CN105039399A - 多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学研究与应用领域，具体涉及人类多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞及其制备技术。本发明提供了一种人类遗传性心肌病-多能干细胞，利用TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑技术，构建人类遗传性心肌病多能干细胞。本发明制得的人类遗传性心肌病变心肌细胞，可以与任意支架材料结合培养形成的各类体外人类遗传性心肌病疾病心肌组织。本发明的人类遗传性心肌病的疾病心肌细胞具备与人类遗传性心肌病患者心肌细胞相似的疾病表型及电生理改变，来源广泛，且能长期体外培养。为寻求有效、新型的治疗手段和筛选有效的相应治疗药物提供了良好的工具和平台。

Description

多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞及其制备方法

技术领域

本发明属生物医学研究与应用领域，具体涉及人类多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞及其制备技术。

背景技术

人类遗传性心肌病包括五种心肌病：肥厚型心肌病(hypertrophiccardiomyopathy，HCM)、扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy,DCM)、限制型心肌病(restrictedcardiomyopathy)、左心室致密化不全型心肌病(leftventricularnoncompaction,LVNC)及致心率失常性右室心肌病(arrhythmogenicrightventricularcardiomyopathy,ARVC)，是由多种单一基因突变造成的重大心脏疾病。这些单一基因包括表达肌小节蛋白、细胞骨架蛋白、离子通道蛋白、核纤层蛋白、线粒体蛋白的基因，如肌球蛋白重链MHC、肌球蛋白轻链MLC、肌钙蛋白TNNT2、肌球蛋白结合蛋白MBPC3、钠离子通道蛋白SCN5a、钾离子通道蛋白KCNH2、核纤层蛋白lamin等(详细描述请见MoritaHandSeidmanCE,JournalofClinicalInvestigation,2005)。这些基因上的不同位点发生突变后，可以导致遗传性心肌病的发生。需要注意的是，同一基因上不同位点发生突变后，可以导致相同类型的遗传性心肌病，也可以导致发生不同类型的遗传性心肌病。例如肌钙蛋白TNNT2基因R92Q与DE160突变均导致肥厚型心肌病，而TNNT2R141W导致扩张型心肌病。

目前对于遗传性心肌病并无有效的、针对疾病本质的、特定治疗手段或治疗药物。现今临床上的治疗措施以预防心源性猝死和改善心功能为主，但仅仅能改善患者的一些临床症状，并不直接针对遗传性心肌病的发病机制而起到明显的治愈效果，也不改变心肌病的自然病史。因此，寻找导致遗传性心肌病的早期的分子通路，进一步搞清发病机制，对于开发有效、新型的治疗药物至关重要。

但是目前对于遗传性心肌病疾病机制的研究进展缓慢。这主要是由于缺乏能大量方便获取的且能忠实重现疾病过程的疾病模型。

从患者的心脏活体获取遗传性心肌病的病变人类心肌细胞非常困难，因为来源非常稀少且在体外不易长期存活，并且这些病变心肌细胞已经处于疾病的晚期，对于疾病发生的早期机制研究并无太多作用。虽然遗传性心肌病的转基因动物模型也已经建立，并且对遗传性心肌病的研究起到了重要作用，但是动物模型由于其心脏的生理功能及分子基础与人类有较大差别(比如小鼠的心率达500次/秒，是人的10倍)，无法完全重现人类疾病表型，并且针对遗传性心肌病动物模型的研究也多集中于疾病晚期，并不能作为疾病早期阶段心肌肌小节导致何种病变的有效研究对象。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有遗传性心肌病疾病模型的限制，利用TALEN或CRISPR/CAS9基因编辑技术介导基因重组，将能导致人类家族性遗传性心肌病的基因突变，导入人类多能干细胞(包括人类胚胎干细胞和诱导多能性干细胞)基因组并替换相对应的正常基因，建立人遗传性心肌病多能干细胞疾病细胞株，进而通过多能干细胞定向分化心肌细胞技术(该技术为已公开的成熟技术，具体实施步骤见Lianetal.,NatureProtocols,2012；8:162-75)，制备可用于研究与应用的人类遗传性心肌病疾病心肌细胞。

本发明提供了一种建立各种人类遗传性心肌病特异的多能干细胞细胞株方法，利用新型的TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑技术，通过基因重组方法编辑人类多能干细胞基因组，构建人类遗传性心肌病多能干细胞。

具体而言，本发明的人类遗传性心肌病-多能干细胞建立方法，其特征在于，利用新型的TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑技术，通过基因重组方法编辑人类多能干细胞基因组，构建人类遗传性心肌病-多能干细胞疾病细胞株；其包括步骤：

A、构建针对不同靶基因(该靶基因突变导致遗传性心肌病，描述见背景技术第一段)的TALEN或CRISPR/CAS9质粒；

B、构建带有步骤A所述导致不同遗传性心肌病的各种相应基因突变的同源基因供体质粒；

C、培养良好的未分化的人类胚胎干细胞或体外重编程正常人类个体的体细胞为诱导多能性干细胞；

D、将步骤A获得的TALEN或CRISPR/CAS9质粒与步骤B获得的带有相应突变的同源基因供体质粒共电转人类多能干细胞，通过基因重组导入将遗传性心肌病的特异突变导入人类胚胎干细胞或诱导多能性干细胞；

E、利用Puromycin药物筛选出杂合或纯合的遗传性心肌病多能干细胞，并建立相应细胞株。

本发明中，所述的细胞株为各种带有导致人类遗传性心肌病基因突变的人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞。

本发明中，人类遗传性心肌病-多能干细胞通过多能干细胞定向分化心肌细胞技术(该技术为已公开的成熟技术，具体实施步骤见Lianetal.,NatureProtocols,2012；8:162-75)得到的相应的人类遗传性心肌病变心肌细胞。

本发明的人类遗传性心肌病-多能干细胞细胞的制备方法中，将筛选出的遗传性心肌病-多能干细胞定向分化为遗传性心肌病-疾病特异的心肌细胞。

本发明的人类遗传性心肌病-多能干细胞细胞的制备方法中，将分化后的人类遗传性心肌病特异的心肌细胞进行纯化，使其比例达到95％以上。

本发明的人类遗传性心肌病-多能干细胞细胞的制备方法中，将分化后的人类遗传性心肌病特异的心肌细胞进行相应疾病表型的验证。

进一步，本发明的人类遗传性心肌病-多能干细胞可用于通过多能干细胞定向分化心肌细胞技术制备得到人类遗传性心肌病变心肌细胞。

以及，所述的人类遗传性心肌病-多能干细胞在用于制备体外人类遗传性心肌病疾病心肌组织，其中，将分化获得的人类遗传性心肌病变心肌细胞与任意支架材料结合，培养形成各类体外人类遗传性心肌病疾病心肌组织。

本发明提供了上述人类遗传性心肌病-多能干细胞的制备方法，即利用TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑技术，通过基因重组方法编辑人类多能干细胞基因组，构建人类遗传性心肌病多能干细胞疾病模型。

本发明采用分子生物学方法构建针对不同基因突变靶位点的TALEN或CRISPR/CAS9质粒及带有相应突变和药物筛选基因的同源基因供体质粒，将二者共电击转染进入人类多能干细胞(包括人类胚胎干细胞humanembryonicstemcells及人类诱导性多功能干细胞(humaninducedpluripotentstemcells))，通过基因重组导入导致遗传性心肌病的特异突变；进而通过嘌呤霉素(Puromycin)等药物筛选出杂合或纯合的遗传性心肌病多能干细胞系，通过已知的多能干细胞定向分化心肌细胞技术，将其定向分化为人类遗传性心肌病疾病特异的心肌细胞；从而进行相关的功能研究，探索导致遗传性心肌病的早期分子通路，进一步搞清发病机制，寻求新型、有效的治疗手段和药物筛选。

更具体的，本发明的人类遗传性心肌病-多能干细胞的制备方法，包括步骤如下：

1)TALEN或CRISPR/CAS9质粒及带有相应突变的同源基因供体质粒的构建，

在TALEN或CRISPR/CAS9骨架质粒的基础上，利用PCR、限制性内切酶、连接酶、点突变等分子生物学方法构建针对不同基因突变靶点的TALEN或CRISPR/CAS9质粒(该质粒带有嘌呤霉素(puromycin)抗性基因，可用于筛选接受了该质粒的阳性细胞克隆)，同时构建带有相应突变的同源基因供体质粒；

2)针对不同靶点TALEN或CRISPR/CAS9质粒的活性检测

用TALEN或CRISPR/CAS9质粒转染293T细胞，提取嘌呤霉素筛选后存活细胞的基因组DNA进行PCR，通过观察DNA测序结果的套峰强弱、T7E1错配酶酶切效率及TA克隆测序比例检测活性；

3)将活性高的TALEN或CRISPR/CAS9质粒与带有相应突变的同源基因供体质粒共电击转染进入人类多能干细胞

人类多能性干细胞培养液，37℃含5％二氧化碳培养箱培养，细胞长满后，Accutase消化，计数合适的细胞量，加入相应比例的TALEN或CRISPR/CAS9与带有相应突变的同源基因供体质粒，选用合适的电压、脉冲强度及脉冲次数进行电转；针对不同多能干细胞细胞系，所选用的电压、脉冲强度及脉冲次数需要经过实验确定最佳数值，电压范围一般在1100毫伏-1400毫伏，脉冲范围一般为0.5-2毫安，脉冲次数一般为1-3次。

4)筛选杂合或纯合的遗传性心肌病多能干细胞系

挑选嘌呤霉素筛选后存活的克隆，提取基因组DNA，利用PCR、TA克隆测序及SouthernBlot等分子生物学方法鉴定杂合或纯合的遗传性心肌病多能干细胞系；

5)体外培养人类正常及遗传性心肌病多能性干细胞、分化心肌细胞

采用专业的诱导多能性干细胞培养液(可于生物试剂市场上购买，如加拿大StemcellTechnology公司)，在37℃含5％二氧化碳培养箱培养内培养人类多能性干细胞，细胞长满后，运用已知方法，联合运用Wnt通路的促进剂(小分子药物CHIR99021)和抑制剂(小分子药物IWR-1)使其向心肌细胞定向分化；

6)心肌细胞纯化：

分化20天后，用已知的纯化心肌细胞的选择性培养基(不含葡萄糖的普通DMEM培养基)培养，得到纯度较高(大于90％)的心肌细胞；

7)心肌细胞表型鉴定及功能、机制研究

利用免疫荧光、膜片钳、多电极微阵列、钙瞬变等方法验证诱导分化的心肌细胞具备与正常成人或遗传性心肌病患者心肌细胞相似的表型及电生理特性，然后采用基因表达芯片结合蛋白质组学和质谱分析，将全基因组表达改变与疾病表型连接起来，研究疾病的发病机制和发现新的治疗靶点。

另一方面，本发明提供了人类遗传性心肌病-多能干细胞的应用，通过多能干细胞定向分化心肌细胞技术得到的人类遗传性心肌病病变心肌细胞。

获得的各类人类遗传性心肌病变心肌细胞可以用于建立针对不同致病基因突变导致的人类遗传性心肌病的体外药物评价及筛选体系。

还可以将分化获得的人类遗传性心肌病变心肌细胞与任意支架材料结合培养形成的各类体外人类遗传性心肌病疾病心肌组织。例如，可以采用去细胞化的动物心脏基质作为支架材料，结合分化获得的人类遗传性心肌病变心肌细胞，制备各类体外人类遗传性心肌病疾病心肌组织。

本发明最终的产品是不同基因突变导致的肥厚型心肌病、扩张型心肌病、限制型心肌病、左心室致密化不全型心肌病及致心率失常性右室心肌病等的人类遗传性心肌病的疾病心肌细胞及由其构建的相应疾病人类心肌组织。

本发明的人类遗传性心肌病的疾病心肌细胞具备与人类遗传性心肌病患者心肌细胞相似的疾病表型及电生理改变，来源广泛，且能长期体外培养。

本发明采用已知的转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(CRISPR/CAS9)基因组编辑技术，编辑人类多能干细胞(包括人类胚胎干细胞humanembryonicstemcells及人类诱导性多功能干细胞(humaninducedpluripotentstemcells))的基因组，将能导致人类家族性遗传性心肌病的基因突变，导入人类多能干细胞基因组并替换相对应的正常基因，建立人类遗传性心肌病多能干细胞疾病模型，再通过已知的多能干细胞定向分化心肌细胞技术，进而制备带有致病性遗传突变的人类遗传性心肌病疾病心肌细胞，用于:

1)体外外模拟人类遗传性心肌病的发生；

2)探寻导致人类遗传性心肌病的早期分子通路及其发病机制；

3)寻求人类遗传性心肌病的新型、有效的治疗靶点；

4)建立针对不同致病基因突变导致的人类遗传性心肌病的体外药物评价及筛选体系；

5)体外重建人类遗传性心肌病的疾病心肌组织。

本发明利用TALEN或CRISPR/CAS9基因重组技术获得的人多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞，具有遗传性心肌病相似的表型及电生理特性。

本发明可以根据不同的基因突变位点设计不同的TALEN或CRISPR/CAS9质粒及带有相应突变的同源基因供体质粒，构建各种类型的人类遗传性心肌病的多能干细胞株，再通过已知的人类多能干细胞定向分化心肌细胞技术，获得大量的不同类别的人类遗传性心肌病病变心肌细胞，来源广泛，且能长期体外培养，为研究疾病机制及药物筛选提供良好的工具。

本发明的人类多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞具有与人类遗传性心肌病患者心肌细胞相似的疾病表型及电生理改变，可进一步与不同支架和基质材料相结合，制造相应不同的人类遗传性心肌病的人类病变心肌组织，为探寻各种基因突变导致的不同遗传性心肌病的早期分子通路，进一步搞清发病机制，寻求有效、新型的治疗手段和筛选有效的相应治疗药物提供了良好的工具和平台。

附图说明

图1，突变同源基因供体质粒构建，其中，

以能够导致肥厚型心肌病与扩张型心肌病的肌钙蛋白TNNT2基因为例，将第160位谷氨酸删除(DeletionofE160,DE160)(已知该突变能够导致遗传性肥厚型心肌病，详细描述可见Watkinsetal.,NewEnglandJournalofMedicine,1995；332:1058-64)，造成突变，药筛基因嘌呤霉素插入左右同源臂中间。

图2，引物设计方案，其中，

DE160位于TNNT2基因的第12位外显子中，围绕DE160突变位点，设计左右共6对的TALEN(L1-3，R1-2)。

图3，TALEN质粒切割TNNT2DE160位点附近DNA效率检测，其中显示了，

DNA剪切一般发生在双染色体当中的一个，由于基因组修复过程中会产生核苷酸的增加或删除，因此PCR测序可发现有序列套峰出现，提示一个染色体中的靶DNA被剪切，T7EI检测可测试错配的DNA情况，T7EI可将错配DNA切割，电泳后出现两条条带。

图4，TALEN基因组编辑后筛选阳性人类遗传性心肌病-多能干细胞突变克隆，

其中，A，多能干细胞阳性突变克隆筛选技术流程；B，PCR检测药筛基因插入阳性的多能干细胞克隆，有阳性条带的证明突变同源基因已插入正确位点；C，OCR产物测序显示一条染色体上的TNNT基因DE160位点已被成功删除。

图5,TNNT2DE160删除突变多能干细胞克隆定向分化为心肌细胞，显示带有DE160删除的心肌细胞具有肥厚型心肌病心肌细胞的表型，

其中，A，免疫荧光显示DE160心肌细胞比正常心肌细胞肥大,肌丝结构排列紊乱；

B，RT-PCR显示肥厚型心肌病相关基因表达升高，与肥厚型心肌病表型相符合；

C，MEA显示与正常心肌细胞相比，DE160心肌细胞收缩节律出现异常；

D，DE160心肌细胞对钙离子通道阻滞剂Verapamil有更高的耐受性，具有肥厚性心肌病相似的电生理特性；

E，视频记录显示随着诱导分化正常心肌细胞收缩频率逐渐加快，DE160杂合心肌细胞收缩频率逐渐减慢，可能是其心肌细胞逐渐失代偿的结果，而DE160纯合心肌细胞丧失收缩功能；原子力显微系统测试心肌细胞收缩力显示DE160心肌细胞收缩力略有提高，符合肥厚型心肌病表型。

具体实施方式

本发明采用已知的转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(CRISPR/CAS9)基因组编辑技术，编辑人类多能干细胞(包括人类胚胎干细胞(humanembryonicstemcells)及人类诱导性多功能干细胞(humaninducedpluripotentstemcells))的基因组，根据不同的基因突变位点设计靶向特异的TALEN或CRISPR/CAS9质粒，通过基因组编辑技术介导基因重组，将能导致人类家族性遗传性心肌病的基因突变，导入人类多能干细胞基因组并替换相对应的正常基因，建立不同基因突变导致的各类人类遗传性心肌病的多能干细胞疾病模型和多能干细胞细胞株。

理论上本发明可以针对任意基因的突变所造成的人类遗传性心肌病制备相对应的多能干细胞模型与细胞株。再通过已知的多能干细胞定向分化心肌细胞技术，进而制备不同人类遗传性心肌病的病变心肌细胞。

本发明是通过下述技术方案和步骤实现的：

A、构建针对不同基因突变靶点的TALEN或CRISPR/CAS9质粒，并检测其对靶基因的剪切活性；

B、构建带有相应突变的同源基因供体质粒；

C、培养良好的未分化的人类胚胎干细胞或正常人类个体的诱导多能性干细胞；

D、将活性高的TALEN或CRISPR/CAS9质粒与带有相应突变的同源基因供体质粒共电击转染进入人类多能干细胞(包括胚胎干细胞及诱导性多功能干细胞)，通过基因重组将导致遗传性心肌病的特异突变导入人类多能干细胞基因组；

E、摸索合适的筛选药物(如嘌呤霉素Puromycin)浓度筛选出杂合或纯合的遗传性心肌病多能干细胞系；

F、将筛选出的人类遗传性心肌病多能干细胞定向分化为人类遗传性心肌病疾病特异的心肌细胞；

G、将分化后的人类遗传性心肌病特异的心肌细胞进行纯化，使其比例达到95％以上，验证表型并进行功能及机制的研究。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、生物化学、细胞生物学等常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《蛋白质纯化》((RichardR.Burgess)，或者可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1

1)TALEN或CRISPR/CAS9质粒及带有相应突变的同源基因供体质粒的构建

在骨架质粒的基础上，构建针对不同突变靶点的TALEN或CRISPR/CAS9质粒及带有相应突变的同源基因供体质粒。例如HCM(DE160、R403Q)，DCM(DK210、E244D)，RCM(R145W、I79N),LVNC(L301Q、R131W),ARVC(Q62K、D1373A)等，TALEN及突变同源基因质粒构建(如图1，图2图例所示)；

2)针对不同靶点TALEN或CRISPR/CAS9质粒的活性检测

用TALEN或CRISPR/CAS9质粒转染293T细胞，提取Puromycin筛选后存活细胞的基因组DNA进行PCR，通过观察套峰强弱、T7E1错配酶酶切效率及TA克隆测序比例检测活性(如图3所示)；

3)将活性高的TALEN或CRISPR/CAS9质粒与Donor质粒共电转人类多能干细胞

人类多能性干细胞培养液，37℃含5％二氧化碳培养箱培养，细胞长满后，Accutase消化，计数合适的细胞量，加入相应比例的TALEN或CRISPR/CAS9与Donor质粒，选用合适的电压、脉冲强度及脉冲次数进行电转；

4)筛选杂合或纯合的遗传性心肌病多能干细胞系

挑选Puromycin筛选后存活的克隆，提取基因组DNA，利用PCR、TA克隆测序及SouthernBlot等分子生物学方法鉴定杂合或纯合的遗传性心肌病多能干细胞系细胞株(如图4所示)；

5)体外培养人类正常及遗传性心肌病多能性干细胞、分化心肌细胞

采用诱导多能性干细胞培养液(购于StemcellTechnolgy公司)，37℃含5％二氧化碳培养箱培养，细胞长满后，联合运用Wnt通路的促进剂和抑制剂使其向心肌细胞定向分化；所述的促进剂为小分子化合物CHIR99021(可于Selleck公司购买)，抑制剂为小分子化合物IWR-1(可于Selleck公司购买)。

6)心肌细胞纯化

分化20天后，用纯化心肌细胞的选择性培养基(不含葡萄糖的普通DMEM培养基，可购自CELLGRO公司)培养，得到纯度较高的心肌细胞；

7)心肌细胞表型鉴定及功能、机制研究

利用免疫荧光、膜片钳、钙瞬变等方法验证诱导分化的心肌细胞具备与正常成人或遗传性心肌病患者心肌细胞相似的表型及电生理特性(如图5所示)；然后采用Microarray结合蛋白质组学和质谱分析，将全基因组表达改变与疾病表型连接起来，研究疾病的发病机制和发现新的治疗靶点。

按本发明上述方法得到的人类多能干细胞-遗传性心肌病心肌心肌细胞具有与人类遗传性心肌病患者心肌细胞相似的疾病表型及电生理改变，既来源广泛又能长期体外培养，解决了人类病变心肌组织来源稀少且不易长期体外培养的弊端，而且可以研究遗传性心肌病的早期发病机制。

实施例2

通过上述方法得到的人多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞，利用多电极微阵列手段可检测其收缩功能和电生理特性；进一步，在该心肌细胞培养环境中加入不同小分子化学药物或中草药制剂等，可通过多电极微阵列系统检测其收缩功能和电生理功能变化，预测所测试小分子化学药物或中草药制剂可能对人体心脏组织的功能影响，筛选新型、有效的治疗药物；例如图5显示了，本发明对携带TNNT2DE160突变的人类胚胎干细胞-肥厚型心肌病心肌细胞加入了儿茶酚胺类小分子药物肾上腺素，观察到肾上腺素对肥厚型心肌病心肌细胞有正性肌力作用，但是造成这些细胞的电活动异常，产生了心律失常。加入肾上腺素受体阻滞剂美托洛尔(metoprolol)后，对肾上腺素致肥厚型心肌病心肌细胞心律失常的作用起到了很好的阻滞效果。

实施例3

药物的心脏毒性是阻碍药物发展的关键因素，基于转基因细胞及动物的药物心脏毒性筛选，往往存在一些假阴性及假阳性的结果，导致不必要的死亡，而且药物的心脏毒性效应更易发生在有基础心脏病变的患者。通过上述方法可以构建一系列人多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞，其含有人类正常心肌细胞表面所有的离子通道，可以反映离子通道间复杂的相互作用，更精确地预测药物的心脏毒性，成为良好的药物毒性筛选的平台。

实施例4

利用上述方法得到的人多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞，结合组织工程学技术，可以进一步体外重建正常人类和遗传性心肌病的人类心室肌组织，从组织层面深入研究遗传性心肌病突变对心室肌发育和功能的影响及遗传性心肌病的基本病理过程。例如，由自然心脏基质和多种人类细胞制备的组织工程心肌组织；该组织工程心肌组织通过临床转化后，可用于1)体外检测各类药物对人类心脏组织的毒性作用；2)治疗或替代心肌梗死后的坏死心肌组织。这种组织工程化人类心肌组织由去细胞化的自然心脏基质作为支架，接种有人多能干细胞-遗传性心肌病多能干细胞分化来源的正常心脏的各种细胞成分制成。构建的组织工程化心肌组织将去细胞化的大鼠或猪的心脏为自然心脏基质作为工程化心肌组织基质，将去细胞化的基质架构后，制得不同尺寸和外形的心脏基质片段，将人多能干细胞-遗传性心肌病多能干细胞定向分化为心血管系统细胞和人的脂肪组织提取的脂肪干细胞与大鼠或猪心脏基质结合培养，制成有功能的工程化人类心脏组织。这种组织工程化人类心肌组织具有与正常人类心肌组织相似的细胞组分、细胞外基质及生物学功能，可以进行体外药物的测试和筛选、初步的临床前期小动物的体内移植研究和治疗疗效观察，最终为实现人类心血管疾病的个体化治疗提供有意义的辅助。

更具体的，通过下述技术方案和步骤实现：

A.取去细胞化得大鼠或猪心脏，获得自然心脏基质；

B.将去细胞化的大鼠或猪心脏基质按需制成形状、尺寸不同的基材；

C.根据本发明获得人多能干细胞-遗传性心肌病多能干细胞，定向分化为该人类的心血管系统细胞

D.将分化后的诱导多能干细胞来源的心肌细胞进行纯化，使其比例达到95％以上，制成种子细胞1；

E、分离相同个体的脂肪干细胞，体外培养，制成种子细胞2；

F、将种子细胞1和种子细胞2混合后接种于去细胞化的大鼠或猪心脏基质上，体外三维培养，构建组织工程化心肌组织。

脂肪干细胞的分离和培养：将所得同一个体的脂肪组织以PBS液冲洗两遍，剪碎，Ⅱ型胶原酶37℃消化；FBS终止消化，离心，弃上清，细胞重悬于PBS中，过滤，所得滤液离心，弃上清，DMEM培养液重悬细胞，种于培养皿中37℃，5％CO2恒温箱中培养，2-3日换一次培养液，直到细胞融合至60％-75％密度时传代；

将纯化后的人多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞和脂肪干细胞接种到所采用的的大小、形状不同的大鼠或猪去细胞化心脏基质上，经体外三维培养，构建不同形状和尺寸的组织工程化心肌组织。采用去细胞化的自然心脏基质作为心肌组织基质，具有良好生物相容性、力学性能和生物降解性。所制得的组织工程化心肌组织与正常心肌组织相似，具有正常心脏的各种细胞成分、细胞外基质及生物学活性。制得的组织工程化人类心肌组织具有与正常人类心肌组织相似细胞成分和电生理功能，既保持一定的机械强度，基本力学性能，又具有合理的孔隙率，良好的细胞相容性，生物降解性，不会引起炎症反应，是一种可以用于移植的具有生物学活性的活组织。可进一步用于进行体外药物的测试和筛选，以及初步的临床前期小动物的体内移植研究和治疗疗效观察，最终对实现人类心血管疾病的个体化治疗提供有意义的辅助。

Claims (8)

1.一种人类遗传性心肌病-多能干细胞，其特征在于，通过下述方法制备，利用新型的TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑技术，通过基因重组方法编辑人类多能干细胞基因组，构建人类遗传性心肌病-多能干细胞疾病细胞株；其包括步骤：

A、构建针对不同靶基因的TALEN或CRISPR/CAS9质粒，所述靶基因突变导致遗传性心肌病；

B、构建带有步骤A所述导致不同遗传性心肌病的各种相应基因突变的同源基因供体质粒；

C、培养良好的未分化的人类胚胎干细胞或体外重编程正常人类个体的体细胞为诱导多能性干细胞；

D、将步骤A获得的TALEN或CRISPR/CAS9质粒与步骤B获得的带有相应突变的同源基因供体质粒共电转人类多能干细胞，通过基因重组导入将遗传性心肌病的特异突变导入人类胚胎干细胞或诱导多能性干细胞；

E、利用Puromycin药物筛选出杂合或纯合的遗传性心肌病多能干细胞，并建立相应细胞株。

2.按权利要求1所述的人类遗传性心肌病-多能干细胞细胞，其特征在于，所述的细胞株为各种带有导致人类遗传性心肌病基因突变的人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞。

3.按权利要求1或者2所述的人类遗传性心肌病-多能干细胞细胞，其特征在于，人类遗传性心肌病-多能干细胞通过多能干细胞定向分化心肌细胞技术得到的相应的人类遗传性心肌病变心肌细胞。

4.如权利要求1所述的人类遗传性心肌病-多能干细胞细胞，其特征在于，所述的制备方法中，将筛选出的遗传性心肌病-多能干细胞定向分化为遗传性心肌病疾病特异的心肌细胞。

5.如权利要求4所述的人类遗传性心肌病-多能干细胞细胞，其特征在于，所述的制备方法中，将分化后的人类遗传性心肌病特异的心肌细胞进行纯化，使其比例达到95％以上。

6.如权利要求4所述的人类遗传性心肌病-多能干细胞细胞，其特征在于，所述的制备方法中，将分化后的人类遗传性心肌病特异的心肌细胞进行相应疾病表型的验证。

7.权利要求1所述的人类遗传性心肌病-多能干细胞在用于制备通过多能干细胞定向分化心肌细胞技术得到人类遗传性心肌病变心肌细胞中的应用。

8.权利要求1所述的人类遗传性心肌病-多能干细胞在用于制备体外人类遗传性心肌病疾病心肌组织中的用途，其中，将分化获得的人类遗传性心肌病变心肌细胞与任意支架材料结合，培养形成各类体外人类遗传性心肌病疾病心肌组织。