CN109666628A - 一种人骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的诱导培养基及诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的诱导培养基及诱导方法，属于细胞诱导、分化技术领域，诱导培养基包括基础培养基和添加成分，所述的基础培养基为IMDM培养基，所述的添加成分包括血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、胎牛血清、青‑链霉素以及肝素，还包括抗坏血酸和/或氢化可的松。氢化可的松与抗坏血酸和肝素的添加量的比例为1:1‑3:8‑10。本发明采用改良的诱导培养基，氢化可的松与抗坏血酸和肝素能够起到协同作用，提高诱导效果，可以稳定、高效、快速的从骨髓间充质干细胞诱导获得内皮细胞，内皮细胞的比例高达93.5％。

Description

一种人骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的诱导培养基 及诱导方法

技术领域

本发明属于细胞诱导、分化技术领域，具体地说，涉及一种人骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的诱导培养基及诱导方法。

背景技术

随着人群老龄化和人们饮食结构的变化，下肢缺血性疾病的发病率正处于逐年上升阶段，已经成为威胁人类健康的一类重大疾病。下肢缺血性疾病的本质是下肢动脉血管狭窄、闭塞，造成血供减少，常引起间歇性跛行、下肢静息痛，甚至出现溃疡、坏疽等严重并发症，可导致截肢、死亡。随着医学技术的进步，外科血管搭桥术和介入腔内成形术已成为下肢缺血性疾病的重要治疗手段。但是，对于那些下肢血管弥漫性闭塞、膝下流出道差的严重下肢缺血患者，无论是通过外科手术还是介入腔内治疗，下肢血供都难以恢复正常，缺血症状也无法得到改善，最终仍然无法避免截肢等严重问题，患者预后差、病死率高。

自“治疗性血管新生”的理念提出后，通过局部注射或动脉回输干细胞治疗促进下肢缺血部位血管新生、加强侧支循环的建立、改善组织供血被认为是严重下肢缺血性疾病最具前景的治疗方式。但是，促进血管新生只在部分动物实验中得到了验证，而在临床的应用中却发现患者的截肢率、无截肢生存率、生存率这些主要终点结果并未得到显著提高，远远还没有达到我们所预期的效果。这可能与干细胞在体内低效的血管生成能力有关，因此我们急需探求一种更为有效的促血管生成方法，为转向临床应用奠定基础。

下肢缺血性疾病多是在高血压、糖尿病、高血脂、吸烟等众多危险因素作用下，血管内膜受到损伤，修复后的炎症增生性反应造成血管狭窄或闭塞，血供缺失。内皮细胞是血管内膜的重要构成细胞，直接与血液接触，是物质间交换的屏障，在血管组织修复和再生中起到了重要作用。内皮细胞的来源主要有两大类：一是直接从人体的组织中提取获得血管内皮细胞，二是通过对干细胞进行定向诱导分化后获取的内皮细胞。越来越多的证据提示内皮细胞可以帮助血管生成，但是目前最突出的问题是内皮种子细胞来源匮乏，获得大量自体内皮细胞较为困难，这也限制了其在临床的广泛应用。因此，寻求其它途径来源的内皮细胞作为替代细胞是解决再生医学领域内皮种子细胞匮乏的有效方法。

随着再生医学的发展和对干细胞研究的不断深入，利用干细胞的多向分化潜能进行血管重建来改善局部组织缺血的治疗模式成为近年来许多学者关注的重点。而寻求一种具备自我更新和多谱系分化能力，并拥有稳定、可靠来源的多能干细胞更是首要问题。骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)能够高度自我更新，易于分离，在体外培养扩增能力较强，在各种适当的细胞因子、药物及细胞外基质的调节作用下，它可以定向分化形成血管内皮细胞，由此诱导出来的细胞在临床应用时不受伦理学限制、不存在组织配型及免疫排斥等问题，有望成为治疗严重的下肢缺血性疾病中所需的内皮细胞的理想来源。很多研究人员在干细胞的诱导方面开展了大量工作，有报道称，在体外环境下给予间充质干细胞特定的诱导刺激条件，可以诱导其分化形成内皮细胞，并且能够表达内皮细胞相关标志物，例如梁峰等在中国医学科学院学报中公开的《体外诱导人骨髓间充质干细胞定向血管内皮细胞分化》。但是在不同的研究中所采用的诱导方案存在着差异，具体的内皮细胞分化效率在许多研究中也并不清楚，而且至今也没有一种稳定、高效、快速的诱导方案，这也是困扰其应用的一个难题。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种人骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的诱导培养基及诱导方法。本发明采用改良的诱导培养基，氢化可的松与抗坏血酸和肝素能够起到协同作用，提高诱导效果，可以稳定、高效、快速的从骨髓间充质干细胞诱导获得内皮细胞，内皮细胞的比例高达93.5％。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种人骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的诱导培养基，包括基础培养基和添加成分，所述的基础培养基为IMDM培养基，所述的添加成分包括血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、胎牛血清、青-链霉素以及肝素。

血管内皮生长因子(VEGF)，是一种在内皮分化、增殖、血管形成中起核心作用的活性细胞因子。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)像VEGF一样，可以促进内皮细胞增殖和迁移、毛细血管生长，与VEGF可以起到协同诱导作用。表皮细胞生长因子(EGF)能促进上皮细胞、成纤维细胞的增值；增强表皮细胞的活力。胰岛素样生长因子(insulin like growthfactor，IGF)是一组具有促生长作用的多肽类物质。诱导培养基中包含此四种细胞因子，可以诱导人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化。但申请人发现在实验中，尽管可以诱导成功，但诱导结果不稳定，诱导出的内皮细胞的比例也较低。肝素是由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，一般可以作为抗凝剂。而申请人在实验中意外并惊喜的发现，在诱导培养基中添加肝素后，可以提高诱导效果的稳定性，还可以提高诱导出的内皮细胞的比例。

进一步的方案，所述的添加成分包括血管内皮生长因子30-100ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子5-30ng/ml、表皮细胞生长因子2-20ng/ml、胰岛素样生长因子5-40ng/ml、体积分数为2-10％的胎牛血清、体积分数为1％的青-链霉素以及肝素5-50μg/ml。

通过调整合适比例的细胞因子、胎牛血清以及肝素的添加量，可以稳定的达到较好的诱导效果，提高诱导出的内皮细胞的比例。

进一步的方案，所述的IMDM培养基中还含有抗坏血酸，所述的抗坏血酸的含量为0.5-10μg/ml。

本方案中在诱导培养基中又添加了一定量的抗坏血酸，申请人在试验中发现，抗坏血酸与肝素能够起到一定的协同诱导作用，可以提高诱导出的内皮细胞的比例。

优选的，所述的抗坏血酸与肝素的添加量的比例为1:5-20。

进一步的方案，所述的IMDM培养基中还含有氢化可的松，所述氢化可的松的含量为0.5-10μg/ml；

本方案中在诱导培养基中还添加了一定量的氢化可的松。申请人在试验中发现，氢化可的松与肝素也能够起到一定的协同诱导作用，可以提高诱导出的内皮细胞的比例。

优选的，所述的氢化可的松与肝素的添加量的比例为1:5-15。

本发明中，诱导培养基中在已经添加肝素、细胞因子等成分的基础上，可以添加抗坏血酸和氢化可的松中的一种，也可以两种同时添加。申请人发现，当两种都添加时，氢化可的松、抗坏血酸和肝素三者可以起到更好的协同诱导作用，进一步提高诱导的内皮细胞的比例，也可以增加诱导试验的稳定性。

优选的，所述的氢化可的松与抗坏血酸和肝素的添加量的比例为1:1-3:8-10。

进一步的方案，所述的诱导培养基在低温下进行配制，所述的低温为0-8℃；

优选的，所述的低温为0-4℃。

本方案在配制诱导培养基时采用低温环境，远离高温，确保诱导培养基中各种细胞因子等有效成分的活性，保证诱导效果。具体的，诱导培养基可以在冰上进行配制，远离酒精灯，避免细胞因子因为温度升高而失活。

本发明的第二目的是提供一种人骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的诱导方法，包括以下步骤：

(1)从人骨髓血中分离获得骨髓间充质干细胞，并进行培养；

(2)通过检测细胞表面抗原，鉴定骨髓间充质干细胞；

(3)配置诱导培养基，将鉴定后的骨髓间充质干细胞置于诱导培养基中进行培养，获得骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞。

进一步的方案，所述的诱导培养基包括基础培养基和添加成分，所述的基础培养基为IMDM培养基，所述的添加成分包括血管内皮生长因子80-150ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子5-30ng/ml、表皮细胞生长因子5-30ng/ml、胰岛素样生长因子5-50ng/ml、体积分数为2-10％的胎牛血清、体积分数为1％的青-链霉素以及肝素5-50μg/ml；

优选的，所述的添加成分还包括0.5-10μg/ml的抗坏血酸、和/或0.5-10μg/ml的氢化可的松；

优选的，所述的氢化可的松与抗坏血酸和肝素的添加量的比例为1:1-3:8-10。

进一步的方案，所述的诱导培养基在低温下进行配制，所述的低温为0-8℃；

优选的，所述的低温为0-4℃；

优选的，所述的诱导培养基在冰上进行配制。

进一步的方案，步骤(1)中，将人骨髓血用PBS溶液等体积稀释后，缓慢叠加到等体积的人淋巴细胞分离液的上部，离心；离心后液体分四层，吸取第二层云雾状的单个核细胞层移入新管，用PBS悬浮，离心，洗涤，用含有10％FBS、1％青-链霉素的IMDM培养基重悬细胞，接种到培养板上进行培养。

进一步的方案，当培养的骨髓间充质干细胞的细胞密度达到80％融合时，进行传代培养，方法包括：

(1)弃掉骨髓间充质干细胞的培养液，加入适量PBS洗涤，

(2)加入含有0.25％胰酶的消化液，放置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中进行消化，在倒置相差显微镜下观察细胞形态来控制消化时间；当细胞皱缩变圆、间隙变大、部分脱壁而悬浮于消化液中时，加入含有FBS的IMDM培养基中止消化过程；

(3)拍打培养瓶使贴壁细胞全部脱落，收集细胞悬液至离心管内，离心，弃上清，加入含有10％FBS的IMDM培养基进行重悬，按照1：3的比例传代，将培养板放置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中进行培养；

优选的，当步骤(3)中细胞融合达到80％时，重复步骤(1)-(3)再次进行传代培养。

进一步的方案，步骤(2)中，选取生长状态良好的骨髓间充质干细胞(BMSCs)，例如待贴壁细胞出现典型的长梭形结构时，加入胰酶消化、加入含有FBS的IMDM培养基中止消化过程、离心、PBS洗涤2次，用PBS重悬细胞制成100μL细胞悬液，加入APC-CD29、PE-Cy7-CD44、FITC-CD90、PE-CD105、PerCP-Cy5.5-CD31、APC-Cy7-CD34流式抗体，充分混匀避光孵育，PBS液洗涤，离心，加PBS重悬、混匀，通过流式细胞分析仪检测这六种表面分子的表达情况。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、采用本发明的诱导培养基，通过1周时间的诱导可以稳定、高效、快速的获得内皮细胞，其中内皮细胞比例高达93.5％。体外成血管实验中诱导而来的内皮细胞能在Matrigel基质中形成管腔状结构，且能摄取Ac-LDL，表明诱导而来的内皮细胞具有真正内皮细胞的功能。因此，本发明的诱导培养基的诱导效率高，诱导速度快，细胞生长状态良好，可以稳定、高效、快速的从骨髓间充质干细胞诱导获得高比例的内皮细胞。

2、本发明的诱导培养基中添加了氢化可的松、抗坏血酸和肝素，三者在一定比例范围内时能够起到协同作用，大大提高诱导效果，提高内皮细胞的获得比例。

3、本发明在配制诱导培养基时采用低温环境，远离高温，确保诱导培养基中各种细胞因子等有效成分的活性，保证诱导效果。具体的，诱导培养基可以在冰上进行配制，远离酒精灯，避免细胞因子因为温度升高而失活。

4、本发明配制诱导培养基后，采用低温保存，使用期限为两周以内，超过两周的诱导培养基需要重新配制，最大限度的保持培养基中细胞因子的活性。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1是普通培养基培养的人骨髓间充质干细胞的形态示意图；

其中，A为培养48h，B为培养72h；

图2是流式细胞仪检测未诱导骨髓间充质干细胞表面抗原的表达情况；

图3是诱导培养基进行诱导培养的人骨髓间充质干细胞的形态示意图；

其中，A为诱导培养3d后，B为诱导培养7d后；

图4是流式细胞仪检测诱导后细胞CD31和CD34表达情况；

其中，A为诱导培养3d后，B为诱导培养7d后；

图5是Dil-Ac-LDL吞噬功能实验结果图；

其中，A为诱导后的分化成的内皮细胞能够吞噬Dil-Ac-LDL而发出红色荧光；B为未诱导的BMSCs，不能吞噬Dil-Ac-LDL，不能发出红色荧光；

图6为Matrigel基质胶体外成血管实验结果图；

其中，A为未诱导的BMSCs，在Matrigel基质胶上呈单个细胞分布或者多个细胞聚集成团，未见管腔样结构形成；B为诱导3d后的细胞，在Matrigel基质胶上形成了少量管腔状结构；C为诱导7d后的细胞在基质胶上形成的管腔状结构明显增多，并且相互交叉形成网格状结构。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件，未注明具体来源的成分，如无特别说明，均通过市售获得。

实施例1到实施例8

实施例1到实施例8各自提供一种诱导培养基，基础培养基为IMDM培养基，向IMDM培养基中加入体积分数为1％的青-链霉素，其他的添加成分如表1所示，按照下表的各成分含量添加到IMDM培养基中，在冰上配制成诱导培养基，置于4℃冰箱中，两周内使用。

表1实施例1到实施例8的诱导培养基的添加成分及用量

实施例9

BMSCs的分离和传代培养

取人骨髓血10～20ml，与等体积PBS充分混匀，缓慢叠加到等体积Ficoll分离液(1.077g/ml)面上，避免与人淋巴细胞分离液混合，在4℃、800g/min的条件下离心20min。经过离心后液体分为四层，最上层为血浆、血小板层，第二层为单个核细胞(Mononuclearcells,MNCs)层，第三层为淋巴细胞分离液层，最底层为红细胞和多核细胞层。吸取血浆层和淋巴细胞分离液层之间呈云雾状的MNCs层液体至新的离心管内，加入适量PBS混匀后，在4℃、700g/min的条件下离心5min，弃去上清，以去除残留分离液。再加入5ml PBS重悬细胞，反复吹打2～3次后，在4℃、500g/min条件下离心5min，弃去上清。加入含有10％FBS、1％青-链霉素的IMDM培养基重悬细胞，充分吹打使之成为均匀的单细胞悬液，然后在计数板上进行细胞计数。按照2×10⁵/cm²的密度将细胞接种于培养板上，然后置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养。

培养48h后首次全量更换培养液，如图1中A所示，骨髓间充质干细胞的贴壁细胞呈梭型、圆形、多角形，用PBS充分洗涤3次，弃除所有非贴壁细胞，黏附的贴壁细胞继续进行培养。每日在倒置相差显微镜下观察这些贴壁细胞的生长状态，每3d需要更换一次培养液。如图1中B所示，培养一段时间后，骨髓间充质干细胞的贴壁细胞形态均一、呈长梭形结构。待细胞密度达到80％融合时，弃去培养液，加入适量PBS轻洗2次，再加入1ml含有0.25％胰酶的消化液，放置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中消化大约2min，期间可以在倒置相差显微镜下观察细胞形态、控制消化时间，当细胞皱缩变圆、间隙变大、部分脱壁而悬浮于消化液中时，加入含有FBS的IMDM培养基中止消化过程。轻轻拍打培养瓶使贴壁细胞全部脱落，收集细胞悬液至离心管内，在室温条件下以1200rpm/min的转速离心5min，弃去上清。加入10ml含有10％FBS的IMDM培养基进行重悬，然后按照1：3的比例传代，将培养板放置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养。每天在倒置相差显微镜下观察传代细胞的生长状态，待细胞融合达到80％时，可继续按照上述步骤再次传代培养。

实施例10

流式细胞仪检测BMSCs表面抗原

选取生长状态良好的BMSCs，加入0.25％胰酶消化大约2min，在倒置相差显微镜下观察，待BMSCs皱缩变圆、部分脱落后，加入含有FBS的IMDM培养基中止消化过程，并轻轻吹打，将BMSCs收集到流式管中，以1200rmp/min的转速离心5min，弃去上清，用PBS漂洗2次，洗去残留培养液，在流式管中加入100μl PBS，重悬细胞，按流式抗体说明书在重悬细胞中分别加入荧光标记抗体：APC-CD29、PE-Cy7-CD44、FITC-CD90、PE-CD105、PerCP-Cy5.5-CD31和APC-Cy7-CD34各5μl，置于室温条件下避光孵育20min。用PBS洗涤2次，彻底去除未结合的荧光抗体，在流式管中加入200μl PBS，重悬细胞，将其置于流式细胞仪上检测BMSCs表面抗原表型，使用FlowJo软件进行后续分析。

结果如图2中所示，CD29、CD44、CD90、CD105呈阳性表达，表达量均大于95％，而CD31、CD34不表达，可见，本发明方法分离得到的干细胞中没有内皮细胞，纯度很高，此外，检测结果还检测到CD31、CD34的表达，说明诱导后的内皮细胞的确是由BMSCs分化而来。

需要说明的是，本领域技术人员知晓，免疫组化、免疫荧光等均为定性或半定量的方法，可以检测小样本的一种细胞表面分子；而流式细胞仪是量测量的方法，用于检测样本中的多种细胞表面分子的检测，虽然对细胞表面多个分子的检测更加方便，但是花费相对更高，对实验技术要求相对较高，尤其是需要样本中的待检测的细胞达到一定数量时才能够进行检测。但是由于本技术领域中很少有人能够得到足够量的内皮细胞，因此，本领域技术人员通常通过免疫组化、免疫荧光检测定向分化获得的内皮细胞。

可见，本发明通过流式细胞仪对获得的内皮细胞进行检测，得到“CD29、CD44、CD90、CD105呈阳性表达，表达量均大于95％，而CD31、CD34不表达”的结果不仅说明了本发明方法获得了本技术领域无法达到的内皮细胞数量，而且，成功地将流式细胞仪用于BMSCs表面抗原的检测，实现了内皮细胞的定量检测，对本技术领域做出的了巨大的贡献。

实施例11

BMSCs向内皮细胞定向诱导分化

①按下列成分配制培养基(配制过程在冰盒上进行)

a普通培养基：

含10％FBS、1％青-链霉素的IMDM培养基；

b内皮细胞定向诱导培养基：

采用实施例1到实施例8的诱导培养基；

②在6孔培养板上分离培养BMSCs，将其分为两组：未诱导组和诱导组，未诱导组每天更换普通培养基，而诱导组每天更换内皮细胞定向诱导培养基，定期于倒置相差显微镜下观察细胞诱导过程中的变化情况。

结果如图3中所示，A为诱导3d后，细胞呈现短梭形、多角形结构，细胞分布稀疏；B为诱导7d后，细胞密度增加，呈现短梭形、多角形结构。

试验例1

流式细胞仪检测诱导后细胞内皮标志物表达水平

于诱导后第3d、7d，在相应的孔内加入0.25％胰酶消化待检测目的细胞2min，通过倒置相差显微镜观察，待细胞皱缩变圆、部分脱落后，加入含有FBS的IMDM培养基中止胰酶消化，并轻轻吹打，将细胞悬液收集于流式管中，以1200rpm/min的转速离心5min，弃去上清，用PBS再洗涤2次，洗去残留培养液，每管加入100μl PBS，重悬细胞，按流式抗体说明书在重悬细胞中分别加入5μl荧光标记抗体：PerCP-Cy5.5-CD31和APC-Cy7-CD34混匀，置于室温条件下避光孵育20min，用PBS充分洗涤2次，完全去除未结合的荧光抗体，在每管细胞中加入200μl PBS，重悬细胞。上机前轻弹流式样品管使细胞悬液均匀，置于流式细胞仪上检测诱导前后细胞内皮标志物阳性表达率，以FlowJo软件分析CD31和CD34表达情况。

结果如图4所示的流式细胞仪检测诱导后细胞CD31和CD34表达情况：以实施例1的诱导培养基进行诱导3d后CD31、CD34双阳性细胞占37.2％；诱导7d后CD31、CD34双阳性细胞可高达93.5％，说明骨髓间充质干细胞已经高效地分化成内皮细胞。以其他实施例的诱导培养基的结果相似。

试验例2

Dil-Ac-LDL吞噬功能实验

Dil-Ac-LDL为荧光活性染料Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate acetylated low density lipoprotein,Dil-ac-LDL)，真正的内皮细胞能够吞噬、摄取Ac-LDL，这是内皮细胞重要的生物学特性之一，常作为鉴定内皮细胞的重要指标，我们于诱导后第7d，分别对未诱导组和诱导组细胞进行Dil-Ac-LDL吞噬试验。

具体实验步骤如下：

①小心吸出培养孔中原培养液，加入无菌PBS轻轻漂洗细胞3次，每次2min，避免贴壁的细胞层脱落；

②将含有Dil-Ac-LDL(10μg/ml)的无血清IMDM培养基加到培养板内，然后将培养板放置到37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温培养箱中孵育4h；

③吸除含有Dil-Ac-LDL的培养基，加入PBS充分清洗3次，每次5min，完全去除未被吞噬的荧光物质，减少背景干扰；

④在培养孔中加入4％多聚甲醛溶液，在室温条件下固定30min；

⑤加入PBS清洗细胞3次，每次5min；

⑥使用荧光显微镜观察两组细胞吞噬Dil-Ac-LDL的情况、摄片保存。

结果如图5中所示，A为诱导后的分化成的内皮细胞能够吞噬Dil-Ac-LDL而发出红色荧光；B为未诱导的BMSCs，不能吞噬Dil-Ac-LDL，不能发出红色荧光。

试验例3

1、Matrigel基质胶体外成血管实验

为了鉴定经过诱导分化后的细胞是否具有类似内皮细胞极具特征性的血管形成能力，我们以未诱导组的细胞作为对照，将诱导组和未诱导组细胞分别接种到Matrigel基质胶上进行体外成血管实验。

具体实验步骤如下：

①预先将高压灭菌的枪头、96孔板置于4℃冰箱冷藏过夜、备用，将-20℃保存的Matrigel基质胶置于4℃冰箱内解冻融化、备用；

②将融化的Matrigel基质胶和无血清IMDM培养基按1：1比例混合均匀，在96孔板每孔中加入50μl稀释的Matrigel基质胶进行包被，加胶时注意枪头垂直于孔中央，操作过程中要避免产生气泡，所有操作均在冰盒上进行；

③将Matrigel基质胶包被的96孔板放置在37℃、5％CO2培养箱中静置10min，使其凝固成胶；

④加入0.25％胰酶常规消化未诱导组以及诱导组的细胞2min，通过倒置显微镜观察、控制消化时间，当贴壁细胞皱缩变圆、间隙变大、部分脱壁而悬浮于消化液上后，加入含有FBS的IMDM培养基中止胰酶消化，用移液枪轻轻吹打培养孔中的细胞使其全部脱落，将细胞悬液收集至EP管内，以3000rpm/min的转速离心5min，弃去上清；

⑤加入PBS洗涤2次，洗去残留培养液，加入IMDM培养基，将消化后的细胞制成单细胞悬液，计数；

⑥将细胞悬液按照2×10⁴个细胞/孔的密度接种到96孔板中，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中孵育12h；

⑦使用倒置相差显微镜观察各组细胞在体外形成管状结构的情况、摄片保存。

2、Matrigel基质胶体外成血管免疫荧光检测

为了明确Matrigel基质胶上的血管状结构是由BMSCs诱导而来的内皮细胞参与形成的，我们对形成的管腔状结构进行了免疫荧光染色。

具体实验步骤如下：

①Matrigel基质胶体外成血管实验步骤同前；

②管腔状结构形成之后，使用移液枪小心吸出培养液，切勿破坏胶层，加入PBS轻轻洗涤3次，每次5min；

③加入4％多聚甲醛溶液100μl，在室温条件下固定30min，加入PBS清洗3次，每次5min；

④室温下加入3％BSA封闭30min；

⑤在不同的孔内分别加入一抗，即按照1：200比例稀释后的兔抗人CD31和CD34抗体，放入湿盒，在4℃冰箱中过夜孵育，加入4℃PBS清洗细胞3次，每次5min；

⑥加入二抗，即按照1：200比例稀释后的AlexaFluor-488标记的羊抗兔IgG，在室温条件下避光孵育2h，加入4℃PBS清洗细胞3次，每次5min；

⑦用含有DAPI的抗荧光衰减剂染核，精细操作，注意避免产生气泡；

⑧通过荧光显微镜观察管状结构上荧光表达情况、摄片保存。

结果如图6中所示，A为未诱导的BMSCs，在Matrigel基质胶上呈单个细胞分布或者多个细胞聚集成团，未见管腔样结构形成；B为诱导3d后的细胞，在Matrigel基质胶上形成了少量管腔状结构；C为诱导7d后的细胞在基质胶上形成的管腔状结构明显增多，并且相互交叉形成网格状结构。

试验例4

抗坏血酸和/或氢化可的松与肝素协同作用试验

组1-18的诱导培养基的基础培养基为IMDM培养基，向IMDM培养基中加入体积分数为1％的青-链霉素，体积分数为10％的FBS、50ng/ml的VEGF，10ng/ml的bFGF、5ng/ml的EGF，20ng/ml的IGF，其它的添加成分如表2中所示。

采用组1-18的诱导培养基，按照实施例9-11的方法进行诱导，诱导7天后采用流式细胞仪检测诱导后细胞内皮标志物表达水平，获得内皮细胞的获得率，结果如表2中所示。

表2其它添加成分、用量及内皮细胞获得率

由上表中可以看出，与对照组相比，单独向培养基中添加肝素、抗坏血酸和氢化可的松时均能够起到一定的提高内皮细胞获得率的作用；当肝素与抗坏血酸或者氢化可的松两种成分同时添加时，相对于添加一种成分，能够提高内皮细胞获得率，而同时仅同时添加抗坏血酸和氢化可，内皮细胞获得率变化不大，说明肝素与抗坏血酸或者氢化可的松能够起到协同诱导的作用；而当肝素与抗坏血酸和氢化可的松同时采用一定的比例添加时，内皮细胞获得率大大提高，说明三者可以起到协同诱导的作用。试验证明，当所述的氢化可的松与抗坏血酸和肝素的添加量的比例为1:1-3:8-10时，效果最佳，内皮细胞获得率达到95％以上。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (10)

1.一种人骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基为包括肝素及基本成分的IMDM培养基；

其中，诱导培养基中肝素的用量为5-50μg/ml。

2.如权利要求1所述培养基，其特征在于，所述基本成分包括胎牛血清、青-链霉素和具有表皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子的生长因子；

其中，所述生长因子还包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子；

其中，所述胎牛血清用量为培养基总体积的为2-10％、青-链霉素用量为培养基总体积的1％；血管内皮生长因子30-100ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子5-30ng/ml、表皮细胞生长因子2-20ng/ml、胰岛素样生长因子5-40ng/ml。

3.根据权利要求1或2所述的诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基中还含有抗坏血酸，所述的抗坏血酸的含量为0.5-10μg/ml；

优选的，所述的抗坏血酸与肝素的添加量的比例为1:5-20。

4.根据权利要求1-3任一所述的诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基中还含有氢化可的松，所述氢化可的松的含量为0.5-10μg/ml；

优选的，所述的氢化可的松与肝素的添加量的比例为1:5-15；

优选的，所述的氢化可的松与抗坏血酸和肝素的添加量的比例为1:1-3:8-10。

5.根据权利要求1-3任一所述的诱导培养基，其特征在于，所述的诱导培养基在低温下进行配制，所述的低温为0-8℃；

优选的，所述的低温为0-4℃。

6.一种人骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)应用密度梯度离心法从人骨髓血中分离获得待测母细胞，并对待测母细胞进行培养，得到待测细胞；

(2)通过检测细胞待测细胞表面抗原，鉴定获得骨髓间充质干细胞；

(3)配置诱导培养基，将鉴定获得的骨髓间充质干细胞置于诱导培养基中进行培养，获得骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞。

7.根据权利要求6所述的诱导方法，其特征在于，所述的诱导培养基所述诱导培养基为包括肝素及基本成分的IMDM培养基；

其中，所述基本成分包括胎牛血清、青-链霉素和生长因子；

其中，所述生长因子包括表皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子；

其中，诱导培养基中肝素的用量为5-50μg/ml、胎牛血清用量为培养基总体积的为2-10％、青-链霉素用量为培养基总体积的1％；表皮细胞生长因子2-20ng/ml、胰岛素样生长因子5-40ng/ml、血管内皮生长因子30-100ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子5-30ng/ml。

优选的，所述的添加成分还包括0.5-10μg/ml的抗坏血酸、和/或0.5-10μg/ml的氢化可的松；

优选的，所述的氢化可的松与抗坏血酸和肝素的添加量的比例为1:1-3:8-10。

8.根据权利要求6或7所述的诱导方法，其特征在于，所述的诱导培养基在低温下进行配制，所述的低温为0-8℃；

优选的，所述的低温为0-4℃；

优选的，所述的诱导培养基在冰上进行配制。

9.根据权利要求6-8任一所述的诱导方法，其特征在于，步骤(1)中，将人骨髓血用PBS溶液等体积稀释后，缓慢叠加到等体积的人淋巴细胞分离液的上部，离心；离心后液体分四层，吸取第二层云雾状的单个核细胞层移入新管，用PBS悬浮，离心，洗涤，用含有10％FBS、1％青-链霉素的IMDM培养基重悬细胞，接种到培养板上进行培养。

10.根据权利要求9所述的诱导方法，其特征在于，当培养的骨髓间充质干细胞的细胞密度达到80％融合时，进行传代培养，方法包括：

(1)弃掉骨髓间充质干细胞的培养液，加入适量PBS洗涤，

(2)加入含有0.25％胰酶的消化液，放置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中进行消化，在倒置相差显微镜下观察细胞形态来控制消化时间；当细胞皱缩变圆、间隙变大、部分脱壁而悬浮于消化液中时，加入含有FBS的IMDM培养基中止消化过程；

(3)拍打培养瓶使贴壁细胞全部脱落，收集细胞悬液至离心管内，离心，弃上清，加入含有10％FBS的IMDM培养基进行重悬，按照1：3的比例传代，将培养板放置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中进行培养；

优选的，当步骤(3)中细胞融合达到80％时，重复步骤(1)-(3)再次进行传代培养。