CN1566332A - 体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及建立一种体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，属于干细胞组织工程领域。即通过胚胎干细胞与原代心肌细胞的共培养，构建体外诱导分化的微环境，以促进胚胎干细胞向心肌细胞的分化。该方法可用于基础科研，并为心肌组织工程提供种子细胞。

Description

体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法

技术领域

本发明属干细胞组织工程领域，具体涉及一种诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法。

背景技术

心肌缺血是临床治疗中常见的心脏损伤类型，为实现缺血心肌在结构与功能的再修复，最近有学者提出细胞水平心肌重塑(cellular cardiomyocyteplasty，CCM)：即移植外源细胞至受损心肌，通过促进和提高心肌细胞再生能力及血运供给以减少心室重构、改善心肌功能。迄今已有多种细胞被应用于CCM研究，但均存在来源受限，数量不足等问题。因此寻找更佳来源的供体细胞已成为CCM研究应用的关键。干细胞作为一类兼具自我更新和多向分化潜能的细胞群体，近年来愈来愈受到国内外学者的关注。目前，通过对干细胞进行体外诱导和人工操作，科学家们正致力于实现对某些损伤性疾病的细胞替代治疗。

1981年，小鼠胚胎干细胞系(ES)的建立开辟了研究的新纪元。基于ES细胞本身所具有的无限增殖能力及分化的全能性，研究者尝试着将ES细胞定向诱导分化为心肌细胞，并应用于缺血性心肌损伤的细胞治疗。许多实验室的研究工作已经表明：ES细胞可以自发性分化形成跳动的心肌合胞体，其表型特征及超微结构皆与成熟的心肌细胞相类似。将ES源性心肌细胞移植至mdx小鼠，同时发现其能够形成稳定的心肌细胞移植体。可见，以ES细胞作为CCM的供体细胞是相当有应用前景的。

但是，在ES形成的拟胚体(EB)只有约5％的细胞可自发分化为心肌细胞，因此，提高ES来源心肌细胞的诱导分化率以及实现分化细胞的体外富集成为CCM研究领域的主要制约因素。目前，已有学者报道：一定剂量5-氮胞苷、维甲酸或二甲基亚砜等均可作为诱导分化剂而成功地诱导出小鼠心肌细胞，从而使诱导分化率得到不同程度的提高。此外，还有一些细胞因子也应用于上述相关研究。尽管如此，由于ES细胞其定向分化的机制尚未明确，各种诱导分化剂的作用机理也并不清晰，所以在应用ES源心肌细胞进行心肌组织工程等下游工作时，通过上述诱导分化剂所获得的心肌细胞的数量并不理想。基于此，诱导ES细胞分化为心肌细胞的方法有待进一步更新与完善。

发明内容

本发明的目的是提供一种获得胚胎干细胞来源的心肌细胞的体外诱导方法，其特征是将带有荧光标记的小鼠胚胎干细胞(ES-GFP)与新生鼠原代心肌细胞和成纤维细胞进行体外共培养，于体外创造胚胎干细胞向心肌细胞分化诱导分化的微环境，从而促进ES细胞向心肌细胞的诱导分化。其方法为：

大鼠心肌细胞共培养体系的建立：所述原代心肌细胞取自1-2日龄新生大鼠，经胰蛋白酶消化制备为1-2×10⁵/ml的细胞悬液，接种至明胶包被的培养皿。体外培养48-72小时，其间经过0.1mmol/ml BrdU处理以抑制成纤维细胞的过度增殖。PBS充分冲洗后将拟胚体加入到该培养体系中进行诱导分化培养。129小鼠源性小鼠胚胎干细胞建首先经过去饲养层细胞后悬浮培养成为拟胚体，6天后再与原代心肌细胞进行共培养。因其带有GFP报告基因，因此ES源心肌细胞易于与心肌细胞相鉴别。

诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化：复苏ES-GFP细胞，常规生长培养基培养1-2天，胰酶消化，1∶3传代。2天后收集细胞，将细胞悬液置于100mm细菌级培养皿内(0.1％明胶预处理)悬浮培养30分钟，待大部分饲养层细胞贴壁后，重新吸取细胞悬液至另一细菌级培养皿悬浮培养，该步骤可去除饲养层细胞，以后定期换液，悬浮培养5天后，形成拟胚体(EB)。将上述EB加入到备用的原代心肌细胞培养体系中(约20个/皿)，同时设实验对照组：对照组1∶10uM 5-氮胞苷+15％H-DMEM；对照组2：15％H-DMEM。各实验及对照组均设3个平行皿。

所述方法的优点为：1)建立小鼠胚胎干细胞与原代心肌细胞的共培养体系，细胞来源不受限制，取材方便，操作简单易行。其中，原代心肌细胞取材自新生大鼠心脏，分离技术已经成熟，过程中无须克服成纤维细胞的污染，因为成纤维细胞的存在有助于在体外进一步模拟构建ES细胞诱导分化为心肌细胞的微环境。2)该体外诱导分化的培养体系成分构成比较简单，除含15％胎牛血清的H-DMEM培养基外，不需要添加任何的细胞因子或其他的诱导分化剂，而这些促分化成分的经济价格比较昂贵，因此该培养方法在实际科研工作中经济适用。3)诱导分化为心肌细胞的比率比较高(可达50-60％)，有助于获得理想数量的供体细胞。本发明利用与原代心肌细胞共培养体系，于体外创造ES诱导分化的微环境，从而促进ES细胞向心肌细胞的分化，以获得理想数量的ES源心肌细胞，最终提供基础科研、临床应用之所需。

具体实施方式

实施例

体外共培养诱导小鼠ES细胞分化为心肌细胞

1)新生大鼠心肌细胞的分离和培养

实验准备：无菌解剖剪2把；5号钳子2把；调温搅拌器；25ml带塞锥形瓶(搅拌子)；

          冰台；一次性无菌塑料培养皿

试剂：

H-DMEM培养基(Gibico)，胎牛血清

胰酶的配制：

     盐水A：              90毫升

     1％胰酶1∶300        10毫升

     使用当天配制，无菌过滤。

盐水A配制：

     Nacl             8g

     Kcl              0.3g

     NaHCO3           0.35g

     葡萄糖           1g

溶解于1L蒸馏水中，无菌过滤备用。

具体操作流程：(该操作流程适用于20-30只新生鼠)

冰台经乙醇擦拭后放入超净台，3个60mm组织培养皿内各装5ml盐水A，

                  置于冰台，分别标记1，2，3号

                            ↓新生鼠经75％乙醇处理后操作间内无菌取出心脏，置于1号培养皿内去除结缔组织及血块，

转入2号漂洗，再到3号皿中。吸弃3号皿盐水，加入2ml预热胰酶，剪碎心脏组织

                               ↓将组织碎块移入有搅拌子的锥形瓶，补加胰酶到10ml，置于37℃水浴，转速60r/min，消化15min。所得主要为红细胞，弃上清后重新加入胰酶10ml消化。吸管吹打，机械分散细胞，

                               孵育10min

                               ↓取装有10毫升预冷全培养基的离心管，转移上清到离心管中停止消化。此为第一次收集到的

    分离细胞。余下的组织块继续胰酶消化，重复消化细胞至散开所有细胞团

                               ↓离心收集细胞，吸弃上清后重悬细胞。细胞计数，接种密度调整为5-6×10⁵/ml，将悬液转移至经过0.1％明胶预处理100mm组织培养皿。孵育4-6小时后，可更换培养基过夜培养

                               ↓

用含0.1mmol/ml BrdU的培养基处理48小时，以抑制成纤维细胞的过度增殖。后以

                   0.1mol/LPBS缓冲液洗涤3-5次，备用

2)ES细胞形成拟胚体

准备工作：

常规ES细胞生长培养基(H-DMEM)；60mm无菌组织培养皿；小鼠成纤维细胞饲养层。具体操作流程：

    复苏ES-GFP细胞，常规生长培养基培养1-2天，胰酶消化，1∶3传代

                               ↓2天后收集细胞，将细胞悬液置于100mm细菌级培养皿内(0.1％明胶预处理)悬浮培养30分钟，待大部分饲养层细胞贴壁后，重新吸取细胞悬液至另一细菌级培养皿悬浮培养，该步

                          骤可去除饲养层细胞

                               ↓

              定期换液，悬浮培养5天后，形成拟胚体(EB)

3)共培养诱导ES-GFP向心肌细胞分化

将上述EB加入到备用的原代心肌细胞培养体系中(约20个/皿)，同时设实验对照组：对照组1——10uM 5-氮胞苷+15％H-DMEM；对照组2——15％H-DMEM。各实验及对照组均设3个平行皿。

结果：观察到实验组EB于2小时内完全贴壁，而对照组1和组2中EB在48小时后仍未完全贴壁。培养6-7天后，相差显微镜下可观察到多个跳动的心肌细胞合胞体。其收缩节律为47--60次/分。具体见表：

               不同组别ES细胞分化为心肌合胞体的数目比较

组别              接种EB数目              心肌合胞体数目

                  (个/皿)                 (个，X±SD)

试验组            20                      10.9±2.0

对照组1^*         20                      5.0±1.2

对照组2^**        20                      1±0.3

(n＝3，实验组与对照组比较，t检验分析：P^*＜0.05；P^**＜0.01)

结果表明大鼠心肌细胞共培养体系可显著提高胚胎干细胞向心肌细胞分化水平。

Claims (6)

1.体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征是包括胚胎干细胞与原代心肌细胞的共培养体系的建立。

2.权利要求1中所述的胚胎干细胞，其特征是可以是人源的，也可以是小鼠的或是其它动物的。

3.权利要求1所述的原代心肌细胞，取材自1-2日龄新生大鼠活小鼠的心脏，其中可以包括有成纤维细胞。

4.权利要求1中所述的原代心肌细胞，其分离方法是：新生鼠经75％乙醇处理后操作间内无菌取出心脏，置于1号培养皿内去除结缔组织及血块。剪碎心脏组织，加入预热的0.05～0.25％胰蛋白胰酶，将组织碎块移入有搅拌子的锥形瓶，补加胰酶，置于37℃水浴，消化5～15min。吸管吹打，机械分散细胞，孵育5～10min。离心收集细胞。

5.权利要求1中所述的原代心肌细胞与成纤维细胞培养体系，其特征是通过0.1mmol/mlBrdU处理48小时，以抑制成纤维细胞的过度增殖。

6.权利要求1中所述的共培养体系，其特征是可以是将胚胎干细胞直接与心肌细胞接触，或者在双室培养装置中共用培养液但不接触。