CN101979104A - 多孔壳聚糖支架、神经干细胞多孔壳聚糖支架及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多孔壳聚糖支架、神经干细胞多孔壳聚糖支架及其用途，将壳聚糖溶于乙酸中成为2%的溶液,向细胞培养板的孔中加入该溶液，冷冻干燥，然后向细胞培养板的孔中加入NaOH水化处理，最后再进行两次-60℃冷冻干燥，得到多孔壳聚糖支架。取神经干细胞克隆球接种于培养孔内灭菌的壳聚糖多孔支架上，加入DMEM/F12无血清培养基或加入含NGF的DMEM/F12无血清培养基，培养得到神经干细胞多孔壳聚糖支架。本发明采用低温冷冻干燥法制备得到的壳聚糖多孔支架孔隙均匀，孔隙率达90%，平均孔径为50～350μm，壳聚糖多孔支架具有良好的NSCs生物相容性。创伤性脑损伤后，经壳聚糖作载体的NSCs移植治疗,可明显改善伤后的学习、记忆等认知功能。

Description

多孔壳聚糖支架、神经干细胞多孔壳聚糖支架及其用途 

技术领域

本发明涉及一种组织工程制品及其用途。 

背景技术

中枢神经系统(central nervous system，CNS)损伤后的再生一直是困扰人类的难题，虽然1992年Reynolds和Richards最先从成鼠的纹状体和海马中分离出了神经干细胞(neural stem cells，NSCs)，此后人们又相继发现成年哺乳动物CNS中的大脑皮质、嗅球、隔区、脊髓等其它区域也存在NSCs，从而打破了传统认为CNS成年后不能再生的观念，但是内源性的NSCs应对CNS损伤产生新的功能性神经元的能力有限。NSCs能够在体外扩增并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。随着胚胎和成体神经干细胞分离、培养技术的成熟，移植外源性NSCs为治疗CNS损伤和神经系统退行性病变提供了广阔的应用前景。目前，利用外源性NSCs移植治疗帕金森病、老年性痴呆、脊髓损伤、休克、癫痫、精神病等神经系统疾病取得了不少进展。 

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是以细胞丢失为主要特征的进行性退行性病变。以往TBI的治疗侧重于药物治疗以减轻急性期的继发性脑损伤和提高慢性进展期存活脑组织的功能，而细胞移植作为TBI治疗手段之一只在最近才开始被研究。作为可移植的细胞种类很多，如永生化祖细胞、NSCs、胚胎神经组织、骨髓基质细胞、脐血细胞、有丝分裂后神经元等。而NSCs具有多分化潜能、低免疫原性、取材容易、来源广泛等特点，因此从临床应用和伦理角度都具有更大的优势。以往的研究大多是单纯的细胞移植或联合某种因子移植来治疗TBI，但移植物的长期存活仍然存在较高的可变性，为了移植的细胞能真正替代中枢神经系统损伤丢失的细胞，移植的细胞必须有足够的存活数量以替代死亡的细胞，因此有必要在损伤区想方设法重建组织结构以利于再生。研究发现如果不给予干预因素，大部分NSCs分化成了胶质细胞，仅少数分化为神经元。单纯的细胞移植由于缺乏必要的三维空间物质基础而不利于NSCs的存活和迁移，也不利于应用干预因素促进NSCs向 神经元分化。随着21世纪生命科学中组织工程(tissue engineering)的兴起，为真正地实现细胞替代疗法提供了新的希望。 

组织工程是应用生命科学和工程学的基本原理，开发能恢复、维持或改善受损组织或器官功能的生物替代物。新生的组织工程化组织首先需要构建细胞----支架复合物，主要包括合适的细胞载体及种子细胞，其关键之一就是组织工程三维多孔支架载体的制备。支架载体的三维空间结构可以为细胞提供获取营养、气体交换、排泄废物和生长代谢的场所，为人为地加入干预因素调控种子细胞的分化提供了条件，也是形成新的具有形态和功能的组织、器官的物质基础。在应用组织工程修复神经系统的研究中，理想的载体应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性。壳聚糖的结构和某些性质与细胞外基质中的主要成分氨基多糖极其相似，而且表面高密度的正电荷有利于粘附带负电荷的细胞。而NSCs由于具有来源广泛、取材容易和多向分化潜能等特点，是一种理想的种子细胞。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种与神经干细胞具有生物相容性、制备方便、可用于修复脑损伤的多孔壳聚糖支架、神经干细胞多孔壳聚糖支架及其用途。 

本发明的技术解决方案是： 

一种多孔壳聚糖支架，其特征是：由下列方法制备而成：将壳聚糖溶于1％乙酸中成为2％W/V的溶液，向细胞培养板的孔中加入该溶液，盖好，于4℃预冷，再置于-28℃冷冻过夜，后在-60℃下冷冻干燥，然后向细胞培养板的孔中加入0.1mol/L NaOH水化处理，再用pH7.2的0.01mol/L PBS清洗，最后再进行两次-60℃冷冻干燥，得到多孔壳聚糖支架。 

所述的多孔壳聚糖支架，由下列方法制备而成：将壳聚糖溶于1％乙酸中成为2％W/V的溶液，向24孔细胞培养板每孔中加入1ml该溶液，盖好，于4℃预冷6h，再置于-28℃冷冻过夜，后在-60℃下冷冻干燥24h，然后向每孔中加入0.1mol/L NaOH 1ml水化20min，再用pH7.2的0.01mol/L PBS清洗3次，最后再进行两次各24小时-60℃冷冻干燥，得 到多孔壳聚糖支架。 

一种神经干细胞多孔壳聚糖支架，其特征是：由下列方法制成：取神经干细胞克隆球接种于培养孔内灭菌的壳聚糖多孔支架上，加入DMEM/F12(即培养基中含有DMEM和F12两种成分)无血清培养基或加入含NGF的DMEM/F12无血清培养基，培养得到神经干细胞多孔壳聚糖支架。 

所述的神经干细胞多孔壳聚糖支架，由下列方法制成：取神经干细胞克隆球以1×10⁵个/ml的密度，接种于培养孔内灭菌的壳聚糖多孔支架上，加入DMEM/F12无血清培养基1.5ml或加入含100ng/ml NGF的DMEM/F12无血清培养基1.5ml，培养板置饱和湿度、37℃、5％CO₂培养箱中培养2周，每隔4天换1/2培养液，得到神经干细胞多孔壳聚糖支架。 

一种神经干细胞多孔壳聚糖支架在制备修复脑损伤的制品中的应用。 

本发明采用低温冷冻干燥法制备得到的壳聚糖多孔支架孔隙均匀，孔隙率达90％，平均孔径为50～350μm。NSCs可以在壳聚糖多孔支架中存活、迁移并向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化，壳聚糖多孔支架具有良好的NSCs生物相容性。大鼠创伤性脑损伤后，经壳聚糖作载体的NSCs移植治疗，可明显改善伤后大鼠的学习、记忆等认知功能。大鼠创伤性脑损伤后，经壳聚糖作载体的NSCs移植治疗，移植物可以抑制损伤区周围的胶质疤痕的形成，减轻损伤侧海马的萎缩变形。大鼠创伤性脑损伤后，经壳聚糖作载体的NSCs移植治疗，移植的NSCs在体内壳聚糖多孔支架中分化的功能性细胞可与宿主脑组织建立联系。NGF在体内、外均可以促进壳聚糖多孔支架中的NSCs向神经元分化及，在体内还可促进植入NSCs分化的神经元与宿主脑组织建立联系，并促进创伤性脑损伤大鼠认知功能的改善。 

下面结合实施例对本发明作进一步说明。 

具体实施方式：

第一部分：体外实验 

壳聚糖支架的制备及与神经干细胞生物相容性 

1实验材料 

1.1实验动物 

孕15d Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，由南通大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(苏)2002-0019。 

1.2实验仪器 

①低温冷冻干燥仪(Lyopro3000，法国Jouan公司)； 

②CO₂培养箱(法国Jouan公司)； 

③超净工作台(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司)； 

④低温冷冻离心机(美国Beckman公司)； 

⑤Leica CM1900恒冷箱冰冻切片机(德国)； 

⑥Leica DMR正置荧光显微镜(德国)； 

⑦Leica DMIRB倒置荧光显微镜(德国)； 

⑧NUAIRE超低温冰箱(-85℃，美国)； 

⑨捷达801系列形态学分析系统(江苏省捷达科技发展有限公司)。 

1.3实验试剂 

1.3.1壳聚糖支架制备主要试剂壳聚糖(chitosan，Cat.No.9012-76-4)Sigma公司。0.1mol/L NaOH，0.01mol/L PBS(pH7.2)，无菌生理盐水，70％的乙醇。 

1.3.2细胞培养主要试剂DMEM培养基(Dulbecco’s Modified EagleMedium，12100-038)，F12培养基(F12Nutrient Mixture，Cat.No.21700-026)，无血清培养添加剂B27(B27Supplement，Cat.No.17504-044)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS，Cat.No.16140-087)均购自Gibco公司。Hepes(N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid，羟乙基哌嗪乙硫磺酸，Cat.No.H3375)，小牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA，Cat.No.A3156)，表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF，Cat.No.E4127)，碱性成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor-Basic，bFGF，Cat.No.F0291)，白血病抑制因子(LeukemiaInhibitory Factor，LIF，Cat.No.L5283)均购自Sigma公司。 

1.3.3抗体试剂小鼠抗微管相关蛋白-2单克隆抗体(MouseAnti-MAP-2 Monoclonal Antibody，Cat.No.MAB3418)，小鼠抗胶质纤维酸性蛋白单克隆抗体(Mouse Anti-Glial Fibrillary Acidic ProteinMonoclonal Antibody，Cat.No.MAB360)，小鼠抗2，3-环核苷酸磷酸二酯酶单克隆抗体(Mouse Anti-2’，3’-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesteraseMonoclonal Antibody，Cat.No.MAB326R)均购自于Chemicon公司。结合生物素的山羊抗鼠抗体(biotinylated anti-mouse IgG(H+L)made ingoat，Cat.No.BA-9200)，卵白素-生物素结合的辣根过氧化物酶复合物(avidin biotion horseradish peroxidase complex，ABC，Cat.No.PK-4000)均购自Vector公司。3，3-二甲基联苯胺(3，3-Diaminobenzidine，DAB，Cat.No.D-5637)购自Sigma公司。 

1.3.4其它试剂0.9％生理盐水，0.01mol/L PBS(pH7.2)(phosphatebuffer saline，磷酸盐缓冲液)，TritonX-100，10％山羊血清，4％多聚甲醛(0.1mol/L PB配制，pH 7.4)，20％、30％蔗糖溶液(0.1mol/L PB配制，pH7.4)。复合麻醉剂Chlorpent：4.25g水合氯醛，2.12g硫酸镁，0.88g戊巴比妥钠，14.25ml无水酒精，33.80ml丙二醇，双蒸水定容至100ml。抗体稀释液：用pH7.2的0.01mol/L PBS、10％山羊血清、0.3％TritonX-100和0.03％NAN₃配制而成。焦油紫染液(Cresylecht Violet)：1％焦油紫溶液中滴加冰醋酸，调节pH至3.75-3.85。分化剂：95％乙醇中滴加冰醋酸，调节pH至4.10。 

2实验方法 

2.1多孔壳聚糖支架的制备 

将壳聚糖溶于1％乙酸中成为2％(W/V)的溶液，向24孔细胞培养板每孔中加入1ml该溶液，迅速盖好，于4℃预冷6h，再置于-28℃冷冻过夜，后在-60℃下冷冻干燥24h。然后向每孔中加入0.1mol/L NaOH 1ml水化20min，再用pH7.2的0.01mol/L PBS清洗3次，最后再进行两次冷冻干燥得到多孔壳聚糖支架。接种细胞前用70％乙醇灭菌，再用无菌生 理盐水浸洗3次，最后在密封条件下经紫外灯照射20min。 

2.2多孔壳聚糖支架孔径的检测 

将制备好的多孔壳聚糖支架用0.01mol/L PBS固定于冻台，行冠状位冰冻连续切片，切片厚度为15μm，待阴干后立即镜下观察，捷达801系列形态学分析软件检测多孔支架的孔径。 

2.3多孔壳聚糖支架孔隙率的检测 

采用乙醇替代法测定，将一定体积的壳聚糖多孔支架材料置于一定体积(V1)的乙醇中，循环抽真空至无气泡逸出，材料和乙醇的总体积记为V2，视(V2-V1)为壳聚糖多孔支架固体的体积。将含乙醇的支架材料移出后记所剩乙醇体积为V3，以材料中所含乙醇的体积(V1-V3)为材料孔隙所占的体积，则材料的总体积为：V＝(V2-V1)+(V1-V3)＝V2-V3。所以壳聚糖多孔支架的孔隙率P＝(V1-V3)/(V2-V3)。 

2.4鼠胚神经干细胞单细胞克隆球的制备 

2.4.1鼠胚神经干细胞原代克隆和传代 

取孕15d SD大鼠1只，腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent 2ml/100g体重。无菌条件下取出鼠胚置无血清DMEM培养基中，分离出前脑，剔除脑膜和脉络膜，然后参照谭雪锋等报道的方法(谭雪锋，金国华，田美玲等.人胚胎神经干细胞的分离、克隆和分化.神经解剖学杂志，2004；20(3)：262-266)进行NSCs的分离培养、原克隆和传代。 

2.4.2单细胞克隆及扩增 

参照黄镇等报道的方法(黄镇，金国华，张新化等.提高成年大鼠神经干细胞单克隆形成率的方法.解剖学报，2002；33(6)：594-598)进行单细胞克隆和扩增，最后得到大量来源于同一细胞的第4代亚细胞系神经干细胞克隆球。 

2.5NSCs的多孔壳聚糖支架培养 

取第4代神经干细胞克隆球以1×10⁵个/mi的密度，接种于培养孔内灭菌的壳聚糖多孔支架上，分成两组，每组12孔：NSCs+支架组加入DMEM/F12无血清培养基1.5ml；NSCs+支架+NGF组加入含100ng/mlNGF的DMEM/F12无血清培养基1.5ml。培养板置饱和湿度、37℃、 5％CO₂培养箱中培养2W，每隔4d换1/2培养液。 

2.6组织固定及切片 

体外培养2W后，吸去各孔中的培养液，用0.01mol/L PBS(pH7.2)清洗3遍，吸去PBS再用含有4％多聚甲醛的0.1mol/L PBS(pH7.2)室温下固定20min，吸去多聚甲醛溶液，PBS清洗后，将贴附有NSCs的多孔壳聚糖支架行冠状位冰冻连续切片，切片厚15μm，各壳聚糖支架收集5套切片，每套取前、中、后的切片各一张，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，阴干待染色。 

2.7切片染色 

2.7.1Nissl染色两组各取一套切片，用焦油紫行Nissl染色，常规脱水、透明、封片，镜下观察。 

2.7.2MAP-2免疫组化染色两组各取一套切片，置于染缸再用0.01mol/LPBS(pH7.2)中漂洗后，每张切片滴加10％山羊血清50μl封闭过夜，吸去山羊血清每张切片滴加1∶200稀释的小鼠抗MAP-2的单克隆抗体50μl，4℃湿盒孵育24h。用0.01mol/L PBS(pH7.2)漂洗3遍，每张切片滴加1∶200稀释的结合有生物素的山羊抗小鼠的第二抗体50μl，4℃湿盒孵育24h。再用PBS洗片3遍后，每张切片滴加ABC液50μl，4℃湿盒孵育24h。最终切片经PBS洗片3遍后，用DAB呈色。常规脱水、透明、封片，镜下观察。 

2.7.3GFAP免疫组织化学染色除滴加的一抗为小鼠抗GFAP的单克隆抗体外，其余均同2.7.2。 

2.7.4CNP免疫组织化学染色除滴加的一抗为小鼠抗CNP的单克隆抗体外，其余均同2.7.2。 

在作上述免疫组化染色时，同时另取3张切片作为阴性对照，用山羊血清替代一抗，其余步骤相同，结果为阴性。 

2.8图像处理、细胞计数、统计分析 

在放大40倍和400倍的显微镜下，将摄取的照片导入图像处理系统。应用捷达801系列形态学分析软件，测量40倍视野下壳聚糖多孔支架 每个孔的最大孔径和最小孔径。计数400倍视野内MAP-2阳性细胞数，并通过图像处理系统得到相应照片中MAP-2阳性细胞的胞体面积和细胞(包括突起)周长，每孔均取3张切片的相应平均值作为统计数据。对GFAP和CNP阳性细胞作一般形态学观察。采用stata7.0统计软件，对两组MAP-2阳性细胞数以及胞体面积和细胞周长进行t检验。 

结果 

1壳聚糖多孔支架 

2％壳聚糖溶液在-60℃下冷冻干燥制备的多孔支架呈海绵状，孔隙率为90％，孔隙均匀，多孔支架孔径为50-350μm。 

2Nissl染色 

两组切片的壳聚糖支架已溶解，但可见大量细胞从神经干细胞球中迁移出来，并以集落形式贴附于壳聚糖多孔支架的孔壁上，NSCs+支架+NGF组可见到较多胞体较大的细胞。 

3MAP-2、GFAP和CNP免疫组织化学染色 

3.1MAP-2免疫组织化学染色 

两组均可见到以集落形式贴壁生长的MAP-2阳性细胞，呈棕黄色，但NSCs+支架+NGF组MAP-2阳性细胞染色较深，细胞较多、胞体较大，多呈圆形或椭圆形，突起较长，有多个突起；而NSCs+支架组MAP-2阳性细胞较少、胞体较小呈圆形或椭圆形，突起较少、较短，以双突起为主。两组MAP-2阳性细胞的数量、面积、周长及统计分析结果见表1-1。T检验结果显示，两组MAP-2阳性细胞数、胞体面积和细胞周长之间的p值均小于0.01，说明两组间三项指标均有显著性差异。 

表1-1MAP-2阳性细胞数、胞体面积、细胞周长结果以及统计分析结果( 

n＝12) 

3.2GFAP免疫组织化学染色 

两组均能见到较多以集落形式贴壁生长的GFAP阳性细胞，呈棕黄色，其胞体较大，形态不规则呈多角形，核呈圆形，从胞体伸出许多分枝状突起。 

3.3CNP免疫组织化学染色 

两组均能见到较少的CNP阳性细胞，呈棕黄色，胞体较小，呈长椭圆形，胞体发出2～3个细长且有分支的突起，有的突起局部呈“宽叶状”形态特征。 

壳聚糖是甲壳素(chitin)脱乙酰化的产物，甲壳素是一种天然生物高分子聚合物，广泛存在于蟹、虾壳中，在自然界中的含量仅次于纤维素。壳聚糖是多糖中仅有的一种碱性氨基多糖，它的结构和某些性质与细胞外基质中的主要成分氨基多糖极其相似，而且表面高密度的正电荷有利于粘附表面带负电荷的细胞。利用冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架的孔径大小和孔隙率可由壳聚糖的浓度和冷冻温度控制，本实验中2％壳聚糖溶液在-60℃下冷冻干燥制备的多孔支架孔隙率为90％，多孔支架孔径为50-350μm，空隙均匀，呈海绵状。该法避免了高温，有利于生物活性分子的控制释放^[21]。 

对生物材料相容性研究有很多方法，其中常用的有体内直接植入法和体外复合细胞培养法两种，体内直接植入由于受多种体内环境因素的影响，不能准确反映生物材料与组织细胞的相容性，而体外复合细胞培养法可以直接观察细胞与生物材料复合生长的情况，较前者更为敏感、客观，是近年来研究生物材料相容性的主要方法。本实验研究选SD大鼠胚NSCs和壳聚糖多孔支架在体外联合培养。NSCs的胞体直径为6-12μm，神经细胞直径一般也不超过100μm，本实验壳聚糖多孔支架孔径在50～350μm之间，细胞可以进入孔内贴壁生长，可以为分化的细胞突起生长提供支架。大部分NSCs接种到支架上后，由于毛细管效应很快随培养基进入支架内，壳聚糖为亲水性阳离子聚合物，带有可质子化的氨基，在溶液中能产生电解质效应，有利于细胞附着。多孔结构的优势在于为细胞提供了足够的生长空间和更大的附着面积，同时有利于营养成分的进入和代谢产物的排出而不致引起细胞的生长抑制作用， 并且为调控细胞生长的微环境提供了结构基础。NGF是神经营养因子家族中的一员，对促进神经系统的发育、维持某些神经元的生长、存活与分化起着重要的作用，并可影响神经系统的突触可塑性。本实验证实NSCs+支架+NGF组中分化的神经元数量和成熟度以及MAP-2免疫组化染色的深度均好于未加NGF的NSCs+支架组。 

本实验在体外细胞培养中观察到，NSCs能够在壳聚糖多孔支架中存活，可以迁移入孔隙内并以集落形式贴壁生长并分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。细胞在壳聚糖多孔支架的孔隙内分泌细胞外基质，细胞连接成片，这说明NSCs与壳聚糖生物支架有良好的生物相容性。若加上一些神经营养因子或细胞因子等神经干细胞向神经元分化所需的微环境，将有可能使NSCs和壳聚糖构成的组织工程材料应用于治疗神经系统损伤或病变。 

第二部分：在体实验 

壳聚糖作载体的神经干细胞移植修复脑损伤试验 

用Feeney法制备大鼠TBI模型后，立即清创并行壳聚糖作载体的神经干细胞移植，术后1、2、3个月行行为学检测和神经元特异性标志物NF-200、胶质细胞特异性标志物GFAP的免疫荧光检测，观察壳聚糖作载体的NSCs移植治疗对大鼠创伤性脑损伤的修复作用。 

材料与方法 

1实验材料 

1.1实验动物 

健康、成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，体重220-240g，雌雄不拘，共54只，由南通大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(苏)2002-0019。 

1.2实验仪器 

(1)TAXIC-653型脑立体定位仪(美国WPI公司)； 

(2)UMP2型微量注射泵(美国WPI公司)； 

(3)低温冷冻干燥仪(Lyopro3000，法国Jouan公司)； 

(4)普通立体定位仪(江湾II型，上海)； 

(5)CO₂培养箱(法国Jouan公司)； 

(6)超净工作台(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司)； 

(7)低温冷冻离心机(美国Beckman公司)； 

(8)Leica CM1900恒冷箱冰冻切片机(德国)； 

(9)Leica DMR正置荧光显微镜(德国)； 

(10)Leica DMIRB倒置荧光显微镜(德国)； 

(11)NUAIRE超低温冰箱(-85℃，美国)； 

(12)捷达801系列形态学分析系统(江苏省捷达科技发展有限公司)。 

1.3.1抗体及荧光抗体试剂 

小鼠抗5-溴-2-脱氧尿苷单克隆抗体(MouseAnti-5-bromo-2’-deoxy-uridine Monoclonal Antibody，Cat.No.B2531)购自Sigma公司。兔抗神经丝蛋白-200多克隆抗体(RabbitAnti-neurofilament-200kD Polyclonal Antibody，Cat.No.AB 1982)购自Chemicon公司，兔抗胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体(Rabbit Anti-GlialFibrillary Acidic Protein Polyclonal Antibody，Cat.No.AB5804)购自Chemicon公司，结合有异硫氰酸荧光素的山羊抗兔IgG(二抗)(GoatAnti-Rabbit IgG FITC Conjugate，Cat.No.F9887)购自Sigma公司，结合有Alex Fluor 568荧光素的山羊抗小鼠IgG(二抗)(Alex Fluor 568 GoatAnti-Mouse IgG，Cat.No.A11004)购自Molecular Probes公司。神经追踪剂BDA-10000试剂盒(NeuroTraceTMBDA-10000Neuronal Tracer Kit，Cat.No.N7167)购自Molecular Probes公司，3，3-二甲基联苯胺(3，3-Diaminobenzidine，DAB，Cat.No.D-5637)购自Sigma公司。 

1.3.2其它试剂 

2％外用碘酊，75％外用酒精，0.9％生理盐水，注射用青霉素钠，0.01mol/L PBS(phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液)(pH7.2)，TritonX-100，10％山羊血清，4％多聚甲醛(0.1mol/L PB配制，pH 7.4)，20％、30％蔗糖溶液(0.1mol/L PB配制，pH7.4)。复合麻醉剂Chlorpent： 4.25g水合氯醛，2.12g硫酸镁，0.88g戊巴比妥钠，14.25ml无水酒精，33.80ml丙二醇，双蒸水定容至100ml。抗体稀释液：用pH7.2的0.01mol/LPBS、10％山羊血清、0.3％TritonX-100和0.03％NAN₃配制而成。焦油紫染液(Cresylecht Violet)：1％焦油紫溶液中滴加冰醋酸，调节pH至3.75-3.85。分化剂：95％乙醇中滴加冰醋酸，调节pH至4.10。 

2实验方法 

2.1动物分组 

取成年健康清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠54只，雌雄不拘，体重200-240g，由南通大学实验动物中心提供，随机分为脑损伤对照组18只、NSCs+支架移植组18只、NSCs+支架+NGF移植组18只，每组又分为术后1个月、2个月、3个月3个时相点，每组各时相点均为6只。上述各时相点6只模型大鼠先作行为学检测，再作形态学检测。 

2.2TBI模型制备 

2.2.1致伤装置 

Feeney法自由落体打击装置由外周导管、下落重棒、底座三部分组成。金属外周导管长40cm，管壁上每隔1.0cm有一小圆孔，以减少重棒打击时管内空气压缩阻力。下落重棒是一根重20g的铜棒。不锈钢圆柱形底座接触脑表面的一端直径为4.5mm。套管末端呈U型，以限制打击时底座压缩深度2.5mm。 

2.2.2致伤过程 

参照Feeney提供的大鼠创伤性脑损伤模型方法(Feeney DM，Boyeson MG，Linn RT et al.Responses to cortical injury：I.methodologyand local effects of contusions in the rat.Brain Res，1981，211(1)：66-77)，SD大鼠称重后经腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent(0.2ml/100g)，待大鼠完全麻醉后，俯卧位将头部固定于普通立体定位仪(江湾II型，上海)上。头顶部剃毛，碘酒一遍，酒精消毒两遍，手术野铺洞巾，于大鼠头顶矢状位中线切开头皮直至骨膜，切口约长2cm。向两侧分离并推开部分肌肉及骨膜后暴露前囟、矢状缝及冠状缝。定位矢状缝和冠状缝的交点即前囟的坐标，以前囟后方3.5mm、左侧2.5mm为中心用手术刀切 除一边长为5mm的正方形骨瓣，形成骨窗，注意保持硬脑膜的完整。在骨窗上方垂直固定Feeney’s模型的打击装置，将已经消毒过的打击装置底座(底座直径4.5mm)置于大鼠骨窗部的硬脑膜表面，以20g重的铜棒从25cm高度沿套管垂直下落打击致伤底座，造成大鼠大脑左侧顶部皮质的局限性损伤，其致伤力度为500g·cm，即刻移开致伤装置，防止持久压迫。打击过程中注意保持打击时致伤底座压缩深度一致均为2.5mm。致伤后被打击部位出现血肿，立即切开硬脑膜，进行清创处理，移植组继续进行相应的移植手术。损伤对照组清创后经消毒生理盐水冲洗，缝合切口，术后给予青霉素10万单位肌肉注射，动物清醒后按性别分笼饲养。 

2.3移植过程 

2.3.1鼠胚神经干细胞单细胞克隆球的制备； 

2.3.2神经干细胞的BrdU标记：为跟踪观察神经干细胞移植后的分化情况，利用神经干细胞增殖分裂特点，将5-溴-2-脱氧尿苷(5-Bromo-2-deoxy-uridine，BrdU)整合到神经干细胞DNA中，以标记神经干细胞。向传至第3代的鼠胚神经干细胞培养液中加入无菌抽滤的BrdU，使BrdU的终浓度为5μmol/L。置饱和湿度的37℃、5％CO₂培养箱中培养7d后供移植用。 

2.3.3壳聚糖多孔支架的制备； 

2.3.4壳聚糖作载体的NSCs移植 

清除TBI模型打击部位的血肿，并进行清创处理，待清创部位无出血后，裁剪已消毒的形态适宜的壳聚糖多孔支架填塞于清创部位，然后取第4代神经干细胞克隆球以1×10⁵个/ml的密度，接种于壳聚糖多孔支架上，NSCs+支架+NGF移植组接种液中含有100ng/ml NGF。然后消毒缝合切口。术后给予青霉素10万单位肌肉注射，动物清醒后按性别分笼饲养。 

2.4注射BDA追踪剂 

损伤对照组和两移植组的模型大鼠于术后1月、2月、3月三个时间点的前7d分别在损伤区和移植区注射BDA追踪剂。SD大鼠称重后经腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent(0.2ml/100g)，待大鼠完全麻醉后， 俯卧位将头部固定于TAXIC-653型脑立体定位仪立体定位上。头顶部剃毛，碘酒一遍，酒精消毒两遍手术野铺洞巾，于大鼠头顶矢状位中线切开头皮直至骨膜，切口约长3cm。向两侧分离并推开部分肌肉及骨膜后暴露前囟，将微量进样器安装在超微注射泵上，固定于立体定位仪上并使之位于颅骨正上方，以前囟后方3.5mm、左侧2.5mm处沿硬脑膜表面垂直进针1.5mm，缓慢注射5％的BDA追踪剂1μl，15分钟内注射完毕，留针10分钟后缓慢退出，然后消毒缝合切口。 

2.5行为学检测 

参照Dunnett(Dunnett SB，Toniolo G，Fine A et al.Transplantation ofembryonic ventral forebrain neurons to neocortex of rats with lesions ofnucleus basalis magnocellularis--II.sensorimotor and learning impairments.Neuroscience，1985，16(4)：787-797)及Miyamoto(Miyamoto M，ShintaniM，Nagaoka A et al.Lesioning of the rat basal forebrain leads to memoryimpairments in passitive and active avoidance tasks.Brain Res，1985，328(1)：97-104)提供的试验方法，损伤对照组、移植组大鼠于TBI术前行避暗回避试验，以检测各组大鼠有无行为学差异，并于术后各时相点进行避暗回避试验和跳台试验以检测大鼠经壳聚糖作载体的NSCs移植治疗后的学习记忆能力。 

2.5.1避暗回避试验 

试验用长50cm，宽50cm，高40cm的木箱，分明暗两室，两室间有一边长为10cm的方孔，暗室底布有铜栅并可通电，电压36V。避暗回避试验的第1天，将大鼠置于有强光照射的明室中，让大鼠在其中自行探索后发现明室与暗室之间的通道并进入暗室，这一过程反复训练直至大鼠能够在60秒找到并进入暗室。试验第2天重复第1天的过程。试验第3天同样将大鼠置于强光照射的明室中，待大鼠进入暗室后关闭明、暗室之间的通道，暗室内通电给予5s的36V的电刺激。让大鼠休息30s后重复上述过程直至大鼠于明箱中不敢进入暗箱的时间超过300s，记录达到这一标准前大鼠被电击的次数即探索次数。让大鼠于试验的第4、5d休息。试验的第6d再次将大鼠置于强光照射的明箱中，记录大鼠完全进入暗室所需的时间即滞留时间，最长记录到1200s。 

2.5.2跳台试验 

该试验是测试大鼠主动学习、被动学习和记忆能力的一种方法。损伤对照组、移植组均于上述避暗回避试验结束后进行跳台试验。仪器由相同大小并相通的两室组成，底部均有电栅，其中一室有一高10cm、10×10cm²的平台，实验时配有条件刺激铃声。先将大鼠放入无跳台一室，在条件刺激铃声5s后即给予10s的36V电击，间隔30s后重复上述过程。大鼠受到电击后钻入具有跳台的一室并跳上平台的为被动回避试验阳性；听到铃声，但在电击前跳上平台为主动回避反应阳性。每日训练10次，连续7d，分别记录第7d主动、被动及总回避(主动+被动)反应的阳性率。 

2.6组织固定及切片 

于上述术后各时相点作完行为学测验的大鼠处死。各组大鼠先经腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent(0.2ml/100g体重)，麻醉后开胸暴露心脏，自心尖部将灌注针头经左心室插至升主动脉，灌注生理盐水约100ml后，改快速灌注含有4％多聚甲醛的0.1mol/L PBS(pH7.2)，待动物全身抽搐后，调慢灌注速度，约50滴/分钟，持续时间约30min后，取出大脑放入含有4％多聚甲醛的0.1mol/L PBS(pH7.2)中后固定4～6h。再先后转入含20％和30％蔗糖的0.1mol/L PBS(pH7.2)中，待组织块下沉后，行冠状位冰冻连续切片，切片厚20μm，损伤对照组每只大鼠收集3套切片，移植组作完行为学测验的每只大鼠收集5套切片，切片均贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上待染色。从前囟处开始收集切片，至前囟后3.80mm处结束。 

2.7切片染色 

2.7.1Nissl染色 

取上述各组一套切片，置室温下凉干后，用焦油紫行Nissl染色，具体流程如下：a.100％三氯甲烷30min，b.100％丙酮15min，c.100％乙醇30s，d.95％乙醇30s，e.75％乙醇60s，f.双蒸水洗3遍，g.焦油紫染色2h，h.双蒸水洗3遍，i.75％乙醇30s，j.95％乙醇30s，k.100％乙醇60s，l.100％三氯甲烷5min，n.分化剂5～7min，Nikon YS100显微镜下观察分化满意后常规脱水，透明，封片，镜下观察。 

2.7.2GFAP免疫荧光染色 

取上述各组一套切片，置于染缸再用0.01mol/L PBS(pH7.2)中漂洗后，每张切片滴加10％山羊血清50μl封闭过夜，吸去山羊血清，每张切片滴加1∶800稀释的兔抗GFAP的多克隆抗体50μl，4℃湿盒孵育24h。用0.01mol/L PBS(pH7.2)漂洗3遍，在避光条件下，每张切片滴加1∶200稀释的结合有FITC的山羊抗兔的第二抗体50μl，4℃湿盒孵育24h。在避光条件下，用PBS洗片3遍后，中性甘油封片。在激发光波长为495nm、吸收光波长为520nm的荧光显微镜下观察拍片。 

2.7.3BrdU与NF-200免疫荧光双标记 

取上述两移植组各一套切片，置于染缸再用0.01mol/L PBS(pH7.2)中漂洗后，每张切片滴加10％山羊血清50μl封闭过夜，吸去山羊血清每张切片滴加含有1∶200稀释的兔抗NF-200的多克隆抗体和1∶150稀释小鼠抗BrdU单克隆抗体50μl，4℃湿盒孵育24h。用0.01mol/L PBS(pH7.2)漂洗3遍，在避光条件下，每张切片滴加含有1∶200稀释的结合有FITC的山羊抗兔的第二抗体和1∶500稀释的结合有Alex Fluor 568荧光素的山羊抗鼠的第二抗体50μl，4℃湿盒孵育24h。在避光条件下，用PBS洗片3遍后，中性甘油封片。先后在激发光波长为580nm、吸收光波长为610nm和激发光波长为495nm、吸收光波长为520nm的荧光显微镜下观察BrdU与NF-200阳性的免疫荧光细胞并摄片。 

2.7.4BrdU与GFAP免疫荧光双标 

取上述两移植组各一套切片，置于染缸再用0.01mol/L PBS(pH7.2)中漂洗后，每张切片滴加10％山羊血清50μl封闭过夜后，吸去山羊血清每张切片滴加含有1∶800稀释的兔抗GFAP的多克隆抗体和1∶150小鼠抗BrdU单克隆抗体50μl，4℃湿盒孵育24h。用0.01mol/LPBS(pH7.2)漂洗3遍，在避光条件下，每张切片滴加含有1∶200稀释的结合有FITC的山羊抗兔的第二抗体和1∶500稀释的结合有Alex Fluor568荧光素的山羊抗鼠的第二抗体50μl，4℃湿盒孵育24h。在避光条件下，用PBS洗片3遍后，中性甘油封片。先后在激发光波长为580nm、吸收光波长为610nm和激发光波长为495nm、吸收光波长为520nm的荧光显微镜下观察BrdU与GFAP阳性的免疫荧光细胞并摄片。 

2.8BDA追踪组化染色 

取上述各组一套切片，置于染缸再用0.01mol/L PBS(pH7.2)中漂洗后，阴干。每张切片滴加含有终浓度为0.5μg/ml Avidin-HRP、0.3％TritonX-100的0.01mol/L PBS(pH7.2)50μl，4℃湿盒孵育24h，用PBS洗片3遍后，用DAB呈色。常规脱水、透明、封片，镜下观察。 

2.8图像处理和统计学分析 

将NSCs+支架移植组、NSCs+支架+NGF移植组摄取的荧光照片导入计算机中，捷达801系列形态学分析系统软件计数200倍视野内BrdU与NF-200免疫荧光双标记阳性细胞数，并通过该图像处理系统计算相应照片中阳性细胞胞体面积和细胞(包括突起)周长，每只模型大鼠均取相应部位的4张切片的平均值作为统计数据。 

采用stata7.0统计软件，对3组大鼠避暗回避试验的探索次数和滞留时间行方差分析，对跳台试验的主动、总回避阳性率行方差分析。对两个不同的移植组BrdU与NF-200免疫荧光双标记阳性细胞数以及胞体面积和细胞周长行t检验，各组其它染色只做形态学上的观察。 

结果 

1行为学检测 

1.1避暗回避试验 

TBI术前三组大鼠避暗回避试验的探索次数和滞留时间经统计学分析表明，P均＞0.05，说明三组大鼠术前的行为学无差异。 

在移植术后1个月、2个月、3个月三个时相点，两移植组较损伤对照组大鼠探索次数明显逐渐减少，滞留时间明显逐渐延长，而且NSCs+支架+NGF移植组大鼠在相应时相点探索次数更少，滞留时间更长。术后3组大鼠避暗回避试验探索次数和滞留时间以及统计结果见表2-1。方差分析结果显示，3组大鼠避暗回避试验探索次数和滞留时间之间的p值均＜0.01，说明3组间二项指标均有显著性差异。 

表2-1术后3组大鼠避暗回避试验探索次数、滞留时间(s)和统计分析结果( n＝6)

1.2跳台试验 

在移植术后1个月、2个月、3个月三个时相点，移植组较损伤对照大鼠第7d主动及总回避阳性率明显逐渐升高。术后主动回避阳性率和总回避阳性率以及统计分析结果详见表2-2。方差分析结果显示，3组大鼠主动回避阳性率和总回避阳性率之间的p值均＜0.01，说明3组间二项指标均有显著性差异。 

表2-2术后3组大鼠跳台试验主动回避及总回避阳性率(％)和统计分析结果( 

n＝6)

2形态学检测 

2.1Nissl染色 

损伤对照组创伤区可见到烧杯状缺损，创伤侧海马严重萎缩变形，海马CA3区及齿状回区的细胞排列紊乱、丢失。两移植组创伤区有移 植物填充，移植物中均可见到许多尼氏阳性细胞，术后3个月时移植物均已经与宿主整合，壳聚糖支架已经部分降解，创伤侧海马CA3区及齿状回的细胞排列紊乱、丢失，但萎缩不明显。 

2.2GFAP免疫荧光染色 

损伤对照组术后1个月创伤区周边可见到大量连接成网状的呈绿色荧光的GFAP阳性细胞，胞体较大，形态不规则呈多角形，从胞体伸出许多分枝状突起，GFAP阳性细胞绿色荧光强度较强，术后3个月仍未有所改变。两移植组术后1～3个月创伤区周边只见到少量的GFAP阳性细胞，没有连接成网状，GFAP阳性细胞荧光强度较弱，两移植组间无明显差异。 

2.3BrdU与NF-200免疫荧光双标记 

移植治疗术后BrdU与NF-200免疫荧光双标记检测中，BrdU标记部分呈红色，NF-200标记处呈绿色。相同视野不同激发光和吸收光波长下所摄取的照片经Spot 4.6软件处理可见到移植区中BrdU与NF-200双标的细胞核呈红色，胞浆及突起呈绿色。NF-200阳性细胞BrdU绝大多数也为阳性。 

2.3.1术后1个月BrdU与NF-200双标检测 

术后1个月NSCs+支架移植组、NSCs+支架+NGF移植组移植区中均可见到BrdU与NF-200双标细胞，胞核呈红色，胞体小呈绿色，多为梭形或圆形，但未见到有突起伸出。NSCs+支架+NGF移植组BrdU与NF-200阳性的双标细胞数较NSCs+支架移植组多。 

2.3.2术后2个月BrdU与NF-200双标检测 

术后2个月两组移植区中BrdU与NF-200双标细胞数量未见变化，但胞体变大，多为圆形，部分细胞可见到有较短的突起伸出，而且NSCs+支架+NGF移植组中短突起的双标细胞明显多于NSCs+支架移植组。 

2.3.3术后3个月BrdU与NF-200双标检测 

术后3个月，两组移植物均已与宿主整合。NSCs+支架+NGF移植组移植区中部分BrdU与NF-200双标细胞形态更加成熟，细胞的突起较长，移植区与宿主交界区少数阳性细胞的突起已延伸至宿主脑组织。 

NSCs+支架移植组、NSCs+支架+NGF移植组BrdU与NF-200免疫 荧光双标记细胞数、胞体面积、细胞周长以及统计分析结果见表2-3。T检验结果显示，除胞体面积和细胞周长在术后1个月两组间p值＞0.05外，余下指标两组之间的p值均＜0.05，有显著性差异。 

表2-3术后两移植组BrdU与NF-200免疫荧光双标记阳性细胞数、胞体面积和细胞周长以及统计分析结果( 

n＝6)

2.4BrdU与GFAP免疫荧光双标记 

移植治疗术后BrdU与GFAP免疫荧光双标检测中，BrdU标记部分呈红色，GFAP标记处呈绿色。相同视野不同激发光和吸收光波长下所摄取的照片经Spot 4.6软件处理可见到移植区中BrdU与GFAP双标细胞核呈红色，胞体及突起呈绿色，胞体形态不规则呈多角形，从胞体伸出许多分枝状突起，两移植组间BrdU与GFAP双标细胞的数量和形态在术后1个月、2个月、3个月时均无明显差异。GFAP阳性的细胞BrdU检测绝大多数也为阳性。 

2.5BDA追踪组化染色 

损伤对照组BDA追踪组化染色结果为阴性。两移植组移植区中的BDA阳性细胞胞体及突起呈棕黄色。移植治疗术后1个月、2个月由于移植物未能很好地与宿主整合，未见到移植区内的细胞突起向宿主脑组织区延伸。术后3个月，两移植组在移植物与宿主交界区均可见到从移植区中有棕黄色突起延伸至宿主脑组织，而且NSCs+支架+NGF移植组向宿主脑组织延伸的突起较NSCs+支架移植组多。 

Claims (5)

1.一种多孔壳聚糖支架，其特征是：由下列方法制备而成：将壳聚糖溶于乙酸中成为2％W/V的溶液，向细胞培养板的孔中加入该溶液，盖好，于4℃预冷，再置于-28℃冷冻过夜，后在-60℃下冷冻干燥，然后向细胞培养板的孔中加入NaOH水化处理，再用PBS清洗，最后再进行两次-60℃冷冻干燥，得到多孔壳聚糖支架。

2.根据权利要求1所述的多孔壳聚糖支架，其特征是：由下列方法制备而成：将壳聚糖溶于1％乙酸中成为2％W/V的溶液，向24孔细胞培养板每孔中加入1ml该溶液，盖好，于4℃预冷6h，再置于-28℃冷冻过夜，后在-60℃下冷冻干燥24h，然后向每孔中加入0.1mol/L NaOH 1ml水化20min，再用pH7.2的0.01mol/L PBS清洗3次，最后再进行两次各24小时-60℃冷冻干燥，得到多孔壳聚糖支架。

3.一种神经干细胞多孔壳聚糖支架，其特征是：由下列方法制成：取神经干细胞克隆球接种于培养孔内灭菌的壳聚糖多孔支架上，加入DMEM/F12无血清培养基或加入含NGF的DMEM/F12无血清培养基，培养得到神经干细胞多孔壳聚糖支架。

4.根据权利要求3所述的神经干细胞多孔壳聚糖支架，其特征是：由下列方法制成：取神经干细胞克隆球以1×10⁵个/ml的密度，接种于培养孔内灭菌的壳聚糖多孔支架上，加入DMEM/F12无血清培养基1.5ml或加入含100ng/ml NGF的DMEM/F12无血清培养基1.5ml，培养板置饱和湿度、37℃、5％CO₂培养箱中培养2周，每隔4天换1/2培养液，得到神经干细胞多孔壳聚糖支架。

5.一种神经干细胞多孔壳聚糖支架在制备修复脑损伤的制品中的应用。