CN108135839A - 用于治疗白质中风的干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞 - Google Patents

用于治疗白质中风的干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞 Download PDF

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Abstract

在各种实施方式中，提供了用于改善诸如白质中风的脑局部缺血损伤后对象恢复的方法和组合物。在各种实施方式中，该方法涉及在对象脑中梗塞核心内或在其直接相邻位置给予干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。

Description

用于治疗白质中风的干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞
优先权
本申请要求2015年8月15日提交的美国临时申请第62/205,723号的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。
技术领域
在各种实施方式中，提供了体外分化的少突胶质细胞祖细胞以及在脑局部缺血损伤治疗中使用相同的少突胶质细胞祖细胞的方法。
背景技术
美国每年795,000例新发生的中风中，皮质下白质中风(WMS)占高达25％，并且其是导致痴呆的第二大原因。在正常的人类衰老过程中，大脑白质区域受到与明显的和临床无症状的局部缺血相关的进行性损伤。这一类的局部缺血常被称为“小血管疾病”，因为其在不阻塞脑大动脉的情况下产生，并且其可以在没有中风损伤典型临床症状的情况下发生(Gorelick等,(2011)Stroke 42(9):2672)。在对未患过中风的无症状个体的脑成像中检测到指示WMS的脑白质病变(Debette和Markus,(2010)British Medical Journal 3413666)，并且其随年龄增长累积，因此存在于几乎所有80岁以上的个体中(de Leeuw等,(2001)Neurol Neurosurg Psychiatry 70:9)。白质损伤的程度与认知、平衡和步态中的异常密切相关，并且带来死亡风险的增加(Zheng等,(2011)Stroke 42(7):2086；Debette和Markus,(2010)British Medical Journal 341x3666)。局部缺血白质损伤的这种进行性积累是导致痴呆的第二主要原因，并且其与阿尔茨海默病相互作用，从而使其恶化并可能加速这种疾病(Gorelick等,(2011)Stroke 42(9):2672；DeCarli等,(2013)AlzheimersDis.33(Suppl 1):S417)。目前，尚未存在对于WMS的治疗。
恢复WMS患者神经学功能的一种潜在可行治疗是细胞移植。WMS具有与传统中风模型中发生的细胞损伤非常不同的模式。WMS中受损的神经元包括少突胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞(OPC)、星形胶质细胞和轴突。人胚胎干细胞衍生的少突胶质细胞(hESC-OPS)为WMS治疗提供了有吸引力的候选物。这些细胞处于匹配白质局部缺血中最受损的细胞元件的谱系，即少突胶质细胞谱系的细胞，并且导致少突胶质细胞，即脑白质区域的髓磷脂化细胞增加(Richardson等,(2011)Neuron 70(4):661)。此外，脑白质病变在WMS中融合并广泛存在，因此任何候选细胞治疗都将需要从注射点移动至损伤位点。OPC已经显示出在CNS损伤模型中广泛移动(Goldman等,(2012)Science 338(6106):491；Sun等,(2013)PLoS One 8(2)；e57534)。最后，OPC是诸如BDNF等分泌神经营养因子的来源，其可以对局部缺血的白质提供直接的修复作用。
AST-OPC1是一群少突胶质细胞祖细胞(OPC)，所述OPC是使用特定分化方案由人胚胎干细胞(hESC)产生的(Nistor等,(2005)Glia 49(3):385.)。AST-OPC1已经通过几种分子的表达表征，所述分子包括巢蛋白、PDGRFa和NG2，与少突胶质细胞前体细胞相关。该细胞进一步通过其极少或缺乏已知存在于其它细胞类型的标志物表达表征，这些标志物例如神经元、星形角质细胞、内胚层、中胚层和hESC等。在体外，AST-OPC1还产生可扩散因子，其支持感觉神经元的神经突延伸(Zhang等,(2006)Stem Cells Dev.15(6):943)。AST-OPC1已经在脊椎损伤中显示出大量移动(Keirstead等,(2005)Neurosci 25(19):4694.)。
因此，需要研发用于包括WMS在内的脑局部缺血损伤的新型疗法。此外，人们需要高纯度、临床级少突胶质细胞祖细胞用于对需要有髓磷脂修复和/或髓鞘再生的病症(如WMS)的细胞治疗。本文所述的组合物和方法满足这些需求以及本领域的其它需求。
发明概述
本文所述各种实施方式中，提供了这样的方法，其尤其用于治疗脑局部缺血损伤后的对象。在一些实施方式中，脑局部缺血损伤是白质皮质下中风。在某些实施方式中，该对象是人。在各种实施方式中，该方法通常涉及将治疗有效量的多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞给予对象的脑中。在一些实施方式中少突胶质细胞祖细胞衍生自人胚胎干细胞。在其他实施方式中，少突胶质细胞祖细胞衍生自除了人胚胎干细胞以外的来源，如成体干细胞、诱导多潜能干细胞等。在一些实施方式中，该方法包括在梗塞核心给予多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。在一些实施方式中，该方法包括在梗塞核心直接相邻位置直接给予多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。
在某些实施方式中，在局部缺血损伤后的亚急性期间给予多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。在一些实施方式中，在局部缺血损伤后的早期亚急性期间给予多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。在其它实施方式中，在晚期亚急性期间给予多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。
在某些实施方式中，使用储库式递送系统(depot delivery system)给予多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。在一些实施方式中，储库式递送系统包括水凝胶。在一些实施方式中，水凝胶包括透明质酸盐。在一些实施方式中，水凝胶包括硫醇化透明质酸盐。在一些实施方式中，水凝胶包括明胶。在其它一些实施方式中，水凝胶包括硫醇化明胶。在一些实施方式中，水凝胶包括透明质酸盐和明胶。在其它实施方式中，水凝胶包括硫醇化透明质酸盐和硫醇化明胶。在一些实施方式中，水凝胶包括交联剂。在其它实施方式中，水凝胶包括硫醇化透明质酸盐、硫醇化明胶和交联剂。
在某些实施方式中，提供了改善脑局部缺血损伤后对象的运动和/或认知机能和/或言语的方法，其中该方法包括在所述对象脑中梗塞核心或其直接相邻位置给予治疗有效量的多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。在某些实施方式中，多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞是人胚胎干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。在其他实施方式中，少突胶质细胞祖细胞衍生自除了人胚胎干细胞以外的来源，如成体干细胞、诱导多潜能干细胞等。在一些实施方式中，脑局部缺血损伤是白质皮质下中风。在某些实施方式中，该对象是人。在一些实施方式中，该方法包括在梗塞核心给予多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。在其它实施方式中，该方法包括在梗塞核心直接相邻位置给予多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。
在某些实施方式中，本公开提供了包含用于治疗白质中风的药物组合物的容器，其中，药物组合物包括多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。在某些实施方式中，多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞是人胚胎干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。在其他实施方式中，少突胶质细胞祖细胞衍生自除了人胚胎干细胞以外的来源，如成体干细胞、诱导多潜能干细胞等。
在其它一些实施方式中，本公开提供了用于治疗皮质下白质中风的药物组合物，其包括多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。在某些实施方式中，多潜能干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞是人胚胎干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。在其他实施方式中，少突胶质细胞祖细胞衍生自除了人胚胎干细胞以外的来源，如成体干细胞、诱导多潜能干细胞等。在某些实施方式中，药物组合物还包括储库式递送系统。在一些实施方式中，储库式递送系统包括水凝胶。在一些实施方式中，水凝胶包括透明质酸盐。在一些实施方式中，水凝胶包括硫醇化透明质酸盐。在一些实施方式中，水凝胶包括明胶。在其它一些实施方式中，水凝胶包括硫醇化明胶。在一些实施方式中，水凝胶包括透明质酸盐和明胶。在其它实施方式中，水凝胶包括硫醇化透明质酸盐和硫醇化明胶。在一些实施方式中，水凝胶包括交联剂。在其它实施方式中，水凝胶包括硫醇化透明质酸盐、硫醇化明胶和交联剂。
附图说明
图1是左半球皮质下中风后2天拍摄的人白质中风的代表性磁性共振成像。箭头指示相较于相同患者之前的扫描新的白质高信号(hyperintensity)。(最初在Sozmen等,(2009)J.Neurosci Methods 180(2):261中公开)。.
图2显示了在白质中风小鼠模型中测试AST-OPC1的研究1的实验时间轴。示出了实验设计中重要的时间点，包括中风后7天进行的AST-OPC1移植，细胞移植后15天进行的组织处理。AST-OPC1剂量＝100,000细胞/小鼠，作为单个1μL注射。缩写：L-NIO＝N5-(l-亚氨乙基)-L-鸟氨酸，二氢氯化物。
图3是指示L-NIO注射位点的小鼠脑冠部的简图。蓝色箭头指示L-NIO的三个注射位点，其以36°的角度直接将L-NIO递送到各小鼠脑的胼胝体以诱导局灶性局部缺血病变。缩写：Cx＝皮质；Str＝纹状体；WM＝白质。
图4A-4B显示了中风损伤的小鼠脑中星形胶质细胞活化和轴突损失的代表性荧光显微图像。图像组显示了中风损伤三周后未损伤的对侧半球(图4A，对照)和中风损伤的半球(图4B，白质中风)中星形胶质细胞(GFAP)和轴突(NF200)的荧光免疫染色。在图4A中，左侧栏描述了针对GFAP(绿色)和NF200(红色)的合并荧光图像，中间栏单独描述了GFAP，而右侧栏单独描述了NF200。在图4B中，左侧栏单独描述了NF200；中间栏单独描述了GFAP；而右侧栏描述了针对GFAP(绿色)和NF200(红色)的合并荧光图像。各行显示针对病变区域(图4B)和对侧(图4A)递增的放大倍数。顶行＝40倍、中间行＝20倍、底行＝600倍。白色方框表示在下图中放大的区域。图4A中的白色点线指示胼胝体的大致边界。星号指示侧脑室。缩写：Cx＝皮质；GFAP＝神经胶质纤维酸蛋白；NF200＝神经丝200；Str＝纹状体；WM＝白质。
图5A-5E显示了中风损伤的小鼠脑中活化的小神经胶质/免疫细胞的代表性荧光显微图像。图5A是指示图5B-5D中所示区域的小鼠脑冠部的简图。示出通过Ibal标记(紫色)确定的未损伤的对侧胼胝体(图5B)和损伤的同侧胼胝体(图5C-5E)内中风损伤后三周后相对小神经胶质/免疫细胞活化。图5D和5E显示了图5C中指示区域较高放大倍数图像。图5C中白色虚线指示梗塞核心和梗塞周围组织之间的大致边界。放大：图5B和图5C＝600倍；图5D和图5E＝1000倍。缩写：Ibal＝离子化钙结合衔接体分子1。
图6A-6D显示了中风损伤的小鼠脑中髓磷脂损失和少突胶质细胞响应的代表性荧光显微图像。未损伤的对侧胼胝体(图6A和图6B)和损伤的同侧胼胝体(图6C和图6D)内中风损伤后三周后相对髓磷脂损失(MBP、绿色)和少突胶质细胞存在(OLIG2、红色)。对于图6A和图6C，左侧图显示MBP和OLIG2的合并图像，中间图单独显示MBP，而右侧图单独显示OLIG2。图6B和6D显示了图6A和6C中合并的图像较高放大倍数的图像。图6E是显示图6A-6D中所描述区域的小鼠脑冠部的简图。放大倍数：图6A和图6C＝600倍；图6B和图6D＝l000倍。缩写：MBP＝髓磷脂碱性蛋白。
图7A-7H显示了中风损伤的小鼠脑中内源性神经发生的代表性荧光显微图像。显示了病变的胼胝体中风损伤三周后相对神经发生(DCX、白色)、髓磷脂存在(MBP、绿色)、少突胶质细胞存在(OLIG2、红色)和小神经胶质/免疫细胞活化(IBA-1、蓝色)。上排图：图7A是上排图的合并图像，图7B是单独的DCX，图7C是单独的MBP，图7D是单独的OLG2。下排图：图7E是下排图的合并图像，图7F是单独的IBA-1，图7G是单独的DCX，图7H是单独的OLG2。图7A中红色方框描述了图7E中放大的区域。图7B中蓝色椭圆形指示DCX阳性细胞。放大倍数：图7A-7D＝200倍；图7E-7H＝600倍。缩写：DCX＝双皮质素，IBA-1＝离子化钙结合衔接体分子1，MBP＝髓磷脂碱性蛋白。
图8是指示将细胞注射至未损伤胼胝体位点的小鼠脑冠部的简图。箭头指示未损伤胼胝体内大致的细胞注射位点。缩写：Cx＝皮质；Str＝纹状体；WM＝白质。
图9A-9D显示了AST-OPC1移植两周后未损伤的小鼠脑中星形胶质细胞和小神经胶质/免疫细胞活化的代表性荧光显微图像。图像组显示了AST-OPC1移植到未损伤的胼胝体中两周后对侧(图9A、图9C)和同侧(图9B、图9D)中星形胶质细胞(GFAP)和活化的小神经胶质/免疫细胞(Ibal/IBA-1)的荧光免疫染色。在图9A和图9C中，左侧栏描述了针对GFAP(绿色)和Ibal(红色)的合并荧光图像，中间栏单独描述了GFAP，而右侧栏单独描述了Ibal。在图9B和图9D中，左侧栏单独描述了Ibal；中间栏单独描述了GFAP；而右侧栏描述了针对GFAP(绿色)和Ibal(红色)的合并荧光图像。图9A和图9B中白色方框指示图9C和图9D中所示放大的区域。放大倍数：图9A和图9B＝40倍；图9C和图9D＝600倍。缩写：Cx＝皮质；GFAP＝神经胶质纤维酸蛋白；Ibal/IBA-1＝离子化钙结合衔接体分子1；Str＝纹状体。
图10A-10E显示了AST-OPC1移植两周后未损伤的小鼠脑中指示无髓磷脂损失和最小未成熟神经元迁移的代表性荧光显微图像。图像组显示了AST-OPC1移植到未损伤的胼胝体中两周后对侧(图10A、图10C)和同侧(图10B、图10D)中髓磷脂(MBP)和未成熟神经元(DCX)的荧光免疫染色。在图10A和图10B中，左侧栏描述了针对MBP(绿色)和DCX(红色)的合并荧光图像，中间栏单独描述了MBP，而右侧栏单独描述了DCX。在图10C和图10D中,MBP染色单独以放大的亚区域示出。图10E是指示荧光显微图像所示区域的小鼠脑冠部的简图。放大倍数：图10A和图10B＝40倍；图10C和图10D＝600倍。缩写：DCX＝双皮质素；MBP＝髓磷脂碱性蛋白。
图11A-11D显示了AST-OPC1移植两周后未损伤的小鼠脑中指示增加的少突胶质细胞反应代表性荧光显微图像。图像组显示了AST-OPC1移植到未损伤的胼胝体中两周后对侧(图11A-11B)和同侧(图11C-9D)中少突胶质细胞(OLIG2)、髓磷脂(MBP)和活化的小神经胶质/免疫细胞(IBA-1)的荧光免疫染色。在图11A中，组图1(最左侧)描述了针对MBP(绿色)和OLIG2(红色)、IBA-1(蓝色)的合并荧光图像，组图2单独描述了IBA-1，组图3单独描述了MBP，而组图4单独描述了OLIG2。在图11B中，示出来自图11A针对IBA-1和OLIG2的合并图像。在图11C中，组图1(最左侧)单独描述了OLIG2，组图2单独描述了MBP，组图3单独描述了IBA-1，而组图4描述了针对MBP(绿色)和OLIG2(红色)和OLG2(红色)以及IBA-1(蓝色)的合并荧光图像。在图11D中，示出来自图11C针对IBA-1和OLIG2的合并图像。图11A和图11C之间的简图指示荧光显微图像所示区域。放大倍数＝200倍。缩写：Ibal/IBA-1＝离子化钙结合衔接体分子1；MBP＝髓磷脂碱性蛋白。
图12是指示将细胞注射至中风病变的胼胝体位点的小鼠脑冠部的简图。蓝色箭头指示L-NIO诱导中风病变的大致注射位点。黑色箭头指示中风病变核心(红色区域)中细胞注射位点的大致位置。大致病变核心以蓝色示出。缩写：Cx＝皮质；Str＝纹状体；WM＝白质。
图13A-13F显示了中风损伤并将AST-OPC1移植到病变核心后小鼠脑中星形胶质细胞和小神经胶质/免疫细胞活化的代表性荧光显微图像。图像组显示了中风后三周且AST-OPC1移植两周后未损伤的对侧半球(图13A-13C)和中风损伤/AST-OPC1移植的半球(图13D-13F)中星形胶质细胞(GFAP)和小神经胶质/免疫细胞(IBA-1)的荧光免疫染色。图13A、13B、13D和13E示出低放大倍数(图13A、图13D)和高放大倍数(图13B、图13E)的GFAP免疫染色。图13C和图13F示出高放大倍数下GFAP(绿色)和IBA-1(桔色)的合并图像(左侧图)、单独的GFAP(中间图)和单独的IBA-1(右侧图)。星号指示大致病变核心。放大倍数：图13A和图13D＝40倍；图13B和图13E＝200倍；图13C和图13F＝600倍。缩写：Cx＝皮质；GFAP＝神经胶质纤维酸蛋白；IBA-1＝离子化钙结合衔接体分子1；Str＝纹状体。
图14A-14D显示了中风损伤并将AST-OPC1移植到病变核心的小鼠脑中后星形胶质细胞活化和轴突损失的代表性荧光显微图像。图像组显示了中风后三周且AST-OPC1移植两周后中风损伤/AST-OPC1移植的半球和星形胶质细胞(GFAP)和轴突(NF200)的荧光免疫染色。图14A示出中风病变中针对GFAP(红色)和NF200(蓝色)的合并图像。图14B单独示出NF200染色，而图14C单独示出GFAP。图14A-14C中的白色点线指示胼胝体的大致边界。图14A-14C中的星号指示中风病变的大致核心。图14D是指示图14A-14C中所示区域的小鼠脑冠部的简图。放大倍数＝200倍。缩写：Cx＝皮质；GFAP＝神经胶质纤维酸蛋白；Str＝纹状体。
图15A-15D显示了中风损伤后并将AST-OPC1移植到病变核心后小鼠脑中AST-OPC1位置、髓磷脂损失和内源性神经发生的代表性荧光显微图像。图像组示出中风后三周且AST-OPC1移植两周后的中风损伤/AST-OPC1移植的半球中AST-OPC1(Hnuc)和髓磷脂(MBP)和未成熟神经元(DCX)的荧光免疫染色。在图15A-15C中，组图1(最左侧)示出中风病变内针对Hnuc(蓝色)、MBP(绿色)和DCX(红色)的合并图像。图15D是指示图15A-15C中所示区域的小鼠脑冠部的简图。放大倍数：图15A＝200倍、图15B＝1200倍、图15C＝2000倍。缩写：DCX＝双皮质素；Hnuc＝抗-人细胞核；MBP＝髓磷脂碱性蛋白。
图16A-16D显示了中风损伤后且将AST-OPC1移植到病变核心后的小鼠脑中小神经胶质/免疫细胞活化、髓磷脂损失和少突角质细胞反应的代表性荧光显微图像。图像组显示了中风后三周且AST-OPC1移植两周后中风损伤/AST-OPC1移植的半球(图16A、图16C)和未损伤的对侧半球(图16B、图16D)中活化的小神经胶质/免疫细胞(Ibal/IBA-1)、髓磷脂(MBP)和少突胶质细胞(OLIG2)的荧光免疫染色。在图16A，组图1(最左侧)示出中风病变内针对IBA-1(蓝色)、MBP(绿色)和OLIG2(红色)的合并图像。组图2单独示出IBA-1，组图3单独示出MBP，而组图4单独示出OLIG2。在图16B中，组图1(最左侧)单独描述了OLIG2，组图2单独描述了MBP，组图3单独描述了IBA-1，而组图4描述了三个染色的合并图像。图16C和图16D显示了仅针对IBA-1(蓝色)和OLIG2(红色)的合并图像。图16A和图16B之间的简图指示荧光显微图像所示区域。放大倍数＝200倍。缩写：IBA-1＝离子化钙结合衔接体分子1；MBP＝髓鞘碱性蛋白。
图17是指示中风病变附近的胼胝体内细胞注射位点的小鼠脑冠部的简图。蓝色箭头指示L-NIO的大致注射位点以诱导中风病变。黑色箭头指示中风病变核心(红色区域)附近细胞注射位点的大致位置。大致病变核心以蓝色示出。缩写：Cx＝皮质；Str＝纹状体；WM＝白质。
图18A-18E显示了中风损伤后并将AST-OPC1移植到病变核心附近后的小鼠脑中星形胶质细胞和小神经胶质/免疫细胞活化的代表性荧光显微图像。图像组显示了中风后三周且AST-OPC1移植两周后未损伤的对侧半球(图18A-18B)和中风损伤/AST-OPC1移植的半球(图13C-13E)中星形胶质细胞(GFAP)和活化的小神经胶质/免疫细胞(IBA-1)的荧光免疫染色。在图18A和图18B中，左侧图显示了针对GFAP(绿色)和IBA-1(桔色)的合并图像，中间图单独显示了GFAP，而右侧图单独显示了IBA-1。图18A中的白色方框指示图18B中放大的区域。在图18C-18D中，左侧图单独显示了IBA-1，中间图单独显示了GFAP，而右侧图显示了合并图像。在图18E中，左侧图显示了针对GFAP(绿色)和IBA-1(桔色)的合并图像，中间图单独显示了GFAP，而右侧图单独显示了IBA-1。图18C和图18D中白色方框分别指示图18D和图18E中所示放大的区域。图18D和图18E中星号指示组图之间的共同标志。放大倍数：图18A和图18C＝40倍、图18B＝600倍、图18D＝1000倍和图18E＝1000倍。缩写：Cx＝皮质；GFAP＝神经胶质纤维酸蛋白；IBA-1＝离子化钙结合衔接体分子1；Str＝纹状体。
图19A-19B显示了中风损伤和将AST-OPC1移植到病变核心附近后的小鼠脑中AST-OPC1位置、反应性星形胶质细胞和活化的小神经胶质/免疫细胞的代表性荧光显微图像。图像组显示了中风后三周且AST-OPC1移植两周后未损伤的对侧半球(图19A)和中风损伤/AST-OPC1移植的半球(图19B)中AST-OPC1(Hnuc)和反应性星形胶质细胞(GFAP)和活化的小神经胶质/免疫细胞(IBA-1)的荧光免疫染色。在图19A和图19B中，组图1(最左侧)示出胼胝体(由图19A和图19B之间的简图所指示)内针对Hnuc(蓝色)、GFAP(绿色)和IBA-1(红色)的合并图像。放大倍数＝600倍。缩写：GFAP＝神经胶质纤维酸蛋白；Hnuc＝抗-人细胞核；IBA-1＝离子化钙结合衔接体分子1。
图20A-20B显示了中风损伤且将AST-OPC1移植病变核心附近后的小鼠脑中AST-OPC1位置、降低的髓磷脂损失和内源性神经发生的代表性荧光显微图像。图20A显示了中风后三周且AST-OPC1移植两周后中风损伤/AST-OPC1移植的半球中AST-OPC1(Hnuc)和髓磷脂(MBP)和未成熟神经元(DCX)的荧光免疫染色。最左边的组图示出针对MBP(绿色)和DCX(红色)的合并图像(上和中组图)或针对Hnuc(蓝色)和MBP(绿色)的合并组图(下组图)。组图的中间列显示了针对MBP或Hnuc的单个染色，而右侧列显示了针对DCX或MBP的单个染色。图20B是指示图20A中所示区域的简图。放大倍数：(上行)＝200倍、(中行)＝600倍、(下行)＝1000倍。缩写：DCX＝双皮质素；Hnuc＝抗-人细胞核；MBP＝髓鞘碱性蛋白。
图21A-21D显示了中风损伤并将AST-OPC1移植到病变核心附近后的小鼠脑中小神经胶质/免疫细胞活化、髓鞘碱损失和少突角质细胞反应的代表性荧光显微图像。图像组显示了中风后三周且AST-OPC1移植两周后中风损伤/AST-OPC1移植的半球(图21B、图21D)和未损伤的对侧半球(图21A、图21C)中小神经胶质/免疫细胞(IBA-1)、髓磷脂(MBP)和少突胶质细胞(OLIG2)的荧光免疫染色。在图21A，组图1(最左侧)示出对侧胼胝体内针对IBA-1(蓝色)、MBP(绿色)和OLIG2(红色)的合并图像。组图2单独示出IBA-1，组图3单独示出MBP，而组图4单独示出OLIG2。在图21B中，组图1(最左侧)单独示出了OLIG2，组图2单独示出MBP，组图3单独示出IBA-1，而组图4示出了三个染色的合并图像。图21C和图21D显示了仅针对IBA-1(蓝色)和OLIG2(红色)的合并图像。图21A和图21B之间的简图指示荧光显微图像所示区域。放大倍数＝200倍。缩写：IBA-1＝离子化钙结合衔接体分子1；MBP＝髓鞘碱性蛋白。
图22A-22D显示了中风损伤并将AST-OPC1移植到病变核心附近后的小鼠脑中AST-OPC1位置的代表性荧光显微图像。图像组显示了中风后三周且AST-OPC1移植两周后中风损伤/AST-OPC1移植的半球(图22B、图22D)和未损伤的对侧半球(图22A、图22C)中AST-OPC1(Hnuc，蓝色)的荧光免疫染色。各图中间的简图指示图22A-22D中所示区域。放大倍数＝200倍。缩写：Hnuc＝抗-人细胞核。
图23A-23B显示了中风损伤且AST-OPC1移植后小鼠脑中梗塞体积和神经胶质瘢痕体积的定量。图23A显示了中风(或假手术)后三周且AST-OPC1移植后两周各处理组的平均梗塞体积。图23B显示了中风(或假手术)后三周且AST-OPC1移植后两周各处理组的平均神经胶质瘢痕体积。处理组标记：WMS＝只有白质中风；OPC＝假手术加上AST-OPCl移植；WMS+OPC内＝中风加上在中风病变内的AST-OPCl移植；WMS+OPC外＝中风加上在中风病变附近的AST-OPCl移植。误差线表示平均值的标准偏差。
图24A-24B显示了中风损伤且AST-OPC1移植后胼胝体病变中髓磷脂碱性蛋白免疫反应活性和少突胶质细胞反应的定量。图24A显示了中风(或假手术)后三周且AST-OPC1移植后两周各处理组的平均髓磷脂碱性蛋白(MBP)免疫反应活性。图24B显示了中风(或假手术)后三周且AST-OPC1移植后两周各处理组的OLIG2阳性细胞的平均数量。处理组标记：天然＝未损伤且未移植的；WMS＝只有白质中风；OPC＝假手术加上AST-OPCl移植；WMS+OPC内＝中风加上在中风病变内的AST-OPCl移植；WMS+OPC外＝中风加上在中风病变附近的AST-OPCl移植。误差线表示平均值的标准偏差。
图25显示了在白质中风小鼠模型中检测AST-OPC1在功能性恢复和白质保护(sparing)中作用的研究2的实验时间轴。示出了实验设计中重要的时间点，包括在中风后7天后AST-OPC1移植，以及月度行为测试。AST-OPC1剂量＝100,000细胞/小鼠作为单个1μL注射。
图26显示了AST-OPC1移植至病变位点附近改善了中风损伤小鼠在网格行走(gridwalking)测试中的表现。示出了各处理组在网格行走测试中随时间变化(中风后)的平均表现(以％脚步错误示出)。中风后第一周对应AST-OPC1移植前一天。使用双向ANOVA与图基HSD事后分析(Tukey's HSD post-hoc analysis)，星号和井号指示相对于未损伤对照组的显著性(p<0.05)。中风后四个月，所有的中风损伤组(+/-AST-OPCl)与对照未损伤动物显著不同，表明持续的缺乏。中风后六个月，仅有只有中风的组和向梗塞给予高剂量AST-OPC1的中风组(中风+内部细胞高剂量)与对照未损伤动物显著不同，表明在其它中风损伤AST-OPC1处理组中积极的恢复。处理组标记：对照＝未损伤未移植；中风＝只有中风；中风+内部细胞高剂量＝中风损伤+100,000AST-OPCl细胞被移植到中风病变内；中风+外部细胞高剂量＝中风损伤+100,000AST-OPCl细胞被移植到中风病变附近；中风+外部细胞低剂量＝中风损伤+10,000AST-OPCl细胞被移植到中风病变附近；细胞高剂量＝100,000AST-OPCl细胞被移植到未损伤胼胝体内；细胞低剂量＝10,000AST-OPCl细胞被移植到未损伤胼胝体内。
图27显示了AST-OPC1移植至病变位点附近改善了中风损伤小鼠在圆筒测试(cylinder test)中的表现。示出了各处理组在圆筒测试中随时间变化(中风后)的平均表现(以相对于损伤前基线的运动缺陷示出)。中风后第一周对应AST-OPC1移植前一天。使用双向ANOVA与图基HSD事后分析，星号指示相对于只有中风组的显著性(p<0.05)。中风后四个月后，接受AST-OPC1的所有中风损伤组与只有中风的动物显著不同，表明AST-OPC1处理后改善的表现。处理组标记：对照＝未损伤未移植；中风＝只有中风；中风+内部细胞高剂量＝中风损伤+100,000AST-OPCl细胞被移植到中风病变内；中风+外部细胞高剂量＝中风损伤+100,000AST-OPCl细胞被移植到中风病变附近；中风+外部细胞低剂量＝中风损伤+10,000AST-OPCl细胞被移植到中风病变附近；细胞高剂量＝100,000AST-OPCl细胞被移植到未损伤胼胝体内；细胞低剂量＝10,000AST-OPCl细胞被移植到未损伤胼胝体内。
图28显示了白质中风损伤并AST-OPC1移植后尼氏(Nissl)染色的小鼠脑的代表性显微图像。图像组显示了各处理组病变的(左侧)和未损伤对侧的(右侧)半球中胼胝体和侧脑室的代表性尼式染色。胼胝体中增加的组织保护以及同侧侧脑室扩大的降低在AST-OPC1处理组中明显，最显著地是在将高剂量AST-OPC1给予病变位点附近的中风损伤组中。处理组标记：对照＝未损伤未移植；白质中风＝只有中风；中风+内部细胞高剂量＝中风损伤+100,000AST-OPCl细胞被移植到中风病变内；中风+外部细胞高剂量＝中风损伤+100,000AST-OPCl细胞被移植到中风病变附近；中风+外部细胞低剂量＝中风损伤+10,000AST-OPCl细胞被移植到中风病变附近。
具体实施方式
在描述本组合物和方法之前，应理解，本文所公开的发明不限于所述的具体方法、组合物、或方法论，因为它们可变化。还应理解，本说明中所用的术语仅用于描述具体形式或实施方式，且不意在限定本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限定。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。可采用与本文所述方法和材料类似或等同的任何方法和材料实施或测试本公开的实施方式。
在各种实施方式中，本文所述方法和组合物涉及这样的发现，即脑局部缺血损伤后AST-OPC1移植提高WMS小鼠模型的恢复。直接将AST-OPC1在亚急性时间点(中风后7天)移植到病变核心内或其直接相邻位置产生AST-OPC1在整个皮质下白质广泛的移动，并且导致受损白质内髓鞘形成增加以及反应性星形细胞增生和炎症测量的降低。在病变核心直接相邻位置移植AST-OPC1后白质的MRI成像显示高信号的降低，而高信号是小鼠模型和人WMS中白质受损的特征。行为评估证明了在两项运动功能测试中的改善。这些结果指示AST-OPC1移植促进WMS中的白质修复和恢复。
在各种实施方式中，提供了将AST-OPC1用于诸如白质中风的脑局部缺血损伤治疗中的方法。本文还提供了适合用于白质中风基于细胞的临床治疗的药物组合物和制剂。
本发明细胞的应用
之前已经描述了由人胚胎干细胞生产大量高纯度、表征的少突胶质细胞祖细胞的方法(例如，美国临时专利申请号62/162,739和62/144,921)。由人胚胎干细胞衍生少突胶质细胞祖细胞(OPC)为包括脑局部缺血损伤治疗在内的许多重要的治疗、研究、研发和商业用途提供了可再生且可扩展的OPC来源。人们也认识到，少突胶质细胞祖细胞可以衍生自除了人胚胎干细胞以外的来源。这样的来源包括但不限于成体干细胞、诱导多潜能干细胞IPSC、培养的干细胞系等等。
术语“AST-OPC1”指这样特定的、表征的、体外分化的细胞群，其包含少突胶质细胞祖细胞(OPC)和根据本文所公开的特定分化方案获自未分化的干细胞的其它表征的细胞类型的混合物。
通过免疫细胞化学(ICC)、流式细胞术和定量聚合酶链反应(qPCR)对AST-OPC1的组成分析证明该细胞群主要包括少突胶质细胞表型的神经谱系细胞。其它神经谱系细胞(即星形胶质细胞和神经元)以低频率存在。唯一在细胞群中检测到的非神经细胞是上皮细胞。中胚层、内胚层谱系细胞和uhESCs通常低于试验的定量或检测。
本文所用的术语“少突胶质细胞祖细胞(OPC)”指这样的神经外胚层/神经胶质谱系的细胞，其具有中枢神经细胞中存在的细胞类型的特征，并且能够分化成少突胶质细胞。这些细胞通常表达特征标志物巢蛋白、NG2和PDGR-Rα。.
本文所用的术语“治疗”、“治疗的”、“处理”或“处理的”可以指治疗性处理或预防性或预防措施，其中所述目的是预防或减缓(缓解)不良生理病症、紊乱或疾病，或获得有益或所需的临床结果。在一些实施方式中，该术语可能同时指治疗和预防。为了本公开的目的，有益或所需临床结果可能包括但不限于，缓解症状；减少所述病症、紊乱或疾病的程度；使所述病症、紊乱或疾病的状态稳定(即，不恶化)；使所述病症、紊乱或疾病的发作延迟或减缓进展；减轻所述病症、紊乱或疾病状态；和缓和(部分或总体)，不论是否可检测，或提高或改善所述病症、紊乱或疾病。治疗包括引起临床显著反应。治疗也包括与不接受治疗的预期生存相比延长生存。在某些实施方式中，特别是在脑局部缺血的情况中，治疗可能包括改善或恢复运动控制，改善或恢复语言，改善或恢复平衡，改善认知(例如，通过各种认知功能试验中的任何一种所测量)等。
本文所用的术语“对象”包括但不限于人类，非人灵长类动物和非人脊椎动物，如野生、家养和农场动物，包括任何哺乳动物，如猫、狗、牛、绵羊、猪、马、兔、诸如小鼠和大鼠的啮齿动物。在一些实施方式中，术语“对象”指雄性。在一些实施方式中，术语“对象”指雌性。
AST-OPC1在需要细胞治疗的人类患者或需其他对象中促进髓磷脂修复或髓鞘再生。以下是需要髓磷脂修复或髓鞘再生的病症、疾病和病原的非限制性示例：脑局部缺血，包括白质中风、多发性硬化症、脑白质营养不良、格林-巴利综合征、进行性神经性腓骨肌萎缩症、泰-萨二氏病、尼曼-皮克病、戈谢病、贺勒氏症和导致髓鞘再生缺失的创伤性损伤，如急性脊髓损伤。
除髓磷脂修复或髓鞘再生外，AST-OPC1分泌神经营养因子，例如BDNF，其可直接对局部缺血组织提供修复作用。
OPC以允许其驻留在、移植到和/或移动到预期组织位置的方式给予。将细胞给予对象可以通过任何本领域已知的方法实现。例如，可以通过手术直接给予需要细胞移植的器官或组织。或者，可以使用非侵入性方法将细胞给予对象。非侵入性递送方法的示例包括使用注射器和/或导管和/或套管将细胞递送到需要细胞治疗的器官或组织中。
在某些实施方式中，将OPC给予到梗塞核心内。在某些实施方式中，在梗塞核心直接相邻的位置给予OPC。本文所用的“直接相邻位置”指梗塞核心外区域，其在一些情况中表示部分中风受损的区域；在其它情况中，“直接相邻位置”指梗塞区域外的健康组织。在一些实施方式中，在离梗塞核心0.01mm至10nm的位置给予OPC。在一些实施方式中，在离梗塞核心0.05mm至3nm的位置给予OPC。在一些实施方式中，在离梗塞核心0.1mm至2mm的位置给予OPC。在一些实施方式中，在离梗塞核心0.5mm至1nm的位置给予OPC。在一些实施方式中，在离梗塞核心0.3mm至0.6nm的位置给予OPC。
在某些实施方式中，在亚急性期间给予对象OPC。本文所用的“亚急性”指急性和慢性阶段之间的时间段，在此期间中风损伤的初始损害和细胞死亡已经结束。如本文所用，“早期亚急性”在人对象中指中风后长达一个月的时间段，而“晚期亚急性”指中风后1-3个月的时间段。
在某些实施方式中，可以对接收本发明OPC的对象进行处理以降低移植的细胞的免疫排斥。考虑的方法包括但不限于，给予传统的免疫抑制药物，如他克莫司、环孢菌素A(Dunn等,Drugs 61:1957,2001)，或使用匹配的多潜能干衍生的细胞诱导免疫耐受性(WO02/44343；美国专利号6,280,718；WO 03/050251)。在某些实施方式中，可以使用抗炎剂(如氯泼尼松)和免疫抑制药物的组合。在某些实施方式中，OPC可以药物组合物的形式提供，包括充分灭菌条件下制备的等渗赋形剂用于人给药。
对于药物制剂的一般原则，读者可参考《同种异体干细胞移植(Allogeneic StemCell Transplantation)》,Lazarus和Laughlin编,斯普林格公司(Springer Science+Business Media LLC)2010年；以及《造血干细胞治疗(Hematopoietic Stem CellTherapy)》,E.D.Ball,J.Lister&P.Law,丘吉尔利文斯敦出版社(ChurchillLivingstone),2000年。细胞赋形剂和组合物的任何伴生元素的选择将根据给予所用途径和装置进行调整。所述组合物还可包括或伴有一种或多种有利于富集的靶细胞植入或功能动员的其他成分。合适的成分可以包括支持或促进靶细胞类型粘附或促进移植组织血管化的基质蛋白。
本发明的药物组合物
少突胶质细胞祖细胞可以给予需要治疗的本文的对象。或者，细胞可以给予需要这样以药物组合物治疗的对象，所述药物组合物与合适的载剂混合和/或使用储库式递送系统。
本文所用的术语“药物组合物”指这样的制剂，其包含与诸如生理上合适的载剂和赋形剂的其它组分组合的一种或多种治疗剂。
本文所用的术语“治疗剂”指能够在对象中产生生物效应的本发明的细胞。取决于本发明的实施方式，“治疗剂”可以指本发明的少突胶质细胞祖细胞。此外或另选地，“治疗剂”可以指本发明的少突胶质细胞分泌的一种或多种具有帮助神经修复作用的因子。
本文所用术语“治疗有效量”表示足以产生期望结果的剂量、给药方案或量。
如本文所用，术语“载剂”、“生理上可接受的载剂”和“生物学上可接受的载剂”可以互换使用并且指稀释剂或载剂物质，其在对象中不引起显著的不良反应或刺激，并且基本上不消除治疗剂的生物活性或作用。术语“赋形剂”指添加到药物组合物中以进一步促进治疗剂给予的物质
本发明的组合物可以配制为用于通过注射的胃肠外给药，例如，通过推注注射或连续输注。化合物可通过连续皮下输注给予约15分钟-约24小时。用于注射的制剂可以单位剂型存在，例如装在安瓿或多剂量容器中，其添加有防腐剂。该组合物可以是诸如油性或水性载剂中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，可含有配方试剂，如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
本文所述治疗剂可以水凝胶的成分给予，诸如2014年5月12日提交的美国专利号14/275,795和美国专利号8,324,184和7,928,069中所述的那些。包括诸如聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)、聚-(乙二醇)(PEG)和聚(乙烯基乙醇)(PVA)的合成聚合物和/或诸如胶原、透明质酸(HA)、纤维蛋白、海藻酸盐、琼脂糖和壳聚糖的天然来源的材料的水凝胶是本领域已知的(Peppas等(2006)Advanced Materials 18:1345；Lee等(2001)Chem.Rev.101:1869)。之前已经描述了通过各种化学修饰形成共价交联的水凝胶(Vercruysse等(1997)Bioconjugate Chem.8:686；Prestwich等(1998)J.Controlled Release 53:93；Burdick等(2005)Biomacromolecules 6:386；Gamini等(2002)Biomaterials 23:1161；美国专利号7,928,069；美国专利号7,981,871)。
基于透明质酸(HA)和猪明胶与丙烯酸多缩乙二醇双酯(PEGDA)(商品名)交联的硫醇修饰的衍生物的水凝胶具有独特的化学、生物和物理属性，而这使其适合许多应用，包括细胞培养、药物递送等(Shu等(2004)J of Biomed Mat Res Part A 68:365；Shu等(2002)Biomacromolecules 3:1304；Vanderhooft等(2009)Macromolecular Biosci 9:20)。包括在内的交联的HA水凝胶已经成功用于角膜上皮伤口愈合(Yang等(2010)Veterinary Opthal 13:144)、角膜组织工程(Espandar等(2012)Archives ofOpthamol 130:202)和视网膜修复(Liu等(2013)Tissue Engineering Part A 19:135)的动物模型中。
已经描述了水凝胶用于维持生物活性并缓释生物制剂的临床前应用(Cai等(2005)Biomaterials 26:6054；Zhang(2011)Biomaterials 32:9415；Overman等(2012)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 109:E2230；Garbern等(2011)Biomaterials 32:2407；Koutsopoulos等(2009)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 106:4623)。此外，其在细胞递送中的应用已经被证明能改善细胞活力以及移植后定位(Laflamme等(2007)Nature Biotechnology 25:1015；Zhong等(2010)Neurorehabilitation and Neural Repair 24:636；Compte等(2009)Stem Cells 27:753)。几种不同的水凝胶已经在FDA批准的眼科小分子疗法中用作赋形剂以增加其在眼表的停留时间(Kompella等(2010)Therapeutic Delivery 1:435).
此外，已经报道了在递送治疗性细胞中显示出前景的两种水凝胶制剂(Ballios等(2010)Biomaterials 31:2555；Caicco等(2012)Journal of Biomedical MaterialsResearch Part A 101:1472；Yang等(2010)Veterinary ophthalmology 13:144；Mazumder等(2012)Journal of Biomedical Materials Research Part A 100:1877).
材料和方法
动物对象。所有过程均由通过职业验证的兽医批准并根据美国国家卫生健康指导中心实验室动物的护理和使用指南(National Institute of Health Guide for theCare and Use of Laboratory Animals)进行。NSG小鼠(Shultz等,(2007)Nat RevImmunol.7(20:118；jaxmice.jax.org/nod-scid-gamma)获自杰克逊实验室公司(JacksonLaboratories，缅因州巴港)。所用动物对象饲养在具有12小时光照/黑暗循环的标准条件中并任意提供食物和水。
使用L-Nio诱导局灶性局部缺血病变。使用了之前已经建立的皮质下白质中风小鼠模型(Sozmen等,(2009).Neurosci Methods 180(2):261；Hinman等,(2013)Stroke 44(1):182)，其模拟了在中期至晚期人白质局部缺血或血管性痴呆中所见大白质病变。简言之，为了诱导局灶性局部缺血病变，如图3所示，将N5-(l-亚氨基乙基)-L-鸟氨酸,二氢氯化物(L-Nio，卡巴开公司(Calbiochem))在三个立体定向坐标直接注射到各小鼠脑的胼胝体中。
由hESC分化AST-OPC1。WA01(HI)hESC系在无饲养物条件下扩大。用胶原酶抬起hESC集落，手动刮取，然后将其接种到包含4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(FGF)和20ng/mL表皮生长因子(EGF)的50％hESC生长培养基和50％神经胶质祖细胞培养基(GPM)的超低粘附烧瓶(第0天)中，以刺激拟胚体形成。在第1天，用包含20ng/mL EGF和10μΜ全反式维甲酸(RA)的50％hESC生长培养基/50％GPM替换培养基。在第2-8天，每天用包含20ng/mL EGF和10μΜRA的100％GPM替换培养基。在第9-26天，将拟胚体维持在无RA的GPM/EGF培养基中，并且每隔两天更换培养基。在第28天，将拟胚体铺在基质胶(Matrigel)包覆的烧瓶中，并在GPM/EGF培养基中培养7天，其中培养基每隔2天更换。在第34天，用胰蛋白酶收获细胞，再次铺在基质胶包覆的烧瓶中，并在GPM/EGF培养基中培养额外的7天，其中培养基每隔2天更换。在第41天，用胰蛋白酶收获细胞，经过滤去除残留的细胞聚集物，并冷冻保存在液氮中。
通过流式细胞术分析分化的AST-OPC1。使用标准流式细胞术对分化的AST-OPC1样品表面和细胞内标志物的存在进行分析。对于表面标志物染色，在第41天，用10％热灭活的山羊血清(HI FBS)封闭AST-OPC1样品，然后用一抗和/或同型对照(0.5μg/5xl05细胞，NG2，英杰公司(Invitrogen)#37-2300；小鼠IgG1BD生物科学公司(BD Biosciences)#55412)在2-8℃孵育30分钟，洗涤，然后用二抗(以0.25μg/5xl05细胞的山羊-抗-小鼠-IgGl-A488英杰公司A21121)在2-8℃孵育30分钟。为了排除无法存活的细胞，在采集细胞前，向染色的样品添加碘化丙啶(1μg/mL，西格玛公司(Sigma)P4864)。然后采集所有样品，并使用Cellquest Pro软件在BD生物科学公司的FACSCaliburTM流式细胞仪系统上分析数据。
对于细胞内标志物染色，在第41天，用叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide)(西格玛公司E2028，5μg/mL)标记AST-OPC1样品以区分死亡细胞，然后用2％多聚甲醛(PFA)固定，然后用90％冷甲醇透化。用5％HI FBS(针对Oct4)或10％热灭活的山羊血清(针对巢蛋白)封闭细胞，然后用一抗和/或同型对照(山羊抗-Oct4圣克鲁兹公司(Santa Cruz)SC8629，以0.15-0.5μg/5xl05细胞的常规山羊IgG SC2028；巢蛋白Nestin Millipore MAB5326；以0.5μg/5xl05细胞的MoIgGl BD生物技术公司554121)在2-8℃孵育30分钟，用染色缓冲液洗涤，并用二抗(以0.25μg/5xl05细胞的驴-抗-山羊-IgG-A488英杰公司A11055或山羊-抗-小鼠-IgGl-A488英杰公司A21121)在2-8℃孵育30分钟。然后采集所有样品，使用Cellquest Pro软件在BD生物科学公司的FACSCaliburTM流式细胞仪系统上分析数据。
移植AST-OPC1到NSG小鼠中。AST-OPC-1细胞来自Asterias生物治疗有限公司(Asterias Biotheraputics,Inc)，以干冰接收，并遵循“AST-OPC1剂量制备方法”(AST-GEN-0021版本0.2)方案。五组不同的动物接受AST-OPC1。细胞在中风后第七天立体定位移植。监测小鼠体温，并使用直肠探针和加热垫稳定在36.5-37.5℃。汉密尔顿注射器内填充了AST-OPC1，固定在立体定位臂上，并连接压力泵。以36°的角度在表1所示坐标切开并给予两次细胞注射。最高剂量组在1μL中接收到总计约100,000个细胞。在第一注射后将针头留在原位2分钟，而第二次注射后将针头留在原位4分钟。
表1.AST-OPC1移植坐标。AP＝前-后；ML＝内-外；DV＝背-腹
处理组 AP ML DV
中风+梗塞内高剂量细胞 +0.14 +3 -1.32
中风+梗塞内低剂量细胞 +0.14 +3 -1.32
中风+梗塞外低剂量细胞 +0.14 +2 -1.4
仅有高剂量细胞 +0.14 +3 -1.32
仅有低剂量细胞 +0.14 +3 -1.32
用于免疫荧光的脑组织处理。术后生存期后(15天)，向各小鼠施用过量的异氟烷，并用0.1M磷酸盐缓冲盐溶液然后用4％多聚甲醛经心脏灌注。移除脑，在4％多聚甲醛中过夜固定后，在30％蔗糖中低温保护2天。其后，将脑移出并冷冻。使用低温恒温器将脑组织每隔200μm切成40μm的切片。
针对人核抗原(HuNu)、小神经胶质/巨噬细胞标志物IBA-1、神经元标志物NF200、星形胶质细胞标志物GFAP、全-少突胶质细胞标志物Olig2、成熟少突胶质细胞标志物MBP和未成熟标志物DCx的免疫染色是如此实现的：室温下，在5％常规驴血清中进行1小时封闭，以4摄氏度在一抗中孵育过夜，以室温在二抗中孵育1小时，将切片固定在替代(subbed)载玻片上并风干。然后以递增浓度的乙醇和二甲苯对固定的切片进行脱水，并用DPX覆盖。一抗是：小鼠抗-HuNu(1:150，密理博公司)、兔抗-Iba-1(1:500,和光化学公司(WakoChemicals))、兔抗-NF200(1:500，西格玛公司)、大鼠抗髓磷脂碱性蛋白(MBP,1:500，密理博公司)、兔抗-Olig2(1:500，密理博公司)、大鼠抗-GFAP(1:500，密理博公司)、山羊抗双皮质素(1:500，圣克鲁兹生物技术公司)和小鼠单克隆-hNuc(1:100，密理博公司)。所有的二抗都是与Cy2(蓝绿色)或Cy3(黄色)(杰克森免疫研究公司(Jackson Immunoresearch))染料偶联的驴F(ab')2片段，并且以1:1000的稀释度使用。
获得Z-堆栈中高分辨共焦图像(尼康C2共聚焦系统)。使用光学分馏仪探针和神经解剖定量软件(Stereoinvestigator，MBF生物科技公司(MBF Bioscience))对梗塞核心、IBA-1、GFAP、HuNu、DCX和01ig2阳性细胞的面积测量值进行立体定量。用强度分布(ImageJ,NIH)对用NF200和MBP染色的白质轴突投射进行定量。
尼氏染色。尼式染色用于组织学检查和神经元损失测量。具有40μm脑切片的载玻片在梯度的乙醇(50％、70％、95％和100％)中脱水、在50％乙醇-50％氯仿中洗涤1小时，在梯度的乙醇(100％、95％、70％、50％)中复水。用甲酚紫溶液对切片进行45秒染色，用蒸馏水漂洗，在包含几滴冰醋酸的70％乙醇中洗涤，然后在梯度的乙醇(70％、95％和100％)中脱水，置于二甲苯中，并使用封片剂盖上。染色的切片在莱卡DM LB荧光显微镜上观察。
核磁共振成像(MRI)。麻醉小鼠并置于Bruker 7T小型动物MRI(瑞士BrukerBioSpin公司)上，在中风后第0天、第7天和第6个月进行MRI成像。在整个过程中监测呼吸频率，并且将体温保持在37±0.5℃采集T2-加权图像集合：快速获取松弛增强因子8，重复时间5300ms，回波时间15.00ms，平面分辨率为0.0156_0.0156_0.50mm，具有13个连续切片。
纤维跟踪成像。纤维跟踪成像，使用下述参数的自旋回波单次发射回波平面成像(EPI)脉冲序列在治疗后第0天、第7天和第6个月采集扩散张量数据(DTI)：TR/TE:5000/35ms；10的信号平均值，30非共线扩散梯度方案，其具有b＝1000s/mm2和b＝0s/mm2的扩散权重，以及3.5x 3.5cm的视野。使用具有单词发射EPI序列的30个方向在96x 96基质上采集数据，并且用零填充的k-空间以构建128x128成像基质。用medInria获得图像，其是一个多平台医疗成像处理和可视化软件。使用每周n＝6只动物在病变区域进行DT1纤维跟踪成像数据。使用Para View 4.1.0图像表示缩放的病变位点DTI纤维跟踪成像的3D视图。
实施例
以下实施例并不旨在限制本发明发明人关于其发明的范围，也不旨在表示下述试验是所有或仅进行的试验。
实施例1：AST-OPC1的衍生和表征
AST-OPC 1(之前称之为GRNOPC 1)通常是通过来自主细胞库(MCB)的WA01(HI)hESC分化生成，如在材料和方法部分所述。产生AST-OPC1的分化过程需要41天，并且将hESC从未分化的细胞集落经拟胚体转变成贴壁的、分散的细胞群，将其收集并冷冻保存。
之前已经描述了通过流式细胞术和免疫细胞化学(ICC)对41天分化的AST-OPC1的分析(美国临时专利申请号62/162,739和62/144,921)。ICC和流式细胞术结果表明细胞群主要包括早期少突胶质细胞祖细胞表型的神经谱系细胞。通过流式细胞术，超过90％的细胞对巢蛋白呈阳性，并且>50％的的细胞对NG2呈阳性，NG2是由少突胶质细胞祖细胞表达的神经/胶质蛋白聚糖。此外，多潜能干细胞标志物Oct4的水平低于定量水平(<0.2％)，这表明缺乏残留的hESC。使用另一种高含量图像分析试验，我们进一步确定了AST-OPC1中Oct4+细胞的频率小于0.05％。使用该定义的AST-OPC1分化过程，我们生产了超过75批次的AST-OPC1，在第41天我们通过ICC进一步对多种这样的标志物的存在进行表征以评估群体的组成并检测潜在的不需要的细胞类型，所述标志物是外胚层、中胚层、内胚层和多潜能细胞类型的标记物。与流式细胞术结果一致，ICC概况指示了这样的细胞群，其主要由早期少突胶质细胞祖细胞组成，具有很少成熟的神经元或星形胶质细胞。内胚层、中胚层或多潜能细胞类型的存在是不可检测的，对于分化的AST-OPC1细胞群<1％。
实施例2：研究1－白质中风的NSG小鼠模型中AST-OPC1移植为了允许全面研究AST-OPC 1异种移植物，之前建立的模拟了在中期至晚期人白质局部缺血或血管性痴呆中所见大白质病变的皮质下白质中风小鼠模型(Sozmen et al.,(2009)J.Neurosci Methods180(2):261；Hinman et al.,(2013)Stroke 44(1):182)被调整为免疫缺陷NSG小鼠(Shultz等,(2007)Nat Rev Immunol.7(20:118；jaxmice.jax.org/nod-scid-gamma)。简言之，为了诱导局灶性局部缺血病变，如图3所示，将N5-(l-亚氨基乙基)-L-鸟氨酸,二氢氯化物(L-Nio，卡巴开公司(Calbiochem))在三个立体定向坐标直接注射到各小鼠脑的胼胝体中。该实验时间轴示于图2。该研究目的和参数详述于表2。在中风诱导后15天(即，AST-OPC1或假注射两周后)处理脑组织，并进行荧光免疫染色以确定髓鞘形成、轴突损失、星形胶质细胞活化、微神经胶质/巨噬细胞反应和少突胶质细胞反应。代表性结果述于图1-24中。
表2
实施例3：研究2－AST-OPC1针对行为恢复的功效研究
将实施例2中所述WMS的NSG小鼠模型用于评估AST-OPC1移植对行为恢复的作用以及根据MRI和离体组织化学染色来评估AST-OPC1移植是否改善白质保留。该实验时间轴示于图25。该研究目的和参数详述于表3。行为测试(圆筒测试和网格行走)在下文中详述。代表性结果述于图26-28中。
表3
圆筒测试。小鼠的探查行为对研究空间和运动行为的神经基础提供了可能性，其可以被用于脑功能的测试。圆筒测试提供了评估啮齿类动物自发前肢使用的方法，并且已经被用于中风的许多运动系统损伤模型中。为了评估前肢缺陷，将动物安置在透明树脂玻璃圆筒中并观察。小鼠将通过竖起其后肢并用前肢和触须探查表面来积极探索垂直表面。当评价圆筒中的行为时，记录同时观察到的针对右前肢，左前肢和两个前肢的独立壁位置的数量。在垂直探索期间，单侧脑受损的动物将会在前肢使用中表现出不对称性。
已经发现圆筒测试是客观的，易于使用和评分的，对其它无法检测的慢性缺陷敏感的，且具有较高评分者之间的可靠性。
网格行走测试。网格行走测试常被称作步伐错误测试，是评价啮齿动物肢体运动过程中对肢体功能(最常见的是后肢，但是也对前肢进行评估)或放置缺陷的相对简单的方法。已经发现该测试客观地显示了中风后运动协调缺陷和康复效应。将动物置于具有开口的抬高的、平坦的网格上。无脑损伤的动物通常将其爪子精确地放在线框上，以在沿着网格移动时保持自己。每当爪子滑过开口网格时记录“步伐错误”。将各肢体对侧和同侧错误的数量与所走总步数比较，然后使用脚步错误指数进行评分。完整的动物通常表现出很少或没有步伐错误，并且当错误出现时候，其是对称的。局部缺血动物通常比完整的动物产生显著更多的对侧步伐错误。已经证明步伐错误测试是检测啮齿动物局部缺血后感觉运动功能受损的灵敏指标。

Claims (39)

1.一种改善脑局部缺血损伤后对象恢复的方法，所述方法包括在所述对象脑中梗塞核心内或其直接相邻位置给予治疗有效量的干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述脑局部缺血损伤是皮质下白质中风。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所述对象是人。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在所述梗塞核心直接相邻位置给予人干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在所述梗塞核心内给予人干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，在所述局部缺血损伤后的亚急性期间给予人干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，使用储库式递送系统给予人干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述储库式递送系统包括水凝胶。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述水凝胶包括硫醇化透明质酸盐。
10.如权利要求8-9中任一项所述的方法，其中，所述水凝胶包括硫醇化明胶。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中，所述水凝胶包括交联剂。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述祖细胞衍生自成体干细胞。
13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述祖细胞衍生自诱导的多潜能干细胞(IPSC)。
14.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述祖细胞衍生自不是获得自胚胎或胎儿组织的干细胞。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述脑局部缺血损伤是由于中风。
16.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述脑局部缺血损伤是由于头部损伤。
17.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述脑局部缺血损伤是由于呼吸衰竭。
18.一种用于改善脑局部缺血损伤后对象运动或认知功能的方法，所述方法包括在所述对象脑中梗塞核心内或其直接相邻位置给予治疗有效量的干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述脑局部缺血损伤是皮质下白质中风。
20.如权利要求18-19中任一项所述的方法，其中，所述对象是人。
21.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中，在所述梗塞核心直接相邻位置给予所述干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。
22.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中，在所述梗塞核心内给予所述干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。
23.如权利要求18-22中任一项所述的方法，其中，在所述局部缺血损伤后的亚急性期间给予所述干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。
24.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中，所述祖细胞衍生自成体干细胞。
25.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中，所述祖细胞衍生自诱导的多潜能干细胞(IPSC)。
26.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中，所述祖细胞衍生自不是获得自胚胎或胎儿组织的干细胞。
27.如权利要求18-26中任一项所述的方法，其中，所述脑局部缺血损伤是由于中风。
28.如权利要求18-26中任一项所述的方法，其中，所述脑局部缺血损伤是由于头部损伤。
29.如权利要求18-26中任一项所述的方法，其中，所述脑局部缺血损伤是由于呼吸衰竭。
30.一种用于治疗皮质下白质中风的药物组合物，所述药物组合物包括人干细胞衍生的少突胶质细胞祖细胞。
31.如权利要求30所述的药物组合物，其还包含储库式递送系统。
32.如权利要求31所述的药物组合物，其中，所述储库式递送系统包括水凝胶。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其中，所述水凝胶包括透明质酸和/或明胶。
34.如权利要求32-33中任一项所述的药物组合物，其中所述水凝胶包括硫醇化透明质酸盐。
35.如权利要求32-34中任一项所述的药物组合物，其中所述水凝胶包括硫醇化明胶。
36.如权利要求32-35中任一项所述的药物组合物，其中，所述水凝胶包括交联剂。
37.如权利要求30-36中任一项所述的药物组合物，其中，所述祖细胞衍生自成体干细胞。
38.如权利要求30-37中任一项所述的药物组合物，其中，所述祖细胞衍生自诱导的多潜能干细胞(IPSC)。
39.如权利要求30-38中任一项所述的药物组合物，其中，所述祖细胞衍生自不是获得自胚胎或胎儿组织的干细胞。
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