊毛醇醚、聚氧乙烯(9EO)乙醯化羊毛脂衍生物、聚氧乙烯(20EO)失水山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯單油酸酯、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯十八醇、聚氧乙烯油醇、聚氧乙烯脂肪醇、聚乙二醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯(20EO)失水山梨醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯十六烷基醇、聚氧乙烯氧丙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯單月桂酸酯、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯(20EO)失水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯單硬脂酸酯及油酸鈉、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚(乙二醇)-聚(丙交酯-ε-己內酯)團聯共聚物及聚乙二醇-聚乳酸團聯共聚物所組成之群組中之一者或其任意之組合。
另一方面，本發明所提供之該奈米級乳液免疫載劑與現有技術下之乳液免疫載劑之特徵差異在於，其係僅使用非離子型之乳化劑做為安定溶液系統之物質。藉由提供僅使用非離子型之乳化劑做為乳化系統之奈米級乳液免疫載劑，使其在遞送至生物體時，相較於其他離子型之乳化劑所帶有之生物毒性較低，雖然整體製備難度較高，但於藥物遞送使用中較為安全的一種乳化劑選擇。
於本發明所提供之一較佳實施例中，該乳化系統係不含陽離子型乳化劑，而所述該陽離子型乳化劑係包含：鹵化十六烷基吡啶(cetylpyridinium halides)、氯 化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)、鹵化十六烷基三甲基(cetyltrimethylammonium halides)、鹵化十六烷基二甲基乙銨(cetyldimethylethylammonium halides)、鹵化十六烷基二甲基苄基氯化銨(cetyldimethylbenzylammonium halides)、鹵化十六烷基三丁基(cetyltributylphosphonium halides)、鹵化十二烷基三甲銨(dodecyltrimethylammonium halides)或十四烷基三甲基鹵化铵(tetradecyltrimethylammonium halides)。
一般而言，該非離子型之乳化劑之pH值係為3至10，溶於水或有機溶劑中時，呈現中性的分子或膠束(Micelle)狀態，因此在酸性、鹼性及電解質的溶液中狀態較為穩定而不致生成沉澱物；基於上述原則，該非離子型之乳化劑可係為聚氧乙烯類物質或多元醇類物質。於一較佳實施例當中，該非離子型之乳化劑可選自於聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚(乙二醇)-聚(丙交酯-ε-己內酯)團聯共聚物、聚乙二醇-聚乳酸團聯共聚物、甘露醇酐脂肪酸酯、山梨醇酐脂肪酸酯、山梨醇酐-聚(丙交酯-ε-己內酯)團聯共聚物、聚乙二醇-聚乳酸團聯共聚物、椰子油還原醇、十六醇、油醇、甘油、季戊四醇、壬基酚、辛基酚、辛基甲酚、山梨醇、乙醇胺、異丙醇胺、蔗糖、月桂酸、椰子油脂肪酸、十四酸、棕櫚酸、油酸及硬脂酸所組成之群組中之一者或其任意之組合。
而在本發明提供之該奈米級乳液免疫載劑當中，為了讓乳液免疫載劑在鼻腔進行高效率的給藥，乳液當中微粒(particle)的粒徑大小(particle size)即成為相當重要的關鍵，乳液系統內的奈米級微粒(particle)能在分布有密集微血管之鼻腔進行快速之給藥，以加快藥 物給藥後的起效時間，同時，小粒徑的乳液與去氧核醣核酸(DNA)、抗原、抗體、蛋白質或其他小分子組裝形成粒徑同樣微小的複合物時，將更容易通過細胞膜被細胞攝取，加上其帶有的電荷特性，能與帶有負電荷的細胞膜相互吸引，使複合物更容易靠近細胞膜而被細胞攝取，並提供充足的藥物穩定性使成份在到達靶組織之前避免在體內遭受破壞；基於前述之原由，本發明提供之該奈米級乳液免疫載劑之微粒(particle)之粒徑大小(particle size)係介於20奈米至200奈米之間。
進一步而言，於本發明之一較佳實施例當中，本發明所提供之該奈米級乳液免疫載劑具有高給藥效率，其容易通過細胞膜被細胞攝取，並提供充足的藥物穩定性使抗原在到達靶組織之前避免在體內遭受破壞；因此，本發明所提供之該奈米級乳液免疫載劑無須搭配其他生物活性劑使用，其中該生物活性劑係包含一免疫刺激物，藉由誘導活化或增加的任何組組成物之活性，以刺激免疫系統的物質(藥物和營養物)，舉例而言，本發明所提供之該奈米級乳液免疫載劑所不具有之該些免疫刺激劑種類係包含但不限於：類鐸受體(TLR)激動劑或短鏈抗菌胜肽，如CpG的寡脫氧核苷酸(TLR-9)、皂苷(TLR-2、TLR-4)、單磷酰脂質A(TLR-4)、鞭毛蛋白(TLR-5)以及抗菌胜肽(TLR-4)。
另一方面，於本發明之一較佳實施例當中，所述之該油相物質，其進一步可具有分散在該連續水相或該連續水相所形成之油殼內之至少一水相初乳微滴，形成一複合型乳劑，其中，該溶液環境系統內需包含一穩定結合介於水相和油相的親脂性乳化劑，使該水相初乳微滴能穩定地存在於該連續水相或其所形成之油殼當 中，該親脂性乳化劑之親水-親脂平衡數值(Hydrophilic-lipophilic balance,HLB)係介於1至7之間，較佳係為3至6。基於前述之原則，於本發明一較佳實施例中，該親脂性乳化劑係選自於甘露醇酐脂肪酸酯、山梨醇酐脂肪酸酯、山梨醇酐-聚(丙交酯-ε-己內酯)團聯共聚物及聚乙二醇-聚乳酸團聯共聚物所組成之群組中之一者或其任意之組合；透過此一設計，該具有水相初乳微滴之乳劑可更為精準地控制乳劑搭載成分之釋放，另一方面，當該乳劑作為疫苗之載體時，可增強病患身體對免疫原反應、及/或有效誘發抗原或抗原呈現細胞之活化。
以下，針對本發明所提供之奈米級乳液免疫載劑的製備方法中，所使用之材料、材料性質及其製備方式進行進一步之說明：請參閱本發明之發明圖式第1圖，其係為本發明之一實施例之奈米級乳液免疫載劑的製備方法之方法流程圖，如圖所示，該奈米級乳液免疫載劑的製備方法其步驟如下：步驟S11：取一乳化系統之一組成乳化劑溶解於一第一水相溶液中，以獲得一第一水相混合物；步驟S13：取該組成乳化劑溶解於一油相物質中，以獲得一油相混合物；步驟S15：將該第一水相混合物與該油相混合物摻混並進行均質，形成一儲存溶液；步驟S17：將該儲存溶液以一第二水相溶液進行稀釋之後，形成一稀釋溶液；步驟S18：一加壓過薄膜之步驟，係將該稀釋溶液以 加壓之方式通過具有選定奈米孔徑之一薄膜，以獲得該奈米級乳液免疫載劑。
如圖示S11之步驟，本發明於一較佳實施例中所提供之奈米級乳劑的製備方法，係先將一乳化劑於一第一水相溶液當中進行溶解，以獲得一第一水相混合物。
其中，該第一水相溶液係為整體奈米級乳劑當中之連續水相，用於分散該連續水相系統內之可分散介質；該乳化劑(Emulsifying Agents)係用以使互不相容的油水兩相彼此相互混溶，以協助溶液環境形成均勻的分散體或乳化體之物質；該乳化劑及該第一水相溶液之定義與特性已於前述之奈米級乳液免疫載劑組成中進行描述，於此不再贅述。
另一方面，本發明所提供之奈米級乳液免疫載劑製備方法，其係僅使用非離子型之乳化劑做為安定溶液系統之物質，其在遞送至生物體中時，相較於其他離子型之乳化劑所帶有之生物毒性-較低，因此屬於一操作難度較高但於藥物遞送使用中較為安全的一種乳化劑選擇。該非離子型乳化劑之定義與特性已於前述之奈米級乳液免疫載劑組成中進行描述，於此不再贅述。
如圖示S13及S15之步驟，其進一步於步驟S11之該第一水相混合物中添加一油相物質，使該第一水相混合物與該油相物質混合形成一油相混合物，而為了使油相物質能均勻的分布於該奈米級乳劑系統當中，於此一實施例之製備的步驟中，進一步對該混合溶液提供一外部應力，配合水相溶液當中所具有的該乳化劑可降低油相與水相之間的表面張力之功效，使油相物質在受外部應力打散的情況下即受到該乳化劑及該水相溶液 之包覆，進而讓該油相物質穩定的分布於整體乳劑環境當中，而當外部應力提供的強度越強時，則油相溶液將會隨之分散成越小之單元被水相溶液所包覆，且會更均勻的分散在該奈米級乳液免疫載劑當中，形成高度均質化及均一化的儲存溶液。
其中，該油相物質係為一種醫藥可接受之油性物質，且為使該奈米級乳液免疫載劑得以在身體內順利進行藥理作用，另一方面，於本發明之一較佳實施例當中，所述之該油相物質，其進一步可具有分散在該連續水相或該連續水相所形成之油殼內之至少一水相初乳微滴，形成一複合型乳劑；其中，該油相物質及該複合型乳劑之定義與特性已於前述之奈米級乳液免疫載劑組成中進行描述，於此不再贅述。
當在溶液系統中提供油相物質或具有至少一水相初乳微滴之油殼之後，即針對該溶液系統進行一均質之步驟，該均質步驟如同前述，係為提供一外部應力於該混合溶液之中使該混合溶液內之該油相連續水相均勻分布於該連續水相溶液之步驟，舉例而言，該所述均質步驟可藉由轉子於溶液環境中高速平穩的旋轉，形成高頻、強烈的圓周剪切運動，並透過定子(stator)的作用於狹窄的間隙中形成強烈、往複的液力剪切、摩擦、離心擠壓、液體流動碰撞等綜合效應，使該油相物質細碎化而呈現安定的油滴狀態；亦或是，對整體溶液施以超音波震盪之外力，利用超音波頻率高、波長短之特性，在整體乳劑環境中快速形成許多真空氣泡並迅速破裂，產生產生強而有力的剪切作用力，使該油相物質逐漸形成油滴之狀態，以達到整體乳劑環境中水相及油相彼此 之間均勻安定存在的目的。基於前述之目的，本發明所提供之一較佳實施例，其均質化之步驟係包含超音波震盪、轉子定子均質化或擠壓式均質化。
另一方面，為簡化其操作步驟，本發明一較佳實施例當中，其係可將步驟S11、S13及S15之該第一水相溶液、該乳化劑及該油相物質係同時加入至溶液環境進行混合後，直接進行均質以形成該儲存溶液，當所選用之該第一水相溶液、該乳化劑及該油相物質彼此性質配合時，該混合溶液之混合順序可不必依循步驟S11至步驟S15進行，當該些必要成分直接混合並進行均質後，其亦可自然的形成連續水相包覆微小油相物質之型態，與分批依序加入之操作步驟獲得同樣之該儲存溶液。
接著，無論該儲存溶液之形成步驟為何，於本發明一較佳實施例當中，如第2圖所示，更可進一步包含一步驟S16，其係於該儲存溶液製備完成之後，與一抗原溶液進行混合，形成一抗原儲存溶液。其中，該抗原溶液可係為疏水性質或親水性質，依照該抗原溶液所選用之抗原不同，可誘發體內不同免疫反應，而該抗原溶液內之抗原係藉由本身所具有之親和性吸附於該儲存溶液內之連續水相或油相物質，形成該抗原儲存溶液，以藉由該乳劑作為載體遞送至目標生物體當中。
承續上段所述，所述之該抗原溶液除了包含抗原之外，不包含任何免疫刺激物，所述之免疫刺激物係藉由誘導活化或增加的任何組成物之活性，以刺激免疫系統的物質(藥物和營養物)；基於前述之原則，本發明所提供之該免疫刺激劑包含但不限於：類鐸受體(TLR) 激動劑或短鏈抗菌胜肽，如CpG的寡脫氧核苷酸(TLR-9)和宿主防禦肽(TLR-4)、皂苷(TLR-2、TLR-4)、單磷酰脂質A(TLR-4)、鞭毛蛋白(TLR-5)以及抗菌胜肽。
如圖示S17之步驟，本發明於一較佳實施例中所提供之該奈米級乳液免疫載劑的製備方法，係將該儲存溶液進行稀釋，透過將該儲存溶液稀釋之過程，降低微乳顆粒於乳劑當中之密度，避免過度密集之微乳顆粒同時通過薄膜孔徑，造成薄膜孔徑之堵塞，另一方面，透過稀釋該儲存溶液，能有效降低該儲存溶液通過薄膜時之壓力，避免該薄膜因擠壓之壓力過大而導致破裂，而失去微小均一化微乳顆粒之功效。
如圖示S18之步驟，本發明於一較佳實施例中所提供之該奈米級乳液免疫載劑的製備方法，係將前一步驟獲得之該稀釋溶液藉由施加外部壓力，而通過具有目標奈米孔徑之一薄膜，使該稀釋溶液內部已於前述均質化步驟而細碎微小化之油滴狀油相物質可在通過該薄膜所具有之奈米孔洞時，將油滴之粒徑尺寸從微米或次微米之等級受奈米孔洞固定形體之限制，向下調整成該奈米孔洞之粒徑大小，藉以確保乳劑內部油滴之粒徑尺寸係為奈米等級，以完成該奈米級乳液免疫載劑之製備。
其中，於一較佳之實施例當中，該加壓過薄膜之步驟，係進一步將具有目標奈米孔徑之該薄膜設置於一雙向加壓的裝置之間，且該雙向加壓裝置之兩側皆各具有一容置空間以放置該稀釋溶液，當該稀釋溶液自該雙向加壓裝置之一側透過外部加壓之方式通過該薄膜至該雙向加壓裝置之另一側後，該稀釋溶液可再從該雙 向加壓裝置之另一側加壓通過該薄膜至該雙向加壓裝置之原側。藉由此一方式，該稀釋溶液得以在消耗較少乳劑體積的情況下完成該通過薄膜之步驟，且減少操作器具更換之繁複步驟，得以花費更少的時間及更具效率之方式完成該奈米級乳液免疫載劑之製備。
承續上段所述，於本發明另一較佳之實施例當中，該雙向加壓裝置係為製備微脂體所用之一標準擠壓器，其係包含位於中央之一薄膜支撐裝置，及連接於該薄膜支撐裝置左右兩側之二中空管柱，該些中空管柱具有一內部容置空間可用以容置該稀釋溶液，且各自具有與該中空管柱內壁密合之一推桿，當該些推桿向該薄膜支撐裝置之方向進行推擠時，能使該稀釋溶液通過該薄膜支撐裝置至另一側中空管柱之該內部容置空間，再經由另一側中空管柱之該推桿擠壓而回到原來的中空管柱之該內部容置空間，其中，該薄膜支撐裝置係具有一擠壓器外套管、至少一薄膜支撐器、一薄膜、一軸承及一緊固螺母，該些元件皆具有一內部空腔並連通於兩側中空管柱之該內部容置空間，使該稀釋溶液能順利通過薄膜進行微乳顆粒之微小均一化。
另一方面，於本發明另一較佳之實施例當中，該來回加壓過薄膜之步驟可重覆進行至少一次，直至該稀釋溶液中之微乳顆粒之粒徑大小與該薄膜之孔徑相符，且微乳顆粒之粒子之分佈均勻為止。透過此一步驟所獲得之該奈米級乳液免疫載劑，由於微乳顆粒之粒徑大小分布較一般僅透過擠壓或均質化之微米級乳劑更為均勻，因此在做為藥物遞送之載體時，能更為平均的散佈於給藥之區段，以提升給藥之效率，特別是當應用於以鼻腔 作為給藥途徑之載體時，其可更為均勻的散佈於鼻腔中的微血管群，達到更佳的給藥效率，而當作為經由鼻腔進行給藥之疫苗載體時，經由反覆步驟所獲得之奈米化微乳顆粒，其油相物質能更能提供較佳之生物活性，觸發更強的免疫刺激反應，進而有效提升疫苗的效力。
承續上段所述，該來回加壓過薄膜之步驟除了可重覆進行複數次之外，如第3圖所示，更可進一步包含一步驟S19，其係於該加壓過薄膜之步驟之後，將該薄膜更換為孔徑較小之另一薄膜，並重覆進行該加壓過薄膜之步驟。
其中，於此一步驟中更換的薄膜孔徑尺寸可以不只一種，可依薄膜孔徑之降冪排列依序進行薄膜之更換及擠壓過膜，此一操作步驟之優點，係可避免乳劑中之微乳顆粒過大因薄膜孔徑過小而無法順利通過薄膜，甚至造成薄膜孔徑堵塞的情況發生；同時，透過此一步驟，可在微乳顆粒均一的微小化至較小的粒徑尺寸後，再進行下一個等級的均一微小化，在循序的微小化過程中能確保微乳顆粒的均一性，而不會發生部分微乳顆粒通過薄膜而部分未通過時，所導致的粒徑分布範圍過大的情況，如此將導致該奈米級乳液免疫載劑作為載體進行藥物遞送時之效率下降，影響藥劑的有效性及其分佈情況。
以下，以具體實施之範例作為此發明之組織技術內容、特徵及成果之闡述之用，並可據以實施，但本發明之保護範圍並不以此為限。
實施例1
奈米級PELC乳液(nanoPELC)及奈米級SLACL乳液(nanoSLACL)之製備
首先先進行聚乙二醇化聚脂(PEGylated-polyester)共聚物的製備，其係由丙交酯和ε-己內酯的開環聚合而合成，使用SnOct2作為催化劑和MePEG5000作為引發劑。簡言之，將預定量之MePEG5000(2.1克)、丙交酯(0.58克)和ε-己內酯(0.47克)置於聚合安瓿，將該混合物脫氣並在真空下密封後，在140℃、真空下進行24小時聚合作用。該共聚物溶於丙酮後倒入乙醇中，收集沉澱的聚合物，經過濾及真空乾燥，得到純產物。
另一方面，另一種乳化劑-山梨醇酐-聚脂(sorbitan-polyester)軛合物之製備係分成兩階段，首先，加入預定量的山梨醇到燒瓶中，簡單地在磷酸環境中，使用ROTAVAPOR® R-210真空旋轉蒸發儀(瑞士Buchi Labortechnik公司產品)，經180℃蒸餾2小時以去除山梨醇中的水，即可製備山梨醇酐。在第二階段中，在山梨醇酐(3.48克)與SnOct2(155μL)環境中，將DL-丙交酯(13.92克)與ε-己內酯(13.92克)在140℃下加熱24小時開環聚合合成山梨醇酐-聚脂軛合物。所得山梨醇酐-(DL-丙交酯-ε-己內酯)共聚物之軛合物(山梨醇酐-PLACL1：4：4)溶解於100mL二氯甲烷中，再以50mL蒸餾水洗滌該溶液，有機相的溶劑將被減壓蒸發一部分以獲得聚合物。
為製備獲得PELC乳劑及SLACL乳劑，本實施例係將聚乙二醇-聚脂共聚物(PEG-b-PLACL)之乳化劑120毫克(mg)溶解於0.8毫升(mL)之磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中，以獲得水相混合溶液，接著將該水相混合溶液與1.1毫升(mL)內含角鯊烯(squalene)及Span®85 之油相物質進行滲混，獲得一油水混合物，最後均質化該油水混合物，以得到微米等級之PELC乳劑；另一方面，將該含山梨醇酐-聚脂軛合物(sobitan-PLACL)及聚乙二醇-聚脂共聚物(PEG-b-PLACL)之乳化劑溶解於磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中，以獲得水相混合溶液，接著將該水相混合溶液與角鯊烯(squalene)進行滲混，獲得一油水混合物，最後均質化該油水混合物，以得到微米等級之SLACL乳劑。
接著將該微米等級之PELC乳劑及SLACL乳劑以磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)稀釋一千倍之後，置入製備微脂體所用之標準擠壓器，進行加壓過膜之步驟，所選用之薄膜孔徑大小依序為1000奈米(nm)、400奈米(nm)、200奈米(nm)及100奈米(nm)，該些微米等級之PELC乳劑及SLACL乳劑依序擠壓通過上述奈米孔徑之薄膜，當該稀釋溶液自該雙向加壓裝置之一側以加壓之方式通過該薄膜至該雙向加壓裝置之另一側後，該稀釋溶液再從該雙向加壓裝置之另一側加壓通過該薄膜至該雙向加壓裝置之原側，並來回11次，以完成奈米級PELC乳劑(nanoPELC)及奈米級SLACL乳劑(nanoSLACL)之製備，並將製備完成之乳液以粒徑分析儀(particle sizer)觀察乳液之粒徑分布。
其結果如第4A圖及第4B圖所示，可觀察到奈米級PELC乳劑(nanoPELC)之粒徑尺寸皆分布於100奈米以下(第5A圖)，而未奈米化之PELC乳劑則多數分布於200奈米至300奈米之間(第5B圖)；另一方面，奈米級SLACL乳劑(nanoSLACL)之粒徑尺寸皆分布於100奈米至200奈米，而未奈米化之SLACL乳劑，則多 數分布於450奈米至1000奈米之間，由此可知，經由奈米化製程之PELC乳劑(nanoPELC)及SLACL乳劑(nanoSLACL)其粒徑尺寸皆有效之微小化，且符合奈米等級之定義。
實施例2
以奈米級乳液免疫載劑做為鼻腔給予疫苗載體之B細胞免疫反應結果
取六週齡大之BALB/c母鼠分成六組(N=6)進行實驗，以每周一次的頻率，將卵清蛋白(ovalbumin,OVA)以五種劑型由鼻腔內給予的方式進行遞送，劑型包含直接遞送OVA(100ug/劑，20uL)、OVA以10%的微米等級PELC乳液進行包覆遞送、OVA以10%奈米級的PELC乳液、OVA以10%的微米等級SLACL乳液及OVA以10%奈米級的SLACL乳液進行包覆遞送，並同時提供硝酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline,PBS)之組別做為控制組，進行為期三週的免疫接種，接著在完成給藥一週後，將小鼠犧牲並取其血清、鼻腔清洗液(nasal washes)，利用酵素免疫分析法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent AssayELISA)進行該些檢體中卵清蛋白特異性(OVA-specific)IgG、IgE及IgA的濃度檢測，觀察小鼠B細胞免疫反應受模擬抗原刺激後的的情況。
首先，小鼠血清及鼻腔清洗液中的卵清蛋白特異性(OVA-specific)IgG、IgE及IgA的濃度檢測結果，如第5A圖至第5C圖所示，可以發現其經由奈米級的PELC乳液(OVA/nanoPELC)及奈米級的SLACL乳液(OVA/nanoSLACL)搭載的卵清蛋白進行疫苗免疫的小鼠組別，其血清中卵清蛋白特異性的IgG及IgA含量，以 及鼻腔黏膜中卵清蛋白特異性的IgA含量都較PBS的控制組來得高，顯見該些乳液能確實的將卵清蛋白進行遞送，另外，經由奈米級的PELC乳液(OVA/nanoPELC)進行卵清蛋白遞送的組別，又明顯較單純進行卵清蛋白遞送的組別(OVA alone)遞送效率更佳；另一方面，在血清中的OVA-IgG及鼻腔黏膜中的IgA小鼠組別中，PELC乳液及SLACL乳液經由奈米化後，其遞送效率都較微米等級PELC乳液及SLACL乳液來得高，顯見以奈米化之乳液進行鼻腔給藥的確能增加藥物遞送之效率，綜合上述之實驗結果，可以觀察到經由鼻腔進行添加奈米化乳液之模擬抗原，能有效的誘發黏膜部位及全身性之抗原專一性免疫反應，其效果顯著優於未添加佐劑以及添加次微米等及乳劑之疫苗抗原。
實施例3
以該奈米級乳液免疫載劑做為鼻腔給予疫苗載體之T細胞免疫反應結果
取六週齡大之BALB/c母鼠分成六組(N=6)進行實驗，以每周一次的頻率，將卵清蛋白(ovalbumin,OVA)以五種劑型由鼻腔內給藥的方式進行遞送，劑型包含直接遞送OVA(100ug/劑，20uL)、OVA以10%的微米等級PELC乳液進行包覆遞送、OVA以10%奈米級的PELC乳液、OVA以10%的微米等級SLACL乳液及OVA以10%奈米級的SLACL乳液進行包覆遞送，並同時提供硝酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline,PBS)之組別做為控制組，進行為期三週的給藥，接著在完成給藥一週後，將小鼠犧牲並取其脾臟並置備成細胞懸浮液，進行anti-CD4、anti-CD8及anti-CD107抗體染色以 觀察其細胞毒性T細胞(cytotoxic lymphocytes,CTLs)的活性反應，另外，透過細胞存活性試驗(MTT assay)來觀察測試添加於奈米化乳液的模擬抗原，其抗原的激活指數(Antigen-stimulation Index)，以及透過細胞的萃取獲得其免疫相關RNA及細胞激素(Cytokine)的表現量，透過上述之方法觀察受疫苗注射之小鼠體內T細胞免疫反應相關的概況。
實驗結果如第6A圖至第6F圖所示，首先在細胞存活性試驗當中，經由奈米級的PELC乳液(OVA/nanoPELC)及奈米級的SLACL乳液(OVA/nanoSLACL)搭載的卵清蛋白進行疫苗免疫的小鼠組別，其胰臟細胞的抗原激活指數(Antigen-stimulation Index)皆較其他的實驗組別來的高(如第7A圖所示)，而在細胞毒性T細胞的活性反應中，更可明顯的觀察到上述現象，藉由觀察脾細胞表面呈現之標記(Surface marker)CD 8及去顆粒作用(degranulation)標記CD107a可以發現，經由奈米級的PELC乳液(OVA/nanoPELC)及奈米級的SLACL乳液(OVA/nanoSLACL)搭載的卵清蛋白能較一般的遞送載體刺激更多的T細胞反應(如第7B圖所示)，以刺激活化更多的細胞毒性T細胞，且該些細胞毒性T細胞之活化亦連帶使著細胞激素(Cytokine)的分泌量增加(如第7C圖及第7D圖所示)，同時可明確觀察到其係藉由分泌介白素-17(Interleukin-17)及干擾素-γ(interferon-γ)以產生對應之免疫反應；另一方面，觀察T細胞免疫反應相關細胞的RNA表現，亦可發現到在與干擾素-γ及抗原特異性T細胞活化有關之T-bet RNA，以及與CD 8細胞免疫反應相關之RORγt RNA，在受奈 米級的PELC乳液(OVA/nanoPELC)及奈米級的SLACL乳液(OVA/nanoSLACL)搭載的卵清蛋白的刺激上，亦表現出較高的RNA表現量(如第7E圖及第7F圖所示)，進而證明奈米級的PELC乳液及奈米級的SLACL乳液在做為鼻腔給予疫苗載體時，對於T細胞免疫反應所產生之調節效果。
實施例4
以該奈米級乳液免疫載劑做為黑色素瘤疫苗之鼻腔給予載體之免疫效果
取六週齡大之C57BL/6母鼠分成四組(N=6)進行實驗，透過血管內接種(intravascularly inoculated)之方式將B16-F10/OVA黑色素瘤細胞株(每隻小鼠5 x 105個細胞)植入小鼠體內，飼養一個禮拜。接著以每周一次的頻率，將OVA疫苗以三種劑型由鼻腔內給予的方式進行遞送，劑型包含直接遞送OVA(100ug/劑)、OVA以0.1%的微米等級PELC乳液進行包覆遞送及OVA以0.1%奈米級的PELC乳液進行包覆遞送，並同時提供PBS之組別做為控制組，進行為期三週的免疫接種，接著在完成給藥一週後，將小鼠犧牲並將其肺臟取出進行病理觀察。
實驗結果如第7圖所示，其中僅給予PBS的組別其病理觀察之肺部顏色最黑，表示其被黑色素瘤細胞株感染的最為嚴重，其次是僅給予OVA之實驗組，其被黑色素瘤感染的區塊不若PBS組嚴重，但仍具有一定的面積，接著是OVA以0.1%微米等級的PELC乳劑進行包覆遞送之實驗組，其仍具有部分的黑色素瘤感染區域，但面積較直接給予OVA之組別來的小，顯見乳液劑型藉由鼻腔黏膜途徑進行給藥之效果，最後是OVA以 0.1%奈米級的PELC乳液進行包覆遞送，如圖所示，該組之小鼠肺臟幾乎沒有被黑色素瘤細胞株感染的區域，證明同樣是以乳液進行鼻腔黏膜途徑進行免疫接種，奈米級的乳液其效用又較一般的乳液更為顯著，證明所提供的乳液劑型不僅確實為奈米等級，且其用以作為癌症疫苗之效果的確較其他劑型進行免疫接種時來得顯著。
綜上所述，本發明確實藉由有效之操作步驟提供一種奈米級乳液免疫載劑，其不僅較既有之乳液提供粒徑尺寸更小的微乳顆粒，更能有效地將該些微乳顆粒的尺寸均一化而不至於有大小不一之情況，藉由提供此種微乳顆粒粒徑尺寸(particle size)更小且更為均一之乳液，能有效提升乳劑之分散能力，尤其是此種奈米級乳液免疫載劑用於鼻腔遞送之給藥系統時，更能有效的散佈於鼻腔密集的微血管群之中，有效的提升給藥效率；另一方面，此種奈米級乳液免疫載劑亦可加入抗原或其他免疫反應之刺激物作為疫苗之載體，同樣藉由鼻腔作為疫苗遞送之途徑，透過動物實驗觀察到以該奈米級乳液免疫載劑作為載體之疫苗能有效的誘發與抗原對應之B細胞及T細胞免疫系統反應，亦可有效的作為癌症疫苗之載體而有效減緩癌症的發生；最後，透過次微米化及奈米化之乳液作為疫苗載體之效用比較，能發現奈米化之乳劑其油相物質能表現出其在次微米等級實難以達到之免疫刺激狀態，生物活性皆能有效提升。因此，本發明所提供之該奈米級乳液免疫載劑及其製備方法，確實提供一種微乳顆粒粒徑尺寸(particle size)更小且更為均一之乳劑之一奈米級乳液免疫載劑，提供一種具有高誘發免疫反應效率且對人體無不良影響之免疫載劑。
惟以上所述者，僅為本創作之較佳實施例而 已，並非用來限定本創作實施之範圍，舉凡依本創作申請專利範圍所述之形狀、構造、特徵及精神所為之均等變化與修飾，均應包括於本創作之申請專利範圍內。

Claims (15)

  1. 一種奈米級乳液免疫載劑，伴隨抗原並經由鼻黏膜給予之後，能夠增強該抗原之免疫效價，係由下列組成成份所組成：含有H 2O分子之一連續水相；含有油脂的一油相物質；以及用於穩定該連續水相和該油相物質界面之一乳化系統，該乳化系統係包含至少一乳化劑，其特徵在於，該乳化系統不含一離子型乳化劑；其中，該乳液免疫載劑中的微粒之粒徑大小係介於20奈米至200奈米之間。
  2. 如申請專利範圍第1項之奈米級乳液免疫載劑，其組成成份包含有：含量大於重量百分比99%的該連續水相；含量小於重量百分比1%的該油相物質；以及含量介於重量百分比0.01%至重量百分比0.2%之該乳化系統。
  3. 如申請專利範圍第1項之奈米級乳液免疫載劑，係不含一免疫刺激物質，所述該免疫刺激物質係包含一類鐸受體(TLR)激動劑或一短鏈抗菌胜肽。
  4. 如申請專利範圍第3項之奈米級乳液免疫載劑，其中該類鐸受體(TLR)激動劑係為CpG的寡脫氧核苷酸(TLR-9)、皂苷(TLR-2、TLR-4)、單磷酰脂質A(TLR-4)或鞭毛蛋白(TLR-5)。
  5. 如申請專利範圍第1項之奈米級乳液免疫載劑，該乳化系統係不含一陽離子型乳化劑，其中所述之該陽離子型乳化劑係為鹵化十六烷基吡啶、氯化十六烷基吡 啶、鹵化十六烷基三甲基、鹵化十六烷基二甲基乙銨、鹵化十六烷基二甲基苄基氯化銨、鹵化十六烷基三丁基、鹵化十二烷基三甲銨或十四烷基三甲基鹵化铵。
  6. 如申請專利範圍第1項之奈米級乳液免疫載劑，其中該至少一乳化劑係選自於聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂油酸衍生物、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物、聚氧丙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯(5EO)羊毛醇醚、失水山梨醇月桂酸酯、失水山梨醇月桂酸酯、聚氧乙烯脂肪酸、聚氧乙烯氧丙烯油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蠟衍生物、四乙二醇單月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯(4EO)失水山梨醇單硬脂酸酯、六乙二醇單硬脂酸酯、聚氧丙烯(5PO)羊毛醇醚、聚氧乙烯(5EO)失水山梨醇單油酸酯、混合脂肪酸和樹脂酸的聚氧乙烯酯類、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯(20EO)失水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯(20EO)失水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯氧丙烯油酸酯、聚氧乙烯羊毛脂衍生物、聚氧乙烯單油酸酯、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯單油酸酯、聚氧乙烯單油酸酯、聚氧乙烯單棕櫚酸酯、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯(10EO)油醇醚、聚氧乙烯單月桂酸酯、聚氧乙烯烷基酚、聚氧乙烯(10EO)乙醯化羊毛脂衍生物、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯單月桂酸酯、聚氧乙烯單月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯植物油、聚氧乙烯(4EO)失水山梨醇單月桂酸酯、混合脂肪酸和樹脂酸的聚氧乙烯酯類、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物、聚氧乙烯(24EO) 膽固醇醚、聚氧丙烯(20PO)羊毛醇醚、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯(20EO)失水山梨醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯(20EO)油醇醚、聚氧乙烯(20EO)甲基葡萄糖苷倍半油酸酯、聚氧乙烯(16EO)羊毛醇醚、聚氧乙烯(25EO)羊毛醇醚、聚氧乙烯(9EO)乙醯化羊毛脂衍生物、聚氧乙烯(20EO)失水山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯單油酸酯、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯十八醇、聚氧乙烯油醇、聚氧乙烯脂肪醇、聚乙二醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯(20EO)失水山梨醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯十六烷基醇、聚氧乙烯氧丙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯單月桂酸酯、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯(20EO)失水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯單硬脂酸酯及油酸鈉、甘露醇酐脂肪酸酯、山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚(乙二醇)-聚(丙交酯-ε-己內酯)團聯共聚物及聚乙二醇-聚乳酸團聯共聚物所組成之群組中之一者或其任意之組合。
  7. 如申請專利範圍第1項之奈米級乳液免疫載劑，其中該連續水相係為純水溶液、磷酸鹽水溶液、檸檬酸鹽水溶液、碳酸鹽水溶液、重碳酸鹽水溶液、氯化鉀水溶液、氯化鈉水溶液、葡萄糖水溶液或乳酸林格溶液。
  8. 如申請專利範圍第1項之奈米級乳液免疫載劑，其中該油相物質係為一身體可代謝之油脂或一脂肪酸。
  9. 如申請專利範圍第8項之奈米級乳液免疫載劑，其中 該身體可代謝之油脂係選自於動物油、植物油、天然油、合成油及半合成衍生物所組成之群組中之一者或其任意之組合。
  10. 如申請專利範圍第8項之奈米級乳液免疫載劑，其中該油相物質係進一步具有分散在該連續水相或該連續水相所形成之油殼內之至少一水相初乳微滴，形成一複合型乳劑。
  11. 一種製備奈米級乳液免疫載劑之方法，該乳液免疫載劑伴隨抗原並經由鼻黏膜給予之後，能夠增強該抗原之免疫效價，該方法包含下列步驟：取一乳化系統之一組成乳化劑溶解於一第一水相溶液中，以獲得一第一水相混合物；取該組成乳化劑溶解於一油相物質中，以獲得一油相混合物；將該第一水相混合物與該油相混合物摻混並進行均質，以獲得一儲存溶液；將該儲存溶液以一第二水相溶液進行稀釋之後，形成一稀釋溶液；以及一加壓過薄膜之步驟，係將該稀釋溶液以加壓之方式通過具有選定奈米孔徑之一薄膜，以獲得如申請專利範圍第1項之奈米級乳液免疫載劑。
  12. 如請求項11所述之製備奈米級乳液免疫載劑的方法，其中該加壓過薄膜之步驟，係將具有所選定奈米孔徑之該薄膜設置於一雙向加壓裝置之間，並將該雙向加壓裝置分成兩側，當該稀釋溶液自該雙向加壓裝置之一側以加壓之方式通過該薄膜至該雙向加壓裝置之另一側後，該稀釋溶液可再從該雙向加壓裝置之 另一側加壓通過該薄膜至該雙向加壓裝置之原側，以完成一來回加壓之步驟。
  13. 如請求項11所述之製備奈米級乳液免疫載劑的方法，其中於該加壓過薄膜之步驟之後，係將該薄膜更換為孔徑較小之另一薄膜，並重覆進行該加壓過薄膜之步驟。
  14. 如請求項12所述之製備奈米級乳液免疫載劑的方法，係將該來回加壓之步驟重覆進行至少一次，直至該稀釋溶液中乳液粒子之粒徑大小與該薄膜之孔徑相符，且其粒徑分佈均勻為止。
  15. 如請求項12所述之製備奈米級乳液免疫載劑的方法，其中該雙向加壓裝置係為製備微脂體所用之標準擠壓器。
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Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5576016A (en) * 1993-05-18 1996-11-19 Pharmos Corporation Solid fat nanoemulsions as drug delivery vehicles
EP1938801A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-02 Biofrontera Bioscience GmbH Nanoemulsion
US20110052633A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-03 National Health Research Institutes Multi-phase emulsions based on amphiphilic block copolymers
EP2496255A4 (en) * 2009-11-05 2014-03-26 Mercia Pharma Inc ADJUVATED INFLUENZA VACCINE IN NANOPARTICLE FORM
CN103816537A (zh) * 2014-01-26 2014-05-28 乾元浩生物股份有限公司 一种纳米佐剂及其制备方法
CN104147599B (zh) * 2014-06-24 2017-03-01 华中科技大学 一种疫苗佐剂、其制备方法及应用

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