CN106581750A - 一种高性能人工椎间盘支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种优良机械性能和生物相容性的人工椎间盘的制备方法，其包括：(1)将PBST熔化，冷却后裁剪、打磨成表面光滑的PBST椭圆环；(2)制备PBST静电纺丝薄膜，将所得薄膜进行盘绕6‑10层，并紧密的套在步骤(1)所得PBST椭圆环的外环上；(3)制备壳聚糖水凝胶，并填入步骤(2)所得物构成的椭圆环中的空心处；所述PBST为聚对苯二甲酸‑共‑丁二酸丁二醇酯。本发明还提供了由上述方法得到的人工椎间盘。本发明所得人工椎间盘支架具有优秀的机械性能和良好的细胞相容性，其压缩应力屈服极限为3.74MPa，弹性模量为29.93Mpa；拉伸应力屈服极限为3.69MPa，弹性模量为43.18MPa。

Description

一种高性能人工椎间盘支架及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程领域，具体涉及一种优良机械性能和生物相容性的人工椎间盘及制备方法。

背景技术

下腰痛是脊柱外科常见疾病，影响患者的生活质量，甚至导致劳动能力的丧失。以椎间盘突出症为主的椎间盘退变性疾病是引起下腰痛的主要原因。随着我国经济的发展，人们对生活水平要求的提高，解决椎间盘退变性疾病引起的下腰痛迫在眉睫。

目前，临床上对椎间盘退变性疾病的治疗，无论是以缓解症状为目的药物或物理治疗，还是以恢复椎体结构稳定性为目的外科手术治疗结果均不理想。以基因治疗、细胞移植和组织工程替代品置换为主要手段的生物治疗策略为椎间盘退变性疾病带来了新希望。

临床中的椎间盘退变性疾病患者多已进入退变的晚期，而且椎间盘的退变是髓核和纤维环同时存在，最好的治疗办法是用组织工程椎间盘置换退变的椎间盘，恢复其生物学功能。

早期的组织工程椎间盘研究主要集中在组织工程髓核或纤维环的构建，有不少学者利用组织工程纤维环或髓核完成椎间盘的修复，并取得了良好的实验结果。Hegewald利用聚乳酸-羟基乙酸[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]支架修复山羊损伤的椎间盘纤维环，实验发现植入的支架能有效地阻止髓核的突出，支架上可见大量的纤维环细胞及细胞基质。近年来，更多的学者意识到组织工程椎间盘的研究应同时包括组织工程髓核和组织工程纤维环，庄颖等利用脱矿骨基质(Demineralized bone matrix gelatin,DBMG)作为纤维环支架，Ⅱ型胶原/透明质酸-硫酸软骨素(collagenⅡ/hyaluronate/chondroitin-6-sulfate,CHCS)作为髓核支架，以纤维环细胞和髓核细胞作为种子细胞，在裸鼠皮下构建双相组织工程椎间盘。实验发现种子细胞在支架上生长良好，分泌Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，形态与天然椎间盘相似，但未能良好的模拟天然椎间盘的结构特点，力学性能较差。

构建组织工程椎间盘的重点和关键在于模拟椎间盘以下特点：①在生理结构方面，椎间盘由髓核、内纤维环、外纤维环组成，髓核呈胶冻状，纤维环呈同心圆结构；②在生化特性方面，外纤维环主要表达I型胶原，内纤维环和髓核主要表达Ⅱ型胶原和蛋白聚糖；③在生物力学方面，纤维环承受椎体间的轴向压力、髓核的膨胀张力及剪切力等。

重要的是，在模拟椎间盘上述特点时，需至少使得所得椎间盘具有良好的机械性能和生物相容性。虽然《Biomimetic method for combining the nucleus pulposus andannulus fibrosus for intervertebral disc tissue engineering》模拟了髓核和内纤维环，但其所得的椎间盘支架的机械性能很差，其弹性模量仅为250KPa左右。另外，其尚未弄清所得支架的机械性能相对于纯凝胶材料而言更高的原因。

因此，本领域急需寻求一种具有优良机械性能和生物相容性的人工椎间盘及制备方法。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种优良机械性能和生物相容性的人工椎间盘的制备方法，该方法包括：

(1)将PBST熔化，冷却后裁剪、打磨成表面光滑的PBST椭圆环；

(2)制备PBST静电纺丝薄膜，将所得薄膜进行盘绕6-10层制成椭圆环，并紧密的套在步骤(1)所得PBST椭圆环的外环上；

(3)制备壳聚糖水凝胶，并填入步骤(2)所得物构成的椭圆环中的空心处；

所述PBST为聚对苯二甲酸-共-丁二酸丁二醇酯。

优选的，步骤(1)中，于160℃下将所述PBST熔化，所述椭圆环的高度为2cm，直径为9mm，前后经为5mm。

优选的，所述PBST静电纺丝薄膜的孔隙率为50-80％。更优选的，所述PBST静电纺丝薄膜的孔隙率为61.83％±7.33％。

作为优选方案，所述PBST静电纺丝薄膜的制备方法为：将PBST溶于氯仿，控制室温为25℃-30℃，纺丝电压为10Kv，接收速度为2ml/h，接收距离为20cm，通过静电纺丝法制备PBST静电纺丝薄膜。优选的，PBST与氯仿的质量体积比为1:4。

所述壳聚糖凝胶的制备方法为：制备壳聚糖水溶液，加入交联剂制备得到壳聚糖凝胶，所述交联剂由1,6-己二酸异氰酸酯和聚乙二醇-200按照体积比4:5混合制备而得。

作为优选方案，所述壳聚糖水溶液的质量分数为1％；和/或，壳聚糖水溶液与交联剂体积比为1000:10。所述交联剂由1,6-己二酸异氰酸酯和聚乙二醇-200按照体积比4:5混合于25℃下反应3天制备而得。

本发明的另外一个目的在于提供由上述方法制备得到的人工椎间盘。

本发明的有益效果：

1、本发明所得人工椎间盘支架具有优秀的机械性能，其压缩应力屈服极限为3.74MPa，弹性模量为29.93Mpa；拉伸应力屈服极限为3.69MPa，弹性模量为43.18MPa；

2、本发明所得人工椎间盘支架具有良好的细胞相容性，可为髓核细胞的生长提供生长条件；

3、本发明得人工椎间盘支架利于细胞的粘附增殖、渗透和代谢交换；

4、本发明椎间盘支架材料符合天然椎间盘的结构特点，利用实际应用。

附图说明

图1为本发明纤维环细胞、髓核细胞的细胞形态和鉴定结果图，其中，A-D分别为纤维环细胞的形态，番红-O染色、CollagenⅡ免疫组化染色、Aggrecan免疫荧光染色；E-H分别为髓核细胞的形态，番红-O染色、CollagenⅡ免疫组化染色、Aggrecan免疫荧光染色(×200,bar＝50μm)；

图2为本发明壳聚糖水凝胶的形态及HE染色结果图；其中，A为壳聚糖水凝胶的大体形态观；B为吸水后的壳聚糖水凝胶；C为壳聚糖水凝胶的扫描电镜；D HE染色(×200,bar＝50μm)；

图3为本发明PBST纺丝薄膜的扫描电镜及细胞相容性检测结果图；其中，A：PBST纤维在显微光镜下形貌(×200,bar＝50μm)；B：PBST纺丝薄膜大体形态观；C：复合纤维环细胞体外培养3d后的PBST纺丝薄膜扫描电镜；D、E：复合纤维环细胞体外培养3W后的PBST纺丝薄膜大体形态观；F：复合纤维环细胞体外培养3W后的PBST纺丝薄膜HE染色(×200,bar＝50μm)；

图4为本发明三相组织工程椎间盘支架的组装图；其中，A：PBST外纤维环；B：盘绕的PBST纺丝薄膜；C：双相组织工程纤维环支架；D：三相组织工程椎间盘支架；

图5为本发明三相组织工程椎间盘支架的压缩性能检测结果图；

图6为本发明三相组织工程椎间盘支架的拉伸性能检测结果图；

图7为本发明组织工程椎间盘在裸鼠皮下培养4W结果图；其中，A：裸鼠皮下的组织工程椎间盘；B：裸鼠皮下组织工程椎间盘标本；

图8为本发明裸鼠皮下标本病理组织染色结果图；其中，A—D分别为HE染色、番红-O染色、CollagenⅡ免疫组化染色、Aggrecan免疫荧光染色(×40,bar＝200μm)；

图9为本发明手术置换兔椎间盘过程图；其中，A：暴露兔椎间盘；B：切除兔椎间盘，保留部分纤维环；C：用组织工程椎间盘置换兔椎间盘；D：钢板固定上下椎体；

图10为本发明支架植入术后4W的影像检测；其中，A：X线检测；B：MRI检测；

图11为本发明组织工程椎间盘标本大体观；其中，A：术后4W解剖实验兔脊柱；B、C：组织工程椎间盘在椎间隙的位置；D：组织工程椎间盘大体形态；

图12为本发明组织工程椎间盘病理组织检测；其中，A—D分别为HE染色、番红-O染色、Collagen II免疫组化染色、Aggrecan免疫荧光染色(×40,bar＝200mm)；

图13为本发明Collagen ⅡmRNA的表达结果图；其中，※:裸鼠组与实验兔组比较，P＝0.025，差异具有统计学意义；﹟﹟：实验兔组与正常组比较，P＝0.002，差异具有统计学意义；＊：正常组与裸鼠组比较，P＝0.047，差异具有统计学意义；

图14为本发明Aggrecan mRNA的表达结果图；其中，※:裸鼠组与实验兔组比较，P＝0.028，差异具有统计学意义；﹟﹟：实验兔组与正常组比较，裸鼠组与实验兔组比较，P＝0.001，差异具有统计学意义；＊：正常组与裸鼠组比较，裸鼠组与实验兔组比较，P＝0.032，差异具有统计学意义。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1.1纤维环细胞、髓核细胞的培养和鉴定

1.1.1纤维环细胞、髓核细胞的培养

取3周龄新西兰大白兔1只，分别用1％戊巴比妥钠100mg/kg耳缘静脉注射过量麻醉处死。75％乙醇浸泡5min，在无菌条件下将椎间盘组织浸泡于含双抗(1％青霉素和链霉素)的PBS溶液中，转入超净工作台，用PBS冲洗椎间盘3遍。用眼科剪去除椎间盘周围肌肉和筋膜，分离纤维环和髓核组织盛于不同的培养皿。用手术刀把纤维环组织块切碎成1mm³(甚至更小)，用含双抗的PBS溶液充分漂洗纤维环组织。将纤维环组织收集入50ml离心管中，加0.2％Ⅱ型胶原酶5mL，37℃恒温摇床中连续震荡8小时，2000r/min离心8min使细胞及组织块沉淀，弃上清液，再加入Ⅱ型胶原酶消化8h。消化充分后将组织块和上清液收集于50mL离心管中，2000r/min离心8min使细胞沉淀，弃上清液，加入DMEM/F12培养基(含10％FBS，1％双抗)5mL。轻轻吹打使细胞重新悬浮后接种于T75的培养瓶中，补充含10％FBS的DMEM/F12培养基至10mL，将培养瓶置于37℃，体积分数5％CO₂培养箱培养，每48小时更换一次培养液。

将分离的髓核组织盛于15ml离心管，加0.2％Ⅱ型胶原酶5mL，用10ml移液枪反复吹打，至髓核组织完全呈“糊”状，消化8h后2000r/min离心8min使细胞、组织沉淀，弃上清液，加入DMEM/F12培养基(含10％FBS，1％双抗)5mL。轻轻吹打使细胞重新悬浮后接种于T75的培养瓶中，补充含10％FBS的DMEM/F12培养基至10mL，将培养瓶置于37℃，体积分数5％CO₂培养箱培养，每48小时更换一次培养液。

当纤维环细胞、髓核细胞长满到单层的80％-90％后，进行细胞传代。细胞传代时，弃掉旧培养液，用PBS溶液清洗三次后，加入3mL0.25％胰蛋白酶消化，放到37℃培养箱消化1-2min，在倒置显微镜下观察细胞悬浮情况。见到大部分细胞开始回缩成球形并可见细胞间出现缝隙时，加入8mL含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化。轻柔吹打培养基使细胞分散均匀，按(1.5-2.0)×10⁵/ml的细胞浓度接种于培养瓶中，将每个培养瓶中培养基添加至10mL，每48小时换液1次。

1.1.2纤维环细胞、髓核细胞的形态观察及鉴定

(1)倒置相差显微镜下观察P2代纤维环细胞、髓核细胞的形态。

(2)P2代细胞番红-O染色：分别取P1代纤维环细胞、髓核细胞行细胞爬片，PBS溶液冲洗后4％多聚甲醛室温固定30min，PBS冲洗3次；0.2％快绿染色1min，PBS冲洗3次；0.5％番红-O染色5min，PBS冲洗3次；梯度酒精脱水，烘干后中性树胶封片。

(3)P2代细胞蛋白聚糖(Aggrecan)免疫荧光染色：分别取P1代纤维环细胞、髓核细胞行细胞爬片，PBS冲洗后4％多聚甲醛室温固定30min，PBS冲洗3次；0.3％Triton-100孵育10min，添加一抗(小鼠抗兔)4℃过夜，添加二抗(山羊抗小鼠)室温下孵育1h；抗荧光淬灭剂封片。

(4)P2代细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色：分别取P1代纤维环细胞、髓核细胞行细胞爬片，PBS冲洗后4％多聚甲醛室温固定30min，PBS冲洗3次；2％牛透明质酸酶孵育30min，3％过氧化氢孵育10min，0.3％Triton-100孵育10min；II型胶原一抗4℃过夜，添加二抗在室温下孵育1h；DAB显色5-10min，苏木素复染1min，75％盐酸酒精1s；梯度酒精脱水，烘干后中性树胶封片观察。

1.2组织工程椎间盘支架的制备

1.2.1髓核支架—壳聚糖水凝胶的制备

在烧瓶内加入1,6-己二酸异氰酸酯0.8ml，聚乙二醇-2001.0ml，搅拌均匀，置于恒温摇床，25℃反应3天，得到交联剂。配置壳聚糖水溶液1ml，浓度为1％(wt％)。加入10μl交联剂(壳聚糖水溶液与交联剂比例为1000:10)，混合均匀后得到壳聚糖水凝胶，-80℃真空冷冻干燥48小时备用。

1.2.2内纤维环支架—PBST纺丝的制备

称取1.0g PBST溶解于4.0ml氯仿，37℃搅拌过夜。控制室温为25℃-30℃，纺丝电压为10Kv，接收速度为2ml/h，接收距离为20cm，静电纺丝采用铝箔纸接收，纺丝过程中用载玻片收集纺丝线，在显微镜下观察，可根据纺丝线的情况适当调整电压及PBST浓度。将纺丝薄膜从铝箔纸上撕下来，真空干燥箱中抽干，75％酒精消毒后备用。1.2.3外纤维环支架—PBST的制备

称取2.0g PBST，置于玻璃培养皿，烘箱160°熔化，取出后冷却成形为约2mm厚的实心“薄饼”，再用手术刀片及磨钻打磨，取左右直径为9mm，前后经为5mm的椭圆形，挖空中心，呈椭圆形“环状”的外纤维环支架。

1.3组织工程椎间盘支架的表征

1.3.1壳聚糖水凝胶的扫描电镜

壳聚糖水凝胶-80℃真空冷冻干燥48小时后常规喷金做扫描电镜检测。

1.3.2壳聚糖水凝胶的细胞相容性检测

将冷冻干燥的壳聚糖水凝胶在无菌操作台中剪切成2×2×2mm大小的颗粒，置于玻璃皿中，紫外照射灭菌消毒12小时。将壳聚糖水凝胶材料放置于24孔板中，每孔各一个。吸取0.1ml细胞浓度为2×10⁷个/ml的P2代髓核细胞，滴加于上述水凝胶材料中，待细胞贴壁4小时后，补充含10％FBS的DMEM/F12培养基至2ml。置于37℃，5％CO₂，饱和湿度培养箱内培养，每两天更换一次培养基，每周更换一次培养皿。培养3W后取出壳聚糖水凝胶组织块，行常规病理包埋切片，常规HE染色。

1.3.3PBST纺丝孔隙率、吸水率的检测

(1)孔隙率的检测：选取一带刻度的试管，装入一定体积的无水乙醇，记为V₁；放入纺丝反复挤压，直至纺丝内无气泡溢出为止，此时的总体积为V₂；V₂-V₁为纺丝结构的体积。取出浸满乙醇的支架，剩于乙醇体积为V₃，V₁-V₃为纺丝中包容的乙醇体积，即纺丝材料中孔隙的体积。纺丝总体积计算公式为：V_总＝(V₂-V₁)+(V₁-V₃)＝V₂-V₃；纺丝孔隙率计算公式：(V₁-V₃)/(V₂-V₃)×100％。测试10个样本，每个样本测3次，取均值。

(2)吸水率的检测：将纺丝薄膜浸泡于蒸馏水中24h，达饱和状态后取出纺丝，吸干纺丝表面水分，称重为W_W；将纺丝冷冻干燥后称重为W_d；按下列公式计算纺丝吸水率：吸水率＝(W_W-W_d)/W_d×100％。测试10个样本，每个样本测试3次，取均值。

1.3.4PBST纺丝的扫描电镜及细胞相容性表征

将上述培养的P2代纤维环细胞制备成1×10⁴个/ml的细胞悬液，滴加0.1ml细胞悬液于已消毒的纺丝薄膜，细胞贴壁4h后移至24孔培养板，补充适量培养基2ml，培养3d。在预定时间点取样，吸弃原有培养基；加入2.5％戊二醛固定2.5h；梯度乙醇脱水；在玻璃瓶中乙酸异戊酯替换；临界点干燥后送扫描电镜观察。

将上述培养的P2代纤维环细胞制备成2×10⁷个/ml的细胞悬液，滴加0.1ml细胞悬液于已消毒的纺丝薄膜，细胞贴壁4h后移至6孔培养板，补充培养基至5ml，每2d更换一次培养基，每1W更换一次6孔板。培养3W后取出组织块，行常规病理包埋切片，HE染色。1.4三相组织工程椎间盘支架的组装

将PBST纺丝薄膜盘绕6-10层，行成同心圆柱状，卷入实心PBST外环中，修剪成约9×5×2mm大小的双相组织工程纤维环支架。盘绕6-10层的PBST纺丝外径略大于PBST内径，使组装的双相纤维环支架连接紧密，无明显缝隙。75％酒精消毒30分钟，-80℃真空冷冻干燥48小时备用。将壳聚糖水凝胶修剪成2×2×2mm大小，在无菌操作台里紫外线消毒2h。填入双相组织工程纤维环中央，组成三相组织工程椎间盘支架。

1.5三相组织工程椎间盘支架的力学检测

将三相组织工程椎间盘支架置于微型生物力学测试机的载物台上，进行压缩、拉伸性能测试，加载速度为1mm/min，压缩、拉伸应力和应变每秒被取样10次，以应变为横坐标，压缩、拉伸应力为纵坐标，绘制应力-应变曲线。取曲线起始阶段相对平滑的直线部分作为分析对象，按下列公式计算支架的弹性模量。弹性模量＝应力/应变，应力＝载荷/横截面积，应变＝位移/支架高度。

纤维环细胞、髓核细胞的细胞形态和鉴定

光学显微镜下可见体外培养的P2代纤维环细胞、髓核在形态上呈长梭形或多边形(图1A、E)，生长速度快；两种细胞番红-O染色均呈阳性，表明细胞分泌蛋白聚糖(图1B、F)；两种细胞Collagen Ⅱ免疫组化染色均阳性，表明细胞分泌Ⅱ型胶原(图1C、G)；两种细胞Aggrecan免疫荧光染色均阳性，进一步证明细胞分泌蛋白聚糖(图1D、H)。

2组织工程椎间盘支架的形态及表征

2.1壳聚糖水凝胶的扫描电镜及细胞相容性检测

制备的壳聚糖水凝胶大体形态呈白色棉花状，比较疏松，吸水后呈透明胶冻状(图2A、B)。扫描电镜可见壳聚糖水凝胶支架存在大量孔隙，孔隙之间相互连通，孔隙形状不规则(图2C)。经接种髓核细胞体外培养3W后，HE染色见髓核细胞在支架内生长良好，细胞分布均匀，分泌大量细胞外基质，细胞及细胞外基质填充于支架孔隙之间(图2D)。

2.2PBST纺丝薄膜的孔隙率、吸水率

经测试，PBST纺丝薄膜的孔隙率为61.83％±7.33％，吸水率为297.34％±57.13％。

2.3PBST纺丝薄膜的扫描电镜及细胞相容性检测

光学显微镜下可见PBST纤维粗细均匀，无珠状体形成(图3A)，纺丝结束后可获得薄纸状的PBST纺丝薄膜，呈白色(图3B)。接种纤维环细胞后体外培养3d，扫描电镜见纤维环细胞粘附在PBST纺丝薄膜表面上生长，且见PBST纺丝薄膜具有良好的孔隙率(图3C)。复合纤维环细胞体外培养3W后的PBST纺丝薄膜，表面被细胞外基质覆盖，表面光滑，韧性较之前增强(图3D、E)。复合纤维环细胞体外培养3W后的PBST纺丝薄膜HE染色可见纤维环细胞在PBST纺丝薄膜表面、内部分布均匀，细胞大量增殖，分泌细胞外基质(图3F)。

2.4三相组织工程椎间盘支架的组装

利用实心的PBST环作为外纤维环支架(图4A)，盘绕6-10层的PBST纺丝薄膜作为内纤维环支架(图4B)，组装成双相组织工程纤维环支架，大小约9×5×2mm，组装的双相纤维环支架连接紧密，无明显缝隙(图4C)。将壳聚糖水凝胶填入双相组织工程纤维环中央，组成三相组织工程椎间盘支架(图4D)。

2.5三相组织工程椎间盘支架的力学检测

三相组织工程椎间盘支架的应力-应变曲线示起始阶段为弹性变形阶段，应力与应变呈正比关系(图6，7)。三相组织工程椎间盘支架的压缩应力屈服极限为3.74MPa，弹性模量为29.93Mpa；拉伸应力屈服极限为3.69MPa，弹性模量为43.18MPa。

3动物实验

3.1种子细胞的接种

分别将P2代纤维环细胞、髓核细胞制备成浓度为2×10⁷个/ml的细胞悬液备用，滴加0.1ml纤维环细胞悬液在双相组织工程纤维环支架上，滴加0.1ml髓核细胞悬液在壳聚糖水凝胶上，将壳聚糖水凝胶填充于双相组织工程纤维环中央，静置4h待种子细胞在支架上贴壁。

3.2在裸鼠皮下构建组织工程椎间盘

选取3月龄雄性裸鼠6只，置于无菌操作台，腹腔注射0.1％戊巴比妥钠0.1-0.2ml，待裸鼠完全麻醉后，常规碘伏消毒裸鼠背部皮肤。取背部后正中长约1.5cm切口，小弯钳分离皮下筋膜。将上述接种细胞后的组织工程椎间盘移至裸鼠皮下，再次消毒手术切口，依次缝合切口。术后3天每日皮下注射青霉素1万单位，无菌级环境喂养4W，无死亡、伤口感染等现象。4W后将裸鼠过度麻醉处死，立即取出皮下标本，获得标本6个，取3个置于培养基备用，其余标本观察大体形态后提取RNA、常规病理包埋切片。

3.3组织工程椎间盘置换兔椎间盘

选取3月龄新西兰大白兔3只，耳缘静脉注射8ml 1％戊巴比妥钠，待麻醉起效后，取仰卧位固定于手术操作台，剔除腹部兔毛，常规消毒铺巾。在无菌条件下取腹部正中切口，长约10cm，切开皮下肌肉，进入腹腔，将肠管置于腹外一侧，生理盐水纱布覆盖肠管。仔细结扎椎体前血管，分离椎体前肌肉组织，暴露椎体及椎间盘。用手术刀片切除椎间盘髓核组织及大部分纤维环组织，保留左右两侧及后侧少量的纤维环组织，保留上下两侧的软骨终板。上下椎体左右两侧钻孔，限深2mm。将上诉裸鼠皮下培养的组织工程椎间盘标本置于切除的兔椎间盘位置，选取适当长度的钢板2根，螺钉4个，固定上下椎体。生理盐水冲洗腹腔，充分止血，逐层缝合伤口。术后3天肌肉注射5万单位青霉素。

实验兔无死亡、伤口感染等情况，4W后麻醉实验兔，行X线检测，再行手术取出内固定，缝合伤口后行脊柱MRI检测。过量麻醉处死实验兔，取出组织工程椎间盘标本，观察标本形态后提取RNA、常规病理切片。

3.4病理组织染色检测

获取裸鼠皮下及实验兔体内组织工程椎间盘标本，去除致密的PBST外纤维环支架，常规固定包埋切片，行HE、番红-O、Collgaen II免疫组化及Aggrecan免疫荧光染色，方法步骤同前。

3.5Real time-PCR检测

取裸鼠皮下组织工程椎间盘(裸鼠组)、实验兔体内组织工程椎间盘(实验兔组)、兔正常椎间盘(正常组)，提取RNA，逆转录为cDNA，检测CollagenⅡ、Aggrecan基因表达量(参照PCR试剂盒的Fermentas两步法)。

3.6.1RNA的提取

(1)液氮下研磨组织，根据组织的量适当加入Trizol裂解液。

(2)将上述裂解液移入EP管中，在室温(15℃～30℃)下静置5min。

(3)按照每1ml Trizol加0.2ml氯仿的量，用力震荡15s，在室温下静置2～3min后，10000g在4℃下离心20min。

(4)取上层液体移入新的EP管中，按照每1ml Trizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下静置10分钟，10000g 4℃离心20min。

(5)弃上清，按照每1ml Trizol加1ml 75％乙醇进行涡旋混合洗涤，7500g4℃离心5min，弃上清液。

(6)在室温下自然干燥沉淀的RNA。

(7)用Rnase-free water溶解RNA沉淀(约25μl)。

3.6.2cDNA的合成

按表1配置40μl cDNA反应液，合成cDNA。

表1cDNA反应液

3.6.3目的基因的体外扩增

按表3配置PCR反应液，引物序列如表2，按表4步骤进行体外扩增。

表2Aggrecan、Collagen II和GAPDH基因引物序列

表3PCR反应液

表4Real-time PCR反应条件

统计学处理：

所有数据均采用SPSS 17.0统计软件(SPSS公司，美国)进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差(x±S)的形式表示，组间的两两比较采用单因素方差分析AVONA法进行检测。检验水准α值取双侧0.05，以P<0.05定义为差异有统计学意义。

3.7组织工程椎间盘在裸鼠皮下的培养及检测

裸鼠生长良好，伤口无明显感染，皮肤无溃烂，表明组织工程椎间盘无毒性反应(图7A)。取出标本后大体形态观察可见组织工程椎间盘结构完整，形态良好，外纤维环致密，内纤维环呈环层状，髓核呈白色胶冻状(图7B)。纤维环与髓核连接紧密，融合良好。病理组织染色均为阳性(图8)，HE染色见大量细胞存在于组织工程椎间盘内，番红-O染色见组织工程椎间盘呈红色，表明含有蛋白聚糖(图9A、B)；CollagenⅡ免疫组化染色可见组织工程椎间盘呈棕褐色，表明细胞分泌Ⅱ型胶原；Aggrecan免疫荧光染色见组织工程椎间盘呈绿色强荧光，表明细胞分泌蛋白聚糖(图8C、D)。

3.8组织工程椎间盘置换兔椎间盘

从腹部前正中入路暴露兔椎间盘(图9A)，可良好的暴露兔椎间盘及上下椎体，适当撑开上下椎体，可切除椎间盘髓核组织及大部分纤维环组织(图9B)，保留左右两侧、后侧少量的纤维环组织，保留上下两侧的软骨终板。将上述裸鼠皮下获取的组织工程椎间盘置换兔椎间盘，钢板固定上下椎体，固定牢靠(图9C、D)。

3.9影像检测

实验兔术后4W行X线检测见钢板内固定位置良好，无断裂、移位，椎间隙高度正常(图10A)。MRI检测见组织工程椎间盘T2相为高信号(图10B)，表明置换后的椎间盘髓核含水量高，符合天然椎间盘髓核的特点。

3.10兔体内的组织工程椎间盘标本形态观及病理组织染色

术后4W解剖实验兔，见钢板固定在位，无断裂、移位，组织工程椎间盘在椎间隙位置良好，无移位、碎裂，组织工程椎间盘髓核、纤维环结构存在，形态完整(图11A、B、C)。外纤维环致密，内纤维环仍呈环层状，髓核呈透明胶冻状，各组织间融合良好，无明显缝隙、缺损(图11D)。

实验兔体内组织工程椎间盘标本病理组织染色均为阳性(图12)，HE染色见大量细胞存在于组织工程椎间盘，番红-O染色见组织工程椎间盘呈红色，表明含有蛋白聚糖(图12A、B)；CollagenⅡ免疫组化染色可见组织工程椎间盘呈棕褐色，表明存在Ⅱ型胶原；Aggrecan免疫荧光染色见组织工程椎间盘呈绿色强荧光，表明细胞分泌蛋白聚糖(图12C、D)。

3.11Real-time PCR检测

从图13和图14可以看出，正常组的CollagenⅡ和Aggrecan mRNA的表达水平最高，其次为裸鼠组，实验兔组最低，组间两两比较差异具有统计学意义。

小结

组织工程椎间盘HE染色可见细胞在支架内部生长良好，分布均匀，细胞及细胞外基质填充于支架间隙，在内纤维环与髓核的交界区融合良好，无明显缝隙。番红-O染色阳性，表明分泌的细胞外基质为蛋白多糖；Collagen Ⅱ免疫组化染色、Aggrecan免疫荧光染色阳性，表明种子细胞在三相支架上分泌Ⅱ型胶原、蛋白聚糖，也证实了组织工程椎间盘内大量繁殖的细胞为纤维环细胞和髓核细胞，非裸鼠皮下的纤维细胞。

Ⅱ型胶原和蛋白多糖是天然椎间盘内纤维环和髓核组织的主要细胞外基质成分，它们的含量可以反映细胞的活性及合成分泌细胞外基质的功能状态。通过HE染色、番红-O染色证实了种子细胞在支架上粘附、生长良好，合成大量细胞外基质；Collagen Ⅱ免疫组化染色、Aggrecan免疫荧光染色证实了组织工程椎间盘含有Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，符合天然椎间盘的组织成份特点，表明本实验构建的组织工程椎间盘与天然椎间盘在形态结构和组织特性方面十分接近。

实验结果表明，兔体内组织工程椎间盘形态、位置良好，能保持组织工程椎间盘的基本结构，无破裂、损坏等现象。三相之间交界处融合良好，外纤维环致密，内纤维环的环层状结构依旧存在，髓核呈透明的胶冻状，三相之间结构分明，又相互融合，符合天然椎间盘的组织结构特点。HE染色、番红-O染色可见细胞在支架内部生长及分泌细胞外基质，无排异反应；Collagen Ⅱ免疫组化染色、Aggrecan免疫荧光染阳性，表明组织工程椎间盘内仍然存在Ⅱ型胶原和蛋白多糖。此时的Ⅱ型胶原和蛋白多糖有可能是置换之前就存在，有可能为置换后细胞再分泌的。经RT-PCR检测发现，置换4W后，组织工程椎间盘内Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA含量较置换之前有所降低。以天然椎间盘的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA含量为标准，置换前的组织工程椎间盘Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达仅次于天然椎间盘，差异具有统计学意义；置换后的组织工程椎间盘Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达较置换前有所降低，差异具有统计学意义。实验结果表明置换后的组织工程椎间盘Ⅱ型胶原和蛋白多糖的mRNA表达量有所下降，但仍持续表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA，说明置换后的椎间盘仍持续分泌Ⅱ型胶原和蛋白多糖，证明体内的组织工程椎间盘发挥着其生物学功能。

综上所述，将体外构建的具有细胞活性的组织工程椎间盘置换兔椎间盘后，在内固定支撑下，能继续保持椎间盘的生物活性，分泌椎间盘细胞外基质，发挥椎间盘的生物学功能。

Claims (10)

1.一种优良机械性能和生物相容性的人工椎间盘的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将PBST熔化，冷却后裁剪、打磨成表面光滑的PBST椭圆环；

(2)制备PBST静电纺丝薄膜，将所得薄膜进行盘绕6-10层，并紧密的套在步骤(1)所得PBST椭圆环的外环上；

(3)制备壳聚糖水凝胶，并填入步骤(2)所得物构成的椭圆环中的空心处；

所述PBST为聚对苯二甲酸-共-丁二酸丁二醇酯。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，于160℃下将所述PBST熔化，所述椭圆环的高度为2cm，直径为9mm，前后经为5mm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBST静电纺丝薄膜的孔隙率为50-80％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBST静电纺丝薄膜的孔隙率为61.83％±7.33％。

5.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述PBST静电纺丝薄膜的制备方法为：将PBST溶于氯仿，控制室温为25℃-30℃，纺丝电压为10Kv，接收速度为2ml/h，接收距离为20cm，通过静电纺丝法制备PBST静电纺丝薄膜。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖凝胶的制备方法为：制备壳聚糖水溶液，加入交联剂制备得到壳聚糖凝胶，所述交联剂由1,6-己二酸异氰酸酯和聚乙二醇-200按照体积比4:5混合制备而得。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PBST与氯仿的质量体积比为1:4。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖水溶液的质量分数为1％；和/或，壳聚糖水溶液与交联剂体积比为1000:10。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述交联剂由1,6-己二酸异氰酸酯和聚乙二醇-200按照体积比4:5混合，于25℃下反应3天制备而得。

10.由权利要求1-9任一项所述方法制备得到的人工椎间盘。