CN106244525B - 一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法 - Google Patents

一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法。所述的联合培养方法包括以下步骤：(1)睾丸支持细胞的培养；(2)心肌组织收集、处理及消化，以获得心肌细胞；(3)采用双层培养法，用睾丸支持细胞联合培养心肌细胞，其中上层为睾丸支持细胞层，下层为心肌细胞；(4)分离、纯化培养的心肌细胞。本发明通过试验发现，用睾丸支持细胞联合培养心肌细胞，相比常规培养组，联合培养组细胞生长速度加快，细胞生长更加旺盛。联合培养组细胞铺满单层需要3‑4d，而常规培养组需要4‑5d。由此证明，睾丸支持细胞可有效促进心肌细胞生长。这种简单且低成本的心肌细胞培养方法，对心脏的生长、发育、生理、代谢、病理研究有重要的现实意义。

Description

一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法
技术领域
本发明涉及一种心肌细胞培养方法，特别涉及一种心肌细胞和睾丸支持细胞的联合培养方法，属于细胞生物学和生物医学领域。
背景技术
心肌细胞培养作为一种体外研究模型，可以更便捷的从细胞和分子水平对其生长、发育、生理、代谢、病理等进行研究，在许多研究领域有重要意义。随着社会经济的发展和生活水平的提高，人类的平均预期寿命显著延长，与之相对应的是，心脏疾病如冠心病的发病率也逐年升高。冠心病和心肌梗死所造成的心肌不可逆性损伤是严重威胁全世界健康的杀手。如何有效的让心肌再生是一个非常有价值的研究课题。有关心肌细胞的生物学属性，一直以来的观点认为，哺乳类心脏是终末分化器官，哺乳类动物成年后其心肌细胞永久性地退出细胞周期，不再具备增殖与再生的能力。哺乳动物的心肌细胞不能分裂的定论在近年来已被推翻。Kajstura等于1998年利用共聚焦显微镜研究心肌组织时，首次发现了正常的成熟心肌细胞具有分裂和增殖能力。在正常对照的心脏中，每100万个细胞中有14个细胞处于有丝分裂期，在缺血性心脏病患者的心脏中，处于有丝分裂的细胞数量大约增加了10倍左右，即100万细胞中有152个细胞处在有丝分裂阶段，原发性扩张性心脏病患者则为131个。同在1998年，An-vers和Kajstura也通过共聚焦显微镜发现了正常心肌组织中有处于有丝分裂期的细胞，并进行了其他一些相关实验，提出成年哺乳动物的心室肌细胞不是终末分化细胞的论点。随着分子生物学和细胞生物学的发展，细胞水平的研究日益受到重视。国内外诸多学者开展了心肌细胞的生理、病理、药理、代谢等方面的基础研究，体外培养的心肌细胞可保持结构及功能上的某些特点，并具有自发性节律搏动、不传代，且心肌细胞的培养具有不受体内神经体液因素的影响等特点。虽然，心肌细胞的培养在心脏生理、病理、药理、代谢等方面研究中已取得长足的发展，但心肌细胞培养娇贵，需要专门特质的心肌细胞培养基，且生长速度较慢等诸多培养瓶颈问题，阻碍了以心肌细胞作为模型细胞进行与心脏相关疾病的研究。
因此，目前急需提出一种能够促进心肌细胞的生长，解决心肌细胞体外培养的诸多瓶颈问题的培养方法。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明提出了一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法，该培养方法中，为了解决心肌细胞体外培养诸多瓶颈问题，巧妙的利用睾丸支持细胞作为“保姆”细胞，利用其自身自然分泌诸多生长因子，来促进心肌细胞的生长。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法，包括以下步骤：
(1)睾丸支持细胞的培养；
(2)心肌组织收集、处理及消化，以获得心肌细胞；
(3)采用双层培养法，用睾丸支持细胞联合培养心肌细胞，其中上层为睾丸支持细胞层，下层为心肌细胞层；
(4)分离、纯化培养的心肌细胞。
在本发明中，优选的，步骤(1)中所述的睾丸支持细胞为羔羊睾丸支持细胞LSC，分类命名为羔羊睾丸支持细胞LSC，该细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C2016120，保藏时间为2016年6月3日。
在本发明中，优选的，步骤(1)中所述的睾丸支持细胞为新生牛睾丸支持细胞系NBSC，分类命名为新生牛睾丸支持细胞系，该细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C201438，保藏时间为2014年3月28日。该细胞系已记载在申请号为201410161991.1，发明名称为“一种用于羊传染性脓疱病毒分离培养和增殖的细胞系及其制备方法和应用”的专利申请中。
在本发明中，优选的，步骤(2)中所述的心肌细胞为原代心肌细胞或经纯化培养后的心肌细胞。
在本发明中，优选的，步骤(2)中所述的心肌组织收集、处理及消化包括以下步骤：选取脱臼处死后的健康母鼠所生的1日龄豚鼠乳鼠，在无菌条件下，摘取心脏，剥离心包膜，小心剪取心室组织，用加双抗D-hanks洗涤心室组织2～3次，剔除纤维结缔组织，只留心肌组织，将心肌组织反复剪成长宽分别为1～3mm的小块，用混合酶消化法制备心肌细胞悬液。
在本发明中，优选的，步骤(3)中所述的双层培养法包括以下步骤：利用双层培养皿培养心肌细胞，其中，睾丸支持细胞按细胞浓度1×105～5×105/ml培养在培养皿的上层，心肌细胞按细胞浓度1×105～5×105/ml培养在培养皿的下层；睾丸支持细胞与心肌细胞由孔径为0.4μm的聚碳酸酯膜隔开，上层的睾丸支持细胞贴壁生长在该膜上，置37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养3-5天。
在生长过程中睾丸支持细胞分泌的各种生长因子可以分泌到培养皿下层的营养液中。这样心肌细胞可以有效的利用睾丸支持细胞分泌的生长因子，促进其生长。心肌细胞生长在培养皿底壁上。
在本发明中，优选的，步骤(1)、(3)、(4)中培养细胞所用的培养液均为含有2～20％(v/v)胎牛血清的高糖DMEM培养液加，加青霉素、链霉素各100单位/ml，调pH至7.0～7.2。
在本发明中，优选的，步骤(4)所述的分离、纯化培养心肌细胞包括以下步骤：在培养液中加0.1mM/L的5-嗅脱氧尿嘧啶，用差速贴壁法分离纯化位于培养皿下层的豚鼠心肌细胞。
本发明通过试验发现，用睾丸支持细胞联合培养原代心肌细胞或纯化的心肌细胞过程中，可以用普通的细胞培养液—高糖DMEM代替CMM心肌细胞专用培养液，细胞生长良好；同时，相比常规培养组，无论是原代心肌细胞还是纯化的心肌细胞，联合培养组细胞生长速度加快，细胞生长更加旺盛。联合培养组细胞铺满单层需要3-4d，而常规培养组需要4-5d。由此证明，睾丸支持细胞与豚鼠心肌细胞联合培养，睾丸支持细胞分泌的细胞生长因子可有效促进心肌细胞生长。这种简单且低成本的心肌细胞培养方法，对心脏的生长、发育、生理、代谢、病理研究有重要的现实意义。
附图说明
图1为37℃、38.5℃和39.5℃条件下羔羊睾丸原代细胞体外生长曲线；
图2为羔羊睾丸支持细胞及其自然传代细胞的体外培养；
A：消化后培养0小时的支持细胞；B：培养2h的支持细胞；C：培养12h的支持细胞；D：培养72h的支持细胞；E：培养2h的自然传代细胞(LSC)；F：培养72h的自然传代细胞(LSC)；
图3为羔羊睾丸支持细胞及其自然传代细胞的鉴定；
A：分离纯化培养的第3代支持细胞HE染色；B：自然传代第10代LSC细胞HE染色；C：分离纯化培养的第3代支持细胞FasL蛋白检测；D：分离纯化培养的第三代支持细胞FasL蛋白检测结果；E：自然传代第10代LSC细胞FasL蛋白检测；F：自然传代第10代LSC细胞FasL蛋白检测结果；
图4为原代心肌细胞联合培养试验组和对照组细胞生长特性；
A：联合培养组培养12h后的原代心肌细胞；B：对照组培养12h后的原代心肌细胞；
C：联合培养组培养72h后的原代心肌细胞；D：对照组培养72h后的原代心肌细胞；
图5为原代心肌细胞的生长曲线；
图6为纯化的心肌细胞生长曲线。
A：培养24h后的纯化心肌细胞；B：培养96h后的纯化心肌细胞；
C：纯化心肌细胞吉姆萨染色；D：纯化心肌细胞吉姆萨染色；
E：纯化心肌细胞间接免疫荧光纯度检测；F：纯化心肌细胞间接免疫荧光Overlay；
图7为纯化的心肌细胞的生长曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[实施例1]羊睾丸支持细胞的分离、培养及鉴定
1.1羊睾丸原代细胞的制备
选健康母羊(体质健康且口蹄疫、布氏杆菌、结核检测为阴性)所生的健康公羔羊，屠宰后采集阴囊(阴囊根部结扎，阴囊外部用75％酒精消毒)，恒温箱内，2小时内送回实验室。用眼科镊子和剪刀将睾丸实质剪切成约1mm×3mm的小块，在D-hanks液中轻轻吹打数次，去除上清，将小组织块放入50mL离心管中加入10倍体积的含0.1wt％IV型胶原酶(GIBCO)、0.25wt％胰酶(GIBCO)的消化液4℃消化12h或过夜，用等体积含10％(v/v)新生牛血清(GIBCO)的DMEM培养液(HyClone)终止消化。用吸管柔和吹打数次后，用200目铜网过滤。收集消化液1000r/min离心10min，弃上清，用无血清DMEM培养液漂洗2次，弃上清，加入含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养液制成细胞悬液。
1.2不同培养条件下羊睾丸原代细胞生长曲线测定
将1.1节中制备的羊睾丸原代细胞悬液以1-2×106个/mL的密度接种到培养瓶中，分三组，每组5瓶，分别置37℃、38.5℃、39.5℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养6h后，换液，弃未贴壁细胞，加入含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培养液，继续纯化、传代培养3代。
将上述制备的新生羊睾丸支持细胞(第三代)以1×105个/mL细胞浓度接种于6块24孔板中，分别置于37℃、38.5℃和39.5℃5％CO2、饱和湿度条件下培养(不同温度各培养2块)，试验自接种起，每隔24h各取3个孔细胞，贴壁支持细胞数目计数，取平均值，连续10d。测定不同培养温度条件下支持细胞的生长情况。优化最佳纯化培养温度和羊睾丸支持细胞差速贴壁纯化培养条件。
1.3羔羊睾丸支持细胞的分离、纯化培养
将1.1节中制备的细胞悬液以1-2×106个/mL的密度接种到培养瓶中，分三组，每组5瓶，分别置37℃、38.5℃、39.5℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养6h后，换液，弃未贴壁细胞，加入含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培养液，继续纯化、传代培养3代。然后进行细胞鉴定。
1.4羔羊睾丸支持细胞的鉴定
将1.3节中分离、纯化培养的支持细胞细胞系进行HE染色观察细胞形态，同时，采用FasL蛋白进行支持细胞的免疫组化鉴定。
免疫组化方法如下：将培养3d的支持细胞用4％多聚甲醛溶液固定10min，PBS漂洗3次×5min，山羊血清室温下封闭孵育20min，加入兔抗大鼠FasL多克隆抗体(abcam公司，1∶100稀释)一抗混合工作液，37℃孵育3h，PBS漂洗3次，加入FITC标记山羊抗兔IgG(abcam公司，1∶50稀释)二抗混合工作液37℃孵育30min，PBS漂洗3次，荧光显微镜下随机选择10个视野，绿色荧光下观察FasL染色结果。计算每视野中FasL阳性细胞和细胞总数，计算阳性细胞百分比，得到支持细胞的纯度。
1.5羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系的建立
1.3节中分离纯化的羔羊睾丸支持细胞，在传代至17-18代时，细胞分裂增殖能力下降(羔羊睾丸支持细胞张满单层需要4-5d)时，每周换液一次，持续一个月后，将持续培养的细胞消化，有限稀释后在96孔板上培养(每孔培养细胞小于5个)，挑选生长良好，传代后依然生长良好的细胞，且生长能力接近低代次睾丸支持细胞(分离纯化的睾丸支持细胞的第3到13代)。该细胞即羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系。将该细胞HE染色观察细胞形态，同时，采用FasL蛋白进行支持细胞的免疫组化鉴定；同时对该细胞系进行进一步传代试验，跟踪其传代培养特性。
1.6结果
试验发现，37℃和38.5℃培养条件下，羔羊睾丸原代细胞潜伏期均为2天，之后进入对数生长期；而39.5℃培养条件下的羔羊睾丸原代细胞潜伏期比37℃和38.52培养条件下的短，提前进入对数生长期；随培养温度的升高，对数生长期细胞增殖速率增大；原代接种5天后,37℃组、38.5℃组和39.5℃组支持细胞进入平台期，但39.5℃组支持细胞平台期维持约1天，之后迅速进入退化衰亡期；38.5℃组平台期维持约4天，之后进入衰亡期；而37℃组测定时间区间内一直处于平台期(图1)。在羔羊睾丸原代细胞中数量最多的是睾丸支持细胞，因此，该曲线也可说明在不同温度条件下羊睾丸支持细胞的生长特性。由此证明，纯化羔羊睾丸支持细胞的最佳温度为38.5℃。
经38.5℃高温培养结合6h差速贴壁，进过三代纯化后得到的支持细胞，刚接种细胞为圆点状，折光性强(图2A)；培养2h开始贴壁(图2B)，伸出突起，胞质开始铺展；培养6h后完全贴壁，培养12h后即可进入增殖期，细胞增殖较快，胞质开始扩张，形态呈现多变形状(图2C)；培养24h后，可见胞体较大、呈长柱状贴壁生长、两侧有多个突起、折光性较强的细胞，此即睾丸支持细胞。培养48h后，睾丸支持细胞体积进一步增大，呈膜状生长于瓶壁,细胞相互连接成网状，胞核清晰可见，位于胞体的中央或稍偏位。睾丸支持细胞的折光性随培养时间的延长而降低，圆型的细胞贴壁数量逐渐减少，睾丸支持细胞占细胞总数的95％以上，亦有少量成纤维细胞生长；3-4d后，长满瓶壁，形成单层细胞(图2D)。分离纯化的羔羊睾丸支持细胞，在传代至18代时，细胞分裂增殖能力下降(羔羊睾丸支持细胞张满单层需要4-5d)时，每周换液一次，持续一个月后，将持续培养的细胞消化，有限稀释后在96孔板上培养，挑选生长良好，传代后依然生长良好的细胞，培养2h开始贴壁(图2E)，72h长满单层(图2F)，且生长能力接近低代次睾丸支持细胞(图2D)，该细胞即羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系。
经HE染色，分离纯化的支持细胞和自然传代培养的LSC，两者形态基本一致(图3A，3B)，其大多呈卵圆形，胞质完全铺开，染色呈红色，而细胞核染色较深，呈蓝色，形状呈圆形或椭圆形位于细胞质中央或偏位，核仁明显，间接免疫荧光检测睾丸支持细胞和自然传代培养的LSC均高表达FasL蛋白，均可看到绿色荧光，支持细胞阳性率达到95％以上(图3C-F)。
由上证明，用分离纯化的羔羊睾丸支持细胞，进一步传代培养，将持续培养的细胞消化，有限稀释后在96孔板上培养，挑选生长良好，传代后依然生长良好的细胞。该细胞即羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系，命名为羔羊睾丸支持细胞LSC。该细胞系已于2016年6月3日送交位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C2016120。
[实施例2]用羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系联合培养原代心肌细胞
2.1羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)的培养
从液氮罐中随机选取冻存的LSC细胞系(保藏编号为:CCTCC NO：C2016120)细胞2管，放入38℃恒温水浴锅里迅速解冻后，1000r/min，离心10min，弃上清后取沉淀加入5％DMEM培养液1ml吹打均匀，移入25cm2细胞培养瓶内，加入5％培养液6ml吹打均匀，置于37℃恒温二氧化碳培养箱内培养，每12h显微镜下观察一次。待细胞铺满单层，备用。
2.2豚鼠乳鼠原代心肌细胞的制备
选健康母鼠所生的1日龄豚鼠乳鼠脱臼处死后，在无菌条件下，摘取心脏，剥离心包膜，小心剪取心室组织，用加双抗D-hanks洗涤心室组织2～3次，剔除纤维结缔组织，只留心肌组织，将心肌组织反复剪成长宽分别为1～3mm的小块。加入D-hanks继续清洗，直至D-hanks清亮干净后，将小组织块放入50mL离心管中加入10倍体积的含0.1wt％Ⅱ型胶原酶、0.25wt％胰酶的消化液4℃消化12小时或过夜，用等体积含10％(v/v)血清的DMEM培养液终止消化。用吸管柔和吹打数次后，用200目不锈钢网过滤。收集消化液1000rpm/min离心10min，弃上清，用无血清培养液漂洗2次，加入含20％(v/v)胎牛血清的高糖DMEM培养液制成细胞悬液。台盼蓝染色判断细胞活力，血细胞计数板计数，当活细胞数达到90％以上时，保存备用。
2.3 LSC细胞与豚鼠乳鼠心肌原代细胞联合培养
将2.1节培养的铺满单层的LSC细胞用胰酶消化制备成细胞悬液，以1×105/ml细胞浓度接种在corning costar Transwell嵌套培养皿(货号3412)的上层嵌套内；将2.2节制备的豚鼠乳鼠原代心肌细胞以1×105/ml细胞浓度接种在corning costar Transwell嵌套培养皿(货号3412)下层；培养细胞所用的培养液均为含有10％(v/v)胎牛血清的高糖DMEM培养液，加青霉素、链霉素各100单位/ml，调pH至7.0～7.2，置37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养；同时，将2.2节制备的豚鼠乳鼠原代心肌细胞以1×105/ml细胞浓度接种，用普通六孔细胞培养皿培养豚鼠乳鼠原代心肌细胞做平行对照。
将LSC细胞与豚鼠乳鼠原代心肌细胞联合培养的豚鼠乳鼠原代心肌细胞(接种4个6孔培养皿)和用普通六孔细胞培养皿(接种4个6孔培养皿)培养的豚鼠乳鼠原代心肌细胞，分别在培养0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h共10个时间点，分别随机取各取两孔进行细胞形态观察并将取样细胞消化进行细胞计数。
试验结果：联合培养试验组和对照组培养的豚鼠原代心肌细胞大多数呈长梭形或多角形、胞核小、胞浆致密，有少量细胞呈不规则形或多角形细胞(图4A、B)。联合培养试验组细胞生长速度在培养前期明显快于对照组，一般3～4天铺满单层(图4C、D)；从细胞生长曲线来看，联合培养组与对照组相比，细胞培养至12h后，联合培养组心肌细胞生长速度明显快于对照组(图5)。
采用新生牛睾丸支持细胞系NBSC(CCTCC NO：C201438)按照上述步骤对原代心肌细胞进行联合培养，结果表明NBSC联合培养组心肌细胞生长速度快于对照组，细胞生长更加旺盛，但略低于LSC联合培养组。
[实施例3]用羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)联合培养纯化的心肌细胞
3.1羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)的培养
从液氮罐中随机选取冻存的LSC细胞系(保藏编号为:CCTCC NO：C2016120)细胞2管，放入38℃恒温水浴锅里迅速解冻后，1000r/min，离心10min，弃上清后取沉淀加入5％DMEM培养液1ml吹打均匀，移入25cm2细胞培养瓶内，加入5％培养液6ml吹打均匀，置于37℃恒温二氧化碳培养箱内培养，每12h显微镜下观察一次。待细胞铺满单层，备用。
3.2豚鼠乳鼠纯化的心肌细胞的制备
选健康母鼠所生的1日龄豚鼠乳鼠脱臼处死后，在无菌条件下，摘取心脏，剥离心包膜，小心剪取心室组织，用加双抗D-hanks洗涤心室组织2～3次，剔除纤维结缔组织，只留心肌组织，将心肌组织反复剪成长宽分别为1～3mm的小块。加入D-hanks继续清洗，直至D-hanks清亮干净后，将小组织块放入50mL离心管中加入10倍体积的含0.1wt％Ⅱ型胶原酶、0.25wt％胰酶的消化液4℃消化12小时或过夜，用等体积含10％(v/v)血清的DMEM培养液终止消化。
将消化好的细胞悬液以1～3×105个/ml的密度接种到培养瓶中，5％CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养1h后，将培养上清吸出加入另一细胞瓶继续培养1h后，将培养上清吸出，加入无菌离心管中以1000rpm/分钟离心10分钟，用含20％(v/v)FBS、0.1mM/L的5-嗅脱氧尿嘧啶(5-BrdU)的高糖DMEM培养液重悬细胞，以2×105个细胞/ml浓度接种到培养瓶中，5％CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养。培养24h后更换培养液。将细胞培养3～5日后，进行细胞形态观察和鉴定。
3.3纯化的心肌细胞鉴定
体内成熟的心肌细胞呈圆杆状，沿一定方向排列，核椭圆，位于胞体中央。胚胎或新生心肌细胞呈圆形或卵圆形，核圆。二维培养条件下心肌细胞形态各异，镜下观察依据细胞形态很难将其与其它类型的细胞区别开来。节律性搏动是心肌细胞的特征之一。此外，特异性蛋白的免疫细胞化学染色是细胞鉴定的常用方法。中间纤维是细胞骨架中最稳定的成分，结蛋白(Desmin)是心肌细胞中间纤维的主要成分，占其中的90％，该蛋白存在于横纹肌和各种平滑肌中。a-横纹肌肌动蛋白(a-Sareomeriaetin)仅存在于心肌和骨骼肌细胞中，不存在于平滑肌中。所以，利用免疫化学方法检测培养心肌的a-横纹肌肌动蛋白(a-Sareomeriaetin actin)来鉴定心肌细胞。
3.4 LSC细胞与豚鼠乳鼠纯化心肌细胞联合培养
将3.1节培养的铺满单层的LSC细胞用胰酶消化制备成细胞悬液，以1×105/ml细胞浓度接种在corning costar Transwell嵌套培养皿(货号3412)的上层嵌套内；将3.2节制备的纯化的心肌细胞以1×105/ml细胞浓度接种在corning costar Transwell嵌套培养皿(货号3412)下层；培养细胞所用的培养液均为含有10％(v/v)胎牛血清的高糖DMEM培养液，加青霉素、链霉素各100单位/ml，调pH至7.0～7.2，置37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养；同时，将3.2节制备的纯化的心肌细胞以1×105/ml细胞浓度接种，用普通六孔细胞培养皿培养纯化的心肌细胞做平行对照。
将LSC细胞与纯化豚鼠心肌细胞联合培养的纯化的心肌细胞(接种4个6孔培养皿)和用普通六孔细胞培养皿(接种4个6孔培养皿)培养的纯化的心肌细胞，分别在培养0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h共10个时间点，分别随机取各取两孔进行细胞形态观察并将取样细胞消化进行细胞计数。
试验结果：纯化培养的豚鼠心肌细胞大多数呈长梭形或多角形、胞核小、胞浆致密；有少量细胞呈不规则形或多角形传代的心肌细胞未呈圆形，贴壁后生长逐渐呈梭形、多角形，胞核1～2个、呈圆形、具有1～2清晰的核仁，单个细胞自行蠕动，当生长成片后可见呈岛屿状搏动，搏动频率30～60次/min。一般3～5天铺满单层；吉姆萨染色细胞核染成紫蓝色，细胞质染成淡紫色；HE染色细胞形态饱满、细胞膜完整；透射电镜观察细胞完整，胞膜皱褶整齐，细胞中肌丝、线粒体清晰、分布均匀，细胞核完整。间接免疫荧光检测心肌细胞特异的α-横纹肌肌动蛋白，分离纯化培养的心肌细胞，几乎都看到绿色荧光，说明该方法较特异，分离纯化的豚鼠心肌细胞纯度较高(图6A、B、C、D、E、F)。
将LSC细胞与纯化豚鼠心肌细胞联合培养的纯化的心肌细胞(接种4个6孔培养皿)和用普通六孔细胞培养皿(接种4个6孔培养皿)培养的纯化的心肌细胞，分别在培养0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h共10个时间点，分别随机取各取两孔进行细胞形态观察并将取样细胞消化进行细胞计数。测定心肌细胞在不同培养条件下的生长曲线(图7)。从细胞生长曲线可以看出，联合培养组与对照组心肌细胞均在36h后进入对数生长期，在72h后进入平台期；联合培养组与对照组联合培养组与对照组心肌细胞在24h以内，联合培养组和对照组细胞生长差异不显著；在24h至108h测定区间内，联合培养组心肌细胞生长速度高于对照组。由此证明，LSC细胞与心肌细胞联合培养时，LSC细胞在生长过程中分泌的各种生长因子可有效促进心肌细胞的生长。这种简单且低成本的心肌细胞培养方法，对心脏的生长、发育、生理、代谢、病理研究有重要的现实意义。
采用新生牛睾丸支持细胞系NBSC(CCTCC NO：C201438)按照上述步骤对纯化后心肌细胞进行联合培养，结果表明NBSC联合培养组心肌细胞生长速度快于对照组，细胞生长更加旺盛，但略低于LSC联合培养组。

Claims (6)

1.一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)睾丸支持细胞的培养；
所述的睾丸支持细胞为羔羊睾丸支持细胞LSC，该细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：C2016120；或
所述的睾丸支持细胞为新生牛睾丸支持细胞系NBSC，该细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：C201438；
(2)心肌组织收集、处理及消化，以获得心肌细胞；
(3)采用双层培养法，用睾丸支持细胞联合培养心肌细胞，其中上层为睾丸支持细胞层，下层为心肌细胞层；
(4)分离、纯化培养的心肌细胞。
2.如权利要求1所述的联合培养方法，其特征在于步骤(2)中所述的心肌细胞为原代心肌细胞或经纯化培养后的心肌细胞。
3.如权利要求1所述的联合培养方法，其特征在于步骤(2)中所述的心肌组织收集、处理及消化包括以下步骤：选取脱臼处死后的健康母鼠所生的1日龄豚鼠乳鼠，在无菌条件下，摘取心脏，剥离心包膜，小心剪取心室组织，用加双抗D-hanks洗涤心室组织2～3次，剔除纤维结缔组织，只留心肌组织，将心肌组织反复剪成长宽分别为1～3mm的小块，用混合酶消化法制备心肌细胞悬液。
4.如权利要求1所述的联合培养方法，其特征在于步骤(3)中所述的双层培养法包括以下步骤：利用双层培养皿联合培养心肌细胞和睾丸支持细胞，其中，睾丸支持细胞按细胞浓度1×105～5×105/ml培养在培养皿的上层，心肌细胞按细胞浓度1×105～5×105/ml培养在培养皿的下层；睾丸支持细胞与心肌细胞由孔径为0.4μm的聚碳酸酯膜隔开，上层的睾丸支持细胞贴壁生长在该膜上，置37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养3-5天。
5.如权利要求1所述的联合培养方法，其特征在于步骤(1)、(3)、(4)中培养细胞所用的培养液均为含有2～20％(v/v)胎牛血清的高糖DMEM培养液，加青霉素、链霉素各100单位/ml，调pH至7.0～7.2。
6.如权利要求1所述的联合培养方法，其特征在于步骤(4)所述的分离、纯化培养心肌细胞包括以下步骤：在培养液中加0.1mM/L的5-嗅脱氧尿嘧啶，用差速贴壁法分离纯化位于培养皿下层的豚鼠心肌细胞。
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