CN102218158A

CN102218158A - 一种复合壳聚糖季铵盐的抗感染pmma骨水泥

Info

Publication number: CN102218158A
Application number: CN2011101515834A
Authority: CN
Inventors: 谭红略; 汤亭亭; 彭兆祥; 郭圣荣
Original assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2011-06-08
Filing date: 2011-06-08
Publication date: 2011-10-19

Abstract

本发明涉及复合壳聚糖季铵盐的抗感染PMMA骨水泥，所述的复合骨水泥由HACC、PMMA和骨水泥单体混合制成，所述的HACC与PMMA的质量比为15-30%。本发明还提供这种复合骨水泥的制备方法和应用。本发明优点在于：1、复合HACC的PMMA可替代目前常用的PMMA抗生素珠链，应用于骨缺损充填并预防感染、治疗慢性骨髓炎以及骨质疏松的椎体增强，达到与抗生素骨水泥类似的抗菌能力，同时避免对抗生素耐药性的产生，并可用于已对抗生素耐药的病人，具有较大的的临床应用价值；2、弹性模量的适当降低也有助于减少治疗椎体与临近节段椎体的应力分布不均，减缓临近椎间盘的过早退变及临近椎体骨折。

Description

一种复合壳聚糖季铵盐的抗感染PMMA骨水泥

技术领域

本发明涉及一种医用骨水泥复合材料，具体地说，是一种复合壳聚糖季铵盐的抗感染PMMA骨水泥。

背景技术

随着社会老龄人口的增加、期望寿命延长及生活质量的提高，全膝及全髋关节置换术及治疗骨质疏松性脊柱压缩骨折的PVP(PKP)技术在骨科临床的应用日益广泛。在这些手术中，聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）是最为常用的植入固定材料，可以达到关节假体及骨折断端的即刻可靠固定。与其他的内植物材料一样，PMMA也将会因细菌侵入和生物膜在其表面的形成而增加感染的风险。临床上初次全髋及全膝置换术后，深部感染的发生率达1%-2%，而因松动进行的关节翻修术有更高的感染率，达到初次关节置换的2-3倍。骨关节感染可能造成灾难性的后果（如截肢），并常需要取出内植物进行二次手术，给患者和社会带来巨大经济负担，因此预防和治疗感染意义重大。

全身及局部抗生素应用是预防骨关节术后感染的有效途径。局部负载抗生素的PMMA骨水泥有较好的抗菌效果，目前已成为骨关节手术预防感染的标准方法。然而，全身及局部抗生素的使用已导致多重耐药细菌菌株出现（如耐药金黄色葡萄球菌MRSA、耐药表皮葡萄球菌MRSE等），难以再应用常规植入的抗生素骨水泥，因此发展新的抗感染植入和固定材料有迫切的临床需求。

壳聚糖是从甲壳类生物体内提取出的天然无毒可吸收的有机物，大量的文献证明其具有良好的生物相容性和一定抑菌能力。然而，壳聚糖因其溶解性差而使其抗感染的应用受到限制。壳聚糖衍生物是目前抗菌材料的研究热点，已经证实具有比壳聚糖更有效的抑菌活性。研究发现壳聚糖季铵化以后，其抗菌性能增强。Tsurugai等发现N,N,N-三甲基壳聚糖季铵盐有抗大肠杆菌ATCC 25922和葡萄球菌属ATCC 149909的活性。含有N-长链烷基壳聚糖的季铵盐对芽孢子菌、大肠杆菌有抗菌作用。

中国专利申请号200910195678.9公开了一种壳聚糖季铵盐及其应用，所述的壳聚糖季铵盐取代度为6%-44%，还提供了壳聚糖季铵盐的新用途，可望在骨科关节假体、钉板及髓内钉等各种金属内植物表面涂层发挥其抗感染作用，另外也可作为骨的替代材料、伤口敷料等发挥作用。中国专利文献02125614.4公开了一种骨修复材料，提供了一种机械强度较高的骨修复材料：0.01-10%的甲壳素衍生物以溶液形式或复合到骨水泥系统、聚乳酸等合成高分子材料中，该发明的甲壳素衍生物可以是磷酸化甲壳素、磷酸化壳聚糖、羧丁基壳聚糖及羧基化硫酸酯化壳聚糖。但是关于复合壳聚糖季铵盐(HACC)的抗感染PMMA骨水泥目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种复合壳聚糖季铵盐的抗感染PMMA骨水泥。

本发明的再一的目的是，提供一种复合壳聚糖季铵盐的抗感染PMMA骨水泥的制备方法。

本发明的另一的目的是，提供一种复合壳聚糖季铵盐的抗感染PMMA骨水泥的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种复合壳聚糖季铵盐的抗感染PMMA骨水泥，所述的复合骨水泥由HACC、PMMA和骨水泥单体混合制成，所述的HACC与PMMA的质量比为15-30%。

所述的HACC与PMMA的质量比为20-30%。

所述的HACC与PMMA的质量比为20%。

所述的骨水泥单体与HACC和PMMA的混合物的液/粉比为1.5ml /2mg。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的制备方法为将质量比15-30%的HACC与PMMA粉剂均匀混合，然后以1.5ml/2mg的液/粉比加入骨水泥单体。

所述的HACC与PMMA的质量比为20-30%。

所述的HACC与PMMA的质量比为20%。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的复合骨水泥在制备骨修复材料中的应用。

本发明优点在于：

1、复合HACC的PMMA可替代目前常用的PMMA抗生素珠链，应用于骨缺损充填并预防感染、治疗慢性骨髓炎以及骨质疏松的椎体增强，达到与抗生素骨水泥类似的抗菌能力，同时避免对抗生素耐药性的产生，并可用于已对抗生素耐药的病人，具有较大的的临床应用价值；

2、弹性模量的适当降低也有助于减少治疗椎体与临近节段椎体的应力分布不均，减缓临近椎间盘的过早退变及临近椎体骨折。

附图说明

附图1A和附图1B是抗压与抗弯强度及模量分析。HACC及壳聚糖以20%的质量比与PMMA复合，其生物力学性能有所降低，但仍高于国际ISSO5833：2002确定的丙烯酸类骨水泥所达到的最低力学强度。

附图2 是细菌黏附的定量与定性分析。培养4h后，对于S.epidermidis及ATCC 35984两菌株，PMMA-G及PMMA-H表面黏附的细菌数明显的低于PMMA及PMMA-C。对于MRSE，PMMA-H 表面黏附的细菌数明显的低于PMMA、PMMA-G及PMMA-C。上述比较差异有统计学意义（P＜0.05）。S.epidermidis在四种材料表面黏附4h后的CLSM（共聚焦激光扫描显微镜）也显示出同样的趋势（活菌染色为绿色，死菌染色为红色）。

附图3是24h细菌生物膜形成分析。培养24h时，S.epidermidis、ATCC35984及MRSE均在材料表面形成生物膜，但从生物膜结晶紫(0.1%CV)染色的OD值分析：对于S.epidermidis及ATCC35984两菌株，PMMA-G及PMMA-H表面生物膜OD值明显的低于PMMA及PMMA-C；对于MRSE，PMMA-H表面生物膜OD值明显低于PMMA、PMMA-G及PMMA-C。上述比较差异有统计学意义（P＜0.05）。MRSE在四种材料表面12h后生物膜SEM也显示同样的趋势。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例

一、材料与方法

（一）实验材料及仪器

材料:普通骨水泥：聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）及负载庆大霉素的骨水泥（PMMA-G, DePuy International Ltd.UK），含有粉剂40g，液体20ml；负载庆大霉素的骨水泥每40g粉剂含庆大霉素2g。HACC(壳聚糖季铵盐)。高纯度壳聚糖（脱乙酰度91.83%，粘均分子量20万，购自浙江金壳生物化学有限公司）。TSB（TSA）培养基或板。Live/Dead染液（LIVE/DEAD Baclight bacteria viability kits, Molecular probes,L13152）：将SYT09和PI各取1支混合后加入5ml无菌dh₂o水中，混匀后-20℃保存。磷酸盐缓冲液。实验菌株：表皮葡萄球菌菌株(S. epidermidis)、甲氧西林耐药的表皮葡萄球菌菌株（MRSE）及购自美国标准细菌库的表皮葡萄球菌菌株 (ATCC 35984)。甲氧西林耐药的表皮葡萄球菌菌株（MRSE）同时对庆大霉素（Gentamicin）耐药。其他试剂均为市售分析纯试剂。

仪器：超净工作台（BIO-HAZARD, VCM-420，中国台湾），电子分析天平（METTLER TOLEDO，AB204-E，瑞士），电磁搅拌器（STUART，SM24，英国），低温离心机（UNIVERSAL，32R，HETTICH，德国）。激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP2; Leica Microsystems, Heidelberg, Germany）及扫描电镜(Joel JSM-6310LV,JEOL Ltd., Tokyo,Japan)。

（二）实验材料的制备

壳聚糖与PMMA粉剂以不同质量比均匀混合（设为15%、20%、25%、30%、40%），再加入骨水泥聚合液体（1.5ml/2g）。上述骨水泥混合加入相应模具，制备抗压强度试验样品，制备12mm×6mm圆柱体、75mm×3mm×10mm矩形片进行生物力学测试，6mm×3mm 盘状片用于细菌学实验。抗压样品进行相应的力学实验，目的为选择理想的材料混合质量比（见图1），结果显示20%的质量比较理想，因此质量比复合入较多HACC，提高试件的抑菌抗菌效果，同时其力学强度仍高于丙烯酸树脂类骨水最低的国际标准（ISO5833:2002）。壳聚糖季铵盐（HACC）则也以20%的质量比与PMMA复合。实验分4组：PMMA、PMMA-Gentamicin（PMMA-庆大霉素，简称PMMA-G）、PMMA-Chitosan（PMMA-壳聚糖，简称PMMA-C）及PMMA-HACC（壳聚糖季铵盐）(简称PMMA-H)。

（三）生物力学测试

骨水泥抗压强度及模量：本实验每组测定5套骨水泥试条，试条制备见前述。力学实验在（23±1）℃环境下进行，将制备的圆柱体放在试验机内，开动试验机以20mm/min恒定的十字头速率作形变对负荷的曲线。当圆柱体破裂或已过上屈服点时停机。对于每个圆柱体，记录最先出现的引起圆柱体破裂所施加的力并计算抗压强度。计算5个圆柱体的平均抗压强度。

（四）抗菌抑菌性能研究

将低温下冻存的上述细菌取出并立即侵入38℃水浴中进行急剧解冻，直到全部融化，再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基内培养。并在营养琼脂培养基上划线接种。在无菌环境下，取单克隆菌落于TSB培养液内于培养箱内震荡过夜培养（37℃）。传代2次后，在细菌处于对数期生长期，以麦氏比浊计将菌液的悬浮浓度调整至1×10⁶CFUs/ml。

将骨水泥试样置入48孔培养板内，每一骨水泥试样重复3孔。每孔滴加1ml的上述细菌悬液，在37℃孵育箱中静态孵育4h后取出，用无菌PBS轻柔清洗3次。试件置入培养液中，以超声洗脱5-7分钟，然后倍稀铺板计细菌数（CFUs/mm²）。

Live/Dead染液含有两种荧光染液SYSTO9和PI，前者使活细菌发出绿色荧光，而后者使死细菌发出红色荧光，从而可以在镜下区分活细菌和死细菌。按说明书的比例将两种染料振荡混匀备用。四种骨水泥材料放入48孔板孔底，每孔加1ml上述细菌悬液，密度为1×10⁶CFUs/ml，放入培养箱有氧37℃培养4h，弃培养液，PBS轻轻洗涤3次，在各标本表面滴加200ul上述配制好的染液，铝箔包裹避光室温孵育15min后，标本于激光共聚焦显微镜下观察。

材料消毒后放入48孔板孔底，每孔加1ml上述细菌悬液，放入培养箱37℃培养4h，弃培养液，PBS轻轻洗涤3次，试件用2.5%戊二醛初始固定，存放4℃冰箱2h。PBS漂洗1h，放入0.1%锇酸固定1h，梯度酒精脱水（30%，50％，70％，80%，90％，95%及100%）各10min。临界点干燥，喷金。在扫描电子显微镜下观察细菌黏附。

二、结果

（一）四种材料生物力学强度比较

PMMA-C及PMMA-H生物力学性能有所降低，与PMMA及PMMA-G相比，差异有统计学意义（p＞0.05）。但仍高于国际ISSO5833：2002确定的丙烯酸类骨水泥所达到的最低力学强度标准（抗压≥70Mpa, 抗弯≥50Mpa）（见图1）。

（二）荧光显微镜观察材料表面对细菌黏附及形成生物膜的影响

经过与TSB细菌培养基4h共培养，在四种材料表面上3种细菌都有一定的黏附生长，经live/dead baclight kit荧光染液染色后荧光显微镜观察发现：对于ATCC 35984、S.epidermidis，PMMA-G、PMMA-H表面黏附的细菌数量较PMMA及PMMA-C表面显著减少且呈散在分布； PMMA及PMMA-C表面黏附菌数量差别不显著且成致密分布（见图2）。对于耐药菌MRSE，只有PMMA-H表面黏附的细菌量较PMMA、PMMA-C及PMMA-G表面显著减少。据此可知负载HACC的PMMA表面具有抑制细菌黏附增殖的性能。

在6h、12h及24h时，通过涂板计数、荧光显微镜及SEM观察分析：对于ATCC 35984、S.epidermidis，PMMA-G、PMMA-H表面细菌生物模形成较PMMA及PMMA-C表面显著减少且细菌呈散在分布；PMMA及PMMA-C表面生物膜活菌数量差别不显著且成致密分布，大量的葡萄球菌聚集在一起，形成典型立体突起的蘑菇状生物膜（见图3）。对于耐药菌MRSE，PMMA-H表面的细菌生物膜量较PMMA、PMMA-C及PMMA-G表面显著减少，细菌呈平铺生长，少见蘑菇状突起的生物膜形成。表明负载HACC的PMMA表面具有抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的特性。

本发明特色在于：复合HACC的PMMA对上述3个细菌具有较明显抑制作用，表现出一定的抗菌抑菌性能。弹性模量的适当降低也有利于在进行骨质疏松椎体增强时刻减少治疗椎体与临近节段椎体的应力分布不均，减缓临近椎间盘的过早退变及临近椎体骨折。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种复合壳聚糖季铵盐的抗感染PMMA骨水泥，其特征在于，所述的复合骨水泥由HACC、PMMA和骨水泥单体混合制成，所述的HACC与PMMA的质量比为15-30%。

2.根据权利要求1所述的复合骨水泥，其特征在于，所述的HACC与PMMA的质量比为20-30%。

3.根据权利要求1所述的复合骨水泥，其特征在于，所述的HACC与PMMA的质量比为20%。

4.根据权利要求1所述的复合骨水泥，其特征在于，所述的骨水泥单体与HACC和PMMA的混合物的液/粉比为1.5ml /2mg。

5.根据权利要求1所述的复合骨水泥的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为将质量比15-30%的HACC与PMMA粉剂均匀混合，然后以1.5ml/2mg的液/粉比加入骨水泥单体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的HACC与PMMA的质量比为20-30%。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的HACC与PMMA的质量比为20%。

8.根据权利要求1-4任一所述的复合骨水泥，其特征在于，所述的复合骨水泥在制备骨修复材料中的应用。