CN106687585A - 用于修饰基因组dna的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

组合物和方法涉及内源基因组DNA区的序列修饰。某些方面涉及用于对细胞中的靶基因组DNA区进行位点特异性序列修饰的方法，所述方法包括：用包含(a)DNA寡核苷酸和(b)DNA消化剂的组合物通过电穿孔转染所述细胞，其中供体DNA包含：(i)含有与所述靶基因组DNA区同源的核酸序列的同源区；和(ii)序列修饰区；并且其中所述基因组DNA序列在所述靶基因组DNA区被特异性修饰。

Description

用于修饰基因组DNA的方法和组合物

发明背景

1.技术领域

本发明一般性地涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及用于修饰基因组DNA的新方法和组合物。

2.背景技术

靶向基因组工程包括在细胞内在沿DNA的特定位点处以定向方式编辑或改变内源DNA。尽管基因修复和同源定向基因改变存在巨大潜力，但当前的基因组工程方法提供非常低的修复或编辑效率，并且有可能引入有害或不期望的DNA序列和结果。

内源基因组序列的修饰可提供先进的治疗应用以及先进的研究方法。目前，最常见的用于体外破坏基因功能的方法是通过RNA干扰(RNAi)。然而，这种方法具有局限性。例如，RNAi可以表现出显著的脱靶效应和毒性。此外，RNAi参与许多内源过程的细胞机制，并且不自然地产生可能非常好地参与目的途径的机制(例如RNAi)可导致误导性的结果或假结果。修饰细胞基因组序列的一种有效且无毒的机制将是更精确的基因敲减方法。

修饰内源基因组序列的有效且无毒的方法还可以提供离体治疗的改进，原因是可以从患者分离细胞，修饰基因组以校正突变，并将患者自身的细胞移植回以获得治疗效果。当前方法效率太低或者太毒以致无法实现这些结果。在本领域中需要允许有效、无毒且稳定的位点定向基因组DNA修饰的技术。

发明内容

组合物和方法涉及内源靶基因组DNA序列的序列修饰或修改。某些方面涉及用于对细胞中的靶基因组DNA区进行位点特异性序列修饰的方法，其包括：用包含(a)DNA寡核苷酸和(b)DNA消化剂的组合物通过电穿孔转染所述细胞；其中所述DNA寡核苷酸包含：(i)包含与所述靶基因组DNA区同源的DNA序列的同源区；和(ii)序列修饰区；并且其中所述基因组DNA序列在所述靶基因组DNA区被特异性修饰。

另一方面涉及用于对细胞中的靶基因组DNA区进行位点特异性序列修饰的方法，其包括：用包含(a)具有100个或更少的核苷酸的DNA寡核苷酸和(b)在RNA上编码的DNA消化剂的组合物通过电穿孔转染干细胞；其中所述DNA寡核苷酸包含：(i)包含与所述靶基因组DNA区同源的DNA序列的同源区；和(ii)序列修饰区；并且其中所述基因组DNA序列在所述靶基因组DNA区被特异性修饰，并且其中所述细胞是干细胞或其后代。在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞。本文使用的术语“原代”指不是无限增殖化的且直接从活组织采集的细胞。这些细胞已经经历非常少的群体倍增，因此相比于连续(肿瘤或人工无限增殖化的)细胞系更能代表其所来源组织的主要功能组分，从而代表体内状态更具代表性的模型。

术语“序列修饰”或“DNA修改”是DNA序列的改变，并且可以包括内源基因组DNA序列的添加、改变或缺失。例如，对于靶基因组序列，供体DNA包含与靶基因组序列互补、相同或同源的序列以及序列修饰或修改区。序列修饰区通常位于同源末端之间。序列修饰不与靶基因组序列互补或与其具有低程度的同源性，并且包含靶基因组序列的改变。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。术语“同源区”是指供体DNA上与靶基因组DNA序列具有一定程度同源性的区域。可以通过用于比较目的而对齐的每个序列中的位置进行比较来确定同源性。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是序列共有的匹配或同源位置数目的函数。“不相关”或“非同源”序列与本发明的序列之一共有小于40％的同一性，但优选小于25％的同一性。

多核苷酸或多核苷酸区(或者多肽或多肽区)与另一序列具有一定百分比(例如，至少或至多60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或可来源于其中的任何范围)的“序列同一性”或“同源性”意指当将两个序列比对时，碱基(或氨基酸)的百分比相同。这种比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序确定，例如Ausubel等编辑的(2007)Current Protocols in Molecular Biology中描述的那些。

在一些实施方案中，寡核苷酸为单链。考虑到单链寡核苷酸将提高细胞对DNA的耐受性并降低DNA诱导的细胞毒性。

在某些实施方案中，供体DNA的同源区与靶基因组序列100％同源或与其相同。在另一些实施方案中，供体DNA的同源区是85％、90％、95％或99％同源的。

在某些实施方案中，供体DNA包含至少或至多10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、75、100、150和200个残基(或可来源于其中的任何范围)的核酸序列，其与靶基因组DNA序列同源。在一些具体实施方案中，供体DNA包含至少约10、或至少约15、或至少约20个核酸的序列，其与基因组DNA序列相同。在上下文中，术语“相同序列”是指与基因组DNA序列完全匹配的序列。相同序列可以在位于DNA序列修饰的5’末端上的区域中和在位于DNA序列修饰的3’末端上的区域中。作为示例性实例，当供体DNA包含至少10个核酸的同源序列时，供体DNA在序列修饰的每一侧上可以包含例如5个核酸的同源序列。类似地，包含10个核酸的同源序列的供体DNA在序列修饰的每一侧上可以包含例如5个核酸的互补序列。

如本文使用的术语“互补”是指核苷酸之间的Watson-Crick碱基配对，并且特别地指彼此氢键合的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接，而胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，核酸包括描述为与指定第二核苷酸序列具有“百分比互补性”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列与指定第二核苷酸序列可具有80％、90％或100％的互补性，表明序列的10个核苷酸中的8个、10个中的9个、或10个中的10个与指定第二个核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3’-TCGA-5’与核苷酸序列5’-AGCT-3’100％互补。此外，核苷酸序列3’-TCGA-与核苷酸序列5’-TTAGCTGG-3’的区域100％互补。本领域技术人员将认识到，两个互补核苷酸序列包含有义链和反义链。

术语“转染”是指用于将生物活性材料(例如核酸、蛋白质、酶或小分子)引入到细胞中的方法。核酸可以是以质粒或寡聚体递送的DNA、和/或RNA、或其组合。

术语“电穿孔”是指其中将外部施加的电场施加于细胞的转染方法。在某些实施方案中，使用的电穿孔方法是静态电穿孔。

在某些实施方案中，使用流式电穿孔(flow electroporation)对细胞进行电穿孔。流式电穿孔包括：将细胞悬浮液和加载分子转移到由流体室(fluid chamber)或流体流路(flow path)构成的设备中；所述流体室或流体流路由沿着流体室或流体流路的侧面设置并且被配置为使所述流体室或流体流路内的生物颗粒受到适合于电穿孔之电场的电极构成；并且将经电穿孔的细胞悬浮液从设备中转移出。术语“流式电穿孔”是指流体室流路内的细胞的电穿孔。该方法对于大规模体积的细胞特别有效。相比之下，由于与穿过液体的移动电流和相对电极之间的距离相关的约束，因此静态电穿孔涉及一组且体积有限的细胞的电穿孔。

在某些方面，将表达构建体转染进细胞中包括使细胞的悬浮液流过流动室中的电场，所述电场由至少部分地限定了所述流动室之相对的带相反电荷的电极产生，其中流动室的热阻小于约10℃/瓦特。在其他某些方面，转染所述细胞包括使用流式电穿孔装置，所述装置包含用于容纳待电穿孔的细胞之悬浮液的室；所述室至少部分地由相对的带相反电荷的电极限定；并且其中所述室的热阻小于约10℃/瓦特。

在某些方面，将表达构建体转染进细胞中包括对细胞悬浮液进行电穿孔或使其暴露于室中的电场，所述电场由至少部分地限定了所述室之相对的带相反电荷的电极产生，其中所述室的热阻小于约10℃/瓦特。在其他某些方面，转染细胞包括使用电穿孔装置，所述装置包含用于容纳待电穿孔的细胞之悬浮液的室；所述室至少部分地由相对的带相反电荷的电极限定；并且其中所述室的热阻小于约10℃/瓦特。

在某些方面，室的热阻约为0.1℃/瓦特至10℃/瓦特。例如，室的热阻可以为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10℃/瓦特或可来源于其中的任何热阻。

相对的带相反电荷的电极可彼此间隔至少1mm、至少2mm、至少3mm或者可来源于其中的任何距离或范围。在任何所公开的实施方案中，所述室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比可为约1比100cm。例如，所述比可为约1比1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cm或者可来源于其中的任何值或范围。在某些方面，所述室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm，并且相对的带相反电荷的电极彼此间隔至少1mm。在另一些方面，所述室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm，并且相对的带相反电荷的电极彼此间隔至少3mm。在甚至另一些方面，所述室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm，并且相对的带相反电荷的电极彼此间隔约3mm至约2cm。例如，相对的带相反电荷的电极可彼此间隔约3、4、5、6、7、8、9或10mm或者可来源于其中的任何距离，或者相对的带相反电荷的电极可彼此间隔约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0cm或者可来源于其中的任何距离。在这些实施方案的一些方面，被电穿孔的细胞基本上不会因此被热降解。

在任何所公开的实施方案中，所述室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm。例如，所述比可为约1比1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cm或者可来源于其中的任何值或范围。在某些方面，所述室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm，并且相对的带相反电荷的电极彼此间隔至少1mm。在另一些方面，所述室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm，并且相对的带相反电荷的电极彼此间隔至少3mm。在甚至另一些方面，所述室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm，并且相对的带相反电荷的电极彼此间隔约3mm至约2cm。例如，相对的带相反电荷的电极可彼此间隔约3、4、5、6、7、8、9或10mm或者可来源于其中的任何距离，或者相对的带相反电荷的电极可彼此间隔约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0cm或者可来源于其中的任何距离。在这些实施方案的一些方面，被电穿孔的细胞基本上不会因此被热降解。

在任何所公开的实施方案中，所述装置还可包含散热的冷却元件。例如，所述冷却元件可以包含热电冷却元件。作为另一个实例，所述冷却元件可包含与电极接触流动的冷却流体。作为又一个实例，所述冷却元件可包含与电极有效关联的散热器(heat sink)。所述室的热阻可小于约3℃/瓦特。在一些实施方案中，所述室的热阻为约0.5℃/瓦特至4℃/瓦特，或者所述室的热阻为约1℃/瓦特至3℃/瓦特。例如，所述室的热阻可为约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0℃/瓦特或者可来源于其中的任何值。

在某些涉及通过电穿孔转染细胞的方法中，所述方法包括使细胞悬浮液暴露于强度大于0.5kV/cm的电场。例如，所述电场的强度可大于约3.5kV/cm。在某些方面，所述电场的强度大于约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.5kV/cm或者可来源于其中的任何值。

在一些实施方案中，转染细胞包括使用流式电穿孔装置，所述装置包含：限定流体通道的壁，所述流体通道具有被配置为接收和暂时容纳待电穿孔细胞的悬浮液之持续流的电穿孔区域；与所述流体通道流体连通的流入口(inlet flow portal)，由此可通过所述流入口将所述悬浮液引入到所述流体通道中；与所述流体通道流体连通的流出口(outletflow portal)，由此可通过所述出口将所述悬浮液从所述流体通道排出；在电穿孔区域内限定所述流体通道的壁包含形成所述流体通道之第一壁的主要部分的第一电极和形成与所述第一壁相对的所述流体通道之第二壁的主要部分的第二电极，所述第一电极和第二电极是这样的，当将所述第一电极和第二电极与电能来源电连通时，在电极间形成所述悬浮液可流过的电场；并且其中所述流体通道的热阻小于约10℃/瓦特。

在某些这样的实施方案中，所述第一电极和第二电极或相对的带相反电荷的电极彼此间隔至少1mm。此外，所述室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm。在一些具体实施方案中，所述室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cm或者可来源于其中的任何值或范围。在某些实施方案中，通过本文所述的电穿孔方法电穿孔的细胞基本上不会因此被热降解。在本文所述的某些实施方案中，所述室是流动室。

在一些方面，电穿孔装置包含用于容纳待电穿孔的细胞之悬浮液的室；所述室至少部分地由相对的带相反电荷的电极限定；并且其中所述室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm。在一些特定方面，所述比为1比70cm。在另一些特定方面，所述比为约1比50cm。例如，所述比可为约1比1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cm或者可来源于其中的任何值。在本文所述的某些实施方案中，所述室是流动室。

在一些实施方案中，所述流式电穿孔装置包含限定流体通道的壁，所述流体通道被配置为接收和暂时容纳待电穿孔的细胞之悬浮液的持续流；与所述流体通道流体连通的流入口，由此可通过所述流入口将所述悬浮液引入到所述流体通道中；与所述流体通道流体连通的流出口，由此可通过所述出口将所述悬浮液从所述流体通道排出；限定所述流体通道的壁包含形成所述流体通道之第一壁的至少一部分的第一电极和形成与所述第一壁相对的所述流体通道的第二壁的至少一部分的第二电极，所述第一电极和第二电极是这样的，当将所述第一电极和第二电极与电能来源电连通时，在电极间形成所述悬浮液可流过的电场；并且其中所述流体通道的热阻小于约10℃/瓦特。在某些方面，所述流体通道的热阻为约0.1℃/瓦特至10℃/瓦特。例如，所述流体通道的热阻可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10℃/瓦特或者可来源于其中的任何热阻。所述第一电极和第二电极可彼此间隔至少1mm、至少2mm、至少3mm或可来源于其中的任何距离或范围。在任何所公开的实施方案中，所述流动室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm。例如，所述比可为约1比1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cm或者可来源于其中的任何值或范围。在某些方面，所述流动室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm，并且所述第一电极和第二电极彼此间隔至少1mm。在另一些方面，所述流动室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm，并且所述第一电极和第二电极彼此间隔至少3mm。在甚至另一些方面，所述流动室之与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为约1比100cm，并且所述第一电极和第二电极彼此间隔约3mm至约2cm。例如，所述第一电极和第二电极可彼此间隔约3、4、5、6、7、8、9或10mm或者可来源于其中的任何距离，或者所述第一电极和第二电极可彼此间隔约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0cm或者可来源于其中的任何距离。在这些实施方案的一些方面，在所述流体通道中被电穿孔的细胞基本上不会因此被热降解。

在某些公开的方法和装置中，所述室的热阻为约0.1℃/瓦特至约4℃/瓦特。在一些方面，所述室的热阻为约1.5℃/瓦特至约2.5℃/瓦特。例如，所述室的热阻可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0℃/瓦特或者可来源于其中的任何热阻。

在某些公开的方法和装置中，所述流式电穿孔装置包含：限定流体通道的壁，所述流体通道被配置为接收和暂时容纳包含颗粒之悬浮液的持续流；与所述流体通道流体连通的流入口，由此可通过所述流入口将所述悬浮液引入到所述流体通道中；与所述流体通道流体连通的流出口，由此可通过所述流出口将所述悬浮液从所述流体通道排出；限定所述流体通道的壁包含形成所述流体通道之第一壁的第一电极板和形成与所述第一壁相对的所述流体通道之第二壁的第二电极板；其中选择与所述悬浮液接触的电极面积以及所述电极之间的距离以使得所述流体通道的热阻小于约4℃/瓦特；设置与电能来源电连通的成对电极，由此在所述电极之间形成电场；由此流过所述流体通道的颗粒的悬浮液可经受所述电极之间形成的电场。在某些方面，限定所述流体通道的所述电极板还包含：由非导电材料形成的且设置在所述第一电极板和第二电极板之间以使电极板维持互相间隔关系的垫圈(gasket)，所述垫圈限定其中形成所述流体通道的相对侧壁的通道。垫圈可以例如与第一电极板和第二电极板各自形成密封。在一些实施方案中，所述装置包含多个流体通道，并且所述垫圈包含多个通道，形成多个通道各自相对的侧壁。在一些方面，流入口和流出口中的一个包含在一个电极板中形成并且与所述流体通道流体连通的孔。流入口和流出口中的另一个可包含在一个电极板中形成并且与所述流体通道流体连通的孔。在某些方面，流入口和流出口包含在另一个电极板中形成并且与所述流体通道流体连通的孔。在任何所公开的实施方案中，所述装置还可包含与所述流体通道有效关联以散热的冷却元件。例如，所述冷却元件可包含热电冷却元件。作为另一个实例，所述冷却元件可包含与所述电极接触流动的冷却流体。作为又一个实例，所述冷却元件可包含与电极有效关联的散热器。所述流体通道的热阻可小于约3℃/瓦特。在一些实施方案中，所述流体通道的热阻为约0.5℃/瓦特至4℃/瓦特，或者所述流体通道的热阻为约1℃/瓦特至3℃/瓦特。例如，所述流道的热阻可为约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0℃/瓦特或者可来源于其中的任何值。

在某些公开的方法和装置中，所述第一电极可包含长形导电结构，其中所述第二电极包含管状的导电结构；其中所述电极被同心地布置以使得第二管状电极围绕与其为隔开关系的所述第一电极；并且其中所述流体通道设置在所述第一电极和第二电极之间限定的环形空间内。所述电极可形成限定所述流体通道的壁的至少一部分。在一些实施方案中，用于维持所述第一电极和第二电极的同心环形垫片(spacer)处于间隔开的同心关系。在某些方面，所述装置与第二类似装置串联或并联布置。

在某些涉及通过流式电穿孔转染细胞的方法中，流体通道的热阻小于约10℃/瓦特。在一些涉及通过流式电穿孔转染细胞的方法中，所述方法包括使待电穿孔的细胞的悬浮液流过流体通道，并且当流过所述流体通道时使所述悬浮液暴露于电场，所述电场的强度大于0.5kV/cm。例如，所述电场的强度可大于约3.5kV/cm。在某些方面，所述电场的强度大于约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.5kV/cm或者可来源于其中的任何值。

在所公开的关于流式电穿孔装置的实施方案中，特别考虑到，对于流式电穿孔描述的参数和参数范围适用于本文所述的方法中使用的静态电穿孔装置。在一些具体实施方案中，使用流式电穿孔而排除静态电穿孔或非流式电穿孔。在另一个具体的实施方案中，使用静态电穿孔而排除流式电穿孔。

任何所公开的方法可包括采用转染细胞的有限稀释以获得单细胞集落的步骤。如本文使用的术语“有限稀释”是指显著地稀释细胞培养物的过程，目的是在每种培养物中获得单细胞。当这样的分离的单细胞进行繁殖时，所得培养物将仅包含原始细胞的克隆。例如，可使用多孔板来获得单细胞培养物或集落。例如，有限稀释可用于患者细胞来源的iPS研究(例如，用于镰状细胞患者的修复)。使用有限稀释方法可将iPS细胞修饰成校正的血红蛋白表达细胞，将其分离并扩增以施用于患者。

在任何所公开的方法中，可以采用包括对经分离且经选择的克隆细胞进行扩增以产生具有特定基因组DNA序列修饰的克隆细胞的步骤。

在涉及对分离的克隆细胞进行扩增的所公开的方法中，扩增可用于大规模生产。例如，可在大于1L的体积中扩增细胞，或者可在大于3L的体积中扩增细胞。在某些方面，在大于1.0、1.5、2.0、2.5或3.0L或者可来源于其中的任何值的体积中扩增细胞。

在任何所公开的方法中，可采用包括对转染并且选择或筛选的细胞进行冷冻的另一个步骤。还可采用再一个步骤，其中扩增先前冷冻的转染并且选择/筛选的细胞。

在所公开的方法中，细胞培养物可包含本领域普通技术人员已知的任何其他成分，如本领域普通技术人员基于所培养的细胞类型容易地选择。例如，可在丁酸钠或相当的盐中培养细胞。

在所公开的方法中，可以采用包括对分离并且选择或筛选的克隆细胞进行扩增以产生具有基因组DNA序列修饰的克隆细胞的另一个步骤。

另一些方面涉及用于产生包含靶基因组DNA序列的基因组DNA序列修饰或修改的稳定细胞系的方法，所述方法包括：用包含(a)DNA寡核苷酸和(b)消化剂的组合物通过电穿孔转染细胞；其中供体DNA包含：(i)含有与所述靶基因组DNA区同源的核酸序列的同源区；和(ii)序列修饰区；并针对在所述靶基因组DNA区上的基因组DNA序列修饰筛选经转染细胞；通过有限稀释分离经筛选的经转染细胞以获得克隆细胞；扩增分离的转染细胞以产生包含基因组DNA序列修饰的稳定细胞系。

本公开内容还提供了通过本文所述的方法产生的细胞系或电穿孔的细胞。

另一方面涉及通过施用有效量的通过本文所述方法产生的细胞系或电穿孔的细胞来治疗患有或疑似患有疾病或病症之对象的方法。

特别考虑到可以排除本文所述的实施方案。进一步考虑到，当描述范围时，可以排除某些范围。

如本文说明书中所使用的，没有数词限定的表述可意指一个/种或更多个/种。当与词语“包括/包含”一起使用时，如本文权利要求中所使用的词语“一个/种”可指一个/种或多于一个/种。

权利要求书中使用术语“或”意指“和/或”，除非明确指明为仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管公开内容支持所指仅仅是替代方案以及“和/或”的定义。如本文使用的“另一个/种”可意指至少第二个/种或更多。

在整个本申请中，术语“约”用来表示数值包括装置和确定数值所采用的方法的误差的固有变化，或者研究对象之间存在的变化。

根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应当理解，这些详细描述和具体实施例虽然说明了本发明的一些优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员将变得明显。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分并包括在内以进一步证明本发明的某些方面。通过参考一个或更多个这些附图结合本文中所出现的一些具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。

图1：用Maxcyte STX静态和流式电穿孔转染技术的稳定细胞系开发过程。附图描绘了稳定细胞产生的工作流程。在电穿孔后，可将细胞培养一段时间而不进行选择以使其从电穿孔过程中恢复(图中未示出)。在电穿孔后，在选择剂存在下通过培养细胞来选择细胞(选择阶段)。在选择阶段后，在选择剂存在下于较低密度下培养细胞以使得进行有限稀释克隆(维持/克隆选择阶段)。在产生克隆群后，筛选表达外源多肽的克隆并扩增(克隆筛选和扩增阶段)。在筛选后，使具有所期望活性的克隆在更大规模上生长以用于生产目的(大规模扩大阶段)，或使其进行长期保存(例如低温保存)。

图2A-C：DNA转染对细胞具有不同的细胞毒性。图2所示为DNA和mRNA转染的外周血淋巴细胞(PBL)和K562细胞的生存力(图2A)；DNA和mRNA转染的PBL和K562细胞的GFP表达(图2B)；以及DNA和mRNA转染的PBL和K562细胞的细胞数(图2C)。数据证明，DNA转染不引起对K562的细胞毒性，但在静息PBL中确实诱导强的细胞毒性。

图3：mRNA-CRISPR转染诱导的K562和PBL之AAVS1位点处的基因组DNA编辑。图3所示是通过静息PBL细胞与K562细胞的Cel-1测定的基因编辑的比较。细胞不进行电穿孔(-EP)或用mRNA-CRISPR进行电穿孔(+EP)(分别为cas9和gRNA)。如下加载该电泳凝胶中的样品：泳道1：标志物；泳道2：PBL的-EP；泳道3：PBL的+EP；泳道4：K562的-EP；泳道5：K562的+EP。校正的AAVS-1位点的切割产物是298和170个碱基对，而亲本带是468个碱基对。编辑率计算为(消化带的密度)/[(消化带的密度+亲本带的密度)。剩余的电穿孔的静息PBL和K562细胞分别显示出46％和49％的编辑率。

图4：mRNA-CRISPR转染诱导的K562之AAVS1位点处的基因组DNA编辑。图4所示是通过Cel-1测定的重复实验结果的电泳凝胶，所述实验结果示出通过用mRNA-CRISPR(Cas9和引导RNA)电穿孔细胞的基因编辑的一致性，其分别诱导59％和52％的DNA编辑。校正的AAVS-1位点的切割产物是298和170个碱基对，而亲本带是468个碱基对。编辑率计算为(消化带的密度)/[(消化带的密度+亲本带的密度)。

图5：mRNA-CRISPR转染诱导的PBL和扩增的T细胞之AAVS1位点处的基因组DNA编辑。图5所示是静息PBL细胞与扩增的T细胞的比较。细胞未经转染(-EP)、用GFP-mRNA转染或用mRNA-CRISPR(Cas9+gRNA，c+g)转染。以标志物、PBL的-EP、GFP和c+g以及扩增的T细胞的-EP和c+g的顺序加载样品。校正的AAVS-1位点的切割产物是298和170个碱基对，而亲本带是468个碱基对。编辑率计算为(消化带的密度)/[(消化带的密度+亲本带的密度)。用Cas9和引导RNA电穿孔的PBL和扩增的T细胞分别显示出32％和45％的编辑。

图6：mRNA-CRISPR转染诱导的K562之AAVS1位点中Hind III序列整合的单链DNA寡核苷酸大小依赖性。细胞未经转染(-EP)、仅用mRNA-CRISPR转染(c+g)或用mRNA-CRISPR加指定的不同大小的单链DNA寡核苷酸转染。以标志物、c+g、c+g+26mer、c+g+50mer、c+g+70mer和c+g+100mer的顺序加载样品。使HindIII识别的6个核苷酸进入产生HindIII消化位点的AAVS1位点中。具有整合的寡核苷酸供体序列的AAVS-1位点的切割产物是298和170个碱基对，而亲本带是468个碱基对。整合率计算为(消化带的密度)/[(消化带的密度+亲本带的密度)。50、70和100核酸供体寡核苷酸分别表现出43％、35％和34％的整合，而20核酸表现出0％的整合。

图7：mRNA-CRISPR寡核苷酸转染诱导的扩增的T细胞之AAVS1位点中的Hind III序列整合。仅用mRNA-CRISPR或用mRNA-CRISPR加50mer单链寡核苷酸(c+g+o)转染细胞。PCR扩增子用HidIII消化(+H3)或未被消化(-H3)。如下加载样品：1)标志物；2)c+g-H3；3)c+g+H3；4)c+g+o-H3；5)c+g+o+H3。供体寡核苷酸将6个核苷酸整合到产生HindIII消化位点的AAVS1位点中。具有整合的寡核苷酸供体序列的AAVS-1位点的切割产物是298和170个碱基对，而亲本带是468个碱基对。整合率计算为(消化带的密度)/[(消化带的密度+亲本带的密度)。用供体寡核苷酸转染的扩增的T细胞显示出15％-30％的整合。

图8A-C：通过MaxCyte系统的mRNA转染对人扩增T细胞具有低的细胞毒性。与图7中相同的扩增的t细胞的生存力和细胞增殖(图8A)，转染后扩增的T细胞的增殖(图8B)，以及转染后扩增的T细胞的GFP表达(图8C)。数据证明，单链寡核苷酸DNA与作为mRNA的核酸酶不仅介导6核苷酸整合(图7)，而且还对扩增的T细胞显示出低的细胞毒性。

图9：造血干细胞(HSC)的表型和GFP表达。在解冻后2天进行电穿孔。数据表明，用mRNA转染比在CD34+HSC上用DNA更有效。

图10A-D：HSC的DNA-GFP转染比HSC上的mRNA-GFP转染具有高得多的细胞毒性。在解冻后2天对HSC细胞进行电穿孔。图10所示是mRNA/DNA转染的CD34+人HSC的生存力(图10A)、增殖(图10B)、GFP表达(图10C)和GFP平均荧光强度(MFI)(图10D)。

图11A-C：用mRNA-Cas9/gRNA加不同大小的单链供体DNA寡核苷酸转染HSC具有低的细胞毒性。在解冻后2天对HSC细胞进行电穿孔。图11所示是通过mRNA-Cas9/gRNA和指定核酸长度的不同大小的DNA单链寡核苷酸转染的HSC的生存力(图11A)、归一化生存力(图11B)和增殖(图11C)。

图12：mRNA-CRISPR转染诱导的CD34+造血干细胞之AAVS1位点中的基因组DNA编辑。细胞未经转染(-EP)、用mRNA-GFP转染(GFP)或重复4次的mRNA-CRISPR转染(C+G 1、2、3、4)。如下加载电泳凝胶样品：1)标志物；2)-EP；3)GFP；4)C+G-1；5)C+G-2；6)C+G-3；7)C+G-4。编辑的AAVS-1位点的切割产物是298和170个碱基对，而亲本带是468个碱基对。编辑率计算为(消化带的密度)/[(消化带的密度+亲本带的密度)。用编码Cas9的mRNA和引导RNA转染的HSC在4次不同的实验中表现出43％、60％、54％和52％的编辑。

图13A-B：mRNA-CRISPR寡核苷酸转染在转染后2天诱导的CD34+造血干细胞之AAVS1位点中的HindIII序列整合。细胞未经转染(-EP)、用GFP-mRNA转染(GFP)、仅用mRNA-CRISPR转染(C+G)或用mRNA-CRISPR加不同大小的寡核苷酸(26mer、50mer、70mer和100mer，其中100mer具有100mer的指定寡核苷酸浓度)转染。如下加载电泳凝胶样品：1)标志物；2)-EP-H3；3)-EP+H3；4)GFP-H3；5)GFP+H3；6)C+G-H3；7)C+G+H3；8)26mer-H3；9)26mer+H3；10)50mer-H3；和11)50mer+H3。图13B中的样品是如下加载的电泳凝胶：1)标志物；2)70mer-H3；3)70mer+H3；4)100mer-30μg/mL-H3；5)100mer-30μg/mL+H3；6)100mer-100μg/mL-H3；7)100mer-100μg/mL+H3；8)100mer-200μg/mL-H3；9)100mer-200μg/mL+H3。整合的AAVS-1位点的切割产物是298和170个碱基对，而亲本带是468个碱基对。整合率计算为(消化带的密度)/[(消化带的密度+亲本带的密度)。用25mer核酸DNA寡核苷酸转染的HSC显示出0％的整合，而用50mer和70mer核酸寡核苷酸转染的HSC分别显示出9％和23％的整合。用30μg/mL的100核苷酸寡核苷酸转染的HSC在该时间点处显示0％的整合(在转染后第4天为13％，数据未显示)，而用100μg/mL和200μg/mL的相同寡核苷酸转染的HSC分别显示出28％和43％的整合。

图14：引导RNA提供整合特异性。具有靶向AAVS1位点的gRNA的寡核苷酸在AAVS1中整合，但不在镰状细胞病(SCD)基因座中整合。细胞未经电穿孔(-EP)或用mRNA-CRISPR加供体寡核苷酸电穿孔(c+g+o)。-/+H表示不存在(-)或存在(+)HindIII核酸内切酶。如下加载电泳凝胶样品：1)标志物；2)-EP+H；3)c+g+o-H；4)c+g+o+H；5)-EP+H；6)c+g+o-H；7)c+g+o+H。泳道2-4代表来自AAVS1基因座的基因组DNA，而泳道5-7代表来自SCD基因座的基因组DNA。整合的AAVS1位点的切割产物是298和170个碱基对，而亲本带是468个碱基对。整合率计算为(消化带的密度)/[(消化带的密度+亲本带的密度)。用DNA寡核苷酸和AAVS1基因座特异性引导RNA转染的K562细胞特异性整合到AAVS1位点中而不是SCD基因座中。AAVS1基因座处的整合率为20％。

图15A-B：使用两种靶向AAVS1基因座(图15A)和SCD基因座(图15B)的引导RNA的位点特异性整合。如图15B所示，在SCD基因座上实现了供体DNA的位点特异性整合。这些结果进一步描述于实施例2中。

图16A-B：具有序列修饰区(大写且非阴影的)和同源区(小写且阴影的)的实例供体DNA寡核苷酸。图16A示出了将终止密码子作为添加插入靶基因组DNA中的实例(SEQ IDNO.40和41)。图16B示出了改变靶基因组DNA中的单个碱基的实例(SEQ ID NO.42和43)。

图17：在转染后1天用编码eGFP的mRNA有效转染HSC。示出了对照细胞(未转染，左侧两张显微照片)和转染细胞(右侧两张显微照片)。对照细胞和转染细胞两者的细胞都是存活的。接近100％的eGFP表达(底部，右侧)证明了用mRNA转染的有效转染效力。

图18：电穿孔介导的HSC中AAVS1位点处的有效基因编辑。用mRNA制剂中的cas9(c)和gRNA(g)转染HSC。进行Cel-1测定以分析基因编辑。泳道1是标志物。泳道2是对照HSC(-EP)。泳道3是GFP-mRNA转染的HSC。泳道4至7是用Cas9/gRNA的HSC的一式四份转染(quadrate trensfection)。

图19：gp91phox中最普遍的突变(“热点”)是外显子7中676位C至T突变。使用CRISPR和供体DNA单链寡核苷酸将T突变校正回C，在校正后从CGD中的终止密码子回到氨基位点226上的Arg，其将恢复gp91表达。通过使用来自CGD患者的EBV转化的B细胞，当在用抗pg91的FITC缀合抗体转染后5天测定gp91表达从1％基础噪声水平(左下角)至10％上调水平(右下角)时，共转染实际上恢复了。在解冻细胞后2天进行转染。

具体实施方式

本文所述的方法使用DNA寡核苷酸和DNA消化剂来修饰/修改DNA序列。考虑到本文所述的方法提供了低毒性和DNA序列修饰并入的高效率。

核酸

B.寡核苷酸

实施方案涉及用包含DNA寡核苷酸和DNA消化剂的组合物通过电穿孔细胞对靶基因组DNA序列进行序列修饰。在一些实施方案中，DNA寡核苷酸为单链。

术语“内源基因组DNA”是指细胞的染色体DNA。术语“靶基因组DNA序列”是指DNA序列修饰针对的内源基因组DNA位点。DNA序列修饰可以是在一个特定位点或多个特定位点改变靶基因组DNA序列的一个或更多个碱基的修饰。改变可以包括将靶基因组DNA序列的至少、至多或恰好1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40个碱基对或可来源于其中的任何范围改变为至少、至多或恰好1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40个不同的碱基对或可来源于其中的任何范围。缺失可以是缺失至少、至多或恰好1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、300、400或500个碱基对或可来源于其中的任何范围。添加可以是添加至少、至多或恰好1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40或更多个碱基对或可来源于其中的任何范围。如果序列修饰以多种方式改变靶基因组DNA，则序列修饰或修改可归类为改变和缺失、改变和添加等。在一个实施方案中，序列修饰是终止密码子。在另一个实施方案中，DNA序列修饰是一个或更多个终止密码子。在另一些实施方案中，DNA序列修饰是1、2、3、4、5或10个终止密码子。当序列修饰是终止密码子时，可以提高基因编辑的效率和/或可靠性。

术语“寡核苷酸(oligo)”或“寡核苷酸(oligonucleotide)”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)，以及在适当情况下，指核糖核酸(RNA)。该术语还应当理解为包括由核苷酸类似物制备的作为RNA或DNA的等同物、衍生物、变体和类似物，并且如适用于所述的实施方案，包括单链(有义或反义)多核苷酸和双链多核苷酸。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。为了清楚起见，当本文提及核酸(其可以是DNA或RNA)的核苷酸时，使用术语“腺苷”、“胞苷”、“鸟苷”和“胸苷”。应当理解，如果核酸是RNA，则具有尿嘧啶碱基的核苷酸是尿苷。

术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用并指聚合物形式的任何长度的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构并且可以实现任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包括经修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在组装多核苷酸之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分间断。可以在聚合后对多核苷酸进行进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。该术语也指双链分子和单链分子两者。除非另有说明或要求，本发明之多核苷酸的任何实施方案涵盖双链形式和已知或预计构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种两者。

本文所述的DNA寡核苷酸包含与靶基因组DNA序列互补的序列和靶基因组DNA序列的序列修饰。

本文使用的术语“互补”是指核苷酸之间的Watson-Crick碱基配对，并且特别地指彼此氢键合的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接，而胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，核酸包含描述为与指定第二核苷酸序列具有“百分比互补性”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列与指定的第二核苷酸序列可具有80％、90％或100％的互补性，表明序列的10个核苷酸中的8个、10个中的9个或10个中的10个与指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3’-TCGA-5’与核苷酸序列5’-AGCT-3’100％互补。此外，核苷酸序列3’-TCGA-与核苷酸序列5’-TTAGCTGG-3’的区域100％互补。本领域技术人员将认识到，两个互补的核苷酸序列包含有义链和反义链。

在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少约10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50个核酸的序列，其与靶基因组DNA序列互补。在一些具体实施方案中，寡核苷酸包含至少约20个核酸的序列，其与基因组DNA序列互补。在上下文中，术语“互补序列”是指与基因组DNA序列完全匹配的序列。互补序列可以在DNA序列修饰的5’末端上的区域中和在DNA序列修饰的3’末端上的区域中。作为示例性实例，当寡核苷酸包含至少20个核酸的互补序列时，寡核苷酸在序列修饰的每一侧上可以包含例如10个核酸的互补序列。类似地，包含10个核酸的互补序列的寡核苷酸在序列修饰的每一侧上可以包含例如5个核酸的互补序列。

DNA寡核苷酸的长度可以为约10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个核酸至约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个核酸或可来源于其的任何范围。在某些实施方案中，寡核苷酸超过20个核酸，或者超过21、22、23、24、25、30或40个核酸。在一些具体实施方案中，寡核苷酸为约30至300个核酸、约25至约200个核酸、约25至约150个核酸、约25至约100个核酸、或约40至约100个核酸。

电穿孔过程期间的寡核苷酸浓度可以是电穿孔室和/或样品容器中寡核苷酸的最终浓度。寡核苷酸浓度可以为约10、20、30、50，75、100、150、200、250、300至约350、400、500、1000、1500、2000、3000、4000或5000μg/mL或者可来源于其中的任何范围。在某些实施方案中，寡核苷酸的浓度为至少30μg/mL。在另一些实施方案中，寡核苷酸的浓度为至少、至多或恰好10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150或200μg/mL或者可来源于其中的任何范围。

C.DNA消化剂

本发明提供了通过用DNA寡核苷酸和DNA消化剂通过电穿孔转染细胞来修饰靶基因组DNA序列的方法。术语“DNA消化剂”是指能够切割核酸的核苷酸亚基之间的键(即，磷酸二酯键)的试剂。在一个具体的实施方案中，在RNA上编码DNA消化剂。考虑到，在RNA上提供DNA消化剂可以实现提高转染后细胞的生存力和提高序列修饰效率中的一项或更多项。在另一些实施方案中，DNA消化剂是蛋白质、酶或具有酶促活性的小分子模拟物。

在一个实施方案中，DNA消化剂是转座酶(transposase)。例如，可以使用设计成将精确限定的DNA序列引入到脊椎动物染色体中的合成DNA转座子(例如，“睡美人(SleepingBeauty)”转座子系统)。睡美人转座子系统由睡美人(SB)转座酶和转座子构成，其被设计成将特定的DNA序列插入到脊椎动物的基因组中。DNA转座子以简单的剪切和粘贴(cut-and-paste)方式从一个DNA位点易位到另一个DNA位点。转座是将确定的DNA区段从一个DNA分子切除并移动到相同或不同DNA分子或基因组中的另一个位点的精确过程。

与所有其他Tc1/mariner型转座酶一样，SB转座酶将转座子插入到接受者DNA序列中的TA二核苷酸碱基对中。插入位点可以是相同DNA分子的其他位置中或在另一个DNA分子(或染色体)中。在哺乳动物(包括人)基因组中，存在约2亿个TA位点。TA插入位点在转座子整合过程中重复。TA序列的这种复制是转座的标志并且用于确定一些实验中的机制。可以在转座子内编码转座酶或者转座酶可由另一来源提供，在这种情况下，转座子成为非自主元件。非自主转座子作为遗传工具极其有用，原因是在插入后它们不能独立地继续切除和重新插入。在人基因组和其他哺乳动物基因组中鉴定的所有DNA转座子是非自主的，原因是即使它们包含转座酶基因，基因也是无功能的并且不能产生可移动转座子的转座酶。

在另一个实施方案中，DNA消化剂是整合酶(integrase)。例如，phiC31整合酶是在噬菌体phiC31的基因组内编码的序列特异性重组酶。phiC31整合酶介导两个34个碱基对序列(称为附着位点(att))之间的重组，一个存在于噬菌体中，而另一个存在于细菌宿主中。已经显示出这种丝氨酸整合酶在包括哺乳动物细胞的许多不同细胞类型中有效地发挥作用。在phiC31整合酶的存在下，含attB的供体质粒可以通过在与天然attP位点具有序列相似性的位点(称为假attP位点)处重组而单向整合到靶基因组中。phiC31整合酶可以整合作为单拷贝的任何大小的质粒，并且不需要辅因子。整合的转基因稳定表达且可遗传。

在一个具体的实施方案中，DNA消化剂是核酸酶(nuclease)。核酸酶是使核酸水解的酶。核酸酶可以分为核酸内切酶或核酸外切酶。核酸内切酶是催化DNA或RNA分子内部核酸之间的键水解的任何一组酶。核酸外切酶是催化单核苷酸从DNA或RNA链的末端水解的任何一组酶。核酸酶也可以基于其否特异性消化DNA或RNA来分类。特异性催化DNA水解的核酸酶可被称为脱氧核糖核酸酶或DNase，而特异性催化RNA水解的核酸酶可以被称为核糖核酸酶或RNase。一些核酸酶对单链核酸序列或双链核酸序列具有特异性。一些酶同时具有核酸外切酶和核酸内切酶性质。此外，一些酶能够消化DNA序列和RNA序列两者。本文使用的术语“核酸酶”通常是指使核酸序列水解的任何酶。

最佳反应条件因不同核酸酶而变化。应考虑的因素包括温度、pH、酶辅因子、盐组成、离子强度和稳定剂。市售核酸酶的供应商(例如，Promega Corp.；New EnglandBiolabs，Inc.)提供关于每种酶的最佳条件的信息。在如于孵育温度下测量的pH 7.2和pH8.5之间使用大多数核酸酶。此外，大多数核酸酶在37℃示出最大活性；然而，一些酶需要更高或更低的温度以获得最佳活性(例如，Taq I，65℃；Sma I，25℃)。DNA浓度也可以是一个因素，原因是高的DNA浓度可降低酶活性，并且过稀的DNA浓度可降至酶的K_m以下并也影响酶活性。

核酸酶的非限制性实例包括DNase I、Benzonase、核酸外切酶I、核酸外切酶III、绿豆核酸酶(Mung Bean nuclease)、核酸酶BAL 31、RNase I、S1核酸酶、λ核酸外切酶、RecJ和T7核酸外切酶。DNase I是非特异性切割DNA以释放具有5’-磷酸化和3’-羟基化末端的二核苷酸、三核苷酸和寡核苷酸产物的核酸内切酶。DNase I作用于单链DNA和双链DNA、染色质和RNA：DNA杂合体。核酸外切酶I催化以3’至5’方向从单链DNA除去核苷酸。核酸外切酶III催化从双链体DNA的3’-羟基末端逐步除去单核苷酸。核酸外切酶III也作用于双链体DNA中的切口以产生单链缺口。单链DNA对核酸外切酶III具有抗性。绿豆核酸酶降解DNA末端的单链延伸。绿豆核酸酶也是一种RNA核酸内切酶。核酸酶BAL 31降解双链体DNA的3’和5’端两者。核酸酶BAL 31也是在双链体DNA和RNA的切口、缺口和单链区切割的高度特异性单链核酸内切酶。RNase I是将在所有RNA二核苷酸处切割的单链特异性RNA核酸内切酶。S1核酸酶内切核酸地降解单链DNA和RNA以产生5’-磷酰基封端的产物。双链核酸(DNA：DNA、DNA：RNA或RNA：RNA)对S1核酸酶降解具有抗性，除非使用极高浓度的酶。λ核酸外切酶催化从双链体DNA除去5’单核苷酸。其优选的底物是5’-磷酸化的双链DNA，尽管λ核酸外切酶还将以大大降低的速率降解单链和非磷酸化底物。λ核酸外切酶不能在切口或缺口处引发DNA消化，RecJ是单链DNA特异性核酸外切酶，其催化以5’至3’方向从DNA除去脱氧单磷酸核苷酸(deoxy-nucleotide monophosphate)。T7核酸外切酶催化从双链体DNA除去5’单核苷酸。T7核酸外切酶催化从5’端或在双链DNA的切口和缺口处除去核苷酸。

限制性核酸内切酶是可以与本发明的方法结合使用的核酸酶的另一个实例。限制性核酸内切酶及其识别序列的非限制性实例提供在表1中。

表1.限制性核酸内切酶的识别序列

其中R＝A或G，K＝G或T，S＝G或C，Y＝C或T，M＝A或C，W＝A或T，B＝非A(C、G或T)，H＝非G(A、C或T)，D＝非C(A、G或T)，V＝非T(A，C或G)，并且N＝任何核苷酸。

本领域普通技术人员将能够根据靶基因组序列和DNA寡核苷酸的特征选择合适的核酸酶。在一个实施方案中，核酸酶是位点特异性核酸酶。在一个相关的实施方案中，核酸酶具有至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、或至少25个碱基对的识别序列。考虑到转染编码具有超过8、10、12、14、16、18、20或25个碱基对的识别序列之核酸酶的RNA将对细胞的毒性更小。此外，提供作为RNA的核酸酶还可以降低对细胞的毒性。

在一个实施方案中，编码位点特异性核酸酶的RNA编码Cas核酸酶。在一个相关的实施方案中，Cas核酸酶是Cas9。在另一个实施方案中，核酸酶是cas9并且组合物还包含引导RNA。可以与本文所述的方法和组合物一起使用的序列特异性核酸酶系统的另一个实例包括Cas9/CRISPR系统(Wiedenheft，B.等，Nature 482，331-338(2010)；Jinek，M.等，Science 337，816-821(2012)；Mali，P.等，Science 339，823-826(2013)；Cong，L.等，Science 339，819-823(2013))。Cas9/CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复，ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统利用RNA引导的DNA结合和靶DNA的序列特异性切割。引导RNA/Cas9组合赋予核酸酶位点特异性。引导RNA(gRNA)包含约20个与基因组PAM(前间区序列邻近基序，protospacer adjacent motifs)位点(NNG)和恒定RNA骨架区上游的靶基因组DNA序列互补的核苷酸。Cas(CRISPR相关的)9蛋白结合gRNA以及与所述gRNA结合的靶DNA，并在PAM位点上游的确定位置处引入双链断裂。Cas9具有与HNH和RuvC核酸内切酶同源的两个独立核酸酶结构域，并且通过使这两个结构域中的任一个突变，可以将Cas9蛋白转化成引入单链断裂的切口酶(Cong，L.等，Science 339，819-823(2013))。特别考虑到，本发明的方法和组合物可以与Cas9的单链或双链诱导形式以及与其他RNA引导的DNA核酸酶(例如其他细菌Cas9样系统)一起使用。本文所述的方法和组合物的序列特异性核酸酶可工程化、嵌合或由生物体分离。可将序列特异性核酸酶以编码序列特异性核酸酶的RNA的形式(例如mRNA)引入到细胞中。

在一个实施方案中，编码位点特异性核酸酶的RNA编码锌指核酸酶。锌指核酸酶通常包含DNA结合结构域(即，锌指)和切割结构域(即，核酸酶)。锌指结合结构域可以被工程化以识别并结合选择的任何核酸序列。参见，例如，Beerli等，(2002)Nat.Biotechnol.20：135-141；Pabo等，(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等，(2001)Nat.Biotechnol.19：656-660；Segal等，(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等，(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：41 1-416；Zhang等，(2000)J.Biol.Chem.275(43)：33850-33860；Doyon等，(2008)Nat.Biotechnol.26：702-708；以及Santiago等，(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：5809-5814。与天然存在的锌指蛋白相比，工程化的锌指结合结构域可具有新的结合特异性。工程方法包括但不限于合理设计和多种选择类型。合理设计包括例如使用包含双联体、三联体和/或四联体核苷酸序列和单个锌指氨基酸序列的数据库，其中每个双联体、三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一个或更多个氨基酸序列有关。参见，例如，美国专利No.6,453,242和6,534,261，其公开内容通过引用整体并入本文。作为一个实例，可使用美国专利6,453,242中描述的算法来设计锌指结合结构域以靶向预选序列。

也可以使用替代方法(例如使用非简并识别密码表的合理设计)来设计锌指结合结构域以靶向特定序列(Sera等，(2002)Biochemistry 41：7074-7081)。用于鉴定DNA序列中的潜在靶位点和设计锌指结合结构域的公开可用的基于网络的工具可以分别在http://www.zincfingertools.org和http://bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFiT/(Mandell等，(2006)Nuc.Acid Res.34：W516-W523；Sander等，(2007)Nuc.Acid Res.35：W599-W605)上找到。

锌指结合结构域可被设计成识别并结合约3个核苷酸至约21个核苷酸长度，或优选约9至约18个核苷酸长度的DNA序列。通常，锌指结合结构域包含至少3个锌指识别区(即，锌指)。在一个实施方案中，锌指结合结构域可以包含4个锌指识别区。在另一个实施方案中，锌指结合结构域可以包含5个锌指识别区。在再一个实施方案中，锌指结合结构域可以包含6个锌指识别区。锌指结合结构域可被设计成结合任何合适的靶DNA序列。参见例如，美国专利No.6,607,882、6,534,261和6,453,242，其公开内容通过引用整体并入本文。

选择锌指识别区的示例性方法可以包括噬菌体展示和双杂交系统，并且公开在美国专利No.5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759；和6,242,568；以及WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197和GB 2,338,237中，其各自通过引用整体并入本文。此外，增强锌指结合结构域的结合特异性已描述在例如WO 02/077227中。

锌指结合结构域和用于设计和构建融合蛋白(和编码其的多核苷酸)的方法是本领域技术人员已知的并且详细描述于美国专利申请公开No.20050064474和20060188987中，所述专利申请各自通过引用整体并入本文。使用合适的接头序列，包括例如5个或更多个氨基酸长度的接头，可将锌指识别区和/或多指锌指蛋白连接在一起。对于6个或更多个氨基酸长度的接头序列的非限制性实例，参见美国专利No.6,479,626；6,903,185；和7,153,949，其公开内容通过引用整体并入本文。本文所述的锌指结合结构域可以包含蛋白质的单个锌指之间合适接头的组合。

在一些实施方案中，锌指核酸酶还可以包含核定位信号或序列(NLS)。NLS是促进将锌指核酸酶蛋白靶向核中以在染色体中的靶序列处引入双链断裂的氨基酸序列。核定位信号是本领域已知的。参见，例如，Makkerh等，(1996)Current Biology 6：1025-1027。

锌指核酸酶还包含切割结构域。锌指核酸酶的切割结构域部分可以由任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。可由其获得切割结构域的核酸内切酶的非限制性实例包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见，例如，2002-2003 Catalog，New EnglandBiolabs，Beverly，Mass.；和Belfort等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388或www.neb.com。另一些切割DNA的酶是已知的(例如，S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰腺DNaseI；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶)。还参见Linn等(编辑)Nucleases，Cold Spring HarborLaboratory Press，1993。这些酶(或其功能片段)中的一种或更多种可用作切割结构域的来源。

切割结构域还可以来源于如上所述的酶或其部分，所述酶或其部分需要二聚化以具有切割活性。切割可能需要两种锌指核酸酶，原因是每种核酸酶包含活性酶二聚体的单体。或者，单个锌指核酸酶可以包含两种单体以产生活性酶二聚体。本文使用的“活性酶二聚体”是能够切割核酸分子的酶二聚体。两种切割单体可来源于相同的核酸内切酶(或其功能片段)，或者每种单体可来源于不同的核酸内切酶(或其功能片段)。

当使用两种切割单体来形成活性酶二聚体时，优选地设置两种锌指核酸酶的识别位点以使得两种锌指核酸酶与其各自识别位点的结合将切割单体彼此置于允许切割单体以形成活性酶二聚体(例如，通过二聚化)的空间取向。结果，识别位点的近边缘可以被约5至约18个核苷酸分开。例如，近边缘可以被约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸分开。然而，应当理解，任何整数核苷酸或核苷酸对可以间插在两个识别位点之间(例如，约2至约50个核苷酸对或更多)。锌指核酸酶的识别位点的近边缘(例如本文详细描述的那些)可以被6个核苷酸分开。通常，切割位点位于识别位点之间。

限制性核酸内切酶(限制酶)存在于许多物种中并且能够与DNA(在识别位点处)序列特异性结合，并在结合位点处或附近切割DNA。某些限制酶(例如，IIS型)在远离识别位点的位点处切割DNA并具有可分离的结合结构域和切割结构域。例如，IIS型酶Fokl从在其一条链上的识别位点的9个核苷酸和从在其另一条链上的识别位点的13个核苷酸处催化DNA的双链切割。参见，例如，美国专利No.5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4275-4279；Li等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2764-2768；Kim等，(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：883-887；Kim等，(1994b)Chem.269：31，978-31，982。因此，锌指核酸酶可以包含来自至少一种IIS型限制酶的切割结构域和一个或更多个锌指结合结构域，其可以被工程化或可以不被工程化。示例性IIS型限制酶描述于例如国际公开WO 07/014,275中，其公开内容通过引用整体并入本文。另一些限制酶还包含可分离的结合结构域和切割结构域，并且这些也是本公开内容所考虑的。参见，例如，Roberts等，(2003)Nucleic Acids Res.31：418-420。

在另一个实施方案中，靶向核酸内切酶可以是大范围核酸酶。大范围核酸酶是以大识别位点(即，识别位点通常为约12个碱基对至约40个碱基对)为特征的内切脱氧核糖核酸酶。由于这种要求，识别位点在任何给定基因组中通常仅出现一次。天然存在的大范围核酸酶识别15-40个碱基对切割位点，并且通常分为四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst box家族和HNH家族。大范围核酸酶可以通过使用本领域技术人员公知的技术修饰其识别序列来靶向特异性染色体序列。

在另一个实施方案中，靶向核酸内切酶可以是转录激活因子样效应物(transcription activator-like effector，TALE)核酸酶。TALE是来自植物病原体黄单胞菌属(Xanthomonas)的转录因子，其可以被容易地改造以结合新DNA靶标。TALE或其截短形式可与核酸内切酶(例如Fokl)的催化结构域连接以产生称为TALE核酸酶或TALEN的靶向核酸内切酶。

在又一个实施方案中，靶向核酸内切酶可以是位点特异性核酸酶。特别地，所述位点特异性核酸酶可以是“稀有切点(rare-cutter)”核酸内切酶，其识别序列很少出现在基因组中。优选地，所述位点特异性核酸酶的识别序列在基因组中仅出现一次。

在再一个实施方案中，靶向核酸内切酶可以是人工靶向的DNA双链断裂诱导剂(也称为人工限制性DNA切点)。例如，人工靶向的DNA双链断裂诱导剂可以包含切割DNA的金属/螯合剂复合物和至少一个与靶向切割位点互补的寡核苷酸。因此，人工靶向的DNA双链断裂诱导剂不含任何蛋白质。金属/螯合剂复合物的金属可以是铈、镉、钴、铬、铜、铁、镁、锰、锌等。金属/螯合剂复合物的螯合剂可以是EDTA、EGTA、BAPTA等。在一个优选的实施方案中，金属/螯合剂复合物可以是Ce(IV)/EGTA。在另一个优选的实施方案中，人工靶向的DNA双链断裂诱导剂可以包含Ce(IV)/EGTA复合物和两条假互补的肽核酸(PNA)链(Katada等，CurrentGene Therapy，2011，11(1)：38-45)。

在另一个实施方案中，核酸酶可以是归巢核酸酶。归巢核酸内切酶包括1-5’cel、l-Ceul、l-Pspl、Vl-Sce、l-SceTV、I-Csml、l-Panl、l-Scell、l-Ppol、l-Scelll、l-Crel、l-Tevl、1-Tev和I-7evIII。其识别序列是已知的。还参见美国专利No.5,420,032；美国专利No.6,833,252；Belfort e a/.(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Ou on等，(1989)Gene 82：115-118；Perler等，(1994)Nucleic Acids Res.22，1 125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等，(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等，(1998)J Mol.Biol.280：345-353和New England Biolabs目录。

在某些实施方案中，核酸酶包含工程化的(非天然存在的)归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)。归巢核酸内切酶和大范围核酸酶(例如，l-Scel、l-Ceul、VI-Pspl、Vl-See、l-ScelN、l-Csml、l-Panl、l-Scell、l-Ppol、l-Scelll、l-Crel、l-Tevl、l-Tevll和I-7evIII)的识别序列是已知的。还参见美国专利No.5,420,032；美国专利No.6,833,252；Belfort等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon ef a/.(1989)Gene 82：115-118；Perler等，(1994)Nucleic Acids Res.22，1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等，(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等，(1998)J.Mol.Biol.280：345-353和New England Biolabs目录。此外，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性可以被工程化以结合非天然靶位点。参见，例如，Chevalier等，(2002)Molec.Cell 10：895-905；Epinat等，(2003)Nucleic Acids Res.31：2952-2962；Ashworth等，(2006)Nature 441：656-659；Paques等，(2007)Current Gene Therapy 7：49-66；美国专利公开No.20070117128。归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合结构域可以作为整体在核酸酶的情况下改变(即，使得核酸酶包含同源切割结构域)或可以融合异源切割结构域。

在一个实施方案中，DNA消化剂是一组位点特异性核酸酶，或选自omega、锌指、TALE和CRISPR/Cas9。

D.标志物

在本发明的某些实施方案中，包含基因组DNA序列修饰的细胞或已用本发明的组合物转染的细胞可以在体外或体内通过在组合物中包含标志物来鉴定。这样的标志物将赋予细胞可鉴定的变化，使得容易鉴定已用所述组合物转染的细胞。通常，可选择的标志物是赋予允许选择的性质的标志物。阳性可选择标志物是其中标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性可选择标志物是其中标志物的存在阻止其选择的标志物。阳性可选择标志物的一个实例是耐药性标志物或抗生素抗性基因/标志物。

通常，药物选择标志物的内含物有助于转化体的克隆和鉴定，例如，赋予新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素、G418、腐草霉素、杀稻瘟菌素和组氨醇抗性的基因是可用的可选择标志物。除了赋予允许基于条件实施来区分转化体之表型的标志物之外，还考虑其他类型的标志物，包括可筛选标志物，例如GFP，其基础是比色分析。或者，可以利用可筛选的酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还知晓如何使用免疫标志物，可能与FACS分析结合。可选择和可筛选的标志物的其他实例是本领域技术人员公知的。在某些实施方案中，标志物是荧光标志物、酶促标志物、发光标志物、可光活化的标志物、光转换标志物或比色标志物。荧光标志物包括例如GFP和变体(例如YFP、RFP等)，以及其他荧光蛋白，例如DsRed、mPlum、mCherry、YPet、Emerald、CyPet、T-Sapphire和Venus。可光活化的标志物包括例如KFP、PA-mRFP和Dronpa。光转换标志物包括例如mEosFP、KikGR和PS-CFP2。发光蛋白包括例如Neptune、FP595和phialidin。筛选标志物的非限制性实例包括。

用于本发明的标志物可以在RNA或DNA上编码。在一个具体的实施方案中，标志物在RNA上编码。

在某些方面，在电穿孔后，通过阴性选择来选择已将电穿孔组合物内化的细胞。在另一些方面，在电穿孔后，通过阳性选择来选择已将电穿孔构建体内化的细胞。在一些方面，选择包括使细胞暴露于将损害在电穿孔期间未表达选择抗性基因或未获得选择抗性基因的细胞生存力之浓度的选择剂。在一些方面，选择包括使细胞暴露于条件致死浓度的选择剂。在某些方面，选择剂或化合物是抗生素。在另一些方面，选择剂是单独或组合的G418(也称为遗传霉素和G418硫酸盐)、嘌呤霉素、博来霉素、潮霉素、腐草霉素或杀稻瘟菌素。在某些方面，选择剂的浓度为0.1μg/L至0.5μg/L、0.5μg/L至1μg/L、1μg/L至2μg/L、2μg/L至5μg/L、5μg/L至10μg/L、10μg/L至100μg/L、100μg/L至500μg/L、0.1mg/L至0.5mg/L、0.5mg/L至1mg/L、1mg/L至2mg/L、2mg/L至5mg/L、5mg/L至10mg/L、10mg/L至100mg/L、100mg/L至500mg/L、0.1g/L至0.5g/L、0.5g/L至1g/L、1g/L至2g/L、2g/L至5g/L、5g/L至10g/L、10g/L至100g/L、或100g/L至500g/L或者可来源于其中的任何范围。在某些方面，选择剂的浓度为(y)g/L，其中’y’可以是任何值，包括但不限于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或可来源于其中的任何范围。在一些实施方案中，选择剂以如下的条件致死浓度存在于培养基中：约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10g/L或可来源于其中的任何范围。

在某些实施方案中，不管编码序列本身的长度如何，核酸区段可以与其他核酸序列(例如启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其他编码区段等)组合，以使得其总长度可明显变化。

E.载体

可在组合物中通过核酸分子编码多肽。在某些实施方案中，所述核酸分子可以是核酸载体的形式。术语“载体”用于指载体核酸分子，可将异源核酸分子插入其中以引入到细胞中，在所述细胞中其可被复制和表达。核酸序列可以是“异源的”，这意指其相对于将载体引入其中的细胞或将其并入的核酸来说是外来物的情况，其包括与细胞中的序列或核酸同源但是在宿主细胞或核酸内通常不存在的位置处的序列。载体包括DNA、RNA、质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)以及人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员将通过标准重组技术(例如，Sambrook等，2001；Ausubel等，1996；二者均通过引用并入本文)熟练地构建载体。载体可用于宿主细胞中以产生抗体。

术语“表达载体”是指包含编码至少部分基因产物之核酸序列的载体，所述载体能够被转录或能够稳定地整合到宿主细胞的基因组中并且随后被转录。在一些情况下，然后将RNA分子翻译为蛋白质、多肽或肽。表达载体可包含多种“控制序列”，其是指在特定的宿主生物体中有效连接的编码序列之转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了管理转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体也可包含还具有其他功能并且在本文中进行了描述的核酸序列。考虑到表达标志物的表达载体可用于本发明。在另一些实施方案中，在mRNA上而不在表达载体中编码标志物。

“启动子”是控制序列。启动子通常是控制转录的起始和速率的核酸序列区域。其可包含调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可结合在其上的遗传元件。短语“有效定位”、“有效连接”、“受到控制”和“受到转录控制”意指，启动子处于相对于核酸序列的正确功能位置和/或方向以控制转录起始和该序列的表达。启动子可以与“增强子”联合使用或者可不与“增强子”联合使用，“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。

不认为用于控制编码肽或蛋白质之多核苷酸的表达的特定启动子是关键的，只要其能够在靶细胞(优选细菌细胞)中表达多核苷酸即可。当靶向人细胞时，优选地将多核苷酸编码区置于邻近能够在人细胞中表达的启动子并受所述启动子控制。一般而言，这样的启动子可包括细菌、人或病毒启动子。

编码序列的有效翻译也可需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供包括ATG起始密码子的外源翻译调控信号。本领域普通技术人员将能够容易地对此进行确定并提供所需信号。

载体可包含多克隆位点(MCS)，其为包含多个限制性酶位点的核酸区域，任意所述限制性酶位点可与标准重组技术结合使用来消化所述载体(参见Carbonelli等，1999，Levenson等，1998和Cocea，1997，通过引用并入本文)。

大多数转录的真核生物RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录本除去内含子。包含真核生物基因组序列的载体可能需要供体和/或接受者剪接位点以确保正确加工转录本从而表达蛋白质(参见Chandler等，1997，通过引用并入本文。)。

载体或构建体通常包含至少一种终止信号。“终止信号”或“终止子”由通过RNA聚合酶参与RNA转录本的特定终止的DNA序列构成。因此，在某些实施方案中，考虑了结束RNA转录本产生的终止信号。终止子可能是在体内达到理想信使水平所必需的。在真核生物系统中，终止子区域还可包含特异性DNA序列，该序列允许新转录本的位点特异性切割以暴露多腺苷酸化位点。其发出信号使特化的内源聚合酶将一段约200个A残基(polyA)的序列添加至转录本的3’末端。经这种polyA尾修饰的RNA分子似乎更稳定并且更有效地翻译。因此，在涉及真核生物的另一些实施方案中，优选地，终止子包含用于RNA切割的信号，并且更优选地，终止子信号促进信使的多腺苷酸化。

在表达中，特别是在真核生物表达中，通常将包含多腺苷酸化信号以实现转录本合适的多腺苷酸化。

为了在宿主细胞中传播载体，其可包含一个或更多个复制起始位点(通常被称为“ori”)，其为复制起始处的特定核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，则可使用自主复制序列(ARS)。

一些载体可使用允许其在原核细胞和真核细胞两者中复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员将进一步了解孵育所有上述宿主细胞以维持它们并且使载体复制的条件。也了解并知晓允许大规模生产载体以及生产由载体编码的核酸及其同源多肽、蛋白质或肽的技术和条件。

在某些具体的实施方案中，通过电穿孔转染到细胞中的组合物是非病毒的(即不含任何病毒组分)。考虑到非病毒方法将降低毒性和/或提高该方法的安全性。考虑到小DNA寡核苷酸和作为RNA提供的DNA消化剂的组合使用提供了细胞毒性降低和基因组DNA序列修饰效率提高的优点。

F.核酸修饰

在本公开内容的上下文中，术语“未经修饰的寡核苷酸”通常是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚体或聚合物。在一些实施方案中，核酸分子是未经修饰的寡核苷酸。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间键构成的寡核苷酸。术语“寡核苷酸类似物”是指具有以与寡核苷酸类似的方式起作用的一个或更多个非天然存在部分的寡核苷酸。由于期望的特性，例如增强的细胞摄取、对其他寡核苷酸或核酸靶标增强的亲和力以及在核酸酶存在下提高的稳定性，因此相比于天然存在形式常常选择这样的非天然寡核苷酸。术语“寡核苷酸”可以用于指未经修饰的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。

核酸分子的具体实例包括含有经修饰的，即，非天然核苷间键的核酸分子。由于期望的特性，例如增强的细胞摄取、对其他寡核苷酸或核酸靶标增强的亲和力以及在核酸酶存在下提高的稳定性，因此相比于天然存在形式常常选择这样的非天然核苷间键。在一个具体的实施方案中，修饰包含甲基。

核酸分子可以具有一个或更多个经修饰的核苷间键。如本说明书中所限定的，具有经修饰的核苷间键的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键和不具有磷原子的核苷间键。出于本说明书的目的并且如本领域有时参考的，在其核苷间骨架中不具有磷原子的经修饰寡核苷酸也可以被认为是寡核苷。

核酸分子的修饰可包括其中修饰一个或两个末端核苷酸的修饰。

一种合适的含磷修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。许多其他经修饰的寡核苷酸骨架(核苷间键)是本领域已知的并且可用于本实施方案的上下文中。

教导制备含磷核苷间键的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697；5,625,050；5,489,677和5,602,240，其各自通过引用并入本文。

其中不包含磷原子的经修饰的寡核苷骨架(核苷间键)具有由短链烷基形成的核苷间键或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或者一个或更多个短链杂原子核苷间键或杂环核苷间键。这些包括具有酰胺骨架的那些；和其他，包括具有混合的N、O、S和CH2组分部分的那些。

教导制备上述不含磷的寡核苷的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，其各自通过引用并入本文。

寡聚化合物还可以包括寡核苷酸模拟物。当术语模拟物应用于寡核苷酸时，其旨在包括寡聚化合物，其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间键两者被新基团替代，仅呋喃糖环用例如吗啉代环的替代在本领域中也被称为糖替代物(sugar surrogate)。维持杂环碱基部分或经修饰的杂环碱基部分以与合适的靶核酸杂交。

寡核苷酸模拟物可以包括寡聚化合物，例如肽核酸(PNA)和环己烯基核酸(称为CeNA，参见Wang等，J.Am.Chem.Soc.，2000，122，8595-8602)。教导制备寡核苷酸模拟物的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其各自通过引用并入本文。另一类寡核苷酸模拟物被称为磷酸单酯核酸并在骨架中并入磷基团。据报道，这类寡核苷酸模拟物作为用于检测核酸的探针和作为用于分子生物学的助剂在抑制基因表达(反义寡核苷酸、核酶、有义寡核苷酸和三链体形成寡核苷酸)领域中具有有用的物理和生物学和药理学特性。已报道了另一种寡核苷酸模拟物，其中呋喃糖基环被环丁基部分替代。

核酸分子还可以包含一个或更多个经修饰或经取代的糖部分。维持碱基部分以与合适的核酸靶化合物杂交。糖修饰可赋予寡聚化合物核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。

代表性的经修饰的糖包括碳环糖或无环糖，在其2’、3’或4’位的一个或更多个上具有取代基的糖，具有替代糖的一个或更多个氢原子的取代基的糖，以及在糖中的任意两个其他原子之间具有键的糖。大量的糖修饰是本领域已知的，在2’位上修饰的糖和在糖的任意2个原子之间具有桥(使得所述糖为双环)的那些特别可用于本实施方案。可用于本实施方案的糖修饰的实例包括但不限于包含选自以下糖取代基的化合物：OH；F；O-、S-或N-烷基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是经取代或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。特别合适的是：2-甲氧基乙氧基(也称为2’-O-甲氧基乙基、2’-MOE或2’-OCH2CH2OCH3)；2’-O-甲基(2’-O-CH3)；2’-氟(2’-F)或具有连接4’碳原子与2’碳原子的桥连基的双环糖修饰的核苷，其中桥基实例包括--CH2--O--、--(CH2)2--O--或--CH2--N(R3)--O，其中R3是H或C1-C12烷基。

赋予提高的核酸酶抗性和对核苷酸极高的结合亲和力的一种修饰是2’-MOE侧链(Baker等，J.Biol.Chem.，1997，272，11944-12000)。2’-MOE取代的直接优点之一是提高结合亲和力，其大于许多类似的2’修饰，例如O-甲基、O-丙基和O-氨基丙基。具有2’-MOE取代基的寡核苷酸也已显示为基因表达的反义抑制剂，其具有用于体内使用的有前景的特征(Martin，P.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504；Altman等，Chimia，1996，50，168-176；Altmann等，Biochem.Soc.Trans.，1996，24，630-637；和Altmann等，NucleosidesNucleotides，1997，16，917-926)。

2’-糖取代基可以处于阿拉伯糖(arabino)(上)位或核糖(ribo)(下)位。一个2’-阿拉伯糖修饰是2’-F。类似的修饰也可以在寡聚化合物上的其他位置，特别是在3’末端核苷上或在2’-5’连接的寡核苷酸中的糖的3’位以及5’末端核苷酸的5’位上进行。寡聚化合物也可以具有例如以环丁基部分替代戊呋喃糖的糖模拟物。教导制备这样的经修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920，其各自通过引用整体并入本文。

代表性的糖取代基公开于标题为“Capped 2’-Oxyethoxy Oligonucleotides”的美国专利No.6,172,209中，其通过引用整体并入本文。

代表性的环状糖取代基公开于标题为“RNA Targeted 2’-Oligomeric compoundsthat are Conformationally Preorganized”的美国专利No.6,271,358中，其通过引用整体并入本文。

代表性的胍基取代基公开于标题为“Functionalized Oligomers”的美国专利No.6,593,466中，其通过引用整体并入本文。

代表性的乙酰胺基取代基公开于美国专利No.6,147,200中，其通过引用整体并入本文。

核酸分子还可以包含一个或更多个核碱基(本领域中常常简称为“碱基”)修饰或取代，所述核碱基修饰或取代在结构上可与天然存在或合成的未经修饰的核碱基区分开，但在功能上可与其互换。这样的核碱基修饰可赋予寡聚化合物核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。如本文使用的“未经修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。本文中也称为杂环碱基部分的经修饰的核碱基包括其他合成和天然的核碱基，所述合成和天然的核碱基的许多实例例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤等。

杂环碱基部分还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环替代的那些，例如，7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。一些核碱基包括美国专利No.3,687,808中公开的那些；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，第858-859页，Kroschwitz，J.I.，编辑.John Wiley&Sons，1990中公开的那些；由Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613公开的那些；以及由Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，编辑，CRC Press，1993公开的那些。这些核碱基中的某些特别可用于提高寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。

核酸分子的另外的修饰公开于美国专利公开2009/0221685中，其通过引用并入本文。本文还公开了核酸分子的另外的合适缀合物。

II.细胞培养

A.宿主细胞

如本文使用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。所有这些术语还包括新鲜分离的细胞和离体培养的活化的或扩增的细胞两者。所有这些术语还包括其后代，其后代是任何和所有接下来的代。应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代可以不相同。在表达异源核酸序列的上下文中，“宿主细胞”指的是原核细胞或真核细胞，并且其包括能够复制载体或表达由载体编码的异源基因之任何可转化的生物体。宿主细胞可以用作并且已经用作为载体或病毒的接受者。宿主细胞可以是“转染的”或“转化的”，其指的是通过其将外源核酸(例如重组的蛋白质编码序列)转移或引入到宿主细胞中的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。

在某些实施方案中，可以对任何原核细胞或真核细胞进行电穿孔。在一些方面，电穿孔涉及人细胞的电穿孔。在另一些方面，电穿孔涉及动物细胞的电穿孔。在某些方面，电穿孔涉及细胞系或杂交细胞类型的电穿孔。在一些方面，细胞或被电穿孔的细胞是癌细胞、肿瘤细胞或无限增殖化细胞。在一些情况下，诱导肿瘤、癌症、无限增殖化细胞或细胞系，而在另一些情况下，肿瘤、癌症、无限增殖化细胞或细胞系自然地进入其各自的状态或状况。在某些方面，被电穿孔的细胞或细胞系可以是A549、B细胞、B16、BHK-21、C2C12、C6、CaCo-2、CAP/、CAP-T、CHO、CHO2、CHO-DG44、CHO-K1、COS-1、Cos-7、CV-1、树突细胞、DLD-1、胚胎干(ES)细胞或衍生物、H1299、HEK、293、293T、293FT、Hep G2、造血干细胞、HOS、Huh-7、诱导性多能干(iPS)细胞或衍生物、Jurkat、K562、L5278Y、LNCaP、MCF7、MDA-MB-231、MDCK、间充质细胞、Min-6、单核细胞、Neur02a、NIH 3T3、NIH3T3L1、K562、NK细胞、NS0、Panc-1、PC12、PC-3、外周血细胞、浆细胞、原代成纤维细胞、RBL、Renca、RLE、SF21、SF9、SH-SY5Y、SK-MES-1、SK-N-SH、SL3、SW403、刺激触发获得多能性(Stimulus-triggered Acquisition ofPluripotency，STAP)细胞或衍生物SW403、T细胞、THP-1、肿瘤细胞、U2OS、U937、外周血淋巴细胞、扩增的T细胞、造血干细胞或Vero细胞。在一些实施方案中，细胞是外周血淋巴细胞、扩增的T细胞、干细胞、造血干细胞或原代细胞。在一些实施方案中，细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，细胞是外周血淋巴细胞。

在一些实施方案中，细胞是从患者分离的细胞。在一些实施方案中，细胞是新分离的。在一些实施方案中，使细胞在以下时间段内转染：小于或恰好20、19、18、17、16，15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1天或者小于或恰好24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1小时、或者可来源于其中的任何范围。在一些实施方案中，分离的细胞从未被冷冻。在一些实施方案中，分离的细胞从未在体外传代。在一些实施方案中，分离的细胞已传代小于或恰好10、9、8、7、6、5、4、3、2、1次或可来源于其中的任何范围。术语“传代”意指使细胞分裂以由预先存在的细胞产生大量细胞的过程。传代涉及使细胞分裂并将少数转移到每个新容器中。对于贴壁培养，首先需要使细胞脱离，通常用胰蛋白酶-EDTA的混合物进行。然后可以使用少量脱离的细胞来接种新培养物，同时丢弃剩余细胞。此外，通过将所有细胞分配到新烧瓶可以容易地扩大培养细胞的量。

在某些实施方案中，细胞是本领域中已知难以转染的细胞。这样的细胞是本领域中已知的，并且包括例如，原代细胞、昆虫细胞、SF9细胞、Jurkat细胞、CHO细胞、干细胞、缓慢分裂细胞和非分裂细胞。在一些实施方案中，细胞是生殖细胞，例如卵细胞或精细胞。在一些实施方案中，细胞是受精胚胎。在一些实施方案中，细胞是人受精胚胎。

在一些实施方案中，细胞可经受有限稀释方法以使得能够扩增细胞的克隆群。有限稀释克隆的方法是本领域技术人员公知的。已经描述将这样的方法例如用于杂交瘤，但是可应用于任何细胞。这样的方法描述于(Cloning hybridoma cells by limitingdilution，Journal of tissue culture methods，1985，第9卷，第3期，第175至177页，由Joan C.Rener，Bruce L.Brown和Roland M.Nardone)中，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，在电穿孔之前或电穿孔之后培养细胞。在另一些实施方案中，在电穿孔后的选择阶段期间培养细胞。在又一些实施方案中，在维持和克隆选择以及初始扩增阶段期间培养细胞。在再一些实施方案中，在筛选阶段期间培养细胞。在另一些实施方案中，在大规模生产阶段期间培养细胞。培养悬浮和贴壁细胞的方法是本领域技术人员公知的。在一些实施方案中，使用市售的细胞培养容器和细胞培养基在悬浮液中培养细胞。可用于一些实施方案中的市售培养容器的实例包括ADME/TOX板、细胞室载玻片(CellChamber Slides)和盖玻片、细胞计数装置、细胞培养表面(Cell Culture Surfaces)、Corning HYPERFlask细胞培养容器、包被的培养皿(Cultureware)、Nalgene低温皿(Cryoware)、培养室、培养皿、玻璃培养瓶、塑料培养瓶、3D培养器皿(format)、多孔培养板、培养板插入物、玻璃培养管、塑料培养管、可堆叠的细胞培养容器、低氧培养室、培养皿和烧瓶载体(flask carrier)、Quickfit培养容器，使用滚瓶、旋转瓶(Spinner Flask)、3D细胞培养或细胞培养袋的扩大细胞培养(Scale-UP Cell Culture)。

在另一些实施方案中，可使用本领域技术人员公知的组分配制培养基。培养细胞的制剂和方法详细描述于以下文献中：Short Protocols in Cell Biology J.Bonifacino等编辑，John Wiley&Sons，2003，第826页；Live Cell Imaging：A Laboratory ManualD.Spector&R.Goldman编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2004，第450页；StemCells Handbook S.Sell编辑，Humana Press，2003，第528页；Animal Cell Culture：Essential Methods，John M.Davis，John Wiley&Sons，3月16日，2011；Basic CellCulture Protocols，Cheryl D.Helgason，Cindy Miller，Humana Press，2005；Human CellCulture Protocols，系列：Methods in Molecular Biology，第806卷，Mitry，Ragai R.；Hughes，Robin D.(编辑)，第3版.2012，XIV，435，第89页，Humana Press；Cancer CellCulture：Method and Protocols，Cheryl D.Helgason，Cindy Miller，Humana Press，2005；Human Cell Culture Protocols，系列：Methods in Molecular Biology，第806卷，Mitry，Ragai R.；Hughes，Robin D.(编辑)，第3版.2012，XIV，435，第89页，Humana Press；Cancer Cell Culture：Method and Protocols，Simon P.Langdon，Springer，2004；Molecular Cell Biology.第4版，Lodish H，Berk A，Zipursky SL等，New York：W.H.Freeman；2000.，第6.2节Growth of Animal Cells in Culture，所有这些均通过引用并入本文。

在一些实施方案中，在筛选和扩增阶段期间和/或在大规模生产阶段(也称为补料分批和比较)期间，由选择或筛选得到的扩增的电穿孔细胞可以包含经修饰的基因组DNA序列。

III.治疗和药物发现应用

在某些实施方案中，由本文所述的方法产生的细胞和细胞系是在基因组DNA修饰后提供治疗效果的细胞和细胞系。原代细胞可以通过本文所述的方法分离、修饰并离体用于重新引入到待治疗的对象中。合适的原代细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、外周血淋巴细胞(PBL)和其他血细胞亚群，例如但不限于CD4+T细胞或CD8+T细胞。其他合适的原代细胞包括祖细胞，例如髓样祖细胞或淋巴样祖细胞。合适的细胞还包括干细胞，例如胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞和皮肤干细胞。例如，iPSC可由患有已知相关基因突变的患者离体获得，并且可以使用本文所述的方法将该突变修饰成野生型等位基因。然后可使经修饰的iPSC分化成多巴胺能神经元并重新植入患者体内。在另一个离体治疗应用中，可从患有已知基因突变的患者分离造血干细胞，然后可对其进行修饰以校正基因突变。然后可以将HSC施用回患者以获得治疗效果，或者可以在施用于患者之前使所述HSC在培养物中分化为更成熟的造血细胞。

在一些实施方案中，经修饰的基因组DNA序列包含疾病相关基因。疾病相关基因是本领域已知的。考虑到疾病相关基因是万维网上在genecards.org/cgi-bin/listdiseasecards.pl？type＝full&nolimit＝1上公开的基因。基因的完整列表以及其相关疾病通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，所述方法包括修饰造血干细胞(也称为成血细胞)或髓样祖细胞中的基因组DNA。

在一些实施方案中，所述方法包括修饰造血干细胞(也称为成血细胞)或髓样祖细胞中的HBB基因基因组DNA序列。在某些实施方案中，修饰序列以校正基因组序列中的疾病相关突变。例如，可以修饰患有镰状细胞贫血的对象的基因组序列以校正E6V突变。因此，本文所述方法可用于校正来自具有基因组突变的对象之细胞的基因组序列，所述基因组突变产生在第六位具有缬氨酸而不是谷氨酸的β-球蛋白蛋白质。因此，在一个实施方案中，序列修饰是将HBB基因的第六个密码子修饰为谷氨酸密码子的基因组DNA校正。

HBB基因的蛋白质编码序列示例于SEQ ID NO：19中：

MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH。

加下划线的谷氨酸代表蛋白质第六位上的氨基酸。在DNA水平下，基因组DNA包含GAG向GTG的突变，这产生了E6V突变体蛋白。

在一些实施方案中，所述方法包括修饰细胞中的gp91phox基因。在一些实施方案中，细胞是来自患者的自体细胞。在一些实施方案中，细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，所述方法用于治疗慢性肉芽肿病(chronic granulomatous disease，CGD)。

gp91phox基因的蛋白质编码序列由SEQ ID NO20示例：

mgnwavnegl sifvilvwlg lnvflfvwyy rvydippkff ytrkllgsal alarapaaclnfncmlillp vcrnllsflr gssaccstrv rrqldrnltf hkmvawmial hsaihtiahl fnvewcvnarvnnsdpysva lselgdrqne sylnfarkri knpegglyla vtllagitgv vitlclilii tsstktirrsyfevfwythh lfviffigla ihgaerivrg qtaeslavhn itvceqkise wgkikecpip qfagnppmtwkwivgpmfly lcerlvrfwr sqqkvvitkv vthpfktie lqmkkkgfkme vgqyifvkcp kvsklewhpftltsapeedf fsihirivgd wteglfnacg cdkqefqdaw klpkiavdgp fgtasedvfs yevvmlvgagigvtpfasil ksvwykycnn atnlklkkiy fywlcrdtha fewfadllql lesqmqernn agflsyniyltgwdesqanh favhhdeekd vitglkqktl ygrpnwdnef ktiasqhpnt rigvflcgpe alaetlskqsisnsesgprg vhfifnkenf(SEQ ID NO：20).

在一些实施方案中，所述方法将gp91phox基因外显子7上676位的核苷酸序列C校正为T。将gp91phox氨基酸位点226处的核苷酸“T”校正为“C”使该位点从终止密码子恢复为正确的Arg。因此，在一个实施方案中，序列修饰是将gp91phox基因的第226位密码子修饰为Arg密码子的基因组DNA校正。

在某些方面，本文所述的方法涉及用于离体治疗的改进方法。可以从对象分离细胞群，并且可以以校正缺陷的方式修饰细胞的基因组DNA。然后可以将细胞群移植到对象中用于治疗用途。在某些情况下，分离的细胞群可包含例如对某些体外操作(例如常规转染和/或电穿孔方法)敏感的细胞亚群，或者对常规转染和/或电穿孔法或基因组DNA操作具有抗性的细胞亚群。考虑到用本文所述的方法修饰基因组DNA将导致这样的群的序列修饰效率更高。

序列修饰效率在本文中也可以被称为编辑率(editing rate)。这可以通过编辑细胞的数目除以细胞总数来计算。在本文提供的实施例中，编辑率计算为(消化带的密度)/[(消化带的密度+亲本带的密度)。

本公开内容的一个方面涉及用于对从对象分离的细胞中的靶基因组DNA区进行位点特异性序列修饰或修改的方法，其包括：从对象分离细胞；用包含(a)DNA寡核苷酸和(b)DNA消化剂的组合物通过电穿孔转染所述细胞；其中供体DNA包含：(i)含有与所述靶基因组DNA区同源的核酸序列的同源区；和(ii)序列修饰区；并且其中所述基因组DNA序列在所述靶基因组DNA区被特异性修饰。在一个实施方案中，分离的细胞包含两种或更多种不同的细胞类型。

当用于本上下文中时，术语“不同的细胞类型”可意指来源于不同细胞谱系的细胞或来源于相同谱系但处于多能性或分化的不同阶段的细胞。在一个实施方案中，两种或更多种不同的细胞类型包含两种或更多种处于多能性或分化的不同阶段的细胞类型。在另一个实施方案中，细胞来自相同谱系但处于多能性或分化的不同阶段。

考虑到本文所述的方法不会对某些细胞群具有负面选择性。因此，在某些实施方案中，两种或更多种不同细胞类型之间的序列修饰效率差异小于1％。在另一些实施方案中，两种或更多种细胞类型之间的序列修饰效率差异小于2％、1.5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％。在另一些实施方案中，两种或更多种细胞类型之间的细胞生存力差异小于5％。在另一些实施方案中，两个细胞群之间的细胞生存力差异小于10％、7％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。

在一些具体实施方案中，分离的细胞是从对象骨髓分离的细胞。在另一个实施方案中，分离的细胞包含干细胞。所述干细胞可以是可从身体分离的任何干细胞。非限制性实例包括造血干细胞、间充质干细胞和神经干细胞。在一个具体的实施方案中，所述细胞是造血干细胞。在另一个实施方案中，分离的细胞包含细胞表面标志物CD34+。

另外，通过本文使用的方法产生的细胞和细胞系可用于药物开发和/或反向遗传研究。这样的细胞和动物可以揭示与特定突变或与其序列修饰有关的表型，并且可以用于筛选将与所讨论的突变或突变体蛋白特异性相互作用的药物或者可用于治疗患病动物的疾病的药物。因为细胞系及其相应的“修饰的”细胞系代表“遗传上相同的”对照，所以这些细胞系还可以为研究特定突变的作用提供工具，并因此为疾病特定突变的修复、药物筛选和发现以及疾病机制研究提供了有力的工具。进一步考虑到，例如该技术可为当前的基因敲减技术(例如RNAi和shRNA)提供科学上更优异的替代选择。在一个实例中，DNA序列修饰是被引入目的基因中以研究发育机制或疾病机制或者用于治疗应用的终止密码子。

IV.电穿孔

某些实施方案涉及使用电穿孔以促进一种或更多种核酸分子进入宿主细胞。

如本文使用的“电穿孔”或“电加载(electroloading)”是指将电流或电场施加至细胞以促进核酸分子进入细胞。本领域技术人员将理解，本发明包括电穿孔的任何方法和技术。

在本发明的某些实施方案中，可以按照以下描述的进行电加载，美国专利号5,612,207(通过引用明确并入本文)、美国专利号5,720,921(通过引用明确并入本文)、美国专利号6,074,605(通过引用明确并入本文)；美国专利号6,090,617(通过引用明确并入本文)；美国专利号6,485,961(通过引用明确并入本文)；美国专利号7,029,916(通过引用明确并入本文)、美国专利号7,141,425(通过引用明确并入本文)、美国专利号7,186,559(通过引用明确并入本文)、美国专利号7,771,984(通过引用明确并入本文)以及美国公开号2011/0065171(通过引用明确并入本文)。

在本发明的上下文中可使用的用于电加载的另一些方法和装置也描述于，例如，公开的PCT申请No.WO 03/018751和WO 2004/031353；美国专利申请No.10/781,440、10/080,272和10/675,592；以及美国专利No.6,773,669、6,090,617、6,617,154中，所有这些均通过引用并入。

在本发明的某些实施方案中，可按照于2002年8月21日提交的美国专利申请序列No.10/225,446中所描述的进行电穿孔，通过引用将其全部公开内容明确并入本文。

在本发明的另一些实施方案中，使用MaxCyteMaxCyte或MaxCyte流式电穿孔仪器进行流式电穿孔。在一些具体实施方案中，静态电穿孔或流式电穿孔与整个本公开内容中描述的参数一起使用。

要求保护的通过电穿孔(优选流式电穿孔)转染细胞的方法能够实现大于40％、大于50％及大于60％、70％、80％或90％(或可来源于其中的任何范围)的转染效率。可通过表达基因产物的细胞的百分比或由基因表达的产物的分泌水平来测量转染效率。在电穿孔过程中以及电穿孔过程之后，细胞维持高的生存力。生存力通常大于50％或更高。电穿孔细胞的生存力是开始未电穿孔群或转染了对照构建体的电穿孔群之生存力的至多或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％(或可来源于其中的任何范围)。

在一些实施方案中，本方法使用流式电穿孔设备以用于颗粒悬浮液的电刺激，所述设备包含具有一个或更多个流入口、一个或更多个流出口和一个或更多个流体通道的流式电穿孔单元组件(cell assembly)，所述流体通道由两个或更多个壁构成，所述流体通道被进一步被配置为接收和暂时容纳来自流入口的悬浮液中颗粒的持续流；以及相对于所述流体通道设置的成对电极，以使得每个电极形成所述流体通道的至少一个壁，所述电极还包括使电极与电能来源电联通，由此流过所述流体通道的颗粒的悬浮液可经受在电极之间形成的电场。

在一些实施方案中，本方法使用流式电穿孔来克服样品大小的限制。用这种方法，使细胞悬浮液通过包含在流动池(优选一次性的)中的平行棒电极。

在另一些实施方案中，使用本文所述的流式电穿孔或静态电穿孔方法来克服样品的热降解。应该理解的是，不同结构的池都可用于本方法。在电穿孔期间，使细胞经受具有预定特征的电脉冲。例如，用于制备样品细胞的具体设置为：电压，750V；脉冲宽度，650微秒；脉冲之间的时间，100微秒；在一个脉冲串(burst)中有2个双相脉冲；脉冲串之间的时间，12秒；流量，0.05mL/秒。然后分子或目的分子可随着浓度和/或电梯度扩散进细胞中。本发明任选地能够使细胞经受一定范围的电场强度。

本流式电穿孔法的另一个优点是可以转染大群细胞的速度。例如，可通过使样品在少于5小时，优选少于4小时且最优选少于3小时以及最优选少于2小时内进行电穿孔来通过电穿孔转染淋巴细胞群。电穿孔的时间是样品通过流式电穿孔过程处理的时间。在某些实施方案中，使用流式电穿孔在30分钟或更短的时间内转染1E10细胞。在另一些实施方案中，使用流式电穿孔在30分钟或60分钟或更短的时间内转染2E11细胞。

对于流式电穿孔，通过将流动池与具有必要的流体和样品的容器中的溶液和细胞悬浮液连接而起始该过程。通过向电穿孔系统提供所需的指令将预充液(Primingsolution)(盐水)和细胞悬浮液引入，其控制着泵和夹管阀(pinch valve)的运行。当细胞经过电极之间的流路时，施加选择了电压、持续时间和频率的电脉冲。将产物和废液收集在指定的容器中。

用户将所期望的电压及其他参数输入至本发明的流式电穿孔系统中。如上所述，可任选地使用一系列的设置。计算机与塔中的电子元件通讯以将电容器组充电至所期望的电压。然后由适当的开关操纵电压，之后将其递送至流路以产生电场(开关提供交替的脉冲或脉冲串以使由延长暴露于电场所带来的电极损耗最小化)。由操作者根据持续时间和频率参数设置将电压递送至本发明的流式电穿孔系统中。现在详细地描述本发明的流式电穿孔系统。

可以通过，例如使电穿孔室与容器中的溶液和细胞悬浮液流体连通(例如，通过管)来起始流式电穿孔过程，其可以在无菌或灭菌环境中进行。可使用一个或更多个泵、真空、阀、改变电穿孔室内部的气压或体积的其他机械装置以及其组合将细胞悬浮液和/或其他试剂引入至电穿孔室，这可导致细胞悬浮液和/或其他试剂以期望的时间和期望的速率流入电穿孔室中。如果一部分细胞悬浮液和/或其他试剂位于电穿孔室中，则具有期望的电压、持续时间和/或间隔的电脉冲被施加至细胞悬浮液和/或其他试剂。在电穿孔后，可使用一个或更多个泵、真空、阀、改变电穿孔室内部的位移、压力或体积的其他电力、机械、气动或微流体装置以及其组合将经处理的细胞悬浮液和/或其他试剂从电穿孔室移除。在某些实施方案中，重力或手动输送可用于移动样品或经处理的样品流入或流出电穿孔室。如果需要的话，可将新的细胞悬浮液和/或其他试剂引入至电穿孔室中。可以独立于还未被电穿孔的样品来收集电穿孔的样品。通过与例如电子电路(例如，提供电脉冲的电子电路)、泵、真空、阀、其组合以及实现和控制样品流进入和流出电穿孔室的其他组件偶联的计算机来暂时协调前述一系列事件。作为一个实例，电穿孔过程可由计算机来实施，包括由操作员通过监视器上的图形用户界面和/或键盘来实施。合适的阀的实例包括夹管阀、蝶阀和/或球阀。合适的泵的实例包括离心泵或正位移泵。

作为一个实例，流式电穿孔装置可包含由垫片隔开的至少两个电极，其中垫片与至少两个电极限定了腔。在一些实施方案中，电穿孔室还可包含穿过垫片的至少三个端口(port)，其中第一端口用于样品流入室，第二端口用于经处理的样品流出室，而第三端口用于非样品流体流入或流出室。在一些实施方案中，当样品流入室时，非样品流体流出室，而当经处理的样品流出室时非样品流体流入室。作为另一个实例，流式电穿孔装置可包含具有顶部和底部部分的电穿孔室，其包含至少两个平行的电极，所述室形成于这两个电极之间并且在电穿孔室的底部部分中具有两个室端口以及在电穿孔室的顶部部分中具有两个室端口。这样的装置还可包含通过室底部部分中之第一室端口与电穿孔室流体连通的至少一个样品容器，并且电穿孔室可通过室顶部部分的第二室端口与所述样品容器流体连通，从而形成第一流体通路。此外，至少一个产品容器可通过室底部部分中的第三室端口与电穿孔室流体连通，并且电穿孔室可通过室顶部部分中的第四室端口与所述产品容器流体连通，从而形成第二流体通路。在一些实施方案中，可使用单个端口的电穿孔室。在另一些实施方案中，可使用电极、垫片、端口和容器的多种其他合适的组合。电穿孔室可包含约1至10mL的内部体积；然而，在另一些实施方案中，电穿孔室可包含更小的内部体积(例如，0.75mL、0.5mL、0.25mL或更小)或者更大的内部体积(例如，15mL、20mL、25mL或更大)。在一些实施方案中，电穿孔室和相关的组件可以是一次性的(例如，医用等级VI材料)，例如PVC袋、PVC管、连接器、硅泵管(silicone pump tubing)等。

任何数目的容器(例如，1、2、3、4、5、6或更多)都可与电穿孔室流体连通。所述容器可以是可收缩、可扩展或固定体积的容器。例如，第一容器(例如，样品来源或样品容器)可包含细胞悬浮液并且可以包含或不包含在电穿孔期间进入细胞悬浮液之细胞中的物质。如果不包含所述物质，则可包括包含该物质的第二容器以使得所述物质在进入电穿孔室之前在管线内(inline)混合或在电穿孔室中混合。在另一种配置中，可连接另一个容器，所述容器可容纳将被丢弃的流体。一个或更多个额外容器可用作经处理的样品或产品的容器。经处理的样品或产物的容器将保留细胞或电穿孔过程产生的其他产物。此外，一个或更多个额外容器可包含多种非样品流体或气体，所述非样品流体或气体可用于将样品分离成离散体积或单位体积。非样品流体或气体的容器可通过第三端口和/或第四端口与电穿孔室流体连通。非样品流体或气体的容器可以被并入经处理样品的容器或样品的容器中(例如，非样品流体的容器可包含一部分经处理样品的容器或样品的容器)；因此，在样品的处理过程中，非样品流体或气体可以从经处理样品的容器传送至另一个容器(其可包括样品的容器)中。非样品流体或气体的容器可以被并入室，只要非样品流体或气体的压缩不影响电穿孔即可。本发明的另一些方面可包括偶联至样品的容器并且可向室提供试剂或其他样品的其他容器。

在另一些实施方案中，电穿孔装置是静态电穿孔并且不涉及细胞流动，但相反涉及单个室中的细胞悬浮液。当使用这样的装置时，对于流式电穿孔描述的参数可用于限制热降解、提高细胞生存力、提高序列修饰整合效率、提高转染效率等。这样的参数包括例如整个申请中描述的流式电穿孔参数和室的热阻、电极间距、与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比、以及电场。

特别考虑到，可以排除本文所述的实施方案。进一步考虑到，当描述范围时，可以排除某些范围。

在某些方面，电穿孔期间的细胞密度是受控变量。电穿孔期间的细胞密度可能会变化或根据但不限于以下而变化：细胞类型、期望的电穿孔效率或期望的所得电穿孔细胞的生存力。在某些方面，整个电穿孔过程中细胞密度是恒定的。在另一些方面，在电穿孔过程期间细胞密度是变化的。在某些方面，电穿孔前的细胞密度可以为1×10⁴细胞/mL至(y)×10⁴，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一些方面，电穿孔前的细胞密度可以为1×10³细胞/mL至(y)×10⁵，其中y是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔前的细胞密度可以为1×10⁶细胞/mL至(y)×10⁶，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某些方面，电穿孔前的细胞密度可以为1×10⁷细胞/mL至(y)×10⁷，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10或者可来源于其中的任何范围。在另一些方面，电穿孔前的细胞密度可以为1×10⁷细胞/mL至1×10⁸细胞/mL、1×10⁸细胞/mL至1×10⁹细胞/mL、1×10⁹细胞/mL至1×10¹⁰细胞/mL、1×10¹⁰细胞/mL至1×10¹¹细胞/mL或1×10¹¹细胞/mL至1×10¹²细胞/mL。在某些方面，电穿孔前的细胞密度可以为(y)×10⁶，其中y可以是以下的任何值：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100或者可来源于其中的任何范围。在某些方面，电穿孔前的细胞密度可以为(y)×10¹⁰，其中y可以是以下的任何值：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000(或可来源于其中的任何范围)。

在某些方面，电穿孔期间的细胞密度是受控变量。电穿孔期间，细胞的细胞密度可能会变化或根据但不限于以下而变化：细胞类型、期望的电穿孔效率或期望的所得电穿孔细胞的生存力。在某些方面，在整个电穿孔过程中细胞密度是恒定的。在另一些方面，在电穿孔过程期间细胞密度是变化的。在某些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为1×10⁴细胞/mL至(y)×10⁴，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为1×10⁵细胞/mL至(y)×10⁵，其中y是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为1×10⁶细胞/mL至(y)×10⁶，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为1×10⁷细胞/mL至(y)×10⁷，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为1×10⁷细胞/mL至1×10⁸细胞/mL、1×10⁸细胞/mL至1×10⁹细胞/mL、1×10⁹细胞/mL至1×10¹⁰细胞/mL、1×10¹⁰细胞/mL至1×10¹¹细胞/mL或1×10¹¹细胞/mL至1×10¹²细胞/mL。在某些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为(y)×10⁶，其中y可以是以下的任何值：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，电穿孔期间的细胞密度可以为(y)×10¹⁰，其中y可以是以下的任何值：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000(或可来源于其中的任何范围)。

在某些方面，电穿孔后的细胞密度可以为1×10⁴细胞/mL至(y)×10⁴，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔后的细胞密度可以为1×10³细胞/mL至(y)×10⁵，其中y是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔后的细胞密度可以为1×10⁶细胞/mL至(y)×10⁶，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，电穿孔后的细胞密度可以为1×10⁷细胞/mL至(y)×10⁷，其中y可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，电穿孔后的细胞密度可以为1×10⁷细胞/mL至1×10⁸细胞/mL、1×10⁸细胞/mL至1×10⁹细胞/mL、1×10⁹细胞/mL至1×10¹⁰细胞/mL、1×10¹⁰细胞/mL至1×10¹¹细胞/mL或1×10¹¹细胞/mL至1×10¹²细胞/mL(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，电穿孔后的细胞密度可以为(y)×10e6，其中y可以是以下的任何值：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100(或可来源于其中的任何范围)。在某些方面，电穿孔后的细胞密度可以为(y)×10¹⁰，其中y可以是以下的任何值：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000(或可来源于其中的任何范围)。

在某些实施方案中，可以对任何原核细胞或真核细胞进行电穿孔。在一些方面，电穿孔涉及人细胞的电穿孔。在另一些方面，电穿孔涉及动物细胞的电穿孔。在某些方面，电穿孔涉及细胞系或杂交细胞类型的电穿孔。在一些方面，细胞或被电穿孔的细胞是癌细胞、肿瘤细胞或无限增殖化细胞。在一些情况下，诱导肿瘤、癌症、无限增殖化细胞或细胞系，而在另一些情况下，肿瘤、癌症、无限增殖化细胞或细胞系自然地进入其各自的状态或状况。在某些方面，被电穿孔的细胞或细胞系可以是A549、B细胞、B16、BHK-21、C2C12、C6、CaCo-2、CAP/、CAP-T、CHO、CHO2、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-DUXB11 COS-1、Cos-7、CV-1、树突细胞、DLD-1、胚胎干(ES)细胞或衍生物、H1299、HEK、293、293T、293FT、Hep G2、造血干细胞、HOS、Huh-7、诱导性多能干(iPS)细胞或衍生物、Jurkat、K562、L5278Y、LNCaP、MCF7、MDA-MB-23l、MDCK、间充质细胞、Min-6、单核细胞、Neuro2a、NIH 3T3、NIH3T3L1、NK细胞、NS0、Panc-1、PC12、PC-3、外周血细胞、浆细胞、原代成纤维细胞、RBL、Renca、RLE、SF21、SF9、SH-SY5Y、SK-MES-1、SK-N-SH、SL3、SW403、刺激触发获得多能性(STAP)细胞或衍生物SW403、T细胞、THP-1、肿瘤细胞、U2OS、U937或Vero细胞。

在某些实施方案中，细胞是本领域中已知难以转染的细胞。这样的细胞是本领域中已知的，包括例如，原代细胞、昆虫细胞、SF9细胞、Jurkat细胞、CHO细胞、干细胞、缓慢分裂细胞和非分裂细胞。

在一些情况下，在一定量的时间内可电穿孔一定数目的细胞。考虑到所描述平台的灵活性、一致性和再现性，在少于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100秒(或可来源于其中的任何范围)内，可电穿孔多至或大于约(y)×10⁴、(y)×10⁵、(y)×10⁶、(y)×10⁷、(y)×10⁸、(y)×10⁹、(y)×10¹⁰、(y)×10¹¹、(y)×10¹²、(y)×10¹³、(y)×10¹⁴或(y)×10¹⁵个细胞(或可来源于其中的任何范围)，其中y可以是以下的任何值：1、2、3、4、5、6、7、8或9(或可来源于其中的任何范围)。在另一些情况下，在少于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120分钟(或可来源于其中的任何范围)内，可电穿孔多至或大于约(y)×10⁴、(y)×10⁵、(y)×10⁶、(y)×10⁷、(y)×10⁸、(y)×10⁹、(y)×10¹⁰、(y)×10¹¹、(y)×10¹²、(y)×10¹³、(y)×10¹⁴或(y)×10¹⁵个细胞(或可来源于其中的任何范围)，其中y可以是以下的任何值：1、2、3、4、5、6、7、8或9(或可来源于其中的任何范围)。在另一些方面，在少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时(或可来源于其中的任何范围)内，可电穿孔多至或大于约(y)×10⁴、(y)×10⁵、(y)×10⁶、(y)×10⁷、(y)×10⁸、(y)×10⁹、(y)×10¹⁰、(y)×10¹¹、(y)×10¹²、(y)×10¹³、(y)×10¹⁴或(y)×10¹⁵个细胞(或可来源于其中的任何范围)，其中y可以是以下的任何值：1、2、3、4、5、6、7、8或9(或可来源于其中的任何范围)。

表达式“(y)×10^e”理解为意指可取任何数值的变量“y”乘以被升至指数值e的10。例如，(y)×10⁴，当y是2时，应理解为意指2×10⁴，这相当于2×10,000，等于20,000。(y)×10e4也可以写为(y)＊10e4或(y)×10⁴或(y)＊10⁴。

细胞或培养基的体积可根据待电穿孔的细胞的量、待筛选的细胞的数目、待筛选的细胞的类型、将要产生的蛋白质的类型、所期望的蛋白质的量，细胞生存力以及与所期望的细胞浓度相关的某些细胞特征而变化。在方法和组合物中可使用的体积的实例包括但不限于：0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000mL或L(或可来源于其中的任何范围)，以及可来源于其中的任何范围。考虑将可容纳这样体积的容器用于本文所述的实施方案中。这样的容器包括但不限于：细胞培养皿、培养皿、烧瓶、生物袋、生物容器、生物反应器或瓮(vat)。特别考虑用于大规模体积的容器，例如能够容纳大于10L或更大的那些。在某些实施方案中，使用100L或更大的体积。

特别考虑到，通过本文所述的方法电穿孔细胞提供效率提高和/或毒性降低的益处。这样的测量可以通过测量并入基因组DNA序列修饰的细胞的量，测量表达标志物的细胞的量和/或测量电穿孔后细胞的生存力来进行。

在一些实施方案中，序列修饰效率大于约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或80％。可通过测定具有序列修饰的细胞的数目并除以细胞总数来测量序列修饰效率。基因组DNA序列修饰的并入可以通过本领域已知的方法测定，例如直接基因组DNA测序、差异限制性消化(如果序列修饰添加、去除或改变限制酶位点)、凝胶电泳、毛细管阵列电泳、MALDI-TOFMS、动态等位基因特异性杂交、分子信标、限制性片段长度多态性、引物延伸、温度梯度凝胶电泳等。

在另一些实施方案中，电穿孔后的细胞生存力为至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或95％。细胞生存力可以通过本领域已知的方法测量。例如，可以通过细胞计数装置在电穿孔之前和之后对细胞进行计数。在另一些实施方案中，测量凋亡。认为引入大量的核酸可诱导凋亡。考虑到本文所述的方法较本领域中的其他方法将导致更少的凋亡。在某些实施方案中，在电穿孔后显示出凋亡的细胞的量小于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。凋亡是指程序性细胞死亡的特定过程并且可以通过本领域已知的方法测量。例如，凋亡可以通过膜联蛋白V测定、激活的胱天蛋白酶3/7检测测定和凋亡测定(Life Technologies)来测量。

在另一些实施方案中，表达编码标志物之核酸的细胞百分比大于约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。

当本公开内容的一个特定实施方案包括如本文所述的范围或特定值时，特别考虑到，范围和特定值(即，浓度、核酸长度和百分比)可在本发明的一些实施方案中排除。也考虑到，当本公开内容包括要素(例如，细胞类型)列表时，本发明的实施方案可明确地排除列表中的一个或更多个要素。

VI.实施例

包括以下实施例以证明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应当理解，在以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明实践中良好地发挥作用的技术，并因此可被认为构成用于其实践的优选方式。然而，鉴于本公开内容，本领域技术人员应当理解，可在所公开的具体的实施方案中做出很多变化，并且仍然得到相同或相似的结果而不偏离本发明的精神和范围。

实施例1-

细胞培养：使冷冻保存的PBMC解冻并在RPMI-1640+10％FBS+100u/ml rhlL-2+抗生素中培养过夜。除去组织培养瓶中的附着细胞。在RPMI-1640+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+抗生素中培养K562。在DMEM+10％FBS+抗生素中培养成纤维细胞。通过Dynalbeads HumanT-Activator CD3/CD28(Invitrogen，Carlsbad CA)按照活化试剂盒的方案活化扩增的T细胞。在活化后3-6天转染细胞。

电穿孔：直接收集PBL、扩增的T细胞或K562细胞或者用胰蛋白酶消化收集成纤维细胞。在用MXCT EP缓冲液洗涤后，将细胞与mRNA(200ug/ml Cas9和100ug/ml gRNA，或100ug/ml GFP)和/或单链DNA寡核苷酸(100ug/ml，除非另有说明)混合并进行电穿孔。EP孵育后20分钟之后，将细胞培养2-5天，之后收集细胞沉淀用于基因修饰测定。

基因组DNA提取：使用Purelink基因组DNA Mini试剂盒(Invitrogen，CarlsbadCA)提取基因组DNA。在使用前将提取的基因组DNA保存在-4℃冷藏室中。

基因修饰测定：通过使用SURVEYOR突变检测试剂盒(Trangenomic，Omaha NE)按照该公司提供的试剂盒的方案进行Cel-1测定以测定基因基因组DNA编辑。通过HindIII消化测定HindIII识别的6个核苷酸的整合。用10％TBE凝胶(Invitrogen，Carlsbad CA)分析样品。

CRISPR(Cas9和gRNA)：靶向SSAV1安全港位点(safe harbor site)上的特异性5′GGGGCCACTAGGGACAGGAT TGG 3′(SEQ ID NO：21)位点的Cas9和gRNA的整个试剂盒购自Washington University in St.Luise Genome Engineering Center。试剂盒中包含用于扩增含有gRNA靶位点的基因组DNA区段的引物(F-5’TTCGGGTCACCTCTCACTCC 3’(SEQ IDNO：22)；R-5’GGCTCCATCGTAAGCAAACC 3’(SEQ ID NO：23))。将约468bp扩增子用于进一步的Cel-1测定和HindIII消化测定，如果发生基因组DNA修饰，则其消化将产生各自约170bp和298bp的两条带。

CRISPR mRNA：用mMESSAGET7 Ultra试剂盒(Invitrogen，Carlsbad CA)由购自Washington University in St Luise的模板质粒DNA制备mRNA。

单链寡聚体：寡核苷酸的序列如下：

实施例2

为了证实所述方法适用于疾病相关基因，测试了限制酶位点是否可以整合在镰状细胞病基因座基因HBB上。在RPMI-1640+10％FBS+2mML-谷氨酰胺+抗生素中培养K562细胞，所述K562细胞是来自慢性骨髓性白血病患者的骨髓来源细胞系。然后根据实施例1中描述的方法对细胞进行电穿孔，使用用于双链DNA切割的Cas9质粒(Addgene质粒#43945)、靶向镰状细胞病(SCD)位点的引导RNA质粒(5′AGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGG 3’(SEQ ID NO：28))，以及用于整合Hind III限制酶位点(加下划线的)(5′tgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatggtgcatctgactcctgAAGCTTggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatca 3′’)(SEQ ID NO：29).的单链寡核苷酸的DNA供体序列。

用与T7启动子缀合的引物通过PCR扩增来制备gRNA模板。引物是

Cel-1.F：5-TTAATACGACTCACTATAGGAGTCTGCCGTTACTGCCCTG-3(SEQ ID NO：30)和Cel-1.R：5-AAAAGCACCGACTCGGTGCC 3(SEQ ID NO：31)。通过Cas9质粒的核酸内切酶线性化(Xhol 1)获得Cas9模板。通过mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA试剂盒(Ambion)制备mRNA。在电穿孔细胞后，如实施例1所述进行基因组DNA提取和测试。

首先测试整合特异性。如预期的，显示出具有靶向AAVS1位点的gRNA的寡核苷酸整合到靶AAVS1位点中而不是SCD基因座中(图14)。接着测试在SCD基因座上是否实现位点特异性整合。如图15A-B所示，将引导RNA直接转染至AAVS1位点和SCD基因座导致在这些位点上成功的基因组修饰。图15B举例说明了可以在疾病相关基因座处对基因组DNA进行位点特异性修饰。

实施例3

本文所述的方法可用于校正患者造血干细胞(HSC)中的致病突变以治愈遗传疾病。本实施例描述了校正慢性肉芽肿病(CGD)中的突变以治愈这种疾病的方法。该疾病不仅证明了本文所述的基因治疗方法的概念验证，而且提出了该疾病的治疗方法(其迄今为止仍然是未解决的挑战)。由于CGD中的遗传突变是公知的，因此具有该疾病的细胞的体外功能测定技术已成熟，建立了CGD的动物模型，并且低校正百分比可导致显著的临床功效。非病毒方法将用于递送编码CRISPR(Cas9和gRNA对)的信使RNA(mRNA)和靶向位于gp91phox基因外显子7上676位处中最普遍的突变(‘热点’)的DNA寡聚体以将点突变从‘T’(其导致疾病表型)转变为‘C’(其在正常细胞中普遍)。通过使用MaxCyte的cGMP和调整相容的封闭系统流式电穿孔平台将促进CRISPR的递送。

如果可示出以临床相关功效校正作为模型疾病的CGD中的突变，则本文所述方法的这种概念验证将有效地验证作为潜在治愈性疗法的技术平台以扩展治愈多种其他疾病(其中疾病与已知突变相关)的相同方法。此外，由于MaxCyte流式转染系统是符合GMP的FDA-Master-File支持的大体积转染技术平台并且已通过当前的临床试验和商业化验证，因此该提出的研究的成功不仅可以容易地转化成对于CGD的临床研究和商业化，而且可以转化成对于许多其他遗传疾病的临床研究和商业化。

HSC是用于治愈CGD的最佳选择并且将用于该方案中。校正自体HSC中的突变基因的基因治疗对于治愈遗传疾病具有最佳潜力。对于CGD，已在临床上发现HSC是对抗这种疾病的正确的候选物。迄今为止，已在临床上测试了使用自体HSC的CGD基因治疗，所述自体HSC由编码通过组成型启动子驱动的疾病基因/cDNA的病毒载体转导。该方法已证明了对患者已产生显著临床益处的从基因组内随机整合位点进行基因整合和表达的可行性，即使具有＜1％-5％的表达校正基因的细胞。然而，由于不能控制基因整合到基因组中的位置，以及干细胞中cDNA的组成型表达，因此关于常规基因治疗的一个主要问题是插入诱变风险，所述表达将导致所有子谱系表达cDNA，甚至是当在正常健康情况下时可能不表达该基因的那些细胞表达cDNA。

非病毒方法具有其优点。然而，通过非病毒转染方法的大多数造血细胞中DNA质粒转染的高细胞毒性和低转染效率阻碍了非病毒转染方法用于HSC转染。通过十多年的研究，发现使用电穿孔进行转染的高细胞毒性和低转染效率是由于DNA摄取介导的凋亡/细胞焦亡(pyroptosis)，而不是电穿孔介导的细胞杀伤。为了将非病毒转染方法应用于基因治疗，必须找到有效转染转基因并提高细胞存活的方式。

已发现mRNA转染是以低细胞毒性表达转基因的有效方式。mRNA转染的瞬时表达特征对于许多应用是有利的，例如CRISPR、TALEN或ZFN核酸酶的强制表达。通过mRNA制剂中核酸酶的电穿孔之基因组DNA中的有效特异性基因编辑促进了该方法的进一步应用。在mRNA制剂中使用核酸酶电穿孔之几个成功的IND申请的批准是很好的实例。对于mRNA转染用于临床试验的这些目前的应用，有意避免DNA材料以降低细胞毒性。因此，通过基因插入缺失(gene indel)在基因敲除应用领域中巧妙地设计该应用。当前的非病毒转染仍然不能应用于将基因或核苷酸添加到基因组DNA中。

本文所述的当前发现表明，即使质粒DNA摄取介导高的细胞毒性，单链DNA寡聚体的转染仍不诱导细胞毒性。该发现允许非病毒方法作为替代基因治疗中cDNA的组成型表达的替代方式用于单核苷酸突变或几个核苷酸突变的基因校正，这将显著地解决诱变问题和当前基因治疗方法中担忧的某些子谱系中不期望的表达。由于大多数遗传疾病涉及单核苷酸突变或几个核苷酸突变，因此该基因校正方法对于对抗遗传疾病可能是非常重要和实用的。转换成mRNA制剂和作为用于CGD HSC中基因校正的供体DNA之DNA单链寡聚体中的核酸酶转染(在本方案中作为一个实例的CRSPR)不仅对于CGD而且对于其他遗传疾病的基因治疗提供了最低的风险和高的有前景结果。

研究设计

遗传疾病对于我们的社会是一个未解决的挑战。已经用仅控制症状的能力，例如使用抗菌/抗真菌预防、用于CGD的IFN-γ和用于镰状细胞病的输血来治疗大多数遗传疾病(例如CGD或镰状细胞病)。尽管抗生素/抗真菌治疗对于CGD患者取得了显著进步，但缺乏有效的治愈疾病的方法，CGD患者不幸地出现了严重甚至致命的复发性感染。干细胞移植可以治愈这种疾病，但其需要严格匹配的供体，而这样的供体很难找到，限制了适用性。

使用离体的突变校正的自体HSC的基因治疗已经证明了对患者有益的功效，提高了治愈遗传疾病的希望。迄今为止，这种方法(使用病毒作为基因递送方法)主要使用编码突变亚基的全部cDNA与启动子以组成型表达用于临床试验的治疗性蛋白质。这种方法在整个基因组中随机整合的安全性和所有子谱系(其中一些可能不自然地表达蛋白质)的恒定表达是很大的问题，导致可能的插入诱变并且可能是一些未知的子序列。

用于校正自体HSC基因组之特定突变位点处的突变核苷酸的非病毒方法在插入诱变、基因表达沉默、病毒感染细胞的耗尽和基因表达调节问题中具有更少的问题。然而，因为非病毒方法在生存力和转染效率方面的效力均太低，所以迄今为止非病毒方法在基因治疗中不受欢迎。然而，通过使用核酸酶(TALEN或CRISPR)，近来申请人发现，电穿孔可以介导将核苷酸有效整合到靶基因组位点中、有效校正特定的突变核苷酸，以及在许多不同的细胞类型(包括HSC)中表型从突变细胞有效逆转到功能性蛋白质表达细胞而没有显著的细胞毒性，其效率比目前报道的高得多，因此重新点燃使用非病毒方法用于基因治疗的希望。此外，由MaxCyte开发的基于电穿孔的符合cGMP的可扩展基因递送技术可以容易地将该发现转化为临床试验和潜在的商业化。

慢性肉芽肿病(CGD)是一组遗传性疾病，其中吞噬细胞不产生用于杀伤某些病原体的活性氧化合物(最重要的是超氧化物自由基)。在美国CGD在200,00人中影响约1人，每年诊断出约20例新病例。CGD管理包括早期诊断、患者教育以及用于预防和治疗感染的抗生素。复发性感染和炎症的发病率是一个主要问题，每年感染率为约0.3。来自匹配供体的造血干细胞(HSC)移植是有疗效的但具有重大相关风险(移植物排斥、移植物抗宿主病、化疗相关毒性)和匹配供体的可用性。已在临床上测试了使用自体干细胞的基因治疗，所述自体干细胞由编码通过组成型启动子驱动的疾病基因/cDNA的病毒载体转导。这种方法已证明了对患者已产生显著益处的从基因组内随机整合位点进行基因整合和表达的可行性。然而，关于常规基因治疗的主要问题是由于不能控制基因整合到基因组中的位置而导致的插入诱变风险。

本文所述的组合物和方法可用于CGD患者中突变的靶向校正。可以使用具有特异性靶向CGD患者HSC中各个突变之校正序列的基于信使RNA的非病毒位点特异性基因编辑工具(CRISPR/Cas9酶)。使用本文所述的方法，可开发非病毒的位点特异性离体基因修饰的细胞疗法作为CGD的治疗。

开发用于CGD突变的位点特异性校正的方案：第一靶标校正将是通过首先使用来自患者的EBV转化的B细胞之gp91phox中外显子7中676位上C至T的最普遍的突变(“热点”)。在此特定CGD中，将氨基酸位点226上的核苷酸“T”校正为“C”使该位点从终止密码子恢复为正确的Arg，并且可以通过gp91表达量化校正细胞的表达并通过测序确认。

确认CGD患者HSC中的功能性基因校正：可以获得来自具有特定C676T突变之CGD患者的自体HSC。可以对转染过程进行优化，并且可以使用本文所述的方法校正突变基因。校正效率可通过如下确定：体外检测gp91表达和超氧化物产生的功能恢复，随后在异种移植模型中进行小鼠移植研究以评估这样的校正患者HSC的植入以及从小鼠回收的人细胞中功能的恢复。

用于临床翻译的扩大制造过程：可以获得来自合适CGD患者的自体HSC。然后可以在扩大的符合cGMP的制造过程中校正突变基因。然后可以检查校正效率和体外功能恢复。

经过几十年的研究，申请人等发现，DNA转染对大多数造血细胞具有细胞毒性，这已成为阻止非病毒方法有效用于基因治疗的最大障碍。申请人确定DNA是细胞毒性来源，而不是如通常直观认为的电穿孔。找到有效转染但具有低细胞毒性和高转染效率的适当替代选择已是我们长期以来的目标。申请人是首先倡导mRNA转染并发现mRNA转染满足要求的首批团体之一。如图17所示，在形态学上，HSC的流式电穿孔转染可通过mRNA介导高的转染效率和低的细胞毒性。

如图10A-D所示，不同的mRNA浓度(导致比通过质粒DNA高得多的转染效率)均得到比用DNA质粒转染的那些更高的细胞生存力。GFP-mRNA转染相对于对照细胞显示出高生存力(图10A)、高转染效率(图10C-D)、相同的细胞增殖速率(图10B)，但DNA质粒引起高细胞毒性(图10A)、延迟的细胞增殖(图10B)和更低的转染效率(图10C-D)。

申请人进一步证实，不仅mRNA有利于转染，单链DNA寡聚体也不引起细胞毒性，这开启了通过非病毒方法进行基因校正的可能性。如图11所示，通过mRNA和单链寡聚体的HSC的流式电穿孔转染具有高转染效率和低细胞毒性。用MAXCYT流式电穿孔技术转染HSC。对照和GFP-mRNA转染得到类似的生存力(图11B)、增殖(图11C)。CRISPR(cas 9(c)和gRNA(g))和单链寡聚体(25mer、50mer、70mer和100mer)的转染都显示出类似的生存力和增殖，但略低于对照细胞。然而，细胞维持了高的生存力和增殖(相对于对照细胞≥80％)，证明了HSC中c+g+寡核苷酸转染的高生存力。

mRNA转染不仅具有低的细胞毒性，其还在转染后介导有效功能。如图18所示，流式电穿孔介导HSC中AAVS1位点上的有效基因编辑。获得了约50％的基因编辑。此外，在转染中组合使用CRISPR和单链DNA寡核苷酸还可以介导有效的核苷酸整合，所述核苷酸整合是基因校正所需的同源重组过程。如图13A-B所示，流式电穿孔介导核苷酸有效整合到HSC的AAVS1位点中。实现在HSC的特定基因组位点上的有效核苷酸整合。6-核苷酸Hind III识别序列的整合是寡聚体大小和浓度依赖性的。其可以在HSC中达到高达约40％的整合。

通过CRISPR和单链DNA寡聚体转染的核苷酸整合可以直观地被认为不同于核苷酸校正，其不增加核苷酸长度。基因校正还将不同于正确功能性蛋白质的基因表达的校正。为了通过概念验证进一步说明，申请人证明了CRISPR和单链寡聚体的mRNA转染不仅可以介导基因整合、基因校正，而且还可以介导表型逆转以具有功能基因表达。如图19所示，流式电穿孔在CGD患者EBV转化的B细胞中介导gp91表达的有效恢复。在相同EBV转化的B细胞中HindIII识别6核苷酸整合的实际速率比gp91表达细胞的速率高得多(数据未示出)。这也在患者HSC中以高效率(＞5％；数据未示出)成功地进行。

以下方法可用于校正患者中的CGD：首先可以通过首先使用来自患者的EBV转化的B细胞靶向gp91phox中外显子7中676位上C至T的最普遍的突变(“热点”)。在此特定CGD中，将氨基酸位点226上的核苷酸“T”校正为“C”使该位点从终止密码子恢复为正确的Arg，并且可以通过gp91表达量化校正细胞的表达并通过测序确认。

首先可以测试4种gRNA(g1、g2、g3和g4)并验证其功效。这些gRNA列于下表中：

可以测试50mer至200mer的寡聚体大小(如下表所示，O1-O4)对基因校正效率的影响。预期，如果大小仍不调用(invoke)细胞内的DNA传感器以引发凋亡或细胞焦亡，则更长的寡聚体大小可以得到更好的校正结果。

对于第一研究阶段，可以使用寡聚体来整合HindIII识别位点(AAGCTT)，并且可以使用通过Cel-1测定的插入缺失效率和通过PCR扩增的扩增子之HindIII消化测定的HindIII识别位点的整合效率来测试四种gRNA的靶向效率。然后可以使用去除HindIII识别序列的寡聚体，并用突变位点上T至C的改变来对于延长的长时间测试gp91表达的恢复以了解基因校正的持续性。

为了确认真实的校正，可以使用以下列出的三种测定：1)使用抗gp91的抗体进行测定以检查gp91表达的恢复；2)分选gp91阳性细胞，并对PCR扩增子进行测序以验证校正；以及3)通过测量用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)刺激增强的化学发光进行O2^-产生的体外功能研究。

由于申请人已产生了Cas9并对其进行了测试，因此申请人不期望与在接近突变位点的位点处与获得有效基因编辑相关的任何问题。可以使用cel-1测定来检查基因编辑的效率。也可以将Hind III识别位点并入突变位点中来检查寡聚体整合。用前述方法和数据，发现用两种测试的gRNA-2与100mer大小的寡聚体得到非常有前景的结果。gp91基因表达恢复到超过3％的水平。如果必要的话，可以设计不同结构的寡聚体。这些包括对细胞内寡聚体稳定性具有键修饰的寡聚体或甚至是双链寡聚体。通过进一步的优化，认为可以获得5％-10％的校正效率，其水平可以足够高以观察到对于CGD患者的显著临床益处。

确认CGD患者HSC中的功能基因校正：可以获得来自具有特定C676T突变之CGD患者的自体HSC。可以对转染进行优化并且可以使用上述四种gRNA和寡聚体校正突变基因。然后可以通过检测gp91表达和体外超氧化物产生的功能恢复来测试校正效率。

一旦已经达到约5％-10％的gp91表达恢复，可以在异种移植模型中进行SCID小鼠植入研究以对于约1-4个月的植入持续时间评估这样的校正患者HSC的植入。此外，还可以测试从小鼠回收的人细胞中的功能恢复。还可以在1-3个月期间用1e6-5e6/小鼠的i.v.尾静脉注射测试校正的HSC的植入效率。

为了确认基因校正，可以使用以下研究：1)使用抗gp91的抗体以测定gp91表达的恢复；2)分选gp91阳性细胞，并对PCR扩增子进行测序以验证校正；以及3)通过测量用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)刺激14-17天分化的髓样细胞增强的化学发光进行O2^-产生的体外功能研究；4)在PMA刺激14-17天分化的髓样细胞后，使用二氢罗丹明123(DHR)荧光探针进行O2^-产生的功能研究的体外FACS分析；5)在PMA刺激半固体琼脂糖中的分化髓样集落后，由氮蓝四唑(NBT)形成还原甲(formazan)中之超氧化物O2^-产生的体外功能研究；以及6)在PMA刺激后使用(DHR)荧光探针，对从SCID小鼠中植入的HSC回收的分化髓样进行超氧化物O2^-产生的体外功能FACS研究。

申请人在HSC培养、转染和基因编辑方面对CD34 HSC非常有经验。可对解冻和用细胞因子培养后的转染条件和转染时间点进行进一步优化。可以检查基因编辑，并且可以对寡聚体进行修饰以并入Hind III识别核苷酸从而检查突变位点处的核苷酸整合效率。可以对寡聚体大小和浓度以及CRISPR比和浓度进行优化以获得有效的基因编辑和Hind III整合。Hind III识别位点整合可以与突变基因校正相关。为了具有有效的校正效率，在解冻后培养HSC 1至5天以允许HSC进入完全增殖期可能是必要的或有利的。由于申请人已在来自校正的CGD患者HSC之分化的嗜中性粒细胞中观察到＞6％的gp91表达恢复，因此预计没有问题。

用于临床转化的扩大制造过程：可以获得来自合适CGD患者的自体HSC。预计每个个体的临床试验将需要4e8-4e9HSC。然后可以研究用于准备未来临床试验的扩大过程和细胞处理。扩大可以从2e6 HSC开始至1e8 HSC，然后从1e8至1e9或4e9。将在体外对转染的细胞进行测定。然后可以在扩大的符合cGMP的制造过程中校正突变基因。然后可以评估校正效率和体外功能恢复。还可以在异种移植模型中进行SCID小鼠移植研究以评估这样的校正患者HSC的移植。

可使用以下实验来确认基因校正：1)使用抗gp91的抗体以测定gp91表达的恢复；2)分选gp91阳性细胞，并对PCR扩增子进行测序以验证校正；以及3)通过测量用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)刺激14-17天分化的髓样细胞增强的化学发光进行O2^-产生的体外功能研究；4)在PMA刺激14-17天分化的髓样细胞后，使用二氢罗丹明123(DHR)荧光探针进行O2^-产生的功能研究的体外FAGS分析；5)在PMA刺激半固体琼脂糖中的分化髓样集落后，由氮蓝四唑(NBT)形成还原甲中之超氧化物O2^-产生的体外功能研究；以及6)在PMA刺激后使用(DHR)荧光探针，对从SGID小鼠中植入的HSC回收的分化髓样进行超氧化物O2^-产生的体外功能FACS研究。

本文所述的方法可用于开发用于制造大量具有用于治疗CGD的有效突变校正之自体HSC的转化平台技术，作为遗传疾病的一个实例平台。将使用所提出的研究结果来开发技术转移包，包括制造过程的开发、分析方法学和产品表征以及用于在NIH cGMP设施上转化成IND授权研究的释放测试要求以支持提交IND申请从而进行人临床试验。本实施例中描述的方法还可以用于开发用于制造治疗CGD的临床相关数目的基因校正自体HSC的可扩展方法。该项目将产生具有高生存力、低毒性和临床相关基因校正水平的突变校正的自体HSC。此外，这些结果可进一步证实所开发的方法用于治疗其他遗传疾病的应用并保证单独的进一步研究。

根据本公开内容，无需过度实验就可以进行和实施本文公开和要求保护的所有方法。虽然已依据一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员明显的是，可对本文所述的方法和步骤或方法步骤的顺序做出改变而不偏离本发明的观念、精神和范围。更具体地，明显的是，可用化学和生理学二者相关的某些试剂替代本文描述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。认为所有这样的对于本领域技术人员来说明显的替代或修改都在如所附权利要求限定的本发明的精神、范围和观念之内。

Claims (81)

1.用于对细胞中的靶基因组DNA区进行位点特异性序列修饰的方法，其包括：

用包含(a)具有100个或更少核苷酸的DNA寡核苷酸和(b)在RNA上编码的DNA消化剂的组合物通过电穿孔转染所述细胞；

其中所述DNA寡核苷酸包含：

(i)含有与所述靶基因组DNA区同源的DNA序列的同源区；和

(ii)序列修饰区；并且

其中所述基因组DNA序列在所述靶基因组DNA区被特异性修饰，并且其中所述细胞是干细胞或其后代。

2.权利要求1所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸为单链并且所述细胞是原代细胞。

3.用于对细胞中的靶基因组DNA区进行位点特异性序列修饰的方法，其包括：

用包含(a)DNA寡核苷酸和(b)DNA消化剂的组合物通过电穿孔转染所述细胞；

其中所述DNA寡核苷酸包含：

(i)含有与所述靶基因组DNA区同源的DNA序列的同源区；和

(ii)序列修饰区；并且

其中所述基因组DNA序列在所述靶基因组DNA区被特异性修饰。

4.权利要求3所述的方法，其中电穿孔是使用流式电穿孔装置的流式电穿孔。

5.权利要求3或4所述的方法，其中所述DNA消化剂是TALEN、转座酶、整合酶或核酸酶。

6.权利要求3至5中任一项所述的方法，其中在一个或更多个RNA上编码所述DNA消化剂。

7.权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述DNA消化剂是核酸酶。

8.权利要求7所述的方法，其中所述组合物还包含Cas9。

9.权利要求7至8中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是位点特异性核酸酶。

10.权利要求9所述的方法，其中所述位点组合物还包含引导RNA。

11.权利要求3至10中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸为单链。

12.权利要求3至11中任一项所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸多于10个核酸。

13.权利要求12所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至800个核酸。

14.权利要求13所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至600个核酸。

15.权利要求14所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至200个核酸。

16.权利要求15所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至100个核酸。

17.权利要求16所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10-50个核酸。

18.权利要求3至17中任一项所述的方法，其中所述组合物中所述DNA寡核苷酸的浓度大于10μg/mL。

19.权利要求18所述的方法，其中所述组合物中所述DNA寡核苷酸的浓度为约10至约500μg/mL。

20.权利要求19所述的方法，其中所述组合物中所述DNA寡核苷酸的浓度为约35至约300μg/mL。

21.权利要求20所述的方法，其中所述组合物中所述DNA寡核苷酸的浓度为约35至约200μg/mL。

22.权利要求3至21中任一项所述的方法，其中所述组合物是非病毒的。

23.权利要求3至22中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

24.权利要求23所述的方法，其中所述细胞是人细胞。

25.权利要求23所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。

26.权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是外周血淋巴细胞。

27.权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是扩增的T细胞。

28.权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是干细胞。

29.权利要求28所述的方法，其中所述干细胞是造血干细胞。

30.权利要求28所述的方法，其中所述细胞是间充质干细胞。

31.权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是原代细胞。

32.权利要求3至31中任一项所述的方法，其中所述基因组DNA序列包含疾病相关基因。

33.权利要求3至32中任一项所述的方法，其中所述基因组DNA序列包含HBB基因。

34.权利要求33所述的方法，其中所述序列修饰是将所述HBB基因的第六个密码子修饰为谷氨酸密码子的基因组DNA校正。

35.权利要求32所述的方法，其中所述疾病是慢性肉芽肿病。

36.权利要求32或35所述的方法，其中所述基因组DNA序列包含gp91phox基因。

37.权利要求3至36中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含至少10个核酸的同源序列。

38.权利要求37所述的方法，其中所述寡核苷酸包含至少20个核酸的同源序列。

39.权利要求38所述的方法，其中所述寡核苷酸包含至少30个核酸的同源序列。

40.权利要求3至39中任一项所述的方法，其中所述序列修饰的效率大于3％。

41.权利要求40所述的方法，其中所述序列修饰的效率大于5％。

42.权利要求41所述的方法，其中所述序列修饰的效率大于10％。

43.权利要求3至42中任一项所述的方法，其中电穿孔后的细胞生存力为至少30％。

44.权利要求43所述的方法，其中电穿孔后的细胞生存力为至少40％。

45.权利要求44所述的方法，其中电穿孔后的细胞生存力为至少50％。

46.权利要求3至45中任一项所述的方法，其中所述DNA序列修饰是一个或更多个终止密码子。

47.权利要求3至46中任一项所述的方法，其中所述组合物包含具有不同同源序列的两个或更多个DNA寡核苷酸。

48.权利要求47所述的方法，其中所述组合物包含两种或更多种DNA消化剂。

49.权利要求48所述的方法，其中所述组合物包含两种或更多种位点特异性DNA消化剂；其中所述DNA消化剂靶向不同的基因组位点。

50.权利要求3至49中任一项所述的方法，其中所述序列修饰改变所述基因组序列的一个或更多个碱基对。

51.权利要求3至49中任一项所述的方法，其中所述序列修饰添加所述基因组序列的一个或更多个碱基对。

52.权利要求3至49中任一项所述的方法，其中所述序列修饰缺失所述基因组序列的一个或更多个碱基对。

53.权利要求3至52中任一项所述的方法，其中所述细胞是从患者分离的细胞。

54.权利要求53所述的方法，其中所述细胞在其转染前短于一周的时间段从所述患者分离。

55.权利要求53所述的方法，其中所述细胞在其转染前短于一天的时间段从所述患者分离。

56.权利要求53至55中任一项所述的方法，其中所述分离的细胞未被冷冻。

57.权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述分离的细胞包含两种或更多种不同的细胞类型。

58.权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种不同的细胞类型包含处于不同多能性阶段的两种或更多种细胞类型。

59.权利要求53至58中任一项所述的方法，其中所述序列修饰的效率大于3％。

60.权利要求59所述的方法，其中所述序列修饰的效率大于5％。

61.权利要求60所述的方法，其中所述序列修饰的效率大于10％。

62.权利要求53至61中任一项所述的方法，其中电穿孔后的细胞生存力为至少30％。

63.权利要求62所述的方法，其中电穿孔后的细胞生存力为至少40％。

64.权利要求63所述的方法，其中电穿孔后的细胞生存力为至少50％。

65.权利要求53至64中任一项所述的方法，其中所述细胞从对象的骨髓分离。

66.权利要求53至65中任一项所述的方法，其中所述细胞包含干细胞。

67.权利要求66所述的方法，其中所述干细胞包含造血干细胞。

68.权利要求67所述的方法，其中所述干细胞包含细胞表面标志物CD34+。

69.权利要求3至68中任一项所述的方法，其还包括对经分离且经选择的克隆细胞进行扩增以产生具有所述DNA序列修饰的克隆细胞。

70.权利要求69所述的方法，其中将细胞扩增以用于大规模生产。

71.权利要求69或70中任一项所述的方法，其中在大于1L的体积中扩增细胞。

72.权利要求71所述的方法，其中在3L或更大的体积中扩增细胞。

73.权利要求3至72中任一项所述的方法，其中在无血清培养基中培养所述细胞。

74.权利要求3至73中任一项所述的方法，其还包括针对所述序列修饰筛选细胞。

75.权利要求3至74中任一项所述的方法，其还包括冷冻经转染的细胞。

76.权利要求3至75中任一项所述的方法，其还包括扩增先前冷冻的经转染细胞。

77.用于产生包含靶基因组DNA序列的基因组DNA序列修饰之稳定细胞系的方法，所述方法包括：

用包含(a)DNA寡核苷酸和(b)消化剂的组合物通过电穿孔转染所述细胞；

其中供体DNA包含：

(i)含有与所述靶基因组DNA区同源的核酸序列的同源区；和

(ii)序列修饰区；并且

针对在所述靶基因组DNA区的所述基因组DNA序列修饰筛选经转染细胞；

通过有限稀释来分离经筛选的经转染细胞以获得克隆细胞；

扩增分离的经转染细胞以产生包含所述基因组DNA序列修饰的稳定细胞系。

78.细胞系，其通过权利要求77所述的方法产生。

79.经电穿孔的细胞，其使用权利要求3至78中任一项所述的方法产生。

80.治疗患有或疑似患有疾病或病症的对象的方法，其通过施用有效量的权利要求79所述的经电穿孔细胞或权利要求78所述的细胞系进行。

81.临床研究方法，其包括施用有效量的权利要求79所述的经电穿孔细胞或权利要求78所述的细胞系。