MX2011011947A - Metodos para el diagnostico de trastornos metabolicos usando intercambiadores epimetabolicos, moleculas intracelulares multidimensionales, o influyentes ambientales. - Google Patents

Metodos para el diagnostico de trastornos metabolicos usando intercambiadores epimetabolicos, moleculas intracelulares multidimensionales, o influyentes ambientales.

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MX2011011947A
MX2011011947A MX2011011947A MX2011011947A MX2011011947A MX 2011011947 A MX2011011947 A MX 2011011947A MX 2011011947 A MX2011011947 A MX 2011011947A MX 2011011947 A MX2011011947 A MX 2011011947A MX 2011011947 A MX2011011947 A MX 2011011947A
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MX
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metabolic disorder
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MX2011011947A
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John Patrick Mccook
Niven Rajin Narain
Rangaprasad Sarangarajan
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Berg Biosystems Llc
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Abstract

Se describen métodos y formulaciones para diagnosticar trastornos metabólicos en seres humanos usando intercambiadores epimetabólicos, moléculas intracelulares multidimensionales o influyentes ambientales.

Description

MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE TRASTORNOS METABÓLICOS UTILIZANDO CAMBIADORES EPIMETABOLICOS, MOLÉCULAS i INTRACELULARES MULTIDIMENSIONALES O INPLUENCIADORES AMBIENTALES SOLICITUDES RELACIONADAS: I La presente solicitud reivindica prioridad de la Solicitud provisional estadounidense Serie N° 61/177,241, presentada el 11 de mayo de 2009, con el titulo "Methods for Treatment of Oncological Disorders Using an Epimetabolic Shifter (Coenzyme Q10)" ["Métodos para el tratamiento de trastornos oncológicos usando un cambiador epimetabólico (coenzima Q10)"] (Expediente del agente N°: 117732-00601), I solicitud provisional estadounidense Serie N° 61/177,243, presentada el 11 de mayo de 2009, con el titulo "Methods for Treatment of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shift|ers, Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers" ["Métodos para el tratamiento de trastornos oncológicos usando cambiadores epimetabólicos, moléculas intracelulares multidimensionales o influenciadores 1 ambientales"] (Expediente del agente N° : 117732-00701), solicitud provisional estadounidense Serie N° 61/177,244, presentada el 11 de mayo de 2009, con el titulo "Methods for the Diagnosis of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters, Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers" ["Métodos para el diagnóstico de trastornos oncológicos usando cambiadores epimetabólicos, ??????µ??e intracelulares multidimensionales o influenciadores ambientales"] (Expediente del agente N°: 117732-00801), solicitud provisional estadounidense Serie N° 61/177,245, presentada el 11 de mayo de 2009, con el titulo "Methods for Treatment of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters, Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers" ["Métodos para el tratamiento de trastornos metabólicos usando cambiadores epimetabólicos, moléculas intracelulares multidimensionales o influenciadores ambientales"] (Expediente del agente N°: 117732-00901) y solicitud provisional estadounidense Serie N° 61/177,246, presentada el 11 de mayo de 2009, con el titulo "Methods for the :Diagnosis of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters, Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers" ["Métodos para el diagnóstico de trastornos metabólicos usando cambiadores epimetabólicos, moléculas intracelulares multidimensionales o influenciadores ambientales"] (Expediente del agente N°: 117732-01001) . Todo el contenido de cada una de las solicitudes anteriores se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia . j ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN: ¦ La invención se refiere al diagnóstico de trastornos metabólicos, tales como diabetes y obesidad.
; Debido a que los niveles de glucosa en sangre aumentan de manera postprandial, la insulina se secreta y estimula las células de los tejidos periféricos (músculos esqueléticos y grasa) para absorber de manera activa glucosa de la sangre como I una fuente de energía. La pérdida de la homeostasis de la glucosa como resultado de la acción o secreción de insulina alterada típicamente da como resultado trastornos metabólicos tales como diabetes, que se pueden disparar o agravar con la obesidad. Debido a que estas afecciones son en general fatales, se necesitan estrategias para rehabilitar una adecuada depuración de glucosa del torrente sanguíneo.
' A pesar de que la diabetes puede surgir como consecuencia de cualquier afección que causa un daño considerable en el páncreas (por ej . , pancreatitis, tumores, administración de determinados fármacos tales como 1 cortlcosteroides o pentamidina, sobrecarga de hierro (por ej . , i hemocromatosis) , endocrinopatías genéticas o adquiridas y escisión quirúrgica) , las formas más comunes de diabetes típicamente surgen de trastornos primarios del sistema de señalización de la insulina. Hay dos tipos principales de diabetes, a saber diabetes tipo 1 (también conocida como diabetes insulinodependiente (IDDM)) y diabetes tipo 2 (también conocida como diabetes insulinodependiente o no insulinodependiente (NIDDM) ) , que comparten complicaciones a largoj plazo a pesar de sus mecanismos patogénicos diversos.
: La diabetes tipo 1, que comprende aproximadamente el 10% de todos los casos de diabetes primaria, es una enfermedad autoinmune específica de órgano caracterizada por la destrucción considerable de las células beta que producen insulina del páncreas. La reducción consecuente en la producción de insulina conlleva inevitablemente a la desregulación del metabolismo metabólico. Mientras la administración de insulina proporciona considerables beneficios a los pacientes que sufren de esta afección, la semivida sérica corta es un impedimento importante para el manténimiento de normoglucemia. Un tratamiento alternativo es el transplante de islotes, pero esta estrategia ha sido poco exitosa .
La diabetes tipo 2, que afecta a una mayor proporción de la población, se caracteriza por una desregulación en la secreción de insulina y/o una respuesta disminuida a la insulina de los tejidos periféricos, es decir, resistencia a la insulina. Mientras que la patogénesis de la diabetes tipo 2 permanece incierta, los estudios epidemiológicos sugieren que esta forma de diabetes resulta de un conjunto de múltiples defectos genéticos o polimorfismos, cada uno contribuyendo con sus propios riesgos predisponentes y modificado por factores ambientales, que incluyen el exceso de peso, alimentación, inactividad, fármacos y exceso en el consumo de alcohol. Aunque se encuentran disponibles varios tratamientos terapéuticos para la administración de la diabetes tipo 2, se asocian con varios efectos colaterales debilitantes. Por consiguiente, a los pacientes diagnosticados con o que tienen riesgo de padecer diabetes tipo 2 se les aconseja normalmente adoptar un estilo de vida más sano, incluyendo pérdida de peso, cambio de dieta, ejercicio e insumo de alcohol moderado. Sin embargo, dichos cambios en el estilo de vida no son suficientes para invertir los daños orgánicos y vasculares ocasionados por la diabetes. ; La coenzima Q10, también denominada en la presente CoQlÓ, Q10, ubiquinona o ubidecarenona es un complemento nutricional popular y se puede encontrar en forma de cápsulas en tiendas de nutrición, tiendas de alimentos naturales, farmacias y similares, como un complemento vitamínico para ayudar a proteger el sistema inmune mediante las propiedades antioxidantes del ubiquinol, la forma reducida de la CoQlO. La CoQlO es reconocida en la técnica y se describe adicionalmente en la Solicitud internacional N° O 2005/069916, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
La CoQlO se encuentra en la mayoría de los tejidos del cuerpo humano y los tejidos de otros mamíferos. La distribución de tejidos y el estado de reducción-oxidación de la CoQlO en humanos han sido revisados en un artículo de revisión por Bhagavan y Chopra (2006 Free Radical Research 40(5)1:445-453). Los autores informan que "como regla general, los ,tejidos con requisitos de alta energía o actividad metatíólica como el corazón, el riñon, el hígado y el músculo contienen concentraciones relativamente altas de CoQlO." Los j autores indican además que " [una] porción importante de la CoQlO, en tejidos se encuentra en la forma reducida como la 1 hidroquinona o uniquinol, con la excepción del cerebro y los pulmones", lo que "parece ser un reflejo del estrés oxidativo aumentado en estos dos tejidos." En particular, Bhagavan informa que en el corazón, el riñon, el hígado, el músculo, í el intestino y la sangre (plasma), alrededor de 61%, 75%, 95%, ,j 65%, 95% y 96%, respectivamente, de la CoQlO se encuentra en la forma reducida. De modo similar, Ruiz-Jiminez et ál. (2007 J. Chroma A, 1175, 242-248) informan que cuando se evalúa el plasma humano para la Q10 y la forma reducida de Q10 (Q10H2), se encontró que la mayoría (90%) de la molécula estaba en la forma reducida.
I ; La CoQlO es muy lipofílica y, en su mayoría, insoluble en agua. Debido a su insolubilidad en agua, solubilidad limitada en lípidos y peso molecular relativamente alto, la eficacia de la absorción de la CoQlO administrada oralmente es baja. Bhagavan y Chopra informan que "en un estudio con ratas se informó que solamente se absorbió alrededor de 2-3% de la CoQlO administrada oralmente". Bhagavan y Chopra informan además que los "[djatos de los estudios en ratas indican que la CoQlO se reduce a ubiquinol ya sea durante o luego de la absorción en el intestino".
Dado que las estrategias disponibles en la actualidad para el manejo de la diabetes son subóptimas, surge la necesidad de tratamientos más eficaces y que no estén asociados a dichos efectos secundarios debilitantes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la aplicación de la coenzima Q10 endógena (también referida como CoQlO o Q10 en la presente) a células ocasiona la restauración de potencial apoptotico. La respuesta apoptótica se induce preferentemente en células cancérosas. Se observó una respuesta al tiempo y a la dosis de lps niveles mitocondriales de Q10 donde, luego de 48 horas, el nivel de Q10 en la mitocondria de células aumento seis, veces. La invención se basa adicionalmente en el sorprendente e inesperado descubrimiento de que la Q10 se mantiene en la forma oxidada suministrada (prooxidante) y no se convierte en la forma reducida (antioxidante) de Q10H2 en ninguna cantidad significativa. La invención se basa en el descubrimiento adicional de que se modula una cantidad significativa de proteínas y niveles de ARNm en células tratadas con Q10. Se encontró que estas proteínas moduladas se agrupaban en diversas vías celulares, incluyendo apoptosis, biología del cáncer y crecimiento celular, glucólisis y metabolismo, transporte molecular y señalización celular .
Los datos de los solicitantes descritos en la presente han proporcionado conocimientos acerca del mecanismo de acción de Q10. En particular, sin pretender limitarse a la teoría, los descubrimientos de los Solicitantes indican que la Q10 induce un cambio metabólico al microambiente celular. Se sabe que varias enfermedades están asociadas a un estado metabólico alterado. Por ejemplo, se sabe que el metabolismo diferencial ocurre en células cancerosas (el efecto Warburg) , por el cual la mayoría de las células cancerosas producen predominantemente energía mediante glucólisis seguida por fermentación de ácido láctico en el citosol, en vez de mediante fosforilación oxidativa (oxidación de piruvato) en la mitocondria. En otro ejemplo, los trastornos metabólicos, tal como diabetes y obesidad, se asocian a un metabolismo de glucosa alterado.
Por consiguiente, en determinados aspectos, la presente invención se refiere a métodos para evaluar si un sujeto se encuentra afectado con un trastorno metabólico. Dichos métodos incluyen (1) determinar el nivel de expresión de un marcador presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y ¡64-69; y (2) comparar el nivel de expresión del marcador presente en la muestra biológica obtenida del sujeto con el nivel de expresión del marcador presente en una muestra de control, donde una modulación en el nivel de expresión del marcador en la muestra biológica obtenida del sujeto con relación al nivel de expresión del marcador en la muestra de control es un indicador de que el sujeto se encuentra afectado con un trastorno metabólico, evaluando asi si el sujeto se encuentra afectado con un trastorno metabólico.
En determinados aspectos, la presente invención se refiere a métodos para evaluar si un sujeto se encuentra afectado con un trastorno metabólico. Dichos métodos incluyen (1) determinar el nivel de expresión de un marcador presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la expresión del marcador se modula en una célula enferma del i trastorno metabólico que se induce para someterse a un cambio de energía metabólica celular hacia la fosforilación oxidativa mitocondrial normal; y (2) comparar el nivel de expresión del marcador presente en la muestra biológica obtenida del sujeto con el nivel de expresión del marcador presente en una muestra de control, donde una modulación en el nivel de expresión del marcador en la muestra biológica obtenida del sujeto con relación al nivel de expresión del marcador en la muestra de control es un indicador de que el sujeto se encuentra afectado con un trastorno metabólico, evaluando asi si el sujeto se encuentra afectado con un trastorno metabólico.
En determinados aspectos, la presente invención se refiere a métodos para pronosticar si un sujeto está predispuesto a desarrollar un trastorno metabólico. Dichos métodos incluyen (1) determinar el nivel de expresión de un marcador presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6- ? 29 y ¡64-69; y (2) comparar el nivel de expresión del marcador presente en la muestra biológica obtenida del sujeto con el niveli de expresión del marcador presente en una muestra de control, donde una modulación en el nivel de expresión del marcador en la muestra biológica obtenida del sujeto con relación al nivel de expresión del marcador en la muestra de control es un indicador de que el sujeto está predispuesto a desarrollar un trastorno metabólico, pronosticando asi si el sujeto está predispuesto a desarrollar un trastorno 'i metabólico .
En determinados aspectos, la presente invención se refiere a métodos para pronosticar si un sujeto está predispuesto a desarrollar un trastorno metabolico. Dichos métodos incluyen (1) determinar el nivel de expresión de un marcador presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la expresión del marcador se modula en una célula enferma del trastorno metabolico que se induce para someterse a un cambio de energía metabólica celular hacia la fosf¿dilación oxidativa mitocondrial normal; y (2) comparar el nivel de expresión del marcador presente en la muestra biológica obtenida del sujeto con el nivel de expresión del marcador presente en una muestra de control, donde una modulación en el nivel de expresión del marcador en la muestra biológica obtenida del sujeto con relación al nivel de expresión del marcador en la muestra de control es un indicador de que el sujeto está predispuesto a desarrollar un i trastorno metabolico, evaluando así si el sujeto está predispuesto a desarrollar un trastorno metabolico.
'! En determinados aspectos, la presente invención se refiere a métodos para evaluar la eficacia de una terapia para ¡tratar un trastorno metabolico en un sujeto. Dichos métodos incluyen comparar (1) el nivel de expresión de un marcador presente en una primera muestra obtenida del sujeto antes; de administrar al sujeto al menos una porción del régimen de tratamiento, donde el marcador se selecciona del grupo, que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69; con (2) el nivel de expresión del marcador presente en una segunda muestra obtenida del sujeto posterior a la administración de al menos una porción del régimen de tratamiento, donde una modulación en el nivel de expresión del marcador en la segunda muestra en comparación con la primera muestra es un indicador de que la terapia es eficaz para tratar el trastorno metabólico en el sujeto.
En determinados aspectos, la presente invención se refiere a métodos para evaluar la eficacia de una terapia para tratar un trastorno metabólico en un sujeto. Dichos métodos incluyen comparar (1) el nivel de expresión de un marcador presente en una primera muestra obtenida del sujeto antes de administrar al sujeto al menos una porción del régimen de tratamiento, donde la expresión del marcador se modula en una célula enferma del trastorno metabólico que se induce para someterse a un cambio de energía metabólica celuliar hacia la fosforilación oxidativa mitocondrial normal; con (2) el nivel de expresión del marcador presente en una segunda muestra obtenida del sujeto posterior a la administración de al menos una porción del régimen de tratamiento, donde una modulación en el nivel de expresión del marcador en la segunda muestra en comparación con la primera muestra es un indicador de que la terapia es eficaz para ¡tratar el trastorno metabólico en el sujeto.
En determinados aspectos, la presente invención se refiere a métodos para evaluar la eficacia de un compuesto influenciador ambiental para tratar un trastorno metabólico en un sujeto que lo necesita. Dichos métodos incluyen (1) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la muestra biológica está expuesta al compuesto influenciador ambiental, y donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69 con un cambio múltiplo positivo y/o con un cambio múltiplo negativo; (2) determinar el nivel de expresión de uno ' o más marcadores presentes en una segunda muestra biológica obtenida del sujeto, donde la muestra no está expuesta al compuesto influenciador ambiental; y (3) comparar el nivel de expresión de uno o más marcadores en la muestra biológica expuestos al compuesto influenciador ambiental y el nivel de expresión de uno o más marcadores en la muestra biológica no expuestos al compuesto influenciador ambiental, donde una disminución del nivel de expresión de uno o más marcadores con cambio múltiplo negativo presente en la muestra biológica expuesta al compuesto influenciador ambiental con relación al nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en la segunda muestra es un indicador de que el compuesto influenciador ambiental es eficaz para I tratar: el trastorno metabólico en el sujeto que lo necesita, y, donde un aumento en el nivel de expresión de uno o más marcadores con un cambio múltiplo positivo en la muestra ¡i biológica expuesta al compuesto influenciador ambiental con relación al nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en la segunda muestra es un indicador de que el compuesto influenciador ambiental es eficaz para tratar el trastorno metabólico en el sujeto que lo necesita, evaluando asi la eficacia del compuesto influenciador ambiental para tratar el trastorno metabólico.
En determinados aspectos, la presente invención se refiere a métodos para evaluar la eficacia de un compuesto influenciador ambiental para tratar un trastorno metabólico en u¡h sujeto que lo necesita. Dichos métodos incluyen (1) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la muestra biológica está expuesta al compuesto influenciador ambiental, y donde el marcador de expresión está regulado por aumento o por disminución, en una célula enferma del trastorno metabólico que se induce para someterse a un cambio de energía metabólica celular hacia la fosforilación oxidátiva mitocondrial normal; (2) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en una segunda muestra biológica obtenida del sujeto, donde la muestra no está : expuesta al compuesto influenciador ambiental; y (3) comparar el nivel de expresión de uno o más marcadores en la muestjra biológica expuesta al compuesto influenciador ambiental y el nivel de expresión de uno o más marcadores en la muestra biológica no expuesta al compuesto influenciador ambiental, donde una disminución en la muestra biológica expuesta al compuesto influenciador ambiental, en el nivel de expresión de uno o más marcadores regulados por disminución con relación al nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en la segunda muestra es un indicador que el compuesto influenciador ambiental es eficaz para tratar el trastorno metabólico en el sujeto que lo necesita, y , donde un aumento en la muestra biológica expuesta al compuesto influenciador ambiental, en el nivel de expresión de uno o más marcadores regulados por aumento con relación al nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en la segunda muestra es un indicador de que el compuesto influenciador ambiental es eficaz para tratar el trastorno metabólico en el sujeto que lo necesita, evaluando así la eficacia del compuesto influenciador ambiental para tratar el trastorno metabólico .
En determinados aspectos, la presente invención se refiere a métodos para identificar un compuesto para tratar un trastorno metabólico en un sujeto. Dichos compuestos incluyen (1) obtener una muestra biológica del sujeto; (2) poner en contacto la muestra biológica con un compuesto de prueba; (3) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en la muestra biológica obtenida del sujeto, donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69 con un cambio múltiplo positivo y/o con un cambio múltiplo negativo; (4) comparar el nivel de expresión de uno o más marcadores en la muestra biológica con una muestra de control no contactada por el compuesto de prueba; y (5) seleccionar un compuesto de prueba que disminuya el nivel de expresión de uno o más marcadores con una cambio múltiplo negativo presente en la muestra biológica y/o aumente el nivel: de expresión de uno o más marcadores con un cambio múltiplo positivo presente en la muestra biológica, identificando asi un compuesto para tratar un trastorno metabblico en un sujeto.
En determinados aspectos, la presente invención se refiere a métodos para identificar un compuesto para tratar un trastorno metabólico en un sujeto. Dichos métodos incluyen (1) obtener una muestra biológica del sujeto; (2) poner en contacto la muestra biológica con un compuesto de prueba; (3) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en la muestra biológica obtenidos del sujeto, donde la expresión del marcador regulado por aumento o por disminución, en una célula enferma del trastorno metabólico que se induce para someterse a un cambio de energía metabólica celular hacia la fosforilación oxidativa mitoóondrial normal; (4) comparar el nivel de expresión de uno o más marcadores en la muestra biológica con una muestra de control no puesta en contacto por el compuesto de prueba; i y (5) seleccionar un compuesto de prueba que disminuya el nivel de expresión, en la muestra biológica, de uno o más marcadores regulados por disminución, y/o aumente el nivel de expresión, en la muestra biológica, de uno o más marcadores regulados por aumento, identificando asi un compuesto para tratar un trastorno metabólico en un sujeto.
En algunas modalidades, el trastorno metabólico es un trastorno que se selecciona del grupo que consiste en diabetes, obesidad, prediabetes, hipertensión, enfermedad cardiovascular, síndrome metabólico y elementos clave para un trastorno metabólico.
En algunas modalidades, el o los marcadores provocan de manera selectiva, en una célula enferma del sujeto, un cambio de energía metabólica celular hacia la fosforilación oxidativa mitocondrial normalizada.
! En algunas modalidades, la muestra comprende un fluido obtenido del sujeto, por ej . , un fluido que se selecciona de fluidos sanguíneos, vómito, saliva, linfa, fluido quístico, orina, fluidos recogidos por lavado bronquial, fluidos recogidos por enjuague peritoneal y fluidos ginecológicos. En algunas modalidades, la muestra es una muestra de sangre o un componente de la misma. En algunas modalidades, la muestra comprende un tejido o componente del mismo obtenido del sujeto, por ej . , tejido seleccionado del hueso, tejido conectivo, cartílago, pulmón, hígado, riñon, tejido muscular, corazón, páncreas y piel.
En algunas modalidades, el sujeto es un humano.
! En algunas modalidades, el nivel de expresión del marcador en la muestra biológica se determina mediante en ensayo de un polinucleótido transcrito o una porción del mismo1 en la muestra. En algunas modalidades, el ensayo del polinucleótido transcrito comprende amplificar el poliríucleótido transcrito. En algunas modalidades, el nivel de expresión del marcador en la muestra del sujeto se determina mediante el ensayo de una proteína o una porción de la misma en la muestra. En algunas modalidades, el marcador se ensaya usando un reactivo, por ej . , un reactivo marcado, que se une específicamente al marcador. Los reactivos pueden incluir, por ejemplo, un anticuerpo y un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno. i En algunas modalidades, el nivel de expresión del marcador en la muestra se determina usando una técnica que se selecciona del grupo que consiste en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , reacción de amplificación, análisis por PCR de transcriptasa inversa, análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP) , detección de escisión de malapareamientos , análisis heteroduplex, análisis de transferencia Southern, análisis de transferencia Northern, análisis de transferencia Western, hibridación in situ, análisis de matrices, secuenciación de ácido desoxirribonucleico, análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción y combinaciones o sub-combinaciones de los mismos, de dicha muestra. En algunas modalidades, el nivel de expresión del marcador en la muestra se determina usando una técnica que se selecciona del grupo que consiste en inmunohistoquimica, inmunocitoquimica, citometria de flujoj, ELISA y espectrometría de masas.
En algunas modalidades, el marcador es un marcador que se selecciona del grupo que consiste en HNF4-alpha, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-Lll (Bim) , XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, cMyc, transaldolasa 1, C0Q1, C0Q3, C0Q6,| preniltransferasa, 4-hidrobenzoato, factor citosólico de neutrófilos 2, sintasa de óxido nítrico 2A, superóxido dismutasa 2, VDAC, canal Bax, ANT, Citocromo c, complejo 1, complejo II, complejo III, complejo IV, Foxo 3a, DJ-1, IDH-1, Cpticj y Cam cinasa II. En algunas modalidades, el marcador es un marcador asociado a apoptosis. En algunas modalidades, el marcador es un marcador asociado a estrés oxidativo. En algunas modalidades, el marcador es un marcador asociado a choque térmico. En algunas modalidades, el marcador es un marcador asociado a angiogénesis . En algunas modalidades, el marcador es un marcador asociado a diabetes. En algunas modalidades, el marcador es un marcador asociado a hipertensión. En algunas modalidades, el marcador es un marcador asociado a enfermedad cardiovascular.
( En algunas modalidades, está determinado el nivel de expresión de una pluralidad de marcadores.
En algunas modalidades, el sujeto está siendo tratado con i una terapia que se selecciona de un compuesto influenciador ambiental, un compuesto de sulfonilurea, un compuesto de meglitinida, prandina, un compuesto de nateglinida, un compuesto de biguanida, un compuesto de tiazolidindiona, precosa, simlina, Byetta, un inhibidor de DPP-IV e insulina. En algunas modalidades, la terapia compr Iende un compuesto influenciador ambiental. Los compuestos influenciadores ambientales pueden ser, por ejemplo, moléculas intracelulares multidimensionales (MIM) o cambiadores epimetabólicos (cambiadores epi). En algunas modalidades, el compuesto influenciador ambiental es CoQ-10. En algunas modalidades, el compuesto influenciador ambiental es vitamina D3. En algunas modalidades, el compuesto i influenciador ambiental es un compuesto que se selecciona de acetilo Co-A, palmitilo, L-carnitina, tirosina, fenilalanina, cisteína y una molécula pequeña. En algunas modalidades, el compuesto influenciador ambiental es un compuesto que se selecciona de fibronectina, TNF-alfa, IL-5, IL-12, IL-23, un factor angiogénico y un factor apoptótico. En algunas i modalidades, la terapia comprende adicionalmente un régimen de tratamiento que se selecciona del tratamiento con un compuesto de sulfonilurea, tratamiento con un compuesto de meglitinida, tratamiento con prandina, tratamiento con un compuesto de nateglinida, tratamiento con un compuesto de biguanida, tratamiento con un compuesto de tiazolidindiona, tratamiento con precosa, tratamiento con simlina, tratamiento con Byetta, tratamiento con un inhibidor de DPP-IV y tratamiento con insulina. i En determinados aspectos, la presente invención se refiere a kits para evaluar si un sujeto se encuentra ? afectado con un trastorno metabólico. Dichos kits incluyen reactivos para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador que se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69, e instrucciones para usar el kit para evaluar si el sujeto se encuentra afectado con el trastorno metabólico.
En determinados aspectos, la presente invención se refiere a kits para pronosticar si un sujeto está predispuesto a desarrollar un trastorno metabólico. Dichos kits incluyen reactivos para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador que se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69, e instrucciones para usar el kit para pronosticar si el sujeto está predispuesto a desarrollar el trastorno metabólico . determinados aspectos, la presente invención se refiere kits para evaluar la eficacia de una terapia para tratar un trastorno metabólico. Dichos kits incluyen reactivos para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador que se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69, e instrucciones para usar el kit para evaluar la eficacia de la terapia para tratar el trastorno metabólico.
En determinados aspectos, la presente invención se refiere a kits para evaluar la eficacia de un compuesto inflúenciador ambiental para tratar un trastorno metabólico en un sujeto que tiene un trastorno metabólico. Dichos kits incluyen reactivos para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador que se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69, é instrucciones para usar el kit para evaluar la eficacia del ¡ compuesto inflúenciador ambiental para tratar el trastorno metabólico en el sujeto que tiene el trastorno metabólico .
I En algunas modalidades, el kit comprende adicionalmente medio's para obtener una muestra biológica de un sujeto. En algunas modalidades, el kit comprende adicionalmente una muestra de control. En algunas modalidades, se comprende adicionalmente un compuesto inflúenciador ambiental. En algunas modalidades, el kit comprende reactivos para determinar el nivel de expresión de una pluralidad de marcadores .
En algunas modalidades, los medios para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador comprende medios para ensayar un polinucleótido transcrito o una porción del mismo en la muestra. En algunas modalidades, los medios para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador comprende medios para ensayar una proteina o una porción de la misma en la muestra.
En determinados aspectos, la presente invención se refiere a métodos para evaluar si un sujeto se encuentra afectado con un estado que responde a la CoQlO. Dichos métodos incluyen (1) determinar el nivel de expresión de un marcador presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69; y (2) comparar el nivel de expresión del marcador presente en la muestra biológica obtenida del sujeto con el I nivel; de expresión del marcador presente en una muestra de control, donde una modulación en el nivel de expresión del marca'dor en la muestra biológica obtenida del sujeto con relación al nivel de expresión del marcador en la muestra de contrpl es un indicador de que el sujeto se encuentra afectado con el estado que responde a la CoQlO, evaluando asi si el sujeto se encuentra afectado con un estado que responde a la CoQlO. En algunas modalidades, el estado que responde a la CoQlO es un trastorno metabólico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS: ¦i '! Figura 1: Sensibilidad de SK-MEL-28 a 24 horas de tratamiento con Q10 medido por la cantidad de células apoptoticas tempranas y tardías. 1 I Figura 2: Sensibilidad de SKBR3 a 24 horas de tratamiento con Q10 medido por la cantidad de células apoptoticas tempranas y tardías.
Figura 3: Sensibilidad de PaCa2 a 24 horas de tratamiento con Q10 medido por la cantidad de células apopléticas tempranas y tardías.
Figura 4: Sensibilidad de PC-3 a 24 horas de tratamiento con Q10 medido por la cantidad de células apoptoticas tempranas y tardías.
Figura 5: Sensibilidad de HepG2 a 24 horas tratamiento con Q10 medido por la cantidad de cél apoptoticas tempranas y tardías.
Figura 6: Sensibilidad de MCF-7 a 24 horas de tratamiento con Q10 medido por la cantidad de células apoptoticas tempranas y tardías.
Figura 7: Medición de células apoptoticas tras 24 horas de tratamiento con Q10, según se mide por el método Apostrand ELISAl Figura 8: Análisis de gel de ejemplo de electroforesis en gel 2-D. Se marcan las manchas extirpadas para su identificación.
Figura 9 : Red de interacción entre proteínas identificadas por electroforesis en gel 2-D moduladas por QIO en células SK-MEL-28. i Figura 10: La vía de pentosa fosfato adaptada de Verhoeven et ál . (Am. J. Hum. Genet. 2001 68 (5) : 1086-1092) .
I Figura 11: Gel 2-D del material enriquecido con mitocondrias de células SK-MEL-28. Se marcan las manchas extirpadas e identificadas mediante caracterización de espectrometría de masas.
: Figura 12 : Cuadro comparativo de las cantidades relativas de Q10 presentes en mitocondria SK-MEL-28 luego de la adición exógena de 100 µ? de Q10 en el medio de cultivo.
¦ Figuras 13A y 13B: Procesos conocidos de mapeo de vía de apoptosis.
Figura 14: Análisis de transferencia Western de Bcl-xl.
Figura 15 : Análisis de transferencia Western de un conjunto de muestra SK-MEL-28 probado con un anticuerpo de Vimemtina.
Figura 16: Análisis de transferencia Western de lisis celular a partir de una cantidad de lineas celulares, evaluadas con cinco anticuerpos que se dirigen a los complejos de fosforilación oxidativa (MitoSciences #MS601) .
Figura 17: Comparación de transferencia Western de niveles Fl-alfa.
Figura 18: Comparación de transferencia Western de respuesta a Q10 con C-III-Core 2.
! Figura 19: Comparación de transferencia Western de respuesta a Q10 con C-II-30. j Figura 20: Comparación de transferencia Western de respuíesta a QIO con C-IV-COX II.
¡ Figura 21: Comparación de transferencia Western de respuesta a QIO con C-I-20 (ND6) .
Figura 22: Análisis de transferencia Western de una variedad de tipos celulares en comparación con cinco proteínas mitocondriales .
:¡ Figura 23: Comparación de transferencia Western de respuesta a Q10 con proteina C-V-a de Complejo V. ¦i ¦I Figura 24: Comparación de transferencia Western de respuesta a Q10 con C-III-Core 1.
I Figura 25: Comparación de transferencia Western de respuesta a Q10 con Porin (VDAC1) . í , Figura 26: Comparación de transferencia Western de respuesta a Q10 con Ciclofilina D.
Figura 27: Comparación de transferencia Western de respuesta a Q10 con Citocromo C.
¡ Figura 28: Modelo teórico de Q10 (esferas) insertado en el canal de unión lipidica de HNF4alfa (lM7W.pdb) en la conformación abierta Hélice 10.
I Figura 29: OCR en células HDFa en varias afecciones de glucosa en condiciones normóxicas e hipóxicas.
Figura 30: OCR en células HASMC en varias afecciones de glucosa en condiciones normóxicas e hipóxicas.
Figura 31: Valores de OCR en células de cáncer de mama CF-7 en ausencia y presencia de CoQlO y factores estresantes .
Figura 32: Valores de OCR en células de cáncer pancreático PaCa-2 en ausencia y presencia de CoQlO y factores estresantes. j DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN: i Definiciones ; Tal como se usa en la presente, cada uno de los siguientes términos tiene el significado que se le asocia al mismo; en esta sección. 1 Los artículos "un" y "una" se usan en la presente para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) I de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemehto .
Los términos "que incluye" e "incluyendo" se usan en la presente con el significado "que incluye, a modo no taxativo" y se usan de forma intercambiable con esa frase.
: El término "o" se usa en la presente con el significado "y/o" y se usa de forma intercambiable con ese término, a menos que el contexto claramente indique otra cosa.
El término "tal como" se usa en la presente con el significado "tal como pero a modo no taxativo" y se usa de forma intercambiable con esa frase.
, Un "paciente" o "sujeto" a ser tratado por el método de la invención puede significar un animal humano o no humano, preferentemente un mamífero. Tal como se usa en la presente, un "sujeto" o un "paciente" incluyen, a modo no taxativo, cualquier animal (por ej . , un humano) , incluyendo caballos, perros, gatos, cerdos, cabras, conejos, hámsters, monos, cobayos, ratas, ratones, lagartijas, víboras, ovejas, ganado, peces y aves.
Tal como se usa en la presente, "supervivencia" se refiere a la continuidad de la vida de un sujeto que ha sido tratado por un trastorno metabólico. En una modalidad, la supervivencia se refiere a la incapacidad de recurrencia de un trastorno metabólico.
"Prevenir" o "prevención" se refiere a una reducción del riesgo de contraer una enfermedad o trastorno (es decir, hacer que al menos uno de los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen en un paciente que puede estar expuesto o predispuesto a la enfermedad, pero que aún no ha experimentado o presentado síntomas de la enfermedad) .
Tal como se usa en la presente, el término "cantidad" se refiere a (a) una cantidad absoluta según se mida en moléculas, moles o peso por célula o volumen unitario o (b) una cantidad relativa según se designe, por ejemplo, por una tasa numérica de 0 a 5.
El término "cantidad de control", tal como se usa en la presente, se refiere a la cantidad de marcador en una célula o una muestra que derivada de un sujeto no afectado con un trastorno metabólico. La "cantidad de control" puede, por ejemplo, estar determinada mediante el cálculo de la cantidad promedio de marcador presente en células o tejidos que se sabe que expresan el marcador, por ej . , expresan esas proteínas a niveles altos, niveles intermediarios y niveles bajos¡. i "Cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de un compuesto que, cuando se administra a un paciente para tratar una enfermedad, es suficiente para lograr dicho tratamiento para la enfermedad. Cuando se administra para prevenir una enfermedad, la cantidad es suficiente para evitar o atrasar el inicio de la enfermedad. La "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo del compuesto, la enfermedad y su gravedad, la edad, el peso, etc. del paciente a ser tratado.
"Prevenir" o "prevención" se refiere a una reducción del riesgo de contraer una enfermedad o trastorno (es decir, hacer que al menos uno de los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen en un paciente que puede estar expuesto o predispuesto a la enfermedad, pero que aún no ha experimentado o presentado síntomas de la enfermedad) .
El término tratamiento "profiláctico" o "terapéutico" se refiere a la administración al sujeto de una o más de las presentes composiciones. Si se administra antes de la manifestación clínica de la afección no deseada (por ej . , enfermedad u otro estado no deseado del animal hospedador) el tratamiento es profiláctico, es decir, protege al hospedador de desarrollar la afección no deseada, mientras que si se administra luego de la manifestación de la afección no deseada, el tratamiento es terapéutico (es decir, pretende disminuir, mejorar o mantener la afección no deseada existente o los efectos secundarios que surgen de la misma) .
: El término "efecto terapéutico" se refiere a un efecto locali o sistémico en animales, particularmente mamíferos y más ¡particularmente humanos causado por una sustancia farmacológicamente activa. Por lo tanto el término significa cualquier sustancia que se pretende para el uso en el diagnóstico, la cura, la mitigación, el tratamiento o la prevención de una enfermedad o en la mejora de afecciones y el desarrollo físico o mental deseables en un animal o humano. La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" significa esa c'antidad de tal sustancia que produce algún efecto local i o sistémico deseado a una relación riesgo/beneficio razonable que se puede aplicar a cualquier tratamiento. En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto dependerá de su índice terapéutico, solubilidad y similares. Por ejemplo, algunos compuestos descubiertos Ij mediante los métodos de la presente invención se pueden administrar en una cantidad suficiente para producir una relación riesgo/beneficio razonable que se puede aplicar a dicho tratamiento.
I El término "expresión" se usa en la presente con el significado del proceso por el cual un polipéptido es producido a partir de ADN. El proceso implica la transcripción del gen en ARNm y la traducción de este ARNm a un polipéptido. Dependiendo del contexto en el que se usa, "expresión" puede referirse a la producción de ARN, proteína o ambas.
I Los términos "nivel de expresión de un gen en una céluía" o "nivel de expresión génica" se refieren al nivel de j! ARNm,' así como una o más transcripciones nacientes pre-ARNm, intermediarios de procesamiento de transcripciones, ARNm madur'o(s) y productos de degradación, codificados por el gen en la célula.
„ El término "modulación" se refiere a la regulación por aumento (es decir, activación o estimulación) , regulación por disminución (es decir, inhibición o supresión) de una respuesta o ambos en combinación o separados. Un "modulador" es un compuesto o molécula que modula y puede ser, por ej . , un agonista, antagonista, activador, estimulador, supresor o inhibidor.
Un "nivel más alto de expresión", "nivel más alto de actividad", "nivel aumentado de expresión" o "nivel aumentado I de actividad" se refiere a un nivel de expresión y/o actividad en una muestra de prueba que es mayor que el error estándar del ensayo empleado para evaluar la expresión y/o actividad, y es preferentemente al menos, dos veces, y más preferentemente tres, cuatro, cinco, diez o más veces el i nivel de expresión y/o actividad del marcador en una muestra de control (por ej . , una muestra de un sujeto sano que no se encuentra afectado con un trastorno oncológico) y preferentemente, el nivel de expresión promedio y/o actividad del marcador en diversas muestras de control.
Un "nivel más bajo de expresión", "nivel más bajo de actividad", "nivel disminuido de expresión" o "nivel disminuido de actividad" se refiere a un nivel de expresión y/o actividad en una muestra de prueba que es mayor que el error| estándar del ensayo empleado para evaluar la expresión y/o actividad, pero es preferentemente al menos, dos veces, y más preferentemente tres, cuatro, cinco, diez o más veces menos! que el nivel de expresión del marcador en una muestra de control (por ej . , una muestra que se calibró directa o indirectamente en comparación con un panel de trastornos oncológicos con información del seguimiento que sirve de estándar de validación para la capacidad de pronóstico del marcador) y preferentemente, el nivel de expresión promedio y/o actividad del marcador en diversas muestras de control. : Tal como se usa en la presente, "anticuerpo" incluye, a modo de ejemplo, formas de origen natural (por ej . , IgG, IgA, IgM, ¡ IgE) y anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos de dadena simple, anticuerpos quiméricos y humanizados y anticuerpos multiespecificos, asi como fragmentos y derivados de todos los anteriores, cuyos fragmentos y derivados tienen al m'enos un sitio de unión antigénico. Los derivados de anticuerpos pueden comprender una proteina o resto químico conjugado con un anticuerpo.
) Tal como se usa en la presente, "estándar conocido" o "contirol" se refieren a una o más cantidades y/o relaciones matemáticas, según sea aplicable, con respecto a un marcador de la invención y la presencia o ausencia de un trastorno metabólico. Los reactivos para generar un estándar conocido incluyen, a modo no taxativo, células de un paciente sin un trastjorno metabólico y opcionalmente anticuerpos marcados. Los ¡estándares conocidos también pueden incluir líneas celulares de cultivo tisular (que incluyen, a modo no taxativo, líneas celulares que fueron manipuladas para expresar proteínas marcadoras específicas o para no expresar i proteínas marcadoras especificas, o muestras que contienen ll constitutivamente cantidades constantes de proteína marcadora i o se j pueden manipular (por ej . , por exposición a un ambiente cambiado, donde dicho ambiente cambiado puede incluir pero a modo i no taxativo factores de crecimiento, hormonas, esteroides, citocinas, anticuerpos, varios fármacos y anti-metabolitos y matrices extracelulares) para expresar una proteína marcadora. Las líneas celulares se pueden montar directamente en láminas de vidrio para análisis, fijadas, incrustadas en parafina directamente como un sedimento, o suspendidas en una matriz tal como agarosa, luego fijadas, incrustadas en parafina, segmentadas y procesadas como i muestras de tejido. Los estándares se deben calibrar directa o indirectamente en comparación con un panel de muestras de pacientes con información del seguimiento que sirva como estándar de validación para la capacidad de pronóstico de proteínas marcadoras.
"Tratamiento primario" tal como se usa en la presente, se refiere al tratamiento inicial de un sujeto afectado con un trastorno metabólico. Los tratamientos primarios incluyen, a modo no taxativo, tratamiento con un compuesto de sulfonilurea, un compuesto de meglitinida, prandina, un 1 compuesto de nateglinida, un compuesto de biguanida, un compuesto de tiazolidindiona, precosa, simlina, Byetta, un inhibidor de DPP-IV o insulina.
Un trastorno metabólico está "tratado" si al menos un síntoma del trastorno metabólico se alivia, termina, se enlentece o se previene o se pretende que esto ocurra. Tal como se usa en la presente, un trastorno metabólico también está ! "tratado" si la reaparición o progreso del trastorno metabólico se reduce, enlentece, retarda o previene.
Un kit es cualquier fabricación (por ej . , un paquete o contenedor) que comprende al menos un reactivo, por ej . , una sonda', para detectar específicamente un marcador de la invención, siendo la fabricación aprobada, distribuida o vendida como una unidad para llevar a cabo los métodos de la presente invención. 1 "Vía metabólica" se refiere a una secuencia de reacciones mediadas por enzimas que transforman un compuesto en otro y proporcionan intermediarios y energía para las funciones celulares. La vía metabólica puede ser lineal o cíclica .
"Estado metabólico" se refiere al contenido molecular de un ambiente celular, multicelular o de tejido particular, en un punto dado en el tiempo según se mide mediante diversos i indicadores químicos y biológicos que se relacionan con un estado de salud o enfermedad.
El término "micromatriz" se refiere a una matriz de diferentes polinucleótidos, oligonucleótidos, polipéptidos (por i ej . , anticuerpos) o péptidos sintetizados en un sustrato, tal como papel, nailon u otro tipo de membrana, filtro, chip, lámina de vidrio o cualquier otro soporte sólido adecuado. ! i , Los términos "trastornos" y "enfermedades" se usan de forma inclusiva y se refieren a cualquier desvío de la estructura o función normal de cualquier parte, órgano o sistema del cuerpo (o cualquier combinación de los mismos) .
? Una enfermedad específica se manifiesta por síntomas y signos característicos, incluyendo cambios biológicos, químicos y ? físicos y generalmente se asocia a una variedad de otros factores que incluye, a modo no taxativo, factores demográficos, ambientales, de empleo, genéticos y médicamente históricos. Algunos signos, síntomas característicos y factores relacionados característicos se pueden cuantificar mediante una variedad de métodos para proporcionar información importante de diagnóstico.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para diagnosticar o pronosticar un estado i que responde a la coenzima Q10 en un sujeto que lo necesita. Las expresiones "estado que responde a la coenzima Q10" o "estado que responde a la CoQlO" incluyen enfermedades, trastornos, estados y/o afecciones que se pueden tratar, prevenir o de otra forma mejorar mediante la administración de Coenzima Q10. Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular y como se describe adicionalmente en la presente, se cree que la CoQlO funciona, al menos parcialmente, mediante la inducción de un cambio metabólico al microambiente celular, tal como un cambio hacia el tipo y/o nivel de fosforilación oxidativa en células de estado normal.
? Por consiguiente, en algunas modalidades, los estados que responden a la CoQlO son estados que surgen de un metabolismo alterado de microambiente celular. Los estados que responden a la coenzima Q10 incluyen, por ejemplo, trastornos oncológicos que, por ejemplo, pueden tender a la glucolisis y biosíntesis de lactato. En algunas modalidades, los trastornos oncológicos que responden a la CoQlO incluyen cáncer del hígado, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer 'i de próstata, cáncer de hígado o cáncer de huesos, carcinomas de células escamosas, carcinomas de células básales, melanomas y queratosis actínica, entre otros. Los estados que responden a la coenzima Q10 también incluyen, por ejemplo, trastornos metabólicos tales como obesidad, diabetes, prediabetes, síndrome metabólico, saciedad y anormalidades endocrinas. Los estados que responden a la coenzima Q10 i también incluyen otros trastornos metabólicos como se I describe en la presente. i En algunas modalidades, los compuestos de la presente invención, por ej . , las MIM o cambiadores epi. descritos en la presente, comparten una actividad común con la coenzima Q10. Tal como se usa en la presente, la frase "comparten una actividad común con la coenzima Q10" se refiere a la capacidad de un compuesto de presentar al menos una porción de la misma actividad que la Coenzima Q10 o una actividad similar. En algunas modalidades, los compuestos de la presente invención presentan 25% o más de actividad de coenzima Q10. En algunas modalidades, los compuestos de la presente invención presentan hasta e incluyendo alrededor de 130% de actividad de coenzima Q10. En algunas modalidades, los compuestos de la presente invención presentan alrededor de 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%,: 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%,; 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129% o 130% de la actividad de la coenzima Q10. Se debe comprender que cada ; uno de los valores enumerados en este párrafo se puede modificar con el término "alrededor de". Además, se debe comprender que cualquier intervalo que se define por cualesquiera dos valores enumerados en este párrafo pretende esta]† abarcado por la presente invención. Por ejemplo, en algunas modalidades, los compuestos de la presente invención presentan entre alrededor de 50% y alrededor de 100% de la ? actividad de coenzima Q10. En algunas modalidades, la actividad compartida por la coenzima Q10 y los compuestos de la presente invención es la capacidad de inducir un cambio en el metabolismo celular. En algunas modalidades, la actividad compartida por una CoQlO y los compuestos de la presente invención se mide por OCR (tasa de consumo de oxigeno) y/o ECAR»(tasa de acidificación extracelular).
Un kit es cualquier fabricación (por ej . , un paquete o contenedor) que comprende al menos un reactivo, por ej . , una sonda, para detectar específicamente un marcador de la invención, siendo la fabricación aprobada, distribuida o vendida como una unidad para llevar a cabo los métodos de la presejnte invención.
¡ El término "intermediario de la vía de biosíntesis de coenzima" tal como se usa en la presente, caracteriza aquellos compuestos que se forman entre la conversión química/biológica de tirosina y Acetil-CoA en ubiquinona. Los intermediarios de la vía de biosíntesis de coenzima incluyen 3-hexaprenil-4-hidroxibenzoato, 3-hexaprenil-4 , 5 dihidroxibenzoato, 3-hexaprenil-4-hidroxi-5-metoxibenzoato 2-hexaprenil-6-metoxi-l, 4-benzoquinona, 2-hexaprenil-3-metiL 6-meíoxi-l, -benzoquinona, 2-hexaprenil-3-metil-5-hidroxi-6 metoxi-1, 4-benzoquinona, 3-Octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2 octaprenilfenol, 2-octaprenil-6-metoxifenol, 2^octaprenil-3 metil-6-metoxi-l, 4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil-5 hidróxi-6-metoxi-l, 4-benzoquinona, 2-decaprenil-3-metil-5 hidroxi-6-metoxi-l, 4-benzoquinona, 2-decapreiiil-3-metil-6 metoxi-1, 4-benzoquinona, 2-decaprenil-6-metoxi-l, 4 benzóquinona, 2-decaprenil-6-metoxifenol, 3-decaprenil-4 hidroxi-5-metoxibenzoato, 3-decaprenil-4 , 5-dihidroxibenzoato 3-decaprenil-4-hidroxibenzoato, 4-hidroxi fenilpiruvato, 4 hidróxifenillactato, 4-hidroxi-benzoato, 4-hidroxicinamato hexaprenidifosfato.
Tal como se usa en la presente, la frase "uso anaerpbico de glucosa" o "glucólisis anaeróbica" se refiere a la producción celular de energía mediante glucólisis seguida por la fermentación de ácido láctico en el citosol. Por ejemplo, muchas células cancerosas producen energía mediante glucólisis anaeróbica.
! Tal como se usa en la presente, la frase "glucólisis aeróbica" o "fosforilación oxidativa mitocondrial" se refiere í a la¡ producción celular de energía mediante glucólisis seguida por oxidación de piruvato en la mitocondria.
I Tal como se usa en la presente, la frase "capaz de bloquear el uso anaeróbico de glucosa y aumentar la fosforilación oxidativa mitocondrial" se refiere a la capacidad de un influenciador ambiental (por ej . , un cambiador epimetabólico) de inducir un cambio en el estado metabólico de una célula de glucólisis anaeróbica a glucólisis aeróbica o fosforilación oxidativa mitocondrial. i I . Trastornos metabólicos ! La presente invención proporciona métodos para diagnosticar o pronosticar un trastorno metabólico. Un "trastorno metabólico", tal como se usa en la presente, se refiere a cualquier afección patológica que resulta de una alteración en el metabolismo de un paciente. Dichos trastornos incluyen aquellos asociados al metabolismo de la glucosa corporal completa aberrante, lipido y/o proteina y consecuencias patológicas que surgen del mismo. Los trastornos metabólicos incluyen aquellos que resultan de una i alteración en la homeostasis de glucosa que resulta, por ejemplo, en hiperglucemia . De acuerdo con esta invención, una alteración en los niveles de glucosa es típicamente un aumento en los niveles de glucosa de al menos 5%, 10%, 20%, 30%, ¡40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 100% con relación a dichos niveles en un individuo sano. Los trastornos metabólicos pueden afectar de manera perjudicial las funciones celulares tales como proliferación, crecimiento, diferenciación o migración celular, regulación celular de homeo'stasis, comunicación inter o intracelular ; función tisular, tal como función hepática, función muscular o función adiposa; respuestas sistémicas en un organismo, tales como' respuestas hormonales (por ej . , respuesta a la insulina) . Los trastornos metabólicos incluyen, a modo no taxativo, obesidad, diabetes (también denominada en la presente diabetes mellitus) (por ej . , diabetes tipo I, diab†tes tipo II, diabetes tipo MODY y diabetes gestacional), pred^abetes, síndrome metabólico, saciedad y anomalías endocrinas, por ej . , por el enve ecimiento. Ejemplos adicionales de trastornos metabólicos incluyen, a modo no taxativo, hiperfagia, hipofagia, enfermedad de almacenamiento !l de triglicéridos, síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Lawrénce-Moon, síndrome de Prader-Labhart-Willi , síndrome de Kearás-Sayre, anorexia, deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media y caquexia. Eri algunas modalidades, el trastorno metabólico es un estado que responde a la coenzima Q10.
: Por "tratar, reducir o prevenir un trastorno metabólico" se entiende mejorar dicha condición antes o despüés de haber ocurrido. En comparación con un control sin tratar equivalente, dicha reducción o grado de prevención es de ai menos 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95% o 100% según lo mide cualquier técnica estándar.
? ¾ La diabetes mellitus es un grupo heterogéneo de enfermedades metabólicas que provocan elevación crónica de glucosa en la sangre (hiperglucemia) . La diabetes se caracteriza por la disfunción o destrucción de los islotes pancreáticos que causan la pérdida de la regulación de glucosa. Los dos tipos principales de diabetes mellitus son Tipo I I, también conocida como "diabetes dependiente de insulina" ("IDDM" ) o "diabetes juvenil" y Tipo II, también conocida como "no dependiente de insulina" ("NIDD ") o "diabetes del adulto". i La "diabetes Tipo I" se refiere a una afección que resulta de una destrucción mediada por la autoinmunidad de célullas ß pancreáticas con la consecuente pérdida de la producción de insulina, que provoca hiperglucemia . Los diabéticos tipo I requieren terapia de reemplazo de insulina para ! asegurar la supervivencia. Mientras que la medicación tal como insulina inyectable e hipoglucémicos orales permiten que los diabéticos vivan más tiempo, la diabetes continúa siendo la tercera causa de muerte, luego de las enfermedades cardiacas y el cáncer. Sin embargo, estas medicaciones no controlan los niveles de azúcar en sangre lo suficiente como para prevenir que varíen los niveles altos y bajos de azúcar en sangre, provocando un daño en los ríñones, ojos y vasos sanguíneos. Los datos de la prueba de control y complicaciones de la diabetes (DCCT) muestran que el control intensivo de la glucosa en sangre retarda de manera significativa las complicaciones de la diabetes, tales como retinopatía, nefropatía y neuropatía, . en comparación con terapias convencionales que consisten en una o dos inyecciones de insulina por día. La terapia intensiva en la DCCT incluyó inyección múltiple de insulina tres o más veces por día o infusión subcutánea continua de insulina (CSII) por bomba externa. Las bombas de insulina son parte de los diversos enfoques alternativos a las inyecciones múltiples subcutáneas diarias (MDI) para aproximarse al reempl fisiológico de insulina.
La "diabetes tipo 2" se refiere a la afección en la cual ?un paciente tiene una concentración de glucosa en suero o gliucosa en sangre en ayunas mayor a 125 mg/dl (6.94 mmol/L) . La diabetes tipo II se caracteriza por hiperglucemia en presencia de niveles de insulina en plasma más altos de lo normal (hiperinsulinemia) y representa más del 90% de todos los casos y ocurre más comúnmente en adultos con sobrepeso mayores de 40 años de edad. El progreso de la diabetes tipo II está asociado a concentraciones ascendentes de glucosa en sangr¡e, junto con una disminución relativa de la velocidad de secreción de insulina inducida por glucosa. En la diabetes tipo II, se cree que los procesos tisulares que controlan el metabolismo de los carbohidratos tienen una sensibilidad disminuida a la insulina y por ende ocurre no por falta de producción de insulina sino por una sensibilidad disminuida a los niveles de glucosa incrementados en la sangre y una incapacidad de responder mediante la producción de insulina. De manera alternativa, la diabetes puede resultar de varios defectos en la maquinaria molecular que median la acción de la insulina en sus células diana, tales como falta de receptores de insulina en las superficies celulares. Por consiguiente, el tratamiento de la diabetes tipo II frecuentemente no requiere la administración de insulina pero se puede basar en cambios en el estilo de vida y alimentación, sumado a terapia con agentes hipoglucémicos tales como, por ejemplo, sulfonilurea .
I "Prediabetes" se refiere a una afección donde un paciente está predispuesto al desarrollo de diabetes tipo 2. La prediabetes extiende la definición de alteración de la tolerancia a la glucosa para incluir individuos con glucosa en sangre en ayunas dentro del intervalo normal .gtoreq.100 mg/dL (Meigs et ál., Diabetes 2003 52:1475-1484) e i hiperinsulinemia en ayunas (concentración elevada de insulina en plasma) . .i "Obesidad" se refiere a la afección donde el paciente tiene un IMC igual o mayor a 30 kg/m2. La "obesidad visceral" se refiere a una relación de cintura a cadera de 1.0 en pacientes hombres 0.8 en pacientes mujeres. En otro aspecto, la obesidad visceral define el riesgo de tener resistencia a la insulina y el desarrollo de la prediabetes.
"Sobrepeso" se refiere a un paciente con un IMC mayor a 25 kg/m2 y menor a 30 kg/m2. "Aumento de peso" se refiere al aumento del peso corporal en relación con los hábitos, de conducta o adicciones, por ej . , atracones o gula, cese de fumar, o en relación con cambios biológicos (de vida) , por ej . , aumento de peso asociado al envejecimiento en hombres y menopausia en mujeres o aumento de peso luego del embarazo.
¡"Síndrome metabólico" (MS) , también denominado Síndrome X, se! refiere a un trastorno metabólico que afecta otras vías y sistemas en el cuerpo. Originalmente, el Síndrome metabólico se definió como un grupo de trastornos metabólicos (que ; incluyen obesidad, resistencia a la insulina, hipertensión y dislipidemia, principalmente hipertrigliceridemia) , que se cataliza para potenciar la enfermedad cardiovascular. Más recientemente (2001), el U.S. National Cholesterol Education Program (NCEP) clasificó el "Síndrome metabólico" como coincidente con cualquiera de los siguientes tres criterios de cinco: Nivel de glucosa en ayunas de al menos 110 mg/dl, nivel de triglicéridos en plasma de al menos 150 mg/dl (hipertrigliceridemia) , colesterol HDL por debajo de 40 mg/dl en hombres o por debajo de 50 mg/dl en mujeres, presión sanguínea de al menos 130/85 mm Hg (hipertensión), y obesidad central, con obesidad central definida como circunferencia de cintura abdominal mayor a 40 pulgadas en hombres y mayor a 35 pulgadas en mujeres. Actualmente, existen tres definiciones más reconocidas internacionalmente para Síndrome metabólico, que obran a continuación: 1) Organización Mundial de la Salud 2) American Heart Association/National Heart, Lung and blood Institute (AHA/NHLBI) y 3) Federación Internacional de Diabetes (IDF). Las definiciones de Síndrome metabólico de la OMS, ; AHA/NHLBI e IDF son muy similares a la definición de NECP ¡ y todas usan los mismos parámetros metabólicos para definir el síndrome, pero la OMS también incluye la evaluación de los niveles de insulina en ayunas (Moebus S et ál, Cardiovascular Diabetology, 6: 1-10, 2007; Athyros V G et ál, Int. J. Cardiology, 117: 204-210, 2007). No obstante, las diferencias en los umbrales para estos parámetros metabólicos requeridos para clasificarse como poseedores del síndrome entre estas diferentes definiciones pueden dar como resultado una clasificación diferente de un sujeto particular que tiene o no el síndrome de acuerdo con estas diferentes definiciones. Asimismo, la prevalencia de la enfermedad cardiovascular (CVD) con S varía según la definición usada. ( oebus S et ál, Cardiovascular Diabetology, 6: 1-10, 2007; Athyros V G et ál, Int. J. Cardiology, 117: 204-210, 2007). La American Diabetes Association estima que 1 de cada 5 personas con sobrepeso sufren de Síndrome metabólico.
En otros aspectos, el síndrome metabólico está descrito por sinónimos aceptados, que incluyen, a modo no taxativo, síndrome X, síndrome de resistencia a la insulina, hipertensión resistente a la insulina, síndrome metabólico hipertensivo, síndrome dismetabólico . Los componentes del síndrome metabólico incluyen, a modo no taxativo, intolerancia a la glucosa, alteración de la tolerancia a la glucosa, alteración de la glucosa en suero en ayunas, alteración de la glucosa en sangre en ayunas, hiperinsulinemia, prediabetes, obesidad, obesidad visceral, hipertrigliceridemia, concentraciones elevadas en suero de ácidos grasos libres, concentraciones elevadas en suero de proteína C-reactiva, concentraciones elevadas en suero de lipoproteína (a) , concentraciones elevadas en suero de homocisteína, concentraciones elevadas en suero de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL) denso y pequeño, concentraciones elevadas en suero de fosfolipasa asociada a la lipoproteína (A2), concentraciones reducidas en suero de colesterol de lipoproteína de alta densidad, concentraciones reducidas en suero de colesterol HDL(2b), concentraciones Í reducidas en suero de adiponectina y albuminuria (véase: Persfradsingh HA. Peroxisome proliferator-activated receptor-gammá: therapeutic target for diseases beyond diabetes: quo vadis? Expert Opin Investig Drugs . (2004) 13:215-28, y referencias citadas en la presente) Los "elementos clave" de los siguientes trastornos metabólicos incluyen a modo no taxativo, alteración de la tolerancia a la glucosa o glucosa en ayunas, circunferencia de cintura aumentada, contenido de grasa visceral aumentado, glucosa en plasma en ayunas aumentada, triglicéridos en plasma en ayunas aumentado, nivel de lipoproteina de alta densidad en ayunas reducido, presión sanguínea aumentada, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, enfermedad cardiovascular (o componentes de los mismos tales como arteriesclerosis, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad vascular periférica o enfermedad cerebrovascular) , insuficiencia cardíaca congestiva, norepinefriña en plasma elevada, factores inflamatorios relacionados con lo cardiovascular elevados, disfunción endotelial vascular que potencia factores en plasma elevados, hiperlipoproteinemia, arteriosclerosis o aterosclerosis, hiperfagia, hiperglucemia, hiperlipidemia e hipertensión o presión sanguínea alta, niveles de triglicéridos postprandiales en plasma o ácidos grasos libres aumentados, estrés oxidativo celular aumentado o indicadores en plasma del mismo, estado hipercoagulable circulante aumentado, esteatosis hepática, enfermedad renal que incluye disfunción renal e insuficiencia renal. i La "resistencia a la insulina" se refiere a una afección en la cual los niveles de insulina circulante en exceso de la respuesta normal a una carga de glucosa se requieren para mantener el estado euglucémico (Ford et ál., JAMA.' 2002, 287:356-9). La resistencia a la insulina y la respuesta de un paciente con resistencia a la insulina a la terapia se puede cuantificar mediante la evaluación del modelo de la homeostasis al puntaje de resistencia a la insulina (HOMA-IR) , un indicador confiable de resistencia a la insulina ( atsuki et ál., Diabetes Care 2001 , 24 : 362 -5 ) . Un estimado de resistencia a la insulina del puntaje del modelo de evaluación de la homeostasis (HOMA)-IR se puede í calcular por la fórmula descrita en Galvin et ál . , Diabet ed 1992 ; 9 : 921- 8 donde HOMA-IR= [insulina en suero en ayunas i ( .mu:U/mL) ] .veces. [glucosa en plasma en ayunas (mmoí/L) /22 . 5 ] .
|La "hiperinsulinemia" se define como la afección en la cual : un sujeto con resistencia a la insulina, con o sin eugliicemia, en la cual la concentración de insulina en plasma o suero postprandial o en ayunas se encuentra elevada por encima de lo normal, individuos magros sin resistencia a la insulina, que tienen una relación cintura-cadera<l .0 (para hombres) o <0 . 8 (para mujeres). i ¡El término "alteración de la tolerancia a la glucosa" (IGT)t se usa para describir una persona que, al proporcionarle una prueba de tolerancia a la glucosa, tiene un nivel de glucosa que se encuentra entre normal e hiperglucémico . Dicha persona posee mayor riesgo de desarrollar diabetes aunque no se considere que tenga diabetes. Por ejemplo, la alteración de la tolerancia a la glucosa se refiere a una afección en la cual un paciente tiene una concentración de glucosa en sangre en ayunas o concentración de glucosa en suero en ayunas mayor a 110 mg/dl y menor a 126 mg/dl (7.00 mmol/L) , o una concentración de glucosa en suero o glucosa en sangre postprandial de 2 horas mayor a 140 mg/dl (7.78 mmol/L) y menor a 200 mg/dl (11.11 mmol/L) . i I La afección de "hiperglucemia" (azúcar en sangre alto) es una afección en la cual el nivel de glucosa en sangre es muy alto. Típicamente, la hiperglucemia ocurre cuando el nivel de glucosa en sangre supera 180 mg/dl. Los síntomas de hiperglucemia incluyen frecuencia al orinar, sed excesiva y pérdida de peso durante un período de tiempo más extenso.
La afección de "hipoglucemia" ( a zúcar en sangre bajo) es una afección en la cual el nivel de glucosa en sangre es muy bajo. Típicamente, la hipoglucemia ocurre cuando el nivel de glucosa en sangre se encuentra por debajo de 70 mg/dl. Los síntomas de la hipoglucemia incluyen mal humor, entumecimiento de las extremidades (especialmente en las manos y brazos), confusión, estado tembloroso o mareos. Debido a que esta afección surge cuando hay un exceso de insulana sobre la cantidad de glucosa disponible algunas veces se denomina como reacción a la insulina.
Los métodos y composiciones de la presente invención son útiles para diagnosticar a cualquier paciente que esté en i riesgo de tener un trastorno metabólico, tal como diabetes. Un paciente en el que se está previniendo el desarrollo de un trastorno metabólico (por ej . , diabetes u obesidad) puede o no haber recibido dicho diagnóstico. Un experto en la técnica entiende que los pacientes de la invención pueden estar sometidos a pruebas estándar o pueden haber sido identificados, sin haber sido examinados, como pacientes de alto ; riesgo debido a la presencia de uno o más factores de riesgo.
El diagnóstico de trastornos metabólicos previamente se ha llevado a cabo usando cualquier método estándar conocido en la técnica, tal como aquellos descritos en la presente. Los métodos para diagnosticar la diabetes se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense N° 6,537,806, incorporada a la presente mediante esta referencia. La I diabetes se puede diagnosticar y controlar usando, por ejemplo, pruebas de orina (urinálisis) que miden los niveles de glucosa y cetona (productos para la descomposición de las grasas); pruebas que miden los niveles de glucosa en la sangre; pruebas de tolerancia a la glucosa y ensayos que detectan marcadores moleculares característicos de un trastorno metabólico en una muestra biológica (por ej . , sangre, suero u orina) recogidos del mamífero (por ej . , i mediciones de niveles de hemoglobina Ale (HbAlc) en el caso de diabetes) .
Un paciente que está siendo tratado por un trastorno metabólico es uno que fue diagnosticado con dicha afección por parte de un médico. El diagnóstico se puede llevar a cabo mediánte medios adecuados, tales como aquellos descritos en la pjresente. Un paciente en el que se está previniendo la diabetes u obesidad puede o no haber recibido dicho diagnóstico. Un experto en la técnica entendería que los pacientes de la invención pueden haber sido sometidos a pruebas estándar o pueden haber sido identificados, sin haber ¦I sido examinados, como pacientes de alto riesgo debido a la presencia de uno o más factores de riesgo, tales como antecedentes familiares, obesidad, etnia particular (por ej . , afroamericanos e hispanoamericanos), diabetes gestacional o parir un bebé que pese más de nueve libras, hipertensión, tener una afección patológica predispuesta a la obesidad o diabetes, niveles elevados de triglicéridos en sangre, niveles elevados de colesterol en sangre, presencia de marcadores moleculares (por ej . , presencia de i autoánticuerpos) y edad (mayor a 45 años de edad) . Un individuo es considerado obeso cuando su peso es 20% (25% en mujeres) o más por encima del peso máximo deseable para su altura. Un adulto es tiene más de 100 libras de sobrepeso, se considera que tiene obesidad mórbida. La obesidad también se defina como un índice de masa corporal (IMC) por encima de 30 kg/rn^. i Los pacientes se pueden diagnosticar como en riesgo de tener diabetes o con diabetes si una prueba aleatoria de glucosa en plasma (llevada a cabo en cualquier momento del día) indica un valor de 200 mg/dL o más, si una prueba de glucosa en plasma en ayunas indica un valor de 126 mg/dL o más !( luego de 8 horas), o si una prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) indica un valor de glucosa en plasma de 200 mg/dL o más en una muestra de sangre tomada dos horas después de que la persona consumió una bebida que contenía 75 gramos de glucosa disuelta en agua. La OGTT mide la glucosa en plasma a intervalos de tiempo durante un periodo de 3 horas. De manera deseable, el nivel de glucosa en plasma en un paciente diabético que se trató de acuerdo con los intervalos de la invención entre 160 y 60 mg/dL, entre 150 y 70 mg/dL, entre 140 y 70 mg/dL, entre 135 y 80 mg/dL y preferentemente entre 120 y 80 mg/dL.
¡ Opcionalmente, se puede emplear una prueba de hemoglobina Ale (HbAlc) , que evalúa los niveles promedio de glucosa en sangre durante los dos a tres meses previos. Una persona sin diabetes típicamente tiene un valor de HbAlc que se encuentra entre 4% y 6%. Por cada 1% de aumento en la HbAlc, los niveles de glucosa en sangre aumentan aproximadamente 30 mg/dL y el riesgo de las complicaciones aumenta. Preferentemente, el valor de HbAlc de un paciente que está siendo tratado de acuerdo con la presente invención se reduce a menos de 9%, menos de 7%, menos de 6%, y más preferentemente alrededor de 5%. Por consiguiente, los niveles de HbAlc del paciente que está siendo tratado se reducen preferentemente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más en relación a dichos niveles antes del tratamiento.
La diabetes gestacional se diagnostica típicamente i según! los valores de glucosa en plasma medidos durante la OGTT. Debido a que los niveles de glucosa disminuyen durante el embarazo, los valores umbral para el diagnóstico de la diabetes en el embarazo son menores que en la misma persona antes' del embarazo. Si una mujer tiene dos lecturas de glucosa en plasma que coinciden o exceden cualquiera de los siguientes números, posee diabetes gestacional: un nivel de glucosa en plasma en ayunas de 95 mg/dL, un nivel luego de 1 hora ; de 180 mg/dL, un nivel luego de 2 horas de 155 mg/dL o un nivel luego de 3 horas de 140 mg/dL.
La prueba de cetona también se puede emplear para diagnosticar la diabetes tipo I. Debido a que las cetonas aumentan en la sangre cuando no hay suficiente insulina, con el tiempo se acumulan en la orina. Los altos niveles de cetonas en sangre pueden provocar una seria afección denominada cetoacidosis .
De acuerdo con las directivas de la American Diabetes Association, para ser diagnosticado con diabetes tipo 2, un individuo debe tener un nivel de glucosa en plasma en ayunas mayor o igual a 126 mg/dl o un valor de glucosa en plasma de la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) a las 2 horas mayor o igual a 200 mg/dl (Diabetes Care, 26:S5-S20, 2003) .
Una afección relacionada denominada prediabetes se define al tener un nivel de glucosa en ayunas mayor a 100 mg/dl pero menor a 126 mg/dl o un nivel de glucosa en plasma de OGTT a las 2 horas mayor a 140 mg/dl pero menor a 200 mg/dl. La evidencia cada vez mayor sugiere que la afección de prediabetes puede ser un factor de riesgo para desarrollar enfermedad cardiovascular (Diabetes Care 26:2910-2914, 2003) . La ¡prediabetes, también denominada alteración de la tolerancia a la glucosa o alteración de la glucosa en ayunas es un importante factor de riesgo para el desarrollo de diabetes mellitus tipo 2, enfermedad cardiovascular y mortálidad. Se le ha dado mucha importancia al desarrollo de intervenciones terapéuticas que previenen el desarrollo de la diabetes tipo 2 mediante el tratamiento eficaz de la predíabetes (Pharmacotherapy, 24:362-71, 2004).
La obesidad (comúnmente denominada índice de masa corpdral aproximadamente >30 kg/m2) en general se asocia a una ¦ diversas afecciones patológicas tales como hiperinsulinemia, resistencia a la insulina, diabetes, hipertensión y dislipidemia . Cada una de estas afecciones contribuye con el riesgo de enfermedad cardiovascular. t Junto con la resistencia a la insulina, la hipertensión y dislipidemia, la obesidad es considerada un componente del síndrome metabólico (también conocido como Síndrome X) que juntos se catalizan para potenciar la enfermedad cardiovascular. Más recientemente, el U.S. National ij Cholesterol Education Program clasificó el síndrome metabólico como coincidente con tres criterios de cinco: Nivelt de glucosa en ayunas de al menos 110 mg/dl, nivel de triglicéridos en plasma de al menos 150 mg/dl (hipettriglicerdemia) , colesterol HDL por debajo de 40 mg/dl en hombres o por debajo de 50 mg/dl en mujeres, presión sanguínea de al menos 130/85 mm Hg (hipertensión) , y obesidad central, con obesidad central definida como circunferencia de cintura abdominal mayor a 40 pulgadas en hombres y mayor a 35 pulgadas en mujeres.
El experto en la técnica reconocerá que el uso de cualquiera de las pruebas anteriores o cualquier otra prueba conocida en la técnica se puede usar para controlar la eficacia de los tratamientos terapéuticos de la invención. Debido a que las mediciones de hemoglobina Ale (HbAlc) es un indicador de glucosa en sangre promedio durante los dos a tres; meses anteriores, esta prueba se puede usar para controlar la respuesta de un paciente al tratamiento contra la diabetes.
Los métodos terapéuticos de la invención son eficaces parajj reducir los niveles de glucosa o niveles de lipidos en un ¡paciente. "Reducir los niveles de glucosa" significa reducir el nivel de glucosa al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, : 70%, 80%, 90%, 95% o 100% en relación a un control sin tratar. De manera deseable, los niveles de glucosa se reducen a niveles normoglucémicos, es decir, entre 150 y 60 mg/dL, entre 140 y 70 mg/dL, entre 130 y 70 mg/dL, entre 125 y 80 mg/dL y preferentemente entre 120 y 80 mg/dL. Dicha reducción en los niveles de glucosa se pueden obtener aumentando cualquiera de las actividades biológicas asociadas a la depuración de la glucosa de la sangre. Por consiguiente, un agente que tiene la capacidad de reducir los niveles de glucosa puede aumentar la producción, secreción o acción de insulina. La acción de insulina puede incrementarse, por ejemplo, aumentando la absorción de glucosa por tejidos periféricos y/o reduciendo la producción hepática de glucosa.
De manera alternativa, el agente de la invención puede í reducir la absorción de carbohidratos de los intestinos, alterar la actividad transportadora de glucosa (por ej . , aumentando la expresión de GLUT4, actividad intrínseca o translocación), aumentar la cantidad de tejido sensible a la insulina (por ej . , aumentando la diferenciación de células muscülares o células de adipocitos) o alterar la transcripción génica en adipositos o células musculares (por ej . , secreción alterada de factores de expresión de adipositos de genes de la vía metabólica) . De manera deseable, el agente de la invención aumenta más de una de las actividades asociadas a la depuración de la glucosa. "Reducir los niveles de lípidos" significa reducir el nivel de lípidos al menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ó 100% en relación a un control sin tratar.
"Alterar la vía de señalización de la insulina para que los ! niveles de glucosa se reduzcan" significa alterar (aumentando o reduciendo) cualquiera de las actividades involucradas en la señalización de la insulina para que el conjünto dé como resultado un aumento en la depuración de glucosa del plasma. Por ejemplo, el influenciador amb. de la invención altera la vía de señalización de la insulina causando un aumento en la producción, secreción o acción de insulina, un aumento en la absorción de glucosa por tejidos periféricos, una reducción en la producción hepática de glucosa o una reducción en la absorción de carbohidratos desde los intestinos.
La capacidad de un influenciador ambiental, por ej . , cambiador epi., para reducir los niveles de glucosa y así tratar un trastorno metabólico se puede evaluar usando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden emplear ensayos de detección que identifican agentes que ¡aumentan la absorción de glucosa. En particular, se pueden emplear adipocitos diferenciados en el cultivo celular para evaluar la capacidad del cambiador epi. de aumentar la absorción de glucosa tras la estimulación de insulina, según se detectó por glucosa radiomarcada . En otro ejemplo de ensayo, los mioblastos humanos obtenidos por inmortalización condicional de las células de un sujeto no diabético se pueden usar para detectar el efecto de agentes en la síntesis glucogénica, usando insulina como un control positivo. Antes del tratamiento, las células tienen escaso suero y luego se incuban con cambiador epi. o control durante un período de dos horas en un medio sin suero que contiene glucosa radiomarcada, luego de lo cual, se mida la síntesis glucogénica. Adicionalmente se describen ejemplos de ensayos en los Ejemplos. i < II . Influenciadores ambientales . La presente invención proporciona métodos para tratar trastornos metabólicos mediante la administración de un influenciador ambiental. Los "influenciadores ambientales" ( influenciadores amb.) son moléculas que influyen o modulan í el ambiente de la enfermedad de un humano en una forma i beneficiosa permitiendo que el ambiente de la enfermedad del humano (o el mamífero no humano) cambie, se restablezca o mantenga un ambiente normal o saludable que lleve a un estado normal. Los influenciadores amb. incluyen moléculas intracelulares multidimensionales (MIM) y cambiadores epimétabólicos (cambiadores epi.) tal como se define a continuación. 1 1. Molécula intracelular multidimensional (MIM) El término "molécula intracelular multidimensional (MIM)j " es una versión asilada o una versión sintéticamente producida de una molécula endógena que es producida naturalmente por el cuerpo y/o está presente en al menos una célula de un humano. Una MIM se caracteriza por uno o más, dos o más, tres o más o todas las siguientes funciones. Las MIM son capaces de ingresar a una célula y el ingreso a la célula incluye el ingreso completo o parcial a la célula, siempre que la porción biológicamente activa de la molécula ingrese completamente a la célula. Las MIM son capaces de inducir una transducción de señal y/o un mecanismo de expre'sión génica dentro de una célula. Las MIM son multidimensionales en el sentido de que las moléculas tienen un efecto terapéutico y portador, es decir, de administración de fármaco. Las MIM también son multidimensionales en el sentido de que las moléculas actúan de una forma en un estado de enfermedad y de una forma diferente en un estado normal. i Por ejemplo, en el caso de CoQ-10, la administración de CoQ-10 a ¡una célula de melanoma en presencia de VEGF lleva a un nivel disminuido de Bcl2 que, a su vez, lleva a un posible oncogénico disminuido para la célula del melanoma. Por el contrario, en un fibroblasto normal, la coadministración de CoQ-10 y VEGF no tiene efecto en los niveles de Bcl2. Preferentemente, las MIM actúan selectivamente en células de un estado de enfermedad y sustancialmente no tienen efecto en células (emparejadas) de un estado normal. Preferentemente, las MIM selectivamente vuelven a las células de un estado de enfermedad más similares desde el punto de vista de fenotipo, estado metabólico, genotipo, nivel de expresión de ARNm/proteina, etc. a las células (emparejadas) de un estado normal .
; En una modalidad, una MIM también es un cambiador epi. En otra modalidad, una MIM no es un cambiador epi. El experto en la técnica comprenderá que una MIM de la invención también pretende abarcar una mezcla de dos o más moléculas endógenas, donde la mezcla se caracteriza por una o más de las funciones anteriores. Las moléculas endógenas en la mezcla están presentes en una proporción tal que la mezcla funciona como una MIM.
Las MIM pueden ser moléculas basadas en lipidos o no basadas en lipidos. Los ejemplos de MIM incluyen, a modo no taxativo, CoQlO, acetil Co-A, palmitil Co-A, L-carnitina, aminoácidos como, por ejemplo, tirosina, fenilalanina y cisteina. En una modalidad, la MIM es una molécula pequeña. En una modalidad de la invención, la MIM no es CoQlO. Las MIM se pueden identificar de forma rutinaria por un experto en la técnica usando cualquiera de los ensayos descritos en detalle en la presente. i ; En algunas modalidades, las MIM incluyen compuestos en la familia de la Vitamina B o nucleósidos, mononucleótidos o dinucleótidos que comprenden un compuesto en la familia de la Vitamina B. Los compuestos en la familia de la vitamina B incluyen, por ejemplo, tiamina (vitamina Bl) , niacina (tamtién conocida como ácido nicotínico o vitamina B3) o piridoxina (vitamina B6) asi como provitaminas tales como panténol (provitamina B5) . En algunas modalidades, la MIM se selecciona a partir de tiamina, niacina y piridoxina. Los nucleósidos, mononucleótidos o dinucleótidos que comprenden li un compuesto en la familia de la vitamina B incluyen, por ejemplo, nucleósidos, mononucleótidos o dinucleóticos que incluyen una molécula de adenina o niacina (ácido nicotínico) . En algunas modalidades, la MIM se selecciona de adenosina, difosfato de adenosina (ADP) , dinucleótido de flavina adenina (FAD, que comprende partes de vitamina B2 y j ADP) ;jy ácido nicotínico dinucleótido.
I .
¡ En otras modalidades, las MIM incluyen aminoácidos. Los ejemplos de aminoácidos incluyen, por ejemplo, tirosina (por ej ., í L-tirosina) , cisteína, fenilalanina (por ej . , L-fenil Ialanina) y alanina. En algunas modalidades, el aminoácido es fenilalanina ú alanina. En algunas modalidades, las iMIM incluyen derivados de aminoácidos tales como 4-hidróxifenilpiruvato o acetilglicina.
! En algunas modalidades, la MIM es un análogo de glucosa, por ej . , una molécula de glucosa donde un sustituyente -OH o -CH20H ha sido reemplazado con un sustítuyente -COOH, -COO" o -NH2. Los ejemplos de análogos de glucosa incluyen glucosamina, ácido glucurónico, glucuronida y glúcuronato.
En algunas modalidades, la MIM se selecciona a partir de compuestos de fórmula (I) : i O R3 I XO' ? ? R4.
(I) donde n es un entero de 0 o 1; R1, R2, R3 y R4, cuando están presentes, se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno e hidroxilo o R1 y R2 se toman juntos con el carbono al que están unidos para formar un grupo carbonilo (C=0) ; W es -COOH o -N(CH3)3+ y ; X es hidrógeno, una carga negativa o un catión de metal alcal Jino, tal como Na+ o [sic] .
Se debe entender que cuando n es 0, el grupo CHR3 está unido al sustituyente .
¡ En algunas modalidades, W es -N(CH3)3+. En algunas modalidades, la MIM es una carnitina, tal como L-carnitina.
En algunas modalidades, la MIM es un ácido dicarboxilico . En algunas modalidades, W es -COOH. En algunas modalidades, R es hidrógeno. En algunas modalidades, n es 0. i En algunas modalidades, R1 y R2 son cada uno independientemente hidrógeno. En algunas modalidades, W es -COOH, R3 es hidrógeno, n es 0 y cada R1 y R2 es independientemente hidrógeno. En algunas modalidades, n es 1. En algunas modalidades R1 y R2 se toman juntos con el carbono al que están unidos para formar un grupo carbonilo (C=0) . En algunas modalidades, R4 es hidrógeno. En algunas modalidades, R4 es hidroxilo. En algunas modalidades, W es -COOH, R3 es hidrógeno, n es 1 y R1 y R2 se toman juntos con el carbono al que están unidos para formar un grupo carbonilo (C=0) .
En algunas modalidades, la MIM es un intermediario del cicló de Krebs, cuyo exceso lleva al ciclo de Krebs hacia la fosforilación oxidativa productiva. Los ejemplos de intermediarios del ciclo de Krebs que son MIM incluyen ácido succínico o succinato, ácido málico o malato y ácido a-cetoglutárico o a-cetoglutarato.
En algunas modalidades, la MIM es un componente básico de CQQIO, que tiene la siguiente estructura: H3CO H3CO i Por lo tanto, los componentes básicos de CoQlO incluyen, a modo no taxativo, fenilalanina, tirosina, 4-hidroxifenilpiruvato, fenilacetato, 3-metoxi-4-hidroximandelato, ácido vanílico, 4-hidroxibenzoato, ácido mevalónico, farnesilo, 2 , 3-dimetoxi-5-metil-p-benzoquinona, así como los ácidos o iones correspondientes de los mismos. En algunas modalidades, la MIM se selecciona de fenilalanina, tirosina, 4-hidroxifenilpiruvato, fenilacetato y 4-hidróxibenzoato . (i) Métodos para identificar MIM La presente invención proporciona métodos para identificar una MIM. Los métodos para identificar una MIM implican, generalmente, la adición exógena a una célula de una molécula endógena y la evaluación del efecto sobre la célula, por ej . , el perfil microambiental celular que la molécula endógena proporciona. Los efectos en la célula se evalúan en uno o más de los niveles celular, de ARNm, de proteína, de lípidos y/o de metabolitos para identificar alteraciones en el perfil de microambiente celular. En una modalidad, las células son células cultivadas, por ej . , in vitro. En una modalidad, las células están presentes en un organismo. La molécula endógena se puede agregar a la célula a una única concentración o se puede agregar a la célula a un intervalo de concentraciones. En una modalidad, la molécula endógena se agrega a las células de forma tal que el nivel de molécula endógena e las células se eleva (por ej . , se eleva en 111 vez, 1.2 veces, 1.3 veces, 1.4 veces, 1.5 veces, 1.6 veces, 1.7 veces, 1.8 veces, 1.9 veces, 2.0 veces, 3.0 veces, 4.0 veces, 5.0 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces, 40 veces, 45 veces, 50 veces o más) en comparación con el nivel de molécula endógena en una célula de control no tratada.
I Las moléculas que inducen un cambio en la célula según se detectan por alteraciones en, por ejemplo, uno cualquiera o más de morfología, fisiología y/o composición (por ej . , ARNm proteína, lípido, metabolito) se pueden evaluar adicionalmente para determinar si los cambios inducidos al perfil de microambiente celular son diferentes entre un estado celular de enfermedad y un estado celular normal. Las células (por ej . , líneas de cultivos celulares) de variado origen de tejido, tipo celular o estado de enfermedad se pueden evaluar para lograr una evaluación comparativa. Por ejemplo, los cambios inducidos en el perfil de microambiente celular de una célula cancerosa se pueden comparar con cambios inducidos a una célula no cancerosa o célula normal.
Una molécula endógena que se observa que induce un cambio en el perfil microambiental de una célula (por ej . , induce un i cambio en la morfología, fisiología y/o composición, por ej . , ARNmj proteína, lípido o metabolito de la célula) y/o que induce de forma diferencial (por ej . , preferentemente) un cambio en el perfil microambiental de una célula enferma en j comparación con una célula normal, se identifica como una MIM. j í Las MIM de la invención pueden ser MIM basadas en 1 lípidos o MIM no basadas en lípidos. Los métodos para identificar MIM basadas en lípidos implican los métodos basados en células antes descritos en los que la molécula endógena basada en lípidos se agrega de forma exógena a la célula. En una modalidad preferida, la molécula endógena basaáa en lípidos se agrega a la célula de forma tal que el nivel de la molécula endógena basada en lípidos en la célula se eleve. En una modalidad, el nivel de la molécula endógena basada en lipidos se eleva en 1.1 vez, 1.2 veces, 1.3 veces, 1.4 veces, 1.5 veces, 1.6 veces, 1.7 veces, 1.8 veces, 1.9 veces, 2.0 veces, 3.0 veces, 4.0 veces, 5.0 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces, 40 veces, 45 veces, 50 veces o más, en comparación con el nivel en una célula de control no tratada. La formulación y administración de moléculas basadas en lipidos a la célula depende de las propiedades de cada molécula probada, pero muchos métodos son conocidos en la técnica. Los ejemplos de formulación y administración de moléculas basadas en lipidos incluyen, a modo ! no taxativo, solubilización mediante cosolventes, moléculas portadoras, liposomas, dispersiones, suspensiones, dispersiones de nanoparticulas, emulsiones, por ej . , emulsiones aceite en agua o agua en aceite, emulsiones multifase, por ej . , emulsiones aceite en agua en aceite, atrapamiento y encapsulamiento de polímero. La administración de la MIM basada en lipidos a la célula se puede confirmar mediante la extracción de los lipidos celulares y la cuantificación de la MIM mediante métodos de rutina conocidos en la técnica, tal como espectrometría de masas. i Los métodos para identificar las MIM no basadas en lipidos implican los métodos basados en células descritos anteriormente donde una molécula endógena no basada en lipidos se agrega de forma exógena a la célula. En una modaíidad preferida, la molécula endógena no basada en lipidos se agrega a la célula de forma tal que el nivel de la molécula endógena no basada en lipidos en la célula se eleve. En uña modalidad, el nivel de la molécula endógena no basada en lipidos se eleva en 1.1 vez, 1.2 veces, 1.3 veces, 1.4 veces, 1.5 veces, 1.6 veces, 1.7 veces, 1.8 veces, 1.9 veces, 2.0 jveces, 3.0 veces, 4.0 veces, 5.0 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces, 40 veces, 45 veces, 50 veces o más, en comparación con el nivel en una 1 célula de control no tratada. La formulación y administración de la molécula no basada en lipidos a la célula depende de las propiedades de cada molécula probada, pero diversos métodos son conocidos en la técnica. Los ejemplos de formulaciones y modos de administración de moléculas no basadas en lipidos incluyen, a modo no taxativo, solubilización por co-solventes , moléculas portadoras, transporte activo, atrapamiento y adsorción de polímeros, injertos de polímeros, encapsulamiento liposomal y formulación con sistemas de administración dirigidos. La administración de la I no basada en lipidos a la célula se puede confirmar mediante la extracción del contenido celular y la cuantificación de la MIM por métodos de rutina conocidos en la técnica, tal como espectrometría de masas.
? I 2. Cambiadores epimetabólicos (cambiadores Epi.) Tal como se usa en la presente un "cambiador epimetabólico" (cambiador epi) es una molécula (endógena o exógena) que modula el cambio metabólico desde un estado saludable (o normal) a un estado de enfermedad o viceversa, manteniendo o reestableciendo así la salud celular, del tejido, del órgano, sistema y/o hospedador en un humano. Los cambiadores pi. son capaces de lograr la normalización en un micrpambiente de tejido. Por ejemplo, un cambiador epi. incluye cualquier molécula que es capaz, cuando se la agrega o se quita de una célula, de afectar el microambiente (por ej . , el estado metabólico) de una célula. El experto en la ¦i técnica comprenderá que un cambiador epi. de la invención í también pretende abarcar una mezcla de dos o más moléculas, donde la mezcla se caracteriza por una o más de las funciones anteriores. Las moléculas en la mezcla están presentes en una proporción tal que la mezcla funciona como un cambiador epi. Los ! ejemplos de cambiadores epi. incluyen, a modo no taxativo, coQ-10; vitamina D3; componentes de ECM como fibrpnectina; inmunomoduladores, como TNFa o cualquiera de las ¡interleucinas, por ej . , IL-5, IL-12. IL-23; factores angiógénicos y factores apoptóticos.
[ En algunas modalidades, el cambiador epi. es una enzima, como una enzima que participa directamente en la catalización de una o más reacciones en el ciclo de Krebs o produce un intermediario del ciclo de Krebs, el exceso del cual impulsa el ciclo de Krebs. En algunas modalidades, la enzima es una enzima de la fase no oxidativa de la vía de pentósa fosfato, tal como transaldolasa o transcetolasa . En otras modalidades, la enzima es una enzima componente o un complejo de enzima que facilita el ciclo de Krebs, tal como i una sintasa o una ligasa. Los ejemplos de enzimas incluyen succinil-CoA sintasa (enzima del ciclo de Krebs) o piruvato carboxilasa (una ligasa que cataliza la carboxilación reversible de piruvato para formar oxaloacetato (OAA) , un i intermediario del ciclo de Krebs) .
En algunas modalidades, el cambiador epi. es un componente básico de la CoQlO. Los componentes básicos de la CoQlÓ incluyen, a modo no taxativo, fenilalanina, tirosina, 4-hidroxifenilpiruvato, fenilacetato, 3-metoxi-4-hidroximandelato, ácido vanílico, 4-hidroxibenzoato, ácido mevalónico, farnesilo, 2 , 3-dimetoxi-5-metil-p-benzoquinona, así como los ácidos o iones correspondientes de los mismos.
En algunas modalidades, el cambiador epi. se selecciona de fenilalanina, tirosina, 4-hidroxifenilpiruvato, fenilacetato y 4-hidroxibenzoato.
En algunas modalidades, el cambiador epi. es un compuesto en la familia de la vitamina B. Los compuestos en la familia de la vitamina B incluyen, por ejemplo, riboflavina (vitamina B2) o análogos de esta. Los cambiadores epi. también incluyen cualquier análogo o profármaco que se pueda metabolizar in vivo con cualquiera de las MIM endógenas, tal como las descritas en la presente.
: En una modalidad, el cambiador epi. también es una MIM.
En una modalidad, el cambiador epi. no es CoQlO. Los cambiadores epi. se pueden identificar de forma rutinaria por un experto en la técnica usando cualquiera de los ensayos descritos en detalle en la presente. 1 (i) Métodos para identificar cambiadores epi Los cambiadores epimetabólicos (cambiador epi) son moléculas capaces de modular el estado metabólico de una célula, por ej . , inducir un cambio metabólico de un estado saludable (o normal) a un estado de enfermedad y viceversa y por lo tanto son capaces de mantener o reestablecer la salud celular, del tejido, del órgano, sistema y/o hospedador en un humano. Los cambiadores epi. de la invención por lo tanto tienen utilidad en la evaluación diagnóstica de un estado de enfermedad. Los cambiadores epi. de la invención tienen utilidad adicional en las aplicaciones terapéuticas, donde la aplicación o administración del cambiador epi. (o modulación del cambiador epi. por otras moléculas terapéuticas) logran una normalización en un microambiente de tejido y el estado de enfermedad.
La identificación de un cambiador epimetabólico implica, generalmente, establecer un perfil molecular, por ej . , de metabolitos, lipidos, proteínas o ARN (como perfiles individuales o en combinación) para un panel de células o tejidos que presenten estados de enfermedad diferenciales, avancle o agresividad. Una molécula del o los perfiles para los cuales un cambio en el nivel (por ej . , un nivel aumentado o disminuido) tiene correlación con el estado, avance o agresividad de una enfermedad, se identifica como un posible cambiador epi. i En una modalidad, un cambiador epi. también es una MIM. Los posibles cambiadores epi. se pueden evaluar para determinar su capacidad de ingresar en células tras la adición exógena a una célula usando cualquiera de una cantidad de métodos de rutina conocidos en la técnica y mediante el uso de cualquiera de los métodos descritos en la 1 presente. Por ejemplo, el ingreso del posible cambiador epi. a la célula se puede confirmar mediante la extracción del contenido celular y la cuantificación del posible cambiador epi . } mediante métodos de rutina conocidos en la técnica, tal como I espectrometría de masas. Un posible cambiador epi. que es capaz de ingresar a una célula se identifica de ese modo como una MIM. í Para identificar un cambiador epi, un posible cambiador epi. ¡se evalúa luego para determinar la capacidad de cambiar el estado metabólico de una célula. La capacidad de un posible cambiador epi. para cambiar el estado metabólico del microambiente celular se evalúa introduciendo (por ej . , agregando de forma exógena) a una célula un posible cambiador epi. ¡y controlando en la célula uno o más de los siguientes: cambios en la expresión génica (por ej . , cambios en ARNm o expresión proteica) , cambios en la Concentración en niveles lipidíeos o de metabolitos, cambios en los niveles moleculares bioenergéticos, cambios en la energética celular y/o cambios en la función y número mitocondrial . Los posibles cambiadores epi. capaces de cambiar el estado metabólico del micrqambiente celular se puede identificar de manera rutinaria por un experto en la técnica usando cualquiera de los énsayos. descritos en detalle en la presente. Los posibles cambiadores epi. se evalúan adicionalmente para determinar la capacidad de cambiar el estado metabólico de una célula enferma hacia un estado saludable normal (o de lo contrario, la capacidad de cambiar el estado metabólico de una célula normal a un estado de enfermedad). Un posible cambiador epi. capaz de cambiar el estado metabólico de una célula enferma a un estado saludable normal (o de cambiar el estado metabólico de una célula normal saludable a un estado de enfermedad) se identifica -entonces como un cambiador epi . En una modalidad preferida, el cambiador epi. no afecta de forma negativa la salud y/o crecimiento de células normales.
Los cambiadores epimetabólicos de la invención incluyen, a modo no taxativo, metabolitos de molécula pequeña, moléculas basadas en lípidos y proteínas y ARN. Para identificar un cambiador epimetabólico en la clase de metabolitos endógenos de molécula pequeña, se establecen perfiles metabólicos para un panel de células o tejidos que presentan estados de enfermedad diferenciales, avance o agresividad. El perfil de metabolitos para cada célula o tejido se determina mediante la extracción de metabolitos de la célula o tejido y la posterior identificación y cuantificación de los metabolitos usando métodos de rutina conocidos por el experto en la técnica incluyendo, por ejemplo, métodos de espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida o espectrometría de masas acoplada a cromatografía de gas. Los metabolitos para los cuales un cambio en el nivel (por ej . , un nivel aumentado o disminuido) tiene correlación con el estado, avance o agresividad de enfermedad, se identifican como posibles cambiadores epi.
' Para identificar cambiadores epi. en la clase de moléculas endógenas basadas en lípidos, se establecen perfiles de lípidos para un panel de células o tejidos que presentan estados, avance o agresividad de enfermedad diferenciales. El perfil de lípidos para cada célula o tejido se determina mediante el uso de métodos de extracción de lípidos seguido por la identificación y cuantificación de los lípidos usando métodos de rutina conocidos por el experto en la técnica incluyendo, por ejemplo, métodos de espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida o espectrometría de masas acoplada a cromatografía de gas. Los lípidos para los cuales un cambio en el nivel (por ej . , un aumento o disminución en el nivel de masa o de traza) tiene correlación con el estado, avance o agresividad de la enfermedad, se identifican como posibles cambiadores epi .
Para identificar cambiadores epi. en la clase de proteínas y ARN, se establecen perfiles de expresión génica para un panel de células o tejidos que presentan estados, avance o agresividad de enfermedad diferenciales. El perfil de expresión para cada célula o tejido se determina a nivel del ARNm y/o la proteína mediante el uso de métodos estándar de matriz de ARNm proteómico, o de matriz genómica, por ej . , como se describen en detalle en la presente. Los genes para los cuales un cambio en la expresión (por ej . , un aumento o disminución en la expresión a nivel del ARNm o la proteína) tiene correlación con el estado, avance o agresividad de la enfermedad, se identifican como posibles cambiadores epi.
Una vez que se establecen los perfiles moleculares descritos anteriormente (por ej . , para metabolitos solubles, moléculas basadas en lípidos, proteínas, ARN u otras clases biológicas de composiciones) , se realiza el análisis de vía celular y bioquímica para elucidar los enlaces conocidos entre los posibles cambiadores epi. identificados en el ambiente celular. Esta información obtenida mediante tal análisis de vías celulares y/o bioquímicas se puede utilizar para categorizar las vías y los posibles cambiadores epi.
Un experto en la técnica puede evaluar y confirmar adicionalmente la utilidad de un cambiador epi. para modular un estado de enfermedad, usando cualquiera de una cantidad de ensayos conocidos en la técnica o descritos en detalle en la presente. La utilidad de un cambiador epi. de modular un estado de enfermedad se puede evaluar mediante la administración exógena directa del cambiador epi. a una célula o a un organismo. La utilidad de un cambiador epi. de modular un estado de enfermedad puede evaluarse alternativamente mediante el desarrollo de moléculas que modulen directamente al cambiador epi. (por ej . , el nivel o la actividad del cambiador epi) . La utilidad de un cambiador epi. de modular un estado de enfermedad también se puede evaluar mediante el desarrollo de moléculas que modulen indirectamente el cambiador epi. (por ej . , el nivel o actividad del cambiador epi) mediante la regulación de otras moléculas, tales como genes (por ej . , regulados a nivel del ARN o la proteína) , colocadas en la misma vía que el cambiador epi .
El enfoque epimetabólico descrito en la presente facilita la identificación de las moléculas endógenas que existen en un microambiente celular y sus niveles se perciben y controlan mediante mecanismos genéticos, de ARNm o basados en proteínas. Las vías de respuesta a la regulación encontradas en células normales que son desencadenadas por un cambiador epi . de la invención pueden proporcionar un valor terapéutico en un ambiente celular mal regulado o enfermo. Además, el enfoque epimetabólico descrito en la presente identifica cambiadores epi. que pueden proporcionar una indicación diagnóstica para usarse en la selección de pacientes clínicos, un kit de diagnóstico de enfermedades o como un indicador pronóstico.
III . Ensayos útiles para identificar MIM/cambiadores epi Técnicas y métodos de la presente invención empleados para separar e identificar moléculas y compuestos de interés incluyen, a modo no taxativo: cromatografía líquida (LC) , cromatografía líquida de alta presión (HPLC) , espectroscopia de masas (MS) , cromatografía de gases (GC) , cromatografía líquida/espectroscopia de masas (LC- S) , cromatografía de gases/espectroscopia de masas (GC-MS) , resonancia magnética nuclear (NMR) , imagenología por resonancia magnética ( RI), infrarrojo transformado de Fourier (FT-IR) y espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente (ICP-MS). Se entiende además que las técnicas de espectrometría de masas incluyen, a modo no taxativo, el uso de instrumentos de sector magnético y doble enfoque, instrumentos de transmisión de cuadrípolo, instrumentos de trampa de iones cuadrípolo, instrumentos de tiempo de vuelo (TOF) , instrumentos de resonancia ciclotrónica iónica de transformación de Fourier (FT-MS) y espectrometría de masas en tiempo de vuelo mediante ionización/deserción por láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) .
Cuantificación de niveles moleculares bioenergéticos: Los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) se pueden identificar mediante cambios en los niveles moleculares de bioenergía celular (por ej . , ATP, piruvato, ADP, NADH, NAD, NADPH, NADP, acetilCoA, FADH2) de células a las que se les ha aplicado un cambiador epi. candidato. Los ejemplos de ensayos de niveles moleculares bioenergéticos usan métodos colorimétricos , basados en fluorescencia y/o bioluminiscencia . Los ejemplos de tales ensayos se proporcionan a continuación.
. Los niveles de ATP dentro de las células se pueden medir con una cantidad de ensayos y sistemas conocidos en la técnica. Por ejemplo, en un sistema, el ATP citoplásmico de las células lisadas reacciona con luciferina y la enzima luciferasa para producir luz. Esta bioluminiscencia se mide mediante un bioluminómetro y se puede calcular la concentración de ATP intracelular de las células lisadas (kit de ensayo EnzyLightTM ATP (EATP-100) , BioAssay Systems, Hayward, CA) . En otro sistema, por ejemplo, tanto ATP como su forma desfosforilada, ADP, se calculan mediante bioluminiscencia; luego de que se calculan los niveles de ATP, la ADP se transforma en ATP y luego se detecta y calcula usando el mismo sistema de luciferasa (kit de ensayo de rción ADP/ATP ApoSENSORTM, BioVision Inc., Mountain CA) .
El piruvato es un intermediario importante en las vías metabólicas celulares. El piruvato se puede convertir en carbohidrato mediante gluconeogénesis, convertirse en ácido graso' o metabolizarse mediante acetil CoA o convertirse en alanina o etanol, dependiendo del estado metabólico de una célula. Por lo tanto la detección de los niveles de piruvato proporciona una medición de la actividad metabólica y el estado de una muestra de célula. Un ensayo para detectar el piruvato, por ejemplo, usa un ensayo colorimétrico y fluorimétrico para detectar las concentraciones de piruvato dentro de diferentes intervalos (kit de ensayo de piruvato EnzyChromTM (Cat# EPYR-100), BioAssay Systems, Hayward, CA) .
Los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) pueden influenciar el proceso de fosforilación oxidativa realizado por la mitocondria en las células, que están implicadas en la generación y mantenimiento de moléculas bioenergías en las células. Además de los ensayos que detectan cambios en energía celular en cultivos celulares y muestras directamente (descrito a continuación) , existen ensayos para detectar y cuantificar los efectos de compuestos en enzimas y complejos diferentes de la mitocondria en las células. Por ejemplo, el ensayo de actividad MT-OXC itoTox™ Complete OXPHOS (MitoSciences Inc., Eugene, OR) puede detectar y cuantificar los efectos de los compuestos aplicados directamente a complejos I y V extraídos de la mitocondria. Los ensayos para la detección y cuantificación de los efectos en complejos mitocondriales individuales como NADH deshidrogenasa (Complejo I), citocromo c oxidasa (Complejo IV) y ATP sintasa (Complejo V) también están disponibles (MitoSciences Inc., Eugene, OR) .
Medición de energía celular: Los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) también se pueden identificar mediante cambios en energía celular. Un ejemplo de la medición de energía celular es la medición en tiempo real del consumo de oxígeno molecular y/o el cambio en el pH del medio de un cultivo celular. Por ejemplo, la capacidad de un posible cambiador epi. de modular el estado metabólico de una célula se puede analizar usando, por ejemplo, el analizador XF24 (Seahorse, Inc.). Esta tecnología permite la detección en tiempo real de cambios en el oxígeno y el pH en una monocapa de células para evaluar la bioenergía de un microambiente celular. El analizador XF24 mide y compara las tasas de consumo de oxígeno (OCR) , que son una medida del metabolismo aeróbico y la acidificación extracelular (ECAR) que es una medida de la glucólisis, ambos indicadores clave de los energía celular.
Medición de fosforilación oxidativa y función mitocondrial La fosforilación oxidativa es un proceso mediante el cual se genera ATP a través de la oxidación de compuestos nutrientes, llevada a cabo en eucariotas mediante complejos de proteina incrustados en las membranas de la mitocondria. Como la fuente principal de ATP en las células de la mayoría de los organismos, los cambios en la actividad de fosforilación oxidativa pueden alterar fuertemente el equilibrio del metabolismo y la energía dentro de una célula. En algunas modalidades de la invención, los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) se pueden detectar y/o identificar por sus efectos sobre la fosforilación oxidativa. En algunas modalidades, los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) se pueden detectar y/o identificar por sus efectos sobre los aspectos específicos de fosforilación oxidativa, incluyendo, a modo no taxativo, la cadena de transporte de electrones y la síntesis de ATP.
Los complejos de proteína incrustados en la membrana de la mitocondria que realizan procesos implicados en la fosforilación oxidativa llevan a cabo tareas específicas y se enumeran como I, II, III y IV. Estos complejos, junto con la sintasa de ATP trans-membrana interna (también conocida como Complejo V) son las entidades calve implicadas en el proceso de fosforilación oxidativa. Además de los ensayos que pueden examinar los efectos de los influenciadores ambientales (por e . , MIM o cambiadores epi) sobre la función mitocondrial en general y el proceso de fosforilación oxidativa en particular, existen ensayos que se pueden usar para examinar los efectos de un cambiador epi. en un complejo individual de forma separada de otros complejos.
El complejo I, también conocido como NADH-coenzima Q oxidoreductasa o NADH deshidrogenasa, es la primera proteina en la cadena de transporte de electrones. En algunas modalidades, se puede realizar la detección y cuantificación del efecto de un cambiador epi. sobre la producción de NAD+ por el Complejo I. Por ejemplo, el complejo se puede inmunocapturar de una muestra en una placa de 96 pocilios; la oxidación de NADH a NAD+ tiene lugar junto con la reducción de una molécula de tinción que tiene una absorbancia aumentada a 450 nM (Complejo I kit de ensayo de microplaca de actividad de enzima, MitoSciences Inc., Eugene, OR) .
El complejo IV, también conocido como citocromo c oxidasa (COX) , es la última proteina en la cadena de transporte de electrones. En algunas modalidades, se puede realizar la detección y cuantificación del efecto de un cambiador epi. sobre la oxidación del citocromo c y la reducción de oxígeno a agua por el Complejo IV. Por ejemplo, COX se puede inmunocapturar en una placa de micropocillos y la oxidación de COX se puede medir con un ensayo colorimétrico (kit de ensayo de microplaca de actividad de enzima de Complejo IV, MitoSciences Inc., Eugene, OR) .
La enzima final en el proceso de fosforilación oxidativa es ATP sintasa (Complejo V) que usa el gradiente de protones creado por los otros complejos para promover la síntesis de ATP a partir de ADP. En algunas modalidades, se puede realizar la detección y cuantificación del efecto de un cambiador epi. sobre la actividad de la ATP sintasa. Por ejemplo, tanto la actividad de ATP sintasa como la cantidad de la ATP sintasa en una muestra se pueden medir para determinar la sintasa ATP que ha sido inmunocapturada en un pocilio de una placa de micropocillos . La enzima también puede funcionar como una ATPasa en algunas condiciones, por lo tanto en este ensayo de actividad de ATP sintasa, la proporción a la cual se reduce la ATP a ADP se mide mediante la detección de la oxidación simultánea de NADH a NAD+. La cantidad de ATP se calcula usando un anticuerpo etiquetado a ATPasa (kit de ensayo de microplaca de formación de dúplex de sintasa ATP (actividad + cantidad) MitoSciences Inc., Eugene, OR) . Los ensayos adicionales para la fosforilación oxidativa incluyen ensayos que prueban los efectos sobre la actividad de los Complejos II y III. Por ejemplo, se puede usar el sistema MT-OXC MitoToxTM Complete OXPHOS (MitoSciences Inc., Eugene, OR) para evaluar los efectos de un compuesto sobre el Complejo II y III así como el Complejo I, IV y V para proporcionar datos sobre los efectos de un compuesto en el sistema de fosforilación oxidativa completo.
Como se describe anteriormente, la observación en tiempo real de muestras de células intactas se puede realizar usando sondas para los cambios en el consumo de oxígeno y pH en el medio de cultivo celular. Estos ensayos de energía celular proporcionan una amplia visión global de la función mitocondrial y los efectos de los posibles influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) sobre la actividad de la mitocondria dentro de las células de la muestra .
Los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) también pueden afectar la transición de permeabilidad mitocondrial (MPT) , un fenómeno donde las membranas mitocondriales experimentan un aumento en la permeabilidad debido a la formación de poros de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP) . Un aumento en la permeabilidad mitocondrial puede llevar a la hinchazón mitocondrial, una incapacidad de realizar la fosforilación oxxdativa y la generación de ATP y la muerte celular. La MPT puede estar implicada en la inducción de apoptosis. (Véase, por ejemplo, Halestrap, A.P., Biochem. Soc. Trans. 34:232-237 (2006) y Lena, A. et ál. Journal of Translational Med. 7:13-26 (2009) , incorporado en su totalidad a la presente mediante esta referencia.) En algunas modalidades, se mide la detección y cuantificación del efecto de un influenciador ambiental (por ej . , MIM o cambiador epi) sobre la formación, discontinuación y/o efectos de MPT y MPTP. Por ejemplo, los ensayos pueden detectar la MPT mediante el uso de moléculas de tinción especializadas (calceína) que están ubicadas dentro de las membranas internas de la mitocondria y otros compartimientos citosólicos. La aplicación de otra molécula, CoC12, sirve para suprimir la fluorescencia del tinte de calceina en el citosol. La CoC12 no puede acceder, sin embargo, al interior de la mitocondria, por lo tanto la fluorescencia de la calceina en la mitocondria no se suprime a menos que haya ocurrido MPT y la CoC12 puede acceder al interior de la mitocondria mediante MPTP. La pérdida de fluorescencia especifica de la mitocondria señala que ocurrió la MPT. Se puede usar citometria de flujo para evaluar la fluorescencia celular y de organelos (kit de ensayo de poros de transición MitoProbeTM, Molecular Probes, Eugene, OR) . Los ensayos adicionales usan un microscopio de fluorescencia para evaluar los resultados experimentales (kit de ensayo de poros de transición mitocondrial Image-iTTM LIVE, Molecular Probes, Eugene, OR) .
Medición de inflamación y, proliferación celular En algunas modalidades de la invención, los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) se pueden identificar y evaluar por sus efectos en la producción o actividad dé moléculas asociadas a la inflamación y/o proliferación celular. Estas moléculas incluyen, a modo no taxativo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, componentes de la matriz extracelular, quimiocinas, neuropéptidos, neurotransmisores, neurotrofinas y otras moléculas implicadas en la señalización celular, asi como moléculas intracelulares, tales como las implicadas en la transducción de señal.
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un factor de crecimiento con propiedades angiogénicas, vasculogénicas y mitogénicas potentes. El VEGF estimula la permeabilidad e hinchazón endotelial y la actividad de VEGF se ve implicada en numerosas enfermedades y trastornos, incluyendo artritis reumatoide, cáncer metastásico, degeneración macular relacionada con la edad y retinopatia diabética.
En algunas modalidades de la invención, un influenciador ambiental (por ej . , MIM o cambiador epi) se puede identificar y caracterizar por sus efectos sobre la producción de VEGF. Por ejemplo, las células mantenidas en condiciones hipóxicas o en condiciones que imitan la acidosis presentarán una producción aumentada de VEGF. El VEGF secretado en el medio se puede someter a ensayo usando un ELISA u otro ensayo basado en anticuerpos, usando anticuerpos anti-VEGF disponibles (RyD Systems, Minneapolis, MN) . En algunas modalidades de la invención, un cambiador epi. se puede identificar y/o caracterizar con base en su/s efecto/s en la capacidad de respuesta de las células a VEGF y/o con base en su/s efecto/s en la expresión o actividad del receptor VEGF.
El factor de necrosis tumoral (TNF) es un mediador clave de la inflamación y la activación del sistema inmune implicado tanto en la función del sistema inmune sano como en las enfermedades autoinmunes. En algunas modalidades de la invención, un cambiador epi. se puede identificar y caracterizar por sus efectos sobre la producción o la actividad de TNF. Por ejemplo, el TNF producido por células cultivadas y secretado al medio se puede cuantificar mediante ELISA y otros ensayos basados en anticuerpos conocidos en la técnica. Además, en algunas modalidades, un influenciador ambiental se puede identificar y caracterizar por su/s efecto/s en la expresión de los receptores de TNF (Human TNF RI Duoset, RyD Systems, Minneapolis, MN) .
Los componentes de la matriz extracelular (ECM) están implicados tanto en la estructura de las células y tejidos como en los procesos de señalización. Por ejemplo, las proteínas de unión al factor de crecimiento beta transformante latente son componentes de ECM que crean un depósito de factor de crecimiento beta transformado (TGF ) dentro de la ECM. El TGF unido a la matriz se puede liberar más tarde durante el proceso del remodelado de matriz y puede ejercer efectos de factor de crecimiento en las células cercanas (Dallas, S. Methods in Mol. Biol. 139:231-243 (2000) ) .
En algunas modalidades, un influenciador ambiental (por ej . , MIM o cambiador epi) se puede identificar y caracterizar por su/s efecto/s sobre la creación de ECM por células cultivadas. Los investigadores han desarrollado técnicas con las cuales se puede estµdiar y cuantificar la creación de EC por las células, asi como la composición de ECM . Por ejemplo, la síntesis de ECM por células se puede evaluar incrustando las células en un hidrogel antes de la incubación. Los análisis bioquímicos y de otro tipo se realizan en la ECM generada por las células luego de la recolección y digestión de células del hidrogel (Strehin, I. and Elisseeff, J. Methods in Mol. Bio. 522:349-362 (2009)).
En algunas modalidades, se puede identificar o caracterizar el efecto del influenciador ambiental (por ej . , MIM o cambiador epi) sobre la producción, estado o falta de ECM o uno de sus componentes en un organismo. Se han desarrollado técnicas para crear ratones condicionales con un gen inactivado que permitan la inactivación de genes ECM particulares solo en tipos distintos de células o en determinadas etapas del desarrollo (Brancaccio, M. et ál. Methods in Mol Bio. 522:15-50 (2009)). Por lo tanto se puede evaluar el efecto de la aplicación o administración de un cambiador epi. o posible cambiador epi. sobre la actividad o ausencia de un componente ECM particular en un tejido particular o en una etapa particular del desarrollo.
Medición de la integridad de membrana plasmática y muerte celular Se pueden identificar los influenciadores ambientales (por ej . , MIM o cambiadores epi) mediante cambios en la integridad de la membrana plasmática de una muestra celular y/o mediante cambios en la cantidad o porcentaje de células que experimentan apoptosis, necrosis o cambios celulares que demuestran una similitud aumentada o reducida de muerte celular .
Un ensayo para la lactato deshidrogenasa (LDC) puede proporcionar una medición de estado celular y niveles de daño. La LDH es una enzima citoplasmática estable y relativamente abundante. Cuando las membranas plasmáticas pierden la integridad física, la LDH se escapa al compartimiento extracelular . Las concentraciones más altas de LDH se correlacionan con niveles más altos de daño a la membrana plasmática y muerte celular. Los ejemplos de ensayos de LDH incluyen ensayos que usan un sistema colorimétrico para detectar y cuantificar los niveles de LDH en una muestra, donde la forma reducida de una sal de tetrazolio se produce mediante la actividad de la enzima de LDH (kit de lactato deshidrogenasa QuantiChromTM (DLDH-100), BioAssay Systems, Hayward, CA; kit de detección de citotoxicidad de LDH, Clontech, Mountain View, CA) .
La apoptosis es un proceso de muerte celular programado que puede tener una variedad de diferentes eventos de inicio. Algunos ensayos pueden detectar cambios en la velocidad y/o cantidad de células que experimentan apoptosis. Un tipo de ensayo que se usa para detectar y cuantificar la apoptosis es un ensayo de caspasa. Las caspasas son proteínas de cisteína específicas del ácido aspártico que se activan mediante la escisión proteolítica durante la apoptosis. Los ejemplos de ensayos que detectan las caspasas activadas incluyen PhiPhiLux® (Oncolmmunin, Inc., Gaithersburg, MD) y Caspase-Glo® 3/7 Assay Systems (Promega Corp., Madison, WI) . Los ensayos adicionales que pueden detectar la apoptosis y los cambios en el porcentaje o cantidad de células que experimentan apoptosis en muestras comparativas incluyen ensayos de framgentación TUNEL/DNA. Estos ensayos detectan los 180 a 200 pares de bases de fragmentos de ADN generados mediante nucleasas durante la fase de ejecución de apoptosis. Los ejemplos de ensayos de fragmentación TUNEL/DNA incluyen el kit de detección de muerte celular in situ (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) y el sistema TUNEL colorimétrico y fluorométrico DeadEnd™ TUNEL (Promega Corp., Madison, WI).
Algunos ensayos de apoptosis detectan y cuantifican proteínas asociadas a un estado apoptótico y/o no apoptótico. Por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad MultiTox-Fluor Múltiple (Promega Corp., Madison, WI) usa un sistema fluorimétrico de un solo sustrato para detectar y cuantificar la proteasas especificas para células vivas y muertas, proporcionando asi una proporción de células vivas a células que han experimentado apoptosis en una muestra de tejido o célula .
Los ensayos adicionales disponibles para detectar y cuantificar la apoptosis incluyen ensayos que detectan la permeabilidad celular (por ej . , APOPercentage™ APOPTOSIS Assay, Biocolor, Reino Unido) y ensayos para Anexina V (por ej . , kit de detección de la apoptosis de anexina V-biotina, BioVision Inc., Mountain View, CA) .
IV. Usos de la invención La invención proporciona métodos para ensayar si un sujeto se encuentra afectado por un trastorno metabólico. Los métodos de la presente invención se pueden practicar junto con cualquier otro método usado por un experto en la técnica para pronosticar un trastorno metabólico y/o la supervivencia de un sujeto que está siendo tratado por un trastorno metabólico. Por ejemplo, los métodos se la invención se pueden realizar junto con un análisis morfológico o citológico de la muestra obtenida del sujeto. Los métodos citológicos podrían incluir la detección inmunohistoquimica o inmunofluorescente (y cuantificación si correspondiera) de cualquier otro marcador molecular solo o junto con otros marcadores y/o junto con los marcadores Shc. Otros métodos podrían incluir la detección de otros marcadores por PCR in situ o por extracción de tejido y cuantificación de otros marcadores por PCR en tiempo real. PCR se define como reacción en cadena de la polimerasa.
También se proporcionan métodos para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento para tratar un trastorno metabólico en un sujeto. En estos métodos se evalúa la cantidad de marcador en un par de muestras (una primera muestra no sometida al régimen de tratamiento y una segunda muestra sometida a al menos una porción del régimen de tratamiento) .
Usando los métodos descritos en la presente, se puede analizar una variedad de moléculas, que incluyen en particular moléculas suficientemente pequeñas para ser capaces de cruzar la membrana celular, para poder identificar moléculas que modulan, por ej . , aumentan la expresión y/o actividad de un marcador de la invención. Los compuestos asi identificados se pueden proporcionar a un sujeto para inhibir un trastorno metabólico en el sujeto o tratar un trastorno metabólico en el sujeto.
V. Marcadores de la invención La invención se refiere a marcadores (en lo sucesivo "biomarcadores" , "marcadores" o "marcadores de la invención") que se enumeran en las Tablas 2-4 y 6-29. La invención proporciona ácidos nucleicos y proteínas que se codifican o corresponden a los marcadores (en los sucesivo "marcadores de ácidos nucleicos" y "proteínas marcadoras", respectivamente) . Estos marcadores son particularmente útiles para el análisis de la presencia de un trastorno metabólico, pronosticando si un sujeto está predispuesto a desarrollar un trastorno metabólico, identificando un compuesto para tratar un trastorno metabólico y evaluando la eficacia de una terapia o de un compuesto influenciador ambiental para tratar un trastorno metabólico.
En algunas modalidades de la presente invención, uno o más biomarcadores se usa con relación a los métodos de la presente invención. Tal como se usa en la presente, el término "uno o más biomarcadores" pretende expresar que se ensaya al menos un biomarcador en una lista descrita de biomarcadores, en diferentes modalidades, se puede ensayar más de un biomarcador establecido en la lista, por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, diez, veinte, treinta, cuarenta, cincuenta, más de cincuenta, o se pueden ensayar todos los biomarcadores en la lista.
Un "marcador" es un gen cuyo nivel de expresión alterado en un tejido o una célula de su nivel de expresión en un tejido o una célula normales o sanos se asocia a un estado de enfermedad, tal como un trastorno metabólico. Un "marcador de ácido nucleico" es un ácido nuecleico (por ej . , ARNm, ADNc) codificado por o que corresponde a un marcador de la invención. Dichos marcadores de ácidos nucleicos incluyen ADN (por ej . , ADNc) que comprende la secuencia total o parcial de cualquier SEQ ID NO (nts) o el complemento de dicha secuencia. Los marcadores de ácidos nucleicos también incluyen ARN que comprende la secuencia total o parcial de cualquier SEQ ID NO (nts) o el complemento de dicha secuencia, donde todos los residuos de timidina se reemplazan con residuos de uridina. Una "proteína marcadora" es una proteína codificada por o que corresponde a un marcador de la invención. Una proteína marcadora comprende la secuencia total o parcial de cualquier SEQ ID NO (AA) . Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan de manera intercambiable.
Un "marcador asociado a apoptosis" es un marcador involucrado en una vía apoptótica. Por ejemplo, los marcadores asociados a apoptosis incluyen, a modo no taxativo, los marcadores enumerados en las Tablas 6A, 6B, 7-9, 25 y 28. Específicamente, los marcadores asociados a apoptosis incluyen Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11 (Bim) , XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA y cMyc.
Un "marcador asociado al estrés oxidativo" es un marcador involucrado en una vía de estrés oxidativo. Por ejemplo, los marcadores asociados al estrés oxidativo incluyen, a modo no taxativo, los marcadores enumerados en las Tablas 10-12. Específicamente, los marcadores asociados al estrés oxidativo incluyen factor citosólico de neutrófilos, óxido nítrico sintasa 2A y superóxido dismutasa 2 (mitocondrial ) .
Un "marcador asociado a choque térmico" es un marcador involucrado en el choque térmico. Por ejemplo, los marcadores asociados al choque térmico incluyen, a modo no taxativo, los marcadores enumerados en la Tabla 13.
Un "marcador asociado a angiogénesis" es un marcador involucrado en una vía de angiogénica. Por ejemplo, los marcadores asociados a angiogénesis incluyen, a modo no taxativo, los marcadores enumerados en las Tablas 24 y 27.
Un "marcador asociado a diabetes" es un marcador involucrado en la diabetes. Por ejemplo, los marcadores asociados a diabetes incluyen, a modo no taxativo, los marcadores enumerados en las Tablas 14-17, 23 y 26.
Un fluido corporal "asociado a un trastorno metabólico" es un fluido que, cuando el cuerpo de un paciente entra en contacto o pasa a través de células metabólicas o en donde las células o proteínas despojadas de células metabólicas, son capaces de pasar. Ejemplos de fluidos corporales asociados a un trastorno metabólico incluyen fluidos corporales (po~r ej . , sangre, suero sanguíneo, sangre con plaquetas que se retiraron de la misma) y se describen más detalladamente a continuación. Muchos fluidos corporales asociados a un trastorno metabólico pueden tener células metabólicas dentro, en particular cuando las células están produciendo metástasis. Los fluidos que contienen células que pueden contener células metabólicas incluyen, a modo no taxativo, sangre, sangre con plaquetas que se retiraron de la misma, linfa y orina.
El nivel de expresión "normal" de un marcador es el nivel de expresión del marcador en células de un sujeto o paciente humano que no se encuentra afectado con un trastorno metabólico .
Una "sobreexpresión" o un "mayor nivel de expresión" de un marcador se refiere a un nivel de expresión en una muestra de prueba que es mayor que el error estándar del ensayo empleado para evaluar la expresión y es preferentemente al menos dos, y más preferentemente tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez veces el nivel de expresión del marcador en una muestra de prueba (por e . , muestra de un sujeto sano que no tiene la enfermedad asociada al marcador, esto es, trastorno metabólico) y preferentemente, el nivel de expresión promedio del marcador en varias muestras de control .
Una "menor nivel de expresión" de un marcador se refiere a un nivel de expresión en una muestra de prueba que es al menos dos veces y más preferentemente tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez veces menor que el nivel de expresión del marcador en una muestra de prueba (por ej . , muestra de sujetos sanos que no tienen la enfermedad asociada al marcador, esto es, trastorno metabólico) y preferentemente, el nivel de expresión promedio del marcador en varias muestras de control.
Un "polinucleótido transcrito" o una "transcripción de rtucleótidos" es un polinucleótido (por ej . , un ARNm, ARNhn, un ADNc o un análogo de dicho ARN o ADNc) que es complementario con u homólogo a todo o una porción de ARNm maduro realizado por transcripción de un marcador de la invención y procesamiento post-transcripcional normal (por ej . , corte y empalme), si hubiera, de la transcripción de ARN y transcripción inversa de la transcripción de ARN.
"Complementario" se refiere al concepto amplio de complementariedad de secuencia entre regiones de dos cadenas de ácido nucleico o entre dos regiones de la misma cadena de ácido nucleico. Se sabe que un residuo de adenina de una primera región de ácido nucleico es capaz de formar uniones de hidrógeno especificas ("apareamiento de bases") con un residuo de una segunda región de ácido nucleico que es antiparalela a la primera región si el residuo es timina o uracilo. De manera similar, se sabe que un residuo de citosina de una primera cadena de ácido nucleico es capaz de apareamiento de bases con un residuo de una segunda cadena de ácido nucleico que es antiparalela a la primera cadena si el residuo es guanina. Una primera región de un ácido nucleico es complementaria con una segunda región del mismo o diferente ácido nucleico, si, cuando dos regiones están dispuestas de manera antiparalela, al menos un residuo de nucleótido de la primera región es capaz de apareamiento de bases con un residuo de la segunda región. Preferentemente, la primera región comprende una primera porción y la segunda región comprende una segunda porción, donde, cuando la primera y la segunda porción están dispuestas de manera antiparalela, al menos 50% y preferentemente al menos alrededor del 75%, al menos alrededor del 90% o al menos alrededor del 95% de los residuos de nucleotidos de la primera porción son capaces de apareamiento de bases con residuos de nucleotidos en una segunda porción. Más preferentemente, todos los residuos de nucleotidos de la primera porción son capaces de apareamiento de bases con residuos de nucleotidos en una segunda porción.
"Homólogo" tal como se usas en la presente, se refiere a la similitud de una secuencia de nucleotidos entre dos regiones de la misma cadena de ácido nucleico o entre regiones de dos cadenas diferentes de ácido nucleico. Cuando la posición de un residuo de nucleótido en ambas regiones está ocupada por el mismo residuo de nucleótido, entonces las regiones son homologas en esa posición. Una primera región es homologa a una segunda región si al menos una posición de residuo de nucleótido de cada región está ocupada por el mismo residuo. La homología entre dos regiones se expresa en términos de proporción de posiciones de residuo de nucleótido de las dos regiones que están ocupadas por el mismo residuo de nuecleótido. A modo de ejemplo, una región que tiene la secuencia de nucleotidos 5'-ATTGCC-3' y una región que tiene la secuencia de nucleotidos 5'-TATGGC-3' comparten 50% de homología. Preferentemente, la primera región comprende una primera porción y la segunda región comprende una segunda porción, donde, al menos alrededor del 50%, y preferentemente al menos alrededor del 75%, al menos alrededor del 90% o al menos alrededor del 95% de las posiciones del residuo de nucleótido de cada una de las porciones están ocupadas por el mismo residuo de nucleótido. Más preferentemente, todas las posiciones del residuo de ni cleótido están ocupadas por el mismo residuo de nucleótido.
"Proteínas de la invención" comprenden proteínas marcadoras y sus fragmentos; proteínas marcadoras variantes y sus fragmentos; péptidos y polipéptidos que comprenden un segmento de al menos 15 aminoácidos de una proteína marcadora o marcadora variante; y proteínas de fusión que comprenden una proteína marcadora o marcadora variante o un segmento de al menos 15 aminoácidos de una proteína marcadora o marcadora variante .
La invención proporciona adicionalmente anticuerpos, derivados de anticuerpo y fragmentos de anticuerpo que se unen específicamente a proteínas marcadoras y fragmentos de proteínas marcadoras de la presente invención. Salvo que se especifique lo contrario en la presente, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" comprenden en líneas generales formas de origen natural (por ej . , IgG, IgA, IgM, IgE) y anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos de cadena simple, anticuerpos quiméricos y humanizados y anticuerpos multiespecíficos, así como fragmentos y derivados de los anteriores, cuyos fragmentos y derivados tienen al menos un sitio de unión antigénico. Los derivados de anticuerpos pueden comprender una proteína o resto químico conjugado con un anticuerpo.
En algunas modalidades, el biomarcador es un regulador de la vía del receptor de insulina. En algunas modalidades, el biomarcador se une al receptor de insulina. En algunas modalidades, el biomarcador es un gen relacionado con la diabetes. Los genes relacionados con la diabetes incluyen, por ejemplo, los genes enumerados en la Tabla 23. En algunas modalidades, el biomarcador está involucrado en el estrés oxidativo. En algunas modalidades, el biomarcador es un modulador de caspasa, por ej . , un activador de caspasa o un inhibidor de caspasa. En algunas modalidades, el biomarcador está involucrado en el crecimiento celular. En otras modalidades, el biomarcador está involucrado en la regulación del ciclo celular y en la síntesis de ADN. En aun otras modalidades, el biomarcador está involucrado en la glucólisis y el metabolismo, por ej . , vía de pentosa fosfato y metabolismo oxidativo mitocondrial . En modalidades adicionales, el biomarcador está involucrado en el transporte molecular. En algunas modalidades, el biomarcador está involucrado en la señalización celular. En otras modalidades, el biomarcador está involucrado en la diabetes y en el estrés oxidativo, por ej . , vías glucolíticas y procesamiento de insulina. En aun otras modalidades, el biomarcador está involucrado en la señalización mediada 14-3-3. En modalidades adicionales, el biomarcador está involucrado en la señalización de ceramida. En algunas modalidades, el biomarcador está involucrado en el transporte de proteínas mitocondriales . En otras modalidades, el biomarcador está involucrado en la diferenciación de adipocitos. En aun otras modalidades, el biomarcador está involucrado en el metabolismo del lipido y del colesterol. En algunas modalidades, el biomarcador está involucrado en la fluidez de la membrana. En otras modalidades, el biomarcador está involucrado en la inmunomodulación. En aun otras modalidades, el biomarcador está involucrado en la estabilidad genómica. En modalidades adicionales, el biomarcador está involucrado en la integridad de proteínas de matriz extracelular . En algunas modalidades, el biomarcador está involucrado en el transporte de la membrana. En otras modalidades, el biomarcador está involucrado en el control oxidativo. En algunas modalidades, el biomarcador está involucrado en la vía de pentosa fosfato. En algunas modalidades, el biomarcador es un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral. En algunas modalidades, el biomarcador está involucrado en el metabolismo del ácido araquidónico . En algunas modalidades, el biomarcador está involucrado en dos o más de las vías indicadas anteriormente. En algunas modalidades, el biomarcador está involucrado en tres o más, cuatro o más, cinco o más, etc. de las vías indicadas anteriormente. En algunas modalidades, más de un biomarcador se usa con relación a la presente invención. En estas modalidades, los biomarcadores pueden estar cada uno individualmente involucrados en uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, etc., de las vías indicadas anteriormente .
En algunas modalidades, en los casos en que un gen particular listado esté asociado a más de una condición de tratamiento, tal como a diferentes periodos de tiempo luego de un tratamiento o tratamiento mediante diferentes concentraciones de un posible influenciador ambiental (por ej . , CoQlO) , el cambio múltiplo para ese gen particular se refiere al tiempo de tratamiento más prolongado registrado. En otras modalidades, el cambio múltiplo para ese gen particular se refiere al tiempo de tratamiento más breve registrado. En otras modalidades, el cambio múltiplo para ese gen particular se refiere al tratamiento por la concentración más alta del influenciador amb. (por ej . CoQlO). En otras modalidades, el cambio múltiplo para ese gen particular se refiere al tratamiento por la concentración más baja de influenciador amb. (por ej . CoQlO) . En aun otras modalidades, el cambio múltiplo para ese gen particular se refiere a la modulación (por ej . , regulación por aumento o disminución) en una forma que es consistente con el efecto terapéutico del influenciador amb.
En determinadas modalidades, el cambio múltiplo positivo o negativo se refiere al de cualquier gen enumerado en cualquiera de las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69. En determinadas modalidades, el cambio múltiplo positivo o negativo se refiere al de cualquier gen enumerado en cualquiera de las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69, excepto por una de las tablas (por ej . , excepto por la Tabla 1, excepto por la Tabla 5, etc.). En algunas modalidades, el cambio múltiplo positivo o negativo se refiere al de cualquier gen listado en cualquiera de las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69) , excepto por cualesquiera dos de las tablas (por ej . , excepto por las Tablas 1 y 5, excepto por las Tablas 2 y 16, etc.)- En algunas modalidades, el cambio múltiplo positivo o negativo se refiere al de cualquier gen listado en cualquiera de las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69, excepto por cualesquiera tres de las tablas o excepto por cualesquiera cuatro de las tablas o excepto por cualesquiera 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de las tablas. En algunas modalidades, el cambio múltiplo positivo o negativo se refiere al de cualquier gen listado en cualquiera de las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69, excepto por las tablas 1, 5, 9, 12 y 59.
Tal como se usa en la presente, "cambio múltiplo positivo" se refiere a "regulación por aumento" o "aumento (de expresión) " de un gen que se lista en las tablas relevantes .
Tal como se usa en a presente, "cambio múltiplo negativo" se refiere a la regulación por disminución" o "disminución (de expresión) " e un gen que se lista en las tablas relevantes.
Se describen diferentes aspectos de la invención más detalladamente en las siguientes subsecciones . 1. Moléculas aisladas de ácido nucleico Un aspecto de la invención se relaciona con las moléculas aisladas de ácido nucleico, incluidos ácidos nucleicos que codifican una proteina marcadora o una porción de la misma. Los ácidos nucleicos aislados de la invención también incluyen moléculas de ácido nucleico suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico marcador y fragmentos de las moléculas de ácido nucleico marcador, por ej . , adecuados para su uso como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de las moléculas de ácido nucleico marcador. Tal como se usa en la presente, se pretende que el término "molécula de ácido nucleico" incluya moléculas de ADN (por ej . , ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ej . , ARNm) y análogos del ADN o ARN generado usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena simple o de cadena doble, pero es preferentemente ADN de cadena doble.
Una molécula de ácido nucleico "aislado" es una molécula que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural de la molécula de ácido nucleico. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (preferentemente secuencias que codifican proteínas) que flanquea naturalmente el ácido nucleico (esto es, secuencia ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo de donde deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas modalidades, la molécula de ácido nucleico aislado puede contener menos de alrededor de 5 kB, 4 kB, 3 kB, 2 kB, 1 kB, 0.5 kB o 0.1 kB de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de donde deriva el ácido nucleico. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico "aislado", tal como una molécula de ADNc puede estar sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo al producirse mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos al sintetizarse químicamente. Una molécula que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones que tienen menos de alrededor de 30%, 20%, 10% o 5% de ácido nucleico heterólogo (también referido en la presente como "ácido nucleico contaminante") .
Una molécula de ácido nucleico de la presente invención se puede aislar usando técnicas de biología molecular estándar y la información de secuencias en los registros de bases de datos descritos en la presente. Usando todas o una porción de las secuencias de ácidos nucleicos, se pueden aislar las moléculas de ácido nucleico de la invención usando técnicas de hibridación estándar y clonación (por ej . , tal como se describe en Sambrook et áJ., ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .
Una molécula de ácido nucleico de la invención se puede aumentar usando ADNc, ARNm o ADN genómico como una plantilla y cebadores de oligonucleótidos apropiados de acuerdo con las técnicas de amplificación de PCR estándar. El ácido nucleico asi amplificado se puede clonar en un vector apropiado y caracterizar por análisis de secuencia de ADN. Además, los nucleótidos que corresponden a todas o una porción de una molécula de ácido nucleico de la invención se puede preparar mediante técnicas sintéticas estándar, por ej . , usando un sintetizador de ADN automatizado.
En otra modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislado de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de un marcador de ácido nucleico o a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que codifica una proteina marcadora. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de nucleótidos dada es una molécula suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos dada que se puede hibridizar con una secuencia de nucleótidos formando asi un dúplex estable.
Además, una molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solo una porción de una secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de ácido nucleico de longitud completa comprende un marcador de ácido nucleico o que codifica una proteina marcadora. Dichos ácidos nucleicos se pueden usar, por ejemplo, como sonda o cebador. La sonda/el cebador se usa típicamente como uno o más oligonucleótidos sustancialmente purificados. El oligonucleótido comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos que se hibridan en condiciones restrictivas hasta al menos alrededor de 7, preferentemente alrededor de 15, más preferentemente alrededor de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 o 400 o más nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico de la invención.
Las sondas con base en la secuencia de una molécula de ácido nucleico de la invención se pueden usar para detectar trasncripciones o secuencias genómicas que corresponden a uno o más marcadores de la invención. La sonda comprende un grupo marcador adjunto a la misma, por ej . , un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de enzima. Dichas sondas se pueden usar como parte de un kit de prueba de diagnóstico para identificar células o tejidos que no expresan la proteína, tal como por niveles de medición de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína en una muestra de células de un sujeto, por ej . , detectando niveles de ARNm o determinando si un gen que codifica la proteína ha sido mutado o eliminado.
La invención comprende adiciortalmente moléculas dé ácido nucleico que difieren, debido a la degeneración del código genético, de la secuencia de nucleótidos de ácidos nucleicos que codifican la proteína marcadora (por ej . , proteína que tiene una secuencia de SEQ ID NO (AA) ) , y por tanto codifican la misma proteína.
Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los polimorfismos de secuencia de ADN que llevan a cambios en la secuencia de aminoácidos pueden existir dentro de una población (por ej . , la población humana). Dichos polimorfismos genéticos pueden existir entre individuos de una población debido a la variación alélica natural. Un alelo es de un grupo de genes que aparecen alternativamente en un sitio genético dado. Además, se apreciará que también pueden existir polimorfismos de ADN que afectan los niveles de expresión de ARN que afecten los niveles de expresión generales de ese gen (por ej . , afectando la regulación o degradación) .
Tal como se usa en la presente "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótidos que aparece en un sitio dado o a un polipéptido codificado por la secuencia de nucléotidos .
Tal como se usa en la presente, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido que corresponde a un marcador de la invención. Dichas variaciones alélicas naturales pueden típicamente dar como resultado en una variación al 1-5% en la secuencia de nucleótidos del gen dado. Los alelos alternativos se pueden identificar secuenciando el gen de interés en una cantidad de individuos diferentes. Esto se puede llevar a cabo fácilmente usando las sondas de hibridación para identificar el mismo sitio genético en una variedad de individuos. Se pretende que cualesquiera variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácido o variaciones que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional estén dentro del alcance la invención.
En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene al menos 7, 15, 20, 25, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 550, 650, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3500, 4000, 4500 o más nucleótidos de longitud y se hibridan en condiciones restrictivas hasta un marcador de ácido nucleico o un ácido nucleico que codifica una proteina marcadora. Tal como se usa en la presente, el término "se híbrida en condiciones restrictivas" pretende describir condiciones para la hibridación y lavado en las cuales las secuencias de nucleótidos al menos 60% (65%, 70%, preferentemente 75%) idénticas entre sí típicamente permanecen hibridizadas entre sí. Dichas condiciones restrictivas son conocidas para aquellos expertos en la técnica y se pueden encontrar en las secciones 6.3.1-6.3.6 de Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, N.Y. (1989) . Un ejemplo no limitante y preferido de las condiciones restrictivas de hibridación preferidas, es la hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a alrededor de 45°C, seguido de uno o más lavados en 0.2X SSC, 0.1% SDS a 50-65°C.
Además de las variantes alélicas de origen natural de una molécula de ácido nucleico de la invención que puede existir en la población, el experto en la técnica apreciará adicionalmente que los cambios de secuencia se pueden introducir mediante mutación así llevando a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada, sin alterar la actividad biológica de la proteína así codificada. Por ejemplo, uno puede realizar sustituciones de nucleótidos que lleven a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos no esenciales. Un residuo de aminoácidos "no esencial" es un residuo que se puede alterar a partir de la secuencia de tipo salvaje sin alterar la actividad biológica, mientras se necesita un residuo de aminoácido "esencial" para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos de aminoácido que no se conservan o solo se semiconservan entre homólogos de diversas especies pueden no ser esenciales para la actividad y por lo tanto pueden ser probablemente dianas para alteración. De manera alternativa, los residuos de aminoácidos que se conservan entre los homólogos de diversas especies (por ej . , murina y humana) pueden ser esenciales para la actividad y por lo tanto no serían probablemente dianas para alteración.
Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína marcadora variante que contiene cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad. Dichas proteínas marcadoras variantes difieren en la secuencia de aminoácidos de proteínas marcadoras de origen natural, aun retienen actividad biológica. En una modalidad, dicha proteina marcadora variante tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 40% idéntica, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una proteina marcadora.
Se puede crear una molécula de ácido nucleico aislada que codifique una proteina marcadora variante mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones en la secuencia de nucleótidos de los marcadores de ácidos nucleicos de modo que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de residuos de aminoácidos en la proteina codificada. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferentemente, las sustituciones conservadoras de aminoácidos se realizan en uno o más residuos de aminoácido no esenciales previstos. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se identificaron familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ej . , lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidicas (por ej . , ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ej . , glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina) , cadenas laterales no polares (por ej . , alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ej . , treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ej . , tirosina, fenilalanina, triptófano, histidína) . De manera alternativa, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificadora, tal como mediante mutagénesis de saturación y los mutantes resultantes pueden analizarse para la actividad biológica para identificar mutantes que retienen la actividad. Luego de la mutagénesis, la proteina codificada se puede expresar recombinantemente y la actividad de la proteina se puede determinar.
La presente invención comprende moléculas de ácidos nucleicos antisentido, esto es, moléculas que son complementarias con un ácido nucleico sentido de la invención, por ej . , complementarias con la cadena de codificación de una molécula de ADNc marcador de cadena doble o complementarias con una secuencia dé ARNm marcador. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido de la invención se puede unir mediante hidrógeno a (esto es, templado con) un ácido nucleico sentido de la invención. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario con una cadena de codificación entera o con solo una porción de la misma, por ej . , toda o parte de una región de codificación de proteina (o marco de lectura abierto) . Una molécula de ácido nucleico antisentido también puede ser antisentido con toda o parte de una región de no codificación de la cadena de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifican una proteina marcadora. Las regiones no codificantes ("regiones no traducidas 5' y 3') son las secuencia 5' y 3' que flaquean la región codificante y no se traducen en aminoácidos.
Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, alrededor de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 o más nucleótidos de longitud. Un ácido nucleico antisentido de la invención se puede construir usando síntesis química y reacciones de unión enzimática usando procedimientos conocidas en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ej . , un oligonucleótido antisentido) se puede sintetizar químicamente usando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de diversas maneras diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ej . , se pueden usar derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, ?-6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2, 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, ?-6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluraciló, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5' metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3 (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w y 2, 6-diaminopurina . De manera alternativa, el ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente usando un vector de expresión en el cual se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito desde el ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido a un ácido nucleico diana de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección) .
Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención se administran típicamente a un sujeto o se generan en el lugar de forma tal que se hibridan con o se unen a ARNm celular y/o ADN genómico que codifica una proteína marcadora para así inhibir la expresión del marcador, por ej . , inhibiendo la transcripción y/o traducción. La hibridación se puede realizar por complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable, o por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco mayor de la hélice doble. Ejemplos de una vía de administración de moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención incluyen la inyección directa en un sitio de tejido o infusión de un ácido nucleico antisentido en un fluido corporal asociado al trastorno metabólico. De manera alternativa, las moléculas de ácido nucleico antisentido se pueden modificar A/EN células seleccionadas diana y luego se administran sistemáticamente. Por ejemplo, para la administración sistémica, las moléculas antisentido se pueden modificar de forma tal que se unen específicamente a receptores o antígenos expresado en una superficie celular seleccionada, por ej . , enlazando las moléculas de ácido nucleico antisentido con antígenos o receptores superficiales celulares. Las moléculas de ácido nucleico antisentido también se pueden administrar a células usando los vectores descritos en la presente. Para alcanzar concentraciones intracelulares suficientes de moléculas antisentido, se prefieren construcciones de vectores donde la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte pol II o pol II.
Una molécula de ácido nucleico antisentido de la invención puede ser una molécula de ácido nucleico a-anomérico. Una molécula de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos de doble cadena específicos con ARN complementario donde, a diferencia de las -unidades habituales, las cadenas son paralelas entre sí (Gaultier et ál. 1987, Nucleic Acids Res 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido puede comprender también un 21 -o-metilribonucleótido (Inoue et ál., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et ál., 1987, FEBS Lett. 215:327-330) .
La invención también comprende ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalítico con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico de cadena simple, tal como un ARNm con quien tienen una región complementaria. Por lo tanto, las ribozimas (por ej . , las ribozimas cabeza de martillo tal como se describen en Haselhoff and Gerlach, 1988, Nature 334:585-591) se pueden usar para escindir catalíticamente transcripciones de ARNm para así inhibir la traducción de la proteína modificada por el ARNm. Una ribozima que tiene especificidad por una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína marcadora se puede diseñar en función de la secuencia de nucleótidos de un ADNc correspondiente al marcador. Por ejemplo, un derivado de Tetrahymena L-19 IVS ARN se puede construir donde la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementario con la secuencia de nucleótidos a ser escindido (véase, Cech et ál., patente estadounidense N° 4,987,071; y Cech et ál., patente estadounidense N° 5,116,742). De manera alternativa, un ARNm que codifica un polipéptido de la invención se puede usar para seleccionar un ARN catalítico que tiene actividad de ribonucleasa específica de una agrupación de moléculas de ARN (véase, Bartel and Szostak, 1993, Science 261 : 1411-1418 ) .
La invención también comprende moléculas de ácido nucleico que forman estructuras de triple hélice. Por ejemplo, la expresión de un marcador de la invención puede estar inhibida por las secuencias de nucleótidos diana complementarias con la región reguladora del gen que codifica el ácido nucleico o la proteína marcadores (por ej . , el promotor y/o potenciador) para formar estructuras de triple hélice que previenen la transcripción del gel en células diana. Véase, en general,, Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6 (6) : 569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher (1992) Bioassays 14 ( 12 ): 807-15.
En diversas modalidades, las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden modificar en el resto base, resto de azúcar o cadena principal de fosfato para mejorar, por ej . , la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, la cadena principal de desoxirribosa fosfato de los ácidos nucleicos se pueden modificar para generar los ácidos péptidonucleicos (véase Hyrup et ál . , 1996, Bioorganic y Medicinal Chemistry 4(1): 5-23) . Tal como se usa en la presente, los términos "ácidos péptidonucleicos" o "PNA" se refieren a imitaciones de ácido nucleico, por ej . , imitaciones de ADN, donde la cadena principal de desoxirribosa fosfato se reemplaza con una cadena principal de pseudopéptido y solo se retienen las cuatro nucleobases naturales. La cadena principal neutra de PNA ha demostrado permitir la hibridación específicos con ADN y ARN en condiciones de baja fuerza iónica. La síntesis de oligómeros de PNA se puede realizar usando protocolos de síntesis de péptidos de fase sólida estándar tal como se describe en Hyrup et ál. (1996), anteriormente; Perry-0 ' Keefe et ál. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:14670-675.
PNA se puede usar en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, PNA se puede usar como agentes antisentido o antigénicos para la modulación especifica de secuencia de expresión génica mediante, por ej . , inducción de transcripción o detención de traducción o inhibición de replicación. También se pueden usar PNA, por ej . , en el análisis de mutaciones de par base simple en un gen mediante, por ej . , fijación de PCR dirigida a PNA; como enzimas de restricción artificial al usarse en combinación con otras enzimas, por ej . , nucleasas SI (Hyrup (1996), anteriormente; o como sondas o cebadores para secuencia de ADN e hibridación (Hyrup, 1996, anteriormente; Perry-01 Keefe et ál., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:14670-675).
En otra modalidad, PNA se pueden modificar, por ej . , para potenciar su estabilidad o absorción celular, adjuntando grupos lipofilicos u otros grupos que ayudan a PNA, mediante la formación de quimeras PNA-ADN o mediante el uso de liposomas u otras técnicas de administración de fármaco conocidas en la técnica. Dichas quimeras permiten enzimas de reconocimiento de ADN, por ej . , ARNasa H y polimerasas de ADN para interactuar con la porción de ADN mientras que la porción de PNA proporcionaría afinidad y especificidad de unión altas. Las quimeras PNA-ADN se pueden enlazar usando enlaces de longitudes apropiadas seleccionados en función de ampliado de bases, cantidad de uniones entre las nucleobases y orientación (Hyrup, 1996, anteriormente) . La síntesis de quimeras de PNA-ADN se pueden realizar como se describe en Hyrup (1996), anteriormente, y Finn et ál. (1996) Nucleic Acids Res. 24 (17 ): 3357-63. Por ejemplo, una cadena de ADN se puede sintetizar en un soporte sólido usando una química de acoplamiento de fosforamidato estándar y análogos de nucleósido modificado. Compuestos tales como 5'-(4-metoxitritil) amino-5 ' -desoxi-timidina fosforamidito se pueden usar como un enlace entre PNA y el extremo 5' de ADN ( ag et ál., 1989, Nucleic Acids Res. 17:5973-88). Los monómeros de PNA luego se acoplan de forma gradual para producir una molécula quimérica con un segmento de PNA 5' y un segmento de ADN 3' (Finn et á1. , 1996, Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63) . De manera alternativa, las moléculas quiméricas se pueden sintetizar con un segmento de PNA 5' y un segmento de ADN 3' (Peterser et ál., 1975, Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124).
En otras modalidades, el oligonucleótido puede incluir otros grupos adjuntos tales como péptidos (por ej . , para dirigirse a un receptores de células hospedadoras in vivo) , o agentes que facilitan el transporte por la membrana celular (véase, por ej . , Letsinger et ál., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et ál. , 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:648-652; Publicación PCT N° WO 88/09810) o la barrera hematoencefálica (véase, por ej . , Publicación PCT N° WO 89/10134). Además, los oligonucleótidos se pueden modificar con agentes de escisión provocada por hibridación (véase, por ej . , Krol et ál., 1988, Bio/Techniques 6:958-976) o agentes intercalantes (véase, por ej . , Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549). A tales efectos, el oligonucleótido se puede conjugar con otra molécula, por ejemplo, un péptido, un agente de reticulación provocada por hibridación, un agente de transporte, un agente de escisión provocada por hibridación, etc.
La invención también incluye ácidos nucleicos de baliza molecular que tienen al menos una región que es complementaria con un ácido nucleico de la invención, de forma tal que la baliza molecular es útil para cuantificar la presencia del ácido nucleico de la invención en una muestra. Un ácido nucleico de "baliza molecular" es un ácido nucleico que comprende un par de regiones complementarias y que tienen un fluoróforo y un extintor fluorescente asociado al mismo. El fluoróforo y el extintor están asociados a diferentes porciones de ácido nucleico en tal orientación que cuando las regiones complementarias están templadas entre si, la fluorescencia del fluoróforo se inactiva mediante el extintor. Cuando las regiones complementarias del ácido nucleico no están templadas entre si, la fluorescencia del fluoróforo se inactiva hasta un nivel menor. Los ácidos nucleicos de baliza molecular se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense 5,876,930. 2. Anticuerpos y proteínas aislados Un aspecto de la invención se refiere a proteínas marcadoras aisladas y porciones biológicamente activas de las mismas, así como fragmentos de polipéptidos adecuados para su uso como inmunógenos para aumentar anticuerpos dirigidos contra una proteína marcadora o un fragmento de la misma. En una modalidad, la proteína marcadora nativa se pueden aislar de fuentes celulares o tisulares mediante un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de proteina estándar. En otra modalidad, una proteina o péptido que comprende toda o un segmento de la proteina marcadora se produce mediante técnicas de ADN recombinante . De manera alternativa a la expresión recombinante, dicha proteina o péptido se puede sintetizar químicamente usando técnicas de síntesis de péptidos estándar.
Una proteína "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de la misma es sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de donde deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos al sintetizarse químicamente. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteínas donde la proteína está separada de componentes celulares de las células a partir de las cuales se aislan o producen recombinantemente . Por lo tanto, la proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones que tienen menos de alrededor de 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína heteróloga (también referida en la presente como "proteína contaminante"). Cuando la proteína o la porción biológicamente activa de la misma se produce recombinantemente, también es preferentemente sustancialmente libre de medio cultivo, esto es, medio de cultivo representa menos de alrededor de 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de proteína. Cuando la proteína se produce por síntesis química, es preferentemente sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos, esto es, está separada de los precursores químicos u otros compuestos químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína. Por consiguiente, dichas preparaciones de la proteína tienen menos de alrededor del 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos diferentes del polipéptido de interés.
Las porciones biológicamente activas de una proteína marcadora incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticos a o derivados de la secuencia de aminoácidos de la proteína marcadora, que incluye menos aminoácidos que la proteína de longitud completa y exhibe al menos una actividad de la proteína de longitud completa correspondiente. Típicamente, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína de longitud completa correspondiente. Una porción biológicamente- activa de una proteína marcadora de la invención puede ser un polipéptido que es, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Además, otras porciones biológicamente activas donde otras regiones de la proteína marcadora están eliminadas, se pueden preparar mediante técnicas recombinantes y evaluar para una o más de las actividades funcionales de la forma nativa de la proteína marcadora.
Las proteínas marcadoras preferidas se codifican mediante secuencias de nucleótidos que comprenden la secuencia de cualquiera de SEQ ID NO (nts) . Otras proteínas útiles son sustancialmente idénticas (por ej , al menos alrededor de 40%, preferentemente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%) a una de estas secuencias y retienen la actividad funcional de la correspondiente proteína marcadora de origen natural que aún difieren en la secuencia de aminoácidos debido a la variación alélica natural o mutagénesis.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ej . , se pueden introducir en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico) . Los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos luego se comparan. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, luego las moléculas son idénticas en esa posición. Preferentemente, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias se calcula usando una alineación global. De manera alternativa, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias se calcula usando una alineación local. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (esto es, % de identidad = # de posiciones idénticas/# total de posiciones (por ej . , posiciones superpuestas) xlOO) . En una modalidad, las dos secuencias tienen la misma longitud. ' En otra modalidad, las dos secuencias no tienen la misma longitud.
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático usado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin and Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado con en Karlin and Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul, et ál. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Las búsguedas de nucleótido BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una molécula de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con un programa BLASTP, puntuación= 50, longitud de palabra= 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una molécula de proteína de la invención. Para obtener alineaciones incompletas para fines de comparación, se puede usar una versión más nueva del algoritmo BLAST llamada Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et ál. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, que es capaz de realizar alineaciones locales incompletas para los programas BLASTN, BLASTP y BLASTX. De manera alternativa, PSI-Blast se puede usar para realizar una búsqueda repetida que detecta relaciones distantes entre moléculas. Al usar programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden usar los parámetros por defecto de los correspondientes programas (por ej., BLASTX y BLASTN) . Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo preferido no limitante de un algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, (1988) CABIOS 4:11-17. Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alienación de secuencia GCG. Al usar el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una tabla de residuos de peso ?? 12?, una penalización de longitud de brecha de 12, una penalización de brecha de 4. Aun otro algoritmo para identificar regiones de similitud y alineación de secuencia local es el algoritmo FASTA tal como se describe en Pearson and Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444-2448. Al usar el algoritmo FASTA para comparar secuencias de nucleótidos o aminoácidos, una tabla de residuo de peso PAM120 se puede usar, por ejemplo, con un valor ¿--tupia de 2.
El porcentaje de identidad entre las dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a las descritas anteriormente, con o sin permitir brechas. Al calcular el porcentaje de identidad solo se cuentan las correspondencias.
La invención también proporciona proteinas quiméricas o de fusión que comprenden una proteina marcadora o un segmento de la misma. Tal como se usa en la presente, una "proteinas quimérica" o "proteina de fusión" comprende toda o una parte (preferentemente una parte biológicamente activa) de una proteina marcadora enlazada a un polipéptido heterólogo (esto es, un polipéptido distinto de la proteina marcadora) . Dentro de la proteina de fusión, el término "enlazada de forma operativa" pretende indicar que la proteina marcadora o el segmento de la misma y el polipéptido heterólogo se fusionan dentro del marco entre si. El polipéptido heterólogo puede estar fusionado con la terminal amino o la terminal carboxilo de la proteina marcadora o segmento.
Una proteina de fusión útil es una proteina de fusión GST donde una proteina marcadora o segmento se fusiona a la terminal carboxilo de las secuencias GST. Dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de un polipéptido recombinante de la invención.
En otra modalidad, la proteína de fusión contiene una secuencia de señal heteróloga en su terminal amino. Por ejemplo, la secuencia de señal nativa de una proteína marcadora se puede quitar y reemplazarse con una secuencia de señal de otra proteína. Por ejemplo, la secuencia secretora gp67 de la proteína del envoltorio de baculovirus también se puede usar como una secuencia de señal heteróloga (Ausubel et ál., ed., Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley y Sons, NY, 1992) . Otros ejemplos de secuencias de señal heteróloga eucariota incluyen las secuencias secretoras de melitina y fosfatasa alcalina placentaria humana (Stratagene; La Jolla, California) . En aun otro ejemplo, secuencias de señal heteróloga procariota útiles incluyen la señal secretora phoA (Sambrook et ál. , anteriormente) y la señal secretora de proteina A (Pharmacia Biotech; Piscataway, Nueva Jersey) .
En aun otra modalidad, la proteina de fusión es una proteina de fusión de inmunoglobulina donde toda o parte de una proteina marcadora se fusiona con secuencias derivadas de un miembro de la familia de la proteina inmunoglobulina. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas y se pueden administrar a un sujeto para inhibir una interacción entre un ligando (soluble o unido a la membrana) y una proteína en la superficie de una célula (receptor) para así suprimir la transducción de señal in vivo. La proteína de fusión de inmunoglobulina se puede usar para afectar la biodisponibilidad de un ligando afín de una proteína marcadora. La inhibición de la interacción ligando/receptor puede ser útil terapéuticamente, tanto para tratar trastornos proliferativos y diferenciales como para modular (por ej . , promover o inhibir) la supervivencia celular. Además, las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos dirigidos a una proteína marcadora en un sujeto, para purificar ligandos y en ensayos de clasificación para identificar moléculas que inhiben la interacción de la proteína marcadora con ligandos.
Las proteínas quiméricas y de fusión de la invención se pueden producir mediante técnicas de ADN recombihante estándar. En otra modalidad, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. De manera alternativa, la amplificación de PCR de los fragmentos de gen se pueden realizar usando cebadores ancla que producen excedentes entre dos fragmentos de gen consecutivos que puede estar posteriormente templado y reamplificado para generar una secuencia de gen quimérica (véase, por ej . , Ausubel et ál . , anteriormente) . Además, varios vectores de expresión están comercialmente disponibles y codifican un resto de fusión (por ej . , un polipéptido GST) . Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención se puede clonar en dicho vector de expresión de manera tal que el resto de fusión esté enlazado dentro del marco con el polipéptido de la invención.
Una secuencia de señal se puede usar para facilitar la secreción y aislamiento de proteínas marcadoras. Las secuencias de señal están caracterizadas típicamente por un núcleo de aminoácidos hidrofóbicos que se escinden generalmente desde la proteína marcadora durante la secreción en uno o más eventos de escisión. Dichos péptidos de señal contienen sitios de procesamiento que permiten la escisión de la secuencia de señal desde las proteínas maduras a medida que pasan a través de la vía secretora. Por lo tanto, la invención se refiere a proteínas marcadoras, proteínas de fusión o segmentos de las mismas que tienen una secuencia de señal así como a dichas proteínas de donde se escinde proteoliticamente la secuencia de señal (esto es, los productos de escisión) . En una modalidad, la secuencia de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de señal puede estar enlazada de forma operativa en un vector de expresión con una proteína de interés, tal como una proteína marcadora o un segmento de la misma. La secuencia de señal dirige la secreción de la proteína, tal como desde el hospedador eucariota donde el vector de expresión se transforma y la secuencia de señal se escinde posteriormente o simultáneamente. La proteína entonces se puede purificar fácilmente desde el medio extracelular mediante técnicas reconocidas en la técnica. De manera alternativa, la secuencia de señal se puede enlazar con la proteína de interés usando una secuencia que facilita la purificación, tal como con un dominio GST.
La presente invención también se refiere a variantes de las proteínas marcadoras. Dichas variantes tienen una secuencia de aminoácidos alterada que pueden funcionar como agonistas (miméticos) o antagonistas. Las variantes se pueden generar por mutagénesis, por ej . , mutación puntual discreta o truncación. Un agonista puede retener sustancialmente las mismas, o un subgrupo de actividades biológicas de la forma de origen natural de la proteína. Un antagonista de una proteína puede inhibir una o más de las actividades de la forma de origen natural de la proteína, por ejemplo, uniendo competitivamente a un miembro corriente abajo o corriente arriba de una cascada de señalización celular que incluye la proteína de interés. Por lo tanto, los efectos biológicos específicos se pueden provocar mediante el tratamiento con una variedad de función limitada. El tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subgrupo de actividades biológicas de la forma de origen natural de la proteína puede tener menos efectos secundarios en un sujeto con respecto al tratamiento con una forma de origen natural de la proteína.
Las variantes de una proteína marcadora que funcionan ya sea como agonistas (miméticos) o antagonistas se pueden identificar analizando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ej . , mutantes de truncación de la proteína de la invención para actividad de agonista o antagonista. En una modalidad, se genera una biblioteca variegada de variantes mediante mutagénesis combinatoria en el nivel de ácido nucleico y se codifica mediante una biblioteca de genes variegada. Una biblioteca variegada de variantes se puede producir, por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias genéticas de manera tal que un set degradado de secuencias de proteína potencial sea expresable como polipéptidos individuales o de manera alternativa como un gran set de proteínas de fusión (por ej . , para visualización de fagos) . Existe una variedad de métodos que se pueden usar para producir bibliotecas de posibles variantes de proteína marcadoras de una secuencia de oligonucleótidos degradada. Se conocen en la técnica métodos para degradar oligonucleótidos (véase, por ej . , Narang, 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura et ál., 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et ál., 1984, Science 198:1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acid Res. 11:477).
Además, las bibliotecas de segmentos de una proteina marcadora se pueden usar para genera una población variegada de polipéptidos para análisis y posterior selección de proteínas marcadoras variantes o segmentos de la mismas. Por ejemplo, una biblioteca para codificar fragmentos de secuencia de codificación se puede generar tratando un fragmento PCR de cadena doble de la secuencia de codificación de interés con una nucleasa en condiciones donde ocurre un corte solo una vez por molécula, desnaturalizando el ADN de cadena doble, renaturalizando el ADN para formar ADN de cadena doble que puede incluir pares sentido/antisentido de diferentes productos cortados, quitando porciones de cadena simple de dúplex reformados mediante el tratamiento con nucleasa SI y ligando la biblioteca de fragmento resultante en un vector de expresión. Mediante este método, se puede derivar una biblioteca de expresión que codifica la terminal amino y los fragmentos internos de diversos tamaños de la proteína de interés.
Se conocen en la técnica diversas técnicas para analizar productos genéticos de bibliotecas combinatorias realizadas por mutaciones puntuales o truncación y para analizar en bibliotecas de ADNc productos que tienen propiedad seleccionada. Las técnicas usadas más generalmente que son susceptibles de análisis de caudal alto para analizar grandes bibliotecas de genes, incluyen típicamente clonar la biblioteca de genes en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la biblioteca resultante de vectores y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis de conjunto recursivo ( EM) , una técnica que mejora la frecuencia de los mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinación con ensayos de clasificación para identificar variantes de una proteina de la invención (Arkin and Yourvan, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et ál. , 1993, Protein Engineering 6(3):327- 331).
Otro aspecto de la invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra una proteina de la invención. En modalidades preferidas, los anticuerpos se unen específicamente a una proteína marcadora o un fragmento de la misma. Los términos "anticuerpo" o "anticuerpos" tal como se usan de forma intercambiable en la presente se refieren a moléculas de inmunoglobulina así como fragmentos y derivados de las mismas que comprenden una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina (esto es, dicha porción contiene un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a un antígeno, tal como una proteína marcadora, por ej . , un epítopo de una proteína marcadora) . Un anticuerpo que se une específicamente a una proteína de la invención es un anticuerpo que se une a la proteína pero que no se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra, una muestra biológica que contiene naturalmente la proteína. Ejemplos de una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina incluyen, a modo no taxativo, anticuerpos de cadena simple (scAb) , fragmentos F(ab) y F(ab' )2.
Una proteína aislada de la invención o un fragmento de la misma se puede usar como un inmunógeno para generar anticuerpos. La proteína de longitud completa se puede usar o, de manera alternativa, la invención proporciona fragmentos de péptido antigénico para su uso como inmunógenos. El péptido antigénico de una proteína de la invención comprende al menos 8 (preferentemente 10, 15, 20 o 30 o más) residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de una de las proteínas de la invención y comprende al menos un epítopo de la proteína de forma tal que un anticuerpo preparado a partir de péptidos forman un complejo inmune específico con la proteína. Epítopos preferidos comprendidos por el péptido antigénico son regiones que están ubicadas en la superficie de la proteína, por ej . , regiones hidrofílicas . El análisis de la secuencia de hidrofobicidad, el análisis de la secuencia de hidrofilicidad o análisis similares se pueden usar para identificar regiones hidrofílicas . En modalidades preferidas, una proteína marcadora aislada o fragmento de la misma se usa como inmunógeno.
Un inmunógeno se usa típicamente para preparar anticuerpos inmunizando un sujeto adecuado (esto es, inmunocompetente) tal como un conejo, cabra, ratón u otro mamífero o vertebrado. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, una proteína o un péptido expresado de forma recombinante o sintetizado de forma química. La preparación puede incluir adicionalmente un adyuvante, tal como un adyuvante completo o incompleto de freund o un agente inmunoestimulador similar. Las composiciones de inmunógeno preferidas son Aquellas que no contienen otras proteínas humanas tales como, por ejemplo, composiciones de inmunógeno realizadas usando una célula hospedadora no humana para expresión recombinante de una proteína de la invención. De tal forma, las composiciones de anticuerpo resultantes tienen unión reducida o ninguna de proteínas humanas diferentes de una proteína de invención.
La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales . El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", tal como se usa en la presente, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solamente una especie de un sitio de unión al antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular. Las composiciones policlonales y monoclonales preferidas son las que han sido seleccionadas para anticuerpos dirigidos contra una proteína de la invención. Preparaciones preferidas de anticuerpos policlonales y monoclonales son las que contienen solamente anticuerpos dirigidos contra una proteína marcadora ' o fragmento de la misma.
Los anticuerpos policlonales se pueden preparar inmunizando un sujeto adecuado con una proteína de la invención como un inmunógeno. El titulo de anticuerpo en el sujeto inmunizado se puede controlar con el paso del tiempo mediante técnicas estándar, tal como con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) usando un polipéptido inmovilizado. Un tiempo apropiado luego de la inmunización, por ej . , cuando los títulos de anticuerpo especifico son superiores, las células que producen anticuerpos se pueden obtener del sujeto y se usan para preparar anticuerpos monoclonales (mAb) mediante técnicas estándar, tales como técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497, la técnica de hibridoma de células B humanas (véase Kozbor et ál., 1983, Immunol. Today 4:72), la técnica de EBV-hibridoma (véase Colé et ál., pp. 77-96 In Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985) o técnicas de trioma. Se conoce la tecnología para producir hibridomas (véase en general Current Protocols in Immunology, Coligan et ál. ed., John iley y Sons, Nueva York, 1994). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo de la invención se detectan mediante el análisis de sobrenadantes de cultivo de hibridoma para anticuerpos que unen el polipéptido de interés, por ej . , usando un ensayo ELISA estándar.
De manera alternativa a la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, se puede identificar y aislar un anticuerpo monoclonal dirigido contra una proteína de la invención mediante el análisis de una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria recombinante (por ej . , una biblioteca de visualización de fagos y anticuerpos) con el polipéptido de interés. Kits para generar y analizar las bibliotecas de visualización de fagos están disponibles comercialmente (por ej . , Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, N° de catálogo 27-9400-01; y Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, N° de catálogo 240612) . De manera adicional, ejemplos de métodos y reactivos particularmente susceptibles para su uso en la creación y análisis de una biblioteca de visualización de anticuerpos se puede encontrar en, por ejemplo, patente estadounidense N° 5,223,409; Publicación PCT N° WO 92/18619; Publicación PCT N° O 91/17271; Publicación PCT N°WO 92/20791; Publicación PCT N°. WO 92/15679; Publicación PCT N° WO 93/01288; Publicación PCT N° WO 92/01047; Publicación PCT N° . WO 92/09690; Publicación PCT N° WO 90/02809; Fuchs et ál. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et ál. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et ál. (1989) Science 246:1275- 1281; Griffiths et ál. (1993) EMBO J. 12:725-734.
La invención también proporciona anticuerpos recombinantes que se unen específicamente a una proteína de la invención. En modalidades preferidas, los anticuerpos recombinantes se unen específicamente a una proteína marcadora o un fragmento de la misma. Anticuerpos recombinantes incluyen, a modo no taxativo, anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto porciones humanas como no humanas, anticuerpos de cadena simple y anticuerpos multiespecíficos . Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual derivan diferentes porciones del anticuerpo a partir de especies de animales diferentes, tales como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. (Véase, por ej . , Cabilly et ál., patente estadounidense N° 4.816.567; y Boss et ál., 4.816.397, que se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia) . Los anticuerpos de cadena simple tienen un sitio de unión al antigeno y consisten en un polipéptido simple. Se pueden producir mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo usando métodos descritos en Ladner et. ál, patente estadounidense N° 4,946,778 (que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia); Bird et ál., (1988) Science 242:423-426; Whitlow et ál., (1991) Methods in Enzymology 2:1-9; Whitlow et ál., (1991) Methods in Enzymology 2:97-105; y Huston et ál., (1991) Methods in Enzymology Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications 203:46-88. Anticuerpos multiespecificos son moléculas de anticuerpo que tienen al menos dos sitios de unión al antigeno que se unen específicamente a diferentes antígenos. Dichas moléculas se pueden producir mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo usando métodos descritos en Segal, patente estadounidense N° 4,676,980 (cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia) ; Holliger et ál., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Whitlow et ál., (1994) Protein Eng. 7:1017-1026 y patente estadounidense N° 6,121,424.
Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos a partir de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de especies no humanas y una región flanqueante de una molécula de inmunoglobulina humana. (Véase, por ej . , Queen, patente estadounidense N° 5,585,089, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia) . Anticuerpos monoclonales humanizados se pueden producir mediante técnicas conocidas de ADN recombinante, por ejemplo usando métodos descritos en la Publicación PCT N° O 87/02671; solicitud de patente europea 184,187; solicitud de patente europea 171,496; solicitud de patente europea 173,494; Publicación PCT N° WO 86/01533; patente estadounidense N° 4,816,567; solicitud de patente europea 125,023; Better et ál. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et ál. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et ál. (1987) J. Immunol. 139:3521- 3526; Sun et ál. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et ál. (1987) Cáncer Res. 47:999-1005; ood et ál. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et ál. (1988) J. Nati. Cáncer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et ál. (1986) Bio/Techniques 4:214; patente estadounidense 5,225,539; Jones et ál. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et ál. (1988) Science 239:1534; y Beidler et ál. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.
Más particularmente, los anticuerpos humanizados se pueden producir, por ejemplo, usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina endógena pero que pueden expresar genes de cadena pesada y ligera humana. Los ratones transgénicos se inmunizan de manera corriente con un antigeno seleccionado, por ej . , todo o una porción de un polipéptido que corresponde a un marcador de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno se pueden obtener usando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reconfiguran durante la diferenciación de células B y posteriormente experimentan cambio de clases y mutación somática. POR consiguiente, mediante el uso de dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA e IgE terapéuticamente útiles. Para un resumen de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65--93). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos, véase, por ej., patente estadounidense 5,625,126; patente estadounidense 5,633,425; patente estadounidense 5,569,825; patente estadounidense 5,661,016; y patente estadounidense 5,545,806. Además, las compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) , se pueden contratar para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando una tecnología similar a la descrita anteriormente.
Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epitopo seleccionado se pueden generar utilizando una técnica referida como "selección guiada". En este enfoque, se utiliza un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ej . , un anticuerpo murino para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epitopo.
Los anticuerpos de la invención se pueden aislar luego de la producción (por ej . , de la sangre o suero del sujeto) o síntesis y se pueden purificar adicionalmente mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, los anticuerpos IgG se pueden purificar usando cromatografía de proteína A. Los anticuerpos específicos para una proteína de la invención se pueden seleccionar (por ej . , purificar parcialmente) o purificar por, por ej . , cromatografía de afinidad. Por ejemplo, una proteína expresada y purificada recombinantemente (o parcialmente purificada) de la invención se produce tal como se describe en la presente y está acoplada de forma covalente o no covalente a un soporte sólido tal como, por ejemplo, una columna de cromatografía. La columna luego se puede usar para anticuerpos para purificar afinidad específicos para las proteínas de la invención de una muestra que contiene anticuerpos dirigidos contra una gran cantidad de diferentes epítopos, así generando uña composición de anticuerpo purificada sustancialmente, esto es, una sustancialmente libre de anticuerpos contaminantes. Por una composición de anticuerpo sustancialmente purificado se quiere decir, en este contexto, que la muestra de anticuerpo contiene como mucho solo 30% (en peso seco) de anticuerpos contaminantes dirigidos contra epítopos que no son los de la proteína deseada de la invención y preferentemente como mucho 20%, aun más preferentemente como mucho 10% y más preferentemente como mucho 5% (en peso seco) de la muestra son anticuerpos contaminantes. Una composición purificada significa que al menos el 99% de los anticuerpos en la composición está dirigido contra la proteina deseada de la invención.
En una modalidad preferida, los anticuerpos sustancialmente purificados de la invención se pueden unir específicamente a un péptido de señal, una secuencia secretada, un dominio extracelular, una transmembrana o un dominio citoplásmico o membrana citoplásmica de una proteína de la invención. En una modalidad particularmente preferida, los anticuerpos sustancialmente purificados de la invención se unen específicamente a una secuencia secretada o un dominio extracelular de las secuencias de aminoácidos de una proteína de la invención. En una modalidad más preferida, los anticuerpos sustancialmente purificados de la invención se unen específicamente a una secuencia secretada o un dominio extracelular de las secuencias de aminoácidos de una proteína marcadora .
Un anticuerpo dirigido contra una proteína de la invención se puede usar para aislar la proteína mediante técnicas estándar, tal como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación . Además, dicho anticuerpo se puede usar para detectar la proteína marcadora o fragmento de la misma (por e'j . , en un lisado celular o sobrenadante celular) para evaluar el nivel y el patrón de expresión del marcador. Los anticuerpos también se pueden usar en forma de diagnóstico para controlar los niveles de proteina en tejidos o fluidos corporales (por ej . , en fluido corporal asociado a un trastorno metabólico) como parte de un procedimiento de ensayos clínicos, por ej . , para, por ejemplo, determinar la eficacia de determinado régimen de tratamiento. La detección se puede facilitar mediante el uso de un derivado de anticuerpo, que comprende un anticuerpo de la invención acoplado con una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminescente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminescentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.
Los anticuerpos de la invención también se pueden usar como agentes terapéuticos en el tratamiento de trastornos metabólicos. En una modalidad preferida, los anticuerpos completamente humanos de la invención se usan para tratamiento terapéutico de pacientes humanos con trastornos metabólicos, en particular aquellos que tienen diabetes u obesidad. En otra modalidad preferida, los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína marcadora o fragmento de la misma se usan para tratamiento terapéutico. Adicionalmente, dicho anticuerpo terapéutico puede ser un derivado de anticuerpo o una inmunotoxina que comprende un anticuerpo conjugado con un resto terapéutico tal como una citotoxina, un agente terapéutico o un ion metálico radioactivo. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Ejemplos incluyen taxol, citohalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio emetina, mitomcina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides , procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Agentes terapéuticos incluyen, a modo no taxativo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluoroacil decarbazina) , agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino) ; antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (antiguamente daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antiguamente actinomicina) , bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) ) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) .
Los anticuerpos conjugados de la invención se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada, para que el resto de fármaco no se interprete como limitado a agentes terapéuticos químicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como una proteína que inhibe ribosoma (véase Better et ál., patente estadounidense N° 6,146,631, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad) , abrina, ricina A, pseudomonas exotoxina o toxina de la difteria; una proteína tal como factor de necrosis tumoral, alfa-interferón, ß-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador tisular del plasminógeno; o, modificadores de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de colonia de macrofase de granulocitos ( "G -CSF" ) , factor estimulante de colonia de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento .
Técnicas para conjugar dicha porción terapéutica con anticuerpos son bien conocidas, véase por ejemplo, Arnon et ál., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy, " in Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et ál. (eds.), pp. (eds.), pp. 24356 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et ál., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et ál. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", in onoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et ál. (eds.), pp. 475-506 (1985) ; "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et ál. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et ál., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporcionar anticuerpos sustancialmente purificados, fragmentos y derivados de anticuerpos, que se unen a una proteina de la invención y preferentemente, a una proteina marcadora. En diversas modalidades, los anticuerpos sustancialmente purificados de la invención o fragmentos o derivados de los mismos pueden ser anticuerpos humanos, no humanos, quiméricos y/o humanizados. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporcionar anticuerpos sustancialmente purificados, fragmentos y derivados de anticuerpos, que se unen a una proteina de la invención y preferentemente, a una proteina marcadora. Dichos anticuerpos no humanos pueden ser anticuerpos de cabra, ratón, oveja, caballo, pollo, conejo o rata. De manera alternativa, los anticuerpos no humanos de la invención puede ser anticuerpos quiméricos y/o humanizados. Además, los anticuerpos no humanos de la invención pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales . En aun un aspecto adicional, la invención proporciona anticuerpos monoclonales, fragmentos y derivados de anticuerpos, que se unen a una proteina de la invención y preferentemente, a una proteina marcadora. Los anticuerpos monoclonales pueden ser anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos y/o no humanos.
La invención también proporciona un kit que contiene un anticuerpo de la invención conjugada con una sustancia detectable e instrucciones para su uso. Aun otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención. En una modalidad, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. 3. Medicina predictiva La presente invención se refiere al campo de la medicina predictiva donde los ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico, farmacogenómica y el monitoreo de ensayos clínicos se usan para fines de pronóstico (predictivos ) para así tratar un individuo de forma profiláctica. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico para determinar el nivel de expresión de una o más proteínas marcadoras o ácidos nucleicos para determinar si un individuo corre el riesgo de desarrollar un trastorno metabólico. Dichos ensayos se pueden usar para fines de pronóstico o predictivos para asi tratar de forma profiláctica un individuo antes de la aparición del trastorno .
Aun otro aspecto de la invención se refiere a controlar la influencia de agentes (por ej . , fármacos u otros compuestos administrados ya sea para inhibir un trastorno metabólico o para tratar o prevenir cualquier otro trastorno {esto es, para entender cualquier efecto carcinogénico que pueda tener dicho tratamiento) . Estos y otros agentes se describen más detalladamente en las siguientes secciones.
A. Ensayos de diagnóstico Un ejemplo de un método para detectar la presencia o ausencia de una proteina marcadora o ácido nucleico en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica (por ej . , un fluido corporal asociado con un trastorno metabólico) de un sujeto de prueba y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar el polipéptido o el ácido nucleico (por ej . , ARNm, ADN genómico o ADNc) . Los métodos de detección de la invención pueden, por lo tanto, detectar ARNm, proteina, ADNc o ADN genómico, Por ejemplo, en una muestra biológica in vitro asi como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección de ARNm incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de una proteina marcadora incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) , transferencias Western, inmurtoprecipitaciones e inmunofluorescencia . Las técnicas in vitro para la detección de ADN genómico incluyen hibridaciones Southern. Las técnicas in vivo para la detección de ARNm incluyen reacción en cadena de polimerasa (PCR) , hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Adicionalmente, las técnicas in vivo para la detección de una proteína marcadora incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo etiquetado dirigido a la proteína o fragmento de la misma. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un marcador radioactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto se puede detectar mediante técnicas de imagenología estándar.
Un principio general de dichos ensayos de diagnóstico y pronóstico implica preparar una muestra o mezcla de reacción que - puede contener un marcador y una sonda en condiciones apropiadas y por un tiempo suficiente para permitir que el marcador y la sonda interactúen y se unan, formando así un complejo que se pueda quitar y/o detectar en la mezcla de reacción. Estos ensayos se pueden dirigir en una variedad de formas .
Por ejemplo, un método para dirigir dicho ensayo implica anclar el marcador o la sonda en un soporte de fase sólida, también referidas como un sustrato y detectar complejos de marcador/sonda diana anclados en la fase sólida al final de la reacción. En una modalidad de dicho método, una muestra de un sujeto que se pretende ensaya para presencia y/o concentración de marcador, se puede anclar en un portador o soporte de fase sólida. En otra modalidad, la situación inversa también es posible, donde la sonda se puede anclar a una fase sólida y la muestra de un sujeto se puede hacer reaccionar como un componente no anclado del ensayo.
Existen muchos métodos establecidos para anclar componentes de ensayo a una fase sólida. Estos incluyen, a modo no taxativo, moléculas de marcador o sonda que se inmovilizan a través de la conjugación de bitiona y estreptavidina. Dichos componentes de ensayo biotinilado pueden prepararse a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando métodos conocidos en la técnica (por ej . , kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL) , e inmovilizarse en los pocilios de las placas de 96 pocilios revestidos con estreptavidina (Pierce Chemical) . En determinadas modalidades, las superficies con componentes de ensayo inmovilizado se pueden preparar con antelación y almacenar .
Otros portadores adecuados o soportes de fase sólida para dichos ensayos incluyen cualquier material capaz de unir la clase de molécula a la que pertenece el marcador o sonda. Los soportes o portadores conocidos incluyen, a modo no taxativo, vidrio, poliestireno, nilón, polipropileno, nilón, polietileno, dextrano, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita.
Para dirigir los ensayos con los enfoques antemencionados, se agrega el componente no inmovilizado a la fase sólida sobre la cual se ancla el segundo componente. Luego de que la reacción se completa, se quitan los compuestos no complejados (por ej . , mediante lavado) en condiciones tales que se forman complejos que permanecerán inmovilizados en la fase sólida. La detección de complejos marcador/sonda anclados a la fase sólida se puede lograr por medio de una cantidad de métodos resumidos en la presente.
En una modalidad preferida, la sonda, al estar anclada al componente de ensayo, se puede etiquetar con el fin de detección y lectura del ensayo, ya sea directa o indirectamente, con marcadores detectables discutidos en la presente y conocidos para los expertos en la técnica.
También es posible detectar directamente la formación de un complejo marcador/sonda sin manipulación adicional o marcado de cualquiera de los componentes (marcador o sonda), por ejemplo, utilizando la técnica de transferencia de energía de fluorescencia (véase, por ejemplo, Lakowicz et ál., patente estadounidense N° 5,631,169; Stavrianopoulos, et ál.t patente estadounidense N° 4,868,103). Un marcador de fluoróforo en la primera molécula "donante" se selecciona de forma tal que, tras excitación con luz incidente de una longitud de onda apropiada, su energía fluorescente emitida será absorbida por un marcador fluorescente en una segunda molécula "aceptora" que a su vez es capaz de fluorescer debido a la energía absorbida. De manera alternativa, la molécula de proteína "donante" puede simplemente utilizar la energía fluorescente natural de residuos de triptofano. Se eligen marcadores que emiten diferentes longitudes de onda de luz de forma tal que el marcador de molécula "aceptora" se puede diferenciar de la "donante". Dado que la eficacia de la transferencia de energía entre los marcadores está relacionada con la distancia que separa las moléculas, se pueden evaluar las relaciones espaciales entre las moléculas. En una situación en la que ocurre una unión entre las moléculas, la emisión fluorescente de un marcador de una molécula "aceptora" en el ensayo debería ser máxima. Un evento de unión FET se puede medir convenientemente a través de medios de detección fluorométrica estándar conocidos en la técnicas (por ej . , usando un fluorímetro) .
En otra modalidad, la determinación de la capacidad de una sonda de reconocer un marcador se puede lograr sin marcar ya sea el componente (sonda o marcador) utilizando una tecnología tal como un análisis de interacción biomolecular en tiempo real (BIA) (por ej . , Sjolander, S. y Urbaniczky, C, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et ál., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Tal como se usa en la presente "BIA" o "resonancia de plasmones superficiales" es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real sin marcar ninguna de las reactantes (por ej . , BIAcore) . Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativo de un evento de unión) da como resultado alteraciones del índice refractivo de la luz cercano a la superficie (el fenómeno óptico de la resonancia de plasmones superficiales (SPR) ) , da como resultado una señal detectable que se puede usar como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.
De manera alternativa, en otra modalidad, se pueden dirigir ensayos análogos de diagnóstico y pronóstico con un marcador y una sonda como solutos en fase liquida. En dicho ensayo, el marcador y la sonda complejadas están separados de los componentes no complejados por cualquier cantidad de técnicas estándar, incluidas, a modo no taxativo: centrifugación diferencial, cromatografía, electroforesis e inmunoprecipitación. En centrifugación diferencial, los complejos marcador/sonda pueden estar separados de componentes de ensayo no complejados a través de una serie de pasos de centrífuga, debido al equilibrio de sedimentación diferente de complejos con base en sus diferentes tamaños y densidades (véase, por ejemplo, Rivas, G., and Minton, A.P., 1993, Trends Biochem Sci. 18 ( 8 ) : 284-7 ) . Las técnicas cromatográficas estándar también se pueden utilizar para separar moléculas complejadas de las no complejas. Por ejemplo, la cromatografía de filtración por gel separa moléculas en función del tamaño y a través de la utilización de una resina de filtración por gél apropiada en formato de columna, por ejemplo, el complejo relativamente grande se puede separar de los componentes no complejados relativamente pequeños. De manera similar, las propiedades de carga relativamente diferentes del complejo marcador/sonda en comparación con los componentes no complejados se pueden aprovechar para diferenciar el complejo de componentes no complejados, por ejemplo mediante la utilización de resinas de cromatografía de intercambio de iones. Dichas resinas y técnicas cromatográficas son conocidas para los expertos en la técnica (véase, por ej . , Heegaard, N.H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11 (1-6) : 141-8; Hage, D.S., y Tweed, S.A. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10 ; 699 ( 1-2 ) : 99-525 ) . La electroforesis en gel también se puede emplear para separar componentes de ensayo complejados separados de componente no unidos (véase, por ej . , Ausubel et al., ed., Current Protocole in Molecular Biology, John iley y Sons, Nueva York, 1987-1999) . En esta técnica, los complejos de proteína o ácido nucleico se separan en función de tamaño o carga, por ejemplo. Para mantener la interacción de unión durante el proceso de electroforesis, se prefieren típicamente materiales y condiciones de gel no desnaturalizante en ausencia de agente de reducción. Las condiciones apropiadas para el ensayo particular y los componentes del mismo son conocidos para un experto en la técnica .
En una modalidad particular, es posible determinar el nivel de ARNm marcador por in situ e in vitro en una muestra biológica usando métodos conocidos en la técnica. Se pretende que el término "muestra biológica" incluya tejidos, células, fluidos biológicos y aislados de los mismos, aislados de un sujeto, así como también de tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Diversos métodos de detección de expresión usan ARN aislado. Para métodos in vitro, es posible utilizar cualquier técnica de aislamiento de ARN que no seleccione en comparación con el aislamiento de ARNm para la purificación del ARN de las células con trastorno metabólico (véase, por ej . , Ausubel et ál., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, Nueva York 1987-1999) . De manera adicional, es posible procesar fácilmente grandes cantidades de muestras de tejido usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, el proceso de aislamiento de ARN de un paso de Chomczynski (1989, patente estadounidense N° 4,843, 155) .
El ARNm aislado se puede usar en ensayos de amplificación o hibridación que incluyen, a modo no taxativo, análisis Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de polimerasa y matrices de sonda. Un método de diagnóstico preferido para la detección de los niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que se puede hibridar al ARNm codificado por el gen que se detecta. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ADNc de longitud completa, o una porción del mismo, tal como un oligonucleotido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridarse específicamente en condiciones estrictas a un ARNm o ADN genómico que codifican un marcador de la presente invención. En la presente se describen otras sondas adecuadas para uso en los ensayos de diagnóstico de la invención. La hibridación de un ARNm con la sonda indica que se está expresando el marcador en cuestión.
En un formato, el ARNm se inmoviliza en una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo ejecutando el ARNm aislado en un gel de agarosa y transfiriendo al ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa . En un formato alternativo, la(s) sonda (s) se inmovilizan en una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con la(s) sonda (s), por ejemplo, en una matriz gene chip Affymetrix. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente métodos de detección de ARNm conocidos para usar para detectar el nivel de ARNm codificado por los marcadores de la presente invención.
Un método alternativo para determinar el nivel de marcador ARNm en una muestra implica el proceso de amplificación de ácido nucleico, por ej . , por RT-PCR (la modalidad experimental establecida en Mullís, 1987, patente estadounidense 4,683,202), reacción en cadena de ligasa (Barany, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 88:189-193), replicación de secuencia autosostenida (Guatelli et ál., 1990,. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et ál., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86:1173-1177), Q-Beta Replicasa (Lizardi et ál., 1988, Bio/'Technology 6:1197), replicación por círculo rodante (Lizardi et ál., patente estadounidense N° 5,854,033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son específicamente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si dichas moléculas están presentes en muy bajas cantidades. Tal como se usa en la presente, los cebadores de amplificación se definen como un par de moléculas de ácido nucleico que pueden templarse a regiones 5' o 3' de un gen (cadenas más y menos, respectivamente o viceversa) y contienen una región corta entre medio. En general, los cebadores de amplificación son de alrededor de 10 a 30 nucleótidos de largo y flanquean una región de alrededor de 50 a 200 nucleótidos de largo. En condiciones apropiadas y 'con reactivos adecuados, dichos cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores.
Para métodos in situ, el ARNm no necesita estar aislado de las células antes de la detección. En dichos métodos, una muestra celular o de tejido se prepara/procesa usando métodos histológicos conocidos. La muestra se inmoviliza luego en un soporte, típicamente una lámina de vidrio, y luego se pone en contacto con una sonda que puede hibridarse a ARNm que codifica el marcador.
Como una alternativa a tomar decisiones basadas en el nivel de expresión absoluto del marcádor, las decisiones se pueden basar en el nivel de expresión normalizado del marcador. Los niveles de expresión se normalizan corrigiendo el nivel de expresión absoluto de un marcador comparando su expresión con la expresión de un gen que no es un marcador, por ej . , un gen de mantenimiento que está expresado constitutivamente. Los genes adecuados para la normalización incluyen genes de mantenimiento tales como el gen de actina o los genes específicos de células epiteliales. Esta normalización permite comparar el nivel de expresión en una muestra, por ej . , muestra de un paciente, con otra muestra, por ej . , muestra de un trastorno no metabólico, o entre muestras de diferentes fuentes.
De manera alternativa, el nivel de expresión se puede proporcionar como un nivel de expresión relativo. Para determinar un nivel de expresión relativo de un marcador, el nivel de expresión del marcador se determina para 10 o más muestras de aislados de trastorno metabólico en comparación con normales, preferentemente 50 muestras o más, antes de determinar el nivel de expresión para la muestra en cuestión. El nivel de expresión medio de cada uno de los genes ensayados en la cantidad más grande de muestras se determina y esto se usa como un nivel de expresión de control para el marcador. El nivel de expresión del marcador determinado para la muestra de prueba (nivel de expresión absoluto) se divide luego por el valor de expresión medio obtenido para ese marcador. Esto proporciona un nivel de expresión relativo.
Preferentemente, las muestras usadas en la determinación de referencia serán de tejidos asociados a un trastorno metabólico. La elección de la fuente celular depende del uso del nivel de expresión relativo. Usando la expresión encontrada en tejidos normales como valor de expresión medio ayuda a validar si el marcador ensayado es especifico de trastorno metabólico (en comparación con células normales) . Además, a medida que se recogen más datos, es posible corregir el valor de expresión medio, proporcionando valores de expresión relativos mejorados basados en datos recogidos.
En otra modalidad de la presente invención, se detecta una proteina marcadora. Un agente preferido para detector una proteina marcadora de la invención es un anticuerpo capaz de unirse a dicha proteina o un fragmento de la misma, preferentemente un anticuerpo con una marca detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferentemente, monoclonales . Es posible usar un anticuerpo intacto o un fragmento o derivado del mismo (por ej . , Fab o F(ab' )2) - El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende abarcar el marcado directo de la sonda o anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, unión física) de una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como también el marcado indirecto de la sonda o anticuerpo mediante la reactividad con otro reactivo que está directamente marcado. Los ejemplos de marcado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado de manera fluorescente y marcado terminal de una sonda de ADN con biotina para que se pueda detectar con estreptavidina marcada de manera fluorescente .
Las proteínas de las células se pueden aislar usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Los métodos de aislamiento de proteínas empleados pueden, por ejemplo, ser los descritos en Harlow y Lañe (Harlow and Lañe, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) .
Es posible emplear diversos formatos para determinar si una muestra contiene una proteína que se una a un anticuerpo dado. Los ejemplos de dichos formatos incluyen, a modo no taxativo, inmunoensayo enzimático (EIA) , radioinmunoensayo (RIA) , análisis de transferencia Western y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) . Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente métodos de detección de proteínas/anticuerpos conocidos para usar para determinar si las células expresan un marcador de la presente invención.
En un formato, los anticuerpos o fragmentos o derivados de anticuerpo se pueden usar en métodos tales como transferencia de Western o técnicas de inmunofluorescencia para detectar las proteínas expresadas. En dichos usos, generalmente se prefiere inmovilizar el anticuerpo o proteínas en un soporte sólido. Los soportes o portadores de fase sólida adecuados incluyen cualquier soporte capaz de unirse a un antígeno o anticuerpo. Los soportes o portadores conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nilón, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita.
Un experto en la técnica conocerá muchos otros portadores adecuados para unirse al anticuerpo o antigeno, y podrá adaptar dicho soporte para usar con la presente invención. Por ejemplo, la proteina aislada de las células con trastorno metabólico se puede ejecutar en una electroforesis de gel de poliacrilamida e inmovilizar en un soporte de fase sólida tal como nitrocelulosa . El soporte se puede lavar luego con amortiguadores adecuados seguido por el tratamiento con el anticuerpo marcado de manera detectable. El soporte de fase sólida puede lavarse luego con el amortiguador una segunda vez para retirar el anticuerpo no unido. La cantidad de marcador unido al soporte sólido se puede detectar luego por medios convencionales.
La invención también abarca kits para detectar la presencia de una proteina marcadora o ácido nucleico en una muestra biológica. Dichos kits se pueden usar para determinar si un sujeto sufre de o corre riesgo de desarrollar un trastorno metabólico tal como diabetes u obesidad. Por ejemplo, el kit puede comprender un compuesto o agente marcado capaz de detectar una proteina marcadora o ácido nucleico en una muestra biológica y medios para determinar la cantidad de la proteina de ARNm en la muestra (por ej . , un anticuerpo que se una a la proteina o fragmento de la misma, o una sonda de oligonucleótido que se una al ADN o ARNm que codifica la proteina. Los kits también pueden incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos al usar el kit.
Para los kits basados en anticuerpos, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ej . , unido a un soporte sólido) que se une a una proteina marcadora, y, opcionalmente, (2) un segundo anticuerpo diferente que se une a la proteina o al primer anticuerpo y se conjuga con una marca detectable.
Para los kits basados en oligonucleótidos, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un oligonucleótido, por ej . , un oligonucleótido marcado de manera detectable, que se híbrida a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteina marcadora o (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico marcadora. El kit también puede comprender, por ej . , un agente amortiguador, un conservante o un agente estabilizador de proteínas. El kit puede comprender adicionalmente componentes necesarios para detectar la marca detectable (por ej . , una enzima o sustrato) . El kit también puede contener una muestra de control o una serie de muestras de control que se pueden ensayar y comparar con la muestra de prueba. Cada componente del kit se puede incorporar a un contenedor individual y todos los distintos contenedores pueden estar dentro de un mismo paquete, junto con las instrucciones para interpretar los resultados de los ensayos llevados a cabo usando el kit.
B. Farmacogenómica Los marcadores de la invención también son útiles como marcadores farmacogenómicos .
Tal como se usa en la presente, un "marcador farmacogenómico" es un marcador bioquímico objetivo cuyo nivel de expresión se correlaciona con una respuesta o susceptibilidad específicas al fármaco clínico en un paciente (véase, por ej . , McLeod et ál. (1999) Eur. J. Cáncer 35(12): 1650-1652) . La presencia o cantidad de expresión del marcador farmacogenómico se relaciona con la respuesta pronosticada del paciente y más particularmente el trastorno metabólico del paciente a la terapia con un fármaco o clase de fármacos específicos. Mediante la evaluación de la presencia o cantidad de la expresión de uno o más marcadores farmacogenómicos en un paciente, es posible seleccionar una terapia de fármacos que es la más adecuada para el paciente o que se prevé tiene mayor grado de éxito. Por ejemplo, según la presencia o cantidad de ARN o proteína codificada por marcadores específicos en un paciente, es posible seleccionar un fármaco o transcurso de tratamiento que está optimizado para el tratamiento del trastorno metabólico específico que está probablemente presente en el paciente. El uso de marcadores farmacogenómicos para los mismos permite seleccionar o designar el tratamiento más adecuado para cada paciente con trastorno metabólico probando diferentes fármacos o regímenes.
Otro aspecto de la farmacogenómica trata las condiciones genéticas que alteran la manera en la que el cuerpo actúa frente a los fármacos. Estas condiciones farmacogenéticas pueden ocurrir ya sea como defectos raros o polimorfismos. Por ejemplo, la deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) es una enzimopatía hereditaria común en la cual la principal complicación clínica es la hemolisis luego de la ingestión de fármacos oxidantes (antimalaria, sulfonamidas, analgésicos, nitrofuranos) y consumo de habas caballares.
Como una modalidad ilustrativa, la actividad de las enzimas que metabolizan fármacos es una determinante principal tanto de la intensidad como de la duración de la acción del fármaco. El descubrimiento de polimorfismos genéticos de enzimas que metabolizan fármacos (por ej . , enzimas N-acetiltransferasa 2 (NAT 2) y citocromo P450 CYP2D6 y CYP2C19) proporcionó una explicación de por qué algunos pacientes no obtienen los efectos farmacológicos esperados o muestran una respuesta farmacológica exagerada y toxicidad grave luego de tomar la dosis segura y estándar de un fármaco. Estos polimorfismos se expresan en dos fenotipos en la población, el metabolizador extensivo (EM) y el metabolizador pobre (PM) . La prevalencia de PM es diferente entre las distintas poblaciones. Pór ejemplo, el gen que codifica CYP2D6 es altamente polimórfico y se han identificado diversas mutaciones en PM, las cuales conllevan a la ausencia de CYP2D6 funcional. Los metabolizadores pobres de CYP2D6 y CYP2C19 frecuentemente experimentan una exagerada respuesta farmacológica y efectos secundarios al recibir las dosis estándar. Si un metabolito es el resto terapéutico activo, un PM no mostrará ninguna respuesta terapéutica, tal como se demostró para el efecto analgésico de codeina mediada por su morfina de metabolitos formada por CYP2D6. El otro extreme son los denominados metabolizadores ultrarrápidos que no responden a dosis estándar. Recientemente, se identificó que la base molecular del metabolismo ultrarrápido era debido a la amplificación del gen CYP2D6.
Por consiguiente, el nivel de expresión de un marcador de la invención en un individuo se puede determinar para seleccionar mediante este un agente (s) apropiado (s) para tratamiento terapéutico o profiláctico del individuo. Asimismo, los estudios farmacogenéticos se pueden usar para aplicar la genotipificación de alelos polimórficos que codifican enzimas que metabolizan fármacos para identificar el fenotipo de respuesta a fármacos de un individuo. Este conocimiento, al aplicarlo a la dosificación o selección de fármacos, puede evitar reacciones secundarias o insuficiencia terapéutica y por consiguiente mejora la eficacia terapéutica o profiláctica al tratar un sujeto con un modulador de la expresión de un marcador de la invención.
C. Control de pruebas clínicas El control de la influencia de agentes (por ej . , compuestos de fármacos) en el nivel de expresión de un marcador de la invención se puede aplicar no solo en la detección básica de fármacos sino también en pruebas clínicas. Por ejemplo, la efectividad de un agente que afecta la expresión del marcador se puede controlar en pruebas clínicas de sujetos que reciben tratamiento para un trastorno metabólico. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un método para controlar la efectividad del tratamiento de un sujeto con un agente (por ej . , un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña u otro fármaco candidato) que comprende los pasos de (i) obtener una muestra de pre-administración de un sujeto antes de la administración al agente; (ii) detectar el nivel de expresión de uno o más marcadores seleccionados de la invención en la muestra de pre-administración; (iii) obtener una o más muestras de postadministración para el sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión del marcador (es) en las muestras de postadministración; (v) comparar el nivel de expresión del marcador (es) en la muestra de pre-administración con el nivel de expresión del marcador (es) en la muestra o muestras de post-administración; y (vi) alterar la administración del agente al sujeto respectivamente. Por ejemplo, la expresión aumentada del/de los gen (es) marcador (es) durante el transcurso del tratamiento puede indicar una dosificación ineficaz y el deseo de aumentar la dosificación. Por el contrario, la expresión disminuida del/de los gen (es) marcador (es) puede indicar el tratamiento eficaz y el no tener la necesidad de cambiar la dosificación.
D. Matrices La invención también incluye una matriz que comprende un marcador de la presente invención. La matriz se puede usar para ensayar la expresión de uno o más genes en la matriz. En una modalidad, la matriz se puede usar para ensayar la expresión de genes en un tejido para determinar la especificidad tisular de genes en la matriz. De esta manera, es posible ensayar simultáneamente hasta alrededor de 7600 genes para expresión. Esto permite desarrollar un perfil que muestra una serie de genes específicamente expresados en uno o más tejidos.
Además de dicha determinación cualitativa, la invención permite la cuantificación de la expresión génica. Por consiguiente, son determinables no solo la especificidad tisular sino también el nivel de expresión de una serie de genes en el tejido. Por ende, los genes se pueden agrupar según su expresión tisular en sí misma y nivel de expresión en ese tejido. Esto es útil, por ejemplo, para determinar la relación de la expresión génica entre téjidos. Así, un tejido se puede perturbar y se puede determinar el efecto de la expresión génica en un segundo tejido. En este contexto, es posible determinar el efecto de un tipo celular en otro tipo celular en respuesta a un estímulo biológico. Dicha determinación es útil, por ejemplo, para conocer el efecto de la interacción célula-célula a nivel de expresión génica. Si un agente se administra terapéuticamente para tratar un tipo celular pero tiene un efecto no deseado sobre otro tipo celular, la invención proporciona un ensayo para determinar la base molecular del efecto no deseado y así proporcionar la oportunidad de administrar conjuntamente un agente para contrarrestar o de otra manera tratar el efecto no deseado. De manera similar, inclusive dentro de un único tipo celular, es posible determinar efectos biológicos no deseados a nivel molecular. Por consiguiente, se pueden determinar y contrarrestar los efectos de un agente sobre la expresión de un gen distinto del gen diana.
En otra modalidad, es posible usar la matriz para controlar el transcurso de tiempo de expresión de uno o más genes en la matriz. Esto puede ocurrir en diversos contextos biológicos, tal como se describe en la presente, por ejemplo en el desarrollo de un trastorno metabólico, progreso de un trastorno metabólico y procesos, tales como transformación celular asociada a un trastorno metabólico.
La matriz también es útil para determinar el efecto de la expresión de un gen en la expresión de otros genes en la misma célula o diferentes células. Esto brinda, por ejemplo, una selección de dianas moleculares alternadas para intervención terapéutica si no se puede regular la diana final o corriente abajo.
La matriz también es útil para determinar patrones de expresión diferenciales de uno o más genes en células normales y anormales. Esto proporciona una serie de genes que podrían servir como una diana molecular para el diagnóstico intervención terapéutica.
VI . Métodos para obtener muestras Las muestras útiles en los métodos de la invención incluyen cualquier muestra de tejido, célula, biopsia o fluido corporal que expresan un marcador de la invención. En una modalidad, una muestra puede ser un tejido, célula, sangre, suero, plasma, raspado bucal, saliva, fluido cefalorraquídeo, orina, excremento o lavado bronquioalveolar . En modalidades preferidas, la muestra de tejido es una muestra del trastorno metabólico, que incluye una muestra de sangre u orina.
Las muestras corporales se pueden obtener de un sujeto por diversas técnicas conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, el uso de una biopsia o por raspado o toma de muestra con hisopo de un área o mediante el uso de una aguja para aspirar fluidos corporales. Los métodos para recoger diversas muestras corporales son conocidos en la técnica.
Las muestras de tejido adecuadas para detectar y cuantificar un marcador de la invención se puede enfriar, congelar o fijar de acuerdo con métodos conocidos por el experto en la técnica. Las muestras de tejido adecuadas se segmentan y colocan preferentemente en una lámina de microscopio para análisis adicionales. De manera alternativa, las muestras sólidas, es decir, muestras de tejido, se pueden solubilizar y/o homogeneizar y posteriormente analizar como extractos solubles.
En una modalidad, una muestra de tejido recién obtenida se congela usando, por ejemplo, nitrógeno liquido o difluorodiclorometano . La muestra congelada se acumula para segmentar usando, por ejemplo, OCT, y se segmenta en serie en un criostat. Las secciones en serie se recogen en una lámina de vidrio de microscopio. Para la tinción inmunohistoquimica, las láminas pueden estar recubiertas con, por ejemplo, cromoalum, gelatina o poli-L-lisina para asegurar que las secciones se adhieran a las láminas. En otra modalidad, las muestras se fijan e incorporan antes de segmentarse. Por ejemplo, una muestra de tejido se puede fijar en, por ejemplo, formalina, deshidratarse en series e incorporarse en, por ejemplo, parafina.
Una vez que se obtiene la muestra se puede usar cualquier método conocido en la técnica adecuado para detectar y cuantificar un marcador de la invención (ya sea a nivel del ácido nucleico o de proteina) . Dichos métodos son conocidos en la técnica e incluyen a modo no taxativo transferencia Western, transferencia Northern, transferencia Southern, inmunohistoquimica, ELISA, por ej . , ELISA amplificado, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, citometria de flujo, inmunocitoquimica, análisis de espectrometría de masas, por ej . , MALDI-TOF y SELDI-TOF, técnicas de hibridación de ácido nucleico, métodos de transcripción inversa de ácido nucleico y métodos de amplificación de ácido nucleico. En modalidades particulares, la expresión de un marcador de la invención se detecta a nivel proteico usando, por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a esas proteínas.
Las muestras pueden necesitar ser modificadas para hacer que un marcador de la invención sea accesible para la unión al anticuerpo. En un aspecto particular de los métodos de inmunocitoquímica o inmunohistoquímica, las láminas se pueden transferir a un amortiguador de pretratamiento y opcionalmente calentar para aumentar la accesibilidad del antígeno. El calentamiento de la muestra en el amortiguador de pretratamiento rápidamente altera la bi-capa de lipidos de las células y hace que los antígenos (puede ser el caso de muestras frescas, pero no típicamente lo que ocurre en muestras fijadas) sean más accesibles para la unión al anticuerpo. Los términos "amortiguador de pretratamiento" y "amortiguador de preparación" se usan de manera intercambiable en la presente para referirse a un amortiguador que se usa para preparar muestras citológicas o histológicas para inmunotinción, particularmente aumentando la accesibilidad de un marcador de la invención para unión al anticuerpo. El amortiguador de pretratamiento puede comprender una solución salina específica de pH, un polímero, un detergente o un tensioactivo no iónico o aniónico tal como, por ejemplo, un tensioactivo no iónico o aniónico etoxilado, un alcanoato o un alcoxilato o inclusive mezclas de estos tensioactivos o el uso de una sal biliar. El amortiguador de pretratamiento puede, por ejemplo, ser una solución de 0.1% a 1% de ácido desoxicólico, sal de sodio o una solución de lauret-13-carboxilato de sodio (por ej . , Sandopan LS) y/o complejo aniónico etoxilado. En algunas modalidades, el amortiguador de pretratamiento también se puede usar como un amortiguador de almacenamiento laminado.
Se puede usar cualquier método para realizar proteínas marcadoras de la invención más accesibles para la unión al anticuerpo en la práctica de la invención, incluyendo los métodos de recuperación antigénica conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Bibbo, et ál. (2002) Acta. Cytol. 46:25-29; Saqi, et ál. (2003) Diagn. Cytopathol. 27:365-370; Bibbo, et ál. (2003) Anal. Quant. Cytol. Histol. 25:8-11, cuyos contenidos se incorporan a la presente mediante esta referencia .
Luego del pretratamiento para aumentar la accesibilidad a la proteína marcadora, las muestras se pueden bloquear usando un agente bloqueador adecuado, por ej . , un reactivo bloqueante de peroxidasa tal como peróxido de hidrógeno. En algunas modalidades, las muestras se pueden bloquear usando un reactivo bloqueante de proteínas para evitar la unión no específica del anticuerpo. El reactivo bloqueante de proteínas puede comprender, por ejemplo, caseína purificada. Un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o policlonal que se une específicamente a un marcador de la invención se incuba luego con la muestra. Un experto en la técnica apreciará que se puede obtener un pronóstico o diagnóstico más preciso en algunos casos mediante la detección de epitopos múltiples en una proteina marcadora de la invención en una muestra de paciente. Por consiguiente, en modalidades particulares, se usan al menos dos anticuerpos dirigidos a diferentes epitopos de un marcador de la invención. Cuando se usa más de un anticuerpo, estos anticuerpos se pueden agregar a una muestra simple secuencialmente como reactivos de anticuerpo individuales o simultáneamente como un cóctel de anticuerpos. De manera alternativa, cada anticuerpo de individuo se puede agregar a una muestra separada del mismo paciente, y se pueden recabar los datos del resultado.
Las técnicas para detectar la unión al anticuerpo son conocidas en la técnica. La unión del anticuerpo a un marcador de la invención se puede detectar mediante el uso de reactivos químicos que generan una señal detectable que corresponde al nivel de unión al anticuerpo y, por consiguiente, al nivel de expresión de proteína marcadora. En uno de los métodos de inmunohistoquímica ó inmunocitoquímica de la invención, la unión al anticuerpo se detecta mediante el uso de un anticuerpo secundario que se conjuga con un polímero marcado. Los ejemplos de polímeros marcados incluyen, a modo no taxativo, los conjugados polímero-enzima. Las enzimas en estos complejos se usan típicamente para catalizar la deposición de un cromogen en el sitio de unión al antígeno-anticuerpo, dando como resultado así la tinción celular que corresponde al nivel de expresión del biomarcador de interés. Las enzimas de particular interés incluyen, a modo no taxativo, peroxidasa de rábano picante (HRP) y fosfatasa alcalina (AP) .
En un método particular de inmunohistoquimica o inmunocitoquímica de la invención, la unión del anticuerpo a un marcador de la invención se detecta mediante el uso de un polímero marcado con HRP que se conjuga con un anticuerpo secundario. La unión del anticuerpo también se puede detectar mediante el uso de un reactivo de sonda especifica de especie, que se una a anticuerpos monoclonales o policlonales, y un polímero conjugado con HRP, que se una a los reactivos de sonda específica de especie. Las láminas se tiñen para la unión al anticuerpo usando cualquier cromagen, por ej . el cromagen 3 , 3-diaminobencidina (DAB) , y luego se contratiñen con hematoxilina y, opcionalmente, un agente para azular como hidróxido de amonio o TBS/Tween-20. Otros cromagenes adecuados incluyen, por ejemplo, 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) . En algunos aspectos de la invención, las láminas se analizan a nivel microscópico con un citotecnologista y/o patologista para evaluar la tinción celular, por ej . , tinción fluorescente (es decir, expresión marcadora) . De manera alternativa, las muestras se pueden analizar mediante microscopio automatizado o mediante el personal con la asistencia de software informático que facilita la identificación de células de tinción positivas.
La detección de la unión al anticuerpo se puede facilitar por el acoplamiento de los anticuerpos antimarcadores a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminescente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminescentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen 125I, 131TI, 35Sc, 14C o_ 3HU.
En una modalidad de la invención se preparan las muestras congeladas tal como se describe anteriormente y posteriormente se tiñen con anticuerpos en comparación con un marcador ¦ de la invención diluido en una concentración apropiada usando, por ejemplo, solución salina amortiguadora de Tris (TBS) . Los anticuerpos primarios se pueden detector incubando las láminas en anti-inmunoglobulina biotinilada. Esta señal se puede ampliar opcionalmente y visualizar usando precipitado de diaminobencidina del antigeno. Además, las láminas se pueden contrateñir opcionalmente con, por ejemplo, hematoxilina, para visualizar las células.
En otra modalidad, las muestras fijas e incorporadas se tiñen con anticuerpos en comparación con un marcador de la invención y se contratiñen tal como se describe anteriormente para secciones congeladas. Asimismo, las muestras se pueden tratar opcionalmente con agentes para ampliar la señal para visualizar la tinción del anticuerpo. Por ejemplo, se puede usar una deposición catalizada por peroxidasa de biotinil-tiramida, que a su vez se hace reaccionar con estreptavidina conjugada con peroxidasa (Sistema de amplificación de señal catalizada (CSA) , DAKO, Carpintería, CA) .
Los ensayos basados en tejidos (es decir, inmunohistoquímica) son los métodos preferidos para detectar y cuantificar un marcador de la invención. En una modalidad, la presencia o ausencia de un marcador de la invención se puede determinar por inmunohistoquímica. En una modalidad, el análisis inmunohistoquímico usa concentraciones bajas de un anticuerpo anti-marcador para que las células que no tienen marcador no se tiñan. En otra modalidad, la presencia o ausencia de un marcador de la invención se determina usando un método inmunohistoquímico que usa altas concentraciones de un anticuerpo anti-marcador para que las células que no tienen la proteína marcadora se tiñan fuertemente. Las células que no se tiñen contienen marcador mutado y no logran producir proteína marcador reconocible de manera antigénica, o son células en las que las vías que regulan niveles marcadores se desregulan, dando como resultado una expresión de estado permanente de proteina marcadora despreciable.
Un experto en la técnica reconocerá que la concentración de un anticuerpo particular usado para poner en práctica los métodos de la invención variará dependiendo de dichos factores como tiempo de unión, nivel de especificidad del anticuerpo para un marcador de la invención y método de preparación de la muestra. Asimismo, cuando se usan anticuerpos múltiples, la concentración requerida se puede afectar por el orden en el que se aplican los anticuerpos a la muestra, por ej . , simultáneamente como un cóctel o secuencialmente como reactivos de anticuerpo individuales. Además, la química de detección usada para visualizar la unión del anticuerpo a un marcador de la invención también se debe optimizar para producir la proporción de señal a ruido deseada .
En una modalidad de la invención, los métodos proteómicos, por ej . , espectrometría de masas, se usan para detectar y cuantificar las proteínas marcadoras de la invención. Por ejemplo, se puede usar la espectrometría de masas en tiempo de vuelo mediante ionización/deserción por láser asistida por matriz (MALDI-TOF S) o espectrometría de masas en tiempo de vuelo mediante ionización/deserción por láser de superficie mejorada (SELDI-TOF MS) que implica la aplicación de una muestra biológica, tal como suero, a un chip de unión a la proteina (Wright, G.L., Jr., et ál. (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J. , et ál. (2002) Clin Chem 48:1296; Laronga, C, et ál. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., et ál. (2002) 359:572; Adam, B.L., et ál. (2002) Cáncer Res 62:3609; Toisón, J. , et ál. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z.r et ál. (2001) Cáncer fles 61:6029) para detectar y cuantificar las proteínas PY-Shc y/o p66-Shc. Los métodos de espectrometría de masas se describen en, por ejemplo, patente estadounidense N° 5,622,824, 5,605,798 y 5,547,835, cuyos contenidos se incorporan en la presente mediante esta referencia.
En otras modalidades, la expresión de un marcador de la invención se detecta a nivel del ácido nucleico. Las técnicas basadas en ácido nucleico para evaluar la expresión son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, determinar el nivel de ARNm marcador en una muestra a partir de un sujeto. Diversos métodos de detección de expresión usan ARN aislado. Es posible utilizar cualquier técnica de aislamiento de ARN que no seleccione en comparación con el aislamiento de ARNm para la purificación del ARN de las células que expresan un marcador de la invención (véase, por ej . , Ausubel et ál., ed., (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley y Sons, Nueva York) . De manera adicional, es posible procesar fácilmente grandes cantidades de muestras de tejido usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, el proceso de aislamiento de ARN de un paso de Chomczynski (1989, patente estadounidense N° 4,843, 155) .
El término "sonda" se refiere a cualquier molécula que es capaz de unirse de manera selectiva a un marcador de la invención, por ejemplo, una proteina y/o transcripción de nucleótido. Las sondas se pueden sintetizar por un experto en la técnica, o derivan de preparaciones biológicas apropiadas. Las sondas se pueden diseñar especí icamente para marcarse. Los ejemplos de moléculas que se pueden utilizar como sondas incluyen, a modo no taxativo, ARN, ADN, proteínas, anticuerpos y moléculas orgánicas.
El ARNm aislado se puede usar en ensayos de amplificación o hibridación que incluyen, a modo no taxativo, análisis Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de polimerasa y matrices de sonda. Un método para la detección de los niveles de ARNm implica contactar el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que se puede hibridar al ARNm marcador. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ADNc de longitud completa, o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridarse específicamente en condiciones estrictas al ADN genómico.
En una modalidad, el ARNm se inmoviliza en una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo ejecutando el ARNm aislado en un gel de agarosa y transfiriendo al ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa . En una modalidad alternativa, la(s) sonda (s) se inmovilizan en una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con la(s) sonda (s), por ejemplo, en una matriz gene chip Affymetrix. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente métodos de detección de ARNm conocidos para usar en la detección del nivel de ARNm marcador.
Un método alternativo para determinar el nivel de ARNm marcador en una muestra implica el proceso de amplificación de ácido nucleico, por ej . , por RT-PCR (la modalidad experimental establecida en Mullís, 1987, patente estadounidense 4,683,202), reacción en cadena de ligasa (Barany, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 88:189-193), replicación de secuencia autosostenida (Guatelli et ál., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et ál., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86:1173-1177), Q-Beta Replicasa (Lizardi et ál., 1988, Bio/'Technology 6:1197), replicación por círculo rodante (Lizardi et ál., patente estadounidense N° 5,854,033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si dichas moléculas están presentes en cantidades muy bajas. En aspectos particulares de la invención, la expresión marcadora se evalúa por RT-PCR fluorogénico cuantitativo (es decir, el sistema TaqMan™) . Dichos métodos típicamente utilizan pares de cebadores de oligonucleótidos que son específicos para un marcador de la invención. Los métodos para diseñar cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia conocida son conocidos en la técnica.
Los niveles de expresión de un marcador de la invención se puede controlar usando una transferencia de membrana (tal como la usada en el análisis de hibridación tal como la Northern, Southern, en mancha y similares) , o micropozos, tubos de muestra, geles, perlas y fibras (o cualquier soporte sólido que comprende ácidos nucleicos unidos) . Véase las patentes estadounidenses N° 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 y 5,445,934, que se incorporan en la presente mediante esta referencia. La detección de la expresión marcadora también comprende usar sondas de ácido nucleico en solución.
En una modalidad de la invenció, las micromatrices se usan para detectar la expresión de un marcador de la invención. Las micromatrices son particularmente adecuadas para este fin debido a réproducibilidad entre diferentes experimentos. Las micromatrices de ADN proporcionan un método para la medición simultánea de los niveles de expresión de grandes cantidades de genes. Cada matriz consiste en un patrón reproducible de sondas de captura unidas a un soporte sólido. El ARN o ADN marcados se hibridan a sondas complementarias en la matriz y luego se detectan por análisis por láser. Las intensidades de hibridación para cada sonda en la matriz se determinan y convierten a un valor cuantitativo que representa niveles relativos de expresión génica. Véase las patentes estadounidenses N° 6.040.138, 5.800.992 y 6.020.135, 6.033.860 y 6.344.316, que se incorporan en la presente mediante esta referencia. Las matrices de oligonucleótidos de alta densidad son particularmente útiles para determinar el perfil de expresión génica para un gran número de ARN en una muestra.
Las cantidades de marcador fosforilado y/o una relación matemática de las cantidades de un marcador de la invención se pueden usar para calcular la supervivencia de un sujeto que se está tratando por un trastorno metabólico, la eficacia de un régimen de tratamiento para tratar un trastorno metabólico, y similares, usando los métodos de la invención, que pueden incluir métodos de análisis de regresión conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los modelos de regresión adecuados incluyen, a modo no taxativo CART (por ej . , Hill, T, and Lewicki, P. (2006) "STATISTICS Methods and Applications" StatSoft, Tulsa, OK) , Cox (por ej . , www.evidence-based-medicine.co.uk), exponencial, normal y log normal (por ej . , www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html) , logística (por ej . , www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression o http: //faculty. chass . ncsu . edu/garson/PA765/logistic . htm) , paramétrico, no paramétrico, semi-paramétrico (por ej . , www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), lineal (por ej . , www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression o http://www.curvefit.com/linear_regression.htm), o aditiva (por ej . , www. en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model o http: //support . sas . com/rnd/app/da/new/dagam.html) .
En una modalidad, un análisis de regresión incluye las cantidades de marcador fosforilado. En otra modalidad, un análisis de regresión incluye una relación matemática marcadora. En aun otra modalidad, un análisis de regresión de las cantidades de marcador fosforilado y/o relación matemática marcadora pueden incluir covariables moleculares y/o clínicas adicionales. Dichas covariables clínicas incluyen, a modo no taxativo, régimen de tratamiento, resultados clínicos (por ej . , supervivencia específica de la enfermedad, insuficiencia terapéutica) y/o resultados clínicos como función del tiempo luego del diagnóstico, tiempo luego de iniciar la terapia y/o tiempo luego de completar el tratamiento.
En otra modalidad, las cantidades de marcador fosforilado, y/o una relación matemática de las cantidades de un marcador se pueden usar para calcular la supervivencia de un sujeto que se está tratando por un trastorno metabólico, la eficacia de un régimen de tratamiento para tratar un trastorno metabólico, y similares, usando los métodos de la invención, que pueden incluir métodos de análisis de regresión conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los modelos de regresión adecuados incluyen, a modo no taxativo CART (por ej . , Hill, T, and Lewicki, P. (2006) "STATISTICS Methods and Applications" StatSoft, Tulsa, 0K) , Cox (por ej . , www.evidence-based-medicine.co.uk), exponencial, normal y log normal (por ej . , www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html) , logística (por ej . , www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression o http: //faculty . chass . ncsu. edu/garson/PA765/logistic . htm) , paramétrico, no paramétrico, semi-paramétrico (por ej . , www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), lineal (por ej . , www. en. wikipedia. org/wiki/Linear_regression o http://www.curvefit.com/linear_regression.htm), o aditiva (por ej . , www . en . wikipedia . org/wiki/Generalized_additive_model o http: //support . sas . com/rnd/app/da/new/dagam. html) .
En una modalidad, un análisis de regresión incluye las cantidades de marcador fosforilado. En otra modalidad, un análisis de regresión incluye una relación matemática marcadora. En aun otra modalidad, un análisis de regresión de las cantidades de marcador fosforilado y/o relación matemática marcadora pueden incluir covariables moleculares y/o clínicas adicionales. Dichas covariables clínicas incluyen, a modo no taxativo, régimen de tratamiento, resultados clínicos (por ej . , supervivencia específica de la enfermedad, insuficiencia terapéutica) y/o resultados clínicos como función del tiempo luego del diagnóstico, tiempo luego de iniciar la terapia y/o tiempo luego de completar el tratamiento.
VII. Kits La invención también proporciona composiciones y kits para pronosticar un trastorno metabólico o supervivencia de un sujeto que está siendo tratado por un trastorno metabólico. Estos kits incluyen uno o más de los siguientes: un anticuerpo detectable que se une específicamente a un marcador de la invención, un anticuerpo detectable que se une específicamente a un marcador de la invención, reactivos para obtener y/o preparar muestras de tejido para tinción e instrucciones de uso.
Los kits de la invención pueden comprender opcionalmente componentes adicionales útiles para realizar los métodos de la invención. A modo de ejemplo, los kits pueden comprender fluidos (por ej . , amortiguador SSC) adecuados para templar ácidos nucleicos complementarios o para unir un anticuerpo con una proteína con la que se une específicamente, o uno o más compartimientos de muestra, un material instructivo que describa la actuación de un método de la invención y controles/estándares específicos del tejido.
VIII . Ensayos de detección La invención también proporciona métodos (también denominados en la presente "ensayos de detección") para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de prueba (por ej . , proteínas, péptidos, peptidomiméticos, peptoides, moléculas pequeñas u otros fármacos) , que modulan la expresión y/o actividad de una diana terapéutica identificada de la invención. Tales ensayos típicamente comprenden una reacción entre un marcador de la invención y uno o más componentes del ensayo. Los otros componentes pueden ser el compuesto de prueba en sí mismo o una combinación de compuestos de prueba y un compañero de unión natural de un marcador de la invención. Los compuestos identificados mediante ensayos tales como los descritos en la presente pueden ser útiles, por ejemplo, para modular, por ejemplo, inhibir, mejorar, tratar o prevenir un trastorno metabólico .
Los compuestos de prueba usados en los ensayos de detección de la presente invención se pueden obtener a partir de cualquier fuente disponible, incluyendo bibliotecas sistemáticas de compuestos naturales y/o sintéticos. Los compuestos de prueba también pueden obtenerse mediante cualquiera de los diversos enfoques de los métodos de la biblioteca combinatoria conocidos en la técnica, que incluyen: bibliotecas biológicas; bibliotecas peptoides (bibliotecas de moléculas que tienen las funcionalidades de péptidos pero con una estructura principal no peptídica novedosa que son resistentes a la degradación enzimática pero que igualmente permanecen bioactivas; véase, por ej . , Zuckermann et ál . , 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85); bibliotecas de fase sólida o de fase de solución paralelas direccionables de forma espacial; métodos de biblioteca sintética que requieren desconvolución, el método de biblioteca "una-perla un-compuesto" y métodos de biblioteca sintéticos usando selección por cromatografía de afinidad.
Los enfoques de biblioteca biológica y de biblioteca peptoide se limitan a bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques se pueden aplicar a oligómero peptidico, no peptidico o bibliotecas de moléculas pequeñas de compuestos (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145).
Los ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares se pueden encontrar en la técnica, por ejemplo en: DeWitt et ál. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6909-8381; Chowdhury et ál. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:11422-6145; Huber et ál. (1994). 37:2678; Cho et ál. (1993) Science 261:1303; Carrell et ál. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et ál. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; y en Gallop et ál. (1994) J. Med. Chem. 37:1233.
Las bibliotecas de compuestos se pueden presentar en solución (por ej . , Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421) o sobre perlas (Lam, 1991, Nature 354:82-84), chips (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), bacterias y/o esporas, (Ladner, USP 5,223, 409), plásmidos (Culi et ál, 1992, Proc Nati Acad Sci EUA 89:1865-1869) o en fagos (Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et ál, 1990, Proc. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, anteriormente).
Los métodos de clasificación de la invención comprenden poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba de modular la ' expresión y/o actividad de un marcador de la invención en la muestra. La expresión y/o actividad de un marcador de la invención se puede determinar como se describe en la presente.
En otra modalidad, la invención proporciona ensayos para analizar compuestos candidatos o de prueba que son sustratos de un marcador de la invención o porciones biológicamente activas de la misma. En aun otra modalidad, la invención proporciona ensayos para clasificar compuestos candidatos o de prueba que se unen a un marcador de la invención o porciones biológicamente activas de la misma. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba de unirse directamente a un marcador se puede lograr, por ejemplo, mediante el acoplamiento del compuesto con un radioisótopo o una etiqueta enzimática de forma tal que la unión del compuesto al marcador se pueda determinar por la detección del compuesto marcador etiquetado en un complejo. Por ejemplo, los compuestos (por ej . , sustratos marcadores) se pueden etiquetar con 131I, 125I, 35S, 14C, o 3H, ya sea directa o indirectamente y el radioisótopo se puede detectar mediante el conteo directo de radioemisión o mediante el conteo de centelleo. De manera alternativa, los componentes del ensayo se pueden etiquetar enzimáticamente con, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa y la etiqueta enzimática se puede detectar mediante determinación de la conversión de un sustrato apropiado a producto.
Esta invención se relaciona adicionalmente con agentes novedosos identificados mediante los ensayos de detección antes descritos. Por consiguiente, se encuentra dentro del alcance de esta invención usar de forma adicional un agente identificado como se describe en la presente en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, un agente capaz de modular la expresión y/o actividad de un marcador de la invención identificado como se describe en la presente se puede usar en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos laterales del tratamiento con tal agente. De manera alternativa, un agente identificado como se describe en la presente se puede usar en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de tal agente. Además, esta invención se refiere a los usos de agentes novedosos identificados mediante los ensayos de detección descritos anteriormente para el tratamiento como se describió anteriormente.
Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no se debería considerar como limitantes. El contenido de todas las referencias y patentes publicadas y solicitudes de patente citadas en toda la solicitud se incorporan a la presente mediante esta referencia .
EJEMPLIFICACIÓN DE LA INVENCIÓN: Ahora que la invención se describió en términos generales, será más fácilmente comprendida con referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen simplemente a efectos de ilustración de algunos aspectos y modalidades de la presente invención y que no pretenden limitar la invención, como lo reconocerá un experto en la técnica a partir de las enseñanzas anteriores y los ejemplos a continuación, que otros ensayos, tipos celulares, agentes, construcciones o métodos de análisis de datos, a modo no taxativo, se pueden emplear sin alejarse del alcance de la invención tal cual se reivindica .
El contenido de cualesquiera patentes, solicitudes de patente, publicaciones de patente o artículos científicos a los que se hace referencia en cualquier parte de esta solicitud se incorporan en su totalidad a la presente.
La puesta en práctica dé la presente invención empleará, cuando corresponda y a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, virología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas se describen en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed. , ed. por Sambrook y Russell (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 2001); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.) Using Antibodies, segunda edición por Harlow y Lañe, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1999; Current Protocols in Cell Biology, ed. por Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford y Yamada, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, 1999 y PCR Protocols, ed. por Bartlett et ál., Humana Press, 2003.
Ejemplo 1 : Identificación de CoQlO como una MIM Para evaluar la CoQlO como una posible MIM, la CoQlO en forma oxidada se agregó de forma exógena a un panel de lineas celulares incluyendo lineas celulares de cáncer y lineas celulares de control normales y se analizaron los cambios inducidos al perfil de microambiente celular para cada linea celular en el panel. Los cambios a la morfología/fisiología celular y a la composición celular, incluyendo niveles de ARNm y de proteína, se evaluaron y compararon para las células enfermas en comparación con las células normales. Los resultados de estos experimentos identificaron a la CoQlO y, en particular, la forma oxidada de la CoQlO, como una MIM.
En un primer conjunto de experimentos, los cambios a la morfología/fisiología celular se evaluaron mediante la examinación de la sensibilidad y la respuesta apoptótica de las células a la CoQlO. Un panel de líneas celulares de la piel incluyendo líneas celulares de control (cultivo primario de queratinocitos y melanocitos) y diversas líneas celulares de cánceres de piel (SK-MEL-28, un melanoma de piel no metastásico; SK-MEL-2, un melanoma de piel metastásico o SCC, un carcinoma de célula escamosa; PaCa2, una linea celular de cáncer pancreático o HEP-G2, una linea celular de cáncer de hígado) se trataron con diversos niveles de coenzima Q10. Los resultados de estos experimentos demostraron que las líneas celulares de cáncer presentaban una respuesta dependiente de la dosis alterada en comparación con las líneas celulares de control con una inducción de apoptosis y muerte celular en las células cancerosas únicamente. Los ejemplos de experimentos se describen en detalle en el Ejemplo 3 a continuación.
Los ensayos se usaron luego para evaluar los cambios en la composición de la célula luego del tratamiento con CoQlO. Los cambios en la expresión génica a nivel del ARNm se analizaron usando metodología de matriz de PCR en tiempo real. Los ejemplos de experimentos se describen en detalle en los Ejemplos 6 y 9-13 a continuación. En experimentos complementarios, los cambios en la expresión génica a nivel de la proteína se analizaron usando metodología de micromatriz de anticuerpo, electroforesis en gel bidimensional seguida por identificación de proteínas usando caracterización de espectrometría de masas y análisis de transferencia western. Los ejemplos de experimentos se describen en detalle a continuación en los Ejemplos 4, 7 y 8 respectivamente. Los resultados de estos ensayos demostraron que los cambios significativos en la expresión génica, tanto a nivel del ARNm como de la proteína, se indujeron en las líneas celulares examinadas debido a la adición de la forma oxidada de la CoQlO. Se encontró que los genes modulados mediante el tratamiento de la CoQlO se agrupaban en diversas vías celulares, incluyendo apoptosis, biología del cáncer y crecimiento celular, glucólisis y metabolismo, transporte molecular y señalización celular.
Los experimentos se realizaron para confirmar el ingreso de la CoQlO en células y para determinar el nivel y la forma de la CoQlO presente en las células. En particular, el nivel de la coenzima Q10, así como la forma de CoQlO (es decir, oxidada o reducida) , presente en la mitocondria se determinó mediante el análisis de preparaciones enriquecidas con mitocondria a partir de células tratadas con CoQlO. Se confirmó que el nivel de la coenzima Q10 presente en la mitocondria aumentó en una forma dependiente del tiempo y la dosis con la adición de Q10 exógena . En un resultado sorpresivo e inesperado, se determinó que la CoQlO estaba presente en la mitocondria principalmente en forma oxidada. Además, los cambios en los niveles de proteínas de muestras enriquecidas con mitocondrias se analizaron usando electroforesis en gel 2-D é identificación de proteínas mediante caracterización de espectrometría de masas. Los resultados de estos experimentos demostraron que los niveles de la forma oxidada de . la CoQlO en la mitocondria en el transcurso del tiempo examinado se correlacionaron con una amplia variedad de cambios celulares, según se evidencia por la modulación de ARNm y los niveles de proteína para proteínas específicas relacionadas con vías metabólicas y apoptóticas. Los ejemplos de experimentos se describen en detalle en el Ejemplo 5 a continuación.
Los resultados descritos por los Solicitantes en la presente identificaron la CoQlO de la molécula endógena y, en particular, la forma oxidada de la CoQlO, como una MIM. Por ejemplo, los resultados identificaron la CoQlO como una MIM, debido a que se observó que la CoQlO induce cambios en la expresión génica tanto a nivel del ARNm como de la proteina. Los resultados identificaron que la CoQlO tenia un carácter multidimensional, debido a que la CoQlO indujo cambios diferenciales en la morfología/fisiología celular y la composición celular (por ej . , cambios diferenciales en la expresión génica tanto a nivel del ARNm como de la proteina) en un estado de enfermedad (por ej . , cáncer) en comparación con un estado normal (por ej . , no canceroso). Además, los resultados identificaron que la CoQlO tenia un carácter multidimensional en el sentido de que la CoQlO era capaz de ingresar a una célula y por lo tanto presentó efectos terapéuticos y de portador.
E emplo 2 : Métodos para ide tificar procesos relevantes para la enfermedad y biomarcadores para trastornos metabólicos A partir de los ensayos basados en células donde las lineas celulares se trataron con una molécula de interés, las diferencias entre las células tratadas en comparación con las no tratadas se evalúan mediante matrices de ARNm, matrices de anticuerpo de proteina y electroforesis en gel 2D. Las proteínas identificadas a partir de análisis de muestras comparativas a ser moduladas por la IM o el cambiador epi. se evalúan desde una perspectiva de Systems Biology con un análisis de vía (software Ingenuity IPA) y una revisión de la bibliografía conocida. Las proteínas identificadas como posibles compuestos terapéuticos o biomarcadoras diana se someten a ensayos de confirmación tales como análisis de transferencia Western, silenciamiento de ARNip o métodos de producción y caracterización de proteínas recombinantes.
Materiales y métodos para los ejemplos 3-8 Solución de coenzima Q10 Una coenzima Q10 de 500 µ? (5% de isopropanol en medio de crecimiento celular) se preparó de la siguiente manera. Una solución de coenzima Q10 de 500 µ? y 10 mL se preparó cada vez. Peso molecular: 863.34 (0.0005 mol/L) (0.010 L) (863.34 g/mol) = 0.004317 g Para realizar 10 mL de una solución de 500 µ , se pesaron 4.32 mg de coenzima Q10 en un tubo falcon de 15 mL y se agregaron 500 µL de isopropanol. La solución se calentó ert un baño de agua a 50-60°C mientras se agitaba para disolverla completamente. A esta solución, se le agregaron 9.5 mL de medio (el mismo medio donde se cultivaron las células) .
Cultivo celular Las células se obtuvieron de Colección americana de cultivos tipo o Gibco. Las células se cultivaron en medio D E /F-12 complementado con 5% de suero bovino fetal, 0.25 ug/mL de Anfotericina, 100 ug/mL de estreptomicina y 100 U mL-1 de penicilina. Las células se mantuvieron en una atmósfera de 95% de aire y 5% de C02 a 37 grados C.
Tratamiento con coenzima Q10 y aislamiento total de proteínas Las células se cultivaron a una confluencia de 85% antes de la exposición con Q10. El medio complementado se acondicionó con Q10 y concentraciones de 50 y 100 micromoles. Los matraces se trataron con control, 50 µ de Q10 y 100 µ? de Q10 por triplicado. La proteína se aisló del matraz tratado y de control luego de 4, 8, 12 y 24 horas. Para el aislamiento de proteínas, las células se lavaron tres veces con 5 mL de PBS helado a pH de 7.4. Las células se rasparon en 3 mL de PBS, se sedimentaron por centrifugación y se volvieron a suspender en un amortiguador de lisis a pH 7.4 (80 mM de TRIS-HC1, 1% de SDS con inhibidores de proteasa y fosfatasa) . Las concentraciones de proteína se cuantificaron usando el método BCA.
Líneas celulares Las líneas celulares enumeradas a continuación se propagaron y se estableció un banco celular para cada una. Se realizó una producción a gran escala de células para diversos ensayos y el material se recolectó para ser analizado. En general, cuando un medio especifico para células no era necesario para mantener las lineas celulares, el medio usado para el crecimiento celular era DMEMF-12 con 5% de suero. Las células se cultivaron típicamente a 75-80% de confluencia (espaciado claro) antes de separar y usar los ensayos celulares y los métodos de práctica estándar. Las siguientes líneas celulares se establecieron para los experimentos: SK- EL-28 (melanoma de piel no metastásico) SK- EL-2 (melanoma de piel metastásico) HEKa (queratinocitos, control de piel) HE a (melanocito, control de piel) nFIB (fibroblastos neonatales) HEP-G2 (cáncer de hígado) [línea celular SBH] SkBr-3 (cáncer de mama, Her2 sobreexpresado ) CF-7 (cáncer de mama, mutación p53) PC-3 (cáncer de próstata) [linea celular SBH] SkBr-3 (adenocarcinoma de mama humano) NCI-ES-0808 SCC (carcinoma de células escamosas) PaCa-2 NIH-3T3 Cultivo celular: Las células se obtuvieron de Colección americana de cultivos tipo o Gibco. Las células se cultivaron en medio D E /F-12 complementado con 5% de suero bovino fetal, 0.25 ug/mL de Anfotericina, 100 ug/mL de estreptomicina y 100 U mL-1 de penicilina. Las células se mantuvieron en una atmósfera de 95% de aire y 5% de C02 a 37 grados C.
Las células SK-MEL28 de melanoma maligno de piel se cultivaron y mantuvieron en DMEM/F12 con Glutamax (Invitrogen, Carlsbad CA) complementado con 5% de FBS, anfotericina y penicilina/estreptomicina. Las células se cultivaron a 37 °C con 5% de C02. Los detalles de lineas celulares adicionales y condiciones de crecimiento se resumen en la tabla a continuación.
Tabla 1. Líneas celulares analizadas para determinar la sensibilidad a Q10.
Linea Descripción Condiciones de crecimiento celular PaCa2 Carcinoma DMEM/F12 con Glutamax + 10% de pancreático FBS, 2.5% de suero de caballo, anfotericina, penicilina/estreptomicina'.
HepG2 Carcinoma MEM con sales de Earle hepatocelular complementada con 10% de FBS, anfotericina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio y aminoácidos no esenciales.
PC3 Adenocarcinoma DME /F12 con Glutamax, de próstata complementado con 5% de FBS, anfotericina y penicilina/estreptomicina .
SKBr3 Cáncer de mama DMEM/F12 con Glutamax, complementado con 5% de FBS y anfotericina, penicilina/estreptomicina .
MCF-7 Cáncer de mama DMEM/F12 con Glutamax, complementado con 5% de FBS y anfotericina, penicilina/estreptomicina .
Tratamiento de células SKMEL28 con Q10: Se trataron células SK-MEL28 con 100 µ? de Q10 o el vehículo de control. La formulación de la Q10 fue la siguiente: En un tubo tapado de 15 mL, se transfirieron 4.32 mg de Q10 (proporcionada por Cytotech) y luego se disolvieron agregando 500 L de isopropanol. La solución resultante se calentó en un baño de agua a 65°C y se agitó en un vórtex a gran velocidad. La solución de QlO/isopropanol se llevó hasta un volumen de 10 mL agregando medio de cultivo celular equilibrado. La solución madre luego se agitó en un vórtex para asegurar la máxima solubilidad de la Q10. La solución madre se diluyó (2 mL de solución madre con 8 mL de medio) para obtener una concentración final de 100 µ? de Q10. Para el vehículo de control, se agregaron 9.5 mL de medio a 500 L de isopropanol. La solución madre de control se diluyó adicionalmente (2 mL de solución madre) con 8 mL de medio. Las células se extrajeron 6, 16, 24, 48 o 72 horas luego del inicio del tratamiento.
Tratamiento de células de SCC con Q10: Se trataron células de SCC con 100 µ? de Q10 (preparada como se describió anteriormente) durante 6 horas o 24 horas. Las células de control fueron células sin tratamiento. Las células se extrajeron y se sedimentaron en diferentes puntos de tiempo luego del tratamiento y los sedimentos se congelaron de forma instantánea y se almacenaron a -80 °C hasta que se aisló el ARN en XTAL como se describe a continuación.
Aislamiento de ARN: Se lisaron células para aislar ARN en diferentes puntos del tratamiento usando el kit RNeasy ini (Qiagen, Inc., Valencia CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se cuantificó midiendo la densidad óptica a 260 nm.
Síntesis de la primera cadena: Se sintetizó ADNc de primera cadena a partir de 1 g de ARN total usando el kit de síntesis de primera cadena RT2 (SABiosciences . , Frederick MD) según las recomendaciones del fabricante .
PCR en tiempo real: Los productos de la síntesis de primera cadena se diluyeron con agua, se mezclaron con el master mix verde SYBR (SABiosciences., Frederick MD) y se cargaron en matrices de PCR. La PCR en tiempo real se realizó en las matrices de PCR (matrices de apoptosis, matrices de diabetes, matrices de estrés oxidativo y protección antioxidante y matrices de proteina de choque térmico) (SABiosciences, Frederick MD) en un Biorad CFX96.
Determinación de la sensibilidad de las lineas celulares a la coenzima Q10 mediante el ensayo de nexina para apoptosis : Se cuantificó el porcentaje de células apoptóticas tempranas y tardía siguiendo un tratamiento de 24 h con coenzima Q10. La apoptosis temprana y tardía se utilizaron como marcador para comprender las diferencias en la sensibilidad de diversas líneas de células cancerosas con relación a la coenzima Q10. Las diferentes líneas celulares analizadas fueron PaCa2, HepG2, PC-3, SKBr3, MCF-7 y SK-MEL28. Las células se dejaron adherir durante la noche en placas de 96 pocilios. Estas células se trataron con vehículo de control, 50 µ? de Q10 o 100 µ? de coenzima Q10. Luego de 24 horas, se calculó la presencia de células apoptóticas en un citómetro de flujo PCA96 (Guava Technologies, Hayward, CA) . Adicionalmente, algunas células se trataron con 4 µ? de estaurosporina durante 2 horas como control positivo para la apoptosis. Las células primero se lavaron con PBS y se separaron con 50 pL de Accumax (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA) a temperatura ambiente. La disociación se detuvo agregando medio de cultivo que contenía 1% de Pluronic F-68 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO) . Luego se agregaron 100 L de reactivo de nexina (Guava Technologies, Hayward, CA) a cada uno de los pocilios. Luego de 20 minutos de incubación en la oscuridad, se realizó el ensayo en placas de baja unión para minimizar unión de las células nuevamente al sustrato. El reactivo de nexina contenía dos tintes. Anexina-V-PE, que detecta la serina de fosfatidilo fuera de la célula, una característica de las células apoptóticas tempranas. El segundo tinte, 7-AAD, penetra solamente las células apoptóticas tardías, al tiempo que se excluye de las células vivas (saludables) y apoptóticas tempranas. Se determinó el porcentaje de cuatro poblaciones de células; vivas, apoptóticas tempranas, apoptóticas tardías y sedimentos, usando el software Cytosoft 2.5.7 (Guava Technologies, Hayward, CA) .
Inmunotransferencia Se ensayaron aproximadamente 50 de proteína por muestra mediante inmunotransferencia . Todos los tratamientos se realizaron en triplicado con controles. Las proteínas se separaron en 12% de geles TRIS-HC1, se transfirieron mediante electroforesis a membranas de nitrocelulosa y se bloquearon usando una solución de 5% de leche y TBST antes de la incubación con anticuerpos primarios. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 grados C en una solución de 5% de BSA y TBST. Los anticuerpos secundarios se incubaron durante una hora a 4 grados. Todos los anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling Technology. Los anticuerpos se utilizaron en una proporción de 1:1000, con la excepción de PActina en una proporción de 1:5000. Las bandas se procesaron y los resultados se cuantificaron usando el software de análisis del densitómetro basado en NIH Java Image J. Todas las bandas también se sondaron y se normalizaron hasta su expresión de Actina respectiva.
Electroforesis bidimensional : Antes del enfoque isoeléctrico (IEF), las muestras se solubilizaron en 40 mM de Tris, 7 M de urea, 2 M de tiourea y 1% de detergente zwitteriónico C7, se redujeron con tributilfosfina y se alquilaron con 10 mM de acrilamida durante 90 min a temperatura ambiente. Luego la muestra se pasó por un dispositivo de corte Amicon Ultra de 10 kDa con al menos 3 volúmenes del amortiguador de resuspensión que consistía en 7 M de urea, 2 M de tiourea y 2% de CHAPS para reducir la conductividad de la muestra. Se sometieron cien microgramos de proteína a IEF en tiras de gradiente de pH inmovilizado de 11-cm con un pH de 3 a 10, pH de 4 a 7 o pH de 6 a 11 (GE, Amersham, EUA) hasta 100,000 voltios por hora. Luego del IEF, las tiras de gradiente de pH inmovilizado se equilibraron en 6 M de urea, 2% de SDS, 50 mM de amortiguador de Tris-acetato, pH 7.0 y 0.01% de azul de bromofenol y se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS en 8 a 16% de gel precast Tris-HCl, 1 mm (Bio-Rad, EUA) . Los geles se procesaron en duplicado. Luego se fijaron, se tiñeron en rubí SPYRO, 80 mL/gel (Invitrogen, EUA) y se tomaron las imágenes en un escáner láser Fuji FLA-5100 o se transfirieron a una membrana de PVDF.
Se obtuvo información adicional para una muestra de control para analizar la utilidad de la identificación de proteínas a través del uso de métodos que utilizan separación pl selectiva de dPC (Protein Forest Inc.), seguida de digestión del tapón de dPC con tripsina con identificación del espectro de masas y semi-cuantitación (Nanomate o LC/LTQ/MS) . El análisis dPC realizado con una muestra de control demostró su utilidad en la identificación de un amplio subconjunto de proteínas. Los materiales producidos durante los estudios se archivaron para poder utilizarlos como recurso en caso de necesidad futura.
Análisis de imagen en gel ,2D: El análisis de todas las imágenes en gel se realizó usando Progenesis Discovery y Pro (Nonlinear Dynamics Inc., Newcastle upon Tyne, RU) . Luego de detectar las manchas, emparejar, restar el fondo, normalizar y filtrar, los datos para las imágenes en gel rubí SPYRO se exportaron. Se realizaron comparaciones en pares entre los grupos usando la prueba t de Student en Progenesis Discovery para identificar manchas cuya expresión estuviera significativamente alterada (p > 0.05) .
Matriz de anticuerpos: Se utilizó una micromatriz de anticuerpos (matriz de anticuerpos XP725 Panorama, Sigma) para analizar más de 700 anticuerpos de proteina para evaluar los cambios en el nivel de concentración de proteina en las células tratadas con Q10 (SK-MEL-28, SCC) . La expresión de una proteina en un extracto celular se detecta cuando se une mediante un anticuerpo correspondiente manchado en el portaobjetos. Antes de la unión, las proteínas se etiquetan directamente con un tinte fluorescente que se usa para visualización fluorescente y análisis cuantitativo. La matriz se usa para comparar perfiles de expresión de proteínas de dos muestras (muestras de prueba en comparación con referencia) , cada una etiquetada con un tinte Cy diferente (Cy3 o Cy5) y las dos muestras se colocan simultáneamente en concentraciones iguales de proteína en la matriz. Luego se registra la intensidad de señal fluorescente para cada muestra de forma individual a una longitud de onda correspondiente a la etiqueta de tinte de la muestra y se compara.
Dosis elevadas de coenzima Q10 regulan la expresión de genes implicados en las vías de estrés apoptótico, diabético y oxidativo en células SKMEL-28 cultivadas.
Detalles experimentales: Las células SKMEL-28 (N° de catálogo del ATCC HTB-72) son células de melanoma de la piel no metastásico que se cultivaron en DMEM-F12 que contenía Glutamax (N° de cat . de Invitrogen 10565-042) complementado con 5% de FBS, penicilina, estreptomicina y anfotericina, se trataron con el vehículo o 100 uM de coenzima Q10 durante diversos lapsos de tiempo. Todo cambio en la expresión génica resultante del tratamiento con la coenzima Q10 se cuantificó usando matrices de PCR en tiempo real (Apoptosis N° de cat. PAHS-12, diabetes N° de cat. PAHS-023 y estrés oxidativo N° de cat. PAHS-065) . (SABiosciences, Frederick, MD) .
Se preparó una concentración madre de 500 uM de coenzima Q10 disolviendo 4.32 mg en 500ul de isopropanol, que se diluyó adicionalmente hasta 10ml agregando medio. La agitación en un vórtex y el calentamiento hasta 65°C de manera alternativa disolvieron la coenzima Q10. Se diluyeron 2 mi de la solución madre hasta 10 mi con medio para obtener 100 uM de Q10 con medio que se utilizó para tratar las células. Se preparó un vehículo en paralelo con un protocolo similar, salvo porque la coenzima Q10 no se agregó.
Las células SKMEL-28 se colocaron en una placa de 6 pocilios a una densidad de lxlO5 células/pocilio. Luego de 24 horas, cuando las células se habían unido y tenían una confluencia del 50%, se agregaron el vehículo o 100 uM de Q10. Las células se extrajeron a las 6, 16, 24, 48 o 72 horas después del tratamiento con Q10, mientras que las células tratadas con vehículo se extrajeron luego de 24 horas. Se lisaron células para aislar ARN en diferentes puntos del tratamiento usando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Inc., Valencia CA, N° de cat 74104) siguiendo las instrucciones del fabricante, usando un tratamiento de desoxirribonucleasa en la columna y columna giratoria. El ARN se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm.
La PCR en tiempo real estuvo precedida por síntesis de ADNc de primera cadena usando 0.4-lug del ARN total como plantilla, usando el kit de síntesis de primera cadena RT2 (SABiosciences . , Frederick MD, N° de cat. C-03) con una etapa de eliminación de ADN genómico según las recomendaciones del fabricante. Los productos de la síntesis de primera cadena se diluyeron con agua, se mezclaron con el master mix verde de SYBR (SABiosciences., Frederick MD, N° de cat. PA-010-12) y se cargaron en matrices de PCR que contenían ensayos de cebadores para 84 genes diferentes unidos en una vía común, 5 genes de mantenimiento utilizados para normalización, transcripción inversa y controles de PCR. La PCR en tiempo real se realizó en un Biorad Cfx96. La amplificación se comenzó con un inicio caliente para activar la enzima, seguido de 40 ciclos (etapa de desnaturalización a 95°C-15 segundos y etapa de hibridación y extensión a 60°C-1 minuto) seguidos de un programa de curva de fundición. Se organizaron los valores de ct, el resultado del termociclador de PCR para todos los grupos de tratamiento en una hoja de cálculo de Excel y se cargaron en el software de análisis comparativo disponible en www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php.
Purificación de muestras enriquecidas con mitocondria: Detalles experimentales: Las células SKMEL-28, NCI-ES0808 y NIH-3T3 que se trataron con 100 µ? de Q10 durante 24 o 48 horas junto con las células que se extrajeron a t=0 se extrajeron lavándolas y raspándolas de los matraces T160. Las células se centrifugaron, se sedimentaron, se congelaron de forma instantánea y se almacenaron a -80°C hasta que se aislaron las mitocondrias . Los sedimentos celulares se descongelaron, se volvieron a suspender y se destruyeron en un homogenizador Dounce. El homogeneizado se centrifugó y las mitocondrias se aislaron usando reactivos, asi como el protocolo recomendado por el kit de aislamiento de mitocondrias para células cultivadas (MitoSciences , Eugene OR, N° de cat. MS852) . La fracción mitocondrial se separó en alícuotas y se almacenó a -80°C.
Método de cuantificación de la coenzima Q10 y Ubiquinol-10 : Se implemento un método para la determinación simultánea de la coenzima Q10 (Q10) y la forma reducida ubiquinol-10 (Q10H2), según un método recientemente publicado (Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chromatogr. A, 1175, 242-248) a través del uso de LC-MS/MS con ionización por electroaspersión (ESI ) en el modo de ion positivo. La identificación altamente selectiva y la cuantificación sensible de la Q10 y Q10H2 son posibles junto con la identificación de otros lípidos seleccionados. Se sometió una alícuota de las muestras enriquecidas con mitocondria de SK- EL-28 tratadas con 100 µ? de Q10 a un pretratamiento convencional basado en precipitación proteica (100 µ? de concentrado de eritrocitos se destruyeron con ultrasonido en 300 µ? de 1-propanol) , extracción de liquido-líquido (agregar 100 µ? de agua al sobrenadante y extraer X3 con 200 µ? de n-hexanos) , evaporación de los extractos de hexanos combinados hasta sequedad y reconstitución en 50 µ? de 95:5 de metanol/hexanos (v/v) . El análisis se realizó mediante LC-MS/MS en un espectrómetro de masas de cuadrúpolo triple Waters Quattro II con una columna de tamaño de partícula de 5 µp? Prism RP de 1 X 100 mm (Keystone Scientific) . Elución isocrática con 4 mM de formato de amonio en 20% de alcohol isopropílico, 80% de metanol, a una velocidad de flujo de 50 µ?/min. Se inyectaron diez µ? de cada muestra. El análisis de MRM se realizó usando transiciones de m/z 882.7>197.00 (Q10H2) y m/z 880.80>197.00 (Q10) con un voltaje de cono de 40 y una energía de colisión de 30.
Ejemplo 3: Sensibilidad de las lineas celulares a la CoQlO Se analizó una cantidad de líneas celulares para determinar su sensibilidad a la Q10 luego de 24 horas de aplicación usando un reactivo (reactivo de nexina) que contenía una combinación de dos tintes, 7AAD y anexina-V-PE . El tinte 7AAD ingresa a las células con membranas celulares permeabilizadas, principalmente las células que presentan una apoptosis tardía. La anexina-V-PE es un tinte que se une a la serina de fosfatidilo, que se expone en la superficie exterior de la membrana plasmática en las células apoptoticas tempranas. El reactivo de nexina entonces se puede utilizar para diferenciar entre diferentes poblaciones de células apoptoticas en un citómetro de flujo.
Las células PaCa2 mostraron un aumento tanto en las células apoptoticas tempranas como en aquellas apoptóticas tardías (entre 5-10% de células reguladas) con 50 µ? de Q10 y 100 µ? de Q10 luego de 24 horas de la aplicación de Q10. Las células PC-3 también mostraron un aumento tanto en la población apoptóticas tempranas como en aquella apoptóticas tardías con 50 µ? y 100 µ? de Q10, si bien el aumento fue menor en comparación con las células PaCa2. Las células MCF-7 y SK-MEL28 mostraron un aumento solamente en la población apoptóticas tempranas con 50 µ? y 100 µ? de Q10. Las células HepG2 también fueron sensibles al tratamiento con 50 µ? de Q10, donde hubo un aumento de alrededor del 20% de la población regulada en las etapas de apoptosis tardía y apoptosis temprana. SKBr3 fue la única línea celular analizada que no mostró aumentos significativos en la apoptosis temprana y tardía con el tratamiento con 50 µ? o 100 µ? de Q10. Los resultados se muestran en las Figuras 1-6.
Para proporcionar una confirmación adicional de que el tratamiento con Q10 provoca una respuesta apoptótica en las células cancerosas hepáticas HepG2, se evaluó un segundo ensayo de apoptosis usando el método basado en ELISA ApoStrand™ que mide el ADN de cadena simple. El ELISA ApoStrand™ se basa en la sensibilidad del ADN en células apoptóticas a la desnaturalización con formamida y la detección del ADN desnaturalizado con un anticuerpo monoclonal para el ADN de cadena simple (ADNcs) . El tratamiento de la linea de células cancerosas hepáticas HepG2 con 50 y 100 µ? de Q10 dio como resultado una apoptosis detectable, con una respuesta a la dosis de 17% y 32%, respectivamente (Figura 7) . Estos resultados son coherentes con la observación de que la Q10 induce la apoptosis en otras lineas de células cancerosas de otros tejidos (por ej . , SCC, SKMEL-28, MCF-7 y PC-3) .
Ejemplo 4: Análisis proteómico de células tratadas con Q10 Los sedimentos celulares de muestras tratadas con Q10 se analizaron usando métodos proteómicos. Los sedimientos celulares se lisaron y se trataron para su uso en análisis de transferencia Western y gel 2-D. Se trataron tres tipos celulares (SKMEL-28, SCC y nFib) con Q10 y se presentaron para caracterización proteómica mediante electroforesis en gel 2-D.
Análisis proteómico de células SKMEL-28 tratadas con Q10 El primer conjunto experimental procesado y evaluado mediante transferencia Western y electroforesis en gel 2-D fue la linea celular de cáncer de piel SKMEL-28. Este conjunto experimental implicó células SK-MEL-28 tratadas a las 3, 6, 12 y 24 horas con 50 o 100 µ? de Q10.
El conjunto de muestras de SK-MEL-28 tratadas con Q10 se sometió a electroforesis en gel 2-D (Figura 8) y se analizó para identificar los cambios en el nivel de proteína con relación a las muestras de control. Se realizó un análisis comparativo de 943 manchas en los veinticuatro geles, comparando la muestra de control con todas las muestras tratadas. El análisis incluyó la identificación de cambios en las manchas con el transcurso del tiempo debido a un aumento, una disminución o una modificación postraduccional .
El análisis encontró treinta y dos cambios de manchas diferenciales estadísticamente significativos. A partir de esto, veinte manchas no redundantes se extirparon y se presentaron para identificación proteica mediante digestión con tripsina y caracterización por espectrometría de masas. Los péptidos caracterizados se cotejaron con bases de datos de proteínas con análisis con el software Mascot y MSRAT para identificar la proteína (Tabla 2) .
Tabla 2. Proteínas que se determinó que tenían una respuesta diferencial al tratamiento con Q10 en las células SKMEL-28.
Ti ( :onc Man Exprés Difere Proteina Nombre Tipo emp Q10cha ión ncia o (u yi) 2D # (hr ) 3 50 528 Por 1.234 catepsina D CTSD peptidasa dismin ución 3 50 702 Por 1.575 Chaperonina que CCT3 otro dismin contiene TCP1, ución subunidad 3 3 50 74 Por 1.383 Inicio de EIF3G regulador dismin traducción de la ución eucariótica traducción factor 3 3 50 829 Por 1.074 Proteina RPLP2 otro dismin ribosomal P2 ución 3 50 368 Por 1.121 transaldolasa 1 TALDO1 enzima dismin ución 6 50 452 Por -1.464 Inicio de EIF6 regulador aument traducción de la o eucariótica traducción factor 6 6 50 175 Por -1.32 Estomatina; STOM otro aument HSPC322 0 6 50 827 Por -1.457 proteina de Y HAZ enzima aument activación 0 Tirosina 3/Triptofart 5- monooxigenasa 50 139 Por -1.628 Vimentina VIM otro aument o 50 218 Por -1.416 Vimentina VI otro aument 0 50 218 Por -1.212 Vimentina VIM otro aument 0 50 139 Por -1.036 Vimentina VIM otro aument o 50 507 Por 1.379 Lamina Bl LMNB1 otro dismin ución 50 571 Por 1.832 Receptor de TOMM22 transportad dismin importación or ución mitocondrial Tom22 50 166 Por -1.171 Proteina 1 de PDCD6I otro aument interacción conP o ALG-2 50 550 Por -1.747 peptidilprolil PPIA enzima aument isomerasa A o 50 613 Por 1.802 galectina-1 LGALS1 otro dismin ución 50 242 Por 1.373 Fosfoglicerato PGAM2 fosfatase dismin mutasa; ución Fosfomannomutasa 2 50 326 Por 1.385 glicil-ARNt GARS enzima dismin sintasa ución 50 419 Por 1.451 Homólogo de MAGOH otro dismin Mago-nashi ución 100 528 Por -1.036 catepsina D CTSD peptidasa dismin ución 100 702 Por 1.151 Chaperonina que CCT3 otro dismin contiene TCP1, ución subunidad 3 100 74 Por 1.122 Inicio de EIF3G regulador dismin traducción de la ución eucariótica traducción factor 3 100 829 Por 1.145 Proteina RPLP2 otro dismin ribosomal P2 ución 100 368 Por 1.209 transaldolasa 1 TALDO1 enzima dismin ución 100 139 Por -1.829 Vimentina VIM otro aument O 6 100 218 Por -1.761 Vimentina VIM otro aument o 6 100 452 Por 1.134 Inicio de EIF6 regulador dismin traducción de la ución eucariótica traducción factor 6 6 100 252 Por 1.4 Proteina Sec dismin 13, queratina II ución 6 100 827 Por 1.12 proteina de YWHAZ enzima dismin activación ución Tirosina 3/Triptofan 5- monooxigenasa 12 100 76 Por -1.679 galectina-1 ; LGALS1 otro aument queratina II o Un hallazgo clave en este experimento fue la disminución de la Transaldolasa 1, lo que avala la premisa de que la Q10 actúa alterando el estado metabólico en las células cancerosas. La transaldolasa 1 es una enzima en la vía de pentosa fosfato (también conocida como derivación de hexosa monofosfato) . La transaldolasa (EC:2.2.1.2) cataliza la transferencia reversible de una unidad de cetol de tres carbonos de la sedoheptulosa 7-fosfato al gliceraldehido 3-fosfato para formar eritrosa 4-fosfato y fructosa 6-fosfato. Esta enzima, junto con la transcetolasa, proporciona un enlace entre las vías glicolítica y pentosa-fosfato. Esto es relevante para la síntesis de NADPH y nucleótidos, para facilitar la producción de equivalentes de reducción para reacciones biosintéticas y mantener un ambiente de reducción.
Una reciente publicación (Basta, P., et ál, agosto de 2008, Cáncer Detect Prevention, 32, 200-208) proporcionó pruebas de polimorfismo genético en la transaldolasa y se relacionó con el carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello. Otra publicación reciente (Qian, Y., et ál, mayo de 2008, Biochem J, 415, 123-134) identificó la deficiencia de transaldolasa como un modulador de la homeostasis mitocondrial, el flujo de Ca2+ y la apoptosis.
A partir de estos resultados iniciales, las otras proteínas identificadas mediante la electroforesis en gel 2-D como moduladas por la Q10 en SK- EL-28 se analizaron para detectar relaciones conocidas (Figura 9) . Una evaluación funcional de estas proteínas reveló que había un grupo implicado en la señalización mediada por 14-3-3 (PDCP6IP, Y HAZ y VIM) , junto con proteínas individuales ligadas a una variedad de procesos [ciclo celular, vía de pentosa fosfato (TALDOl) , señalización de ceramida (CTSD) , biosíntesis de aminoacilo-ARNt (GARS) e importación de proteínas mitocondriales (TOM22) ] .
Análisis proteómico de células SCC tratadas con Q10 Otra linea de células línea celular de cáncer de la piel, el carcinoma de células escamosas (SCC) , también se preparó y se analizó mediante electroforesis en gel 2-D como un experimento de seguimiento al análisis previo de SK-MEL-28. Las células de SCC se trataron con 100 µ? de Q10 durante 6 horas o 24 horas antes de la extracción. También se extrajo un control de células sin tratar. Los sedimentos celulares se lisaron y las muestras se sometieron a electroforesis en 2-D (en duplicado) . Se realizó el análisis de más de seiscientas manchas de proteínas en el estudio comparativo, donde se comparó la muestra de control con los tratamientos de seis y veinticuatro horas.
Los veinticinco cambios de manchas diferenciales estadísticamente significativos superiores se evaluaron a partir del análisis comparativo de los geles de electroforesis 2-D. A partir de esto, se extirparon doce manchas y se presentaron para identificación mediante digestión con tripsina y caracterización mediante espectrometría de masas (los resultados se resumen en la Tabla 3 a continuación) .
Tabla 3. Proteínas que se determinó que tenían una respuesta diferencial al tratamiento con 100 uM de Q10 en células de SCC a las 6 y las 24 horas.
Respuest Ubicación N° a Proteina Nombre celular Función de (cambio mane múltiplo ha ) Disminuc ión (1.5) a las 6 y las 14 331 Transaldolasa 1 TALDO1 Citoplasma Enzima hr.
Disminuc ión BSCv humano (2,1) a (marco de Estrictosi las 6 y lectura 3 del Membrana dina las 24 23 cromosoma 20) C20ORF3 plasmática sintasa hr.
Aumento (-1.2) a las 6 hr, disminuc Núcleo ión a ( ¿mitocond las 24 54 Proteína NM23 NME1 ria?) Cinasa hr.
Disminuc ión (2.6) a las 6 dos EST humanos hr, de la línea disminuc celular de ión cáncer de mama adiciona 116 (HSP 70) HSP70 1 a las 24 hr.
Aumento Proteína 1 de Respuesta (-1.9) choque térmico al estrés las 6 y de 27kDa HSPB1 Citoplasma ambiental 24 hr Disminuc ión (2,3) a Filamentos las 6 y intermedio las 24 Queratina I KRT1 Citoplasma s hr Aumento Filamentos (-1,6) a intermedio las 6 y Queratina 14 KRT14 Citoplasma s 24 hr Aumento Filamentos (-1,5) a intermedio las 6 y Queratina 13 KR 13 Citoplasma s 24 hr Disminuc ión (1.6) a las 24 Subunidad hr Proteasoma beta de solament 7 PSMB7 Citoplasma proteasoma e Disminuc ión Subunidad 3 (1,3) a activadora de las 24 proteasoma PSME3 Citoplasma peptidasa hr solament e Disminuc ión Inhibidor de la (1,5) a disociación de las 6 hr GDP rho (GDI) solament 66 alfa ARHGDIA Citoplasma Inhibidor e Disminuc ión 1 ¿Desconocida? (9.5) Transaldolasa 1: Como se observó previamente en las células SKMEL-28 tratadas con Q10, la enzima Transaldolasa 1 se moduló con una disminución en los niveles. Esto proporciona una ' confirmación independiente de la observación previa de un enlace entre la Q10 y las alteraciones en la transaldolasa (y, por lo tanto, el estado metabólico de la célula) .
La transaldolasa es una enzima en la fase no oxidativa de la via de pentosa fosfato (Figura 10) . La vía de pentosa fosfato es critica en el estado metabólico de las células para la generación de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (menos NADH) , para la biosíntesis reductiva y en la formación de ribosa, que es un componente esencial del ATP, el ADN y el ARN. La transaldolasa también une la vía de pentosa fosfato a la glucólisis. La glucólisis es la via metabólica mediante la cual las células cancerosas obtienen la energía que necesitan para la supervivencia celular, ya que no se utiliza el proceso mitocondrial de la fosforilación oxidativa. La Q10 es un factor coenzimático esencial necesario para la fosforilación oxidativa y la producción de ATP mitocondrial.
¦ BSCv: La mancha 23 fue una proteína humana novedosa del cromosoma 20 denominada BSCv. La proteína BSCv también se conoce como proteína asociada a la membrana plasmática de adipocitos (nombres génicos: APMAP o C20orf3) y se prevé que sea una proteína de membrana tipo II de pase único con similitud de secuencia con la familia de proteínas de estrictosidina sintasa. El tratamiento con Q10 provocó una reducción en los niveles de esta proteíña. Esta proteína no está bien caracterizada ni se ha confirmado su homología con las estrictosidina sintasas. De manera interesante, esta proteína se ha asociado con una incidencia en la diferenciación de adipocitos (Albrektsen et ál., 2001). Estudios proteómicos recientes de tejido adiposo omental humano identificaron BSCv como una de las nueve proteínas con expresión diferencial para el síndrome de ovario poliquístico (PCOS) de mujeres con obesidad mórbida (Cortón, 2008 Hum. Reprod. 23: 651-661). Como proteína de superficie celular que responde a la Q10, un anticuerpo en comparación con BSCv sería útil como biomarcador. Con base en los resultados actuales y la bibliografía disponible, BSCv puede tener una posible incidencia en el cáncer y la diabetes.
NM23A: Se cree que la proteina de células no metastásicas 1 (NM23A, también conocida como NME1) es un supresor metastásico. Este gen (NME1) se identificó debido a sus menores niveles de transcriptasa en ARNm en células altamente metastásicas. La proteína tiene actividad como una nucleósido difosfato cinasa (NDK) y existe como un hexámero compuesto por la isoforma 'A' (codificada por este gen) y 'B' (codificada por NME2) . Se han identificado mutaciones en este gen en neuroblastomas agresivos. Las actividades de la NDK mantienen un equilibrio entre las concentraciones de diferentes nucleósidos trifosfatos como, por ejemplo, cuando la GTP producida en el ciclo ácido cítrico (Krebs) se convierte en ATP. El complejo de NDK está asociado a p53 a través de la interacción con STRAP. Cabe destacar que STRAP está enlazado con HNF4A. Por consiguiente, NM23A es una posible proteína implicada en las vías importantes para el control celular y el tratamiento de enfermedades.
Inhibidor de la disociación de GDP rho (GDI) alfa: GDI regula la reacción de intercambio de GDP/GTP de las proteínas Rho inhibiendo la disociación de GDP de las mismas y la unión posterior de GTP a ellas. La proteína se regula por aumento en las células cancerosas.
E emplo 5 : Análisis de enriquecimiento mitocondrial Diversos elementos de prueba sugirieron que se garantizó una evaluación más minuciosa de la incidencia de las proteínas mitocondriales y la biología del cáncer y la respuesta a la Q10. Primero, hay una incidencia esencial de la Q10 en el proceso de fosforilación oxidativa mitocondrial para la producción energética en células normales. No obstante, el cambio metabólico que ocurre en las células cancerosas es con respecto a la producción energética a través de la vía alternativa de la glucólisis, que no necesita Q10. Segundo, la respuesta apoptotica de las células necesita de las proteínas mitocondriales para tener lugar. Se ha establecido la Q10 como estimuladora de la apoptosis en células cancerosas (proteínas de la familia de Bclc-2, citocromo c) . Por último, se detectó que nuevas proteínas mitocondriales eran moduladas por el tratamiento con Q10, según lo muestran los ejemplos de la modulación de los niveles proteicos de la proteina del receptor de importación mitocondrial TOM22 (véase los experimentos descritos en la presente) .
Producción de muestras enriquecidas con mitocondria: Las células SKMEL-28 de cáncer de piel se trataron con 100 µ? de Q10 o un vehículo de imitación durante 6, 19 o 48 horas. Las células se extrajeron lavándolas y raspándolas de matraces T-160 (4 para cada punto de tiempo) . Las células se recolectaron mediante centrifugación y los sedimentos se congelaron de forma instantánea y se almacenaron a -80 °C. Los sedimentos celulares se volvieron a suspender y se destruyeron usando un homogenizador Dounce de 2 mL. Los reactivos y los métodos se obtuvieron de un kit de aislamiento de mitocondrias para células cultivadas (MitoSciences, N° de cat . MS852). Las muestras de mitocondria resultantes se dividieron en alícuotas de 75 iL (4-5 alícuotas por muestra) y se almacenaron a -80 °C.
Análisis proteómico de muestras enriquecidas con mitocondria aisladas de células SK-MEL-28 tratadas con Q10 Se realizó electroforesis en gel 2-D en proteínas solubilizadas de dos alícuotas de las muestras enriquecidas con mitocondria SK-MEL-28 tratadas con 100 µ? de Q10 durante 6, 19 y 48 horas (junto con los controles de vehículo de imitación correspondientes) . Las muestras se sometieron a electroforesis 2-D (en duplicado) . Se realizó el análisis de 525 manchas de proteínas en el estudio comparativo, donde se compararon las muestras de control con las muestras de otros puntos de tiempo (Figura 11) .
Los nueve cambios de manchas diferenciales estadísticamente significativos se seleccionaron a partir del análisis comparativo de los geles de electroforesis 2-D. A partir de esto, 9 manchas no redundantes se extirparon y se presentaron para identificación mediante digestión con tripsina y caractarizacion por espectrometría de masa.
Tabla 4. Proteínas que se determinó que tenían una respuesta diferencial al tratamiento con Q10 en las mitocondrias de SKMEL-28.
N°d Respuesta e (cambio man múltiplo) cha Proteina ombre Función Alto (1.3) a las 6 hr, caída hasta Proteína niveles bajos 11 desconocida luego de esto Baja (1.3) a las 6 Desconocido, hr, con una igual que la mayor caída A mancha N° 11, las 19 y las 131 modificada ? 48 hr Bajo isoforma 7 de scinde el acil- (1.3) a las 6 acil-CoA CoA graso en hr, vuelve a tioesterasa ácidos grasos la normalidad 279 hBACHb COT7 libres y CoA a las 48 hr cataliza la Alto (1.5) a producción de las 6 hr, fosfoenolpiruvato vuelve a la a partir de normalidad a 372 Piruvato cinasa K 2 piruvato y ATP. las 48 hr Proteína Alto a las 19 isomerasa de y las 48 hr 110 Proteína ER60 DIA3 disulfuro Filamento Alto solamente 185 Queratina 10 RT10 intermedio a las 19 hr Proteína Alto solamente 202 Beta-actina estructural a las 19 hr proteína de unión Alto solamente a carbohidratos a las 19 hr del retículo endoplásmico y un actor candidato en las etapas tempranas de la N-glieosilación 246 alectina LEC proteica Formación de poro Alto a las 48 nuclear hr Dominio de proteína superhélice que hipotética 75 contiene 58 CDC58 conservada Acil-CoA tioesterasa 7: Acil-CóA tioesterasa 7 (ACOT7) es un miembro de la familia enzimática que cataliza la hidrólisis de acil-CoA graso en CoA y ácido graso libres. Esta enzima, por lo tanto, tiene incidencia en la regulación del metabolismo lipídico y la señalización celular. ACOT7 tiene preferencia por sustratos de acil-CoA de cadena larga con cadenas de ácidos grasos de 8-16 átomos de carbono (C8-C16) . La función celular exacta de ACOT7 no se comprende por completo. La transcripción de este gen se activa mediante la proteína de unión al elemento regulador de esterol 2, lo que sugiere una función en el metabolismo del colesterol.
Los resultados en este Ejemplo indican que AC0T7 está posiblemente implicado en el metabolismo de la Q10, ya sea de forma directa o indirecta. Por lo tanto, el direccionamiento de AC0T7 podría facilitar la modulación de niveles intercelulares de Q10 y así impactar los efectos celulares de la QIO.
Piruvato cinasa: La piruvato cinasa es una enzima implicada en la última etapa de la glucólisis. Cataliza la transferencia de un grupo fosfato del fosfoenolpiruvato (PEP) a ADP, lo que proporciona una molécula de piruvato y una molécula de ATP. ' cinasa piruvato fosfoenolniruvato (PEP) (PK) piruvato (Pyr) a transferasa OH QO P =0 o T Se presume que la proteína es la de PKM2, la isoforma tipo 2, ya que esta se identificó a partir de la muestra de SK- EL-28 enriquecida con mitocondria. Se sabe que esta isoforma está implicada en la formación y la regulación células tumorales.
Cuantificación de los niveles de Q10 en mitocondrias Se implemento un método para la determinación simultánea de la coenzima Q10 (Q10) y la forma reducida ubiquinol-10 (Q10H2), con base en un método recientemente publicado (Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chroma A, 1175, 242-248) a través del uso de LC-MS-MS con ionización por electroaspersión (ESI) en el modo positivo. La identificación altamente selectiva y la cuantificación sensible de la Q10 y Q10H2 son posibles junto con la identificación de otros lipidos seleccionados. Se sometió una alícuota de las muestras enriquecidas con mitocondria de SK-MEL-28 tratadas con 100 µ? de Q10 a un pretratamiento convencional basado en Precipitación de proteínas, extracción de líquido-líquido, evaporación hasta sequedad y reconstitución con 95:5 de metanol/hexanos (v/v) .
En este análisis, se cuantificaron Q10, Q10H2 y Q9 (Tabla 5) . Los niveles de la molécula Q9 relacionada fueron bajos y cercanos al nivel de detección. El nivel de las muestras sin tratar fue relativamente coherente con la muestra tratada con Q10 a las 6 horas que tenía el mismo nivel. Para controlar la varianza de la muestra en el material total, los niveles de colesterol también se midieron para confirmar que las diferencias no se debían a errores en el tamaño de la muestra. Cuando se corrigieron los niveles de QIO en comparación con los valores totales de proteínas obtenidos mediante extracción de proteínas, otras alícuotas de las mismas preparaciones mitocondriales, las proporciones relativas fueron comparativas. Por lo tanto, se obtuvo un aumento significativo en los niveles de QIO a las 19 horas (~3 veces) con un aumento incluso mayor a las 48 horas (~ 6 veces) (Figura 12) .
Area de pico ng/ muestra t>ef muestra Archivo Muestra Invección 09 010 09 010 Q OM, colestero! 081204-05 lOOi^Std 245-342 352792 0S1204-O6 prueba de 6h#1 10% 2560 32649 1.04 0S1204-07 Solvente s/ trat #1 5 ul 3781 3174 1.54 Ü.9 081204-08 Solvente 8/ trat #·2 5 li 2396 4399 1.25 081204-09 prueba de 6h#2 20% 1572 36328 ?·) 081204-10 Solvente s/trat#3 10 ul 1722 2504 ¾í ?.71 081204-11 48 hr trat c/Q10 20% 4879 164496 1.99 i¾s:.v ; .-r-; -.'-53.*P 081204-12 prueba de 48h 20% 2412 25552 0.9S 081204-13 6 Ir trat c/Q10 20% 692 25427 7.2Í 081204-14 19 hr trat c Q10 20% 1161 59164 16.77 081204-15 prueba de 19h 20% 901 19999 ¦~ 5.6? Tabla 5. Resultados de la cuantificación por HPLC-MS para los niveles de QIO presentes en las muestras enriquecidas con mitocondria de células SK-MEL-28 tratadas con 100 uM de QIO en el medio.
Un resultado sorprendente de este estudio fue el hallazgo de que la QIO se suministró a las células como la forma oxidada. Para las muestras a las 48 horas, también se midió la forma reducida Q10H2 y se encontró que estaba presente en cantidades significativamente menores (0.28 ng/muestra de CoQ10H2 en comparación con 46.63 ng/muestra de CoQlO) . Hubo un aumento general (3 veces) en los niveles de Q10H2 en la muestra a las 48 horas tratada con Q10, si bien los niveles fueron cercanos al limite de detección presupuesto del ensayo. De manera interesante, la forma oxidada (Q10) puede actuar como un pro-oxidante en sistemas biológicos. De acuerdo con la literatura, cuando se evaluó el plasma humano para determinar la Q10 y Q10H2, se descubrió que la mayoría (90%) de la molécula estaba en la forma reducida de Q10H2 (Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chroma A, 1175, 242-248) que puede actuar como antioxidante.
Por lo tanto, estos resultados confirman y cuantifican que los niveles de Q10 aumentan en la mitocondria tras la adición exógena de Q10 al medio. Un descubrimiento sorprendente e inesperado fue que la Q10 se mantuvo en la forma oxidada proporcionada (pro-oxidante) y no se convirtió en la forma reducida (antioxidante) de Q10H2 en ninguna cantidad significativa.
Ejemplo 6: Matrices de PCR en tiempo real Experimento 1: Matriz de apoptosis Como se indicó anteriormente en el Ejemplo 3, la exposición de células cancerosas a la Q10 induce la muerte de una parte de estas células debido a procesos apoptóticos. Para identificar proteínas implicadas en la respuesta a la Q10, se emplearon métodos de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para identificar cambios en el nivel de ARNm para genes/proteínas implicados en matrices de vías dirigidas para la apoptosis.
Usando matrices de PCR como herramienta de análisis, se evaluó un espectro de dianas moleculares que ofrecería posiblemente una percepción del modo de acción biológica de la Q10 dentro de las células. Se evaluaron cambios en los niveles de ARNm usando cuantificación por PCR en tiempo real para evaluar los niveles de ARNm en subconjuntos preseleccionados que contenían 80 dianas específicas para las vías .
Para la interpretación de los resultados de ARNm, se identificaron y evaluaron los genes alterados en su transcripción de ARNm en un nivel doble. El nivel de transcripción génica para producir ARNm solamente proporciona un cálculo aproximado de los posibles cambios en el nivel de proteína expresada. El experto comprenderá que cada ARNm puede tener diferentes proporciones en las cuales se degrada o traduce de forma ineficaz, lo que da como resultado diferentes cantidades de proteína.
Células SkBr-3 tratadas con 50um de Q10 durante 24 horas Se utilizó el método de ensayo de RT-PCR para proporcionar una medida de cambios del nivel de ARNm para un total de 84 proteínas relacionadas con la vía apoptotica. Los experimentos con el análisis de apoptosis por PCR en tiempo real en SkBr3 con QlO (24 hr) identificaron los siguientes ARNm como afectados: Bcl2, Bcl2Ll, Bcl2Lll, Birc6, Bax, Xiap, Hprtl, Apafl, Abll, Braf. Estos resultados proporcionaron nuevamente pruebas que avalan la respuesta apoptotica de las células cancerosas al tratamiento con QlO.
Tabla 6A Símbolo Regulac Unigen Refsec Descripción Gnombre ión por amiento ^ - disminu BCL2L1 13.1957 Hs.516 M_1385 1 tipo BCL2 BCL - XL/S 966 78 BNIP2 6.3291 Hs.646 NM_0043 proteína 2 de BNIP - 2/N 490 30 interacción de IP2 19kDa E1B BCL2/adeno irus BCL2 5.4717 Hs.150 NM_0006 CLL de células Bel - 2 749 33 B/linfoma 2 BIRC6 4.7966 Hs.150 NM_0162 6 que contiene APOLLON/B 107 52 la repetición de RUCE IAP baculoviral (apollon) BCL2L11 4.6012 Hs.469 NM_0065 11 tipo BCL2 BAM/BIM 658 38 (facilitador de la apoptosis) XIAP 4.3832 Hs.356 NM 0011 Inhibidor de la API3/BIRC 076 67 apoptosis ligado 4 a X BRAF 4.3832 Hs.550 NM_0043 Homólogo del B - raf 061 33 oncogén viral de 1/BRAF1 sarcoma murino V-raf Bl BAX 3.896 Hs.631 NM_0043 Pro eína X Bax zeta 546 24 asociada con BCL2 APAF1 2.6244 Hs.708 NM 0011 Factor 1 CED4/DKFZ 112 60 activador de la p781B1145 peptidasa apoptó ica HPRT1 - 160.6 Hs.412 NM_0001 Hipoxantina HGPRT/HPR 748 707 94 fosforribosiltra T nsferasa 1 (síndrome de Lesch-Nyhan) Los resultados coherentes a partir de tres experimentos independientes de SK- EL-28 se resumen a continuación de la Tabla 6B. Muchos genes se regulan en las células de SCC, asi como con tratamiento con 100 µ? de Q10. Los genes en la matriz de apoptosis que parecen estar regulados en células SCC se describen en la Tabla 7. Encontramos que diversos genes se regulan a las 6 horas, tanto en células SK-MEL-28 como células SCC. A las 24 horas, la regulación disminuye.
Los genes que parecen regulados en células SK-MEL-28 y en células de SCC se describen en la Tabla 8.
Tabla 6B: Genes en las células SK-MEL-28 regulados mediante el tratamiento con 100 uM de Q10 cuando se analizan según la matriz de apoptosis .
Ubicació Funciones Símbolo Descripción Regulación n Posibles Oncogén 1 C- abl, cinasa de Regulado por tirosina disminución a Cinasa de ABL1 receptora las 72 horas Núcleo tirosina Vía del Atanogen Regulado por receptor asociado con aumento a las Citoplas glucocorticoide BAG1 BCL2 48 horas ma antiapoptótica Regulado por CLL de células disminución a Citoplas BCL2 B/linfoma 2 las 48 horas ma Muerte celular Proteína Al Regulado por Regula relacionada con disminución a Citoplas caspasas, BCL2A1 BCL2 las 48 horas ma fosforila TP73 Regulado por disminución a Citoplas Inhibidor de BCL2L1 1 tipo BCL2 las 72 horas ma caspasa 10 tipo BCL2 Regulado por (facilitador de disminución a Citoplas Activador de BCL2L10 la apoptosis) las 48 horas ma caspasa 11 tipo BCL2 Regulado por Activador de (facilitador de disminución a Citoplas caspasa 3 pro- BCL2L11 la apoptosis) las 48 horas ma apoptótico 3 que contiene la repetición Regulado por de IAP disminución a Citoplas BIRC3 baculoviral las 6 horas ma Anti-apoptótico 8 que contiene la repetición Regulado por de IAP disminución a Citoplas Activa la BIRC8 baculoviral las 48 horas roa caspasa Familia del dominio de reclutamiento Regulado por de caspasa, disminución a Activador de CARD8 miembro 8 las 48 horas Núcleo caspasa Caspasa 14, peptidasa de Peptidasa de cisteina Regulado por cisteina relacionada con disminución a Citoplas relacionada con CASP14 la apoptosis las 48 horas ma la apoptosis Caspasa 5, peptidasa de Peptidasa de cisteina Regulado por cisteina relacionada con disminución a Citoplas relacionada con CASP5 la apoptosis las 48 horas ma la apoptosis Ligando CD40 (superfamilia del TNF, miembro 5, Regulado por Espacio síndrome de disminución a extracel Unión al CD40LG híper-IgM) las 48 horas ular receptor CD40 Efector a tipo DFFA que induce Regulado por la muerte aumento a las Citoplas CIDEA celular 48 horas ma Pro-apoptótico Dominio de muerte asociado Regulado por con Fas disminución a Citoplas FADD (TNFRSF6) las 6 horas ma Pro-apoptótico Fas Regulado por Membrana (superfamilia aumento a las plasmáti FAS del receptor 48 horas ca Pro-apoptótico del TNF, miembro 6) Ligando Fas (superfamilia Regulado por Espacio del TNF, disminución a extracel FASLG miembro 6) las 48 horas ular Pro-apoptótico Detención del crecimiento y provocación de Regulado por daño en el ADN, aumento a las Detención del GADD45A alfa 48 horas Núcleo crecimiento Harakiri, proteina que interactúa con BCL2 (contiene Regulado por solamente el disminución a Citoplas HRK dominio BH3) las 48 horas ma Pro-apoptótico Que contiene el Regulado por activador de la dominio PYD y disminución a Citoplas proteasa PYCARD CARD las 6 horas ma apoptótica Factor de Regulado por necrosis aumento a las tumoral 48 horas y (superfamilia luego regulado Espacio Unión al del TNF, por extracel receptor del TNF miembro 2) disminución ular TNF Superfamilia Regulado por del receptor aumento a las del factor de 48 horas y necrosis luego regulado Membrana tumoral, por plasmáti Activador de TNFRSF10A miembro 10a disminución ca caspasa Superfamilia del receptor Regulado por Membrana Señalización de del factor de disminución a plasmáti p53, activación' TNFRSF10B necrosis las 72 horas ca de caspasa tumoral, miembro 10b Superfamilia del receptor del factor de necrosis Regulado por Membrana tumoral, disminución a plasmáti TNFRSF1A miembro 1A las 72 horas ca Pro-apoptótico Superfamilia del receptor del factor de necrosis Regulado por Membrana tumoral, disminución a plasmáti Activa la TNFRSF21 miembro 21 las 48 horas ca caspasa Regulado por Membrana disminución a plasmáti Inhibidor de CD27 Molécula CD27 las 48 horas ca caspasa Superfamilia del receptor del factor de necrosis Regulado por Membrana tumoral, disminución a plasmáti TNFRSF9 miembro 9 las 48 horas ca Pro-apoptótico Superfamilia de (ligandos) del factor de necrosis Regulado por Espacio tumoral, aumento a las extracel TNFSF10 miembro 10 48 horas ular Pro-apoptótico Regulado por Proteina disminución a Factor de TP73 tumoral p73 las 48 horas Núcleo transcripción Factor 3 asociado con el Regulado por receptor del disminución a Citoplas Dominio de TRAF3 TNF las 48 horas ma dedos de cinc Factor 4 asociado con el Regulado por receptor del disminución a Citoplas Dominio de TRAF4 TNF las 48 horas ma dedos de cinc Tabla 7. Genes en las células de SCC regulados mediante el tratamiento con 100 µ? de Q10 cuando se analizan según la matriz de apoptosis.
Símbolo Descripción Regulación Regulado por disminución Homólogo 1 del oncogén a las 6 horas y luego viral de timoma murino v- regulado por aumento a AK 1 akt las 24 horas Atanógeno 4 asociado con Regulado por aumento a BAG4 BCL2 las 24 horas Proteina X asociada con Regulado por aumento a BAX BCL2 las 24 horas Regulado por aumento a BCL2 CLL de células B/linfoma 2 las 24 horas Regulado por disminución a las 6 horas y luego regulado por aumento a BCL2L1 1 tipo BCL2 las 24 horas 3 que contiene la repetición de IAP Regulado por disminución BIRC3 baculoviral a las 6 horas proteína 3 de interacción de 19kDa E1B Regulado por disminución BNIP3 BCL2/adenovirus a las 24 horas Familia del dominio de reclutamiento de caspasa, Regulado por disminución CARD6 miembro 6 a las 6 horas Caspasa 6, peptidasa de cisteina relacionada con Regulado por aumento a CASP6 la apoptosis las 24 horas Caspasa 7, peptidasa de cisteina relacionada con Regulado por aumento a CASP7 la apoptosis las 24 horas Molécula CD40, miembro 5 de la superfamilia del Regulado por disminución CD40 receptor del TNF a las 6 horas Dominio de muerte asociado Regulado por aumento a FADD. con Fas (TNFRSF6) las 24 horas Detención del crecimiento y provocación de daño en Regulado por aumento a GADD45A el ADN, alfa las 24 horas Harakiri, proteina que interactúa con BCL2 (contiene solamente el Regulado por aumento a HRK dominio BH3) las 24 horas Superfamilia del receptor del factor de necrosis Regulado por disminución TNFRSF21 tumoral, miembro 21 a las 6 horas Regulado por disminución Superfamilia del receptor a las 6 horas y luego del factor de necrosis regulado por aumento a TNFRSF25 tumoral, miembro 25 las 24 horas Regulado por disminución CD27 Molécula CD27 a las 6 horas Superfamilia del receptor del factor de necrosis Regulado por disminución TNFRSF9 tumoral, miembro 9 a las 6 horas Superfamilia de (ligandos) del factor de necrosis Regulado por aumento a TNFSF10 tumoral, miembro 10 las 24 horas Regulado por disminución CD70 Molécula CD70 a las 6 horas Regulado por aumento a TP53 Proteína tumoral p53 las 24 horas Regulado por disminución a las 6 horas y luego regulado por aumento a TP73 Proteina tumoral p73 las 24 horas Factor 2 asociado con el Regulado por aumento a TRAF2 receptor del TNF las 24 horas Tabla 8. Genes de la matriz de apoptosis regulados con el tratamiento con 100 µ? de Q10 tanto en células SK-MEL-28 como SCC.
Símbolo Descripción BCL2 CLL de células B/linfoma 2 BCL2L1 1 tipo BCL2 (Bcl-xl) 3 que contiene la repetición de IAP BIRC3 baculoviral FADD Dominio de muerte asociado con Fas (TNFRSF6) Detención del crecimiento y provocación de GADD45A daño en el ADN, alfa Superfamilia del receptor del factor de TNFRSF21 necrosis tumoral, miembro 21 CD27 Molécula CD27 Superfamilia del receptor del factor de TNFRSF9 necrosis tumoral, miembro 9 Superfamilia de (ligandos) del factor de TNFSF10 necrosis tumoral, miembro 10 TP73 Proteína tumoral p73 TRAF2 Factor 2 asociado con el receptor del TNF De manera interesante, los niveles de ARNm alterados mostraron una regulación por aumento significativa en una serie de proteínas apoptóticas, con Bcl-xl como una de las más elevadas. Esto también se observó en los experimentos de la matriz de proteínas en células SK-MEL-28.
Bcl-xl es una molécula transmembrana en la mitocondria (Bcl-xl significa "linfoma de células básales extra-largo") . Está implicada en la vía de transducción de señales del FAS-L y es una de las muchas proteínas anti-apoptóticas miembro de la familia de proteínas Bcl-2. Ha estado implicada en la supervivencia de células cancerosas. No obstante, se sabe que el corte y empalme alternativo de ARNm de Bcl-x humano puede dar como resultado al menos dos especies de ARNm de Bcl-x distintas, Bcl-xL y Bcl-xS. El producto de proteína predominante (233 aminoácidos) es el mayor ARNm de Bcl-x, Bcl-xL, que inhibe la muerte celular tras el retiro del factor de crecimiento (Boise et ál., 1993. Cell 74, 597-608). Bcl-xS, por otra parte, inhibe la capacidad de Bcl-2 de inhibir la muerte celular y vuelve a las células más susceptibles a la muerte celular apoptótica. Los ensayos empleados no distinguen qué isoforma de Bcl-x se regula por aumento. La isoforma de Bcl-x que se regula por aumento mediante la CoQlO en estos estudios se puede determinar a través de métodos de rutina conocidos en la técnica, por ej . , mediante el uso de métodos de RT-PCR para evaluar la proporción de las dos isoformas de corte y empalme de ARNm (Bcl-xL en comparación con Bcl-sL) .
A partir del estudio de proteínas relacionadas apoptóticas, se observó que había múltiples factores pro y anti-apoptóticos en la familia BCL-2 o que interactúan con estos factores y tienen niveles de expresión modulados (BCL2L11, BNIP2, BAG1, HRK, BAK1, BCL2 , BCL2L1). Estas proteínas controlan la permeabilización de la membrana exterior mitocondrial .
Se observa un marcador temprano para la respuesta apoptótica con la regulación por aumento de la Caspasa-9 (16 horas) , lo cual es coherente con las observaciones previas de apoptosis con las proteínas de caspasa 3/7. La provocación de vías de señalización de estrés da lugar a la liberación de citocromo c a partir de la mitocondria y la activación de apaf-1 (apoptosoma) que, a su vez, escinde la proenzima de la caspasa-9 en la forma activa. Luego del inicio, la caspasa-9 procede a la escisión de la procaspasa-3 y la procaspasa-7 para desencadenar vías apoptóticas adicionales.
También hay un nexo coherente con la modulación de la familia de proteínas del receptor del factor de necrosis tumoral .
También se observa una fuerte regulación por disminución de la proteína tumoral p73. Los análisis de muchos tumores típicamente encontrados en humanos, incluyendo el cáncer de mama y de ovario, muestran una gran expresión de p73 en comparación con los tejidos normales en las áreas correspondientes. Hallazgos recientes sugieren que la sobreexpresión desregulada de los factores de transcripción en el cuerpo implicados en la regulación del ciclo celular y la síntesis del ADN en células de mamífero (es decir, E2F1) induce la expresión de p73. La idea es que p73 puede ser una oncoproteína, pero puede implicar mecanismos diferentes a la proteína p53 relacionada. Un mapeo con esquemas de la vía de apoptosis se proporciona en las Figuras 13A y 13B.
Células SKMEL-28 A partir del estudio de proteínas relacionadas apoptóticas, se observó que había múltiples factores pro y anti-apoptóticos en la familia BCL-2 o que interactúan con estos factores y tienen niveles de expresión modulados (BCL2L11, BNIP2, BAG1, HRK, BAK1, BCL2 , BCL2L1) . Estas proteínas controlan la permeabilización de la membrana exterior mitocondrial .
Se observa un marcador temprano para la respuesta apoptótica con la regulación por aumento de la Caspasa-9 (16 horas) , lo cual es coherente con las observaciones previas de apoptosis con las proteínas de caspasa 3/7. La provocación de vías de señalización de estrés da lugar a la liberación de citocromo c a partir de la mitocondria y la activación de apaf-1 (apoptosoma) que, a su vez, escinde la proenzima de la caspasa-9 en la forma activa. Luego del inicio, la caspasa-9 procede a la escisión de la procaspasa-3 y la procaspasa-7 para desencadenar vías apoptóticas adicionales.
Tabla 9. Cambios en los niveles de ARNm para las células SKMEL-28 tratadas con 100 µ? de A10, evaluados según matrices de RT-PCR con énfasis en las vías apoptóticas .
Refsec Descripción Símbolo 6 hr 16 hr 24 hr 72 hr de Q10 de Q10 de Q10 de Q10 NM_006538 11 tipo BCL2 BCL2L11 2.13 2.41 1.92 2.51 (facilitador de la apoptosis) NM_000875 Receptor 1 del IGF1R 1.77 1.09 1.33 1.25 factor de crecimiento tipo insulina NM_004048 Beta-2- B2M 1.74 1.76 1.58 3.11 microglobulina NM_003921 CLL de células BCL10 1.55 1.87 1.48 -3.11 B/linfoma 10 NM_004330 proteína 2 de BNIP2 1.46 1.51 1.57 -1.61 interacción de 19kDa E1B BCL2/adenovirus NM_005157 Oncogén 1 C- ABL1 1.42 2.77 -1.22 -2.03 abl, cinasa de tirosina receptora NM_004323 Atanógeno BAG1 1.41 1.44 -1.61 -2.45 asociado con BCL2 NM_001229 Caspasa 9, CASP9 1.32 3.96 1.83 1.14 peptidasa de cisteina relacionada con la apoptosis NM_003806 Harakiri, HRK 1.18 4.52 2.73 -1.14 proteína que interactúa con BCL2 (contiene solamente el dominio BH3) NM_001924 Detención del GADD45A 1.07 3.34 1.13 -2.36 crecimiento y provocación de daño en el ADN, alfa NM_001188 Destructor/Anta BAK1 1.06 2.73 -1.00 -4.54 gonista de BCL- 2 1 NM_004295 Factor 4 TRAF4 -1.91 2.63 -1.58 -740.66 asociado con el receptor del TNF NM_003842 Superfamilia TNFRSF10B -2.07 1.53 -1.81 -710.49 del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 10b NM 000633 CLL de células BCL2 -2.98 -1.63 -2.82 -11.36 B/linfoma 2 NM_001242 Molécula CD27 CD27 -3.40 -2.38 -1.35 -12.72 NM_014430 Efector b tipo CIDEB -3.48 1.56 -3.69 -2.59 DFFA que induce la muerte celular NM 001065 Superfamilia TNFRSF1A -4.53 2.28 -3.30 1.22 del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 1A NM_005427 Proteina TP73 -4.66 -9.80 -8.71 -26.96 tumoral p73 NM_003844 Superfamilia TNFRSF10A -4.84 -5.26 -4.33 -11.84 del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 10a NM_138578 1 tipo BCL2 BCL2L1 -4.94 -1.80 -6.17 -7.04 ??_001165 3 que contiene BIRC3 -13.68 -1.98 -2.42 -3.42 la repetición de IAP baculoviral Hay un nexo coherente con la modulación de la familia de proteínas del receptor del factor de necrosis tumoral.
También se observa una fuerte regulación por disminución de la proteína tumoral p73. Los análisis de muchos tumores típicamente encontrados en humanos, incluyendo el cáncer de mama y de ovario, muestran una gran expresión de p73 en comparación con los tejidos normales en las áreas correspondientes. Hallazgos recientes sugieren gue la sobreexpresión desregulada de los factores de transcripción en el cuerpo implicados en la regulación del ciclo celular y la síntesis del ADN en células de mamífero (es decir, E2F1) induce la expresión de p73. La idea es que p73 puede ser una oncoproteína, pero puede implicar mecanismos diferentes a la proteína p53 relacionada.
Experimento 2 : Matrices de PCR en tiempo real usando matriz de protección antioxidante y estrés oxidativo Para identificar las proteínas implicadas en la respuesta a la Q10, se utilizaron métodos de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para identificar cambios en el nivel de ARNm para genes/proteínas implicados en matrices de vías dirigidas para el estrés oxidativo y la protección antioxidante.
La Tabla 10 a continuación proporciona una lista de genes que se regulan en las células SK-MEL28 con el tratamiento con 100 µ? de Q10. Los resultados se proporcionan solamente para aquellos genes regulados en dos experimentos independientes. Si bien hay una cantidad significativa de regulación génica observada a las 6 horas, los cambios más significativos en los niveles de ARN se observan a las 48 horas .
Tabla 10. Genes en las células SK-MEL-28 que se regulan mediante el tratamiento con 100 µ? de Q1Ó según se observó en las matrices de protección antioxidante y estrés oxidativo .
Símbo Ubicació lo Descripción Regulación n Funciones Posibles Regulación por disminución Espacio a las 48 extracel Proteina portadora, ALB Albúmina horas ular antiapoptótica Regulación Produce radicales por aumento libres, proceso a las 16 Citoplas metabólico de AOX1 Aldehido oxidasa 1 horas ma fármacos Regulación por disminución Espacio a las 48 extracel APOE Apolipoproteína E horas ular Metabolismo lipidico Regulación Homólogo 1 de la por proteina disminución antioxidante ATX1 a las 48 Citoplas AT0X1 (levadura) horas ma Metabolismo del cobre Regulación proteína 3 de por interacción de disminución 19kDa E1B a las 48 Citoplas BNIP3 BCL2/adenovirus horas ma Anti-apoptótico Regulación El que contiene el por dominio de choque disminución por frío, unión al a las 48 Citoplas Regulación CSDE1 ARN horas ma transcripcional .
Regulación por disminución Citocromo b-245, a las 48 Citoplas CYBA polipéptido alfa horas ma Apoptótico Regulación por disminución a las 48 Citoplas peroxidasa, CYGB citoglobina horas ma transportador Regulación por Portador de 24- disminución electrones, se une a DHCR2 deshidrocolesterol a las 6 Citoplas TP53, implicado en la 4 reductasa horas ma apoptosis .
Regulación por aumento Membrana Unión al ion de a las 48 plasmáti calcio, portador de DUÓX1 Oxidasa dual 1 horas ca electrones .
Regulación por disminución a las 48 Desconoc Unión al ion de DU0X2 Oxidasa dual 2 horas ida calcio Regulación por disminución Epóxido hidrolasa a las 48 Citoplas Metabolismo del ácido EPHX2 2, citoplásmica horas ma araquidónico Regulación por disminución Metabolismo de Peroxidasa del a las 48 Citoplas fenilalanina, EPX eosinófilo horas ma apoptosis .
Regulación por Portador de Glutationa disminución electrones, se une a peroxidasa 2 a las 48 Citoplas TP53, implicado en la GPX2 (gastrointestinal) horas ma apoptosis .
Regulación Metabolismos del Glutationa por aumento Espacio ácido araquidónico, peroxidasa 3 a las 48 extracel regulado por aumento GPX3 (plasma) horas ular en carcinomas.
Glutationa peroxidasa 5 (proteina Regulación relacionada con el por aumento Espacio epididimal a las 48 extracel Metabolismo del ácido GPX5 andrógeno) horas ular araquidónico Regulación por Glutationa disminución Espacio peroxidasa 6 a las 48 extracel Metabolismo del ácido GPX6 (olfatoria) horas ular araquidónico Regulación por Metabolismo del disminución glutamato y la Glutationa a las 48 Citoplas glutationa, GSR reductasa horas ma apoptosis .
Regulación por Factor de disminución Activador transcripción a las 6 transcripcional, GTF2I general II, i horas Núcleo transcripción de fos.
Regulación Queratina 1 por aumento (hiperqueratosis a las 48 Citoplas KRT1 epidermolitica) horas ma Unión a azúcar.
Regulación por disminución Espacio a las 48 extracel Metabolismo de LPO Lactoperoxidasa horas ular fenilalanina .
Regulación Lectina de unión a por Señalización de mañosa (proteina disminución Espacio complemento, C) 2, soluble a las 48 extracel reconocimiento de MBL2 (defecto opsónico) horas ular patrón en receptores.
Regulación Glutationa S- por aumento transferasa 3 a las 16 Citoplas Metabolismo MGST3 microsomal horas ma xenobiótico Regulación por disminución Metabolismo de a las 48 Citoplas fenilalanina, MPO Mieloperoxidasa horas ma antiapoptótico.
Regulación por Proteína de disminución membrana interna a las 6 Citoplas Mantenimiento del ADN MPV17 mitocondrial MpV17 horas ma mitocondrial Regulación por disminución a las 48 Citoplas MT3 Metalotioneína 3 horas ma Unión al ion de cobre Factor 1 citosólico de neutrófilos Regulación (enfermedad por granulomatosa disminución crónica, autosomal a partir de Citoplas Produce radicales NCF1 1) las 6 horas ma libres Factor 2 citosólico de neutrófilos (65kDa, enfermedad Regulación granulomatosa por aumento crónica, autosomal a las 48 Citoplas Portador de NCF2 2) horas ma electrones .
Células no Regulación metastásicas 5, por proteína expresada disminución Metabolismo de en (nucleósido- a las 48 Desconoc cinasa, purina y NME5 difosfato-cinasa) horas ida pirimidina .
Regulación Sintasa de óxido por Señalización del nítrico 2A disminución receptor de (inducible, a las 48 Citoplas glucocorticoides, N0S2A hepatocitos) horas ma apoptosis .
Regulación por disminución Resistencia a la a las 48 Citoplas Responde al estrés 0XR1 oxidación 1 horas ma oxidativo.
Regulación por aumento PDLIM Dominio 1 de PDZ y a las 48 Citoplas Activador de la 1 LIM (elfina) horas ma transcripción.
Regulación Proteína de unión por a la disminución PIP3- fosfoinositida a las 48 Citoplas E PIP3-E horas ma Peroxidasa .
Regulación Incidencia en el por metabolismo de la disminución fenilalanina . a las 6 Citoplas Incidencia en la PRDX2 Peroxirredoxina 2 horas ma muerte celular.
Regulación por disminución a partir de Citoplas Tioredoxina PRDX4 Peroxirredoxina 4 las 24 horas ma peroxidasa .
Intercambiador RAC Regulación 1 dependiente del por ¦ 3, , 5-trifosfato disminución de a las 48 Citoplas Forma radicales P EX1 fosfatidilinositol horas ma libres de oxigeno.
Regulación por disminución Espacio a las 48 extracel Incidencia en la PRG3 Proteoglicano 3 horas ular muerte celular.
Sintasa prostaglandin- Regulación endoperóxido 1 por metabolismo del ácido (prostaglandina disminución araquidónico, G/H sintasa y a las 48 Citoplas síntesis de la PTGS1 ciclooxigenasa) horas ma prostaglandina .
Sintasa prostaglandin- endoperóxido 2 Regulación metabolismo del ácido (prostaglandina por aumento araquidónico, G/H sintasa y a las 48 Citoplas síntesis de la PTGS2 ciclooxigenasa) horas ma prostaglandina .
Regulación se une a TRAF , unión Homólogo de la por aumento al ion de calcio, peroxidasina a las 48 Desconoc unión del ion de PXDN (drosófila) horas ida hierro.
Regulación por Tipo (drosófila) disminución peroxidasa, unión al homólogo de la a las 48 Desconoc ion de calcio, unión PXDNL peroxidasina horas ida del ion de hierro.
Regulación por aumento apoptótico, unión al proteína del dedo a las 16 ion de cobre, vía de RNF7 anular 7 horas Núcleo ubiquitina .
Regulación Cinasa 2 regulada por por disminución glucocorticoides/s a las 48 Citoplas Cinasa, regulador del SGK2 uero horas ma canal de potasio.
Sirtuina (homólogo 2 de regulación de la información del tipo de Regulación emparej amiento por aumento silencioso) 2 (S. a las 16 Factor de SIRT2 cerevisiae) . horas Núcleo transcripción Superóxido dismutasa 1, soluble (esclerosis Regulación lateral por aumento amiotrófica 1, a las 16 Citoplas Activador de la S0D1 (adulto) ) horas ma caspasa, apoptótico Regulación Superóxido por aumento dismutasa 2, a las 16 Citoplas Apoptótico, regulado SOD2 mitocondrial horas ma por el TNF Regulación por Superóxido disminución Espacio dismutasa 3, a las 48 extracel SOD3 extracelular horas ular Pro-apoptótico Regulación por Homólogo de la disminución sulfiredoxina 1 a las 48 Citoplas Unión al ADN, SRXN1 (S. cerevisiae) horas ma oxidorreductasa Regulación yodación de por tiroglobulina, disminución Membrana metabolismo de Peroxidasa a las 48 plasmáti tirosina, metabolismo TPO tiroidea horas ca de fenilalanina .
Regulación por Señalización del disminución citoesqueleto de a las 48 Citoplas actina, señalización ??? Titina horas ma de integrina Regulación 2 que contiene el por dominio de disminución TXNDC tioredoxina a las 48 Citoplas Metabolismo de 2 (espermatozoides) horas ma pirimidina El factor 2 citosólico de neutrofilos (NCF2, 65kDa, enfermedad granulomatosa crónica, autósomal 2) fue uno de los ARNm más inducidos al inicio (observado a las 6 horas) . Posteriormente, a las 16 horas y en lo sucesivo, el factor 1 citosólico de neutrofilos (NCF1) (enfermedad granulomatosa crónica, autósomal 1) se indujo a niveles muy elevados luego de una fase de retraso inicial.
El factor 2 citosólico de neutrofilos es la subunidad citosólica del complejo multiproteico conocido como NADPH oxidasa, comúnmente encontrada en los neutrofilos. Esta oxidasa produce una explosión de superóxidó que se suministra a la luz del fagosoma de neutrofilos.
La NADPH oxidasa (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato-oxidasa) es un complejo enzimático unido a la membrana. Se puede encontrar en la membrana plasmática, asi como en la membrana del fagosoma. Está compuesto por seis subunidades. Estas subunidades son: • una guanosina trifosfatasa Rho (GTPasa) , normalmente Racl o Rac2 (Rae significa sustrato de la toxina botulínica C3 relacionada con Rho) • Cinco unidades "phox" (Phox significa oxidasa fagocítica) o P91-PH0X (contiene hemo) o p22phox o p40phox o p47phox (NCF1) o p67phox (NCF2) Cabe destacar que no cambian otros niveles de NADPH oxidasa. La enzima es NOX5, que es una NADPH oxidasa novedosa que genera superóxido y funciona como un canal H+ de forma dependiente de Ca(2+).
Adicionalmente, también se reguló por aumento el intercambiador 1 RAC dependiente del 3, , 5-trifosfato de fosfatidilinositol (PREX1) . Esta proteína actúa como un factor de intercambio del nucleótido de guanina para la familia RHO de proteínas de unión a GTP pequeñas (RAC) . Ha mostrado unirse y activar RAC1 intercambiando GDP unida por GTP libre. La proteína codificada, que se encuentra principalmente en el citoplasma, se activa mediante la fosfatidilinositol-3 , 4 , 5-trifosfato y las subunidades beta-gamma de proteínas G heterotriméricas .
La segunda proteína principal inducida temprana fue la sintasa de óxido nítrico 2A (inducible, hepatocitos) (N0S2A) .
El óxido nítrico es un radical libre reactivo que actúa como un mediador biológico en diversos procesos, incluyendo la neurotransmisión y las actividades antimicrobianas y antitumorales . Este gen codifica una sintasa de óxido nítrico que se expresa en el hígado y se puede inducir mediante una combinación de lipopolisacáridos y algunas citocinas.
La superóxido dismutasa 2, mitocondrial (S0D2) es un miembro de la familia de superóxido dismutasa de hierro/manganeso. Codifica una proteína mitocondrial que forma un homotetrámero y se une a un ion de manganeso por subunidad. Esta proteína se une a los subproductos de superóxido de la fosforilación oxidativa y los convierte en peróxido de hidrógeno y oxígeno diatómico. Las mutaciones en este gen se han asociado con la cardiomiopatía idiopática (IDC), el envejecimiento prematuro, la enfermedad de la neurona motora esporádica y el cáncer.
Un ejemplo de una proteína regulada por disminución es la secuencia de cabeza de tenedor MI (FOXMl), que se sabe que tiene una incidencia fundamental en el avance del ciclo celular, donde alcanza su pico la expresión de FOXMl endógena en las fases S y G2/M. Estudios recientes han demostrado que FOXMl regula la expresión de una matriz amplia de genes específicos para G2/M, como Plkl, ciclina B2, Nek2 y CENPF, y tiene una incidencia fundamental en el mantenimiento de la segregación cromosomal y la estabilidad genómica. Ahora se conoce al gen FOXMl como un proto-oncogén humano. La regulación por aumento anormal de FOXMl está implicada en la oncogénesis del carcinoma de células básales (BCC) . La regulación por aumento de FOXMl se encontró posteriormente en la mayoría de los cánceres humanos sólidos, incluyendo el de hígado, mama, pulmón, próstata, cérvix del útero, colon, páncreas y cerebro. Estudios adicionales con BCC y Q10 deberían evaluar los niveles de FOXMl.
Células SKMEL-28 Se realizaron experimentos adicionales usando células SKMEL-28. El nivel de ARNm presente en las células SKMEL-28 tratadas con 100 µ? de Q10 se comparó con los niveles de células sin tratar en diversos puntos usando métodos de PCR en tiempo real (RT-PCR) . La matriz de PCR (SABiosciences) es un conjunto de ensayos optimizados de cebadores de PCR en tiempo real en placas de 96 pocilios para genes con foco en vías o enfermedades, así como controles de calidad del ARN apropiados. La matriz de PCR realiza análisis de expresión génica con sensibilidad a la PCR en tiempo real y la capacidad de determinar perfiles de genes múltiples de una micromatriz .
Tabla 11. Lista y clasificación de los niveles de ARNm evaluados en la matriz de PCR de protección antioxidante y estrés oxidativo. Luego de seis horas de tratamiento con 100 µ? de Q10 en células SKMEL-28, los mayores cambios en los niveles de ARNm se indican resaltando el código de la proteina (aumento -negrita; disminución -subrayado o sin cambio -gris) .
Antioxidantes : Glutationa Peroxidasas (GPx) : GPX1, j, GPX3, GPX , _Peroxirredoxinas (TPx) : PRDX1, PRDX2, PRDX3, PRDX , PRDX5 PRDX6.
Otras Peroxidasas: CAT, CYGB, |3Ü ¾BÜO ¾, EPX GPR156, mmm, PTGS2, PXDN, PXDNL, TPO, TTN.
Otros antioxidantes: ¡ffEBj, APOE, GSR, MT3, SELS, SOD1, SRXN1, TXNDC2 , TXNRDl, Genes implicados en el metabolismo de especies de oxigeno reactivo (ROS) : Superóxido Dismutasas (SOD) : S0D1, Otros genes implicados, en el metabolismo de superóxido: ALOX12, CCS, CYBA, DU0X1, DUOX2, MT3, NCF1, NCF2, NOS2A, |¾§, ???' PRG3.
Otros genes implicados en el metabolismo de ROS: AOX1, BNIP3, K 2, PV17, SFTPD.
Genes que responden al estrés oxidativo: ANGPTL7, APOE, AT0X1, CAT, CCL5, CYGB, DGDK, DHCR24, DUOXl, DU0X2, DUSP1, EPX, F0XM1, GLRX2, GPR156, GPX1, gggg, GPX3, GPX4, , GSS, KRT1, BP¾. MSRA, N E5, NUDT1, OXRl, OXSR1, PDLIM1, PNKP, PRDX2, PRDX5, PRDX6, PRNP, RNF7, S¾aFO¾¾, SGK2, SIRT2, SOD1, SRXN1, STK25, Sil, TTN, Tabla 12. Evaluación en el tiempo del tratamiento con 100 µ? de SKMEL-28. Los cambios en los niveles de ARNm se controlaron a través de métodos de RT-PCR y se evaluó la matriz de proteínas de protección antioxidante y estrés oxidativo.
Refa se Símbol Descripción 6 hr 16 hr 24 hr 48 hr 72 hr o de Q10 de de de Q10 de Q10 Q10 Q10 NM_00026 NCF1 Factor 1 0 alto 3.382 15.783 31.536 5 citosólico de 9 8 9 neutrófilos (enfermedad granulomatosa crónica, autosomal 1) N _01242 RPL13A Proteina ribosomal -0.902 3.185 2.549 4.9253 7.82 3 L13a 5 7 2 NM_0.2082 PREX1 Intercambiador RAC -3.297 2.867 0.322 6.3719 7.476 0 1 dependiente del 1 2 3,4, 5-trifosfato de fosfatidilinositol NM_0¡1223 SIRT2 Sirtuina (homólogo -0.902 4.082 4.476 5.7166 6.6257 7 2 de regulación de 5 9 6 la información del tipo de empare amiento silencioso) 2 (S. cerevisiae) .
NM_00512 CCS Chaperona de cobre -0.620 3.007 3.452 2.9801 6.1539 5 para la superóxido 6 7 dismutasa NM_18165 PRDX5 Peroxirredoxina 5 -2.995 3.045 3.538 4.7955 6.0169 2 4 1 NM_01627 SGK2 Cinasa 2 regulada 0 0 0 0.5995 5.937 6 por glucocorticoides/s uero NM_00355 NME5 Células no -0.665 3.113 3.369 3.1549 5.782 1 metastásicas 5, 2 8 4 proteina expresada en (nucleósido- difosfato-cinasa) NM_00441 DUSP1 Fosfatase 1 de -0.699 0.590 2.771 3.321 5.5375 7 especificidad dual 8 2 3 NM_00175 CAT Catalasa -0.858 2.842 0.104 3.8557 5.3988 2 9 4 6 NM_00004 APOE Apolipoproteina E -0.821 3.206 -0.95 3.7694 5.3315 1 2 9 43 NM_00010 CYBA Citocromo b-245, -0.394 4.347 3.920 6.2452 5.0762 1 polipéptido alfa 5 5' 8 NM_0'00 3 NCF2 Factor 2 1.2266 3.007 0.095 5.476 0 3 citosólico de 7 4 neutrófilos (65kDa, enfermedad granulomatosa crónica, autosomal 2) NM_00096 PTGS2 Prostaglandin- -0.691 2.704 2.655 4.0553 -3.302 3 endoperóxido 2 6 2 2 sintasa 2 (prostaglandina G/H sintasa y ciclooxigenasa) NM_18307 PRNP Proteina de prión -0.214 3.523 2.908 5.0837 -3.939 9 (p27-30) 4 6 6 6 (enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de Gerstmann- Strausler- Scheinker, insomnio familiar fatal) NM_00405 BNIP3 proteina 3 de -2.937 3.328 4.312 -18.20 -4.842 2 interacción de 6 8 69 4 19kDa E1B BCL2/adenovirus NM_00024 MBL2 Lectina de unión a -0.362 -1.90 -3.01 -1.185 -6.454 2 mañosa (proteina 2 72 42 4 4 C) 2, soluble (defecto opsónico) NM_02195 F0XM1 Secuencia cabeza -0.813 0.068 -0.92 3.3655 -10.09 3 de tenedor MI 5 16 53 El factor 2 citosólico de neutrófilos (NCF2, 65kDa, enfermedad granulomatosa crónica, autosomal 2) fue uno de los ARNm más inducidos al inicio (observado a las 6 horas) . Posteriormente, a las 16 horas y en lo. sucesivo, el factor 1 citosólico de neutrófilos (NCF1) (enfermedad granulomatosa crónica, autosomal 1) se indujo a niveles muy elevados luego de una fase de retraso inicial.
El factor 2 citosólico de neutrófilos es la subunidad cictosólica del complejo multiproteico conocido como NADPH oxidasa, comúnmente encontrada en los neutrófilos. Esta oxidasa produce una explosión de superóxido que se suministra a la luz del fagosoma de neutrófilos. La NADPH oxidasa (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato-oxidasa) es un complejo enzimático unido a la membrana. Se puede encontrar en la membrana plasmática, asi como en la membrana del fagosoma. Está compuesto por seis subunidades. Estas subunidades son: • una guanosina trifosfatasa Rho (GTPasa) , normalmente Racl o Rac2 1 (Rae significa sustrató de la toxina botulínica C3 relacionada con Rho) • Cinco unidades "phox" (oxidasa fagocítica) .
P91-PHOX (contiene hemo) p22phox p40phox p47phox (NCF1) p67phox (NCF2) Cabe destacar que no cambian otros niveles de NADPH oxidasa. La enzima es N0X5, que es una NADPH oxidasa novedosa que genera superóxido y funciona como un canal H+ de forma dependiente de Ca(2+).
Adicionalmente, también se reguló por aumento el intercambiador 1 RAC dependiente del 3 , 4 , 5-trifosfato de fosfatidilinositol (PREX1) . Esta proteina actúa como un factor de intercambio del nucleótido de guanina para la familia RHO de proteínas de unión a GTP pequeñas (RAC) . Ha mostrado unirse y activar RAC1 intercambiando GDP unida por GTP libre. La proteína codificada, que se encuentra principalmente en el citoplasma, se activa mediante la fosfatidilinositol-3, 4, 5-trifosfato y las subunidades beta-gamma de proteínas G heterotriméricas.
La segunda proteína principal inducida temprana fue la sintasa de óxido nítrico 2A (inducible, hepatocitos) (N0S2A) . El óxido nítrico es un radical libre reactivo que actúa como un mediador biológico en diversos procesos, incluyendo la neurotransmisión y las actividades antimicrobianas y antitumorales . Este gen codifica una sintasa de óxido nítrico que se expresa en el hígado y se puede inducir mediante una combinación de lipopolisacáridos y algunas citocinas.
Un ejemplo de una proteína regulada por disminución es F0XM1, que se sabe que tiene una incidencia fundamental en el avance del ciclo celular donde alcanza su pico la expresión de F0X 1 endógena en las fases S y G2/M. Estudios recientes han demostrado que F0XM1 regula la expresión de una matriz amplia de genes específicos para G2/M, como Plkl, ciclina B2, Nek2 y CENPF, y tiene una incidencia fundamental en el mantenimiento de la segregación cromosomal y la estabilidad genómica. Ahora se conoce al gen FOX 1 como un proto-oncogén humano. La regulación por aumento anormal de FOXM1 está implicada en la oncogénesis del carcinoma de células básales (BCC), . La regulación por aumento de FOXM1 se encontró posteriormente en la mayoría de los cánceres humanos sólidos, incluyendo de hígado, mama, pulmón, próstata, cérvix, útero, colon, páncreas y cerebro.
Experimento 3 : Matrices de PC en tiempo real usando una matriz de choque térmico Se ejecutaron matrices de choque térmico para las células de SCC y los datos de genes regulados se resumen a continuación en la Tabla 13.
Tabla 13. Genes de la matriz de choqué térmico regulados con el tratamiento con 100 uM de Q10 en células de SCC.
Símbolo Descripción Regulación Ubicación Funciones Posibles Chaperonina que contiene Regulada por Ensamblaje del TCP1, disminución complejo proteico subunidad 6B a las 24 y plegamiento CCT6B (zeta 2) horas Citoplasma proteico .
Responde al daño Homólogo de en el ADN y los dnaJ (Hsp40), Regulado por cambios en el subfamilia A, aumento a plegamiento de DNAJA1 miembro 1 las 6 horas Núcleo proteínas . relacionado con dnaJ Regulado por (Hsp40) , disminución Apoptosis y subfamilia B, a las 6 plegamiento DNAJB13 miembro 13 horas Desconocida proteico .
Se une a HSP, implicado en el Homólogo de Regulado por ensamblaje del dnaJ (Hsp40), disminución complejo proteico subfamilia B, a las 6 y el plegamiento DNAJB5 miembro 5 horas Desconocida proteico .
Se uñe a HSP, implicado en el Homólogo de Regulado por ensamblaje del dnaJ (Hsp40), disminución complejo proteico subfamilia Ct- a las 6 y el plegamiento DNAJC12 miembro 12 horas Desconocida proteico .
Se une a HSP, implicado en el Homólogo de Regulado por ensamblaje del dnaJ (Hsp40), disminución complejo proteico subfamilia C, a las 6 y el plegamiento DNAJC4 miembro 4 horas Citoplasma proteico .
Homólogo de Regulado por Implicado en el D AJC5B dnaJ (Hsp40), disminución Desconocida plegamiento subfamilia C, a las 6 proteico, responde miembro 5 beta horas a los cambios en el plegamiento proteico .
Regula el TNF, se Proteina 8 de Regulado por une a BAG1, STUB1, choque térmico aumento a TP53, implicada en HSPA8 de 70kDa las 6 horas Citoplasma la apoptosis.
Se une a HSPA8, importante para el plegamiento Proteina 1 de proteico, responde choque térmico Regulado por al estrés y al de aumento a desdoblamien o HSPH1 105kDa/110kDa las 6 horas Citoplasma proteico .
Experimento 4 : Matrices de PCR en tiempo real usando una matriz de diabetes Los experimentos descritos en este ejemplo se realizaron para analizar la hipótesis general de que la Q10 tendría impacto en genes múltiples y alteraría el estado metabólico de una célula. El ARNm de células SKMEL-28 tratadas con 100 µ de Q10 se evaluó mediante RT-PCR en comparación con un panel de proteínas diana implicadas en la diabetes y las vías relacionadas. Los resultados de este experimento demuestran que diversas proteínas implicadas en las vías glucólicas y el procesamiento de insulina se ven alteradas en sus niveles de expresión de ARNm (resumen en la Tabla 14) .
Tabla 14. Cambios principales en el nivel de ARNm para las células SKMEL-28 tratadas con 100 µ? de Q10 durante 16 horas.
Refsec Descripción Símbolo Cambio múltiplo luego de 16 horas (100 µ? de Q10) NM_000162 Glucocinasa GCK 8.5386 (hexocinasa 4) NM_178849 Factor nuclear de HNF4A 8.421 hepatocitos 4 alfa NM_005249 Secuencia cabeza de F0XG1 4.6396 tenedor Gl NM_000599 Proteina de unión al IGFBP5 2.2721 factor de crecimiento tipo insulina 5 NMJD01101 Actina, beta ACTB -2.0936 NM_002863 Fosforilasa, PYGL -2.65 glucógeno, hígado (enfermedad de Hers, enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo VI) NM_001065 Superfamilia del TNFRSF1A -2.8011 receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 1A N _021158 Homólogo 3 de tribbles TRIB3 -2.8011 (Drosófila) NM_003749 Sustrato del receptor IRS2 -2.9404 de insulina 2 NM_004578 RAB4A, miembro de la RAB4A -3.1296 familia del oncogén RAS NM_004176 Factor 1 de SREBF1 -3.5455 transcripción de unión al elemento regulador de esterol NM 004969 Enzima que degrada la IDE -4.4878 insulina NMJ05026 Fosfoinositida-3- PIK3CD -6.8971 cinasa, catalítica, polipéptido delta NM_000208 Receptor de insulina INSR -8.6099 NM_003376 Factor A de VEGFA -15.5194 crecimiento endotelial vascular N _001315 Cinasa de proteína MAPK14 -74.3366 activada por mitógenos 14 Los resultados de este experimento inicial muestran que los niveles de ARNm para una variedad de proteínas relacionadas con la insulina se modularon en ambas direcciones. Los resultados indican que la Q10 tendría impacto en el tratamiento y/o la evaluación de la enfermedad diabética .
Luego se realizaron experimentos adicionales para confirmar los resultados obtenidos anteriormente a partir de células SK-MEL-28 tratadas con Q10. Muchos de los genes en las células SK-MEL-28 se regulan ya a las 6 horas luego del inicio del tratamiento con Q10. No obstante, la regulación inicial se vuelve menos evidente a las 16 y las 24 horas. A alrededor de las 48 horas, se descubrió que muchos de los genes en la matriz de diabetes se ven fuertemente regulados otra vez. Los resultados coherentes de dos o más experimentos independientemente se resumen a continuación de la Tabla 15. Las células de SCC también parecieron presentar regulación en algunos genes, tanto a las 6 como a las 24 horas luego del tratamiento con Q10. Estos resultados a partir de células de SCC se resumen en el Tabla 16, mientras que los genes que se regulan tanto en las células SK-MEL-28 como en las células de SC se resumen en la Tabla 17.
Tabla 15. Genes en las células SK-MEL-28 regulados mediante el tratamiento con 100 uM de Q10 cuando se analizan según la matriz de diabetes.
Símbol Ubicació Funciones o Descripción Regulación n Posibles Señalización de cAMP, Regulado por Membrana señalización Receptor beta 3 disminución a plasmáti de la proteina ADRB3 adrenérgico las 48 horas ca G Molécula 1 de adhesión a células relacionadas con el Regulación antigeno positiva carcinoembriónico Regulado por Espacio antiapoptótica CEACAM (glucoproteina disminución a extracel de la 1 biliar) las 48 horas ular angiogénesis proteina de unión Regulado por Señalización al aumento a las del receptor CEBPA potenciador/CCAAT 48 horas Núcleo de (C/EBP), alfa glucocorticoid es, activación de VDR/RXR.
Señalización Proteina 4 asociada Regulado por Membrana del receptor con lirtfocitos T disminución a plasmáti de células T, CTLA4 citotóxicos las 48 horas ca activa CASP8.
Regulado por Fosfatasa 4 de disminución a DUSP4 especificidad dual las 48 horas Núcleo Fosfatasa Regulador negativo de la ectonucleótido Regulado por Membrana vía del pirofosfatasa/fosfo disminución a plasmáti receptor de ENPP1 diesterasa 1 las 48 horas ca insulina Secuencia de cabeza de tenedor C2 (MFH- 1, cabeza de Regulado por Factor de tenedor mesenquimal disminución a transcripción F0XC2 1) las 48 horas Núcleo antiapoptótico Regulado por aumento a las Via de la 48 horas y pentosa luego fosfato, Glucosa-6-fosfatasa regulado por Citoplas metabolismo de G6PD deshidrogenasa disminución ma glutationa .
Regulado por Desciclación Hemo oxigenasa disminución a Citoplas de la hemo HM0X1 (desciclación) 1 las 48 horas ma oxigenasa Molécula 1 de Regulado por adhesión atorvastatina, intercelular Regulado por Membrana procesa (CD54), receptor de disminución a plasmáti algunas ICAMl rinovirus humano las 48 horas ca caspasas . receptor de Regulado por Membrana Regulación por IL4R interleucina 4 disminución a plasmáti aumento las 48 horas ca mediante TP73, se une a IRS1 e IRS2 Regulado por aumento a las 48 horas y Sustrato del luego Membrana Se une al receptor de regulado por plasmáti receptor de IRSl insulina 1 disminución ca insulina Sustrato del Regulado por Membrana receptor de disminución a plasmáti Señalización IRS2 insulina 2 las 48 horas ca de IGF-1 Regulado por Factor sensible a disminución a Citoplas Señalización NSF la N-etilmaleimida las 48 horas ma de GABA Fosfoinositida-3- Regulado por cinasa, catalítica, disminución a Citoplas PIK3CD polipéptido delta las 48 horas ma Cinasa Receptor gamma activado por el Regulado por proliferador de disminución a Factor de PPARG peroxisoma las 48 horas Núcleo transcripción Regulado por Cinasa de proteína disminución a Citoplas Familia de la PR CB1 C, beta 1 las 48 horas ma P C Selectina L (molécula de Regulado por Membrana adhesión a disminución a plasmáti Activa RAS, SELL linfocitos 1) las 48 horas ca MAPK Regulado por Factor 1 de aumento a las transcripción de 48 horas y unión al elemento luego regulador de regulado por Factor de SREBF1 esterol disminución Núcleo transcripción STXBP1 proteína de unión a Regulado por Citoplas Presente en la sintaxina 1 disminución a ma fracción las 48 horas enriquecida con mielina.
Regulado por aumento a las Factor de 48 horas y crecimiento luego Espacio transformante, beta regulado por extracel TGFBl 1 disminución ular Pro-apoptótico Regulado por Activador de homeosecuencia NK2 disminución a la NKX2-1 1 las 48 horas Núcleo transcripción Factor de necrosis tumoral Regulado por Espacio (superfamilia del aumento a las extracel TNF TNF, miembro 2) 48 horas ular Pro-apoptótico Superfamilia del receptor del factor Regulado por Membrana TNFRSF de necrosis disminución a plasmáti 1A tumoral, miembro 1A las 72 horas ca Pro-apoptótico Regulado por aumento a las 58 horas y Factor A de luego crecimiento regulado por Citoplas VEGFA endotelial vascular disminución ma Cinasa Tabla 16. Genes en las células de SCC regulados mediante el tratamiento con 100 µ? de Q10 cuando se analizan según la matriz de diabetes.
Símbolo Descripción Regulación Regulado por Glucosa-6-fosfatasa G6PD disminución a las deshidrogenasa 6 horas Molécula 1 de adhesión Regulado por ICA l intracelular (CD54) , receptor disminución a las de rinovirus humano 6 horas Regulado por 1 tipo inositol polifosfato INPPL1 disminución a las fosfatasa 6 horas Regulado por sintasa de óxido nítrico 3 NOS3 disminución a las (célula endotelial) 6 horas Regulado por Fosfoinositida-3-cinasa, PIK3CD disminución a las catalítica, polipéptido delta 6 horas Regulado por Receptor activado proliferativo PPARA disminución a las de peroxisomas, alfa 6 horas Fosforilasa, glucógeno, hígado Regulado por (enfermedad de Hers, enfermedad PYGL disminución a las de almacenamiento de glucógeno 6 horas tipo VI) Factor 1 de transcripción de Regulado por SREBF1 unión al elemento regulador de disminución a las esterol 6 horas Regulado por STXBP2 proteína de unión a sintaxina 2 disminución a las 6 horas Factor de necrosis tumoral Regulado por TNF (superfamilia del TNF, miembro disminución a las 2) 6 horas Superfamilia del receptor del Regulado por TNFRSF1A factor de necrosis tumoral, disminución a las miembro 1A 6 y las 24 horas Factor A de crecimiento Regulado por VEGFA endotelial vascular disminución a las 6 horas Tabla 17. Genes de la matriz de diabetes regulados con el tratamiento con 100 uM de Q10 tanto para células SK-MEL-28 como SCC Símbolo Descripción G6PD Glucosa-6- fos fatasa deshidrogenasa Molécula 1 de adhesión intracelular ' (CD54), receptor de ICAM1 rinovirus humano PIK3CD Fosfoinositida-3-cinasa, catalítica, polipéptido delta Factor 1 de transcripción de unión al elemento regulador SREBF1 de esterol Factor de necrosis tumoral (superfamilia del TNF, miembro TNF 2) Superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, TNFRSF1A miembro 1A VEGFA Factor A de crecimiento endotelial vascular Los niveles de ARNm para una variedad de proteínas relacionadas con la insulina se modularon en ambas direcciones. La Q10 tiene impacto en la regulación del metabolismo celular y, por lo tanto, tiene influencia en enfermedades de desregulación metabólica como la diabetes. Se describen a continuación dos proteínas que se modularon de manera significativa.
Cinasa de proteína activada por mitógenos 14 (MAPK14): La cinasa de proteína activada por mitógenos 14 (MAPK14) es un miembro de la familia de cinasas MAP. Las cinasas MAP actúan como un punto de integración para múltiples señales bioquímicas y están implicadas en una amplia variedad de procesos celulares como el desarrollo y la regulación de la transcripción, la proliferación y la diferenciación. Los resultados de este experimento muestran que la MAPK14 se reguló por disminución de forma significativa.
Factor nuclear de hepatocitos 4 alfa (HNF4A) : HNF4 (factor nuclear de hepatocitos 4) es una proteina del receptor nuclear que se expresa mayormente en el hígado, el intestino, el riñón y las células beta pancreáticas, crítica para el desarrollo del hígado. En humanos, hay dos isoformas de NHF4, alfa y gamma, codificadas por dos genes separados, HNF4A y HNF4G, respectivamente. (Véase, por ej . , Chartier FL, Bossu JP, Laudet V, Fruchart JC, Laine B (1994). "Cloning and sequéncing of cDNAs encoding the human hepatocyte nuclear factor 4 indícate the presence of two isoforms in human liver". Gene 147 (2): 269-72.) HNF4 se clasificó originalmente como un receptor huérfano. No obstante, luego se descubrió que HNF4 era constitutivamente activa en virtud de su unión continua a una variedad de ácidos grasos. (Véase, por ej . , Sladek F (2002). "Desperately seeking ... something" . Mol Cell 10 (2): 219-221 y Jump DB, Botolin D, Wang Y, Xu J, Christian B, Demeure O (2005) . "Fatty acid regulation of hepatic gene transcription" . J Nutr 135 (11)). El dominio de unión al ligando de HNF4, como sucede con otros receptores nucleares, adopta un pliegue intercalado alfa-helicoidal canónico (véase, por ej . , Wisely GB, Miller AB, Davis RG, Thornquest AD Jr, Johnson R, Spitzer T, Sefler A, Shearer B, Moore JT, Miller AB, Willson TM, Williams SP (2002) . "Hepatocyte nuclear factor 4 is a transcription factor that constitutively binds fatty acids". Structure 10 (9): 1225-34 y Dhe-Paganon S, Duda K, Iwamoto M, Chi YI, Shoelson SE (2002) . "Crystal structure of the HNF4 alpha ligand binding domain in complex with endogenous fatty acid ligand". J Biol Chem 277 (41) : 37973-6) e interactúa con proteínas coactivadoras . (Véase, por ej . , Duda K, Chi YI, Shoelson SE (2004) . "Structural basis for HNF-4alpha activation by ligand and coactivator binding". J Biol Chem 279 (22): 23311-6).
Las mutaciones en el gen HNF4- se han ligado a la diabetes hereditaria juvenil de tipo 2 ( ODY) . (Véase, por ej . , Fajans SS, Bell GI, Polonsky KS (2001) . "Molecular mechanisms and clinical pathophysiology of maturity-onset diabetes of the young". N Engl J Med 345 (13): 971-80.) El factor nuclear de hepatócitos 4 (HNF4) es un factor de transcripción específico tisular que se sabe que regula una gran cantidad de genes en células pancreáticas y hepatócitos. Si bien HNF4 se expresa en gran medida en algunas partes del riñon, se sabe poco acerca de su incidencia en este órgano, así como acerca de los genes regulados por HNF4 en las células renales. La abundancia y la actividad de HNF4 se reducen frecuentemente en el carcinoma de células renales (RCC) , lo que indica determinada función de supresión tumoral de HNF4 en las células renales. De manera interesante, muchos de los genes regulados por HNF4 han mostrado verse desregulados en estudios de micromatriz de RCC. Estos genes (ACY1, WT1, SELENBP1, COBL, EFHD1, AGXT2L1, ALDH5A1, THEM2, ABCB1, FLJ14146, CSPG2 , TRIM9 y HEY1) son buenos candidatos para genes cuya actividad se ve alterada tras el descenso de HNF4 en el RCC.
En la estructura del dominio de unión al ligando de HNF4alfa (lM7W.pdb; Dhe-Paganon (2002) JBC, 277, 37973), se observó un lipido pequeño que se co-purificó a partir de la producción de E. coli. El cristal contiene dos conformaciones de la proteina, donde la hélice extendida 10 y la hélice corta 12 tienen conformaciones alternas. Tras la examinación de lá región de unión a lipidos, resultó interesante observar que hay dos regiones de salida. Una región de salida tiene el grupo principal de lipidos pequeños y se sabe que se colocalizan diversas regiones de cavidad con este puerto de salida. Una hipótesis podría ser que la Q10 se une específicamente a este factor de transcripción. Cuando la Q10 se modela en este túnel de unión a lipidos, el anillo de Q10 encajaría en la cavidad superficial (Figura 28) . Una mutación de pérdida de función conocida (E276Q) tendría el potencial de ordenar los residuos que recubren esta cavidad superficial y, por lo tanto, tienen un impacto negativo en la supuesta unión a la Q10.
Adicionalmente, con este modelo de unión a la Q10, la cola hidrofóbica se extendería más allá de la cavidad interna y entonces interactuaría con la hélice extendida 10. Por lo tanto, esta interacción podría posiblemente alterar la conformación del grupo 10/12 helicoidal. Esto luego podría alterar el equilibrio de activación/inactivación actividad del factor de transcripción.
Ejemplo 7: Análisis de micromatriz de anticuerpos La evaluación de la concentración de proteínas debido a la presencia de Q10 se evaluó a través de la utilización de métodos de micromatriz de anticuerpos. La micromatriz contenía anticuerpos para más de 700 proteínas, con muestras de un amplio espectro de tipos de proteínas y posibles marcadores de vías.
Se realizó un experimento inicial para evaluar los cambios en el nivel de concentración de proteína en células tratadas con Q10 con una micromatriz de anticuerpos (matriz de anticuerpos Panorama XP725, Sigma) y células SK-MEL-28 tratadas durante 6 o 24 horas. Las células se recolectaron y se extrajeron para obtener un sobrenadante proteico soluble. Se etiquetaron dos porciones de proteína (~1 mg total) de cada muestra (a 1 mg/mL) con tinte fluorescente (Cy3 y Cy5, respectivamente) . El exceso de tinte se retiró de la proteína y el material se utilizó para las incubaciones de micromatrices . Para comparar dos muestras de puntos diferentes, se mezclaron cantidades iguales de proteína, con cada muestra de diferente tipo de etiqueta (por ej . , el extracto a las 3 horas etiquetado con Cy3 se mezcló con el extracto a las 24 horas etiquetado con Cy5) . Luego de la incubación con el chip de micromatriz (de acuerdo con los protocolos recomendados por los fabricantes) , los chips se lavaron y se secaron. Las micromatrices se analizaron con un escáner de láser fluorescente para medir la intensidad de fluorescencia relativa para los tintes Cy3 y Cy5.
Tabla 18. Proteínas con mayores niveles en las células SK-MEL-28 luego del tratamiento de 24 horas con 50 µ? de Q10 Nombre Proporción Nombre Proporción Proteina de choque Cdkl 0.1 térmico 110 0.4 Fosfatasa de proteina DcRl 0.1 serina treonina lgl 0.4 Proteina cinasa Cb2 0.1 COX II 0.5 Receptor II soluble del factor de necrosis tumoral 0.1 HSP70 0.5 BAD 0.1 BLK 0.5 Caspasal3 0.2 Citoqueratina 8 12 0.5 FBI1 PAKEMON 0.2 BUBR1 0.5 Zixina 0.2 FOXC2 0.5 Fosfatasa de proteina Cdc25A 0.3 serina treonina 2A Bg 0.5 PIASx 0.3 MSH6 0.5 Factor de crecimiento nervioso b 0.3 DR6 0.5 Fosfatasa de proteina tirosina PEST 0.3 Radl7 0.5 hBRM hSNF2a 0.4 BAF57 0.5 Factor b pan de crecimiento GRP94 0.4 transformante 0.5 Calmodulina 0.4 BTK 0.5 Fosfatasa de proteina Fosfatasa de proteina serina treonina 2 A/B serina treonina 2C a b 0.4 pan2 0.5 ARC 0.4 CNPasa 0.5 Neurabina II 0.4 SynCAM 0.5 Sintasa de óxido Antígeno nuclear de nítrico bNOS 0.4 célula proliferativa 0.5 Fosfatasa de proteina serina treonina Ib 0.4 Tabla 19. Proteínas con mayores niveles en las células SK-MEL-28 luego del tratamiento de 24 horas con 50 µ? de Q10 Nombre Proporción Nombre Proporción BclxL 4.2 Claspina 2.1 BID 3.7 GRP75 2.1 Bmf ¦ 3.7 Caspasa 6 2.1 PUMA bbc3 3.0 ILP2 2.1 Cinasa zip 2.8 aActinina 2.1 Bmf 2.8 Vitronectina 2.1 DcR2 2.7 DRAK1 2.1 E2F1 2.7 PTEN 2.1 FAK pTyr577 2.5 Grb2 2.1 FKHRL1 FOX03a 2.5 HDAC4 2.0 MTBP 2.5 HDAC7 2.0 Sintasa de óxido Conexina 32 2.5 nítrico bNOS 2.0 Anexina VII 2.4 HDAC2 2.0 p63 2.4 p38 MAPK 2.0 SÜMOl 2.4 Reelina 2.0 IAfadina 2.3 Proteína cinasa Cd 2.0 MDMX 2.3 cerbB3 2.0 Pyk2 2.3 hSNF5 INI1 2.0 Proteína que interactúa con . el receptor RIP 2.3 Proteína cinasa Ca 2.0 Receptor de glutamato RICK 2.3 NMDAR 2a 2.0 IK a 2.3 Leptina 2.0 Bclx 2.3 Dimetil histona H3 2.0 diMeLys Afadina 2.2 BID 2.0 Proteina de la célula proliferativa Ki67 2.2 MeCP2 2.0 Receptor del factor de crecimiento nervioso Histona H3 pSer28 2.2 p75 2.0 . Cinasa de la cadena CAS LIN2 2.2 ligera de miosina 2.0 Centrina 2.2 cRaf pSer621 2.0 TOM22 2.1 GRP78 BiP 2.0 Sintasa endotelial de óxido nítrico eNOS 2.1 cMyc 2.0 Proteina cinasa Ba 2.1 Raf1 2.0 Laminina 2.1 MTA2 MTA1L 2.0 Miosina Ib nuclear 2.1 Sir2 2.0 Caspasa 7 2.1 ATF2 pThr69 71 2.0 MAP Cinasa 2 ER 2 2.1 Proteína cinasa C 2.0 KIF17 2.1 Proteína cinasa Cb2 2.0 Para confirmar las proteínas de apoptosis previamente observadas y para expandir la evaluación a una cantidad mayor de proteínas pro-apoptosis y anti-apoptosis, se eligieron dos métodos de ensayo que podían analizar la amplia familia de proteínas posiblemente implicadas.
En primer lugar, se utilizó una micromatriz de anticuerpos (matriz de anticuerpos Panorama XP725, Sigma) para analizar más de 700 anticuerpos dé proteínas para evaluar los cambios en el nivel de concentración de proteína en células SK-MEL-28 tratadas durante 24 horas con 50 µ? de Q10.
De los experimentos de matriz de anticuerpos, en SKMEL-28 con Q10 (24 hr) , las siguientes son algunas de las proteínas identificadas con niveles alterados: Bcl-xl, Bmf, BTK, BLK, cJun (pSer63) , Conexina 32, PUMA bbc3, BID, Par4, cCbl. La conclusión clave de este estudio inicial fue que se alteran las proteínas pro-apoptosis esperadas.
Micromatriz de anticuerpos para SK-MEL-28 Se utilizó una micromatriz de anticuerpos (matriz de anticuerpos Panorama XP725, Sigma) para analizar más de 700 anticuerpos de proteínas para evaluar los cambios en el nivel de concentración de proteína en células SK-MEL-28 tratadas durante 24 horas con 50 µ? de Q10.
Tabla 20. Cambios en los niveles de proteína en SKMEL-28 tratadas con 50 µ? de Q10 Noní )re Número de SKMEL28 SKMEL28 HEKa con anticuerpo siori- QlO/ / HEKa Q10/ o (Sigma) SKMEL28 de HEKa de de control control control BclxL B9429 2.46 1.04 1.83 PUMA bbc3 P4743 2.31 1.14 2.14 Bmf B1559 2.23 1.12 2.11 Bmf B1684 2.09 1.13 1.74 cJun pSer63 J2128 1.99 1.14 1.85 BLK B8928 1.94 1.05 1.51 De los experimentos de matriz de anticuerpos, en SKMEL-28 con QIO (24 hr) , las siguientes son algunas de las proteínas identificadas con niveles alterados: Bcl-xl, Bmf, BTK, BLK, cJun (pSer63) , Conexina 32, PUMA bbc3, BID, Par4, cCbl. Estos datos confirman que los niveles de proteínas pro-apoptosis se ven alterados tras la incubación con niveles elevados de QIO agregada de forma exógena.
Bcl-xl ("linfoma de células básales -extra largo") es una molécula transmembrana en la mitocondria. Está implicada en la vía de transducción de señales del FAS-L y es una de las muchas proteínas anti-apoptóticas miembro de la familia de proteínas Bcl-2. Ha estado implicada en la supervivencia de células cancerosas. No obstante, se sabe que el corte y empalme alternativo de ARNm de Bcl-x humano puede dar como resultado al menos dos especies de ARNm de Bcl-x distintas, Bcl-xL y Bcl-xS. El producto de proteína predominante (233 aminoácidos) es el mayor ARNm de Bcl-x, Bcl-xL, que inhibe la muerte celular tras el retiro del factor de crecimiento (Boise et ál., 1993. Cell 74, 597-608). Bcl-xS, por otra parte, inhibe la capacidad de Bcl-2 de inhibir la muerte celular y vuelve a las células más susceptibles a la muerte celular apoptótica.
Tabla 21. Proteínas con mayores niveles en las células de SCC luego del tratamiento de 24 horas con 100 uM de Q10.
Nombre Proporción Nombre Proporción PUMA bbc3 3.81 Sir2 2.25 HDAC7 3.21 DcR3 2.24 BID 3.12 RbAp48 RbAp46 2.21 MTBP 3.00 OGlcNAc Transferasa 2.21 p38 MAP cinasa no activada 2.93 GRP78 BiP 2.20 PKR 2.87 Sin3A 2.20 TRAIL 2.86 p63 2.20 DR5 2.86 Presenilinal 2.19 Cdk3 2.82 PML 2.18 NCaderina 2.71 PAKlpThr212 2.17 Reelina 2.68 HDAC8 2.16 Regulador de p35 Cdk5 2.63 HDAC6 2.15 Sintasa inducible de HDAC10 2.60 óxido nítrico iNOS 2.15 RAP1 2.59 Neurofibromina 2.15 PSF 2.56 Sintaxina 6 2.13 cMyc 2.55 Parquina 2.12 Metil histona H3 MeLys9 2.54 Radl7 2.11 Sintasa de óxido HDAC1 2.51 nítrico bNOS 2.10 FIA 2.48 TIS7 2.09 estatmina OP18 (estatmina ROC 1 2.45 1/oncoproteina 18) 2.08 fosfo-b-Catenina Bim 2.45 pSer45 2.07 FXR2 2.44 Neurabina II 2.07 DEDAF 2.44 Tubulina e 2.07 DcRl 2.40 PKB pThr308 2.07 Ornitina APRIL 2.40 descarboxilasa 2.07 PRMT1 2.36 P53 BP1 2.06 Pyk2 pTyr580 2.34 Pyk2 2.05 Vitronectina 2.33 HDAC5 2.05 Sinaptopodina 2.32 Conexina 43 2.05 Caspasal3 2.30 Sintrofina al 2.04 Sintaxina 8 2 29 MRP1 2.04 DR6 2 29 cerbB4 2.03 BLK 2 28 Nitrosocisteina S 2.03 ROC 2 2 28 SGK 2.02 Rab5 2.01 Hidrolasa de ubiquitina C terminal Ll 2.01 Miosina Ib nuclear 2.00 Repuesta 4 a la apoptósis prostética Par4 2.00 Tabla 22. Proteínas con menores niveles en las células de SCC luego del tratamiento de 24 horas con 100 uM de Q10.
Nombre Proporción API 0.68 Centrina 0.55 CUGBP1 0.67 Cistatina A 0.69 Citoqueratina CK5 0.60 Fibronectina 0.63 gParvin 0.70 Independiencia del factor de crecimiento 1 0.63 Factor de crecimiento nervioso b 0.60 ProCaspasa 8 0.72 Rab7 0.62 Rab9 0.73 Fosfatasa de proteina serina treonina lgl 0.71 Fosfatasa de proteina serina treonina 2A Bg 0.73 S l 0 70 SLIPR MAGI3 0 67 Espectrina a y b 0 70 Spred2 0 66 TRF1 0 74 Ejemplo 8 : Análisis de transferencia Western El primer experimento procesado y evaluado mediante transferencia Western y electroforesis en gel 2-D se realizó en la linea celular de cáncer de piel SKMEL-28. Este conjunto experimental implicó células SK-MEL-28 tratadas a las 3, 6, 12 y 24 horas con 50 o 100 µ? de Q10.
Se evaluó una variedad de tipos de células mediante análisis de transferencia Western en comparación con un anticuerpo para Bcl-xL (Figura 14), un anticuerpo para Vimentina (Figura 15) , una serie de anticuerpos para la función de fosforilación oxidativa mitocondrial (Figuras 16-21) y en comparación con una serie de anticuerpos relacionados con la integridad de la membrana mitocondrial (Figuras 22-27). Los resultados de estos experimentos demostraron que muchas de las proteínas examinadas se regularon por aumento o se regularon por disminución como resultado del tratamiento de células con Q10.
Ejemplo 9: Genes relacionados con la diabetes que se detectó que se modulaban en el nivel de AR m mediante el tratamiento de células de cáncer pancreático (PaCa2) con 100 um de Q10 Se ejecutaron matrices de diabetes para muestras tratadas con lOOuM de Q10 en diversos puntos de tiempo luego del tratamiento. Los experimentos se realizaron esencialmente como se describió anteriormente. Los diversos genes que se encontró que se modulaban tras el tratamiento con Q10 se resumen en la Tabla 23 a continuación. Los resultados mostraron que los siguientes genes se modulan mediante el tratamiento con Q10: ABCC8, ACLY, ADRB3, CCL5, CEACAMl, CEBRA, FOXG1, FOXP3 , G6PD, GLP1R, GPD1, HNF4A, ICAM1, IGFBP5 , INPPL1, IRS2, MAPK14, ME1, NFKB1 , PARP1, PIK3C2B, PIK3CD, PPARGC1B, PRKAG2, PTPN1, PYGL, SLC2A4 , SNAP25, HNF1B, TNRFSF1A, TRIB3 , VAPA, VEGFA, IL4R e IL6.
Tabla 23: Genes de la matriz de diabetes cuya expresión se regula con 100 µ? de Q10 y sus posibles funciones en una célula .
Regulada por aumento (gris) y regulada por disminución (blanco) .
Nombre del gen Función génica Señalización de cAMP, señalización de la ADRB proteina G Ligandos naturales para CCR5 y se regula CCL5 mediante el TNF Regulación positiva antiapoptótica de la CEACmi angiogénesis Aumenta la insulina y disminuye la secreción GLPíjjl de glucagón del páncreas.
Metabolismo de -carbohidratos, oxidación de GPDT 3NADH. ' v„l^^^SI" . ....
Regulado por atorvastatina, procesa algunas icm 1 caspasas .
Punto de control del daño en el ADN, angiogénesis, proceso . metabólico de la MAPí 14 glucosa.
Restauración del ADN, regula TP53, N0S2A, PAREl ,~ NKFB, mantenimiento de telómeros.
Señalización media^r1 por la fosfoinositidá, PIK||C2B regula el AKT y AKT1.
PIK3CD Cinasa Metabolismo de carbohidratos, regula el PYGI glucógeno y la glucógeno sintasa. regula la glucosa y se regula mediante INS e SLC2 A4 insulina regulación de laíSsfe reción de insulin - SNAE 25 absorción de n u;ró;¾^Bsmisores ' Señalización del receptor de CEBPA glucocorticoides , activación de VDR/RXR.
F0XP3 Regula la IL4, IL2 Via de la pentosa fosfato, metabolismo de G6PD glutationa .
Regulación del crecimiento celular, regulado IGFBP5 por el IGF1 INPPL1 Regula Akt y el glucógeno IRS2 Señalización de IGF-1 ME1 Regula el ácido málico y se regula mediante T3 NFKB1 Regula la IL6 y el TNF PPARGC1B Regulado por APK14 PRKAG2 Biosíntesis de colesterol, ácidos grasos. desfosforila JAK2 y la cinasa del receptor PTPN1 del EGF VEGFA Cinasa, angiogénesis Regulación por aumento mediante TP73, se une IL4R a IRS1 e IRS2 HNF1B HNF4 TNFRSF1A Pro-apoptótico TRIB3 Regula AKTl y regulador negativo de NFkB VAPA Regula NFkB, tráfico de vesícula.
Ejemplo 10 : Genes relacionados con la angiogénesis que se detectó que se modulaban en el nivel de ARNm mediante el tratamiento de células de cáncer pancreático (PaCa2) con 100 um de Q10 Se ejecutaron matrices de angiogénesis para muestras tratadas con lOOuM de Q10 en diversos puntos de tiempo luego del tratamiento. Los experimentos se realizaron esencialmente como se describió anteriormente. Los diversos genes que se encontró que se modulaban tras el tratamiento con Q10 se resumen en la Tabla 24 a continuación. Los resultados mostraron que los siguientes genes se modulan mediante el tratamiento con Q10: AKTl, ANGPTL4, ANGPEP, CCL2, CDH4, CXCL1, EDG1, EFNA3, EFNB2 , EGF, FGF1, ID3, IL1B, IL8, KDR, NRP1, PECAMl, PR0K2, SERPINFl, SPHK1, STAB1, TGFB1, VEGFA y VEGFB.
Tabla 24: Lista de genes de la matriz de angiogénesis cuya expresión se regula con 100 µ? de Q10 y sus posibles funciones en una célula.
Regulada por aumento (gris) y regulada por disminución (blanco) .
Gen Función génica ANGI TL4 antiangiogénesis, regulador negativo de la apoptosis, metabolismo lipidico.
CDHí maduración de vasos sanguíneos, adhesión a células, regulador negativo de la proliferación celular.
FGF] Adhesión celular, proliferación celular.
AKT1 proceso metabólico de carbohidratos, proceso biosintético de glucógenos, proceso metabólico de la glucosa, vía de señalización del receptor de insulina, activación de productos génicos pro-apoptóticos, cambios mitocondriales apoptóticos A PEP proteólisis, desarrollo de organismos multicelulares, diferenciación celular CCL2 quimiotaxis, anti-apoptosis, castada JAK-STAT, morfogénesis de órganos, replicación genómica viral CXCL1 quimiotaxis, respuesta inflamatoria, respuesta inmunitaria, regulación negativa de la proliferación celular, biogénesis y organización del citoesqueleto de actina EDG1 regulación positiva de la proliferación celular, transmisión del impulso nervioso, regulación de la adhesión celular, diferenciación neuronal, regulación positiva de la migración celular, regulación positiva de Ras.
EFNB2 señalización célula-célula, regulada por VEGFA.
EGF activación de la actividad de MAPKK, regulación positiva de la mitosis, replicación del ADN ILIB respuesta al estimulo de glucocorticoides, apoptosis, transducción de señal, señalización célula-célula, regulación negativa de la proliferación celular IL8 detención del ciclo celular KDR vía del VEGF, regulada por AKT NRP1 adhesión celular, transducción de señal, señalización célula-célula, proliferación celular, regulado por VEGFA PECAM1 adhesión celular, regulado por el TNF PR0 2 activación de AP , anti-apoptosis , proliferación celular, regula AKT.
SPHK1 anti-apoptosis, proliferación celular, regula la mitosis, migración celular STAB1 respuesta inflamatoria, adhesión celular, endocitosis mediada por receptor, señalización célula-célula, regulación negativa de la angiogénesis, respuesta de defensa a la bacteria .
VEGFA anti-apoptosis, regula el TNF, regulado por HIF1.
Ejemplo 11 : Genes relacionados con la apoptosis que se detectó que se modulaban en el nivel de ARNm mediante el tratamiento de células de cáncer pancreático (PaCa2) con 100 um dé Q10 Se ejecutaron matrices de apoptosis para muestras tratadas con lOOuM de Q10 en diversos puntos de tiempo luego del tratamiento. Los experimentos se realizaron esencialmente como se describió anteriormente. Los diversos genes que se encontró que se modulaban tras el tratamiento con Q10 se resumen en la Tabla 25 a continuación. Los resultados mostraron que los siguientes genes se modulan mediante el tratamiento con Q10: ABL1, AKT1, Bcl2Ll, BclAFl, CASP1, CASP2, CASP6, CIDEA, FADD, LTA, TNF, TNFSF10A y TNFSF10.
Tabla 25: Lista de genes de la matriz de apoptosis , cuya expresión se regula con 100 µ? de Q10 y sus posibles funciones en una célula.
Regulada por aumento (gris) y regulada por disminución (blanco) .
Gen ^Función génica - ¦ ·¦ - : · · pro-apoptótico, regula la IL1B, regulado por el CASE 1 TNF CASí 6 pro-apoptótico, regula PARP, MCL1, APP apoptosis, diferenciación, proliferación celular, TNF metabolismo lipidico y coagulación.
TNF= FIO Pro-apoptótico, regula caspasas Regula Bcl2Ll, TP53, pro-apoptótico, biogénesis y ABL1 organización del citoesqueleto de actina Pro-apoptótico, cambios mitocondriales AKT1 apoptóticos, transporte de carbohidratos, respuesta al calor, metabolismo de la glucosa, vía de señalización del IGF BclAFl Pro-apoptótico Anti-apoptótico, liberación del citocromo c de la mitocondria, regula caspasas, se une a BAD, BAX, BC12L1 BC12L11 CASP2 Anti-apoptótico CIDEA Pro-apoptótico FADD Pro-apoptótico LTA Pro-apoptótico TNFSF10A Activador de caspasa Ejemplo 12 : Matrices de diabetes en PCR en células de cáncer de hígado (HepG2) Se trataron células (de cáncer de hígado) HepG2 con el vehículo durante 24 horas o con 100 µ? de Q10 en diferentes duraciones. El tratamiento se inicio en 1x105 células por pocilio, siguiendo el procedimiento utilizado en las células PaCa2 (precedente, Ejemplos 9-11) . No obstante, la cantidad total de ARN que se extrajo de estas muestras fue menor a la esperada. La transcripción inversa se realiza normalmente usando 1 µg de ARN total (determinado con medición a 260 nm) . El volumen máximo que se puede utilizar por transcripción inversa es de 8 µ?. Dado que la concentración de ARN fue baja, el análisis de matrices de RT-PCR usando el vehículo y muestras tratadas con Q10 de 16 horas y 48 horas se realizó usando 0.44 µg de ARN. Las matrices proporcionaron un análisis inicial de tendencias y patrones en la regulación génica de HepG2 con el tratamiento con 100 µ? de Q10, como se resume en la Tabla 26 a continuación. Los resultados mostraron que cada uno de los genes PPARGC1A, PRKAA1 y SNAP25 se reguló por disminución a las 16 horas después del tratamiento (en aproximadamente 20 veces, 6 veces y 5 veces, respectivamente) . A las 48 horas después del tratamiento, PPARGC1A y PRKAA1 se habían normalizado o se habían regulado ligeramente por aumento, mien'tras que SNAP25 se había regulado por disminución aproximadamente 2 veces.
Tabla 26: Lista de genes regulados en la matriz de diabetes cuando las células HepG2 se trataron con 100 µ? de Q10.
Gen Nombre del gen Función génica receptor gamma activado por el Implicado en la proliferador de proliferación y muerte peroxisoma, celular, la respiración coactivador 1 celular y el potencial PPARGC1A alfa transmembrana .
Regula TP53 y está implicada en la proteína cinasa, apoptosis, regula la subunidad glucólisis, regula las catalítica alfa 1 actividades enzimáticas PRKAA1 activada por AMP. metabólicas .
Tiene incidencia en el transporte, la fusión, proteína la exocitosis y la sinaptosomal liberación de SNAP25 asociada, 25kDa moléculas .
Ejemplo 13 : Matriz de angiogénesis en PCR en células de cáncer de hígado (HEP62) Se trataron células (de cáncer de hígado) HepG2 con el vehículo durante 24 horas o con 100 µ de Q10 en diferentes duraciones. El tratamiento se inicio en 1x105 células por pocilio, siguiendo el procedimiento utilizado en las células PaCa2 (precedente, Ejemplos 9-11) . No obstante, la cantidad total de ARN que se extrajo de estas muestras fue menor a la esperada. La transcripción inversa se realiza normalmente usando 1 g de ARN total (determinado con medición a 260 nm) . El volumen máximo que se puede utilizar por transcripción inversa es de 8 µ?. Dado que la concentración de ARN fue baja, el análisis de matrices de RT-PCR usando el vehículo y muestras tratadas con Q10 de 16 horas y 48 horas se realizó usando 0.44 µg de ARN. Las matrices proporcionaron un análisis inicial de tendencias y patrones en la regulación génica de HepG2 con el tratamiento con 100 µ? de Q10, como se resume en la Tabla 27 a continuación. Los diversos genes que se encontró que se modulaban tras el tratamiento con Q10 se resumen en la Tabla 27 a continuación. Los resultados mostraron que cada uno de los genes ANGPTL3, ANGPTL4, CXCL1, CXCL3, CXCL5, ENG, MMP2 y TIMP3 se regularon por aumento a las 16 horas después del tratamiento (en aproximadamente 5.5, 3, 3, 3.2, 3, 3, 1 y 6.5 veces, 6 veces y 5 veces, respectivamente, con respecto al control) . ID3 se reguló por disminución a las 16 horas después del tratamiento con Q10, en aproximadamente 5 veces con respecto al control. A las 48 horas después del tratamiento, ANGPTL3, CXCL1, CXCL3, ENG y TI P3 se mantenían regulados por aumento (en aproximadamente 3.5, 1.5, 3.175, 2 y 3 veces, respectivamente, con respecto al control), mientras que ANGPTL4, CXCL5, ID3 y MMP2 se regularon por disminución en aproximadamente 1, 1, 2 y 18 veces, respectivamente, con respecto al control.
Tabla 27: Lista de genes regulados en la matriz de angiogénesis cuando las células HepG2 se trataron con 100 uM de Q10.
Gen Nombre del gen Función génica Se expresa predominantemente in vivo, tiene incidencia en la adhesión y la migración celular, regula el metabolismo del ANGPTL3 3 tipo angiopoyetina glicerol y ácidos grasos.
Regulado por PPARG, inhibidor de la apoptosis para células endoteliales vasculares, tiene incidencia en el metabolismo de la glucosa y los lipidos y la ANGPTL4 4 tipo angiopoyetina sensibilidad a la insulina. ligando 1 (motivo C- X-C) de quimiocina (actividad de estimulación del crecimiento de Incidencia en la migración y la CXCL1 melanomas, alfa) proliferación celular Activación de quimiocina, proliferación, migración, ligando 3 (motivo C- activación de células CXCL3 X-C) de quimiocina estrelladas hepáticas.
CXCL5 ligando 5 (motivo C- Producido junto con la IL8 X-C) de quimiocirta cuando se estimula con IL1 o TNFA. Incidencia en la quimiotaxis, migración, proliferación Se une a TGFBR y está implicada en la migración, proliferación, ENG endoglina unión e invasión. inhibidor del ADN Regula MMP2, regulado por TGFB1, que se une a 3, vitamina D3, ácido retinoico, proteina de hélice- VEGFA, implicado en la bucle-hélice apoptosis, proliferación, ID3 negativa dominante diferenciación, migración.
Activación de células estrelladas hepáticas, metalopeptidasa de señalización de HIF, se une a matriz 2 (gelatinasa TIMP3, implicado en la A, gelatinasa de 72 tumorigénesis, apoptosis, kDa, colagenasa tipo proliferación, invasividad, MMP2 IV de 72 kDa) migración y quimiotaxis.
Regula MMP2, ICAM1. Regulado por TGFB, EGF, TNF, FGF y TP53. Implicado en la apoptosis, la Inhibidor 3 de la adhesión célula-célula y la TI P3 metalopeptidasa TIMP malignidad.
Las proteínas que se sabe que están implicadas en el proceso de angiogénesis fueron componentes en la matriz de RT-PCR. La angiogénesis es un proceso crítico mediante el cual las células cancerosas se vuelven malignas. Algunas de estas proteínas también están implicadas en la diabetes.
ANGPTL3 y ANGPTL4: La literatura relacionada con ANGPTL3 conecta esta proteina con la regulación del metabolismo lipídico. En particular, la bibliografía (Li, C. Curr Opin Lipidol. abril de 2006; 1 (2) : 152-6) enseña que tanto las angiopoyetinas como las proteínas tipo angiopoyetina comparten estructuras de dominio similares. ANGPTL3 y 4 son los dos únicos miembros de esta superfamilia que inhiben la actividad de la lipoproteína lipasa. No obstante, ANGPTL3 y 4 se regulan de forma diferencial en niveles múltiples, lo que sugiere funciones no-redundantes in vivo. ANGPTL3 y 4 se procesan de forma proteolítica en dos mitades y se regulan de forma diferencial mediante receptores nucleares. La sobreexpresión transgénica de ANGPTL4, así como la inactivación génica de ANGPTL3 o 4 demuestran que estas dos proteínas tienen una incidencia fundamental en el metabolismo de lipoproteínas: la ANGPTL3 derivada del hígado inhibe la actividad de la lipoproteína lipasa principalmente en el estado posprandial, mientras que ANGPTL4 tiene una gran incidencia tanto en el estado posprandial como en el estado en ayunas. Además, ANGPTL4 regula el suministro de ácidos grasos derivados de lipoproteína específicos en tejidos. ANGPTL4 es, por lo tanto, un inhibidor endocrino o autócrino/paracrino de la lipoproteína lipasa, dependiendo de sus sitios de expresión.
La lipoproteína lipasa es una enzima que hidroliza lípidos en lipoproteínas, como los que se encuentran en quilomicrones y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) en tres ácidos grasos libres y una molécula de glicerol. La actividad de la lipoproteína lipasa en un tejido dado es la etapa limitante para la absorción de ácidos grasos derivados de triglicéridos . Los inequilibrios en la división de ácidos grasos tienen consecuencias metabólicas muy importantes. Las dietas altas en grasas han mostrado que ocasionan una sobreexpresión de LPL especifica en tejidos, que se ha implicado en la resistencia a la insulina especifica de tejidos y el desarrollo consiguiente de diabetes mellitus tipo 2.
Los resultados en este Ejemplo indican que la Q10 modula proteínas implicadas en el metabolismo lipídico y, por lo tanto, amerita una mayor investigación de ANGPTL3/ANGPTL4 y sus vías relacionadas. Por ejemplo, se ha indicado que ANGPTL3/ANGPTL4 tienen incidencia en las siguientes vías: Akt, : colesterol, ácido graso, colesterol HDL, HNF1A, ITGA5, ITGA5, ITGAV, ITG83, trilodotinonina L, LIPG, LPL, Mapk, Nrth, NR1H3, PPARD, PTK2, RXRA, triacilglerol y ácido 9-cis-retinoico.
Ejemplo 1 : Matriz de apoptosis en PCR en células de cáncer de hígado (HEPG2) Se ejecutaron matrices de apoptosis para muestras tratadas con lOOuM de Q10 durante 16 y 48 horas como se describió anteriormente. No obstante, la matriz para las 48 horas se ejecutó con FAM como el fluoroforo en lugar de SYBR. Tanto el FAM como SYBR fluoresceh a la misma longitud de ond .
Los diversos genes que se encontró que se modulaban tras el tratamiento con Q10 se resumen en la Tabla 28 a continuación. Los resultados mostraron que CASP9 se reguló por aumento a las 16 horas después del tratamiento con Q10 en aproximadamente 61 veces con respecto al control, mientras que BAG1 y TNFRSF1A se regularon por disminución a las 16 horas después del tratamiento en aproximadamente 6 y 4 veces, respectivamente, con respecto al control. A las 48 horas después del tratamiento, CASP9, BAG1 y TNFRSF1A se regularon por aumento en aproximadamente 55, 1 y 1 vez, respectivamente, con respecto al control.
Tabla 28: Lista de genes regulados en la matriz de apoptosis cuando las células HepG2 se trataron con 100 uM de Q10.
Gen Nombre del gen Función génica Atanógeno asociado Implicado en la BAG1 con BCL2 apoptosis caspasa 9, peptidasa de cisteina Apoptosis a través de relacionada con la la liberación del CASP9 apoptosis citocromo c. superfamilia del anti-apoptosis, se receptor del factor une a muchos factores de necrosis tumoral, de muerte celular, TNFRSF1A miembro 1A regula ICA 1 Ejemplo 15: Evaluación de la capacidad del cambiador epi. de tratar un trastorno metabólico Para determinar si un cambiador epi. seleccionado, por ej . , CoQlO, es capaz de tratar un trastorno metabólico, por ej . , diabetes, se emplean ensayos basados en células que controlan un aumento en la absorción de glucosa estimulada por insulina in vitro. En particular, se usan adipocitos de ratón diferenciados para identificar agentes que tienen la capacidad de aumentar la absorción de glucosa tras la estimulación de insulina, según se detectó por el coriteo de centelleo de glucosa radiomarcada (usando, por ejemplo, el lector Perkin Elmer 1450 Microbeta JET) . Estos ensayos se realizaron de la siguiente manera manera Materiales y métodos : Medio Prees Medio completo, también conocido como medio "Prees", se prepara de la siguiente manera. Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) se complementa con L-glutamina, penicilina-G y estreptomicina (pen/estrep) y suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) (calor inactivado a 65. grados. C. durante 30 minutos) . Dado que el suero puede afectar el crecimiento, la adherencia y la diferenciación de células, todo lote nuevo de suero se analizó primero antes de su uso. El medio se equilibró en el incubador (5% de CO.sub.2) hasta que el pH se encontró dentro del intervalo adecuado (.alrededor de.7), tal como se indicó con el color rojo/anaranjado del tinte indicador. Si el medio se volvió rosa (indicando un pH alto) , descartamos el medio dado que las condiciones básicas pueden afectar las células y desnaturalizar la insulina usada en el medio de diferenciación 1 (DM1) y el medio de diferenciación 2 ( DM2 ) .
Medios de diferenciación El medio de diferenciación 1 (DM1) se preparó complementando DMEM con 10% de FBS, L-glutamina, pen/estrep, IBMX (375. mu. M), insulina (120 nM) y dexametasona (188 nM) . El medio de diferenciación 2 (DM2) se preparó complementando DMEM con 10% de FBS, L-glutamina, pen/estrep e insulina (120 nM) .
Preparación de, placas gelatinizadas Las placas de cultivo celular se gelatinizan de la siguiente manera. Se esterilizó en autoclave gelatina (1% p/v en agua destilada) y se almacenó a temperatura ambiente. El fondo de cada pocilio de cultivo celular se cubrió uniformemente en la solución de gelatina, asegurando que no se forman burbujas. Esta solución se retiró dejando detrás una película fina de gelatina. Éstas placas se dejaron secar debajo de la campana de cultivo del tejido. Luego se lavan las placas con PBS, luego de lo cual se agregó una solución de dialdehido glutárico al 0.5% (glutaraldehido en agua destilada) a los pocilios de cultivo celular. Luego de diez minutos se lavaron los pocilios dos veces con DMEM que contenía pen-estrep. Cada etapa de lavado debería durar aproximadamente cinco minutos.
Cultivo celular Se dividen células pre-adipocitos 3T3-L1 aproximadamente cada 2-3 días o tras alcanzar una confluencia de aproximadamente 60%. La sobreconfluencia puede afectar la capacidad de estas células de diferenciarse en adipocitos.
Otros reactivos D- (+) -glucosa (glucosa "fría", no radiomarcada ) se agregó a una mezcla de DPBS a una concentración final de 10 mM. Amortiguador de lisis, una mezcla de una base (por ej . , hidróxido de sodio a una concentración final de 0.5 N) y un detergente (por ej . , dodecilsulfato de sodio (SDS) diluido hasta una concentración final de 0.1% p/p) se preparó cada vez (dentro de una a dos horas de uso) . Antes de su uso, se calentó el amortiguador de lisis hasta una temperatura que excede la de temperatura ambiente por un periodo de aproximadamente 30 minutos para evitar la precipitación del amortiguador .
Determinación de absorción de glucosa Las células pre-adipocito 3T3-L1 se colocaron en placas a una densidad de aproximadamente 5000 células/pocilio (en placas negras NUNC de 96 pocilios) . Estas células se diferencian en adipocitos en dos etapas separadas. Inicialmente, las células se cultivan en medio de diferenciación 1 (DM1) (día 1 de diferenciación de adipocitos) por un periodo de dos a tres días. El DM1 evita la proliferación e induce la expresión de genes específicos de adipocitos. Las células se cultivan luego en un medio de diferenciación 2 (DM2) por 3 a 4 días, luego de lo cual el medio de cultivo se reemplaza por DM2 fresco. El ensayo de absorción de glucosa se realiza el dia 9-15 de diferenciación.
Dos días antes del experimento (en el dia 7-13 de diferenciación) , se retira el DM2 y se reemplaza con medio Prees fresco. En este momento se agregan los compuestos candidatos, permitiendo un periodo de incubación de aproximadamente 48 horas. El dia del experimento, a las células (ahora en el dia 9 a 15 de diferenciación) se les retira el suero durante tres horas en DPBS, sulfato de magnesio (0.8 mM) y Hepes (10 mM) a pH .alrededor de .7. Después de este periodo de incubación, se agregó DPBS fresco que contenia insulina (10 nM) a los adipocitos. DPBS fresco sin ninguna insulina se coloca en células que sirvieron como un control negativo. Luego de un periodo de incubación de 25 minutos a 37 grados. C, se agregó glucosa radioactiva (marcada con .sup.l4C, a una concentración final de 0.04 mM, .alrededor de.0.26 .mu.Ci . sup.14C-glucosa en cada pocilio) al medio por un periodo de 15 minutos a temperatura ambiente. Luego se retiró el medio y las células se lavaron completamente y se lisaron. Tras la lisis, las células de una masa pequeña y turbia se separaron del fondo del pocilio. Se agregó 10% de ácido acético glacial a cada pocilio para neutralizar la reacción de lisis. El fluido de centelleo se agregó luego a los pocilios y la incorporación de glucosa se determinó midiendo la cantidad de radioactividad en cada pocilio usando el lector de placas MicroBeta.
Usando el protocolo de experimentos anterior, se identificó un cambiador epi . como capaz de tratar un trastorno metabólico, por ej . , diabetes, cuando el cambiador epi. potencia, aumenta o amplía la absorción de glucosa estimulada con insulina en las células in vitro.
Ejemplo 16: Identificación de una MIM asociada con un trastorno metabólico Para evaluar una molécula candidata (por ej . , un influenciador ambiental) como una posible MIM, la MIM candidata seleccionada se agregó de forma exógena a un panel de líneas celulares, incluyendo líneas celulares enfermas (de cáncer) y líneas celulares de control normales y se analizaron los cambios inducidos en el perfil de microambiente celular para cada línea celular en el panel. Los cambios en la morfología, la fisiología celular y/o la composición celular, incluyendo, por ejemplo, niveles de ARNm y de proteína, se evaluaron y compararon para las células enfermas en comparación con las células normales.
Los cambios en la morfología/fisiología celular se evaluaron examinando la sensibilidad y la respuesta apoptótica de las células a la MIM candidata. Estos experimentos se realizan tal como se describe en detalle en el Ejemplo 3. En resumen, se trató un panel de líneas celulares que consistía en al menos una línea celular de control y al menos una línea celular de cáncer con diversas concentraciones de la MIM candidata. Se evaluó la sensibilidad de las líneas celulares a la posible MIM controlando la supervivencia celular en diversos puntos, así como con respecto al rango de concentraciones aplicadas. La respuesta apoptótica de las líneas celulares a la posible MIM se evaluó usando, por ejemplo, reactivo nexina en combinación con metodologías de citometría de flujo. El reactivo nexina contenía una combinación de dos tintes, 7AAD y anexina-V-PE y permitió la cuantificación de la población de células apoptóticas tempranas y tardía. Se puede usar un ensayo de apoptosis adicional que mide el ADN de cadena única, usando, por ejemplo metodologías de ELISA ApostrandTM. Se evaluaron y compararon la sensibilidad y la respuesta apoptótica de la enfermedad y las líneas celulares de control. Una molécula que presentó citotoxicidad diferencial y/o que indujo de forma diferencial la respuesta apoptótica en las células enfermas en comparación con las células normales se identificó como una MIM. Se evaluaron los cambios en la composición de las células después del tratamiento con la MIM candidata. Los cambios en la expresión génica a nivel del ARNm se analizaron usando metodología de matriz de PCR en tiempo real. Estos experimentos se realizan tal como se describe en detalle en los Ejemplos 6 y 9-13. En resumen, la MIM candidata se agregó de forma exógena a una o más líneas celulares incluyendo, por ejemplo, una línea celular enferma y una línea celular de control normal y el ARNm se extrajo de las células en diversos puntos de tiempo después del tratamiento. El nivel de ARNm para genes implicados en vías específicas se evaluó usando matrices de vías dirigidas, incluyendo, por ejemplo, matrices específicas para apoptosis, estrés oxidativo y protección antioxidante, angiogénesis , choque térmico y diabetes. Los genes que se alteraron en su transcripción de ARNm en un nivel doble o mayor se identificaron y se evaluaron. Una molécula que indujo cambios en los niveles de ARNm en células y/o que indujo cambios diferenciales en el nivel de uno o más ARNm en las células enfermas en comparación con las células normales se identificó como una MI .
En experimentos complementarios, los cambios en la expresión génica a nivel de proteína se analizaron usando metodología de micromatriz de anticuerpo, electroforesis en gel bidimensional seguida por identificación de proteínas usando caracterización de espectrometría de masas y análisis de transferencia western. Estos experimentos se realizaron como se describió con detalle en los Ejemplos 7, 4 y 8, respectivamente. En resumen, la MIM candidata se agregó de forma exógena a una o más líneas celulares incluyendo, por ejemplo, una línea celular enferma y una línea celular de control normal y la proteína soluble se extrajo de las células en diversos puntos, por ej . , a las 6 horas o 24 horas después del tratamiento. Los cambios inducidos en los niveles de proteína mediante la MIM candidata se evaluaron usando una micromatriz de anticuerpos que contenía anticuerpos para más de 700 proteínas, con muestras de un amplio espectro de tipos de proteínas y marcadores de posibles vías. Se puede realizar un análisis proteómico complementario adicional utilizando electroforesis en gel bidimensional (2-D) acoplada a metodologías de espectrometría de masa. La MIM candidata se agregó de forma exógena a una o más líneas celulares incluyendo, por ejemplo, una línea celular enferma y una línea celular de control normal y los sedimentos celulares se lisaron y se sometieron a electroforesis en gel 2-D. Los geles se analizaron para identificar cambios en los niveles de proteína en las muestras tratadas con relación a las muestras de control sin tratar. Se analizaron los geles para identificar cambios en las manchas con el transcurso del tratamiento debido a niveles mayores, niveles menores o modificación postraduccional . Se extirparon las manchas que presentaban cambios estadísticamente significativos y se presentaron para identificación proteica mediante digestión con tripsina y caracterización por espectrometría de masa. Los péptidos caracterizados se cotejaron con bases de datos de proteínas, por ejemplo, con análisis con el software Mascot y MSRAT para identificar las proteínas. Además del análisis en gel 2-D y los experimentos de micromatriz de anticuerpos que anteceden, los posibles cambios en los niveles de proteínas específicas inducidos por la MIM candidata se pueden evaluar mediante análisis de transferencia Western. En todos los experimentos proteómicos, las proteínas con mayores o menores niveles en las diversas líneas celulares se identificaron y evaluaron. Una molécula que indujo cambios en los niveles de proteína en células y/o que indujo cambios diferenciales en el nivel de una o más proteínas en las células enfermas en comparación con las células normales se identificó como una MIM.
Los genes que se descubrió que se modulaban con el tratamiento con una MIM candidata de los experimentos que anteceden se sometieron a análisis de vía celular y bioquímica y, por lo tanto, se pueden dividir en categorías en diversas vías celulares, incluyendo, por ejemplo, apoptosis, biología de cáncer y crecimiento celular, glucólisis y metabolismo, transporte molecular y señalización celular .
Se realizaron experimentos para confirmar el ingreso de una MIM candidata a las células, para determinar si la MIM candidata se llega a ubicar en la célula y para determinar el nivel y la forma de la MIM candidata presente en las células. Estos experimentos se realizan tal como se describe en detalle en el Ejemplo 5. Por ejemplo, para determinar el nivel y la forma de la MIM candidata presente en la mitocondria, se prepararon y analizaron preparaciones enriquecidas de mitocondria a partir de células tratadas con la MIM candidata. Se puede confirmar de esa forma que el nivel de la MIM candidata presente en la mitocondria aumenta en una forma dependiente del tiempo y la dosis con la adición de MIM candidata exógena. Además, los cambios en los niveles de proteína de muestras enriquecidas con mitocondria se analizaron usando electroforesis en gel 2-D e identificación de proteínas mediante caracterización de espectrometría de masas, como se describió anteriormente para las muestras de proteína celular. Las MIM candidatas que se determinó que ingresaron a la célula y que estaban presentes en niveles mayores, por ej . , en la mitocondria, se identificaron como MIM. Los niveles de la MIM candidata en la célula o, por ejemplo, específicamente en la mitocondria, durante el período examinado, pueden tener correlación con otros cambios celulares observados, como lo prueban, por ejemplo, la modulación de los niveles de ARNm y proteína para proteínas específicas .
Las MIM candidatas que se observó que inducían cambios en la composición celular, por ej . , que inducían cambios en la expresión génica a nivel del ARNm o la proteina, se identificaron como MIM. Las MI candidatas que se observó que inducían cambios diferenciales en la morfología celular, la fisiología o la composición celular (por ej . , cambios diferenciales en la expresión génica a nivel del ARNm o la proteína), en un estado de enfermedad (por ej . , diabetes u obesidad), en comparación con un estado normal, se identificaron como MIM y, en particular, se indicó que poseían un carácter multidimensional . Las MIM candidatas que se encontró que podían ingresar a la célula se identificaron como MIM y, en particular, se indicó que tenían carácter multidimensional, dado que la MIM candidata presenta de esa forma un efecto portador además de un efecto terapéutico.
Ejemplo 17: identificación de CoQlO como un cambiador epi . asociado a un trastorno metabólico Se trató un panel de líneas celulares de la piel que consistía en líneas celulares de control (cultivo primario de queratinocitos y melanocitos) y diversas líneas celulares de cáncer de piel (SK-MEL-28, un melanoma de piel no metastásico; SK-MEL-2, un melanoma de piel metastásico o SCC, un carcinoma de células escamosas; PaCa2, una línea celular de cáncer pancreático o HP-G2, una línea celular de cáncer de hígado) con diversos niveles de coenzima Q10. Las líneas celulares cancerosas presentaron una respuesta dependiente de la dosis alterada en comparación con las líneas celulares de control con una inducción de apoptosis y muerte celular en las células cancerosas únicamente. Se presentan ejemplos detallados de experimentos, por ej . , en el Ejemplo 3 en la presente .
Se usaron ensayos para evaluar los cambios en la composición de los niveles de ARNm y proteína de las células antedichas después del tratamiento con CoQlO. Los cambios en la expresión de ARNm se analizaron usando micromatrices de PCR en tiempo real específicas para cada uno de apoptosis, estrés oxidativo y antioxidantes, angiogénesis y diabetes. Los cambios en la expresión de proteínas se analizaron usando análisis de micromatriz de anticuerpos y análisis de transferencia western. Los resultados de estos ensayos demostraron que los cambios significativos en la expresión génica, tanto a nivel del ARNm como de la proteína, se produjeron en las líneas celulares debido a la adición de la coenzima Q10. Se observó que diversos genes que se sabe que están asociados a o implicados en los procesos metabólicos celulares se modularon como resultado del tratamiento con CoQlO. Por ejemplo, se descubrió que la expresión de la proteína del receptor nuclear HNF4A se modulaba por aumento en las células luego del tratamiento con Q10. También se moduló la expresión de transaldolasa 1 (TAL) en las células tratadas con Q10. TAL equilibra los niveles de NADPH y el intermediario de oxígeno reactivo, mediante lo cual se regula el potencial de transmembrana mitocondrial , que es un punto de control crítico dé la síntesis de ??? y la supervivencia celular. De particular relevancia para los trastornos metabólicos, se identificaron diversos genes que se sabe que están asociados a, por ej . , con diabetes, como regulados por la Q10. Se presentan ejemplos detallados de experimentos, por ej . , en los Ejemplos 4, 6, 7, 8 y 9 en la presente.
La Q10 es un cofactor esencial para los procesos de fosforilación oxidativa en la mitocoñdria para la producción energética. El nivel de la coenzima Q10, asi como la forma de CoQlO presente en la mitocoñdria se determinó mediante el análisis de preparaciones enriquecidas con mitocoñdria a partir de células tratadas con CoQlO. Se confirmó que el nivel de la coenzima Q10 presente en la mitocoñdria aumentó en una forma dependiente del tiempo y la dosis con la adición de Q10 exógena. El transcurso · del tiempo tuvo correlación con una amplia variedad de cambios celulares según se observó en la modulación de los niveles de ARNm y proteina para proteínas específicas relacionadas con vías metabólicas y apoptóticas. Se presentan ejemplos detallados de experimentos, por ej . , en el Ejemplo 5 en la presente.
Los resultados descritos en la presente identificaron la molécula endógena CoQlO como un cambiador epi. En particular, los resultados indicaron que la CoQlO inducía un cambio en el estado metabólico y la restauración parcial de la función mitocondrial en las células. Estas conclusiones se basan en la siguiente interpretación de los datos descritos en la presente y el conocimiento actual en la técnica correspondiente .
Se sabe que la Q10 se sintetiza, se transporta de forma activa a, se enriquece en y se utiliza en la membrana interna mitocondrial. También se sabe que la Q10 es un cofactor esencial para los procesos de fosforilación oxidativa en la mitocoñdria para la producción energética. No obstante, la mayoría de las células cancerosas producen predominantemente energía mediante glucólisis, seguida por fermentación de ácido láctico en el citosol, en lugar de mediante oxidación de piruvato en la mitocondria como la mayoría de las células normales. La fosforilación oxidativa implica los complejos de transporte de electrones y el citocromo c. La apoptosis implica la alteración de la mitocondria, con permeabilización de la membrana mitocondrial interna mediante factores pro-apoptóticos. Al utilizar una vía de síntesis de energía metabólica diferente, las células cancerosas pueden mitigar la respuesta normal a la apoptosis hasta niveles anormales en la célula. Si bien no desean limitarse por la teoría, los solicitantes proponen que la Q10 funciona regulando por aumento las proteínas de la vía de fosforilación oxidativa y así produciendo un cambio en la función mitocondrial hasta un estado que reconocería los defectos oncogénicos y desencadenaría la apoptosis. Por lo tanto, la Q10 actúa como un cambiador epi. al cambiar el estado metabólico de la célula .
Ejemplo 18 : Identificación de un cambiador epi . asociado con un trastorno metabólico Se trató un panel de líneas celulares de la piel que consistía en líneas celulares de control (por ej . , cultivo primario de queratinocitos y melanocitos) y líneas celulares cancerosas (por ej . ,SK-MEL-28, un melanoma de piel no metastásico; SK-MEL-2, un melanoma de piel metastásico o SCC, un carcinoma de células escamosas; PaCa2, una línea celular de cáncer pancreático o HEP-G2, una línea celular de cáncer de hígado) con diversos niveles de un cambiador epi. candidato. Los cambios en la morfología/fisiología celular se evaluaron examinando la sensibilidad y la respuesta apoptótica de las células al cambiador epi. candidato. Estos experimentos se realizaron como se describe con detalle en el Ejemplo 3. En resumen, se evaluó la sensibilidad de las líneas celulares al cambiador epi. candidato controlando la supervivencia celular en diversos puntos de tiempo y en un rango de concentraciones aplicadas. La respuesta apoptótica de las líneas celulares al cambiador epi. candidato se evaluó usando, por ejemplo, reactivo nexina en combinación con metodologías de citometría de flujo. El reactivo nexina contenía una combinación de dos tintes, 7AAD y anexina-V-PE y permitió la cuantificación de la población de células apoptóticas tempranas y tardía. Se puede usar un ensayo de apoptosis adicional que mide el ADN de cadena simple, usando, por ejemplo metodologías de ELISA ApostrandTM. Se evaluaron y compararon la sensibilidad y la respuesta apoptótica de la enfermedad y las líneas celulares de control. Los cambiadores epi. candidatos se evaluaron con base en su capacidad de inhibir el crecimiento celular preferente o selectivamente en células cancerosas, en comparación con las células normales o de control. Los cambiadores epi. candidatos se evaluaron adicionalmente con base en su capacidad de inducir preferente o selectivamente la apoptosis en células cancerosas en comparación con las células normales o de control.
Se usaron ensayos para evaluar los cambios en la composición del nivel de ARNm y proteína de las células antedichas después del tratamiento con el cambiador epi. candidato. Los cambios en los niveles de ARNm se analizaron usando micromatrices de PCR en tiempo real. Estos experimentos se realizan como se describe con detalle en los Ejemplos 6 y 9 a 13. En resumen, se extrae el ARNm de las células en diversos puntos de tiempo después del tratamiento. El nivel de ARNm para genes implicados en vias especificas se evaluó usando matrices de vias dirigidas, incluyendo matrices especificas para apoptosis, estrés oxidativo y protección antioxidante, angiogénesis, choque térmico o diabetes. Los genes que se alteraron en su transcripción de ARNm en un nivel doble o mayor se identificaron y se evaluaron.
Los cambios en la expresión de proteína se analizaron usando análisis de micromatriz de anticuerpo, análisis de electroforesis en gel 2-D acoplado con caracterización por espectrometría de masas y análisis de transferencia Western. Estos experimentos se realizaron como se describió con detalle en los Ejemplos 7, 4 y 8, respectivamente. En resumen, se extrajo la proteína soluble de las células en diversos puntos, por ej . , a las 6 horas o las 24 horas, después del tratamiento con el cambiador epi . candidato. Los cambios inducidos en los niveles de proteína mediante el cambiador epi. candidato se evaluaron usando una micromatriz de anticuerpos que contenía anticuerpos para más de 700 proteínas, con muestras de un amplio espectro de tipos de proteínas y marcadores de posibles vías. Se puede realizar un análisis proteómico complementario adicional utilizando electroforesis en gel bidimensional (2-D) acoplada a metodologías de espectrometría de masa. El cambiador epi. candidato se agregó de forma exógena a las líneas celulares y los sedimentos celulares se lisaron y se sometieron a electroforesis en gel 2-D. Los geles se analizaron para identificar cambios en los niveles de proteina en las muestras tratadas con relación a las muestras de control sin tratar. Se analizaron los geles para identificar cambios en las manchas con el transcurso del tratamiento debido a niveles mayores, niveles menores o modificación postraduccional . Se extirparon las manchas que presentaban cambios estadísticamente significativos y se presentaron para identificación proteica mediante digestión con tripsina y caracterización por espectrometría de masa. Los péptidos caracterizados se cotejaron con bases de datos de proteínas, por ejemplo, con análisis con el software Mascot y MSRAT para identificar las proteínas. Además del análisis en gel 2-D y los experimentos de micromatriz de anticuerpos que anteceden, los posibles cambios en los niveles de proteínas específicas inducidos por la MIM candidata se pueden evaluar mediante análisis de transferencia Western. En todos los experimentos proteómicos, se identificaron y evaluaron las proteínas con mayores o menores niveles en las diversas líneas celulares.
Los cambiadores epi. candidatos se evaluaron con base en los cambios inducidos a la expresión génica en los niveles de ARNm y/o proteína, en las líneas celulares debido a la adición del cambiador epi. candidato. En particular, los cambiadores epi. candidatos se evaluaron con base en su capacidad de modular genes que se sabe que están asociados con o implicados en procesos metabólicós celulares. De particular relevancia para los trastornos metabólicós, los cambiadores epi. candidatos se evaluaron con base en su capacidad de modular genes que se sabe que están asociados, por ejemplo, con la diabetes o la obesidad.
El nivel del cambiador epi. candidato, asi como la forma del cambiador epi. candidato presente en la célula o una ubicación celular particular se determina usando métodos habituales conocidos por los expertos. Por ejemplo, el nivel de cambiador epi. candidato en la mitocondria en el tiempo y en un espectro de dosis se determina analizando preparaciones enriquecidas mitoncondriales de células tratadas con el cambiador epi. candidato. Los niveles del cambiador epi. en la mitocondria en el tiempo se pueden comparar y correlacionar con otros cambios celulares observados, como la modulación del ARNm y los niveles de proteina para proteínas específicas relacionadas con vías metabólicas y apoptóticas.
Los cambiadores epi. candidatos que se observó que inducían un cambio en el estado metabólico de una célula con base en los resultados obtenidos a partir de los experimentos que anteceden se identifican como cambiadores Epi. Por ejemplo, un cambiador epi. candidato que potencia, aumenta o amplía la absorción de glucosa estimulada por insulina en las células se identifica como un cambiador Epi.
Ejemplo 19: Identificación de Vitamina D3 como cambiador Epi La vitamina D3 o la, 25-dihidroxivitamina D3 (también conocida como calcitriol) , es un metabolito de la vitamina D que se sintetiza a partir de la vitamina D mediante un proceso enzimático de dos pasos. La vitamina D3 interactúa con su receptor de vitamina D nuclear (VDR) ubicuo para regular la transcripción de un amplio espectro de genes implicados en la homeostasis de calcio y fosfato, así como en la división y diferenciación celular. Se ha indicado que la vitamina D3 tiene efectos anticancerígenos en diversos sistemas modelo, incluyendo carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma de próstata, cánceres de ovario, mama y pulmón (analizado en Deeb et ál. 2007 Nature Reviews Cáncer 7:684-700) .
Se indica que los efectos anticancerígenos de la vitamina D3 implican mecanismos múltiples, incluyendo detención del crecimiento en la fase Gl del ciclo celular, apoptosis, diferenciación de células tumorales, alteración de las señales de supervivencia celular mediadas por el factor de crecimiento e inhibición de la angiogénesis y la adhesión celular (analizado en Deeb et ál. 2007 Nature Reviews Cáncer 7:684-700). Por ejemplo, con relación particular a la apoptosis, se ha indicado que la vitamina D3 induce la apoptosis al regular mediadores clave de la apoptosis, como al reprimir la expresión de las proteínas anti-apoptóticas, pro-supervivencia BCL2 y BCL-XL o al inducir la expresión de proteínas pro-apoptóticas (por ej . , BAX, BAK y BAD) (Deeb et ál. 2007). En un ejemplo adicional, con relación particular a la angiogénesis, se ha indicado que la Vitamina D3 inhibe la proliferación de algunas células endoteliales derivadas de tumores, así como la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que induce la angiogénesis en tumores (analizado en asuda and Jones, 2006 Mol. Cáncer Ther. 5(4): 797-8070). En otro ejemplo, con relación particular a la detención del ciclo celular, se ha indicado que la Vitamina D3 induce la transcripción génica del inhibidor de cinasa dependiente de la ciclina p21WAFI/CIPI e induce la síntesis y/o estabilización de la proteína p27KIPI inhibidora de cinasa dependiente de la ciclina, ambas criticas para inducir la detención de Gl. (Deeb et ál. 2007).
En función de las observaciones que anteceden, la vitamina D3 se identifica como un cambiador Epi, es decir, debido a su capacidad de cambiar el estado metabolico de una célula. La vitamina D3 es un cambiador epi. debido a su capacidad de inducir apoptosis en uña célula y, en particular, en función de su capacidad de inhibir de forma diferencial el crecimiento celular e inducir la respuesta apoptótica en células enfermas (cancerosas) en comparación con células normales (por ej . , modula de forma diferencial la expresión de proteínas, como BCL-2, BCL-XL y BAX, implicadas en la apoptosis en células cancerosas en comparación con células normales) .
Ejemplo 20: Resumen de proteínas clave En resumen, basándos en los experimentos descritos en los Ejemplos que anteceden las proteínas clave moduladas por Q10 se resumen en la tabla continuación.
Tabla 29. Proteínas clave moduladas por Q10.
Vía Ejemplos Factores de transcripción HNF4alfa Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-Lll (Bim) , XIAP, BRAF, Bax, c- Respuesta apoptótica Jun, Bmf, PUMA, cMyc Vía de fosfato de transaldolasa 1 pentosa C0Q1, C0Q3, C0Q6, preniltransferasa, Vía biosintética 4-hidroxibenzoato Factor 2 citosólico de neutrófilos, Estrés oxidante sintasa de óxido nítrico 2A, (pro-oxidante) superóxido dismutasa 2 (mitocondrial) Alteraciones de membrana VDAC, canal Bax, ANT, Metabolismo de fosforilación Citocromo c, complejo I, complejo II, oxidativa complejo III, complejo IV Ejemplo 21 : Análisis Western de células tratadas con Coenzima Q10 En las últimas cinco décadas se han generado inmensos volúmenes de información que implican factores endógenos/exógenos que influencian procesos específicos como la causa subyacente de transformaciones malignas. La literatura clínica y básica proporciona pruebas de que los cambios en la estructura y función del ADN cumplen una función en el inicio y el avance del cáncer, definiendo el cáncer como una enfermedad genética (Wooster, 2010; Haiman, 2010) . A principios de los años 20, Otto Warburg y otros investigadores involucrados en la caracterización de cambios fundamentales en la etiología de la oncogénesis describieron dos importantes observaciones (a) la capacidad de las células de transportar y utilizar glucosa en la generación de ATP para la producción de energía en presencia . de oxígeno, también conocido como Efecto Warburg y (b) alteraciones en la estructura y función mitocondrial-incluidos cambios en el transporte de electrones que lleva a una reducción en la producción de ATP mitocondrial . En los últimos años se ha visto un resurgimiento en la investigación de la función central de la bioenergia celular en la etiología del cáncer, esto es, considerando al cáncer como una enfermedad metabólica .
Históricamente, aunque las mutaciones en los genes han sido consideradas las responsables de los cambios en la expresión génica, existe mucha literatura que apoya los procesos epigenéticos que cumplen una función crítica influenciando la expresión génica en respaldo de la carcinogénesis . Esto está probado por la observación que la tasa de mutación para la mayoría de los genes es baja y no puede suponer las numerosas (espectro de) mutaciones encontradas en las células cancerosas. La alteración epigenética se regula mediante la metilación y modificación de colas de histona, ambos cambios unidos inherentemente al estatus de energía (nutriente) de las células ya que requieren la disponibilidad de co-factores, por ej . , requerimiento de CoA acetilo para la acetilación de histona (ref) . La biosintesis de CoA acetilo depende de la glucólisis y ciclo de Kreb, uniendo directamente el estatus de energía intracelular para la regulación de expresión y actividad génicas .
En células normales, la fosforilación oxidativa mitocondrial genera ATP suficiente para cumplir con las exigencias de energía para mantener las actividades fisiológicas normales y la supervivencia celular. Una consecuencia de la producción de energía mitocondrial es la generación de especie reactiva de oxígeno (ROS) , producción aberrante que lleva al daño de la mitocondria (refs.). Está bien establecido que la generación de ROS crónica por la mitocondria lleva a la acumulación cumulativa de mutaciones genéticas, un fenómeno que ha estado implicado en la etiología de la carcinogénesis . Se ha sugerido que las células cancerosas reducen la respiración mitocondrial para minimizar la generación de ROS y cambian a glucólisis para mantener la producción de energía. Por lo tanto, sería esencial un cambio progresivo de generación de energía de fosforilación oxidativa a glucólisis para que una célula mantenga la producción de energía para mantener las funciones fisiológicas y podría estar asociada a la evolución de un fenotipo celular normal al de una célula cancerosa. El cambio progresivo en el perfil de energía celular (bioenergético) de manera conjunta con la alteración acumulada (mutaciones) en la estructura genética mitocondrial altera la metaboloma celular. Los cambios en el perfil metabolímico de células completas como consecuencia de la transición entre fosforilación mitocondrial y glucólisis corresponden a bioenergía anormal inducida por un perfil metabolómico y es la causa subyacente que respalda la carcinogénesis. La intervención diana usando una molécula endógena para provocar un cambio metabolómico celular hacia las condiciones de una fosforilación oxidativa mitocondrial normal no cancerosa asociada con un estado bioenergético celular, representa un criterio de valoración terapéutico en el tratamiento del cáncer .
Coenzima Q10 como una MIM que provoca un cambio epi-metabolómico Los datos presentados en la presente demuestran que el tratamiento de células cancerosas y normales con la coenzima Q10 está asociado a cambios en la expresión de proteínas que regulan las terminales bioquímicas clave dentro de la glucólisis-continuidad del estrés oxidativo mitocondrial. La combinación de datos que describen la valoración de la expresión de proteínas mediante las tasas de transferencia Western y consumo de oxígeno, demuestra que en las células normales existe una alteración significativa en las tasas de respiración mitocondrial y glucolítica normal que sigue la exposición a la coenzima Q10. Por lo tanto, los valores para la expresión de tasas de respiración mitocondrial y proteínas en líneas celulares normales, por ej . , un HDFa (fibroblasto adulto humano normal), HASMC (célula del músculo liso aórtico humano normal), nFib (fibroblasto normal) y HeKa (queratinocitos humanos normales) se pueden considerar representantes del estado fisiológico de referencia. Cualquier desviación en la expresión de tasas de respiración mitocondrial y proteínas en líneas celulares cancerosas por ej . , HepG2 (cáncer de hígado), PaCa-2 (cáncer pancreático),. MCF7 (cáncer de mama) , SK-MEL (melanoma) y SCC-25 (carcinoma de células escamosas) , representa una alteración debido al inicio/avance de la enfermedad, en este caso cáncer. Las pruebas experimentales proporcionan un respaldo a la hipótesis de que la exposición de la coenzima Q10 a las células cancerosas está asociada a la reorganización patofisiológica celular que es reminiscente de las células normales. Específicamente, los datos proporcionados en la presente demuestran que la exposición de la coenzima Q10 en células cancerosas está asociada al cambio en las vías glucolíticas y la fosforilación oxidativa mitocondrial responsable de la inducción de la reorganización global de la arquitectura celular a la observada en células normales.
En células normales, los criterios de valoración del rendimiento glucolítico están unidos a la fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) , esto es, generación piruvato a partir de glucosa mediante la vía glucolítica para la entrada en el ciclo de Krebs (también conocido como ciclo del ácido tricarboxílico, ciclo del ácido cítrico o de TCA) para generar equivalentes de reducción para respaldar la OXPHOS mitocondrial para la producción de ATP. Por lo tanto, en células normales la expresión y la orientación funcional de los productos génicos implicados en la glucólisis se ceban hacia la generación adecuada de piruvato y su entrada en el ciclo de Krebs. La expresión y función desreguladas de proteínas clave que participan en las vías de glucólisis y ciclo de Krebs en células cancerosas dan como resultado una glucólisis mejorada con una reducción significativa en la función mitocondrial. La exposición de las células cancerosas a la coenzima Q10, urta molécula endógena que influencia selectivamente la cadena respiratoria mitocondrial, altera (normaliza) la expresión de proteínas de las vías de glucólisis y ciclo de Krebs para facilitar un cambio bioenergético de manera tal que la producción de energía (esto es, generación de ATP) se restituye a la mitocondria.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Experimento de transferencia Western 1 Las células usadas para el experimento fueron células HDFa y MCF-7 que se trataron o no con la coenzima Q10 a dos concentraciones diferentes, 50 µ? y 100 µ?, y se cultivaron luego de 24 horas de tratamiento. Los sedimentos de células completas se resuspendieron de a uno en - 1 mL de amortiguador C7 y se transfirieron a tubos marcados de 15 mL. Las muestras se destruyeron luego por ultrasonido en la cámara fría en hielo usando 6 pulsos de ultrasonido ajustado a N° 14. Las muestras se centrifugaron durante un tiempo corto hasta 2500 g luego de la destrucción por ultrasonido y las muestras se transfirieron a tubos de 2 mi. El pH de cada muestra se verificó (el pH deber ser 9.0) usando la espuma restante en los tubos de prueba de 50 mL.
La alquilación y reducción de muestras se realizaron para cada muestra agregando 10 ul de acrilamida 1M, 25 ul de tributilfosfeno e incubación durante 90 mins con mezcla intermitente. Luego de la incubación, se agregaron 10 ul de DTT 1M y los tubos se centrifugaron a 20, 000 g a 20 grados durante 10 minutos y el sobrenadante se transfirió a unidades de filtro centrifugo marcado Amicon Ultra con un corte de 10 k (catálogo Millipore N° UFC 801024) . Las muestras se centrifugaron durante 15 minutos a 2500 g en 2 intervalos. La conductividad se midió para determinar Chaps solamente asi como las muestras usando un medidor de conductividad. Si la conductividad de las muestras es alta, entonces se agrega 1 mi de chaps para intercambio de amortiguador y se centrifuga nuevamente a 2500 g hasta que el volumen baja hasta 250 ul. Cuando la conductividad es 200 o menos las muestras se centrifugan en intervalos de 5 minutos a 2500 g hasta que el volumen del sobrenadante se encuentra entre 150 y 100 ul . Los sobrenadantes de muestra se transfieren a los tubos Eppendorf y se realiza el ensayo Bradford usando BSA como estándar.
Las muestras se procesaron según protocolos estándar tal como se describió anteriormente y la cantidad de proteína en cada una de las muestras se determinó mediante el ensayo Bradford. Los volúmenes de las muestras equivalentes a 10 ug de proteina se prepararon tal como se muestra a continuación con tinte Lamelli Loading (LDS) y agua MilliQ, se llevaron a cabo en un gel de 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE (Invitrogen, catálogo N° NP0323Box) .
Los geles se llevaron a cabo durante 50 minutos usando amortiguador MOPS IX usando un sistema NOVEX Xcell Surelock a 200 V. Los geles luego se transfirieron durante 1 hora usando un protocolo de transferencia húmedo NOVEX Xcell Surelock a 30 V. Las bandas se tiñeron con Simply Blue Safestain de Invitrogen (LC6065) .
Niveles de IDH1 y ATP-Citrato Liasa en muestras de HDFa y MCF-7.
Luego de la transferencia cada una de las bandas se colocó entre 2 papel filtro Whatman y se secó durante 15-20 minutos. Luego de secar las bandas se etiquetaron con la fecha, el tipo de muestra y ya sea banda 1 o banda 2 usando un lápiz HB. Los marcadores de peso molecular se esbozaron con el lápiz y con líneas simples para el azul y dobles para los marcadores de color. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) . La banda uno se sondó con el anticuerpo primario para IDH1 (señalización celular N° 3997) en TBS-T con en 5% de BSA (a diluciones 1:1000) y la banda 2 con el anticuerpo policlonal de conejo para ATP-Citrato Liasa en 5% de BSA (señalización celular N° 4332) a dilución 1:1000 por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave. Luego de la incubación durante la noche con anticuerpos primarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15' ; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con un escáner 5100 Fuji Láser a resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Niveles de actina en muestras de HDFa y MCF-7.
Las bandas anteriores se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las 2 bandas se analizaron en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. Las bandas luego se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15' ; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo para Actina en 5% de BSA (catálogo Sigma N° A5316, clon AC-74) a diluciones 1:5000 durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Luego de 1 hora de incubación con anticuerpo primario para Actina, las membranas se lavaron 3 veces TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (antirratón; dilución 1:10,000) durante 1 h en el agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Experimento de transferencia Western 2 Las células usadas para el experimento fueron células SKMEL28, SCC-25, nFib y Heka que se trataron o no con la coenzima Q10 a dos concentraciones diferentes, 50 µ? y 100 µ?, y se cultivaron luego de 3, 6 y/o 24 horas de tratamiento. Las muestras se procesaron y se llevaron a cabo en 4-12% de gel Bis-Tris Novex NuPAGE tal como se describió anteriormente. Los geles se llevaron a cabo, transfirieron y tiñeron esencialmente tal como se describió anteriormente.
Niveles de IDH1 para las 4 líneas celulares Luego de la transferencia la banda se secó durante 15-20 minutos, se activó con metanol durante 5 segundos, se lavó con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. La banda se bloqueó durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavó 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una). Esto luego se sondó con el anticuerpo primario para IDHl (señalización celular N° 3997) en TBS-T con en 5% de BSA (a diluciones 1:1000) por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave. Luego de la incubación durante la noche con anticuerpos primarios para IDHl, la banda se lavó 3 veces con TBS-T (1 vez 15' ; 2 veces 5' cada una) y se sondó con el anticuerpo secundario (anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, la banda se lavó 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y luego se incubó con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Niveles de ATP-Citrato Liasa , en 4 líneas celulares diferentes .
La banda de isocitrato deshidrogenasa se depuró por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. La banda se analizó en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. La banda se activó con metanol durante 5 segundos, se lavó con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. La banda se bloqueó durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavó 3 veces con TBS-T (1 vez 15' ; 2 veces 5' cada una) . Esta luego se sondó con el anticuerpo policlonal de conejo para ATP-citrato liasa eñ 5% de BSA (señalización celular N° 4332) a dilución 1:1000 durante la noche a 4 grados C con agitación. Luego de la incubación durante la noche con anticuerpo primario ATP-citrato liasa, la membrana se lavó 3 veces TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondó con el anticuerpo secundario (anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, la banda se lavó 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y luego se incubó con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Niveles de actina en 4 líneas celulares diferentes .
La banda de ATP-citrato liasa se depuró por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. La banda se analizó en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. La banda se activó con metanol durante 5 segundos, se lavó con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. La banda se bloqueó durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavó 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondó con el anticuerpo para Actina en 5% de BSA (catálogo Sigma N° A5316, clon AC-74) a diluciones 1:5000 durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Luego de 1 hora de incubación con anticuerpo primario para Actina, las membranas se lavaron 3 veces TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (antirratón; dilución 1:10,000) durante 1 h en el agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15' ; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Experimento de transferencia Western 3 Las células usadas en el experimento fueron células HepG2, HASMC y PACA2 que se trataron o no con la coenzima Q10 a dos concentraciones diferentes (50 µ? y 100 µ?) y se cultivaron luego de 48 horas de tratamiento. En este experimento (experimento de transferencia Western 3) y en todos los experimentos descritos a continuación en este Ejemplo (esto es, experimentos de transferencia Western 4 a 9), las células se trataron adicionalmente ya sea con 5 mM de glucosa ("5G") o 22 mM de glucosa ("22G") . Las muestras derivadas de las células se procesaron y se llevaron a cabo en 4-12% de gel Bis-Tris Novex NuPAGE tal como se describió anteriormente. Los geles se llevaron a cabo, transfirieron y tiñeron esencialmente tal como se describió anteriormente.
Niveles de IDH1, ATP-Citrato Liasa y Actina en HASMC en comparación con PACA2 y HepG2.
Los niveles de IDH1, ATP-citrato liasa y actina se determinaron sondando las bandas con anticuerpos primarios para IDH1, ATP-citrato liasa y actina, esencialmente tal como se describió anteriormente.
Experimento de transferencia Western 4 Las células usadas para el experimento fueron células HepG2 que se trataron o no con la coenzima Q10 a dos concentraciones diferentes, 50 o 100 µ?, y se cultivaron luego de 24 o 48 horas de tratamiento. Las muestras se procesaron y se llevaron a cabo en 4-12% de gel Bis-Tris Novex NuPAGE tal como se describió anteriormente. Los geles se llevaron a cabo, transfirieron y tiñeron esencialmente tal como se describió anteriormente.
Niveles de lactato deshidrogenasa en células HepG2.
Luego de cada transferencia la banda se secó durante 15-20 minutos, se activó con metanol durante 5 segundos, se lavó con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con lactato deshidrogenasa (abcam ab2101; policlonal) en 5% de BSA (a diluciones 1:1000) durante la noche a 4 grados C con agitación. Luego de la incubación durante la noche con anticuerpo primario para lactato deshidrogenasa, las bandas se lavaron 3 veces TBS-T (1 vez 15' ; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (conejo anticabra; dilución 1:10,000) durante 1 h a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 mins y luego cada banda se escaneó con un escáner 5100 Fuji Láser a 25 uM de resolución, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Niveles de forma piruvato cinasa muscular (PKM2) en células HepG2.
Las bandas de lactato deshidrogenasa se depuraron incubando durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C, y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada una. Las 2 bandas se analizaron en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo policlonal de conejo para piruvato cinasa M2 en 5% de BSA (NOVUS BIOLOGICALS catálogo N° H00005315-D01P) a diluciones 1:500 durante 1 hora a 4 grados C con agitación. Luego de la incubación durante la noche con anticuerpo primario para piruvato cinasa M2, las membranas se lavaron 3 veces TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15' ; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Niveles de piruvato deshidrogenasa beta en células HepG2.
Las bandas de piruvato cinasa se depuraron incubando durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C, y seguido de dos lavados de 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada una. Las 2 bandas se analizaron en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. Luego de realizar la depuración segura del anticuerpo y de que el reactivo ECF funcionara, las bandas se activaron con metanól durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo para piruvato deshidrogenasa en 5% de BSA (ABNOVA catálogo N° H00005162-M03) a diluciones 1:500 durante 1 hora a 4 grados C con agitación. Luego de la incubación durante la noche con anticuerpo primario para piruvato deshidrogenasa, las membranas se lavaron 3 veces TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (antirratón; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Niveles de actina en células HepG2.
Las bandas de piruvato deshidrogenasa se depuraron y luego se volvieron a sondar para actina, esencialmente tal como se describió anteriormente.
Experimento de transferencia Western 5 Las células usadas para el experimento fueron células MIAPACA2 (PACA2) que se trataron o no con la coenzima Q10 a dos concentraciones diferentes, 50 µ? o 100 µ , y se cultivaron luego de 24 o 48 horas de tratamiento. Las muestras de PACA2 se procesaron y los geles se llevaron a cabo, transfirieron, tiñeron y escanearon esencialmente como se describió anteriormente.
Niveles de lactato deshidrogenasa (LDH) y piruvato deshidrogenasa (PDH) en células PaCa2 Los niveles de LDH y PDH se determinaron sondeando las bandas sucesivamente con anticuerpos primarios para LDH y PDH, esencialmente como se describió anteriormente.
Niveles de caspasa 3 en células PaCa2.
Las bandas se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las 2 bandas se analizaron en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% .de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15' ; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo para caspasa 3 en 5% de BSA (Santacruz Biotechnology N° sc7272) a diluciones 1:200 durante la noche a 4 grados C con agitación. Luego de la incubación durante la noche con anticuerpo primario para caspasa 3, las membranas se lavaron 3 veces TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (antirratón; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15' ; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Experimento de transferencia Western 6 Las células que se usaron para este experimento de transferencia Western fueron PC-3, HepG2, MCF-7, HDFa y PACA2 que se trataron o no con la formulación de la coenzima Q10 IV y se cultivaron luego de 24 horas de tratamiento. Las muestras se procesaron y los geles se llevaron a cabo, transfirieron, tiñeron y escanearon esencialmente como se describió anteriormente.
Niveles de caspasa 3 y actina en diferentes tipos celulares .
Los niveles de caspasa 3 y actina se determinaron sondando las bandas sucesivamente con anticuerpos primarios para caspasa 3 y actina, esencialmente como se describió anteriormente .
Experimento de transferencia Western 7 Las células usadas para el experimento fueron células de músculo liso de la aorta (HASMC) en humanos se trataron o no con la coenzima Q10 a dos concentraciones diferentes, 50 µ? o 100 µ?, y se cultivaron luego de 24 o 48 horas de tratamiento. Las muestras de HASMC se procesaron y los geles se llevaron a cabo, transfirieron, tiñeron y escanearon esencialmente como se describió anteriormente.
Protocolo experimental para actina: Los niveles de actina sé determinaron sondeando las bandas con un anticuerpo primario para actina, esencialmente como se describió anteriormente.
Protocolo experimental para Hif lalfa, caspasa3 y PDHB: Las bandas se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se analizaron en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo primario para Hifl alfa, caspasa 3 o PDHB en 5% de BSA (a diluciones 1:200) por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave. El anticuerpo primario para Hif 1 alfa (Abcam ab2185; anticonejo) fue a dilución 1:500 en 5% de BSA. El anticuerpo primario para caspasa 3 (Santacruz sc7272; anticonejo) fue a dilución 1:200 en 5% de BSA. El anticuerpo primario para piruvato deshidrogenasa (PDHB) (Novus Biologicals H00005162-M03; antirratón) fue a dilución 1:500 en 5% de BSA. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (PDHB antirratón; Hifla y Caspasa 3 anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Protocolo experimental para PKM2, SDHB y SDHC: Las bandas anteriores se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se analizaron en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo primario para PKM2, SDHB o SDHC en 5% de BSA en TBS-T por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave. El anticuerpo primario para SDHC (ABNOVA H00006391-M02 ; antirratón) fue a dilución 1:500. El anticuerpo primario para SDHB fue de Abcam ab4714-200; antirratón; a dilución 1:1000. El anticuerpo primario para piruvato cinasa M2 (PKM2) fue de Novus Biologicals H00005315-D0IP; anticonejo; a dilución 1:500. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (SDHB & C antirratón; y PKM2 anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Protocolo experimental para LDH y Bik: Las bandas anteriores se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se analizaron en un escáner láser para verificar si la depuración estaba completa. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y sé sondaron con el anticuerpo primario para LDH o Bik en 5% de BSA en TBS-T por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave. EL anticuerpo primario para LDH fue de Abcam ab2101; anticabra; a dilución 1:1000. EL anticuerpo primario para Bik fue de señalización celular N° 9942; anticonejo; a dilución 1:1000. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (LDH anticabra; Jackson Laboratories) y Bik anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15' ; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Experimento de transferencia Western 9 Las células usadas fueron células HepG2 que se trataron o no con la coenzima Q10 a dos concentraciones diferentes, 50 µ? o 100 µ , y se cultivaron luego de 24 o 48 horas de tratamiento. Las muestras de HepG2 se procesaron y los geles se llevaron a cabo, transfirieron, tiñeron y escanearon esencialmente como se describió anteriormente.
Protocolo experimental para actina: Los niveles de actina se determinaron sondando las bandas con un anticuerpo primario para actina, esencialmente como se describió anteriormente.
Protocolo experimental para caspasa3 y MMP-6: Las bandas se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavadós de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15' ; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo primario para caspasa 3 o MMP-6 en 5% de BSA por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave. El anticuerpo primario para caspasa 3 (Abcam ab44976-100; anticonejo) fue a una dilución 1:500 en 5% de BSA. El anticuerpo primario para MMP-6 (Santacruz scMM0029-ZB5 ; antirratón) fue a una dilución 1:100 en 5% de BSA. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (MMP-6 antirratón; Caspasa 3 anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Protocolo experimental para LDH: Las bandas anteriores se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo primario para LDH en 5% de BSA o 5% de leche por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave. El anticuerpo primario para LDH 080309b! (Abcam ab2101; anticabra) fue a una dilución 1:1000 en 5% de BSA. El anticuerpo primario para LDH 080309b2 (Abcam ab2101; anticabra) fue a una dilución 1:1000 en 5% de leche. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (Jackson Immuno Research anticabra; dilución 1:10,000; 305-055-045) durante 1 h. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con un escáner 5100 Fuji Láser a resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 V y a 500 V.
Protocolo experimental para Transaldolasa e Hifla: Las bandas anteriores se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo primario para Transaldolasa o Hifla en 5% de BSA por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave. EL anticuerpo primario para Transaldolasa (Abcam ab67467; antirratón) fue a una dilución 1:500. EL anticuerpo primario para Hifla (Abcam ab2185; antirratón) fue a una dilución 1:500. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (antirratón o anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 u , 16 bit, láser verde, a 400 y 500V.
Protocolo experimental para IGFBP3 y TP53: Las bandas anteriores se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hóra con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo primario para TIGFBP3 o TP53 en 5% de BSA por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave. EL anticuerpo primario para IGFBP3 (Abcam ab76001; anticonejo) fue a una dilución 1:100. EL anticuerpo primario para TP53 (Sigma Aldrich AV02055; anticonejo) fue a una dilución 1:100. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15' ; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (anticonejo; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 y 500V.
Protocolo experimental para Transaldolasa y PDHB: Las bandas anteriores se depuraron por incubación durante 30 minutos con metanol, seguido de dos lavados de 10 minutos con TBS-T, luego 30 minutos de incubación con amortiguador de depuración a 50 grados C y seguido de dos lavados con 100 mi o más de TBS-T durante 30' cada uno. Las bandas se activaron con metanol durante 5 segundos, se lavaron con agua durante 5 minutos y TBST durante 15 minutos. Las bandas se bloquearon durante 1 hora con 5% de reactivo de bloqueo en TBS-T a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo primario para Transaldolasa o PDHB en 5% de BSA por incubación durante la noche a 4 grados C con agitación suave. EL artticuerpó primario para Transaldolasa (Santacruz sc51440; anticabra) fue a una dilución 1:200. EL anticuerpo primario para PDHB (Novus Biologicals H00005162-M03; antirratón) fue a una dilución 1:500. Luego de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15'; 2 veces 5' cada una) y se sondaron con el anticuerpo secundario (anticabra o antirratón; dilución 1:10,000) durante 1 h en un agitador basculante orbital a temperatura ambiente. Luego de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios, las bandas se lavaron 3 veces con TBS-T (1 vez 15' ; 2 veces 5' cada una) y luego se incubaron con reactivo ECF durante 5 minutos y luego cada banda se escaneó con escáner 5100 Fuji Láser a una resolución de 25 uM, 16 bit, láser verde, a 400 y 500 V.
RESULTADOS Isocitrato deshidrogenasa-1 (IDH-1) La isocitrato deshidrogenasa es una de las enzimas que es parte del ciclo de TCA que ocurre normalmente dentro de la matriz mitocondrial . Sin embargo, la IDH1 es la forma citosólica de la enzima que cataliza la descarboxilación oxidativa del isocitrato en a-cetoglutarato y que genera dióxido de carbono en un proceso de dos pasos. IDH1 es la forma dependiente de NADP+ que está presente en el citosol y la peroxisoma. IDH1 está inactiváda por la fosforilación de Serll3 y se expresa en muchas especies que incluyen aquellas sin un ciclo de ácido cítrico. Parecería que la IDH1 funciona normalmente como un supresor tumoral que tras inactivación contribuye a la tumorigénesis parcialmente mediante activación de la vía HIF-1 (Bayley 2010; Reitman, 2010) . Estudios recientes han implicado una mutación de inactivación en IDH1 de la etiología del glioblastoma (Bleeker, 2009; Bleeker, 2010) .
El tratamiento con la coenzima Q10 aumentó la expresión de IDH1 en líneas celulares cancerosas que incluyen células MCF-7, SKMEL28, HepG2 y PaCa-2. Hubo un moderado aumento en la expresión de líneas celulares SCC25. En cultivos de contraste de fibroblastos derivados humanos primarios HDFa, nFIB y las células de músculo liso de la aorta humanas HASMC, no demostraron cambios significativos en el patrón de expresión de la IDHl como respuesta a la coenzima Q10. a-cetoglutarato ( -KG) es un intermediario clave en el ciclo de TCA, sintetizado bioquímicamente a partir de isocitrato y se convierte finalmente en succinilo coA y es un MIM y cambiador epi. susceptibles de ser modificados por fármacos. La creación de a-KG sirve como coyuntura crítica en el ciclo de TCA como puede ser usado por la célula para reponer intermediarios del ciclo, dando como resultado la creación de equivalentes de reducción para aumentar la fosforilación oxidativa. Por lo tanto, la coenzima Q10 medió el aumento en la expresión de IDHl daría como resultado la formación de intermediarios que pueden ser usados en el ciclo de TCA mitocondrial para aumentar la fosforilación oxidativa en células cancerosas. Los resultados se muestran en las Tablas 30 a 32 a continuación.
Tabla 30: IDHl en HDFa y MCF-7 Composición Intensidad normalizada promedio HDF, Medio 346 HDF2 -50-Coenzima 519 Q10 HDF2 -100-Coenzima 600 Q10 MCF, Medio 221 MCF24-50-Coenzima 336 Q10 MCF24-100-Coenzima 649 QIO Tabla 31: IDH1 en HASMC en comparación con HepG2 luego del tratamiento Cantidad - Composición Intensidad normalizada HAS5g48-medio 20 HAS5g48-50-Coenzima 948 Q10 HAS5g48-100-Coenzima 1864 Q10 HAS22G48-Medio 1917 HAS22G48-50-Coenzima 1370 Q10 HAS22G48-100-Coenzima 1023 Q10 Hep5g48-Medio 14892 Hep5g48-50-Coenzima 14106 Q10 Hep5g48-100-Coenzima 15774 Q10 Hep22G48-Medio 16558 Hep22G48-50-Coenzima 15537 Q10 Hep22G48-100-Coenzima 27878 Q10 Tabla: 32: IDH1 en HASMC en comparación con PACA2 luego del tratamiento Cantidad - Composición Intensidad normalizada HAS5g48-medio 562 HAS5g48-50-Coenzima Q10 509 HAS5g48-100-Coenzima 627 Q10 HAS22G48-Medio 822 HAS22G48-50-Coenzima 1028 Q10 HAS22G48-100-Coenzima 1015 Q10 PACA5g48-Medio 1095 PACA5g48-50-Coenzima 1095 Q10 PACA5g48-100-Coenzima 860 Q10 PACA22G48-Medio 1103 PACA22G48-50-Coenzima 1503 Q10 PACA22G48-100-Coenzima 1630 Q10 ATP-Citrato Liasa (ACL) La ATP-citrato liasa (ACL) es un homotetráméro (~126kd) , enzima que cataliza la formación de acetil-CoA y oxaloacetato en el citosol. Ésta reacción se un primer paso muy importante en la biosíntesis de ácidos grasos, colesterol y acetilcolina, asi como para glucogénesis (Towle et ál., 1997). Los nutrientes y las hormonas regulan el nivel de expresión y el estado de fosforilación de esta enzima clave. Se ha reportado la fosforilación Ser454 de ACL mediante Akt y PKA (Berwick., DC et ál., 2002; Pierce MW et ál., 1982).
Los datos describen el efecto de la coenzima Q10 en ATP-citrato liasa es este en células normales y cancerosas. Consecuentemente se observa que en células cancerosas hay uña reducción dependiente de la dosis en la expresión de enzimas ACL. En contraste, esto parecería ser una tendencia hacia la expresión aumentada de ACL en células normales. Se ha demostrado que ACL citosólico es esencial para la acetilación de histona en células durante la estimulación del factor de crecimiento y durante la diferenciación. El hecho de que ACL utiliza el citrato derivado de glucosa citosólica para generar Acetil CoA esencial para acetilación de histona, un proceso importante en el proceso neoplástico demuestra un rol en la expresión de ACL inducida por coenzima Q10 en la influencia de la función de células cancerosas. Acetil CoA generado a partir del citrato por ACL citosólico sirve como una fuente para la biosíntesis de nuevos lipidos y colesterol durante la división celular. Por lo tanto, los cambios inducidos por la coenzima Q10 en la expresión de ACL alteran la disponibilidad de acetil CoA para la síntesis de lipidos y colesterol en células normales en comparación con células cancerosas. Los resultados se muestran en las Tablas 33 a 36 a continuación.
Tabla 33: ATPCL en HDFa y MCF-7 Composición Intensidad normalizada promedio HDF-Medio ~ 15000 HDF-50-Coenzima ~ 17500 Q10 HDF-100-Coenzima ~ 25000 Q10 MCF-Medio ~ 7500 MCF-50-Coenzima ~ 7500 Q10 MCF-100-Coenzima ~ 12500 Q10 Tabla 34: Banda de ATP-Citrato Liasa ~kd en HASMC en compa ación con HepG2 Cantidad - Composición Intensidad normalizada HAS5g48-medio 24557 HAS5g48-50-Coenzima 23341 Q10 HAS5g48-100-Coenzima 25544 Q10 HAS22G48-Medio 27014 HAS22G48-50-Coenzima 21439 Q10 HAS22G48-100-Coenzima 19491 Q10 Hep5g48-Medio 28377 Hep5g48-50-Coenzima 24106 Q10 Hep5g48-100-Coenzima 22463 Q10 Hep22G48-Medio 24262 Hep22G48-50-Coenzima 31235 QIO Hep22G48-100-Coenzima 50588 QIO Tabla 35: Banda de ATP-Citrato Liasa ~kd en HASMC en comparación con PACA2 Cantidad - Composición Intensidad normalizada HAS5g48-medio 11036 HAS5g48-50-Coenzima Q10 12056 HAS5g48-100-Coenzima 15265 Q10 HAS22G48-Medio 18270 HAS22G48-50-Coenzima 15857 Q10 HAS22G48-100-Coenzima 13892 Q10 PACA5g 8-Medio 11727 PACA5g48-50-Coenzima 8027 Q10 PACA5g48-100-Coenzima 4942 Q10 PACA22G48- edio 8541 PACA22G48-50-Coenzima 9537 Q10 PACA22G48-100-Coenzima 14901 QIO Tabla 36: ATP-Citrato Liasa en HepG2 y PACA2 como % de CTR Cantidad - Composición Intensidad normalizada PACA5g48-Medio 1.00 PACA5g48-50-Coenzima 0.68 QIO PACA5g48-100-Coenzima 0.42 QIO PACA22G48-Medio 1.00 PACA22G48-50-Coenzima 1.12 QIO PACA22G48-100-Coenzima 1.74 QIO Hep5g48- edio 1.00 Hep5g48-50-Coenzima QIO 0.85 Hep5g48-100-Coenzima 0.79 QIO Hep22G48-Medio 1.00 Hep22G48-50-Coenzima 1.29 QIO Hep22G48-100-Coenzima 2.09 QIO Piruvato cinasa ?2 (PK 2) La piruvato cinasa es una enzima implicada en la via glucolítica. Es la responsable de la transferencia de fosfato desde fosfoenolpiruvato (PEP) a difosfosfato de adenosina (ADP) para generar ATP y piruvato. PKM2 es una isoenzima de la piruvato cinasa glicolitica, cuya expresión se caracteriza por la función metabólica del tejido, esto es, la isoenzima M2 se expresa en células de proliferación rápida normales con necesidades de mucha energía tales como células embriónicas y también se expresa en algunos tejidos diferenciados normales tales como células islote de pulmón o pancreáticas que requieren una alta tasa de síntesis de ácido nucleico. PK 2 se expresa sumamente en células tumorales debido a su dependencia en vía glucolítica para cumplir con requisitos energía celular. La isoforma PKM2 que normalmente se dice está restringido de forma embrional se reexpresa en células cancerosas. Las células que expresan PKM2 favorecen un fenotipo glucolítico aeróbico más fuerte (muestran un cambio en el fenotipo metabólico) con una producción aumentada de lactato y una fosforilación oxidativa reducida. Por lo tanto, la reducción en la expresión de PKM2 en células cancerosas cambiaría o regularía por disminución la generación de energía mediante la vía glucolítica, una estrategia que es útil en el tratamiento del cáncer. Los datos demuestran un patrón de expresión variable de PKM2 en células cancerosas y normales, y las células cancerosas demuestran niveles mayores de expresión en comparación con las normales. El tratamiento de células con el patrón de expresión alterado por la coenzima Q10 de los niveles de banda superior e inferior de PK 2 en células normales y cancerosas. En las células cancerosas probadas, se dio una reducción dependiente de la dosis en la expresión de PKM2 y no se observó ningún cambio importante en las células normales. Los resultados se muestran en las Tablas 37 a 39 a continuación.
Tabla 37: Banda superior de forma 2 de piruvato cinasa muscular en HepG2 Cantidad Volumen Intensidad Composición normalizado normalizada (24h) (48h) 5g- edio 28386 413 5g-50-Coenzima 29269 303 Q10 5g-100-Coenzima 18307 354 Q10 22G- edio 25903 659 22G-50-Coenzima 22294 562 Q10 22G-100-Coenzima 19560 601 Q10 Tabla 38: Banda inferior de forma 2 de piruvato cinasa muscular (58 KD) en HepG2 Cantidad Volumen Volumen Composición normalizado normalizado (24h) (48h) 5g-Medio 10483 310 5g-50-Coenzima Q10 11197 185 5g-100-Coenzima Q10 7642 122 22G-Medio 9150 306 22G-50-Coenzima Q10 6302 344 22G-100-Coenzima 6904 465 Q10 Tabla 39: Banda superior de forma 2 de piruvato cinasa muscular en células HASMC luego del tratamiento.
Cantidad - Composición Intensidad normalizada 5g48-Medio 608 5g48-50-Coenzima Q10 811 5g48-100-Coenzima Q10 611 22G48-Medio 516 22G48-50-Coenzima Q10 595 22G48-100-Coenzima Q10 496 22G24-Medio 301 22G24-50-Coenzima Q10 477 22G24-100-Coenzima Q10 701 Lactato deshidrogenasa (LDH) LDH es una enzima que cataliza la iñterconversión de piruvato y lactato con la iñterconversión simultánea de NADH y NAD+. Tiene la capacidad de convertir el piruvato en lactato (ácido láctico) bajo una tensión de oxígeno celular bajo para la generación de equivalentes de reducción y generación de ATP a costa de la fosforilación oxidativa mitocondrial . Las células cancerosas típicamente demuestran una expresión aumentada de LDH para mantener el flujo glucolítico para generar ATP y equivalentes de reducción y OXPHOS mitocondriales de reducción. Por lo tanto, la reducción de la expresión de LDH en células cancerosas cambiaría el metabolismo a partir de la generación de lactato para facilitar la entrada de piruvato en el ciclo de TCA. El tratamiento con la coenzima Q10 redujo la expresión de lactato deshidrogenasa (LDH) en cáncer con el mínimo efecto sobre células normales, respaldando una función para la coenzima Q10 en la provocación de un cambio en la bioenergía de células cancerosas para la generación de ATP a partir de fuentes OXPHOS glicolíticas a mitocondriales minimizando la conversión de piruvato citoplásmico en ácido láctico. Los resultados se muestran en las Tablas 40 a 42 a continuación.
Tabla, 40: Lactato deshidrogenasa en HepG2 Cantidad Volumen Volumen Composición normalizado normalizado (24h) (48h) 5g-Medio 7981 5997 5g-50-Coenzima Q10 7900 5188 5g-100-Coenzima Q10 6616 7319 22G-Medio 9171 7527 22G-50-Coenzima Q10 7550 6173 22G-100-Coenzima 7124 9141 Q10 Tabla 41: Lactato deshidrogenasa en HepG2 como % de control de 2 experimentos Cantidad - Composición Promedio de volumen como % de control 5g24-Medio 1.00 5g24-50-Coenzima Q10 0.64 5g24-100-Coenzima Q10 1.06 5g48-Medio 1.00 5g48-50-Coenzima Q10 1.12 5g48-100-Coenzima Q10 1.21 22G24'-Medio 1.00 22G24-50-Coenzima Q10 1.21 22G24-100-Coenzima Q10 1.44 22G48-Medio 1.00 22G48-50-Coenzima Q10 0.95 22G48-100-Coenzima Q10 0.67 Tabla 42: Lactato deshidrogenasa en PACA2 Cantidad Volumen Volumen Composición normalizado normalizado (24h) (48h) 5g-Medio 2122 2360 5g-50-Coenzima Q10 5068 2978 5g-100-Coenzima Q10 3675 2396 22G-Medio 4499 2332 22G-50-Coenzima Q10 10218 2575 22G-100-Coenzima 7158 3557 Q10 Piruvato deshidrogenasa - B (PDH-E1) La piruvato deshidrogenasa beta (PDH-E1) en el primer componente de la enzima que es parte del complejo piruvato deshidrogenasa (PDC) que convierte piruvato en acetil CoA. PDH-E1 requiere tiamina como cofactor para su actividad, realiza las primeras dos reacciones bioquímicas en el complejo PDC esencial para la conversión del piruvato en acetil CoA para ingresar en el ciclo de TCA en la mitocondria. Por lo tanto, reducciones concomitantes en la i expresión de PKM2 y LDH junto con un aumento en la expresión de PDH-El en células cancerosas potenciarían la tasa de entrada del piruvato hacia el aumento de OXPHOS mitocondrial para la generación de ATP. Los datos muestran que para la expresión de PDH-El en líneas celulares normales y cancerosas, las expresiones de referencia de esta enzima se reducen en células cancerosas en comparación células normales. El tratamiento con la coenzima Q10 está asociado al aumento progresivo en la expresión de las proteínas PDH-El en células cancerosas con cambios mínimos en las células normales. Los resultados se muestran en las Tablas 43 a 45 a continuación .
Tabla 43: Piruvato deshidrogenasa beta en HepG2 Cantidad Volumen Volumen Composición normalizad normalizado o (24h) (48h) 5g-Medio 517 100 5g-50-Coenzima Q10 921 123 5g-100-Coenzima Q10 433 205 22G-Medio 484 181 22G-50-Coenzima Q10 426 232 22G-100-Coenzima 340 456 Q10 Tabla 44: Piruvato deshidrogenasa beta en PACA2 Cantidad Volumen Volumen Composición normalizado normalizado (24h) (48h) 5g-Medio 323 375 5g-50-Coenzima Q10 492 339 5g-100-Coenzima QIO 467 252 22G-Medio 572 276 22G-50-Coenzima QIO 924 279 22G-100-Coenzima 1201 385 QIO Tabla 45: Piruvato deshidrogenasa beta en HASMC luego del tratamiento Cantidad - Composición Volumen normalizado 5g48-Medio 140 5g48-50-Coenzima Q10 147 5g48-100-Coenzima Q10 147 22G48-Medio 174 22G48-50-Coenzima Q10 149 22G48-100-Coenzima Q10 123 22G24-Medio 140 22G24-50-Coenzima Q10 145 22G24-100-Coenzima Q10 150 Caspasa 3 El control del comienzo de la apoptosis normalmente se emplea en el nivel de las caspasas iniciadoras, caspasa-2, -9 y -8/10. En la vía extrínseca de la apoptosis, la caspasa-8, una vez activa, directamente escinde y activa la ejecución de caspasas (tales como caspasa-3) . La caspasa-3 escinde y activa otras caspasas (6, 7, y 9) así como dianas pertinentes en las células (por ej . , PARP y DFF) . En estos estudios, los niveles de la proteina caspasa-3 efectora se midieron en las lineas celulares cancerosas y en lineas celulares normales como respuesta a la coenzima Q10. Se debe observar que aunque el control de la apoptosis se realiza mediante las caspasas iniciadoras, una cantidad de vías de señalización interrumpieron en cambio la transmisión de la señal apoptotica a través de la inhibición directa de caspasas efectoras. Por ej . , P38 MAPK fosforila la caspasa-3 y suprime su actividad (Alvarado-Kristensson et ál., 2004). Resulta interesante que la activación de los fosfatos de proteina (PP2A) en el mismo estudio o proteina cinasa C delta (PKC delta) (Voss et á., 2005) puede contrarrestar el efecto de p38 MAPK para amplificar la activación de caspasa-3 y reforzar la transmisión de la señal apoptotica. Por lo tanto, los eventos al nivel de la activación de caspasa-3 o luego de la activación de caspasa-3 pueden determinar el último destino de la célula en algunos casos.
La caspasa-3 es una proteina cisteina-ácido aspártico que cumple una función central en la fase de ejecución de la apoptosis celular. Los niveles de caspasa 3 en las células cancerosas se aumentaron con el tratamiento con la coenzima Q10. Por el contrario, la expresión de caspasa-3 en células normales se redujo moderadamente en células normales. Los resultados se muestran en las Tablas 46 a 48 a continuación.
Tabla 46: Caspasa 3 en PACA2 Cantidad Volumen Volumen Composición normalizado normalizado (24h) (48h) 5g-Medio 324 300 5g-50-Coenzima Q10 325 701 5g-100-Coenzima Q10 374 291 22G-Medio 344 135 22G-50-Coenzima Q10 675 497 22G-100-Coenzima 842 559 Q10 : Tabla 47: Caspasa 3 en células HepG2 como % de control de 2 experimentos Cantidad - Composición Volumen normalizado como % de control 5g24-Medio 1.00 5g24-50-Coenzima Q10 1.08 5g24-100-Coenzima Q10 1.76 5g48-Medio 1.00 5g48-50-Coenzima Q10 1.44 5g48-100-Coenzima Q10 0.95 22G24-Medio 1.00 22G24-50-Coenzima Q10 1.39 22G24-100-Coenzima Q10 1.78 22G48-Medio 1.00 22G48-50-Coenzima Q10 1.50 22G48-100-Coenzima Q10 1.45 Tabla 48: Caspasa 3 en HASMC luego del tratamiento Cantidad - Composición Volumen normalizado 5g48-Medio 658 5g48-50-Coenzima Q10 766 5g48-100-Coenzima Q10 669 22G48-Medio 846 22G48-50-Coenzima Q10 639 22G48-100-Coenzima Q10 624 22G24-Medio 982 22G24-50-Coenzima Q10 835 22G24-100-Coenzima Q10 865 Succinato deshidrogenasa (SDH) La succinato deshidrogenasa, también conocida como succinato-coenzima Q reductasa es un complejo de la membrana mitocondrial interna que está involucrada tanto en TCA como en la cadena de transporte de electrones. En el TCA, este complejo cataliza la oxidación de succinato en fumarato con la reducción concomitante de ubiquinona en ubiquinol. (Baysal et ál., Science 2000; y Tomlinson et ál., Nature Genetics 2002). Se descubrió que las mutaciones de lineas germinales en las subunidades de SDH B, C y D inician los eventos de paraganglioma o leiomioma familiar (Baysal et ál., Science 2000) .
Los análisis de transferencia Western se usaron para caracterizar la expresión de la subunidad B de SDH en preparaciones mitocondriales de células cancerosas tratadas con la coenzima Q10. Los resultados sugieren que el tratamiento con la coenzima Q10 está asociado a los niveles proteicos de SDH aumentados en la mitocondria de las células. Estos resultados sugieren que uno de los mecanismos de acción la coenzima Q10 es cambiar el metabolismo de la célula hacia el ciclo de TCA y la mitocondria aumentando los niveles de enzimas mitocondriales tales como SDHB. Los resultados se muestran en la Tabla 49 a continuación.
Tabla 49: Succinato deshidrogenasa B en NCIE0808 Mitopreps Composición - Tiempo Volumen normalizado promedio Medio 531 50 uM Coenzima Q10, 634 3h 100 uM Coenzima Q10, 964 3h 50 uM Coenzima Q10, 1077 6h 100 uM Coenzima Q10, 934 6h Factor inducible por hipoxia -1 El factor inducible por hipoxia (Hif) es un factor de transcripción compuesto por subunidades alfa y beta. En normoxia, los niveles de proteínas de Hifl alfa son muy bajos debido a su continuada degradación a través de una secuencia de eventos postraduccionales . El cambio entre la fosforilación glucolitica y oxidativa se considera generalmente que está controlado por las actividades relativas de dos enzimas PDH y LDH que determinan el destino catabólico del piruvato. Hif controla este punto de bifurcación crucial induciendo los niveles de LDH e inhibiendo la actividad de PDH estimulando PDK. Debido a esta capacidad de desviar el metabolismo del piruvato desde la mitocondria hacia el citosol, se considera que Hif es un mediador crucial del cambio bioenergético en células cancerosas .
El tratamiento con la coenzima Q10 redujo los niveles de la proteina Hifl alfa luego en las preparaciones mitocondriales de células cancerosas. En Usados de células completas de células normales, se observó la banda inferior de Hifl y mostró una reducción también. Los resultados se muestran en las Tablas 50 a 51 a continuación.
Tabla 50: Banda inferior de Hifl alfa en células HASMC luego del tratamiento Cantidad - Composición Volumen normalizado 5g48- edio 22244 5g48-50-Coenzima Q10 21664 5g48-100-Coenzima Q10 19540 22G48-Medio 14752 22G48-50-Coenzima Q10 17496 22G48-100-Coenzima Q10 23111 22G24-Medio 21073 22G24-50-Coenzima Q10 18486 22G24-100-Coenzima Q10 17919 Tabla 51: Banda superior de Hifl alfa HepG2 luego del tratamiento Cantidad - Composición Volumen normalizado 5g24- edio 12186 5g24-50-Coenzima Q10 8998 5g24-100-Coenzima Q10 9315 5g48-Medio 8868 5g48-50-Coenzima Q10 8601 5g48-100-Coenzima Q10 10192 22G24-Medio 11748 22G24-50-Coenzima Q10 14089 22G24-100-Coenzima Q10 8530 22G48- edio 8695 22G48-50-Coenzima Q10 9416 22G48-100-Coenzima Q10 5608 Ejemplo 22 : Análisis de las tasas de consumo de oxigeno (OCR) y acidificación extracelular (ECAR) en células normales y cancerosas tratadas con CoQlO Este ejemplo demuestra la exposición de las células al tratamiento mediante un IM/cambiador epi . de la invención-CoQlO representativo en ausencia y/o presencia de factores estresantes (por ej . , hiperglucemia, hipoxia, ácido láctico) se asocian a un cambia hacia la glucólisis (biosintesis de lactato y fosforilación oxidativa mitocondrial (tal como se mide por los valores ECAR y OCR) representativos de valores observados en células normales en condiciones fisiológicas normales .
Los solicitantes han demostrado en la sección previa que el tratamiento con CoQlO en células cancerosas está asociado a cambios en la expresión de proteínas específica que potencian la fosforilación oxidativa mitocondrial con una reducción concomitante en la glucólisis o biosíntesis de lactato. Este ejemplo muestra que una medida directa de la fosforilación oxidativa mitocondrial se puede obtener midiendo las tasas de consumo de oxígeno (OCR) en líneas celulares usando en analizador SeaHorse XF, un instrumento que mide el oxígeno disuelto y los niveles de pH extracelulares en un modelo experimental in vitro. (SeaHorse Biosciences Inc, North Billerica, A) .
El pH del microambiente extracelular es relativamente ácido en tumores en comparación con el pH intracelular (citoplásmico) y tejidos normales circundantes. Esta característica de los tumores sirve para muchos fines que incluyen la capacidad de invadir la matriz extracelular (ECM) , un atributo distintivo de metástasis tumoral que inicia posteriormente las cascadas de señalización que modulan adicionalmente: • angiogénesis tumoral • activación aumentada de mecanismos de detención que controlan la renovación del ciclo celular • mecanismos iñmunomoduladores que facilitan un sistema de evasión celular en comparación con la inmunovigilancia • elementos de control metabólico que aumentan la dependencia del flujo glucolitico y el uso de lactato • desregulación de familias génicas apoptóticas clave tales como Bcl-2, IAP, EndoG, AIF que sirven para aumentar la oncogenicidad Mientras no se pretende limitarse por cualquier teoría particular, el pH ácido del microambiente externo en el tumor es una consecuencia del aumento en las concentraciones del ion hidrógeno extrudidas de las células tumorales debido a la producción de lactato aumentada a partir de un fenotipo glucolitico alterado.
En este experimento, el OCR y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) en líneas celulares normales se obtuvieron en presencia y ausencia de CoQlO para determinar los valores del punto de referencia. Se observó que en su ambiente nutritivo natural, las tasas de OCR básales en líneas celulares normales son diferentes y son normalmente una función de los roles fisiológicos de las células en el cuerpo.
Por ejemplo, se llevó a cabo un conjunto de experimentos usando la línea celular no cancerosa HDFa, que es una línea celular de fibroblastos dérmicos de adultos humanos. Los fibroblastos son células que sintetizan y secretan principalmente los componentes de matriz extracelular (ECM) y colágeno que forman el marco estructural (estroma) para tejidos. Además, se sabe que los fibroblastos sirven como mensajeros de tejidos de diversas funciones tal como cicatrización de heridas e inmunomodulación localizada. En condiciones fisiológicas normales, se cumplen los requisitos de energía en fibroblastos normales usando una combinación de glucólisis y fosforilación oxidativa - la glucólisis proporciona los nutrientes necesarios para la síntesis de ECM.
En oposición a HDFa, la HASMC (célula del músculo liso aórtico humano) se encuentra en arterias, venas, vasos linfáticos, tractos gastrointestinales, tracto respiratorio, vejiga urinaria y otros tejidos con capacidad de someterse a acoplamiento excitación-contracción regulado. La capacidad de los músculos lisos, tales como células HASMC para someterse a contracción requiere energía proporcionada por ATP. Estos tejidos realizan una transición desde modos de energía baja donde ATP se puede suministrar desde la mitocondria a modos de energía alta (durante el ejercicio/estrés) donde se proporciona la energía cambiando a glucólisis para una generación de ATP rápida. De éste modo, las células del músculo liso normal pueden usar una combinación de OXPHOS mitocondrial y glucólisis para cumplir con sus requisitos de energía en un ambiente fisiológico normal.
Las diferencias en sus funciones fisiológicas correspondientes (esto es, HDFa y HASMC) se observaron en los valores de OCR en reposo medidos en estas líneas celulares usando un analizador SeaHorse XF. Las Figuras 29 y 30 a continuación describen el OCR en células HDFa y HASMC cultivadas en condiciones de glucosa fisiológicamente normal (alrededor de 4.6 mM) y glucosa alta (hiperglucémica) .
Los valores de OCR de referencia para HDFa en ausencia de cualquier tratamiento en disponibilidad de oxigeno normal son aproximadamente 40 pmoles/min (Figura 29) en presencia de 5.5 nM de glucosa. Este valor se elevó ligeramente cuando las células se mantuvieron a 22 mM de glucosa. Por el contrario, en células HASMC, los valores de OCR a 5.5 mM de glucosa son aproximadamente 90 pmoles/min y el valor de OCR se redujo a aproximadamente 40 pmoles/min estando a 22 mM de glucosa. Por lo tanto, en condiciones hiperglucémicas, existe una respuesta diferencial entre HDFa y HASMC, lo que demuestra adicionalmente diferencias inherentes en su estructura y función fisiológicas correspondientes.
El tratamiento con CoQlO está asociado a cambios en OCR que representa las condiciones observadas en condiciones de glucosa normales (5 mM) . La complejidad de la respuesta fisiológica está compuesta en presencia de una tensión de oxigeno baja. De este modo, la exposición de CoQlO está asociada a cambios en las tasas de OCR en células normales hacia el estado fisiológico que es natural a una célula particular.
La Tabla 52 a continuación describe los valores de ECAR (mpH/min) en células HDFa en presencia o ausencia de CoQlO en condiciones normóxicas e hipóxicas a 5.5 mM y 22 mM de glucosa. Se puede observar que en células normales el tratamiento con CoQlO tuvo una mínima influencia en los valores de ECAR, aunque tuvo una influencia sobre OCR en estas células. En condiciones hipóxicas de alta glucosa, el tratamiento con CoQlO se asoció con la disminución de ECAR elevado hasta un valor que se observó en condiciones normóxicas no tratadas.
Tabla 52: Valores de ECAR en células HDFa en presencia y ausencia de CoQlO en condiciones normóxicas e hipóxicas a 5.5 mM y 22 mM de glucosa Normoxia Hipoxia Normoxia Hipoxia (5.5mM) (5.5mM) (22mM) (22mM) Tratamiento ECAR SE ECAR SEM ECAR SEM ECAR SEM Sin tratar 5 1.32 5 0.62 5 0.62 9 0.81 50µ? 31510 6 1.11 5 0.78 5 0.78 6 0.70 ???µ? 31510 6 0.76 5 1.19 5 1.19 8 1.07 En la Tabla 53 los valores de ECAR de referencia medidos (mpH/min) en HASMC fueron mayores en comparación con los de HDFa. La inducción de condiciones hipóxicas ocasionaron un aumento en ECAR muy probablemente asociado a la acidosis inducida por hipoxia intracelular posterior a una glucólisis aumentada.
Tabla 53: Valores de ECAR en células HASMC en presencia y ausencia de CoQlO en condiciones normóxicas e hipóxicas a 5.5 mM y 22 mM de glucosa Normóxico Hipóxico Normóxico Hipóxico (5.5mM) (5.5mM) (22mM) (22mM) Tratamiento ECAR SEM ECAR SEM ECAR SEM ECAR SEM Sin tratar 9 2.22 11, 2.18 22 2.08 19 1.45 50µ? 31510 9 2.13 11 2.54 21 1.72 17 1.60 ???µ? 31510 9 1.72 13 2.30 22 1.64 17 1.47 Se observó que el tratamiento con CoQlO está asociado a una tendencia descendente de las tasas de ECAR en células HASMC hiperglucémicas en condiciones hipóxicas hacia un valor que se observaría en condiciones de glucosa normal normóxica. Estos datos demuestran la presencia de variables fisiológicas que son inherentes a la función fisiológica de un tipo especifico de célula, las alteraciones observadas en condiciones anormales (por ej . , hiperglucemia) se cambian a normal al tratarse con CoQlO.
Por el contrario, las células cancerosas (por ej . , MCF-7, PaCa-2) se ceban esencialmente para cultivar en niveles mayores de glucosa en comparación con células normales debido a su fenotipo glucolítico para su mantenimiento en el cultivo. El tratamiento con CoQlO provocó una reducción uniforme en los valores de OCR (Figura 31 y Figura 32) .
Los efectos de CoQlO sobre los valores de OCR en células MCF-7 y PaCa-2 fueron similares a los de las células HDFa y HASMC normales, donde la respuesta variable sugería una respuesta terapéutica con base en el perfil metabólico individual de la línea celular cancerosa.
Tabla 54: Valores de ECAR en células PaCa-2 en presencia y ausencia de CoQlO en condiciones normóxicas e hipóxicas a 5.5 mM y 22 mM de glucosa Normoxia Hipoxia Normoxia Hipoxia (17mM) (17mM) (22m ) (22mM) Tratamiento ECAR SEM ECAR SEM ECAR SEM ECAR SEM Sin tratar 21 5.97 16 3.41 24 4.35 36 5.65 50µ 31510 13 3.08 12 1.66 20 5.15 25 4.58 ???µ? 31510 14 2.14 17 2.59 19 3.38 30 5.62 La Tabla 54 describe los valores de ECAR en células PaCa-2. A diferencia de las células normales, las células cancerosas se ceban fenotipicamente para usar alta glucosa para la generación de ATP (glucólisis potenciada) lo que da como resultado ECAR alto (Tabla 54, ECAR para normoxia no tratada 17mM) a 21 mpH/min. El tratamiento con CoQlO produce una reducción significativa en tasas de ECAR en estas condiciones, muy probablemente asociada a una reducción en el ácido láctico generado por glucólisis. La reducción asociada en OCR en estas células probablemente se asoció a la eficacia aumentada del OXPHOS mitocondrial .
Una comparación similar de los valores de OCR y ECAR (no se muestran los datos) se determinaron en varias otras lineas celulares cancerosas y normales, que incluyen: lineas celulares de HAEC (células endoteliales aórticas humanas normales) , MCF-7 (cáncer de mama) , HepG2 (cáncer de hígado) y PC-3 altamente metastásico (cáncer de próstata) . En todas las líneas celulares probadas, la exposición a CoQlO en presencia y/o ausencia de factores estresantes (por ej . , hiperglucemia, hipoxia, ácido láctico) se asoció a un cambio en los valores de OCR y ECAR que representan los valores observados en células normales en condiciones fisiológicas normales. Por lo tanto, el efecto general de CoQlO en el tratamiento del cáncer, incluyendo muerte celular, es un efecto descendente de su influencia colectiva en resultados proteómicos, genómicos, metabolómicos junto con el cambio de la bioenergia celular de la glucólisis a OXPHOS mitocondrial .
Ejemplo 23 : Moléculas básicas para la biosintesis de CoQlO Este ejemplo demuestra que determinados precursores de la biosintesis de CoQlO, tal como aquellos para la biosintesis del anillo de benzoquinona y aquellos para la biosintesis de repeticiones isoprenoides y su unión al anillo de benzoquinona ("componentes básicos") se pueden administrar individualmente o en combinación Con células diana y realizar una regulación por disminución del inhibidor de apoptosis Bcl-2, y/o regulación por aumento del promotor de apoptosis Caspasa-3. Determinados precursores o combinaciones de los mismos pueden inhibir también la proliferación celular. Los datos sugieren que dichos precursores de CoQlO se pueden usar en lugar de CoQlO para lograr sustancialmente los mismos resultados que la administración de CoQlO.
Algunas condiciones experimentales ejemplares usadas en los experimentos se enumeran a continuación.
Se cultivaron células de melanoma Skmel-28 en D EM/F12 complementadas con 5% de suero bovino fetal (FBS) y IX de concentración final de antibióticos. Las células se cultivaron hasta 85% de confluencia y se trataron con componentes básicos durante 3, 6, 12 y 4 horas. Luego se sedimentaron las células y se realizó el análisis de transferencia Western.
Los componentes básicos incluyen L-fenilalanina, DL fenilalanina, D-fenilalanina, L-tirosina, DL-tirosina, D tirosina, 4-hidroxi-fenilpiruvato, fenilacetato, 3-metoxi-4 hidroximandelato (vanililmandelato o VMA) , ácido vanílico, 4 hidroxi-benzoato, piridoxina, pantenol, ácido mevalónico acetilglicina, acetil-CoA, farnesilo y 2 , 3-dimetoxi-5-metil p-benzoquinona .
En el análisis de transferencia Western, se sedimentaron las células en PBS frío, se Usaron y se cuantificaron los niveles de proteina usando un ensayo de proteina BCA. El lisado de célula completa se cargó en un gel Tris-HCl con 4% de carga y 12% de ejecución. Luego se transfirieron las proteínas a un papel de nitrocelulosa y luego se bloquearon con 5% de solución tris-amortiguada con leche durante 1 hora. Las proteínas luego se expusieron a anticuerpos primarios (Bcl-2 y caspasa-3) durante la noche. El papel de nitrocelulosa luego se expuso a Pico Chemilluminescent durante 5 min y se registró la expresión de proteínas. Luego de la exposición, se cuantificó la actina usando el mismo método. Usando imageJ se cuantificaron los niveles de expresión de proteínas. Se usó una prueba t para analizar la importancia estadística.
A continuación se resumen los resultados ilustrativos de los experimentos.
Análisis de transferencia Western del componente básico L-fenilalanina: Antes de proceder a la vía de síntesis para la estructura del anillo de quinona, L-fenilalanina se convierte en tirosina. Se realizó un análisis de transferencia Western para cuantificar todo cambio en la expresión de proteínas apoptóticas en las células de melanoma. Las concentraciones probadas fueron 5 µ?, 25 µ y 100 µ?. Los estudios iniciales agregaron L-Fenilalanina a medio DMEM/F12 que contenía una concentración de fenilalanina 0.4 M. Para los 5 µ?, 25 µ? y 100 µ? la concentración final de la L-fenilalanina en el medio fue 0.405 M, 0.425 M y 0.500 M, respectivamente. Estas concentraciones finales se probaron en las células Skmel-28 para períodos de incubación de 3, 6, 12 y 24 horas. Las células se cultivaron hasta 80% de confluencia antes de la adición del medio de tratamiento y se cosecharon usando procedimiento de análisis de transferencia Western tal como se describió anteriormente. Se observó una disminución estadísticamente significativa en Bcl-2 para los 100 µ? de L-fenilalanina después de 3 horas y 12 horas de incubación. Para los 5 µ? de L-fenilalanina, se observó una disminución estadísticamente significativa en Bcl-2 después de 6 horas de incubación. Para los 25 µ? de L-fenilalanina, se observó una disminución estadísticamente significativa en Bcl-2 y un aumento estadísticamente significativo en caspasa-3 después de 12 horas de incubación. Una disminución estadísticamente significativa en Bcl-2 indica un cambio en el potencial apoptótico y un aumento estadísticamente significativo en caspasa-3 confirma que las células están experimentando apoptosis. Hubo una tendencia constante para la disminución en Bcl-2 en comparación con el control aunque debido al tamaño de muestra y desviación estándar estos puntos de tiempo no fueron estadísticamente significativos en este experimento.
Análisis de transferencia Western del componente básico D-fenilalanina: Se probó D-fenilalanina, una forma químicamente sintética de la L-fenilalanina bioactiva, para su comparación con L-fenilalanina . Para las tres concentraciones (5 µ?, 25 µ? y 100 µ?) de D-fenilalanina, hubo una reducción significativa en la expresión de Bcl-2 después de 6 horas de incubación. Además, para los 5 µ? y 25 µ?, hubo una reducción significativa después de 3 horas de incubación. Para las concentraciones de 5µ? y 100 µ , se observó un aumento significativo en la expresión de caspasa-3 después de 6 horas de incubación.
Análisis de transferencia Western del componente básico DL-fenilalanina: También se probó DL-fenilalanina para su comparación con L-fenilalanina . Nuevamente, se probaron las concentraciones de 5 µ?, 25 µ? y 100 µ en las células Skmel-28. Los períodos de incubación fueron 3, 6, 12 y 24 horas. Se observó un aumento estadísticamente significativo en caspasa-3 después de 3 horas de incubación. Se observó una disminución estadísticamente significativa en Bcl-2 después de 24 horas de incubación. Aunque hubo una tendencia de Bcl-2 en disminución y caspasa-3 en aumento en todas las otras concentraciones y puntos de tiempo de incubación, no fueron estadísticamente significativos en este experimento.
Análisis de transferencia Western del componente básico L-tirosina: L-tirosina es un componente básico para la síntesis de la estructura del anillo de quinona de CoQlO. La prueba inicial de L-tirosina no tuvo como resultado una concentración de proteína suficientemente alta para el análisis de transferencia Western. A partir de este estudio se probaron concentraciones en 25 µ? para análisis de transferencia Western. El medio DMEM/F12 usado contenía una concentración de sal disódica de L-tirosina de 0.398467 M. La concentración inicial aumentó en 500 nM, 5 µ? y 15 µ?. Se observó un aumento estadísticamente significativo en caspasa-3 para la concentración de 500 nM después de 12 horas de incubación. Se observó también un aumento estadísticamente significativo en caspasa-3 para la disminución estadísticamente significativa de 5A en Bcl-2 para la concentración de 5 µ? después de 24 horas de incubación. Se observó una disminución estadísticamente significativa en Bcl-2 para los 500 µ? de concentraciones de 5 µ? después de 24 horas de incubación.
Análisis de transferencia Western del componente básico D-tirosina: Se probó D-tirosina, una forma sintética de L-tirosina, para su comparación con el efecto apoptótico de L-tirosina en las células de melanoma. Con base en los estudios iniciales con L-tirosina, se eligieron las concentraciones por debajo de 25 µ? para el análisis de transferencia Western. Las concentraciones probadas fueron 1 µ?, 5 µ y 15 µ?. D-tirosina mostró una reducción en la expresión de Bcl-2 para las concentraciones de 5 µ y 15 µ? para los períodos de tiempo de 12 y 24 horas. Caspasa-3 aumentó de manera significativa para la concentración de 5 µ para los períodos de tiempo 3, 12 y 24. Hubo también un aumento en la expresión de caspasa-3 para 1 µ? para los periodos de tiempo de 12 y 24 horas. Además hay un aumento en la expresión de caspasa-3 para ' 5 µ para el periodo de tiempo de 12 horas.
Análisis de transferencia Western del componente básico DL-tirosina: Se probó DL-tirosina, una forma sintética de L-tirosina, para su comparación con el efecto apoptótico de L-tirosina en las células. Hay una disminución estadística en la expresión de Bcl-2 observada en las concentraciones de 1 µ? y 15 µ después de 12 horas de incubación y para los 5 µ? después de 24 horas de incubación. Se observó también un aumento en la expresión de caspasa-3 para los 5 µ? y 15 µ? después de 12 horas de incubación.
Análisis de transferencia Western del componente básico 4-hidroxi-fenilpiruvato: 4-hidroxi-fenilpiruvato se deriva de los aminoácidos tirosina y fenilalanina y puede incidir en la síntesis de la estructura del anillo. Se probaron las concentraciones de 1 µ?, 5 µ? y 15 µ? para la expresión de Bcl-2 y caspasa-3. Para las concentraciones de 5 µ? y 15 µ? hubo una reducción significativa en la expresión de Bcl-2 después de 24 horas de incubación y un aumento significativo en la expresión de caspasa-3 después de 12 horas de incubación.
Análisis de transf rencia Western del componente básico fenilacetato: Fenilacetato tiene el potencial de convertirse en 4-hidroxi-benzoatO, que incide en la unión de la cadena lateral a la estructura del anillo. La concentración probada fue 1 µ?, 5 µ? y 15 µ?. Para fenilacetato hubo una disminución en la expresión de Bcl-2 para la concentración de 5 µ? y 15 µ? después de 12 horas y 24 horas de incubación. Se observó un aumento en la expresión de caspasa-3 para la concentración de 5 µ? y 15 µ? después de 12 horas y 24 horas de incubación.
Análisis de transferencia Western del componente básico 3-metoxi-4-hidroximandelato (vanilil andelato o VMA) : VMA es un componente adicional para la síntesis de la estructura del anillo de quinona de CoQlO. Las concentraciones probadas fueron 100 nM, 250 nM, 500 nM, 1 µ?, 25 µ?, 50 µ? y 100 µ?. Aunque no se observó un efecto apoptótico estadísticamente significativo en este experimento, los datos indicaron una tendencia descendente de la expresión de Bcl-2.
Análisis de transferencia Western del componente básico ácido vanílico: Vanílico es un precursor para la síntesis del anillo de quinona y se probó en una concentración de 500 nm, 5 µ?, y 15 µ?. Un análisis de transferencia Western midió la expresión de Bcl-2 y Caspasa-3. El ácido vanílico mostró que reduce significativamente la expresión de Bcl-2 para las concentraciones de 500 nM y 5 µ? en el punto de tiempo de 24 horas de incubación. Para la concentración de 15 µ? hay una reducción en la expresión de Bcl-2 después de 3 horas de incubación. Para las células incubadas con 15 µ? durante 24 horas hubo un aumento significativo en la expresión de Caspasa-3.
Análisis de transferencia Western del componente básico 4-Hidroxibenzoato: El ácido de 4-Hidroxibenzoato incide en la unión de la cadena lateral de isoprenoide a la estructura del anillo. Las concentraciones probadas fueron 500 nM, 1 µ? y 50 µ?. Hubo una reducción significativa en la expresión de Bcl-2 para la concentración de 15 µ? después de 24 horas de incubación .
Análisis de transferencia Western del componente básico. 4-Piridoxina: Piridoxina es otro precursor básico para la síntesis de la estructura de anillo de quinona de CoQlO. Las concentraciones probadas para este compuesto son 5µ?, 25µ? y 100 µ . Las células se ensayaron para sus niveles de Bcl-2 y Caspasa-3. Piridoxina mostró una reducción significativa en Bcl-2 después de 24 horas de incubación en células de melanoma .
Análisis de transferencia Western del componente básico Pantenol: Pantenol incide en la síntesis de la estructura del anillo de quinona de CoQlO. Las concentraciones probadas en las células de melanoma fueron 5 µ?, 25 µ? y 100 µ?. Este compuesto mostró una reducción significativa en la expresión de Bcl-2 para la concentración de 25 µ?.
Análisis de transferencia Western del componente básico Mevalónico: El ácido mevalónico es uno de los componentes principales para la síntesis de CoQlO. Este compuesto se probó en las concentraciones de 500 nM, 1 µ?, 25 µ?? y 50 µ?.
No hubo reducción significativa en la expresión de Bcl-2 o un aumento en la expresión de Caspasa-3 en este experimento.
Análisis de transferencia Western del componente básico Acetilglicina Otra vía para la síntesis de CoQlO es la síntesis de isoprenoide (cadena lateral) . La adición de Acetilglicina convierte la Coenzima A a Acetil-CoA que ingresa en la senda mevalónica para la síntesis de la síntesis de isoprenoide. Las concentraciones probadas fueron 5 µ?, 25 µ? y 100 µ?. La prueba de Acetilglicina mostró una disminución significativa en la expresión de Bcl-2 después de 12 horas de incubación para la concentración de 5 µ? y 25 µ?. Se registró una disminución significativa en Bcl-2 para la concentración de 100 µ? en el punto de tiempo de 24 horas de incubación.
Análisis de transferencia Western del componente básico Acetil-CoA: Acetil-CoA es un precursor para la senda mevalónica para la síntesis de CoQlO. Las concentraciones probadas fueron 500 nm, 1 µ?, 25 µ? y 50 µ?. No se observó reducción significativa en expresión de Bcl-2 o aumento en expresión de Caspasa-3 para los puntos de tiempo y concentraciones probados.
Análisis de transferencia Western del componente básico L-Tirosina en combinación con Farnesilo: L-Tirosina es uno de los precursores para la síntesis de la estructura del anillo de quinona para CoQlO. Un experimento previo probó la reacción de L-Tirosina en medio con L-Fenilalanina y L-Tirosina. En este estudio se examinó L-Tirosina en medio sin la adición de L-Fenilalanina y L-Tirosina. En este estudio las concentraciones finales de L-Tirosina probadas fueron 500 nM, 5 µ? y 15 µ?. Se probó Farnesilo en una concentración de 50 µ?. No se observó respuesta significativa para los puntos de tiempo de 3 y 6 horas.
Análisis de transferencia Western del componente básico L-fenilalanina en combinación con Farnesilo: Se examinó L-Fenilalanina, un precursor para la síntesis de la estructura del anillo de quinona, en combinación con Farnesilo en medio libre de L-Tirosina y L-Fenilalanina. Se realizó un análisis de transferencia Western para ensayar la expresión de Bcl-2 y Caspasa-3. Las concentraciones finales de L-Fenilalanina fueron: 5 µ?, 25 µ? y 100 µ?. Se agregó Farnesilo en una concentración de 50 µ?. Este estudio mostró una disminución en la expresión de Bcl-2 para la mayoría de las concentraciones y combinaciones probadas tal como se describe en la tabla 55 a continuación.
Tabla 55 L- hr 6 hr 12 hr 4 hr fenilanalina Bcl-2 as-3 Bcl-2 as-3 Bcl-2 as-3 cl-2 as-3 5 µ? X 5 µ? dw/ Farnesilo 25 µ? X X 25 µ? dw/ X Farnesilo 100 µ? X X 100 µ? dw/ Farnesilo Ensayo de proliferación celular de la combinación de 4-Hidroxi-Benzoato con Benzoquinona : Este conjunto de experimentos usó un ensayo de proliferación celular para evaluar el efecto de combinar las diferentes moléculas básicas en la proliferación celular.
El primer estudio examinó el efecto de combinar 4-Hidroxi-Benzoato con Benzoquinona. Las células se incubaron durante 48 horas, luego de lo cual se realizó un conteo de células para las células vivas. Se Comparó cada grupo de prueba con el control y cada grupo de combinación se comparó con Benzoquinona de control. Los compuestos se analizaron estadísticamente para la adición de Benzoquinona. La siguiente tabla resume los resultados del conteo de células donde la marca X indica una disminución estadística en la cantidad de células.
Tabla 56 4-Hidroxi Comparado con Comparado con omparado con control 4-hidroxi con benzoquinona compuesto sin de control benzoquinona 500 nm X 500 nm con X X Benzo (35µ?) 500 nm con X X Benzo (70µ?) 1 µp? X 1 µ?? con Benzo X X (35µ?) 1 µp? con Benzo X X (70µ ) 50 µp? X 50 µp? con X Benzo (35µ?) 50 µp? con X X Benzo (70µ?) Hay una disminución significativa en la cantidad de células para las células incubadas con 4-Hidroxibenzoico y benzoquinona y en combinación. Para la combinación de 50 µ? de 4-Hidroxibenzoato en combinación con 70 µ? de Benzoquinona hay una reducción significativa en la cantidad de células en comparación con la Benzoquinona de control. Esto sugiere un efecto sinergistico para esta proporción molar.
Se realizaron estudios adicionales probando proporciones molares adicionales. Para la primera prueba se probó 4-Hidroxibenzoico en concentraciones de 500 nM, 1 µ? y 50 µ?. Estas concentraciones se probaron en combinación con 2 , 3-Dimetoxi-5-metil-p-benzoquinona (Benzo). La concentración de Benzo probada fue 25 µ?, 50 µ? y 100 µ?. Las células de melanoma se cultivaron hasta 80% de confluencia y se sembraron en placas de 6 pocilios a una concentración de 40 células por pocilio. Las células se trataron con CoQlO, 4-Hidroxibenzoato, Benzo y una combinación de 4-Hidroxibenzoato/Benzo.
Se realizó una prueba T con p<0.05 como estadísticamente significativa. Una X significa una disminución estadística en la cantidad de células.
Tabla 57 Control en comparación con Benzo 25 µ? Control en comparación con Benzo (B) 50 µ? Control en comparación a con Benzo (B) 100 uM Control eñ comparación con 4-Hidroxibenzoato (HB) 500 nm Control en comparación X con HB 1 µ? Control en comparación X con HB 50 µ? 500 nM HB en X comparación con 500 nM HB con 25 B 500 nM HB en X comparación con 500 nM HB con 50 B 500 nM HB en X comparación con 500 nM HB con 100 B 1 uM HB en comparación X con 1 µ? HB con 25 B 1 uM HB en comparación X con 1 µ? HB con 50 B 1 uM HB en comparación con 1 µ? HB con 100 B 50 uM HB en comparación con 50 µ? HB con 25 B 50 uM HB en comparación y con 50 µ? HB con 50 B 50 uM HB en comparación con 50 µ? HB con 100 B 500 nM HB con 25 B en y comparación con 25 B 500 nM HB con 50 B en y comparación con 50 B 500 nM HB con 100 B en y comparación con 100 B 1 µ? HB con 25 B en y, comparación con 25 B 1 µ? HB con 50 B en y comparación con 50 B 1 µ? HB con 100 B en comparación con 100 B 50 µ? HB con 25 B en y comparación con 25 B 50 µ? HB con 50 B en y comparación con 50 B 50 µ? HB con 100 B en comparación con 100 B Hay una disminución significativa en la proliferación celular para el medio de tratamiento que contiene HB. Además, la combinación de HB con benzoquinona mostró una reducción significativa en la cantidad de células en comparación con las células incubadas con las concentraciones de benzoquinona correspondientes .
También se realizó un ensayo de proliferación celular en células de fibroblastos neonatales. Las concentraciones de HB probadas fueron 500 nM, 5 µ? y 25 µ?. También se probó HB en combinación con benzoquinona en concentraciones de 25 µ?, 50 µ? y 100 µ?. Las células de melanoma se sembraron en células 40k por pocilio y se trataron durante 24 horas. Las células se tripsinizaron y cuantificaron usando un contador coulter .
El análisis estadístico no mostró una reducción significativa en las células de fibroblastos. Esto indica toxicidad mínima a no toxicidad en células normales.
Ensayo de proliferación celular de la combinación de fenilacetato y Benzoquinona: Fenilacetato es un precursor para la síntesis de ácido 4-Hidroxibenzoico (facilita la unión de la estructura del anillo) . Se realizó un ensayo de proliferación celular para ensayar el efecto de incubar fenilacetato en combinación con CoQlO y Benzoquinona.
Tabla 58 Control y 25/25 µ? Ben X Control y 25/50 µ Ben X Control y 25/100 µ? Ben x Control y 25/25 µ? Q-10 x Control y 25/25 µ Q-10 X Control y 25/50 µ? Q-10 X Control y 25/100 µ? Q- x 10 Control y Ben 25 x Control y Ben 50 X Control y Ben 100 X Control y Q-10 25 Control y Q-10 50 Control y Q-10 100 X Ben 25 µ? y 500 nM/25 X µ? Ben Ben 25 µ? y 5 nM/25 µ? X Ben Ben 25 µ? y 25 nM/25 µ? X Ben Ben 50 µ? y 500 nM/50 X µ? Ben Ben 50 µ? y 5 nM/50 µ? X Ben Ben 50 µ? y 25 nM/50 µ? X Ben Ben 100 µ? y 500 nM/100 µ? Ben Ben 100 µ? y 5 nM/100 µ? Ben Ben 100 µ? y 25 nM/100 µ? Ben Q-10 25 µ? y 500 nM/25 µ? Q-10 Q-10 25 µ? y 5 nM/25 µ? y Q-10 Q-10 25 µ? y 25 nM/25 y µ? Q-10 Q-10 50 µ? y 500 nM/50 µ? Q-10 Q-10 50 µ? y 5 nM/50 µ? y Q-10 Q-10 50 µ? y 25 nM/50 y µ? Q-10 Q-10 100 µ? y 500 y nM/100 µ? Q-10 Q-10 100 µ? y 5 nM/100 y µ? Q-10 Q-10 100 µ? y 25 nM/100 y µ? Q-10 Los datos indican que la adición de fenilacetato en combinación con benzoquinona disminuye significativamente la proliferación celular. La combinación con CoQlO y fenilacetato disminuye significativamente la cantidad de células en comparación con la incubación con CoQlO y benzoquinona sola.
Ensayo de proliferación celular de la combinación de 4-Hidróxi-Benzoato con Farnesilo: Se incubó 4-Hidroxi-Benzoato en combinación con Farnesilo. A continuación se enumera el resumen de los resultados. Los grupos de 4-Hidroxibenzoato se compararon con el control y grupos de Farnesilo de control. La X significa una disminución estadística en la cantidad de células .
Tabla 59 4-Hidroxi- Comparado con Comparado con omparado con Benzoato control 4-hidroxi con farnesilo de compuesto sin control farnesilo 500 nm X 500 nm con X Farnesilo (35µ?) 500 nm con X Farnesilo (70µ ) 1 µ?? Error 1 µp? con Error Farnesilo (35µ?) 1 µp? con Error Farnesilo (70µ?) 50 µp? X 50 µp? con X Farnesilo (35µ ) 50 pm con X Farnesilo (70µ?) Ensayo de proliferación celular de la combinación de L-Fenilalanina con Benzoquinona : Se realizó un ensayo de proliferación celular para probar la combinación de L-Fenilalanina combinada con Benzoquinona. A continuación obra un resumen de los resultados de L-Fenilalanina en comparación con el control y Benzoquinona de control. La X significa una disminución estadística.
Tabla 60 L-fenilanalina Comparado con Comparado con Comparado control L-fenilanalina con con compuesto benzoquinona sin de control benzoquinona 5 µ? 5 µp? con Benzo X (50µ?) 5 µ?? con Benzo X (???µ?) 25 µp? 25 µp? con X Benzo (50µ?) 25 µp? con X Benzo (???µ?) 100 µp? 100 µp? con X X X Benzo (50 µ?) 100 µp? con X X X Benzo (100 µ?) Se observa una incidencia sinergistica similar para la L-Fenilalanina en combinación con Benzoquinona.
Ensayo de proliferación celular de la combinación de L-Fenilalanina con Farnesilo: Resultados preliminares para el estudio de proliferación celular de combinación de L-Fenilanalina incubada en combinación con Farnesilo. La L-Fenilalanina se comparó con el control y grupo de Farnesilo de control. Una X significa una disminución estadística en la cantidad de células.
Tabla 61 L-fenilanalina Comparado con Comparado con omparado con control L-fenilanalina farnesilo de con compuesto control sin Farnesilo 5 µ? 5 µp? con Farnesilo (50µ?) 5 µp? con Farnesilo (???µ?) 25 µp? X 25 µp? con X X Farnesilo (50µ?) 25 µp? con X X Farnesilo (???µ?) 100 µp? X 100 µp? con X Farnesilo (50 µ ) 100 µp? con X Farnesilo (100 µ?) Ensayo de proliferación celular de la combinación de L- Tirosina con Benzoquinona : Se incubó L-Tirosina en combinación con Benzoquinona luego de lo cual se realizó un conteo de células. Los grupos se compararon con los grupos de control y grupo de Benzoquinona de control.
Tabla 62 L-Tirosina Comparado con Comparado con Comparado control L-Tirosina con con compuesto sin benzoquinona benzoquinona de control 500 nm 500 nm con Benzo (50µ?) 500 nm con Benzo (100 µ?) 5 µ?? X 5 µ?? con Benzo X (50 µ?) 5 µp? con Benzo X (100 µ?) 15 µ?a X 15 µp? con X Benzo (50 µ?) 15 µp? con X Benzo (100 µ?) La adición de Benzoquinona no amplió el efecto de L-Tirosina en la cantidad de células.
Ensayo de proliferación celular de la combinación de L- Tirosina con Benzoquinona: Este estudio examinó la combinación de L-Tirosina con Farnesilo. Los grupos se compararon con el control y grupos de Farnesilo de control.
Tabla 63 L-Tirosina Comparado con Comparado con Comparado con control L-Tirosina con farnesilo de compuesto sin control Farnesilo 500 nm 500 nm con Farne.silo (50µ?) 500 nm con Farnesilo (50µ?) 5 µp? X 5 µp? con X Farnesilo (50 µ?) 5 µp? con X Farnesilo (100 µ?) 15 µ?? X 15 µp? con X Farnesilo (50 µ?) 15 µp? con X Farnesilo (100 µ?) La combinación de L-Tirosina y Farnesilo no parece tener un efecto sinergistico en la reducción de la cantidad de células en este experimentó.
La síntesis de la CoQlO se divide en dos partes principales, que consisten en la síntesis de la estructura del anillo y la síntesis de la estructura de la cadena lateral. Aquí, se complementan las células oncogénicas con compuestos que son precursores para la síntesis de la cadena lateral y los componentes de la estructura del anillo. Nuestros resultados enfocaron el estudio a 3 componentes principales implicados en la síntesis de la estructura del anillo y dos compuestos que inciden en la unión de la estructura del anillo a la estructura de la cadena lateral. Los tres compuestos que mostraron una reducción significativa en Bcl-2 y un aumento en la expresión de Caspasa-3 son: 1) L-Fenilalanina, 2) L-Tirosina y 3) 4-Hidroxifenilpiruvato . Los dos compuestos implicados en la unión de la cadena lateral a la estructura del anillo son: 1) 4-Hidroxibenzoato y 2) Fenilacetato .
Nuestros resultados mostraron que la administración exógena de estos compuestos en combinación con 2,3 Dimetoxi-5-metil-p-benzoquinona (benzoquinona) inhibe significativamente la proliferación celular. Esto indica que un complemento de la estructura del anillo con compuestos para la unión de la cadena lateral al anillo de benzoquinona puede complementar un mecanismo de síntesis de CoQlO deteriorado. Esto puede ayudar también en la estabilización de la molécula para mantener las propiedades funcionales requeridas por los procesos celulares. Fenilacetato es un precursor para la síntesis de 4-Hidroxibenzoato, cuya administración exógena en combinación con benzoquinona tiene un efecto similar en las células oncogénicas.
Ejemplo 24: Modulación de expresión génica mediante la Coenzima Q10 en modelo celular para diabetes La coenzima Q10 es una molécula endógena con una incidencia establecida en el mantenimiento de la función mitocondrial normal influenciando directamente la fosforilación oxidativa. Se presentan pruebas experimentales que demuestran la capacidad de la coenzima Q10 en la modulación de dianas intracelulares que sirven como indicios clave de trastornos metabólicos, tales como diabetes, de una manera representativa de criterios de valoración terapéuticos .
Para entender cómo la Coenzima Q10 regula la expresión de genes asociados a la causa o tratamiento de la diabetes, se usó una línea celular inmortalizada de túbulo proximal renal primario derivada de riñon humano (HK-2) y cultivos primarios de las células del músculo liso aórtico humano (HA SC) como modelos experimentales. Las células HK-2 y HASMC se mantienen normalmente en el cultivo de 5.5 mM de glucosa, que es una concentración que corresponde a un intervalo considerado normal en la sangre humana. Sin embargo, para simular un ambiente diabético, ambas líneas celulares se mantuvieron posteriormente a 22 mM de glucosa, que corresponde al intervalo observado en la sangre humana asociado a hiperglucemia crónica. Posteriormente, las células se dejaron propagar por 3 pasajes de modo que los procesos de regulación intracelular se adapten funcionalmente para imitar un estado diabético. La opción de línea celular se basó en la influencia fisiológica de diabetes en disfunción renal y progresión a la enfermedad renal en etapa terminal (ESRD) en adición a la patofisiología progresiva de una función cardiovascular comprometida.
Efecto de coenzima Q10 en la expresión génica en células HK-2 usando la matriz de diabetes en PCR La matriz de diabetes en PCR (SABiosciences) ofrece un análisis de 84 genes simultáneamente. Los 4 tratamientos probados en este estudio fueron: HK-2; HK-2 H mantenida a 22 mM de gluco HK2 (H) + 50 µ? de Coenzima Q10 y HK2 (H) + 100 µ? de Coenzima Q10.
Un análisis estricto de los datos de PCR en tiempo real de las muestras de HK-2 en las matrices de diabetes (SABiosciences., Frederick MD, N° de cat. C-03) se realizó para excluir todos los resultados donde la regulación génica no era al menos una regulación doble en comparación con células no tratadas normales HK-2 con un valor p menor a 0.05. Los genes que se observó estaban regulados por hiperglucemia crónica o por la Coenzima Q10 se enumeran en la Tabla 64 y sus funciones y ubicaciones subcelulares (derivadas del análisis de senda de habilidad) se enumeran en la Tabla 65.
Tabla 64 Regulaci valor Regulación valor Regulación de valor Genes órt de P de HK-2 (H) - P HK-2 (H) -100 P HK-2 (H) 50 µ? µ? Coenzima en veces Coenzima Q10 Q10 en en veces veces CEAGAMI 1.26 0.409 3.47 0.067 5.36 0.032 PIK3C2B 1.48 0.131 2.32 0.115 3.31 0.003 INSR -1.09 0.568 2.51 0.103 2.88 0.024 TNF 2.00 0.005 2.57 0.042 2.81 0.020 ENPP1 -1.50 0.002 1.42 0.238 2.67 0.038 PRKCB -1.75 0.005 1.82 0.280 2.49 0.042 DUSP4 1.27 0.318 1.24 0.455 2.26 0.060 SELL -1.58 0.219 1.77 0.042 2.06 0.021 SNAP25 -1.00 0.934 1.46 0.377 1.97 0.059 Tabla 65 Símbolo Nombre del gen Entrez Ubicación Tipo (s) CEACAM1 Molécula 1 de adhesión a Membrana receptor células relacionadas con plasmática de el antígeno transmembra carcinoembriónico na (glucoproteína biliar) PIK3C2B fosfoinositida-3-cinasa, Citoplasma cinasa clase 2, polipéptido beta INSR Receptor de insulina Membrana cinasa plasmática TNF Factor de necrosis Espacio citosina tumoral (superfamilia del extracelula TNF, miembro 2) r ENPP1 ectonucleótido Membrana enzima pirofosfatasa/fosfodiester plasmática asa 1 PRKCB Cinasa de proteína C, Citoplasma cinasa beta DUSP4 fosfatase 4 de Núcleo fosfatasa especificidad dual SELL selectina L Membrana otro plasmática SNAP25 proteína sinaptosomal Membrana asociada, 25kDa plasmática transportad or Entre las transcripciones de ARN detectadas con niveles modulados, la Molécula 1 de adhesión a células relacionadas con el antígeno carcinoembriónico (CEACAM1) se identificaron como altamente reguladas por aumento en células HK2 (H) , en particular con un tratamiento con 100 µ? de coenzima Q10. CEACAM-1, también conocida como CD66a y BGP-I, es una glucoproteína transmembrana tipo I 115-200 KD que pertenece a la subfamilia CEA unida a la membrana de la superfamilia CEA. En la superfamilia de células, forma homo- y heterodímeros no covalentes. La región extracelular contiene tres dominios similares a Ig tipo C2 y un dominio similar a V tipo N-terminal. Existen múltiples variantes de empalme que implican regiones C-terminal con el segundo dominio tipo C2 (aa 320 y más) . Se ha sugerido que la falta de expresión de CEACAM1 intacta en ratones promueve el síndrome metabólico asociado a la diabetes, mientras que un aumento en la expresión de CEACAM1 está asociada a la internalización de insulina aumentada que sugiere un aumento en la sensibilidad a la insulina y el uso de glucosa (por ej . , movimiento de glucosa desde la sangre a las células) , mitigando de este modo la resistencia a la insulina, una característica distintiva de diabetes mellitus tipo 2.
Tal como se muestra en la Tabla 55, también se alteró la expresión del receptor de insulina (INSR) en células HK-2 diabéticas tratadas con coenzima Q10. Sin limitarse por la teoría, el aumento en la expresión de INSR con el tratamiento de coenzima QlO debería potenciar la sensibilidad a la insulina (sola o en adición a la expresión de CEACAM1) con el potencial de invertir una gran complicación metabólica/fisiológica asociada a diabetes.
Efecto de coenzima QlO en la expresión génica. en células HK-2 usando matrices mitocondriales La expresión diferencial de genes mitocondriales en diabetes se ensayó usando las matrices mitocondriales (Cat# PAHS 087E, SABisociences Frederick MD) . Los genes que se regularon por hiperglucemia crónica y/o tratamiento de coenzima QlO se enumeran en la Tabla 66 mientras que sus funciones y ubicaciones se incluyen en la Tabla 67.
Tabla 66 HK2 (H) HK-2 (H) 50 µ? HK-2 (H) 100 valor Genes no valor p Coenzima valor p µ? Coenzima P tratado QlO Q10 GRPEL1 -1.5837 0.15125 -2.6512 0.04704 -1.933 0.1391 5 61 SLC25A3 -8.6338 0.07195 -8.2059 0.0425 -1.6984 0.9951 1 94 ?0??4? -2.3134 0.14003 -1.1567 0.11540 -1.9509 0.0387 3 7 62 TSPO -3.6385 0.11105 -6.7583 0.07376 -2.1104 0.1670 6 9 84 Tabla 67 Símbolo Nombre del gen Entrez Ubicación ipo (s) 1 tipo GrpE, GRPEL1 Mitocondria tro mitocondrial (E. coli) familia portadora de soluto 25 (portador membrana SLC25A3 ransportador mitocondrial; portador mitocondrial de fosfato) , miembro 3 translocasa de homólogo membrana de membrana TO M40 externa de anal iónico mitocondrial externa 40 mitocondria (levadura) membrana eceptor de proteína translocadora TSPO externa de transmembran (18kDa) mitocondria a Hasta la fecha, la incidencia de los cuatros genes mitocondriales identificados (Tabla 3) en las células HK-2 diabéticas tratadas con coenzima Q10 en diabetes no se caracteriza .
Estudio 2: Efecto de coenzima Q10 en la expresión génica en células HASMC usando, la matriz de, diabetes en PCR La matriz de diabetes en PCR (SABiosciences) ofrece un análisis de 84 genes simultáneamente. Los 4 tratamientos probados en este estudio fueron: HASMC; HASMC H mantenidas a 22 mM de gluco HASMC (H) + 50 µ? de Coenzima Q10 y HASMC (H) + 100 µ? de Coenzima Q10.
Un análisis estricto de los datos de PCR en tiempo real de las muestras de HASMC en las matrices de diabetes (SABiosciences., Frederick MD, N° de cat. C-03) se realizó para excluir todos los resultados donde la regulación genética no era al menos una regulación doble en comparación con células no tratadas normales HASMC con un valor p menor a 0.05. Los genes que se observó estaban regulados por hiperglucemia crónica o por la Coenzima Q10 se enumeran en la Tabla 68.
Tabla 68 HASMC HASMC (H) (H) -50 -100 µ? HASMC- valor valor Genes µ? de alor p de (H) P P Coenzim Coenzima a Q10. Q10.
AGT 1.3051 0.5475 -1.0169 .78162 2.3027 0.0301 07 2 95 0.0137 .02248 0.0226 CCL5 17.417 -5.3796 -4.6913 98 9 96 9 0.0129 .01443 0.0129 CEACAM1 -5.3424 -5.8025 5.5629 85 6 48 0.0492 .01268 0.0007 IL6 2.7085 3.8172 6.0349 63 5 75 0.2077 .08120 0.0163 INSR 1.4649 1.9622 2.0801 88 4 16 0.0729 .19119 0.0276 NFKB1 1.482 1.3779 2.0898 24 1 94 0.2182 .25489 0.0694 PIK3C2B 2.0479 1.4331 2.6329 76 4 22 0.0875 .39390 0.0001 SELL 1.2476 4.0371 1.9308 13 4 77 0.1083 .04352 0.1337 TNF -1.814 -3.2434 -1.8489 22 6 57 En las células HASMC, el tratamiento de células hiperglucémicas con coenzima QlO dio como resultado la expresión alterada de genes implicados en la regulación de la función vascular (AGT) , sensibilidad a la insulina (CEACAM1, INSR, SELL) y función inmune/de inflamación (IL-ß, TNF, CCL5) . Sin limitarse a la teoría, se puede asociar un aumento en la expresión de INSR con sensibilidad a la insulina aumentada en células HASMC, que es una propiedad fisiológica que sería beneficiosa en el tratamiento de diabetes, donde se ha sugerido que la IL-6, además de sus propiedades inmunoregulatorias, afecta la homeostasis y el metabolismo de la glucosa, tanto directa como directamente, mediante acción sobre las células del músculo esquelético, adipocitos, hepatocitos, células ß pancreáticas y células neuroendócrinas . Tras la activación, las células T normales expresan y secretan RANTES y ligando (CCL5) de quimiocina (C-Cmotif) . CCL5 se expresa mediante adipocitos y los niveles séricos de RANTES se aumentan en la obesidad y diabetes tipo 2. Sin embargo, tal como se muestra en la Tabla 68, el tratamiento de células HASMC con la coenzima Q10 provoca una disminución significativa en la expresión de CCL5. Con base en los datos anteriores, se espera que la administración de la coenzima Q10 tenga un beneficio terapéutico en la administración de diabetes.
Efecto de coenzima Q10 en la expresión génica en células HASMC usando matrices mitocondriales La expresión diferencial de genes mitocondriales en diabetes se ensayó usando las matrices mitocondriales (Cat# PAHS 087E, SABisociences Frederick MD) . Los genes que se regularon mediante hiperglucemia crónica y/o tratamiento con coenzima Q10 se muestran en la Tabla 69.
Tabla 69 HASMC HASMC (H) -50 (H) -100 HASMC- Genes alor p uM de valor p µ? de valor p (H) Coenzima Coenzima Q10. Q10.
BCL2L1 -1.6558 .244494 -2.7863 0.008744 -2.3001 0.014537 MFN1 -1. 992 .317009 -1.2585 0.021185 -2.2632 0.005961 PMAIP1 -4.7816 .206848 -6.8132 0.000158 -4.352 0.000286 SLC25A1 -2.2051 .020868 -1.834 0.00581 -3.0001 0.03285 SLC25A13 -2.0527 .035987 -1.5 0.029019 -1.5245 0.043712 SLC25A19 -1.0699 .417217 -1.4257 0.104814 -2.1214 0.007737 SLC25A22 -2.1747 .007344 -1.9839 0.0013 -10.3747 0.003437 TIMM 4 -1.3605 .414909 -2.3214 0.004118 -1.9931 0.010206 TOMM40 -1.1982 .428061 -2.0922 0.002195 -2.2684 0.003272 TSPO -1.402 .304875 -2.0586 0.061365 -2.3647 0.044656 El tratamiento de células HASMC hiperglucémicas con coenzima Q10 dio como resultado la expresión alterada de genes que regulan la muerte celular programada o apoptosis (BCL2L1, PMIAP1 conocido también como NOXA) , proteínas transportadoras (SLC25A1 [transportador de citrato] , SLC25A13 [intercambiador de aspartato-glutamato] , SLC25A19 [transportador de pirofosfato de tiamina] y SLC25A22 [cotransportador de glutamato-hidrógeno] ) y proteínas de transporte de matriz mitocondrial (MFN1, TIMM44 y TOMM40) . Las actividades de estos transportadores desempeñan un papel importante en la regulación de precursores esenciales para el ciclo de Kreb y en el mantenimiento de la fosforilación oxidativa mitocondrial. Estos resultados indican que la exposición de células HASMC diabéticas a la Coenzima Q10 está asociada a cambios en la expresión de genes citoplásmicos y mitocondriales que a su vez son coherentes con la Coenzima Q10 proporcionando un beneficio terapéutico en el tratamiento de diabetes.
Una comparación de los datos obtenidos mediante tratamiento de células HASMC y células HK-2 con la coenzima Q10 o en un ambiente hiperglucémico revela que 4 genes se regularon comúnmente mediante coenzima Q10 en ambas lineas celulares (por ej . , PIK3C2B y SELL en el ensayo de expresión génica y TOMM40 y TSPO en el ensayo de matriz mitocondrial ) . Estos resultados demuestran que el tratamiento de células con la coenzima Q10 en un ambiente diabético está asociado a la expresión alterada de genes que se conocen por estar implicados en la causa o el tratamiento de diabetes.
Equivalentes : Los expertos en la técnica reconocerán o podrán determinar usando solamente la experimentación de rutina, muchos equivalentes de las modalidades y los métodos específicos descritos en la presente. Se pretende que dichos equivalentes estén comprendidos en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (55)

REIVINDICACIONES Se reivindica lo siguiente:
1. Un método para evaluar si un sujeto se encuentra afectado por un trastorno metabólico; el método comprende lo siguiente: (1) determinar el nivel de expresión de un marcador presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69; y (2) comparar el nivel de expresión del marcador presente en la muestra biológica obtenida del sujeto con el nivel de expresión del marcador presente en una muestra de control, donde una modulación en el nivel de expresión del marcador en la muestra biológica obtenida del sujeto con relación al nivel de expresión del marcador en la muestra de control es un indicador de que el sujeto se encuentra afectado por un trastorno metabólico, evaluando asi si el sujeto se encuentra afectado con un trastorno metabólico.
2. Un método para evaluar si un sujeto se encuentra afectado por un trastorno metabólico; el método comprende lo siguiente: (1) determinar el nivel de expresión de un marcador presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la expresión del marcador se modula en una célula enferma del trastorno metabólico que se induce para someterse a un cambio de energía metabólica celular hacia la fosforilación oxidativa mitocondrial normal; y (2) comparar el nivel de expresión del marcador presente en la muestra biológica obtenida del sujeto con el nivel de expresión del marcador presente en una muestra de control, donde una modulación en el nivel de expresión del marcador en la muestra biológica obtenida del sujeto con relación al nivel de expresión del marcador en la muestra de control es un indicador de que el sujeto se encuentra afectado por un trastorno metabólico, evaluando así si el sujeto se encuentra afectado por un trastorno metabólico.
3. Un método para pronosticar si un sujeto está predispuesto a desarrollar un trastorno metabólico; el método comprende lo siguiente: (1) determinar el nivel de expresión de un marcador presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69; y (2) comparar el nivel de expresión del marcador presente en la muestra biológica obtenida del sujeto con el nivel de expresión del marcador presente en una muestra de control, donde una modulación én el nivel de expresión del marcador en la muestra biológica obtenida del sujeto con relación al nivel de expresión del marcador en la muestra de control es un indicador de que el sujeto está predispuesto a desarrollar un trastorno metabólico, pronosticando asi si el sujeto está predispuesto a desarrollar un trastorno metabólico.
4. Un método para pronosticar si un sujeto está predispuesto a desarrollar un trastorno metabólico; el método comprende lo siguiente: (1) determinar el nivel de expresión de un marcador presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la expresión del marcador se modula en una célula enferma del trastorno metabólico que se induce para someterse a un cambio de energía metabólica celular hacia la fosforilación oxidativa mitocondrial normal; y (2) comparar el nivel de expresión del marcador presente en la muestra biológica obtenida del sujeto con el nivel de expresión del marcador presente en una muestra de control, donde una modulación en el nivel de expresión del marcador en la muestra biológica obtenida del sujeto con relación al nivel de expresión del marcador en la muestra de control es un indicador de que el sujeto está predispuesto a desarrollar un trastorno metabólico, pronosticando así si el sujetó está predispuesto a desarrollar un trastorno metabólico.
5. Un método para evaluar la eficacia c una terapia para tratar un trastorno metabólico un suj eto; el método comprende lo siguiente: comparar (1) el nivel de expresión de un marcador presente en una primera muestra obtenida del sujeto antes de administrar al sujeto al menos una porción del régimen de tratamiento, donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69; con (2) el nivel de expresión del marcador presente en una segunda muestra obtenida del sujeto luego de la administración de al menos una porción del régimen de tratamiento, donde una modulación en el nivel de expresión del marcador en la segunda muestra en comparación con la primera muestra es un indicador de que la terapia es eficaz para tratar el trastorno metabólico en el sujeto.
6. Un método para evaluar la eficacia de una terapia para tratar un trastorno metabólico en un sujeto; el método comprende lo siguiente: comparar (1) el nivel de expresión de un marcador presente en una primera muestra obtenida del sujeto para administrar al sujeto al menos una porción del régimen de tratamiento, donde la expresión del marcador se modula en una célula enferma del trastorno metabólico que se induce para someterse a un cambio de energía metabólica celular hacia la fosforilación oxidativa mitocondrial normal; con (2) el nivel de expresión del marcador presenté en una segunda muestra obtenida del sujeto luego de la administración de al menos una porción del régimen de tratamiento, donde una modulación en el nivel de expresión del marcador en la segunda muestra en comparación con la primera muestra es un indicador de que la terapia es eficaz para tratar el trastorno metabólico en el sujeto.
7. Un método para evaluar la eficacia de un compuesto influenciador ambiental para tratar un trastorno metabólico en un sujeto que lo necesita; el método comprende lo siguiente: (1) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la muestra biológica está expuesta al compuesto influenciador ambiental y donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69 con un cambio múltiplo positivo y/o con un cambio múltiplo negativo; (2) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en una segunda muestra biológica obtenida del sujeto, donde la muestra no está expuesta al compuestó influenciador ambiental; y (3) comparar el nivel de expresión de uno o más marcadores en la muestra biológica expuesta al compuesto influenciador ambiental y el nivel de expresión de uno o más marcadores en la muestra biológica no expuesta al compuesto influenciador ambiental, (4) donde una reducción en el nivel de expresión de uno o más marcadores con un cambio múltiplo negativo presente en la muestra biológica expuesta al compuesto influenciador ambiental con relación al nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en una segunda muestra es un indicador de que el compuesto influenciador ambiental es eficaz para tratar el trastorno metabólico en el sujeto que lo necesita, y, donde un aumento en el nivel de expresión de uno o más marcadores con un cambio múltiplo positivo presente en la muestra biológica expuesta al compuesto influenciador ambiental con relación al nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en una segunda muestra es un indicador de que el compuesto influenciador ambiental es eficaz para tratar el trastorno metabólico en el sujeto que lo necesita, evaluando asi la eficacia del compuesto influenciador ambiental para tratar el trastorno metabólico .
8. Un método para evaluar la eficacia de un compuesto influenciador ambiental para tratar un trastorno metabólico en un sujeto que lo necesita; el método comprende lo siguiente: (1) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la muestra biológica está expuesta a un compuesto influenciador ambiental, y donde la expresión del marcador se regula por aumento o por disminución en una célula enferma del trastorno metabólico que se induce para someterse a un cambio de energía metabólica celular hacia la fosforilación oxidativa mitocondrial normal; (2) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en una segunda muestra biológica obtenida del sujeto, donde la muestra no está expuesta al compuesto influenciador ambiental; y (3) comparar el nivel de expresión de uno o más marcadores en la muestra biológica expuesta al compuesto influenciador ambiental y el nivel de expresión de uno o más marcadores en la muestra biológica no expuesta al compuesto influenciador ambiental, (4) donde una reducción en la muestra biológica expuesta al compuesto influenciador ambiental, en el nivel de expresión de uno o más marcadores regulados por disminución con relación al nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en la segunda muestra es un indicador de que el compuesto influenciador ambiental es eficaz para tratar el trastorno metabólico en el sujeto que lo necesita, y, donde un aumento en la muestra biológica expuesta al compuesto influenciador ambiental en el nivel de expresión de uno o más marcadores regulados por aumento con relación al nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en la segunda muestra es un indicador de que el compuesto influenciador ambiental es eficaz para tratar el trastorno metabólico en el sujeto que lo necesita, evaluando así la eficacia del compuesto influenciador ambiental para tratar el trastorno metabólico .
9. Un método para identificar un compuesto para tratar un trastorno metabólico en un sujeto; el método comprende lo siguiente: (1) obtener una muestra biológica del sujeto; (2) poner en contacto la muestra biológica con un compuesto de prueba; (3) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en la muestra biológica obtenida del sujeto, donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69 con un cambio múltiplo positivo y/o con un cambio múltiplo negativo; (4) comparar el nivel de expresión de uno o más marcadores en la muestra biológica con una muestra de control que no está en contacto con el compuesto de prueba; y (5) seleccionar un compuesto de prueba que reduzca el nivel de expresión de uno o más marcadores con un cambio múltiplo negativo presente en la muestra biológica y/o aumente el nivel de expresión de uno o más marcadores con un cambio múltiplo positivo presente en la muestra biológica, identificando así un compuesto para tratar un trastorno metabólico en un sujeto.
10. Un método para identificar un compuesto para tratar un trastorno metabólico en un sujeto; el método comprende lo siguiente: (1) obtener una muestra biológica del sujeto; (2) poner en contacto la muestra biológica con un compuesto de prueba; (3) determinar el nivel de expresión de uno o más marcadores presentes en la muestra biológica obtenida del sujeto, donde la expresión del marcador se regula por aumento o por disminución en una célula enferma del trastorno metabólico que se induce para someterse a un cambio de energía metabólica celular hacia la fosforilación oxidativa mitocondrial normal; (4) comparar el nivel de expresión de uno o más marcadores en la muestra biológica con una muestra de control que no está en contacto con el compuesto de prueba; y (5) seleccionar un compuesto de prueba que reduzca el nivel de expresión en la muestra biológica de uno o más marcadores regulados por disminución y/o que aumente el nivel de expresión en la muestra biológica de uno o más marcadores regulados por aumento, identificando así un compuesto para tratar un trastorno metabólico en un sujeto.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el trastorno metabólico es un trastorno que se selecciona del grupo que consiste en diabetes, obesidad, prediabetes, hipertensión, enfermedad cardiovascular, síndrome metabólico y elementos clave para un trastorno metabólico.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el o los marcadores provocan de manera selectiva, en una célula enferma del sujeto, un cambio de energía metabólica celular hacia la fosforilación oxidativa mitocondrial normalizada.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde la muestra comprende un fluido obtenido del sujeto.
14. El método de la reivindicación 13, donde el fluido se selecciona del grupo que consiste en fluidos sanguíneos, vómito, saliva, linfa y orina.
15. El método dé la reivindicación 14, donde la muestra es una muestra sanguínea o un componente de esta.
16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde la muestra comprende un tejido o uñ componente de este obtenido del sujeto.
17. El método de la reivindicación 16, donde el tejido se selecciona del grupo que consiste en hueso, tejido conectivo, cartílago, pulmón, hígado, riñon, tejido muscular, corazón, páncreas y piel.
18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, donde el sujeto es un humano.
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, donde el nivel de expresión del marcador en la muestra biológica se determina mediante el ensayo de un polinucleótido transcrito o una porción de este en la muestra.
20. El método de la reivindicación 19, donde el ensayo del polinucleótido transcrito comprende amplificar el polinucleótido transcrito.
21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, donde el nivel de expresión del marcador en la muestra del sujeto se determina mediante el ensayo de una proteína o una porción de esta en la muestra .
22. El método de cualquiera de la reivindicaciones 1-18, donde el marcador se ensay usando un reactivo que se une específicamente a marcador .
23. El método de la reivindicación 22, donde reactivo está marcado.
24. El método se la reivindicación 22, donde el reactivo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo y un fragmento de anticuerpo de unión al antigeno .
25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-24, donde el nivel de expresión del marcador en la muestra se determina usando una técnica que se selecciona del grupo que consiste en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , reacción de amplificación, análisis por PCR de transcriptasa inversa, análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP) , detección de escisión de malapareamientos, análisis heteroduplex, análisis de transferencia Southern, análisis de transferencia Northern, análisis de transferencia Western, hibridación in situ, análisis de matrices, secuenciación de ácido desoxirribonucleico, análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción y combinaciones o sub-combinaciones de estos, de dicha muestra.
26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-24, donde el nivel de expresión del marcador en la muestra se determina usando una técnica que se selecciona del grupo que consiste en inmunohistoquímica, inmunocitoquimica, citometría flujo, ELISA y espectrometría de masas.
27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde el marcador es un marcador que se selecciona del grupo que consiste en HNF4-alfa, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-Lll (Bim) , XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, cMyc, transaldolasa 1, C0Q1, C0Q3, C0Q6, preniltransferasa, 4-hidrobenzoato, factor citosólico de neutrófilos 2, sintasa de óxido nítrico 2A, superóxido dismutasa 2, VDAC, canal Bax, ANT, Citocromo c, complejo I, complejo II, complejo III, complejo IV, Foxó 3a, DJ-1, IDH-1, CptlC y Cam cinasa II.
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde el marcador es un marcador asociado a la apoptosis.
29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde el marcador es un marcador asociado al estrés oxidativo.
30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde el marcador es un marcador asociado al choque térmico.
31. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde el marcador es un marcador asociado a la angiogénesis .
32. El método de cualquiera de la reivindicaciones 1-26, donde el marcador es un marcado asociado a la diabetes.
33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde el marcador es un marcador asociado a la hipertensión.
34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde él marcador es un marcador asociado a la enfermedad cardiovascular.
35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde se determina el nivel de expresión de una pluralidad de marcadores.
36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5-8, donde el sujeto está siendo tratado con una terapia que se selecciona de un grupo que consiste en un compuesto influenciador ambiental, un compuesto de sulfonilurea, un compuesto de meglitinida, prandina, un compuesto de nateglinida, un compuesto de biguanida, un compuesto de tiazolidindiona, precosa, simlina, Byetta, un inhibidor de DPP-IV e insulina.
37. El método de la reivindicación 5 o 6, donde la terapia comprende un compuesto influenciador ambiental.
38. El método de la reivindicación 36 o 37, donde la terapia comprende adicionalmente un régimen de tratamiento que se selecciona del grupo que consiste en tratamiento con un compuesto de sulfonilurea, tratamiento con un compuesto de meglitinida, tratamiento con prandina, tratamiento con un compuesto de nateglinida, tratamiento con un compuesto de biguanida, tratamiento con un compuesto de tiazolidindiona, tratamiento con precosa, tratamiento con simlina, tratamiento con Byetta, tratamiento con un inhibidor de DPP-IV y tratamiento con insulina.
39. El método de la reivindicación 36 o 37, donde el compuesto influenciador ambiental es una molécula intracelular multidimensional (MIM) o un cambiador epimetabólico (cambiador epi) .
40. El método de la reivindicación 36 o 37, donde compuesto influenciador ambiental es CoQ-10.
41. El método de la reivindicación 36 o 37, donde el compuesto influenciador ambiental es vitamina D3.
42. El método de la reivindicación 36 o 37, donde el compuesto influenciador ambiental es un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en acetilo Co-A, palmitilo, L-carnitina, tirosina, fenilalanina, cisteina y una molécula pequeña.
43. El método de la reivindicación 36 o 37, donde el compuesto influenciador ambiental es un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en fibronectina, TNF-alfa, IL-5, IL-12, IL-23, un factor angiogénico y un factor apoptótico.
44. Un kit para evaluar si un sujeto se encuentra afectado por un trastorno metabólico; el kit comprende reactivos para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador que se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69, e instrucciones para usar el kit para evaluar si el sujeto se encuentra afectado por el trastorno metabólico.
45. Un kit para pronosticar si un sujeto está predispuesto a desarrollar un trastorno metabólico; el kit comprende reactivos para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador que se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69, e instrucciones para usar el kit para pronosticar si el sujeto está predispuesto a desarrollar el trastorno metabólico.
46. Un kit para evaluar la eficacia de una terapia para tratar un trastorno metabólico; el kit comprende reactivos para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador que se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69, e instrucciones para usar el kit para evaluar la eficacia de una terapia para tratar el trastorno metabólico.
4 . Un kit para evaluar la eficacia de un compuesto influenciador ambiental para tratar un trastorno metabólico en un sujeto que tiene un trastorno metabólico; el kit comprende reactivos para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador que se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69, e instrucciones para usar el kit para evaluar la eficacia del compuesto influenciador ambiental para tratar el trastorno metabólico en el sujeto que tiene el trastorno metabólico .
48. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 44-47, que comprende adicionalmente medios para obtener una muestra biológica de un sujeto.
49. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 44-48, que comprende adicionalmente una muestra de control .
50. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 44-49, donde los medios para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador comprenden medios para evaluar un polinucleótido transcrito o una porción de este en la muestra.
51. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 44-49, donde los medios para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador comprenden medios para ensayar una proteina o una porción de esta en la muestra .
52. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 44-51, que comprende adicionalmente un compuesto influenciador ambiental.
53. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 44-52, donde el kit comprende reactivos para determinar el nivel de expresión de una pluralidad de marcadores.
54. Un método para evaluar si un sujeto se encuentra afectado por un estado que responde a la CoQlO; el método comprende lo siguiente: (1) determinar el nivel de expresión de un marcador presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en los marcadores enumerados en las Tablas 2-4 y 6-29 y 64-69; y (2) comparar el nivel de expresión del marcador presente en la muestra biológica obtenida del sujeto con el nivel de expresión del marcador presente en una muestra de control, donde una modulación en el nivel de expresión del marcador en la muestra biológica obtenida del sujeto con relación al nivel de expresión del marcador en la muestra de control es un indicador de que el sujeto se encuentra afectado por un estado que responde a la CoQlO, evaluando asi si el sujeto se encuentra afectado por un estado que responde a la CoQlO.
55. El método de la reivindicación 54, donde el estado que responde a la CoQlO es un trastorno metabólico .
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