KR20220068222A - Cd24 발현 세포 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20220068222A
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존야 슈레퍼
스티브 하어
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사나 바이오테크놀로지, 인크.
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Abstract

CD24를 발현하는 세포를 포함하는 세포 및 이들의 사용 및 생성의 관련 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 세포는 하나 이상의 MHC I 및/또는 MHC II 인간 백혈구 항원을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 저면역원성이다.

Description

CD24 발현 세포 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 8월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/891,180호에 대해 우선권을 주장하고, 이의 개시는 그 전문이 본원에 포함된다.
암 및 퇴행성 질환은 인간 건강에 불균형적으로 위협을 가하게 된다. 종종 연령과 관련된, 이러한 질환은 병에 걸린 조직 및 기관의 점진적인 악화, 그리고 궁극적으로 병에 걸린 대상체의 장애 및 사망을 초래한다. 재생 의학의 가능성은 병에 걸리거나 결손된 세포를 새로운 건강한 세포로 대체하는 것이다. 지난 5년 동안, 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)를 사용하여 환자에 이식하기 위한 임의의 성체 세포 유형을 생성하는 재생 의학의 새로운 패러다임이 등장하였다. 원칙적으로, hPSC-기반 세포 요법은 모든 퇴행성 질환은 아닐지라도 대부분을 치료할 수 있는 잠재력을 가지고 있지만, 이러한 요법의 성공은 대상체의 면역 반응에 의해 제한될 수 있다.
면역 거부반응을 극복하기 위해 고려된 전략에는 HLA-매칭 (예를 들어, 일란성 쌍둥이 또는 제대 은행), 대상체에 대한 면역억제제의 투여, 항체 차단, 골수 억제/혼합 키메리즘, HLA-매칭 줄기 세포 저장소, 및 자가 줄기 세포 요법이 포함된다.
세포 대체 요법과 관련된 면역 거부반응을 극복하기 위한 신규한 접근법, 조성물 및 방법에 대한 요구가 여전히 남아있다.
일 측면에서, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현 및 세포에서 CD24의 발현을 증가시키는 변형을 포함하는 단리된 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 CIITA 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 CIITA 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 세포에서 CD47, DUX4, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4, C1-억제제, IL-10, IL-35, FASL, CCL21, Mfge8, 및 Serpinb9로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 발현을 증가시키는 변형을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 세포에서 CD47의 발현을 증가시키는 변형을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 B2M 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 B2M 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 NLRC5 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 CIITA 유전자를 표적화하는 유전적 변형은 CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 B2M 유전자를 표적화하는 유전자 변형은 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전적 변형은 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 CD24의 발현을 증가시키는 변형은 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 구현예에서, 상기 CD47, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 발현을 증가시키는 변형은 CD47, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD47의 발현을 증가시키는 변형은 CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 임의의 폴리펩티드의 발현을 증가시키기 위한 발현 벡터는 유도성 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 상기 CD24의 발현을 증가시키는 변형은 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 세포의 선택된 유전자좌로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 구현예에서, 상기 CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 변형은 CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 세포의 선택된 유전자좌로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD47의 발현을 증가시키는 변형은 CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 세포의 선택된 유전자좌로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 선택된 유전자좌 및/또는 CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 선택된 유전자좌는 세이프 하버 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 상기 세이프 하버는 AAVS1 유전자좌, CCR5 유전자좌, CLYBL 유전자좌, ROSA26 유전자좌, 및 SHS231 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 유도성 자살 스위치를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 세포는 줄기 세포, 분화된 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 전구 세포, 체세포, 1차 T 세포 및 키메라 항원 수용체 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, CD24 (예를 들어, CD24 폴리펩티드)를 포함하는 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입함으로써, CD24를 포함하는 세포를 생산하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 구현예에서, 상기 CD24를 포함하는 세포는 CIITA 유전자를 표적화하기 위한 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 포함하는 CIITA 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유전적 변형은 CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터는 유도성 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 상기 CD24를 포함하는 세포는 CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 벡터를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제2 발현 벡터는 CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제2 발현 벡터는 유도성 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 제2 발현 벡터는 바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 상기 CD24를 포함하는 세포는 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 포함하는 B2M 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 더 포함한다. 일부 경우에, 유전적 변형은 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 CD24를 포함하는 세포는 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 포함하는 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 더 포함한다. 일부 경우에, 상기 유전적 변형은 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 세포는 줄기 세포, 분화된 세포, 배아 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 전구 세포, 체세포, 1차 T 세포 및 키메라 항원 수용체 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 줄기 세포의 선택된 유전자좌로 도입함으로써, 저면역원성 줄기 세포를 생산하는 것을 포함하는 저면역원성 줄기 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90% 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 구현예에서, CIITA 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 줄기 세포로 도입하는 것을 포함하는, 줄기 세포에서 CIITA 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 생성하는 것을 더 포함하고, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 도입은 CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산을 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 선택된 유전자좌는 세이프 하버 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 세이프 하버 유전자좌는 AAVS1 유전자좌, CCR5 유전자좌, CLYBL 유전자좌, ROSA26 유전자좌, 및 SHS231 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 저면역원성 줄기 세포를 제조하는 방법은 CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 줄기 세포의 선택된 유전자좌로 도입하는 것을 더 포함한다. 특정 구현예에서, CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 줄기 세포의 선택된 유전자좌로 도입하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선택된 유전자좌는 세이프 하버 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 상기 세이프 하버 유전자좌는 AAVS1 유전자좌, CCR5 유전자좌, CLYBL 유전자좌, ROSA26 유전자좌, 및 SHS231 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 저면역원성 줄기 세포를 제조하는 방법은 B2M 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 줄기 세포로 도입하는 것을 포함하는, 줄기 세포에서 B2M 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 생성하는 것을 더 포함하고, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 도입은 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산을 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 저면역원성 줄기 세포를 제조하는 방법은 NLRC5 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 줄기 세포로 도입하는 것을 포함하는, 줄기 세포에서 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 생성하는 것을 더 포함하고, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 도입은 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산을 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 저면역원성 줄기 세포를 제조하는 방법은 유도성 자살 스위치를 포함하는 발현 벡터를 줄기 세포로 도입하는 것을 더 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 제조된 저면역원성 줄기 세포를 분화 조건하에서 배양함으로써, 분화된 저면역원성 세포를 제조하는 것을 포함하는 분화된 저면역원성 세포를 제조하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 분화 조건은 줄기 세포를 심장 세포, 신경 세포, 내피 세포, T 세포, 췌장 섬 세포, 망막 색소 상피 세포, 신장 세포, 간 세포, 갑상선 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 및 상피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 유형으로 분화시키기에 적합하다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 분화된 저면역원성 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
CD24를 발현하고, MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CD24를 발현하고, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CIITA를 발현하지 않고, CD24를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
B2M을 발현하지 않고, CD24를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
NLRC5를 발현하지 않고, CD24를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CD24 및, CD47, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CD24 및 CD47을 발현하고, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CIITA를 발현하지 않고, CD24, 및 CD47, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 발현하고, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CIITA를 발현하지 않고, CD24 및 CD47을 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CIITA 및 B2M을 발현하지 않고, CD24를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CIITA 및 B2M을 발현하지 않고, CD24, 및 CD47, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CIITA 및 B2M을 발현하지 않고, CD24 및 CD47을 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CIITA 및 NLRC5를 발현하지 않고, CD24를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CIITA 및 NLRC5를 발현하지 않고, CD24, 및 CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CIITA 및 NLRC5를 발현하지 않고, CD24 및 CD47을 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CIITA, B2M 및 NLRC5를 발현하지 않고, CD24, 및 CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
CIITA, B2M 및 NLRC5를 발현하지 않고, CD24 및 CD47을 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 세포 중 임의의 하나는 줄기 세포, 분화된 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 전구 세포, 체세포, 1차 T 세포 및 키메라 항원 수용체 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 분화 조건하에서 배양하여 심장 세포, 신경 세포, 내피 세포, T 세포, 췌장 섬 세포, 망막 색소 상피 (RPE) 세포, 신장 세포, 간 세포, 갑상선 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 및 상피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 분화된 세포를 생성함으로써, 본원에 개시된 만능 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포가 본원에 제공된다.
본 개시의 일 측면에서, 외인성 CD24 폴리펩티드를 포함하는 단리된 줄기 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% (예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상) 서열 동일성을 갖는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드) 서열을 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90% (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상) 서열 동일성을 갖는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현한다.
일부 구현예에서, 상기 단리된 세포는 MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 MHC II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 상기 세포는 MHC 클래스 I 및 MHC II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 CIITA의 감소된 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 B2M의 감소된 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 NLRC5의 감소된 발현을 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 단리된 세포는 CIITA의 발현을 감소시키는 CIITA를 표적화하는 게놈 변형을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 게놈 변형은 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 CIITA를 표적화하는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 상기 세포는 CIITA를 표적화하는 Cas 단백질에 의해 인식되는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CIITA를 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041호의 서열번호 5184 내지 36352로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 목록을 포함하는 개시는 그 전체가 참조로 포함된다.
다른 구현예에서, 상기 단리된 세포는 B2M의 발현을 감소시키는 B2M을 표적화하는 게놈 변형을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 게놈 변형은 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 B2M을 표적화하는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 상기 세포는 B2M을 표적화하는 Cas 단백질에 의해 인식되는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 B2M을 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041호의 서열번호 81240 내지 85644로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 목록을 포함하는 개시는 그 전체가 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 단리된 세포는 NLRC5의 발현을 감소시키는 NLRC5를 표적화하는 게놈 변형을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 게놈 변형은 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 NLRC5를 표적화하는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 상기 세포는 NLRC5를 표적화하는 Cas 단백질에 의해 인식되는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 NLRC5를 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041호의 서열번호 36353 내지 81239로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 목록을 포함하는 개시는 그 전체가 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 단리된 세포는 CIITA의 발현을 감소시키는 유전자 발현 변형을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 B2M의 발현을 감소시키는 유전자 발현 변형을 더 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 NLRC5의 발현을 감소시키는 유전자 발현 변형을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 발현 변형은 siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 안티센스 RNA, 및 기타 RNA-매개 억제 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 단리된 세포는 HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 외인성 면역조절 인자를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 면역조절 인자를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개괄된 상기 단리된 세포는 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 및 성체 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 분화 조건하에서 본원에 기재된 임의의 줄기 세포로부터 생성된 단리된 세포가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 저면역원성, 예를 들어, 투여 시 환자에 대해 저면역원성인 단리된 세포가 본원에 제공된다.
일 측면에서, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% (예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상) 서열 동일성을 갖는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 도입하는 것을 포함하는, 외인성 CD24 폴리펩티드를 포함하는 줄기 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 CD24 폴리펩티드 서열은 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90% (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상) 서열 동일성을 갖는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 도입하는 것을 포함하는, 외인성 CD24 폴리펩티드를 포함하는 줄기 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 CD24 폴리펩티드 서열은 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 외인성 CD24 폴리펩티드의 발현 벡터는 유도성 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 상기 발현 벡터는 세이프 하버 유전자좌를 특이적으로 표적화한다. 특정 구현예에서, 상기 세이프 하버 유전자좌는 AAVS1 유전자좌이다.
일부 구현예에서, 상기 줄기 세포를 제조하는 방법은 CIITA 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포로 도입하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 상기 방법은 또한 CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 도입하는 것을 포함하고, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041호의 서열번호 5184 내지 36352로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 목록을 포함하는 개시는 그 전체가 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 B2M 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포로 도입하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 상기 방법은 또한 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 도입하는 것을 포함하고, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041호의 서열번호 81240 내지 85644로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 목록을 포함하는 개시는 그 전체가 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 NLRC5 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포로 도입하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 상기 방법은 또한 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 도입하는 것을 포함하고, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041호의 서열번호 36353 내지 81239로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 목록을 포함하는 개시는 그 전체가 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 CIITA의 발현을 감소시키는 유전자 발현 변형 분자를 세포로 도입하는 것을 더 포함하고, 상기 유전자 발현 변형 분자는 CIITA를 특이적으로 표적화하는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 안티센스 RNA, 및 기타 RNA-매개 억제 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 B2M의 발현을 감소시키는 유전자 발현 변형 분자를 세포로 도입하는 것을 더 포함하고, 상기 유전자 발현 변형 분자는 B2M을 특이적으로 표적화하는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 안티센스 RNA, 및 기타 RNA-매개 억제 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 NLRC5의 발현을 감소시키는 유전자 발현 변형 분자를 세포로 도입하는 것을 더 포함하고, 상기 유전자 발현 변형 분자는 NLRC5를 특이적으로 표적화하는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 안티센스 RNA, 및 기타 RNA-매개 억제 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역관용 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 도입하는 것을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 적어도 2개의 발현 벡터를 도입하는 것을 더 포함하고, 상기 제1 발현 벡터는 HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 제1 면역관용 폴리펩티드를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 제2 발현 벡터는 HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 면역관용 폴리펩티드를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 상기 발현 벡터, 제1 발현 벡터, 및/또는 제2 발현 벡터는 유도성 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 상기 발현 벡터, 제1 발현 벡터, 및/또는 제2 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 상기 발현 벡터, 제1 발현 벡터, 및/또는 제2 발현 벡터는 세이프 하버 유전자좌를 특이적으로 표적화한다. 일부 경우에, 상기 세이프 하버 유전자좌는 AAVS1 유전자좌이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 유도성 자살 스위치를 포함하는 발현 벡터를 줄기 세포로 도입하는 것을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 줄기 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 및 성체 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 줄기 세포는 비변형 줄기 세포에 비해 MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 줄기 세포는 비변형 줄기 세포에 비해 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 줄기 세포는 비변형 줄기 세포에 비해 MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 줄기 세포 중 임의의 하나 또는 본원에 개괄된 방법에 따라 제조된 줄기 세포 중 임의의 하나를 분화 조건하에서 배양함으로써, 분화된 세포를 제조하는 것을 포함하는 분화된 세포를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 분화 조건은 줄기 세포를 심장 세포, 간 세포, 신장 세포, 췌장 세포, 신경 세포, 면역 세포, 중간엽 세포, 및 내피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 유형으로 분화시키기에 적합하다.
또 다른 측면에서, 세포 기반 요법, 예컨대, 세포 대체 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공되나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법은 본원에 개괄된 임의의 방법에 따라 제조된 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함한다.
외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포가 본원에 제공된다.
외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 CIITA를 발현하는 줄기 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 B2M을 발현하는 줄기 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 NLRC5를 발현하는 줄기 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 CIITA, B2M, NLRC5, 및 이들의 조합을 발현하는 줄기 세포가 본원에 제공된다.
외인성 CD24 폴리펩티드, 및 HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자를 발현하는 줄기 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 CIITA를 발현하는 줄기 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 B2M을 발현하는 줄기 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 NLRC5를 발현하는 줄기 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 CIITA, B2M, NLRC5, 및 이들의 조합을 발현하는 줄기 세포가 본원에 제공된다.
외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포가 본원에 제공된다.
외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 CIITA를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 B2M을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 NLRC5를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 CIITA, B2M, NLRC5, 및 이들의 조합을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포가 본원에 제공된다.
외인성 CD24 폴리펩티드, 및 HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 CIITA를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 B2M을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 NLRC5를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포가 본원에 제공된다. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 CIITA, B2M, NLRC5, 및 이들의 조합을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 줄기 세포는 저면역원성, 예를 들어, 투여 시 환자에 대해 저면역원성이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 분화된 세포는 저면역원성, 예를 들어, 투여 시 환자에 대해 저면역원성이다.
일부 구현예에서, 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포를 포함하는 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법 (일부 경우에, 세포 대체 요법)을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포를 포함하는 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법 (일부 경우에, 세포 대체 요법)을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포를 포함하는 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 CIITA를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포를 포함하는 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법 (일부 경우에, 세포 대체 요법)을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 B2M을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포를 포함하는 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 NLRC5를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포를 포함하는 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 CIITA, B2M, NLRC5, 및 이들의 조합을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포를 포함하는 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 외인성 CD24 폴리펩티드, 및 HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포를 포함하는 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법 (일부 경우에, 세포 대체 요법)을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 CIITA를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포를 포함하는 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 B2M을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포를 포함하는 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 NLRC5를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포를 포함하는 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 CIITA, B2M, NLRC5, 및 이들의 조합을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포를 포함하는 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
저면역원성 세포, 이의 생산 방법 및 이의 사용 방법에 대한 상세한 설명은 2015년 5월 9일자로 출원된 WO2016183041호, 2018년 1월 14일자로 출원된 WO2018132783호, 및 2018년 3월 20일자로 출원된 WO2018175390호에서 확인할 수 있으며, 서열 목록 및 도면을 포함하는 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 다른 목적, 이점 및 구현예는 하기의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
도 1a 내지 도 1h는 서열번호 1 내지 33에 도시된 바와 같은 DUX4 폴리뉴클레오티드 및 DUX4, CD47, 및 CD24 폴리펩티드의 서열을 도시한다.
I. 개요
게놈 편집 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 생성에 뒤이어 상기 iPSC의 분화는 만능성, 후성적 상태, 분화 능력, 및 게놈 안정성과 관련하여, 비용이 많이 들고, 시간이 많이 걸리며 매우 가변적인 과정으로 남아 있다. 또한, 게놈 편집 및 장기간 배양 중에 발생하는 변화는 적응 면역 반응을 유발하여 자가 줄기 세포-유래 이식 또는 이식편에도 면역 거부반응을 초래하는 것으로 확인되었다. 줄기 세포-유래 이식에 대한 대상체의 면역 거부반응의 문제를 극복하기 위해, 본 발명자들은 이식가능한 세포 유형에 대한 생존가능한 공급원을 나타내는 저면역원성 세포 (예를 들어, 저면역원성 만능 세포, 저면역원성 분화된 세포, 저면역원성 1차 T 세포 등)를 개발하고 본원에 개시하였다. 상기 CD24 발현 세포는 수용자 대상체에게 투여 시 적응 및 선천 면역 거부반응으로부터 보호된다. 유리하게는, 본원에 개시된 세포는 대상체의 유전적 구성에 관계없이 수용자 대상체의 면역 체계에 의해 거부되지 않는다. 상기 세포는 수용자 대상체에게 투여 시 적응 및 선천 면역 거부반응으로부터 보호된다.
일부 구현예에서, 본원에 개괄된 CD24를 발현하는 저면역원성 세포는 선천 면역 세포 거부반응의 대상이 되지 않는다. 일부 경우에, 저면역원성 세포는 NK 세포-매개 용해에 민감하지 않다. 일부 경우에, 저면역원성 세포는 대식세포 포식(engulfment)에 민감하지 않다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 면역억제제가 거의 또는 전혀 필요하지 않은 수용자 대상체에게 이식되는 보편적으로 호환가능한 세포 또는 조직 (예를 들어, 보편적인 공여자 세포 또는 조직)의 공급원으로 유용하다. 상기 저면역원성 세포는 이식 시 세포-특이적 특성 및 특징을 유지한다.
일부 구현예에서, MHC-불일치 동종이형 수용자에서 면역 거부반응을 회피하는 줄기 세포 또는 이의 분화된 유도체가 본원에 제공된다. 일부 경우에, 본원에 개괄된 줄기 세포로부터 생산된 분화된 세포는 MHC-불일치 동종이형 수용자에게 투여 (예를 들어, 이식(transplanted) 또는 이식(grafted))될 때 면역 거부반응을 회피한다. 즉, 줄기 세포 및 상기 줄기 세포 (이의 자손 포함)로부터 유래된 분화된 세포는 저면역원성이다. 일부 구현예에서, 본원에 개괄된 저면역원성 줄기 세포는 야생형 줄기 세포에 비해 감소된 면역원성 (예컨대, 적어도 2.5%-99% 더 적은 면역원성)을 갖는다. 일부 경우에, 상기 저면역원성 줄기 세포는 야생형 줄기 세포에 비해 면역원성이 결여되어 있다. 상기 줄기 세포 또는 이의 분화된 유도체는 수용자 환자로 이식 또는 생착하기 위한 보편적인 공여자 세포로서 적합하다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 환자에 대해 비면역원성이다. 일부 구현예에서, 감소된 면역원성을 갖는 줄기 세포가 본원에 제공된다. 상기 줄기 세포는 만능 줄기 세포 잠재력 및 분화 능력을 유지한다.
제공된 방법은 세포, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 만능 줄기 세포에서 MHC 클래스 I 발현 및/또는 MHC 클래스 II 발현의 불활성화 또는 제거에 유용하다. 일부 구현예에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제 (예를 들어, CRISPR/Cas, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 엔도뉴클레아제 시스템)를 활용하는 게놈 편집 기술은 또한 인간 줄기 세포에서 중요한 면역 유전자의 발현을 (예를 들어, 중요한 면역 유전자의 게놈 DNA를 결실시킴에 의해) 감소시키거나 제거하기 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 게놈 편집 기술 또는 기타 유전자 조절 기술은 인간 세포에 관용-유도 인자를 삽입하여 저면역원성 세포 및 이로부터 제조된 분화된 세포를 제공하는 데 사용된다. 이와 같이, 저면역원성 세포는 MHC I 및 MHC II 발현의 감소된 또는 제거된 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 수용자 대상체에서 비면역원성 (예를 들어, 면역 반응을 유도하지 않음)이다.
게놈 편집 기술은 원하는 유전자좌 부위에서 이중-가닥 DNA 파손을 가능하게 한다. 상기 제어된 이중-가닥 파손은 특정 유전자좌 부위에서 상동 재조합을 촉진한다. 이 과정은 서열을 인식하고 이에 결합하며, 핵산 분자에서 이중-가닥 파손을 유도하는 엔도뉴클레아제를 사용하여, 핵산 분자, 예컨대 염색체의 특정 서열을 표적화하는 데 중점을 맞춘다. 상기 이중-가닥 파손은 오류 발생이 쉬운(error-prone) 비-상동 말단-연결 (NHEJ)에 의해 또는 상동 재조합 (HR)에 의해 복구된다.
특정 구체예의 실시는 특별히 달리 명시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 화학, 생화학, 유기 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 유전학, 면역학, 및 세포 생물학의 통상적인 방법을 적용할 것이며, 이들 중 다수는 예시의 목적을 위해 하기에 기재되어 있다. 상기 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (제3판, 2001); Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (제2판, 1989); Maniatis 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 2008년 7월 업데이트); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach 및 W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; 뿐만 아니라, 저널의 단행본, 예컨대 Advances in Immunology을 참조한다.
II. 정의
세포를 특성화하기 위해 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "저면역원성"은 일반적으로 상기 세포는 상기 세포가 이식된 대상체에 의한 면역 거부반응에 덜 취약하다는 것을 의미한다. 예를 들어, 비변경 또는 비변형 야생형 세포에 비해, 상기 저면역원성 세포는 상기 세포가 이식된 대상체에 의한 면역 거부반응에 약 2.5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 또는 그 이상덜 취약할 수 있다. 일부 측면에서, 게놈 편집 기술은 MHC I 및 MHC II 유전자의 발현을 조절하는 데 사용되며, 따라서, 저면역원성 세포를 생성한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 MHC-불일치 동종이형 수용자에서 면역 거부반응을 회피한다. 일부 경우에, 본원에 개괄된 저면역원성 줄기 세포로부터 생산된 분화된 세포는 MHC-불일치 동종이형 수용자에게 투여 (예를 들어, 이식(transplanted) 또는 이식(grafted))될 때 면역 거부반응을 회피한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 T 세포-매개 적응 면역 거부반응 및/또는 선천 면역 세포 거부반응으로부터 보호된다.
세포의 저면역원성은 적응 및 선천 면역 반응을 유도하는 세포의 능력과 같은 세포의 면역원성을 평가함으로써 결정될 수 있다. 상기 면역 반응은 당업자에 의해 인식되는 검정법을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응 검정법은 T 세포 증식, T 세포 활성화, T 세포 사멸, NK 세포 증식, NK 세포 활성화, 및 대식세포 활성에 대한 저면역원성 세포의 효과를 측정한다. 일부 경우에, 저면역원성 세포 및 이의 유도체는 대상체에 투여 시 T 세포 및/또는 NK 세포에 의해 감소된 사멸을 겪는다. 일부 경우에, 상기 세포 및 이의 유도체는 비변형 또는 야생형 세포에 비해 감소된 대식세포 포식을 나타낸다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 상응하는 비변형 야생형 세포에 비해 수용자 대상체에서 감소된 또는 약화된 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포는 비면역원성이거나 수용자 대상체에서 면역 반응을 유도하지 못한다.
본원에 사용된 바와 같이 "면역억제 인자" 또는 "면역 조절 인자" 또는 "면역관용 인자"는 투여, 이식, 또는 생착 시 숙주 또는 수용자 대상체의 면역 체계에 의해 인식되는 세포의 능력을 조절하거나 영향을 미치는 저면역원성 인자, 보체 억제제, 및 기타 인자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "면역 신호전달 인자"는 일부 경우에 면역 신호전달 경로를 활성화시키는 분자, 단백질, 펩티드 등을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 "세이프 하버 유전자좌"는 전이유전자 또는 외인성 유전자의 안전한 발현을 허용하는 유전자의 유전자좌(locus)를 지칭한다. 예시적인 "세이프 하버" 유전자좌는 CCR5 유전자, CXCR4 유전자, PPP1R12C (AAVS1로도 공지됨) 유전자, 알부민 유전자, SHS231 유전자좌, CLYBL 유전자, 및 Rosa 유전자 (예를 들어, ROSA26)를 포함한다.
본 개시의 목적을 위한 "유전자"는, 유전자 생성물을 암호화하는 DNA 영역, 뿐만 아니라 이러한 조절 서열이 암호화하고/하거나 전사된 서열에 인접하는지의 여부와 관계없이, 유전자 생성물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 반드시 이에 제한되는 것은 아니나, 프로모터 서열, 터미네이터, 번역 조절 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 침묵자, 절연자, 경계 요소, 복제 기점, 기질 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역을 포함한다.
"유전자 발현"은 유전자 내에 함유된 정보를 유전자 생성물로 전환시키는 것을 지칭한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접 전사 생성물 (예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 간섭 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 임의의 기타 유형의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물에는 또한, 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화, 및 편집과 같은 공정에 의해 변형되는 RNA, 및 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스토일화, 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질이 포함된다.
유전자 발현의 "조절"은 유전자의 발현 수준의 변화를 지칭한다. 발현의 조절은 이에 제한되지는 않으나, 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있다. 또한, 조절은 완전할 수 있으며, 즉, 여기서 유전자 발현은 완전히 불활성화되거나 야생형 수준 또는 그 이상으로 활성화되고; 또는 부분적일 수 있으며, 여기서 유전자 발현은 부분적으로 감소되거나, 야생형 수준의 일부 비율로 부분적으로 활성화된다.
용어 "작동적으로 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된"은 둘 이상의 구성요소 (예컨대, 서열 요소)의 병렬배치와 관련하여 상호교환적으로 사용되며, 여기서 구성요소는 두 구성요소가 모두 정상적으로 기능하고 구성요소 중 적어도 하나가 다른 구성요소 중 적어도 하나에서 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 배열된다. 예시로서, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 암호화 서열의 전사 수준을 제어하는 경우에, 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터는 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로 암호화 서열과 시스에서 작동적으로 연결되지만, 이에 직접적으로 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 비록 이들이 인접하지 않더라도 암호화 서열에 작동적으로 연결되는 전사 조절 서열이다.
"벡터" 또는 "구축물"은 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 구축물", "발현 벡터" 및 "유전자 전달 벡터"는 관심 유전자의 발현을 지시할 수 있고, 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 구축물을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝, 및 발현 비히클, 뿐만 아니라 통합 벡터를 포함한다. 벡터 또는 구축물을 세포 내로 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 지질-매개 전달 (즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공, 직접 주입, 세포 융합, 입자 충격, 인산칼슘 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "만능 줄기 세포"는 3개의 배엽 중 임의의 것으로 분화할 가능성을 갖는다: 내배엽 (예를 들어, 위 연결, 위장관, 폐 등), 중배엽 (예를 들어, 근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기 조직 등) 또는 외배엽 (예를 들어, 표피 조직 및 신경계 조직). 본원에 사용된 바와 같은 용어 "만능 줄기 세포"는 또한 "유도 만능 줄기 세포", 또는 "iPSC", 또는 비-만능 세포로부터 유래된 만능 줄기 세포의 유형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포는 만능 세포가 아닌 세포로부터 생산되거나 생성된다. 즉, 만능 줄기 세포는 비-만능 세포의 직접적 또는 간접적 자손일 수 있다. 모세포의 예는 다양한 수단에 의해 만능, 미분화 표현형을 유도하도록 재프로그래밍된 체세포를 포함한다. 상기 "iPS" 또는 "iPSC" 세포는 특정 조절 유전자의 발현을 유도함에 의해 또는 특정 단백질의 외인성 적용에 의해 생성될 수 있다. iPS 세포의 유도 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 하기에 추가로 기재된다. (예를 들어, Zhou 등, Stem Cells 27 (11): 2667-74 (2009); Huangfu 등, Nature Biotechnol. 26 (7): 795 (2008); Woltjen 등, Nature 458 (7239): 766-770 (2009); 및 Zhou 등, Cell Stem Cell 8:381-384 (2009)를 참조하고; 이들 각각은 이들 전체가 본원에 참조로 포함된다.) 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 생성은 하기에 개괄된다. 본원에 사용된 바와 같이 "hiPSC"는 인간 유도 만능 줄기 세포이다.
"HLA" 또는 "인간 백혈구 항원" 복합체는 인간에서 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 단백질을 암호화하는 유전자 복합체이다. HLA 복합체를 구성하는 이러한 세포-표면 단백질은 항원에 대한 면역 반응의 조절을 담당한다. 인간에는 클래스 I 및 클래스 II, "HLA-I" 및 "HLA-II"의 두 가지 MHC가 있다. HLA-I에는 세포의 내부로부터 펩티드를 제시하는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C의 3개의 단백질이 포함되며, HLA-I 복합체에 의해 제시되는 항원은 킬러 T-세포 (CD8+ T-세포 또는 세포독성 T 세포로도 공지됨)를 유인한다. HLA-I 단백질은 β-2 마이크로글로불린 (B2M)과 관련된다. HLA-II는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOB, HLA-DQ 및 HLA-DR의 5개의 단백질을 포함하며, 이는 세포 외부로부터 T 림프구로 항원을 제시한다. 이는 CD4+ 세포 (T-헬퍼 세포로도 공지됨)를 자극한다. "MHC" 또는 "HLA"의 사용은 유전자가 인간 (HLA) 또는 뮤린 (MHC)으로부터 유래했는지의 여부에 따라 달라지므로, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 따라서, 포유동물 세포와 관련하여 이러한 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이식(grafting)", "투여", "도입", "이식(implanting)" 및 "이식(transplanting)" 뿐만 아니라 이들의 문법적 변형은 원하는 부위에 도입된 세포의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의해 대상체로 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 세포)를 배치하는 맥락에서 상호교환적으로 사용된다. 세포는 원하는 부위에 직접적으로 이식될 수 있거나, 대안적으로 대상체에서 원하는 위치로의 전달을 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있으며, 상기 이식된 세포 또는 세포의 구성요소의 적어도 일부는 생존 가능하도록 유지된다. 대상체에게 투여한 후 세포의 생존 기간은 짧게는 수 시간, 예를 들어 24시간에서 수 일, 길게는 수 년일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 또한 원하는 부위 이외의 위치, 예컨대 뇌 또는 피하로, 예를 들어, 캡슐로 투여 (예를 들어, 주입) 하여 이식된 세포를 이식 위치에 유지하고 이식된 세포의 이동을 방지할 수 있다.
단리된 세포에 적용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 세포를 임의의 종류의 과정 또는 조건에 적용하거나, 세포에 대해 임의의 종류의 조작 또는 절차를 수행하는 것을 포함한다. 대상체에 적용된 바와 같이, 상기 용어는 표적 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, B2M)이 본원에 기재된 방법에 따라 생체외에서 변경된 세포 또는 세포 집단을 개체에게 투여하는 것을 지칭한다. 상기 개체는 일반적으로 질병에 걸리거나 손상을 입거나, 집단의 평균 구성원에 비해 질병에 걸릴 위험이 증가하고, 이러한 관심, 보살핌, 또는 관리를 필요로 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "치료하는" 및 "치료"는 대상체가 질병의 적어도 하나의 증상의 감소 또는 질병의 개선, 예를 들어 유익하거나 원하는 임상 결과를 갖도록, 본원에 기재된 방법에 따라 생체외에서 변경된 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과에는 이에 제한되지는 않으나, 하나 이상의 증상의 완화, 질병의 정도 감소, 질병의 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 질병 진행의 지연 또는 감속, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 검출가능 또는 검출불가능 여부와 관계없이 (부분적이든 전체적이든) 완화가 포함된다. 치료는 치료를 받지 않는 경우, 예상 생존 기간과 비교하여 생존 기간을 연장하는 것을 지칭할 수 있다. 따라서, 당업자는 치료가 질병 상태를 개선할 수 있지만, 질병에 대한 완전한 치유가 아닐 수 있음을 인식한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 예방을 포함한다. 대안적으로, 질병의 진행이 감소되거나 중단되는 경우 치료는 "효과적"이다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상된 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 이들은 이미 폴리뉴클레오티드 서열의 발현과 관련된 장애로 진단된 이들 뿐만 아니라 유전적 민감성 또는 기타 인자로 인해 상기 장애가 발생할 가능성이 있는 이들을 포함한다.
질병 또는 장애의 "치료", "예방" 또는 "개선"은 상기 질병 또는 장애의 발병을 지연시키거나 예방하는 것, 상기 질병 또는 장애와 관련된 병태의 진행 또는 중증도를 역전, 완화, 개선, 억제, 감속, 또는 진행, 악화 또는 저하를 중단시키는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 질병 또는 장애의 증상은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%까지 완화된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 조절되지 않은 성장, 분화의 결여, 국소 조직 침습, 및 전이를 초래하는 독특한 특성 (예를 들어, 정상적 제어의 상실)이 있는 세포의 과증식으로 정의된다. 본 발명의 방법과 관련하여, 암은 임의의 급성 림프구성암, 급성 골수성 백혈병, 폐포 횡문근 육종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 항문암, 항문관, 또는 항문직장암, 눈의 암, 간내담관의 암, 관절의 암, 목, 담낭, 또는 흉막의 암, 코, 비강, 또는 중이의 암, 구강암, 외음부 암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수암, 결장암, 식도암, 자궁경부암, 섬유육종, 위장관 유암종, 호지킨 림프종, 하인두암, 신장암, 후두암, 백혈병, 액체 종양, 간암, 폐암, 림프종, 악성 중피종, 비만세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 복막, 장막, 및 장간막암, 인두암, 전립선암, 직장암, 신장암, 피부암, 소장암, 연조직암, 고형암, 위암, 고환암, 갑상선암, 요관암, 및 방광암을 포함하는 임의의 암일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "종양"은 악성 유형의 세포 또는 조직의 비정상적인 성장을 지칭하며, 특별히 명시되지 않는 한, 양성 유형 조직은 포함하지 않는다.
용어 "만성 감염성 질환"은 감염원이 원인이 되어 감염이 지속되는 질환을 지칭한다. 상기 질환에는 간염 (A, B, 또는 C), 헤르페스 바이러스 (예를 들어, VZV, HSV-1, HSV-6, HSV-II, CMV, 및 EBV), 및 HIV/AIDS가 포함될 수 있다. 비-바이러스의 예로는 만성 진균 질환, 예컨대 아스페르길루스증, 칸디다증, 콕시디오이데스진균증, 및 크립토코커스 및 히스토플라스마증과 관련된 질병이 포함될 수 있다. 만성 세균 감염원의 비제한적인 예는 클라미디아 뉴모니아, 리스테리아 모노사이토제네스, 및 마이코박테리움 튜버큐로시스일 수 있다. 일부 구현예에서, 장애는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염이다. 일부 구현예에서, 장애는 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)이다.
용어 "자가면역 질환"은 대상체가 그 자신의 조직에 대해 파괴적인 면역 반응을 일으키는 임의의 질병 또는 장애를 지칭한다. 자가면역 질환은 대상체 (예를 들어, 인간)의 거의 모든 기관계에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 이에 제한되지는 않으나, 신경계, 위장관계, 및 내분비계, 뿐만 아니라 피부 및 기타 결합 조직, 눈, 혈액 및 혈관의 질환을 포함한다. 자가면역 질환의 예는 이에 제한되지는 않으나, 하시모토 갑상선염, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 그레이브스병, 경피증, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증 및 당뇨병을 포함한다.
추가적인 또는 대안적인 측면에서, 본 발명은 예를 들어, 뉴클레아제 시스템, 예컨대 TAL 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 또는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템을 활용하여 당업자에게 이용가능한 임의의 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는 것을 고려한다. CRISPR/Cas (예를 들어, Cas9 및 Cpf1) 및 TALEN을 활용하는 방법의 예가 본원에 상세히 기재되어 있지만, 본 발명은 이러한 방법/시스템의 사용으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 당업자에게 공지된 표적 세포에서 발현을 감소 또는 제거하기 위해 예를 들어 B2M을 표적화하는 다른 방법이 본원에서 활용될 수 있다.
본 발명의 방법은 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 임의의 목적을 위해 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는 것을 고려한다. 일부 구현예에서, 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 돌연변이 세포를 생성하도록 변경된다. 본원에 사용된 바와 같이, "돌연변이 세포"는 이의 원래 유전자형과 상이한 생성된 유전자형을 갖는 세포를 지칭한다. 일부 경우에, "돌연변이 세포"는 예를 들어, 정상적으로 기능하는 유전자가 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 변경될 때 돌연변이 표현형을 나타낸다. 다른 경우에, "돌연변이 세포"는 예를 들어, 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템이 돌연변이 유전자형을 교정하기 위해 사용될 때 야생형 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 유전적 돌연변이를 교정하거나 복구하기 위해 (예를 들어, 세포에 대한 정상 표현형을 회복시키기 위해) 변경된다. 일부 구현예에서, 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 유전적 돌연변이를 유도하기 위해 (예를 들어, 유전자 또는 게놈 요소의 기능을 파괴하기 위해) 변경된다.
일부 구현예에서, 변경은 인델이다. 본원에 사용된 바와 같이, "인델"은 삽입, 결실, 또는 이들의 조합으로 인한 돌연변이를 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 인델의 길이가 3의 배수가 아닌 한, 게놈 서열의 암호화 영역에 있는 인델은 프레임시프트 돌연변이를 야기할 것이다. 일부 구현예에서, 변경은 점 돌연변이이다. 본원에 사용된 바와 같이, "점 돌연변이"는 뉴클레오티드 중 하나를 대체하는 치환을 지칭한다. 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 임의의 길이의 인델 또는 점 돌연변이를 유도하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "녹아웃"은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 방해하는 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 결실시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 녹아웃은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능적 도메인 (예를 들어, DNA 결합 도메인)에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 인델을 유도함에 의해 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 세부사항에 기초하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이들의 일부를 녹아웃시키기 위해 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템을 사용하는 방법을 쉽게 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 변경은 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부의 녹아웃을 초래한다. 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부를 녹아웃시키는 것은 다양한 적용에 유용할 수 있다. 예를 들어, 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 녹아웃시키는 것은 연구 목적을 위해 시험관 내에서 수행될 수 있다. 생체외 목적을 위해, 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 녹아웃시키는 것은 (예를 들어, 생체외 세포 내의 돌연변이 대립유전자를 녹아웃시키고, 녹아웃된 돌연변이 대립유전자를 포함하는 이들 세포를 대상체에 도입함으로써) 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 발현과 관련된 장애를 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다.
본원에서 "녹인(knock in)"은 숙주 세포에 유전적 기능을 부가하는 과정을 의미한다. 이는 녹인된 유전자 생성물, 예를 들어, RNA 또는 암호화된 단백질의 증가된 수준을 유발한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이는 숙주 세포에 유전자의 하나 이상의 추가적인 복제(copy)를 부가하거나, 내인성 유전자의 조절 성분을 변경하는 것을 포함하여, 단백질의 발현을 증가시키는 여러 방법으로 수행할 수 있다. 이는 프로모터를 변형하거나, 다른 프로모터를 부가하거나, 인핸서를 부가하거나, 다른 유전자 발현 서열을 변형하여 수행할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 변경 또는 변형은 표적 또는 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 감소된 발현을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 변경 또는 변형은 표적 또는 선택된 폴리펩티드 서열의 감소된 발현을 초래한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 변경 또는 변형은 표적 또는 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 증가된 발현을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 변경 또는 변형은 표적 또는 선택된 폴리펩티드 서열의 증가된 발현을 초래한다.
용어 "감소하는", "감소된", "감소", 및 "감소하는"은 모두 통계적으로 유의한 양만큼의 감소를 의미하기 위해 일반적으로 본원에 사용된다. 그러나, 의심의 여지를 없애기 위하여, "감소하는", "감소된", "감소", 및 "감소하는"은 참조 수준에 비해 적어도 10% 감소, 예를 들어, 참조 수준에 비해 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 최대 90% 감소 및 100% 감소를 포함하는 것 (즉, 참조 시료에 비해 수준 부재), 또는 10-100% 사이의 임의의 감소를 의미한다.
용어 "증가된", "증가하는" 또는 "향상" 또는 "활성화"는 모두 통계적으로 유의한 양만큼의 증가를 의미하기 위해 일반적으로 본원에 사용되며; 의심의 여지를 없애기 위하여, 상기 용어 "증가된", "증가하는" 또는 "향상" 또는 "활성화"는 참조 수준에 비해 적어도 10% 증가, 예를 들어, 참조 수준에 비해 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 최대 90% 증가 및 100% 증가를 포함하는 것, 또는 10-100% 사이의 임의의 증가, 또는 참조 수준에 비해 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 2배 내지 10배 또는 그 이상의 임의의 증가를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "외인성"은 참조된 분자 또는 참조된 폴리펩티드가 관심 세포 내로 도입됨을 의미하는 것으로 의도된다. 폴리펩티드는 예를 들어, 세포의 유전적 물질 내로 암호화 핵산의 도입에 의해, 예컨대 염색체 내로의 통합에 의해 또는 비-염색체 유전적 물질, 예컨대 플라스미드 또는 발현 벡터로서 도입될 수 있다. 따라서, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용되는 용어는 발현가능한 형태의 암호화 핵산을 세포에 도입하는 것을 지칭한다. "외인성" 분자는 일반적으로 세포에 존재하지는 않지만, 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 기타 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자, 구축물, 인자 등이다. "세포 내 정상적인 존재"는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예를 들어 뉴런의 배아 발달 동안에만 존재하는 분자는 성체 뉴런 세포에 대한 외인성 분자이다. 외인성 분자는, 예를 들어, 오작동하는 내인성 분자의 기능 버젼 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 오작동 버젼을 포함할 수 있다.
외인성 분자 또는 인자는 특히 조합 화학 공정에 의해 생성되는 것과 같은 소분자, 또는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지질단백질, 다당류, 상기 분자의 임의의 변형된 유도체, 또는 상기 분자 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체와 같은 거대분자일 수 있다. 핵산에는 DNA 및 RNA가 포함되며, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고; 선형, 분지형 또는 원형일 수 있으며; 임의의 길이일 수 있다. 핵산에는 이중체를 형성할 수 있는 것 뿐만 아니라, 삼중체를 형성할 수 있는 핵산이 포함된다. 예를 들어, 미국등록특허 제5,176,996호 및 제5,422,251호를 참조한다. 단백질은 이에 제한되지는 않으나, DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화된 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 재조합효소, 리가제, 토포이소머라제, 자이라제 및 헬리카제를 포함한다.
용어 "내인성"은 세포에 존재하는 참조된 분자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 유사하게, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용될 때 용어는 세포 내에 함유되고 외인성으로 도입되지 않은 암호화 핵산의 발현을 지칭한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여, 용어 퍼센트 "동일성"은 하기 기재된 서열 비교 알고리즘 (예를 들어, BLASTP 및 BLASTN 또는 당업자가 사용가능한 기타 알고리즘) 중 하나를 사용하거나 육안 검사에 의해 측정되는 바와 같이, 최대 일치성을 위해 비교 및 정렬될 때, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 적용에 따라, 퍼센트 "동일성"은 비교되는 서열의 영역, 예를 들어 기능적 도메인에 걸쳐 존재할 수 있거나, 대안적으로, 비교되는 2개의 서열 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다. 서열 비교의 경우, 전형적으로 하나의 서열이 테스트 서열과 비교되는 참조 서열로 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 테스트 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하여, 하위서열 좌표를 지정하고, 필요한 경우 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 그런 다음 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기반으로, 참조 서열과 관련된 테스트 서열(들)의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
비교를 위한 최적의 서열 정렬은 예를 들어, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 로컬 상동성 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사도 검색 방법에 의해, 상기 알고리즘 (Wisconsin Genetics Software Package 중 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)의 컴퓨터화된 구현에 의해, 또는 육안 검사에 의해 (일반적으로 Ausubel 등, 하기 참조) 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 일례는 BLAST 알고리즘이며, 이는 Altschul 등, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보센터를 통해 공개적으로 사용가능하다.
용어 "대상체" 및 "개체"는 본원에 상호교환적으로 사용되며, 동물, 예를 들어, 세포를 수득할 수 있는 인간 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 세포로 예방적 치료를 비롯한 치료가 제공되는 인간을 지칭한다. 특정 동물, 예컨대 인간 대상체에 특정한 감염, 병태 또는 질병 상태의 치료를 위해, 대상체라는 용어는 해당 특정 동물을 지칭한다. 본원에 상호교환적으로 사용되는 "비-인간 동물" 및 "비-인간 포유동물"은 포유동물, 예컨대 랫트, 마우스, 토끼, 양, 고양이, 개, 소, 돼지, 및 비-인간 영장류를 포함한다. 용어 "대상체"는 또한 포유동물, 파충류, 양서류 및 어류를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 척추동물을 포함한다. 그러나, 유리하게는, 대상체는 포유동물, 예컨대 인간, 또는 기타 포유동물, 예컨대 가축화된 포유동물, 예를 들어, 개, 고양이, 말 등, 또는 생산 포유동물, 예를 들어, 소, 양, 돼지 등이다.
청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있다는 점에 주목한다. 이와 같이, 이 진술은 청구범위 요소의 인용, 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독", "오직" 등과 같은 배타적 용어의 사용에 대한 선행 근거로 사용하기 위한 것이다. 본 개시를 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 설명되고 예시된 각각의 개별적인 구현예는 본 발명의 범주 또는 사상을 벗어나지 않고 임의의 다른 여러 구현예의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 결합되는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있지만, 대표적인 예시적인 방법 및 재료가 이제 설명된다.
본 발명에서 기재된 바와 같이, 하기 용어들이 사용될 것이고, 하기에 지시된 바와 같이 정의된다.
본 발명을 추가로 설명하기 전에, 본 발명은 기재된 특정 구현예로 제한되지 않으며, 물론 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이므로, 이를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명확히 명시되지 않는 한, 그 범위의 상한 및 하한과 그 언급된 범위 내 임의의 다른 언급되거나 개재하는 값 사이에서, 하한 단위의 10분의 1까지 각각의 개재하는 값이 본 발명 내에 포괄된다는 것이 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 포함될 수 있으며 더 작은 범위에서는 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한도에 대해, 본 발명 내에 또한 포괄된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계의 둘 중 어느 하나를 제외한 범위가 또한 본 발명에 포함된다. 특정 범위는 "약"이라는 용어가 앞에 오는 수치 값과 함께 본원에 제시된다. 용어 "약"은 그것이 선행하는 정확한 숫자 뿐만 아니라 그 용어가 선행하는 숫자에 가깝거나 대략적인 숫자에 대한 문자적 지원을 제공하기 위해 본원에 사용된다. 숫자가 구체적으로 언급된 숫자에 가깝거나 대략적인지 여부를 결정할 때, 인용되지 않은 수에 가깝거나 대략적인 수는 제시된 문맥에서 구체적으로 인용된 수와 실질적으로 등가를 제공하는 수일 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 또한, 인용된 각각의 간행물, 특허 또는 특허 출원은 인용된 간행물과 관련된 주제를 개시하고 설명하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전의 개시를 위한 것이며, 본원에 설명된 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 간행물보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공된 공개일은 실제 공개일과 다를 수 있으며, 이는 별도의 확인이 필요할 수 있다.
III. 구현예의 상세한 설명
A. 저면역원성 세포
CD24의 발현을 증가시키기 위한 변형, 및 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 발현을 조절하는 하나 이상의 표적화된 폴리뉴클레오티드 서열의 변형을 포함하는 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 외인성 CD24 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 또한 CD47, DUX4, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1,CTLA4, C1-억제제, IL-10, IL-35, FASL, CCL21, Mfge8, 및 Serpinb95로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 세포는 외인성 CD24 및 CD47 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 DUX4 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 CD27 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 CD35 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 CD46 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 CD55 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 CD59 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 CD200 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 HLA-C 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 HLA-E 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 HLA-E 중쇄 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 HLA-G 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 PD-L1 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 IDO1 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 CTLA4 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 C1-억제제 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 IL-10 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 IL-35 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 FASL 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 CCL21 폴리펩티드, 외인성 CD24 및 Mfge8 폴리펩티드, 및 외인성 CD24 및 Serpinb95 폴리펩티드 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 MHC I 및/또는 MHC II의 발현을 조절하는 하나 이상의 표적화된 폴리뉴클레오티드 서열의 게놈 변형을 포함한다. 일부 측면에서, 유전적 편집 시스템은 하나 이상의 표적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 표적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 B2M, CIITA, 및 NLRC5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다. 특정 구현예에서, 상기 세포의 게놈은 HLA 발현의 중요한 성분을 감소 또는 결실시키도록 변경되었다.
일부 측면에서, 본 개시는 게놈 DNA의 연속 스트레치(contiguous stretch)를 결실시키도록 유전자를 편집함으로써, 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 I 분자의 표면 발현을 감소시키거나, 제거한 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 특정 측면에서, 본 개시는 게놈 DNA의 연속 스트레치를 결실시키도록 유전자를 편집함으로써, 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 II 분자의 표면 발현을 감소시키거나, 제거한 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 특정 측면에서, 본 개시는 게놈 DNA의 연속 스트레치를 결실시키도록 하나 이상의 유전자를 편집함으로써, 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 I 및 II 분자의 표면 발현을 감소시키거나, 제거한 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 특정 측면에서, 본 개시는 게놈 DNA의 연속 스트레치를 결실시키도록 하나 이상의 유전자를 편집함으로써, 세포 또는 이의 집단에서 MHC 클래스 I 및 II 분자의 표면 발현을 감소시키거나, 제거한 게놈을 포함하는 줄기 세포 (예를 들어, 만능 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포) 또는 이의 집단을 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 MHC I 또는 MHC II의 발현은 게놈 DNA의 연속 스트레치를 표적화 및 결실시킴으로써, B2M, CIITA 및 NLRC5로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나, 제거함에 의해 조절된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포 및 방법은 CIITA 유전자 서열을 절단하기 위해 인간 세포를 게놈적으로 편집하는 것 뿐만 아니라, 이에 제한되지는 않으나 B2M 및 NLRC5와 같은 하나 이상의 추가 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하기 위해 상기 세포의 게놈을 편집하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포 및 방법은 B2M 유전자 서열을 절단하기 위해 인간 세포를 게놈적으로 편집하는 것 뿐만 아니라, 이에 제한되지는 않으나 CIITA 및 NLRC5와 같은 하나 이상의 추가 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하기 위해 상기 세포의 게놈을 편집하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포 및 방법은 NLRC5 유전자 서열을 절단하기 위해 인간 세포를 게놈적으로 편집하는 것 뿐만 아니라, 이에 제한되지는 않으나 B2M 및 CIITA와 같은 하나 이상의 추가 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하기 위해 상기 세포의 게놈을 편집하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, MHC I의 발현은 DUX4의 발현을 과발현 또는 증가시킴에 의해 조절된다. 일부 경우에, DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 DUX4 단백질 서열을 보존하면서 CpG 부위의 총 수를 감소시키기 위해 하나 이상의 염기 치환을 포함하는 코돈 변경된 서열이다. 일부 경우에, 상기 코돈 변경된 서열은 서열번호 1이다. 다른 경우에, DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2 내지 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90% (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상) 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 경우에, DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2 내지 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, DUX4의 증가된 발현을 갖는 본원에 기재된 세포는 또한 CD24를 과발현한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 상기 세포는 이에 제한되지는 않으나, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같이 변형된 줄기 세포 (예를 들어, 저면역원성 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 및 조혈 줄기 세포) 또는 이의 집단을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 1차 T 세포는 세포독성 T-세포, 헬퍼 T-세포, 기억 T-세포, 조절 T-세포, 종양 침윤 림프구, 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 1차 T 세포는 수용자 대상체 (예를 들어, 세포가 투여되는 환자)와 상이한 하나 이상의 공여자 대상체로부터의 1차 T 세포의 풀(pool)로부터 유래한 것이다. 상기 1차 T 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100 또는 그 이상의 공여자 대상체로부터 수득되고 함께 풀링될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 1차 T 세포는 하나 또는 다수의 개체로부터 수확되고, 일부 경우에, 상기 1차 T 세포 또는 1차 T 세포의 풀은 시험관 내에서 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 1차 T 세포 또는 1차 T 세포의 풀은 CD24, 및 일부 경우에, CD47 또한 외인성으로 발현하도록 조작되고 시험관 내에서 배양된다.
특정 구현예에서, 상기 1차 T 세포 또는 1차 T 세포의 풀은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된 것이다. CAR는 당업자에게 공지된 임의의 것일 수 있다. 유용한 CAR는 CD19, CD38, CD123, CD138, 및 BCMA를 포함하는 군으로부터 선택되는 항원에 결합하는 것을 포함한다. 일부 경우에, CAR는 FDA-승인된 CAR-T 세포 치료제, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 티사젠렉류셀(tisagenlecleucel) 및 액시캅타진 실로류셀(axicabtagene ciloleucel), 또는 임상 시험에서 연구 중인 기타 치료제에 사용되는 것과 동일하거나 동등한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 1차 T 세포 또는 1차 T 세포의 풀은 비변형 1차 T 세포에 비해 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 나타내도록 조작된 것이다. 특정 구현예에서, 상기 1차 T 세포 또는 1차 T 세포의 풀은 비변형 1차 T 세포에 비해 CTLA4, PD1, 또는 CTLA4 및 PD1 둘 다의 감소된 발현을 나타내도록 조작된 것이다. T 세포를 포함하는 세포를 유전적으로 변형시키는 방법은 예를 들어, WO2016183041호에 상세히 기재되어 있으며, 상기 개시는 표, 부록, 서열 목록 및 도면을 포함하여 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 CAR T 세포는 (a) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하는 제1 세대 CAR; (b) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 적어도 2개의 신호전달 도메인을 포함하는 제2 세대 CAR; (c) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 적어도 3개의 신호전달 도메인을 포함하는 제3 세대 CAR; 및 (d) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 3개 또는 4개의 신호전달 도메인, 및 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함하는 제4 세대 CAR;를 포함하는 군으로부터 선택되는 CAR를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 CAR의 항원 결합 도메인은 이에 제한되지는 않으나, (a) 신생 세포의 항원 특징을 표적화하는 항원 결합 도메인; (b) T 세포의 항원 특징을 표적화하는 항원 결합 도메인; (c) 자가면역 또는 염증성 장애의 항원 특징을 표적화하는 항원 결합 도메인; (d) 노화 세포의 항원 특징을 표적화하는 항원 결합 도메인; (e) 감염성 질환의 항원 특징을 표적화하는 항원 결합 도메인; 및 (f) 세포의 세포 표면 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인은 항체, 항원-결합 부위 또는 이의 단편, scFv, 및 Fab를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인은 CD19 또는 BCMA에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인은 항-CD19 scFv, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나 FMC63이다.
일부 구현예에서, 상기 CAR의 막횡단 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD9, CD16, CD28, CD45, CD22, CD33, CD34, CD37, CD40, CD40L/CD154, CD45, CD64, CD80, CD86, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, CD154, FcεRIγ, VEGFR2, FAS, FGFR2B의 막횡단 영역, 및 이들의 기능적 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 CAR의 신호전달 도메인(들)은 공동자극 도메인(들)을 포함한다. 예를 들면, 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함할 수 있다. 또는, 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CAR가 2개 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 경우, 2개의 공동자극 도메인은 동일하지 않다. 일부 구현예에서, 상기 공동자극 도메인은 동일하지 않은 2개의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 공동자극 도메인은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생산, CAR T 세포 증식, 및/또는 CAR T 세포 지속성을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 상기 공동자극 도메인은 T 세포 활성화 동안 사이토카인 생산, CAR T 세포 증식, 및/또는 CAR T 세포 지속성을 향상시킨다.
본원에 기재된 바와 같이, 제4 세대 CAR는 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 3개 또는 4개의 신호전달 도메인, 및 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 사이토카인 유전자는 저면역원성 세포의 내인성 또는 외인성 사이토카인 유전자이다. 일부 경우에, 상기 사이토카인 유전자는 전-염증성 사이토카인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 전-염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-9, IL-12, IL-18, TNF, IFN-감마, 및 이들의 기능적 단편을 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 CAR의 성공적인 신호전달 시 사이토카인 유전자의 발현을 유도하는 도메인은 전사 인자 또는 기능적 도메인 또는 이들의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 CAR는 CD3 제타 도메인 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이들의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CAR는 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이들의 기능적 변이체; 및 (ii) CD28 도메인, 또는 4-1BB 도메인, 또는 이들의 기능적 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 CAR는 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이들의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인, 또는 이들의 기능적 변이체; 및 (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인, 또는 이들의 기능적 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 CAR는 (i) CD3 제타 도메인, 또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM), 또는 이들의 기능적 변이체; (ii) CD28 도메인, 또는 이들의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 도메인, 또는 CD134 도메인, 또는 이들의 기능적 변이체; 및 (iv) 사이토카인 또는 공동자극 리간드 전이유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CAR는 (i) 항-CD19 scFv; (ii) CD8α 힌지 및 막횡단 도메인 또는 이들의 기능적 변이체; (iii) 4-1BB 공동자극 도메인 또는 이들의 기능적 변이체; 및 (iv) CD3ζ 신호전달 도메인 또는 이들의 기능적 변이체를 포함한다.
CAR 구축물을 도입하거나 CAR-T 세포를 생성하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상세한 설명은 예를 들어, Vormittag 등, Curr Opin Biotechnol, 2018, 53, 162-181; 및 Eyquem 등, Nature, 2017, 543, 113-117에서 확인된다.
일부 구현예에서, 상기 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 예를 들어 내인성 T 세포 수용체 유전자 (예를 들어, T 세포 수용체 알파 불변 영역 (TRAC) 또는 T 세포 수용체 베타 불변 영역 (TRBC))의 파괴에 의한, 내인성 T 세포 수용체의 감소된 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 (예를 들어, 키메라 항원 수용체, CD24, CD47, 또는 본원에 개시된 기타 면역관용 인자)를 암호화하는 외인성 핵산은 파괴된 T 세포 수용체 유전자에 삽입된다.
일부 구현예에서, 상기 1차 T 세포로부터 유래된 세포는 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4 (CTLA4) 및/또는 예정된 세포 사멸 (PD1)의 감소된 발현을 포함한다. CTLA4, PD1, 및 CTLA4 및 PD1 둘 다의 발현을 감소시키거나, 제거하는 방법은 당업자에 의해 인식되는 임의의 것, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나 희귀-절단 엔도뉴클레아제 및 RNA 침묵 또는 RNA 간섭 기술을 활용하는 유전적 변형 기술을 포함할 수 있다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 비제한적인 예는 임의의 Cas 단백질, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 엔도뉴클레아제를 포함한다.
일부 구현예에서, 기재된 조작된 세포의 집단은 수용자 대상체에 투여 시 감소된 수준의 면역 활성화를 유도하거나, 면역 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 수용자 대상체에서 감소된 수준의 전신성(systemic) TH1 활성화를 유도하거나, 전신성 TH1 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 수용자 대상체에서 말초혈액 단핵세포 (PBMC)의 감소된 수준의 면역 활성화를 유도하거나, PBMC의 면역 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 수용자 대상체에 투여 시 세포에 대해 감소된 수준의 공여자 특이적 IgG 항체를 유도하거나, 공여자 특이적 IgG 항체를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 수용자 대상체에서 세포에 대해 감소된 수준의 IgM 및 IgG 항체 생산을 유도하거나, IgM 및 IgG 항체 생산을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 수용자 대상체에 투여 시 세포의 감소된 수준의 세포독성 T 세포 사멸을 유도한다.
B. CD24
일부 측면에서, 본 개시는 면역관용 인자 (예를 들어, 면역조절 폴리펩티드) CD24를 발현하도록 변형된 줄기 세포 (예를 들어, 만능 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 CD24를 발현하도록 줄기 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 줄기 세포는 외인성 CD24를 발현한다. 일부 경우에, 상기 줄기 세포는 인간 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 발현한다.
열안정성 항원 또는 소세포 폐암 클러스터 4 항원으로도 일컬어지는 CD24는 글리코실화된 글리코실포스파티딜이노시톨-고정된 표면 단백질이다 (Pirruccello 등, J Immunol, 1986, 136, 3779-3784; Chen 등, Glycobiology, 2017, 57, 800-806). 선천 면역 세포 상의 Siglec-10에 결합한다. 최근에 Siglec-10을 통해 CD24가 선천 면역 체크포인트로 작용하는 것으로 나타났다 (Barkal 등, Nature, 2019, 572, 392-396).
일부 구현예에서, 본원에 개괄된 상기 세포는 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상)을 갖는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개괄된 상기 세포는 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성 (예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상)을 갖는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개괄된 상기 세포는 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개괄된 상기 세포는 NCBI 참조 번호 NP_001278666.1, NP_001278667.1, NP_001278668.1, 및 NP_037362.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상)을 갖는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 상기 CD24 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_001278666.1, NP_001278667.1, NP_001278668.1, 및 NP_037362.1에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성 (예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상)을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 개괄된 상기 세포는 NCBI 참조 번호 NP_001278666.1, NP_001278667.1, NP_001278668.1, 및 NP_037362.1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 NCBI 참조 번호 NM_00129737.1, NM_00129738.1, NM_001291739.1, 및 NM_013230.3에 제시된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상)을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 NCBI 참조 번호 NM_00129737.1, NM_00129738.1, NM_001291739.1, 및 NM_013230.3에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, CD24 단백질 발현은 CD24 단백질에 대한 항체로 탐침된(probed) 세포 용해물에 대해 웨스턴 블롯을 사용하여 검출한다. 또 다른 구현예에서, 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 사용하여 외인성 CD24 mRNA의 존재를 확인한다.
C. CIITA
특정 측면에서, 본원에 개시된 본 발명은 클래스 II 트랜스활성화인자 (CIITA) 발현을 표적화 및 조절 (예를 들어, 감소 또는 제거) 함에 의해, MHC II 유전자의 발현을 조절 (예를 들어, 감소 또는 제거) 한다. 일부 측면에서, 상기 조절은 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 일어난다. CIITA는 단백질의 LR 또는 뉴클레오티드 결합 도메인 (NBD) 류신-풍부 반복 (LRR) 패밀리의 구성원이며, MHC 인핸서좀(enhanceosome)과 결합하여 MHC II의 전사를 조절한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CIITA의 변이체이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CIITA의 상동체이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 CIITA의 이종상동체(ortholog)이다.
일부 측면에서, CIITA의 감소된 또는 제거된 발현은 이하 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, 및 HLA-DR인 MHC 클래스 II 중 하나 이상의 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 본원에 개괄된 상기 세포는 CIITA 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 CIITA 유전자를 표적화하는 유전적 변형은 CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CIITA를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 부록 1의 서열번호 5184 내지 36352 또는 WO2016183041호의 표 12로 이루어진 군으로부터 선택되며, 본 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
CIITA 유전자가 불활성화되었는지의 여부를 테스트하기 위한 검정법이 공지되어 있으며, 본원에 기재되어 있다. 일 구현예에서, CIITA 유전자의 생성된 유전적 변형은 PCR에 의해, 그리고 HLA-II 발현의 감소는 FACS 분석에 의해 검정될 수 있다. 또 다른 구현예에서, CIITA 단백질 발현은 CIITA 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물에 대해 웨스턴 블롯을 사용하여 검출한다. 또 다른 구현예에서, 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 사용하여 불활성화 유전적 변형의 존재를 확인한다.
D. B2M
특정 구현예에서, 본원에 개시된 본 발명은 부수적인 사슬 B2M의 발현을 표적화 및 조절 (예를 들어, 감소 또는 제거) 함에 의해, MHC-I 유전자의 발현을 조절 (예를 들어, 감소 또는 제거) 한다. 일부 측면에서, 상기 조절은 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 일어난다. B2M의 발현을 조절 (예를 들어, 감소 또는 제거) 함에 의해, MHC-I 분자의 표면 트래피킹(trafficking)이 차단되고, 상기 세포는 수용자 대상체로 이식될 때 면역 관용을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 예를 들어, 투여 시 수용자 대상체 또는 환자에서 저면역원성으로 간주된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 B2M의 변이체이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 B2M의 상동체이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 B2M의 이종상동체이다.
일부 측면에서, B2M의 감소된 또는 제거된 발현은 이하 - HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C인 MHC I 분자 중 하나 이상의 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 본원에 개괄된 상기 저면역원성 세포는 B2M 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 B2M 유전자를 표적화하는 유전적 변형은 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 부록 2의 서열번호 81240 내지 85644 또는 WO2016/183041호의 표 15로 이루어진 군으로부터 선택되며, 본 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
B2M 유전자가 불활성화되었는지의 여부를 테스트하기 위한 검정법이 공지되어 있으며, 본원에 기재되어 있다. 일 구현예에서, B2M 유전자의 생성된 유전적 변형은 PCR에 의해, 그리고 HLA-I 발현의 감소는 FACS 분석에 의해 검정될 수 있다. 또 다른 구현예에서, B2M 단백질 발현은 B2M 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물에 대해 웨스턴 블롯을 사용하여 검출한다. 또 다른 구현예에서, 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 사용하여 불활성화 유전적 변형의 존재를 확인한다.
E. NLRC5
특정 측면에서, 본원에 개시된 본 발명은 5/NOD27/CLR16.1을 함유하는 NLR 패밀리, CARD 도메인 (NLRC5)의 발현을 표적화 및 조절 (예를 들어, 감소 또는 제거) 함에 의해, MHC-I 유전자의 발현을 조절 (예를 들어, 감소 또는 제거) 한다. 일부 측면에서, 상기 조절은 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 일어난다. NLRC5는 MHC-I-매개 반응의 중요한 조절자이며, CIITA와 유사하게 NLRC5는 IFN-γ에 의해 고도로 유도될 수 있고 핵으로 전위될 수 있다. NLRC5는 MHC-I 유전자의 프로모터를 활성화시키고, MHC-I 뿐만 아니라 MHC-I 항원 제시에 연관된 관련 유전자의 전사를 유도한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 NLRC5의 변이체이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 NLRC5의 상동체이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 NLRC5의 이종상동체이다.
일부 측면에서, NLRC5의 감소된 또는 제거된 발현은 이하 - HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C인 MHC I 분자 중 하나 이상의 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 본원에 개괄된 상기 세포는 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전적 변형은 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 부록 3의 서열번호 36353 내지 81239 또는 WO2016183041호의 표 14로 이루어진 군으로부터 선택되며, 본 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
NLRC5 유전자가 불활성화되었는지의 여부를 테스트하기 위한 검정법이 공지되어 있으며, 본원에 기재되어 있다. 일 구현예에서, NLRC5 유전자의 생성된 유전적 변형은 PCR에 의해, 그리고 HLA-I 발현의 감소는 FACS 분석에 의해 검정될 수 있다. 또 다른 구현예에서, NLRC5 단백질 발현은 NLRC5 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물에 대해 웨스턴 블롯을 사용하여 검출한다. 또 다른 구현예에서, 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 사용하여 불활성화 유전적 변형의 존재를 확인한다.
F. CD47
일부 구현예에서, 상기 세포는 외인성 CD24 폴리펩티드 및 외인성 CD47 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 만능 세포 또는 만능 세포로부터 생성된 분화된 세포는 외인성 CD24 폴리펩티드 및 외인성 CD47 폴리펩티드를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시는 면역관용 인자 (예를 들어, 면역조절 폴리펩티드) CD47을 발현하도록 변형된 세포 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 CD47을 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 줄기 세포는 외인성 CD47 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 발현한다. 일부 경우에, 상기 세포는 인간 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 발현한다.
CD47은 백혈구 표면 항원이며, 세포 부착 및 인테그린의 조절 역할을 갖고 있다. 이는 세포의 표면 상에 발현되어 순환하는 대식세포에 세포를 포식하지 말라는 신호를 보낸다.
일부 구현예에서, 본원에 개괄된 상기 세포는 NCBI 참조 서열 번호 NP_001768.1 및 NP_942088.1, 및 서열번호 32 및 33에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성 (예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상)을 갖는 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개괄된 상기 세포는 NCBI 참조 서열 번호 NP_001768.1 및 NP_942088.1, 및 서열번호 32 및 33에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 NCBI 참조 번호 NM_001777.3 및 NM_198793.2에 제시된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상)을 갖는 CD47에 대한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 NCBI 참조 서열 번호 NM_001777.3 및 NM_198793.2에 제시된 CD47에 대한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 NCBI 참조 서열 번호 NP_001768.1 및 NP_942088.1, 및 서열번호 32 및 33에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성 (예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상)을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개괄된 상기 세포는 NCBI 참조 서열 번호 NP_001768.1 및 NP_942088.1, 및 서열번호 32 및 33에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CD47 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템, 예컨대 CRISPR/Cas 시스템은 면역관용 인자의 삽입, 예컨대 세이프 하버 유전자좌, 예컨대 AAVS1 유전자좌로 면역관용 인자의 삽입을 촉진하는 데 사용된다. 일부 경우에, 상기 CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 세이프 하버 유전자좌, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, 또는 SHS231 유전자좌로 삽입된다.
또 다른 구현예에서, CD47 단백질 발현은 CD47 단백질에 대한 항체로 탐침된 세포 용해물에 대해 웨스턴 블롯을 사용하여 검출한다. 또 다른 구현예에서, 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 사용하여 외인성 CD47 mRNA의 존재를 확인한다.
G. DUX4
일부 측면에서, 본 개시는 면역관용 또는 면역억제 인자, 예컨대 DUX4의 발현을 증가시키도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 DUX4의 증가된 발현을 제공하도록 세포의 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 일 측면에서, 본 개시는 외인성으로 발현된 DUX4 단백질을 포함하는 세포 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, DUX4의 증가된 발현은 이하 - HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C인 MHC I 분자 중 하나 이상의 발현을 억제시키거나, 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 외인성 CD24 폴리펩티드 및 외인성 DUX4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 만능 세포 또는 만능 세포로부터 생성된 분화된 세포는 외인성 CD24 폴리펩티드 및 외인성 DUX4 폴리펩티드를 포함한다.
DUX4는 배아 조직 및 유도 만능 줄기 세포에서 활성인 전사 인자이며, 정상적이고 건강한 체세포 조직에서는 침묵한다(Feng 등, 2015, ELife4; De Iaco 등, 2017, Nat Genet, 49, 941-945; Hendrickson 등, 2017, Nat Genet, 49, 925-934; Snider 등, 2010, PLoS Genet, e1001181; Whiddon 등, 2017, Nat Genet). DUX4 발현은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 유전자 발현 (예를 들어, B2M, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C의 발현)의 IFN-감마 매개 유도를 차단하는 작용을 한다. DUX4 발현은 MHC 클래스 I에 의한 억제된 항원 제시와 관련이 있다 (Chew 등, Developmental Cell, 2019, 50, 1-14). DUX4는 절단-단계 유전자 발현 (전사) 프로그램에서 전사 인자로서 기능한다. 이의 표적 유전자에는 이에 제한되지는 않으나, 코딩 유전자, 비코딩 유전자, 및 반복 요소가 포함된다.
DUX4 C-말단 전사 활성화 도메인을 포함하는 가장 긴 동종형을 갖는, 적어도 2개의 DUX4 동종형이 있다. 동종형은 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생성된다. 예를 들어, Geng 등, 2012, Dev Cell, 22, 38-51; Snider 등, 2010, PLoS Genet, e1001181을 참조한다. DUX4에 대한 활성 동종형은 이의 N-말단 DNA-결합 도메인 및 이의 C-말단 활성화 도메인을 포함한다. 예를 들어, Choi 등, 2016, Nucleic Acid Res, 44, 5161-5173을 참조한다.
DUX4의 CpG 모티프 수를 줄이면 DUX4 전이유전자의 침묵을 감소시키는 것으로 나타났다 (Jagannathan 등, Human Molecular Genetics, 2016, 25(20):4419-4431). 서열번호 1은 DUX4 단백질 서열을 보존하면서 CpG 부위의 총 수를 감소시키기 위한 하나 이상의 염기 치환을 포함하는 DUX4의 코돈 변경된 서열을 나타낸다. 핵산 서열은 Addgene, 카탈로그 No. 99281에서 상업적으로 이용가능하다.
특정 측면에서, 적어도 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 DUX4의 세포, 예를 들어, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포 또는 CAR-T 세포 내로의 삽입을 촉진하는 데 활용될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템, 예컨대 CRISPR/Cas 시스템은 면역관용 인자의 삽입, 예컨대 세이프 하버 유전자좌, 예컨대 AAVS1 유전자좌로 면역관용 인자의 삽입을 촉진하는 데 사용된다. 일부 경우에, 상기 DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 세이프 하버 유전자좌, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, 또는 SHS231 유전자좌로 삽입된다.
일부 경우에, 상기 DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1이다. 일부 구현예에서, 상기 DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90% (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상) 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 상기 DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
다른 구현예에서, 상기 면역관용 인자의 발현은 발현 벡터를 사용하여 촉진된다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 DUX4 단백질 서열을 보존하면서 CpG 부위의 총 수를 감소시키기 위한 하나 이상의 염기 치환을 포함하는 코돈 변경된 서열인 DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 경우에, 상기 DUX4의 코돈 변경된 서열은 서열번호 1이다. 다른 구현예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 1인 DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 90% (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상) 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열인 DUX4 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열인 DUX4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
DUX4 발현의 증가는 공지된 기술, 예컨대 웨스턴 블롯, ELISA 검정법, FACS 검정법, 면역검정법 등을 사용하여 검정할 수 있다.
H. 추가 면역관용 인자
특정 구현예에서, 하나 이상의 면역관용 인자는 게놈-편집된 세포로 삽입되거나 재삽입되어 면역-특권을 가진 보편적 공여자 세포, 예컨대 보편적 공여자 줄기 세포, 보편적 공여자 T 세포, 또는 보편적 공여자 세포를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 저면역원성 세포는 하나 이상의 면역관용 인자를 발현하도록 더 변형되었다. 예시적인 면역관용 인자는, 제한없이, 하나 이상의 CD24, CD47, DUX4, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, FASL, CCL21, Mfge8, 및 Serpinb9를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역관용 인자는 CD47, DUX4, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, FASL, CCL21, Mfge8, 및 Serpinb9로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템, 예컨대 CRISPR/Cas 시스템은 면역관용 인자의 삽입, 예컨대 세이프 하버 유전자좌, 예컨대 AAVS1 유전자좌로 면역관용 인자의 삽입을 촉진하는 데 사용된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 임의의 면역관용 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 세이프 하버 유전자좌, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, AAVS1, CCR5, CLYBL, ROSA26, 또는 SHS231 유전자좌로 삽입된다.
일부 측면에서, 본 개시는 세포 게놈이 CD47을 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 CD47을 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 세포주로 CD47의 삽입을 촉진하는 데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 본원에 참조로 포함되는 WO2016183041호의 표 29 중 서열번호 200784 내지 231885로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시는 세포 게놈이 HLA-C를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 HLA-C를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 세포주로 HLA-C의 삽입을 촉진하는 데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 본원에 참조로 포함되는 WO2016183041호의 표 10 중 서열번호 3278 내지 5183으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시는 세포 게놈이 HLA-E를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 HLA-E를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 세포주로 HLA-E의 삽입을 촉진하는 데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 본원에 참조로 포함되는 WO2016183041호의 표 19 중 서열번호 189859 내지 193183으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시는 세포 게놈이 HLA-F를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 HLA-F를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 세포주로 HLA-F의 삽입을 촉진하는 데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 본원에 참조로 포함되는 WO2016183041호의 표 45 중 서열번호 688808 내지 399754로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시는 세포 게놈이 HLA-G를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 HLA-G를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 줄기 세포주로 HLA-G의 삽입을 촉진하는 데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 본원에 참조로 포함되는 WO2016183041호의 표 18 중 서열번호 188372 내지 189858로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시는 세포 게놈이 PD-L1을 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 PD-L1을 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 줄기 세포주로 PD-L1의 삽입을 촉진하는 데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 본원에 참조로 포함되는 WO2016183041호의 표 21 중 서열번호 193184 내지 200783으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시는 세포 게놈이 CTLA4-Ig를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 CTLA4-Ig를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 줄기 세포주로 CTLA4-Ig의 삽입을 촉진하는 데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 서열 목록을 포함하는 WO2016183041에 개시된 임의의 하나로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시는 세포 게놈이 CI-억제제를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 CI-억제제를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 줄기 세포주로 CI-억제제의 삽입을 촉진하는 데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 서열 목록을 포함하는 WO2016183041에 개시된 임의의 하나로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시는 세포 게놈이 IL-35를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 IL-35를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 줄기 세포주로 IL-35의 삽입을 촉진하는 데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 서열 목록을 포함하는 WO2016183041에 개시된 임의의 하나로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 면역관용 인자는 발현 벡터를 사용하여 세포에서 발현된다. 예를 들어, 세포에서 CD47을 발현하기 위한 발현 벡터는 CD47 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD47 폴리펩티드는 서열번호 32 또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 발현 벡터는 유도성 발현 벡터일 수 있다. 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 세포 게놈이 HLA-A, HLA-B, HLA-C, RFX-ANK, CIITA, NFY-A, NLRC5, B2M, RFX5, RFX-AP, HLA-G, HLA-E, NFY-B, PD-L1, NFY-C, IRF1, TAP1, GITR, 4-1BB, CD28, B7-1, CD47, B7-2, OX40, CD27, HVEM, SLAM, CD226, ICOS, LAG3, TIGIT, TIM3, CD160, BTLA, CD244, LFA-1, ST2, HLA-F, CD30, B7-H3, VISTA, TLT, PD-L2, CD58, CD2, HELIOS, 및 IDO1로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 중 임의의 하나를 발현하도록 변형된 게놈을 포함하는 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 상기 줄기 세포로부터 유래되거나 생성된 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 이들의 임의의 자손) 또는 이의 집단을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, RFX-ANK, CIITA, NFY-A, NLRC5, B2M, RFX5, RFX-AP, HLA-G, HLA-E, NFY-B, PD-L1, NFY-C, IRF1, TAP1, GITR, 4-1BB, CD28, B7-1, CD47, B7-2, OX40, CD27, HVEM, SLAM, CD226, ICOS, LAG3, TIGIT, TIM3, CD160, BTLA, CD244, LFA-1, ST2, HLA-F, CD30, B7-H3, VISTA, TLT, PD-L2, CD58, CD2, HELIOS, 및 IDO1로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 중 임의의 하나를 발현하도록 세포 게놈을 변경하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 줄기 세포주로 선택된 폴리펩티드의 삽입을 촉진하는 데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 리보핵산 또는 적어도 한 쌍의 리보핵산은 부록 1 내지 47 및 WO2016183041호의 서열 목록에 개시된 임의의 하나로부터 선택되며, 상기 개시는 본원에 참조로 포함된다.
I. 예시적인 구현예
일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24의 증가된 발현 및 MHC 클래스 I 복합체의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24의 증가된 발현 및 MHC 클래스 II 복합체의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24의 증가된 발현 및 MHC 클래스 II 및 MHC 클래스 II 복합체의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다.
일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24의 증가된 발현 및 B2M의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24의 증가된 발현 및 CIITA의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24의 증가된 발현 및 NLRC5의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24의 증가된 발현, 및 B2M 및 CIITA의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24의 증가된 발현, 및 B2M 및 NLRC5의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24의 증가된 발현, 및 CIITA 및 NLRC5의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24의 증가된 발현, 및 B2M, CIITA 및 NLRC5의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 본원에 기재된 임의의 세포는 또한 CD47, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, FASL, CCL21, Mfge8, 및 Serpinb9를 포함하나 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자의 증가된 발현을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24 및 CD47의 증가된 발현 및 MHC 클래스 I 복합체의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24 및 CD47의 증가된 발현 및 MHC 클래스 II 복합체의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24 및 CD47의 증가된 발현 및 MHC 클래스 II 및 MHC 클래스 II 복합체의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24 및 CD47의 증가된 발현 및 B2M의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24 및 CD47의 증가된 발현 및 CIITA의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24 및 CD47의 증가된 발현 및 NLRC5의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24 및 CD47의 증가된 발현 및 B2M 및 CIITA의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24 및 CD47의 증가된 발현 및 B2M 및 NLRC5의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24 및 CD47의 증가된 발현 및 CIITA 및 NLRC5의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포 및 이의 집단은 CD24 및 CD47의 증가된 발현 및 B2M, CIITA 및 NLRC5의 하나 이상의 분자의 감소된 발현을 나타낸다. 본원에 기재된 임의의 세포는 또한 D27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, FASL, CCL21, Mfge8, 및 Serpinb9를 포함하나 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 증가된 발현을 나타낼 수 있다.
당업자는 조작되거나 변형된 유전자, 단백질 또는 분자의 발현 수준, 예컨대 증가되거나 감소된 발현이 비교가능한 비조작되거나 비변형 세포를 참조하거나 비교될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, CD24의 증가된 발현을 갖는 조작된 줄기 세포는 비변형 줄기 세포에 비해 더 높은 수준의 CD24 단백질을 갖는 변형된 줄기 세포를 지칭한다.
J. 유전적 변형의 방법
일부 구현예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산의 형태로 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포로 도입된다. 핵산을 세포로 도입하는 과정은 임의의 적합한 기술에 의해 달성될 수 있다. 적합한 기술은 인산칼슘 또는 지질-매개 형질감염, 전기천공, 및 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 또는 감염을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 mRNA (예를 들어, 합성, 변형된 mRNA)를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템을 활용하여 당업자가 이용할 수 있는 임의의 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는 것을 고려한다. 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경할 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 시스템을 사용할 수 있다. 상기 CRISPR-Cas 시스템은 다양한 Cas 단백질을 사용할 수 있다 (Haft 등, PLoS Comput Biol. 2005; 1(6)e60). CRISPR/Cas 시스템이 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경할 수 있도록 하는 상기 Cas 단백질의 분자 기구(molecular machinery)에는 RNA 결합 단백질, 엔도- 및 엑소-뉴클레아제, 헬리카제 및 폴리머라제가 포함된다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR 유형 I 시스템이다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR 유형 II 시스템이다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR 유형 V 시스템이다.
본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 세포에서 임의의 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는데 사용될 수 있다. 당업자는 임의의 특정 세포에서 변경될 바람직한 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 서열의 발현이 장애와 관련되거나, 그 외에는 세포로 병원체의 진입을 촉진하는 임의의 게놈 서열에 상응할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 세포에서 변경하기 위한 바람직한 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 질병 관련 단일 폴리뉴클레오티드 다형성을 함유하는 게놈 서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 이러한 예에서, 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 야생형 대립유전자로 대체함으로써 세포에서 질병 관련 SNP를 교정하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 병원체의 세포 내로의 진입 또는 증식을 담당하는 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열은 병원체가 세포로 진입하거나 세포 내부에서 증식하는 것을 방지하기 위해 표적 유전자의 기능을 방해하도록 결실 또는 삽입에 적합한 표적일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 서열이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 게놈 서열이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 포유동물 게놈 서열이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 척추동물 게놈 서열이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 Cas 단백질 및 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프에 대해 Cas 단백질을 지시하고 이에 혼성화할 수 있는 적어도 1개 내지 2개의 리보핵산을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "단백질" 및 "폴리펩티드"는 펩티드 결합 (즉, 아미노산의 중합체)에 의해 연결된 일련의 아미노산 잔기를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 변형된 아미노산 (예를 들어, 인산화, 당화, 글리코실화 등) 및 아미노산 유사체를 포함한다. 예시적인 폴리펩티드 또는 단백질은 유전자 생성물, 천연 발생 단백질, 상동체, 이원체, 단편 및 상기의 다른 등가물, 변이체, 및 유사체를 포함한다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 하나 이상의 아미노산 치환 또는 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에, 치환 및/또는 변형은 단백질 분해를 방지하거나 감소시킬 수 있고/있거나, 세포에서 폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 Cas 단백질은 펩티드 결합 치환 (예를 들어, 우레아, 티오우레아, 카르바메이트, 설포닐 우레아 등)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 Cas 단백질은 천연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 Cas 단백질은 대체 아미노산 (예를 들어, D-아미노산, 베타-아미노산, 호모시스테인, 포스포세린 등)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 모이어티 (예를 들어, PEG화, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 말단-캡핑 등)를 포함하도록 변형을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 코어 Cas 단백질을 포함한다. 예시적인 Cas 코어 단백질은 이에 제한되지는 않으나, Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8 및 Cas9를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 E. coli 서브타입의 Cas 단백질 (CASS2로도 공지됨)을 포함한다. 예시적인 E. Coli 서브타입의 Cas 단백질은 이에 제한되지는 않으나, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, 및 Cas5e를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Ypest 서브타입의 Cas 단백질 (CASS3으로도 공지됨)을 포함한다. 예시적인 Ypest 서브타입의 Cas 단백질은 이에 제한되지는 않으나, Csy1, Csy2, Csy3, 및 Csy4를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Nmeni 서브타입의 Cas 단백질 (CASS4로도 공지됨)을 포함한다. 예시적인 Nmeni 서브타입의 Cas 단백질은 이에 제한되지는 않으나, Csn1 및 Csn2를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Dvulg 서브타입의 Cas 단백질 (CASS1로도 공지됨)을 포함한다. 예시적인 Dvulg 서브타입의 Cas 단백질은 Csd1, Csd2, 및 Cas5d를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Tneap 서브타입의 Cas 단백질 (CASS7로도 공지됨)을 포함한다. 예시적인 Tneap 서브타입의 Cas 단백질은 이에 제한되지는 않으나, Cst1, Cst2, Cas5t를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Hmari 서브타입의 Cas 단백질을 포함한다. 예시적인 Hmari 서브타입의 Cas 단백질은 이에 제한되지는 않으나, Csh1, Csh2, 및 Cas5h를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Apern 서브타입의 Cas 단백질 (CASS5로도 공지됨)을 포함한다. 예시적인 Apern 서브타입의 Cas 단백질은 이에 제한되지는 않으나, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, 및 Cas5a를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Mtube 서브타입의 Cas 단백질 (CASS6으로도 공지됨)을 포함한다. 예시적인 Mtube 서브타입의 Cas 단백질은 이에 제한되지는 않으나, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, 및 Csm5를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 RAMP 모듈 Cas 단백질을 포함한다. 예시적인 RAMP 모듈 Cas 단백질은 이에 제한되지는 않으나, Cmr1, Cmr2, Cmr3, Cmr4, Cmr5, 및 Cmr6을 포함한다. 예를 들어, Klompe 등, Nature 571, 219-225 (2019); Strecker 등, Science 365, 48-53 (2019)을 참조한다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 본원에 기재된 Cas 단백질 중 임의의 하나 또는 이의 기능적 부분을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "기능적 부분"은 적어도 하나의 리보핵산 (예를 들어, 가이드 RNA (gRNA))을 갖는 복합체이며, 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 절단하는 이의 능력을 유지하는 펩티드의 부분을 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 기능적 부분은 DNA 결합 도메인, 적어도 하나의 RNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인, 및 엔도뉴클레아제 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 작동가능하게 연결된 Cas9 단백질 기능적 도메인의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 기능적 부분은 DNA 결합 도메인, 적어도 하나의 RNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인, 및 엔도뉴클레아제 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 작동가능하게 연결된 Cas12a (Cpf1로도 공지됨) 단백질 기능적 도메인의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 기능적 도메인은 복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질의 기능적 부분은 RuvC-유사 도메인의 기능적 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질의 기능적 부분은 HNH 뉴클레아제 도메인의 기능적 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질의 기능적 부분은 RuvC-유사 도메인의 기능적 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 외인성 Cas 단백질은 폴리펩티드 형태로 세포로 도입될 수 있다. 특정 구현예에서, Cas 단백질은 세포-투과성 폴리펩티드 또는 세포-투과성 펩티드에 접합되거나 융합될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "세포-투과성 폴리펩티드" 및 "세포-투과성 펩티드"는 각각 세포로 분자의 흡수를 촉진하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 지칭한다. 상기 세포-투과성 폴리펩티드는 검출가능한 표지를 함유할 수 있다.
특정 구현예에서, Cas 단백질은 (예를 들어, 양전하, 음전하 또는 전체 중성 전하를 운반하는) 하전된 단백질에 접합되거나 융합될 수 있다. 이러한 연결은 공유적일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 Cas 단백질은 세포를 침투하는 Cas 단백질의 능력을 현저히 증가시키기 위해 양전하로 하전된 GFP(superpositively charged GFP)에 융합될 수 있다 (Cronican 등, ACS Chem Biol. 2010; 5(8):747-52). 특정 구현예에서, 상기 Cas 단백질은 세포로 이의 진입을 촉진하기 위해 단백질 형질도입 도메인 (PTD)에 융합될 수 있다. 예시적인 PTD는 Tat, 올리고아르기닌, 및 페네트라틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 Cas9 단백질은 세포-투과성 펩티드에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 PTD에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 tat 도메인에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 올리고아르기닌 도메인에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 페네트라틴 도메인에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 양전하로 하전된 GFP에 융합된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질은 세포-투과성 펩티드에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질은 PTD에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질은 tat 도메인에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질은 올리고아르기닌 도메인에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질은 페네트라틴 도메인에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 단백질은 양전하로 하전된 GFP에 융합된 Cas12a 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas 단백질을 암호화하는 핵산의 형태로 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포로 도입될 수 있다. 핵산을 세포로 도입하는 과정은 임의의 적합한 기술에 의해 달성될 수 있다. 적합한 기술은 인산칼슘 또는 지질-매개 형질감염, 전기천공, 및 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 또는 감염을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 mRNA (예를 들어, 합성, 변형된 mRNA)를 포함한다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 1개 내지 2개의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 2개의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 1개의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 핵산 (예를 들어, 합성, 변형된 mRNA)에 의해 암호화된다.
본 발명의 방법은 Cas 단백질을 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프에 대해 지시하고 이에 혼성화될 수 있는 임의의 리보핵산의 사용을 고려한다. 일부 구현예에서, 리보핵산 중 적어도 하나는 트레이서RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 리보핵산 중 적어도 하나는 CRISPR RNA (crRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 리보핵산은 Cas 단백질을 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프에 지시하고 이에 혼성화되는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 리보핵산 중 적어도 하나는 Cas 단백질을 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프에 지시하고 이에 혼성화되는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 1개 내지 2개의 리보핵산 둘 다는 Cas 단백질을 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프에 지시하고 이에 혼성화되는 가이드 RNA를 포함한다. 본 발명의 리보핵산은 사용되는 특정 CRISPR/Cas 시스템, 및 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에 따라 다양한 상이한 표적 모티프에 혼성화되도록 선택될 수 있으며, 이는 당업자에 의해 이해될 것이다. 1개 내지 2개의 리보핵산은 또한 표적 폴리뉴클레오티드 서열 이외의 핵산 서열과의 혼성화를 최소화하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 1개 내지 2개의 리보핵산은 세포에서 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교할 때 적어도 2개의 미스매치를 함유하는 표적 모티프에 혼성화된다. 일부 구현예에서, 1개 내지 2개의 리보핵산은 세포에서 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교할 때 적어도 하나의 미스매치를 함유하는 표적 모티프에 혼성화된다. 일부 구현예에서, 1개 내지 2개의 리보핵산은 Cas 단백질에 의해 인식되는 데옥시리보핵산 모티프에 바로 인접한 표적 모티프에 혼성화되도록 설계된다. 일부 구현예에서, 1개 내지 2개의 리보핵산 각각은 표적 모티프 사이에 위치한 돌연변이 대립유전자의 측면에 있는 Cas 단백질에 의해 인식되는 데옥시리보핵산 모티프에 바로 인접한 표적 모티프에 혼성화되도록 설계된다.
일부 구현예에서, 1개 내지 2개의 리보핵산 각각은 Cas 단백질을 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프에 지시하고 이에 혼성화되는 가이드 RNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 리보핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 동일한 가닥 상의 서열에 상보적이고/이거나, 이에 혼성화된다. 일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 리보핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 반대 가닥 상의 서열에 상보적이고/이거나, 이에 혼성화된다. 일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 리보핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 반대 가닥 상의 서열에 상보적이지 않고/않거나, 이에 혼성화되지 않는다. 일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 리보핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 중첩된 표적 모티프에 상보적이고/이거나, 이에 혼성화된다. 일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 리보핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 오프셋 표적 모티프에 상보적이고/이거나, 이에 혼성화된다.
일부 구현예에서, Cas 단백질을 암호화하는 핵산 및 적어도 1개 내지 2개의 리보핵산을 암호화하는 핵산은 바이러스 형질도입 (예를 들어, 렌티바이러스 형질도입)을 통해 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 1개 내지 2개의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 2개의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 1개의 리보핵산과 복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 핵산 (예를 들어, 합성, 변형된 mRNA)에 의해 암호화된다.
본원에 기재된 유전자의 CRISPR/Cas-기반 표적화에 유용한 예시적인 gRNA 서열은 표 1에 제공되어 있다. 상기 서열은 2016년 5월 9일자에 출원된 WO2016183041호에서 확인할 수 있으며, 표, 부록, 및 서열 목록을 포함하는 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
표 1. 유전자 표적화에 유용한 예시적인 gRNA 서열
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일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 방법론을 사용하여 제조된다.
"TALE-뉴클레아제" (TALEN)는 전사 활성자 유사 이펙터 (TALE) 및 핵산 표적 서열을 절단하기 위한 하나의 뉴클레아제 촉매 도메인으로부터 전형적으로 유래된 핵산-결합 도메인으로 이루어진 융합 단백질을 의미한다. 상기 촉매 도메인은 바람직하게는 뉴클레아제 도메인이고, 보다 바람직하게는 예를 들면 I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-I와 같은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 도메인이다. 특정 구현예에서, 상기 TALE 도메인은 예를 들면 I-CreI 및 I-OnuI 또는 이의 기능적 변이체와 같은 메가뉴클레아제에 융합될 수 있다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 뉴클레아제는 단량체성 TALE-뉴클레아제이다. 단량체성 TALE-뉴클레아제는 WO2012138927호에 기재된 I-TevI의 촉매 도메인과 조작된 TAL 반복부의 융합과 같은 특이적 인식 및 절단을 위한 이량체화를 필요로 하지 않는 TALE-뉴클레아제이다. 크산토모나스 박테리아 종 유래 단백질인 전사 활성자 유사 이펙터 (TALE)는 복수의 반복된 서열을 포함하며, 각 반복은 핵산 표적화된 서열의 각 뉴클레오티드 염기에 특이적인 위치 12 및 13 (RVD)에 이중(di)-잔기를 포함한다. 유사한 모듈식 염기-당-염기(base-per-base) 핵산 결합 특성 (MBBBD)을 갖는 결합 도메인은 또한 다른 박테리아 종에서 출원인에 의해 최근에 발견된 새로운 모듈식 단백질로부터 유래될 수 있다. 새로운 모듈식 단백질은 TAL 반복부보다 더 많은 서열 가변성을 표시하는 이점을 갖는다. 바람직하게는, 상이한 뉴클레오티드의 인식과 관련된 RVD는 C를 인식하기 위한 HD, T를 인식하기 위한 NG, A를 인식하기 위한 NI, G 또는 A를 인식하기 위한 NN, A, C, G 또는 T를 인식하기 위한 NS, T를 인식하기 위한 HG, T를 인식하기 위한 IG, G를 인식하기 위한 NK, C를 인식하기 위한 HA, C를 인식하기 위한 ND, C를 인식하기 위한 HI, G를 인식하기 위한 HN, G를 인식하기 위한 NA, G 또는 A를 인식하기 위한 SN, 및 T를 인식하기 위한 YG, A를 인식하기 위한 TL, A 또는 G를 인식하기 위한 VT 및 A를 인식하기 위한 SW이다. 또 다른 구현예에서, 중요한 아미노산 12 및 13은 뉴클레오티드 A, T, C 및 G로 이들의 특이성을 조절하고, 특히 이 특이성을 향상시키기 위해 다른 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다. TALEN 키트는 상업적으로 판매된다.
일부 구현예에서, 세포는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 사용하여 조작된다. "징크 핑거 결합 단백질"은 아연 이온의 배위를 통한 단백질 구조의 안정화의 결과로서 바람직하게는 서열-특이적 방식으로 DNA, RNA 및/또는 단백질에 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 용어 징크 핑거 결합 단백질은 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 축약된다. 개별 DNA 결합 도메인은 전형적으로 "핑거"로 일컬어진다. ZFP는 적어도 하나의 핑거, 전형적으로 2개의 핑거, 3개의 핑거, 또는 6개의 핑거를 갖는다. 각 핑거는 2개 내지 4개의 DNA 염기쌍, 전형적으로 3개 내지 4개의 DNA 염기쌍에 결합한다. ZFP는 표적 부위 또는 표적 분절이라고 일컬어지는 핵산 서열에 결합한다. 각 핑거는 전형적으로 대략 30개의 아미노산, 아연-킬레이트, DNA-결합 서브도메인(subdomain)을 포함한다. 연구는 상기 부류의 단일 징크 핑거가 단일 베타 회전의 2개의 시스테인 잔기와 함께 아연과 배위된 2개의 불변 히스티딘 잔기를 포함하는 알파 나선으로 이루어짐을 입증하였다 (예를 들어, Berg & Shi, Science 271:1081-1085 (1996) 참조).
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 호밍 엔도뉴클레아제를 사용하여 제조된다. 상기 호밍 엔도뉴클레아제는 당업계에 잘 알려져 있다 (Stoddard 2005). 호밍 엔도뉴클레아제는 DNA 표적 서열을 인식하고, 단일- 또는 이중-가닥 파손을 생성한다. 호밍 엔도뉴클레아제는 12 내지 45 염기쌍 (bp) 길이 범위, 일반적으로 14 내지 40 bp 길이 범위의 DNA 표적 부위를 인식하는, 매우 특이적인 것이다. 본 발명에 따른 호밍 엔도뉴클레아제는 예를 들어 LAGLIDADG 엔도뉴클레아제, HNH 엔도뉴클레아제, 또는 GIY-YIG 엔도뉴클레아제에 상응할 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 호밍 엔도뉴클레아제는 I-CreI 변이체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 메가뉴클레아제를 사용하여 제조된다. 메가뉴클레아제는 정의상 큰 서열을 인식하는 서열-특이적 엔도뉴클레아제이다 (Chevalier, B. S. 및 B. L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-3774). 이들은 살아있는 세포의 독특한 부위를 절단함으로써, 절단 부위 부근에서 유전자 표적화를 1000배 또는 그 이상까지 향상시킬 수 있다 (Puchta 등, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 5034-5040; Rouet 등, Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096-8106; Choulika 등, Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968-1973; Puchta 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 5055-5060; Sargent 등, Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 267-77; Donoho 등, Mol. Cell. Biol, 1998, 18, 4070-4078; Elliott 등, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93-101; Cohen-Tannoudji 등, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 1444-1448).
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 폴리펩티드, 예컨대 면역관용 인자의 발현을 녹다운 (예를 들어, 감소, 제거, 또는 억제)시키기 위해 RNA 침묵 또는 RNA 간섭 (RNAi)을 사용하여 제조된다. 유용한 RNAi 방법은 합성 RNAi 분자, 짧은 간섭 RNA (siRNA), PIWI-상호작용 NRA (piRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA), 및 당업자가 인식하는 기타 일시적인 녹다운 방법을 활용하는 것들을 포함한다. 서열 특이적 shRNA, siRNA, miRNA 등을 포함하는 RNAi용 시약은 상업적으로 이용가능하다. 예를 들면, CIITA는 세포로 CIITA siRNA를 도입하거나 CIITA shRNA-발현 바이러스를 형질도입함으로써 만능 줄기 세포에서 녹다운될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 간섭은 CIITA, B2M, 및 NLRC5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 발현을 감소 또는 억제하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 면역-특권 또는 저면역원성 세포를 생성하기 위해 (표적 폴리펩티드를 포함하는) 하나 이상의 면역 인자의 발현을 감소시키도록 유전적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포 및 CAR-T 세포)는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키기 위한 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. 상기 표적 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 비제한적인 예는 CIITA, B2M, NLRC5, CTLA4, PD1, HLA-A, HLA-BM, HLA-C, RFX-ANK, NFY-A, RFX5, RFX-AP, NFY-B, NFY-C, IRF1, 및 TAP1을 포함한다.
일부 측면에서, 상기 유전적 변형은 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 일어난다. 하나 또는 복수의 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절 (예를 들어, 감소 또는 결실) 함으로써, 상기 세포는 수용자 대상체로 이식될 때 감소된 면역 활성화를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 예를 들어, 투여 시 수용자 대상체 또는 환자에서 저면역원성으로 간주된다.
K. 면역관용 인자의 과발현 방법
수용자 대상체에 투여시 면역 반응을 촉발하거나 활성화되지 않는 세포가 본원에 제공된다. 상기 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서, 상기 세포는 수용자에서 면역 인식 및 관용에 영향을 미치는 유전자 및 면역관용 (예를 들어, 면역) 인자의 발현을 증가시키도록 변형된다.
특정 구현예에서, 본원에 열거된 하나 이상의 표적 단백질의 발현을 조절하는 게놈 변형을 보유하는 본원에 개시된 임의의 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 분화된 세포, 조혈 줄기 세포, 1차 T 세포 및 CAR-T 세포)는 또한 하나 이상의 면역관용 인자를 발현하도록 변형된다. 예시적인 면역관용 인자는, 제한 없이, CD24, CD47, DUX4, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, FasL, CCL21, CCL22, Mfge8, 및 Serpinb9 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역관용 인자는 CD24, CD47, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, FasL, CCL21, CCL22, Mfge8, 및 Serpinb9를 포함하는 군으로부터 선택된다.
인간 CD27 (CD27L 수용체, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 7, TNFSF7, T 세포 활성화 항원 S152, Tp55, 및 T14로도 공지됨)에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC12P008144, HGNC 번호 11922, NCBI 유전자 ID 939, Uniprot 번호 P26842, 및 NCBI 참조서열 번호 NM_001242.4 및 NP_001233.1에 제공된다.
인간 CD46에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC01P207752, HGNC 번호 6953, NCBI 유전자 ID 4179, Uniprot 번호 P15529, 및 NCBI 참조서열 번호 NM_002389.4, NM_153826.3, NM_172350.2, NM_172351.2, NM_172352.2 NP_758860.1, NM_172353.2, NM_172359.2, NM_172361.2, NP_002380.3, NP_722548.1, NP_758860.1, NP_758861.1, NP_758862.1, NP_758863.1, NP_758869.1, 및 NP_758871.1에 제공된다.
인간 CD55 (보체 붕괴-촉진 인자로도 공지됨)에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC01P207321, HGNC 번호 2665, NCBI 유전자 ID 1604, Uniprot 번호 P08174, 및 NCBI 참조서열 번호 NM_000574.4, NM_001114752.2, NM_001300903.1, NM_001300904.1, NP_000565.1, NP_001108224.1, NP_001287832.1, 및 NP_001287833.1에 제공된다.
인간 CD59에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC11M033704, HGNC 번호 1689, NCBI 유전자 ID 966, Uniprot 번호 P13987, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_000602.1, NM_000611.5, NP_001120695.1, NM_001127223.1, NP_001120697.1, NM_001127225.1, NP_001120698.1, NM_001127226.1, NP_001120699.1, NM_001127227.1, NP_976074.1, NM_203329.2, NP_976075.1, NM_203330.2, NP_976076.1, 및 NM_203331.2에 제공된다.
인간 CD200에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC03P112332, HGNC 번호 7203, NCBI 유전자 ID 4345, Uniprot 번호 P41217, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_001004196.2, NM_001004196.3, NP_001305757.1, NM_001318828.1, NP_005935.4, NM_005944.6, XP_005247539.1, 및 XM_005247482.2에 제공된다.
인간 HLA-C에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC06M031272, HGNC 번호 4933, NCBI 유전자 ID 3107, Uniprot 번호 P10321, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_002108.4 및 NM_002117.5에 제공된다.
인간 HLA-E에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC06P047281, HGNC 번호 4962, NCBI 유전자 ID 3133, Uniprot 번호 P13747, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_005507.3 및 NM_005516.5에 제공된다.
인간 HLA-G에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC06P047256, HGNC 번호 4964, NCBI 유전자 ID 3135, Uniprot 번호 P17693, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_002118.1 및 NM_002127.5에 제공된다.
인간 PD-L1 또는 CD274에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC09P005450, HGNC 번호 17635, NCBI 유전자 ID 29126, Uniprot 번호 Q9NZQ7, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_001254635.1, NM_001267706.1, NP_054862.1, 및 NM_014143.3에 제공된다.
인간 IDO1에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC08P039891, HGNC 번호 6059, NCBI 유전자 ID 3620, Uniprot 번호 P14902, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_002155.1 및 NM_002164.5에 제공된다.
인간 IL-10에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC01M206767, HGNC 번호 5962, NCBI 유전자 ID 3586, Uniprot 번호 P22301, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_000563.1 및 NM_000572.2에 제공된다.
인간 Fas 리간드 (FasL, FASLG, CD178, TNFSF6 등으로도 공지됨)에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC01P172628, HGNC 번호 11936, NCBI 유전자 ID 356, Uniprot 번호 P48023, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_000630.1, NM_000639.2, NP_001289675.1, 및 NM_001302746.1에 제공된다.
인간 CCL21에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC09M034709, HGNC 번호 10620, NCBI 유전자 ID 6366, Uniprot 번호 O00585, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_002980.1 및 NM_002989.3에 제공된다.
인간 CCL22에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC16P057359, HGNC 번호 10621, NCBI 유전자 ID 6367, Uniprot 번호 O00626, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_002981.2, NM_002990.4, XP_016879020.1, 및 XM_017023531.1에 제공된다.
인간 Mfge8에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC15M088898, HGNC 번호 7036, NCBI 유전자 ID 4240, Uniprot 번호 Q08431, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_001108086.1, NM_001114614.2, NP_001297248.1, NM_001310319.1, NP_001297249.1, NM_001310320.1, NP_001297250.1, NM_001310321.1, NP_005919.2, 및 NM_005928.3에 제공된다.
인간 SerpinB9에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC06M002887, HGNC 번호 8955, NCBI 유전자 ID 5272, Uniprot 번호 P50453, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_004146.1, NM_004155.5, XP_005249241.1, 및 XM_005249184.4에 제공된다.
인간 CD35 (보체 수용체 유형 1 (CR1), C3b/C4b 수용체 (C3BR), C4Br, 놉 혈액형군 항원, 및 C3-결합 도메인으로도 공지됨)에 대한 유용한 게놈, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 정보는 예를 들어, GeneCard 식별자 GC01P207496, HGNC 번호 2334, NCBI 유전자 ID 1378, Uniprot 번호 P17927, 및 NCBI 참조서열 번호 NP_000564.2, NM_000573.3, NP_000642.3, 및 NM_000651.4에 제공된다.
유전자 및 인자 (단백질)의 발현을 조절하는 방법은 게놈 편집 기술, 및, RNA 또는 단백질 발현 기술 등을 포함한다. 이들 기술 모두에 대해, 잘 알려진 재조합 기술이 사용되어 본원에 개괄된 바와 같은 재조합 핵산을 생성한다.
특정 구현예에서, 면역관용 인자를 암호화하는 재조합 핵산은 발현 구축물에서 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 치료될 숙주 세포 및 수용자 대상체에 적절할 것이다. 수많은 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 다양한 숙주 세포에 대해 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 이에 제한되지는 않으나, 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 시작 및 종결 서열, 번역 시작 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성자 서열을 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터가 또한 고려된다. 프로모터는 자연 발생 프로모터이거나, 하나 이상의 프로모터의 요소를 결합하는 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 구축물은 플라스미드와 같은 에피솜 상의 세포에 존재할 수 있거나, 상기 발현 구축물은 염색체에 삽입될 수 있다. 특정 구현예에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 선택적 마커 유전자를 포함한다. 특정 구현예는 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 본원에서 사용하기 위한 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 및 기타 발현 조절 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 벡터는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 발현되기를 원하는 특정 변이체 폴리펩티드, 벡터의 카피 수, 그 카피 수를 제어하는 능력, 또는 벡터에 의해 암호화되는 임의의 다른 단백질, 예컨대 항생제 마커의 발현을 위해 설계된다.
적합한 포유동물 프로모터의 예는 예를 들어 하기 유전자로부터의 프로모터를 포함한다: 햄스터의 유비퀴틴/S27a 프로모터 (WO 97/15664), 유인원 공포 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV)의 긴 말단 반복 영역, 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터 (MMTV), 모로니 뮤린 백혈병 바이러스 긴 말단 반복 영역, 및 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV)의 초기 프로모터. 다른 이종 포유동물 프로모터의 예는 액틴, 면역글로불린 또는 열 충격 프로모터(들)이다. 추가 구현예에서, 포유동물 숙주 세포에 사용하기 위한 프로모터는 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (UK 2,211,504 공개, 1989년 7월 5일), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 유인원 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 수득할 수 있다. 추가 구현예에서, 이종 포유동물 프로모터가 사용된다. 예에는 액틴 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 및 열-충격 프로모터가 포함된다. SV40의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스의 복제기점(origin of replication)을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다 (Fiers 등, Nature 273: 113-120 (1978)). 인간 사이토메갈로바이러스의 즉각적인 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다 (Greenaway 등, 유전자 18: 355-360 (1982)). 상기 참고문헌은 이들의 전체가 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 표적 유전자 (예를 들어, CD24, CD47, 또는 다른 면역관용 인자)의 발현은 (1) 내인성 CD24, CD47, 또는 기타 유전자에 특이적인 부위-특이적 결합 도메인 및 (2) 전사 활성자를 함유하는 융합 단백질 또는 단백질 복합체의 발현에 의해 증가된다.
일부 구현예에서, 상기 조절 인자는 부위 특이적 DNA-결합 핵산 분자, 예컨대 가이드 RNA (gRNA)로 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)로도 공지된 ZFP를 함유하는 융합 단백질 또는 징크 핑거 단백질(ZFP)과 같은 부위 특이적 DNA-결합 표적화된 단백질에 의해 달성된다.
일부 측면에서, 상기 조절 인자는 표적화된 영역에서 유전자에 특이적으로 결합하거나 하이브리드화되는 DNA 결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산을 사용하는 것과 같은 부위-특이적 결합 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 제공된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 부위-특이적 뉴클레아제, 예컨대 변형된 뉴클레아제와 커플링되거나 복합화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 투여는 변형된 뉴클레아제의 DNA-표적화 단백질, 예컨대 메가뉴클레아제 또는 RNA-가이드된 뉴클레아제, 예컨대 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 핵산 (CRISPR)-Cas 시스템, 예컨대 CRISPR-Cas9 시스템을 포함하는 융합을 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결여되도록 변형된다. 일부 구현예에서, 상기 변형된 뉴클레아제는 촉매적으로 사멸된 dCas9이다.
일부 구현예에서, 상기 부위 특이적 결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열. 또한, 미국등록특허 제5,420,032호; 미국등록특허 제6,833,252호; Belfort 등, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon 등, (1989) Gene 82:115-118; Perler 등, (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble 등, (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast 등, (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs 카탈로그를 참조한다. 또한, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비천연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, Chevalier 등, (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat 등, (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth 등, (2006) Nature 441:656-659; Paques 등, (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; 미국공개특허 제2007/0117128호를 참조한다.
징크 핑거, TALE 및 CRISPR 시스템 결합 도메인은, 예를 들어 자연 발생 징크 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작 (하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 조작된 DNA 결합 단백질 (징크 핑거 또는 TALE)은 비-자연적 발생 단백질이다. 설계를 위한 합리적인 기준에는 기존 ZFP 및/또는 TALE 설계의 정보 및 결합 데이터를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 대체 규칙 및 컴퓨터화된 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 미국등록특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호를 참조하고; 또한, WO 98/53058호; WO 98/53059호; WO 98/53060호; WO 02/016536호 및 WO 03/016496호 및 미국공개특허 제20110301073호를 참조한다.
일부 구현예에서, 상기 부위-특이적 결합 도메인은 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 하나 이상의 징크-핑거 단백질 (ZFP) 또는 이의 도메인을 포함한다. ZFP 또는 이의 도메인은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화된 결합 도메인 내의 아미노산 서열 영역인 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 더 큰 단백질 내의 단백질 또는 도메인이다.
ZFP 중에는 개별 핑거의 조립에 의해 생성된 특정 DNA 서열, 전형적으로 9-18개의 뉴클레오티드 길이를 표적화하는 인공 ZFP 도메인이 있다. ZFP는 단일 핑거 도메인이 대략 30개 길이의 아미노산이며, 단일 베타 회전의 2개의 시스테인과 아연을 통해 배위된 2개의 불변 히스티딘 잔기를 함유하고, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 핑거를 갖는 알파 나선을 함유하는 것들을 포함한다. 일반적으로, ZFP의 서열-특이성은 징크 핑거 인식 나선 상의 4개의 나선 위치 (-1, 2, 3 및 6)에서 아미노산 치환을 함으로써 변경될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, ZFP 또는 ZFP-함유 분자는 비-자연적 발생이며, 예를 들어 선택되는 표적 부위에 결합하도록 조작된다. 예를 들어, Beerli 등 (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo 등 (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan 등 (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal 등 (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo 등 (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; 미국등록특허 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,503,717호; 제6,689,558호; 제7,030,215호; 제6,794,136호; 제7,067,317호; 제7,262,054호; 제7,070,934호; 제7,361,635호; 제7,253,273호; 및 미국공개특허 제2005/0064474호; 제2007/0218528호; 제2005/0267061호를 참조하고, 이들 전체가 본원에 참조로 모두 포함된다.
많은 유전자-특이적으로 조작된 징크 핑거는 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)와 협업하여 징크-핑거 구성을 위한 플랫폼 (CompoZr)을 개발하여, 연구자들이 징크-핑거 구성 및 검증을 완전히 우회할 수 있도록 하며, 수천 개의 단백질에 대해 특이적으로 표적화된 징크 핑거를 제공한다 (Gaj 등, Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). 일부 구현예에서, 상업적으로 이용가능한 징크 핑거가 사용되거나 맞춤 설계된 것이다.
일부 구현예에서, 상기 부위-특이적 결합 도메인은 자연 발생 또는 조작된 (비-자연적 발생) 전사 활성자-유사 단백질 (TAL) DNA 결합 도메인, 예컨대, 전사 활성자-유사 단백질 이펙터 (TALE) 단백질을 포함하며, 예를 들어, 미국공개특허 제20110301073호를 참조하고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 부위-특이적 결합 도메인은 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 일반적으로, "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr (트랜스-활성화 CRISPR) 서열 (예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복" 및 tracrRNA-처리 부분 직접 반복 포함), 가이드 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서" 또는 "표적화 서열"로도 지칭됨), 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터의 기타 서열 및 전사체를 포함하여, CRISPR-관련 ("Cas") 유전자의 발현에 관련되거나 활성을 지시하는 전사체 및 기타 요소를 집합적으로 지칭한다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화되고, 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하기 위해, 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50% 또는 약 50% 이상, 약 60% 또는 약 60% 이상, 약 75% 또는 약 75% 이상, 약 80% 또는 약 80% 이상, 약 85% 또는 약 85% 이상, 약 90% 또는 약 90% 이상, 약 95% 또는 약 95% 이상, 약 97.5% 또는 약 97.5% 이상, 약 99% 또는 약 99% 이상, 또는 그 이상이다. 일부 예에서, gRNA의 표적화 도메인은 표적 핵산 상의 표적 서열에 대해 상보적, 예를 들어, 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상보적, 예를 들어, 완전히 상보적이다.
일부 구현예에서, 상기 표적 부위는 표적 유전자의 전사 개시 부위의 상류이다. 일부 측면에서, 상기 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위에 인접한다. 일부 측면에서, 상기 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 하류의 RNA 폴리머라제 정지 부위에 인접한다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 전사 개시, 하나 이상의 전사 인핸서 또는 활성자의 결합, 및/또는 RNA 폴리머라제의 결합을 촉진하기 위해, 표적 유전자의 프로모터 영역을 표적화하도록 구성된다. 하나 이상의 gRNA는 유전자의 프로모터 영역을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 유전자의 하나 이상의 영역이 표적화될 수 있다. 특정 측면에서, 상기 표적 부위는 유전자의 전사 시작 부위 (TSS)의 양쪽에서 600개 염기쌍 이내이다.
프로모터 및 활성자를 포함하는 조절 영역의 서열 및 엑손 서열을 포함하는, 유전자를 표적화하는 서열이거나 이를 포함하는 gRNA 서열을 설계하거나 확인하기 위한 것은 당업자의 수준 이내이다. CRISPR 게놈 편집을 위한 게놈-전체 gRNA 데이터베이스는 공개적으로 이용가능하며, 이는 인간 게놈 또는 마우스 게놈에 있는 유전자의 구성적 엑손에 예시적인 단일 가이드 RNA (sgRNA) 표적 서열을 포함한다 (예를 들어, genescript.com/gRNA-database.html 참조; 또한, Sanjana 등 (2014) Nat. Methods, 11:783-4; www.e-crisp.org/E-CRISP/; crispr.mit.edu/ 참조). 일부 구현예에서, gRNA 서열은 비-표적 유전자에 대한 최소의 표적외(off-target) 결합을 갖는 서열이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 조절 인자는 기능적 도메인, 예를 들어, 전사 활성자를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 전사 활성자는 표적 유전자의 하나 이상의 전사 제어 요소와 같은 하나 이상의 조절 요소이거나 이를 함유하며, 이에 의해 상기 제공된 바와 같은 부위-특이적 도메인은 상기 유전자의 발현을 유도하는 것으로 인식된다. 일부 구현예에서, 전사 활성자는 표적 유전자의 발현을 유도한다. 일부 경우에, 전사 활성자는 이종 전사활성화 도메인의 전부 또는 일부일 수 있거나, 이를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 전사 활성자는 단순 포진-유도된 전사활성화 도메인, Dnmt3a 메틸트랜스퍼라제 도메인, p65, VP16 및 VP64로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 조절 인자는 징크 핑거 전사 인자 (ZF-TF)이다. 일부 구현예에서, 상기 조절 인자는 VP64-p65-Rta (VPR)이다.
특정 구현예에서, 상기 조절 인자는 전사 조절 도메인을 더 포함한다. 공통 도메인은 예를 들어, 전사 인자 도메인 (활성자, 억제자, 공동-활성자, 공동-억제자), 침묵자, 종양유전자 (예를 들어, myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos 패밀리 구성원 등); DNA 복구 효소 및 이들의 관련 인자 및 변형자(modifier); DNA 재배열 효소 및 이들의 관련 인자 및 변형자; 염색질 관련 단백질 및 이들의 변형자 (예를 들어, 키나제, 아세틸라제 및 데아세틸라제); 및 DNA 변형 효소 (예를 들어, 메틸트랜스퍼라제 예컨대, DNMT 패밀리의 구성원 (예를 들어, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L 등, 토포이소머라제, 헬리카제, 리가제, 키나제, 포스파타제, 폴리머라제, 엔도뉴클레아제) 및 이들의 관련 인자 및 변형자를 포함한다. 예를 들어, 미국공개특허 제2013/0253040호를 참조하고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
활성화를 달성하는 데 적합한 도메인은 HSV VP 16 활성화 도메인 (예를 들어, Hagmann 등, J. Virol. 71, 5952-5962 (1 97) 참조) 핵 호르몬 수용체 (예를 들어, Torchia 등, Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998) 참조); 핵 인자 카파 B의 p65 서브유닛 (Bitko & Bank, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) 및 Doyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)); Liu 등, Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)), 또는 인공 키메라 기능적 도메인, 예컨대 VP64 (Beerli 등, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14623-33), 및 데그론 (Molinari 등, (1999) EMBO J. 18, 6439-6447)을 포함한다. 추가의 예시적인 활성화 도메인은 Oct 1, Oct-2A, Spl, AP-2, 및 CTF1 (Seipel 등, EMBOJ. 11, 4961-4968 (1992) 뿐만 아니라 p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, AtHD2A 및 ERF-2를 포함한다. 예를 들어, Robyr 등, (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood 등, (1999) J. Mol. Endocrinol 23:255-275; Leo 등, (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKenna 등, (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik 등, (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; 및 Lemon 등, (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504을 참조한다. 추가의 예시적인 활성화 도메인은 이에 제한되지는 않으나, OsGAI, HALF-1, Cl, AP1, ARF-5, -6,-1, 및 -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, 및 TRAB1을 포함하고, 예를 들어, Ogawa 등, (2000) Gene 245:21-29; Okanami 등, (1996) Genes Cells 1 :87-99; Goff 등, (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho 등, (1999) Plant Mol Biol 40:419-429; Ulmason 등, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels 등, (2000) Plant J. 22:1-8; Gong 등, (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; 및 Hobo 등, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353을 참조한다.
유전적 억제자를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 억제 도메인은 이에 제한되지는 않으나, KRAB A/B, KOX, TGF-베타-유도성 초기 유전자 (TIEG), v-erbA, SID, MBD2, MBD3, DNMT 패밀리의 구성원 (예를 들어, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L 등), Rb, 및 MeCP2를 포함한다. 예를 들어, Bird 등, (1999) Cell 99:451-454; Tyler 등, (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler 등, (1999) Cell 99:447-450; 및 Robertson 등, (2000) Nature Genet. 25:338-342을 참조한다. 추가의 예시적인 억제 도메인은 이에 제한되지는 않으나, ROM2 및 AtHD2A를 포함한다. 예를 들어, Chem 등, (1996) Plant Cell 8:305-321; 및 Wu 등, (2000) Plant J. 22:19-27를 참조한다.
일부 경우에, 상기 도메인은 염색체의 후성적 조절에 관여한다. 일부 구현예에서, 상기 도메인은 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT), 예를 들어, 유형-A, 핵 국소화된 것, 예컨대, MYST 패밀리 구성원 MOZ, Ybf2/Sas3, MOF, 및 Tip60, GNAT 패밀리 구성원 Gcn5 또는 pCAF, p300 패밀리 구성원 CBP, p300 또는 Rttl09 (Bemdsen 및 Denu (2008) Curr Opin Struct Biol l8(6):682-689)이다. 다른 경우에, 상기 도메인은 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 예컨대 클래스 I (HDAC-l, 2, 3, 및 8), 클래스 II (HDAC IIA (HDAC-4, 5, 7 및 9), HD AC IIB (HDAC 6 및 10)), 클래스 IV (HDAC-l 1), 클래스 III (시르투인 (SIRT); SIRT1-7로도 공지됨)이다 (Mottamal 등, (2015) Molecules 20(3):3898-394l 참조). 일부 구현예에서 사용되는 또 다른 도메인은 히스톤 포스포릴라제 또는 키나제이고, 상기 예는 MSK1, MSK2, ATR, ATM, DNA-PK, Bubl, VprBP, IKK-a, PKCpi, Dik/Zip, JAK2, PKC5, WSTF 및 CK2를 포함한다. 일부 구현예에서, 메틸화 도메인이 사용되고, Ezh2, PRMT1/6, PRMT5/7, PRMT 2/6, CARM1, set7/9, MLL, ALL-1, Suv 39h, G9a, SETDB1, Ezh2, Set2, Dotl, PRMT 1/6, PRMT 5/7, PR-Set7 및 Suv4-20h와 같은 군으로부터 선택될 수 있다. 수모화(sumoylation) 및 비오틴화에 관여하는 도메인 (Lys9, 13, 4, 18 및 12)이 또한 일부 구현예에서 사용될 수 있다 (리뷰, Kousarides (2007) Cell 128:693-705 참조).
융합 분자는 당업자에게 잘 알려진 클로닝 및 생화학적 접합 방법에 의해 구축된다. 융합 분자는 DNA-결합 도메인 및 기능적 도메인 (예를 들어, 전사 활성화 또는 억제 도메인)을 포함한다. 융합 분자는 또한 선택적으로 (예를 들어, SV40 매질 T-항원으로부터의 것과 같은) 핵 국소화 신호 및 (예를 들어, FLAG 및 혈구응집소와 같은) 에피토프 태그를 포함한다. 융합 단백질 (및 이를 암호화하는 핵산)은 번역 리딩 프레임이 융합 성분들 사이에 보유되도록 설계된다.
한편으로는 기능적 도메인 (또는 이의 기능적 단편)의 폴리펩티드 성분과, 다른 한편으로는 비-단백질 DNA-결합 도메인 (예를 들어, 항생제, 삽입제, 작은 홈 결합제, 핵산) 간의 융합물은 당업자에게 공지된 생화학적 접합 방법에 의해 구축된다. 예를 들어, Pierce Chemical Company (Rockford, IL) 카탈로그를 참조한다. 작은 홈 결합제와 폴리펩티드 간의 융합물 제조 방법 및 조성물이 기재되어 있다. Mapp 등, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935. 마찬가지로, 폴리펩티드 성분 기능 도메인과 관련된 sgRNA 핵산 성분을 포함하는 CRISPR/Cas TF 및 뉴클레아제가 또한 당업자에게 공지되어 있고, 본원에서 상세화된다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 세포로 도입하는 과정은 임의의 적합한 기술에 의해 달성될 수 있다. 적합한 기술은 인산칼슘 또는 지질-매개 형질감염, 전기천공, 및 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 또는 감염을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입 (예를 들어, 렌티바이러스 형질도입)을 통해 세포로 도입된다.
본원에 기재된 임의의 분자의 발현의 존재는 일단 변경되면, 공지된 기술, 예컨대 웨스턴 블롯, ELISA 검정법, FACS 검정법 등을 사용하여 분석될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 "자살 유전자" 또는 "자살 스위치"를 포함하는 저면역원성 만능 세포를 제공한다. 이는 혼입되어 부적절한 방식으로 성장하고 분열할 경우 저면역원성 만능 세포의 사멸을 유발할 수 있는 "안전 스위치"로 기능한다. 상기 "자살 유전자" 절제 접근법은 특정 화합물에 의해 활성화될 때만 세포 사멸을 야기하는 단백질을 암호화하는 유전자 전달 벡터에 자살 유전자를 포함한다. 자살 유전자는 무독성 화합물을 고독성 대사 산물로 선택적으로 전환하는 효소를 암호화할 수 있다. 그 결과 효소를 발현하는 세포가 특이적으로 제거된다. 일부 구현예에서, 자살 유전자는 헤르페스바이러스 티미딘 키나제 (HSV-tk) 유전자이고, 유발제는 간시클로버이다. 다른 구현예에서, 자살 유전자는 대장균 시토신 데아미나제 (EC-CD) 유전자이고, 유발제는 5-플루오로시토신 (5-FC)이다 (Barese 등, Mol. Therap. 20(10): 1932-1943 (2012), Xu 등, Cell Res. 8:73-8 (1998), 둘 모두 이들 전체가 본원에 참조로 포함됨).
다른 구현예에서, 자살 유전자는 유도성 카스파제 단백질이다. 유도성 카스파제 단백질은 아폽토시스를 유도할 수 있는 카스파제 단백질의 적어도 일부를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 유도성 카스파제 단백질은 iCasp9이다. 이는 일련의 아미노산을 통해 인간 카스파제 9를 암호화하는 유전자에 연결된 F36V 돌연변이를 갖는 인간 FK506-결합 단백질인 FKBP12의 서열을 포함한다. FKBP12-F36V는 소분자 이량체화제인 AP1903에 고친화도로 결합한다. 따라서, 본 발명에서 iCasp9의 자살 기능은 화학적 이량체화 유도제 (CID)의 투여에 의해 유발된다. 일부 구현예에서, CID는 소분자 약물 API 903이다. 이량체화는 아폽토시스의 빠른 유도를 야기한다 (WO2011146862호; Stasi 등, N. Engl. J. Med 365;18 (2011); Tey 등, Biol. Blood Marrow Transplant. 13:913-924 (2007) 참조, 이들 각각은 이들 전체가 본원에 참조로 포함됨).
L. 유도 만능 줄기 세포의 생성
본 발명은 저면역원성 만능 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 만능 줄기 세포를 생성하는 것을 포함한다. 마우스 및 인간 만능 줄기 세포 (일반적으로 iPSC; 뮤린 세포의 경우 miPSC 또는 인간 세포의 경우 hiPSC로 지칭됨)의 생성은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, iPCS의 생성을 위한 다양한 상이한 방법이 있다. 원래 유도는 4가지 전사 인자인, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4의 바이러스 도입을 사용하여 마우스 배아 또는 성체 섬유아세포에서 수행되었으며; Takahashi 및 Yamanaka Cell 126:663-676 (2006)을 참조하고, 이로써 그 전체가 그리고 구체적으로 본원에 개괄된 기술에 대해 참조로 포함된다. 그 이후로, 다수의 방법이 개발되었으며; 리뷰의 경우 Seki 등, World J. Stem Cells 7(1): 116-125 (2015), 및 Lakshmipathy 및 Vermuri, 편집자, Methods in Molecular Biology: Pluripotent Stem Cells, Methods and Protocols, Springer 2013을 참조하고, 이로써 이 둘 모두는 이들 전체가, 그리고 특히 hiPSC를 생성하는 방법에 대해 참조로 명시적으로 포함된다 (예를 들어, 후자 참조의 제3장 참조).
일반적으로, iPSC는 통상 에피솜 벡터를 사용하여 도입된, 숙주 세포에서 하나 이상의 재프로그래밍 인자"의 일시적인 발현에 의해 생성된다. 이러한 조건 하에서, 소량의 세포는 iPSC가 되도록 유도된다 (일반적으로, 선택 마커가 사용되지 않으므로, 이 단계의 효율성은 낮음). 일단 세포가 "재프로그래밍" 되고, 만능이 되면, 이들은 에피솜 벡터(들)을 잃고 내인성 유전자를 사용하여 인자를 생성한다.
또한 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 사용될 수 있거나 사용되는 재프로그래밍 인자의 수는 변할 수 있다. 일반적으로, 더 적은 수의 재프로그래밍 인자가 사용되는 경우, 세포를 만능 상태로 전환하는 효율성 뿐만 아니라 "만능성"이 저하되고, 예를 들어, 더 적은 수의 재프로그래밍 인자는 세포가 완전히 만능이 아니지만 더 적은 수의 세포 유형으로만 분화될 수 있는 결과를 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 1개의 재프로그래밍 인자, OCT4가 사용된다. 다른 구현예에서, 2개의 재프로그래밍 인자, OCT4 및 KLF4가 사용된다. 다른 구현예에서, 3개의 재프로그래밍 인자, OCT4, KLF4 및 SOX2가 사용된다. 다른 구현예에서, 4개의 재프로그래밍 인자, OCT4, KLF4, SOX2 및 c-Myc가 사용된다. 다른 구현예에서, 5개, 6개 또는 7개의 재프로그래밍 인자는 SOKMNLT; SOX2, OCT4 (POU5F1), KLF4, MYC, NANOG, LIN28, 및 SV40L T 항원으로부터 선택하여 사용할 수 있다. 일반적으로, 이들 재프로그래밍 인자 유전자는 당업계에 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능한 것과 같은 에피솜 벡터 상에 제공된다.
일반적으로, 당업계에 공지된 바와 같이, iPSC는 본원에 기재된 바와 같은 재프로그래밍 인자를 일시적으로 발현시킴에 의해, 비-만능 세포, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 혈액 세포, 섬유아세포 등으로부터 제조된다.
M. 저면역원성 표현형 및 만능성 유지에 대한 검정
일단 저면역원성 세포가 생성되면, 이들은 WO2016183041호 및 WO2018132783호에 기재된 바와 같이 이들의 저면역원성 및/또는 만능성의 유지에 대해 검정될 수 있다.
일부 구현예에서, 저면역원성은 WO2018132783호의 도 13 및 도 15에 예시된 바와 같은 다수의 기술을 사용하여 검정된다. 이러한 기술에는 동종이형 숙주로의 이식 및 숙주 면역 체계를 회피하는 저면역원성 만능 세포의 성장 (예를 들어, 기형종)에 대한 모니터링이 포함된다. 일부 경우에, 저면역원성 만능 세포 유도체는 루시퍼라제를 발현하도록 형질도입된 다음 생물발광 이미징을 사용하여 따를 수 있다. 유사하게, 상기 세포에 대한 숙주 동물의 T 세포 및/또는 B 세포 반응은 세포가 숙주 동물에서 면역 반응을 일으키지 않음을 확인하기 위해 테스트된다. T 세포 기능은 Elispot, ELISA, FACS, PCR, 또는 질량 세포 분석법 (CYTOF)으로 평가될 수 있다. B 세포 반응 또는 항체 반응은 FACS 또는 Luminex를 사용하여 평가된다. 추가적으로 또는 대안적으로, WO2018132783호의 도 14 및 15에 일반적으로 나타낸 바와 같이, 세포는 선천 면역 반응, 예를 들어 NK 세포 사멸을 회피하는 이들의 능력에 대해 검정될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 면역원성은 T 세포 면역검정, 예컨대 당업자에 의해 인식되는 T 세포 증식 검정, T 세포 활성화 검정, 및 T 세포 사멸 검정을 사용하여 평가된다. 일부 경우에, T 세포 증식 검정은 인터페론-감마로 세포를 전처리하고, 표지된 T 세포와 세포를 공동 배양하여 미리 선택된 일정 정도의 시간 후에 T 세포 집단 (또는 증식하는 T 세포 집단)의 존재를 검정하는 것을 포함한다. 일부 경우에, T 세포 활성화 검정은 T 세포를 본원에 개괄된 세포와 공동 배양하고, T 세포에서 T 세포 활성화 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다.
생체내 검정은 본원에 개괄된 세포의 면역원성을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 저면역원성 세포의 생존 및 면역원성은 동종이형 인간화 면역결핍 마우스 모델을 사용하여 결정된다. 일부 경우에, 저면역원성 만능 줄기 세포를 동종이형 인간화 NSG-SGM3 마우스에 이식하고, 세포 거부반응, 세포 생존, 및 기형종 형성에 대해 검정한다. 일부 경우에, 이식된 저면역원성 만능 줄기 세포 또는 이의 분화된 세포는 마우스 모델에서 장기간 생존을 나타낸다.
세포의 저면역원성을 포함하는 면역원성을 결정하기 위한 추가 기술은 예를 들어, Deuse 등, Nature Biotechnology, 2019, 37, 252-258 및 Han 등, Proc Natl Acad Sci USA, 2019, 116(21), 10441-10446에 기재되어 있으며, 도면, 도면 범례, 및 방법의 설명을 포함하는 상기 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
유사하게, 만능성의 유지는 다수의 방법으로 테스트된다. 일 구현예에서, 만능성은 본원에 일반적으로 기재되고, WO2018132783호의 도 29에 나타낸 바와 같은 특정 만능성-특이적 인자의 발현에 의해 검정된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 만능 세포는 만능성의 표시로서 하나 이상의 세포 유형으로 분화된다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 만능 세포에서 MHC I 기능 (세포가 인간 세포로부터 유래된 경우 HLA I)의 성공적인 감소는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 하기에 기술되는 바와 같이 측정될 수 있다; 예를 들어, HLA 복합체에 결합하는 표지된 항체를 사용하고; 예를 들어, 인간 주요 조직적합성 HLA 클래스 I 항원의 알파 사슬에 결합하는 상업적으로 이용가능한 HLA-A, B, C 항체를 사용하는 FACS 기술.
또한, 세포는 HLA I 복합체가 세포 표면 상에 발현되지 않음을 확인하기 위해 테스트될 수 있다. 이는 상기 논의된 바와 같이, 하나 이상의 HLA 세포 표면 구성요소에 대한 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 검정될 수 있다.
만능 세포 또는 이의 유도체에서 MHC II 기능 (세포가 인간 세포로부터 유래된 경우 HLA II)의 성공적인 감소는 당업계에 공지된 기술, 예컨대 단백질에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅, FACS 기술, RT-PCR 기술 등을 사용하여 측정될 수 있다.
또한, 세포는 HLA II 복합체가 세포 표면 상에 발현되지 않음을 확인하기 위해 테스트될 수 있다. 또, 이 검정은 당업계에 알려진 바와 같이 수행되고 (예를 들어, WO2018132783호의 도 21 참조), 일반적으로 인간 HLA 클래스 II HLA-DR, DP 및 대부분의 DQ 항원에 결합하는 상업용 항체를 기반으로 하는 웨스턴 블롯 또는 FACS 분석을 사용하여 수행된다.
HLA I 및 II (또는 MHC I 및 II)의 감소 이외에도, 본 발명의 저면역원성 세포는 대식세포 식세포작용 및 NK 세포 사멸에 대한 감소된 민감성을 갖는다. 생성된 저면역원성 세포는 하나 이상의 CD24 전이유전자의 발현으로 인해 면역 대식세포 및 선천 경로를 "회피"한다.
N. 저면역원성 만능 줄기 세포의 유지
일단 저면역원성 만능 줄기 세포가 생성되면, 이들은 iPSC를 유지하는 것으로 알려진 미분화된 상태가 유지될 수 있다. 예를 들어, 세포는 분화를 방지하고 만능성을 유지하는 배양 배지를 사용하여 매트리젤(Matrigel) 상에서 배양될 수 있다. 또한, 이들은 만능성을 유지하기 위한 조건 하에서 배양 배지 내 존재할 수 있다.
O. 만능 줄기 세포의 분화
본 발명은 수용자 대상체로의 후속 이식을 위해 상이한 세포 유형으로 분화될 수 있는 만능 줄기 세포를 제공한다. 분화는 일반적으로 세포-특이적 마커의 존재를 평가함에 의해, 당업계에 공지된 바와 같이 분석될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 분화된 저면역원성 만능 세포 유도체는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 이식될 수 있으며, 이는 세포 유형 및 이들 세포의 궁극적인 용도 둘 다에 따라 달라진다.
1. 만능 줄기 세포로부터 분화된 심장 세포
본 발명은 대상체 (예를 들어, 수용자)로의 후속 이식 또는 생착을 위해 상이한 심장 세포 유형으로 분화될 수 있는 만능 줄기 세포를 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 분화 방법은 공지된 기술을 사용하여 원하는 세포 유형에 따라 달라진다. 예시적인 심장 세포 유형은 이에 제한되지는 않으나, 심근세포, 결절성 심근세포, 전도성 심근세포, 작업성 심근세포, 심근세포 전구체 세포, 심장 줄기 세포, 심방 심장 줄기 세포, 심실 심장 줄기 세포, 심장외막 세포, 조혈 세포, 혈관 내피 세포, 심내막 내피 세포, 심장 판막 간질 세포, 심장 박동원 세포 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 심근세포 전구체는 (탈분화 또는 재프로그래밍 없이) 성숙 (말기) 심근세포를 포함하는 자손을 생성할 수 있는 세포를 포함한다. 심근세포 전구체 세포는 종종 GATA-4, Nkx2.5, 및 MEF-2 전사 인자의 패밀리로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 사용하여 식별될 수 있다. 일부 경우에, 심근세포는 하기 목록으로부터의 하나 이상의 마커 (때때로 적어도 3개 또는 5개의 마커)를 발현하는 미성숙 심근세포 또는 성숙 심근세포를 지칭한다: 심장 트로포닌 I (cTnl), 심장 트로포닌 T (cTnT), 근절 미오신 중쇄 (MHC), GATA-4, Nkx2.5, N-카드헤린, β2-아드레날린 수용체, ANF, 전사 인자의 MEF-2 패밀리, 크레아틴 키나제 MB (CK-MB), 미오글로빈, 또는 심방 나트륨이뇨 인자 (ANF). 일부 구현예에서, 심장 세포는 자발적인 주기적 수축 활성을 나타낸다. 일부 경우에, 심장 세포가 적절한 Ca2+ 농도 및 전해질 균형을 갖는 적합한 조직 배양 환경에서 배양될 때, 세포는 배양 배지에 임의의 추가 성분을 추가할 필요 없이, 세포의 한 축을 가로질러 주기적 방식으로 수축한 다음 수축으로부터 해제되는 것으로 관찰될 수 있다. 일부 구현예에서, 심장 세포는 저면역원성 심장 세포이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 심장 세포는 소아 심근병증, 연령-관련 심근병증, 확장성 심근병증, 비대형 심근병증, 제한성 심근병증, 만성 허혈성 심근병증, 분만주위 심근병증, 염증성 심근병증, 특발성 심근병증, 기타 심근병증, 심근 허혈성 재관류 손상, 심실 기능장애, 심부전, 울혈성 심부전, 관상동맥 질환, 말기 심장병, 동맥경화증, 허혈, 고혈압, 재협착증, 협심증, 류마티스성 심질환, 동맥 염증, 심혈관 질환, 심근경색, 심근허혈, 울혈성 심부전, 심근경색, 심장허혈, 심장손상, 심근허혈, 혈관질환, 후천성 심질환, 선천성 심질환, 동맥경화, 관상동맥질환, 기능장애 전도 계통, 기능장애 관상동맥, 폐 고혈압, 심장 부정맥, 근이영양증, 근육량 이상, 근육 변성, 심근염, 감염성 심근염, 약물- 또는 독소-유발 근육 이상, 과민성 심근염, 및 자가면역 심장내막염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 심장 장애를 치료하기 위해 수용자 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 시험관내 분화에 의해 저면역원성 만능 (HIP) 세포의 집단으로부터 저면역원성 심장 세포의 집단을 생산하는 방법은 하기를 포함한다: (a) GSK 억제제를 포함하는 배양 배지에서 HIP 세포의 집단을 배양하는 단계; (b) WNT 길항제를 포함하는 배양 배지에서 HIP 세포의 집단을 배양하여 전(pre)-심장 세포의 집단을 생성하는 단계; 및 (c) 인슐린을 포함하는 배양 배지에서 전-심장 세포의 집단을 배양하여 저면역원성 심장 세포의 집단을 생성하는 단계. 일부 구현예에서, GSK 억제제는 CHIR-99021, 이의 유도체, 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, GSK 억제제는 약 2 mM 내지 약 10 mM 범위의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, WNT 길항제는 IWR1, 이의 유도체, 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, WNT 길항제는 약 2 mM 내지 약 10 mM 범위의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 심장 세포의 집단은 비-심장 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 단리된 저면역원성 심장 세포의 집단은 투여 전에 확장된다. 특정 구현예에서, 단리된 저면역원성 심장 세포의 집단은 투여 전에 확장되고 동결보존된다.
유도 만능 줄기 세포 또는 만능 줄기 세포를 심장 세포로 분화시키는 다른 유용한 방법은 예를 들어, US2017/0152485호; US2017/0058263호; US2017/0002325호; US2016/0362661호; US2016/0068814호; US9,062,289호; US7,897,389호; 및 US7,452,718호에 기재되어 있다. 유도 만능 줄기 세포 또는 만능 줄기 세포로부터 심장 세포를 생산하는 추가 방법은 예를 들어, Xu 등, Stem Cells and Development, 2006, 15(5): 631-9, Burridge 등, Cell Stem Cell, 2012, 10: 16-28, 및 Chen 등, Stem Cell Res, 2015, l5(2):365-375에 기재되어 있다.
다양한 구현예에서, 저면역원성 심장 세포는 BMP 경로 억제제, WNT 신호전달 활성자, WNT 신호전달 억제제, WNT 작용제, WNT 길항제, Src 억제제, EGFR 억제제, PCK 활성자, 사이토카인, 성장 인자, 심장친화성 제제(cardiotropic agent), 화합물 등을 포함하는 배양 배지에서 배양될 수 있다.
상기 WNT 신호전달 활성자는 이에 제한되지는 않으나, CHIR99021을 포함한다. PCK 활성자는 이에 제한되지는 않으나, PMA를 포함한다. WNT 신호전달 억제제는 이에 제한되지는 않으나, KY02111, SO3031 (KY01-I), SO2031 (KY02-I), 및 SO3042 (KY03-I), 및 XAV939로부터 선택되는 화합물을 포함한다. Src 억제제는 이에 제한되지는 않으나, A419259를 포함한다. EGFR 억제제는 이에 제한되지는 않으나, AG1478을 포함한다.
iPSC로부터 심장 세포를 생성하기 위한 제제의 비-제한적인 예는 액티빈 A, BMP-4, Wnt3a, VEGF, 가용성 프리즐드 단백질, 사이클로스포린 A, 안지오텐신 II, 페닐에프린, 아스코르브산, 디메틸설폭사이드, 5-아자-2'-데옥시시티딘 등을 포함한다.
본 발명의 세포는 저면역원성 만능 세포의 심장 세포로의 분화를 지지 및/또는 촉진하기 위해 합성 표면과 같은 표면 상에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 표면은 이에 제한되지는 않으나, 선택된 하나 이상의 아크릴레이트 단량체의 단독중합체 또는 공중합체를 포함하는 중합체 재료를 포함한다. 아크릴레이트 단량체 및 메타크릴레이트 단량체의 비-제한적인 예는 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트, 글리세롤 디메타크릴레이트, 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트, 디(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트, 테트라(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트, 1,6-헥산디올 프로폭실레이트 디아크릴레이트, 네오펜틸 글리콜 디아크릴레이트, 트리메틸올프로판 벤조에이트 디아크릴레이트, 트리메틸올프로판 에톡실레이트(1 EO/QH) 메틸, 트리시클로[5.2.1.02,6]데칸 디메탄올 디아크릴레이트, 네오펜틸 글리콜 에톡실레이트 디아크릴레이트, 및 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트를 포함한다. 아크릴레이트는 당업계에 공지된 바와 같이 합성되거나 상업적 공급업체, 예컨대 Polysciences, Inc., Sigma Aldrich, Inc. 및 Sartomer, Inc.로부터 수득된다.
중합체성 재료는 지지체 재료의 표면 상에 분산될 수 있다. 세포 배양에 적합한 유용한 지지체 재료는 세라믹 물질, 유리, 플라스틱, 중합체 또는 공-중합체, 이들의 임의의 조합, 또는 다른 재료 상의 하나의 재료의 코팅을 포함한다. 일부 경우에, 유리는 소다석회 유리, 파이렉스 유리, 바이코 유리, 석영 유리, 실리콘, 또는 이들의 유도체 등을 포함한다.
일부 경우에, 수지상 중합체를 포함하는 플라스틱 또는 중합체는 폴리(염화비닐), 폴리(비닐 알코올), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(비닐 아세테이트-말레산 무수물), 폴리(디메틸실록산)모노메타크릴레이트, 고리형 올레핀 중합체, 플루오로카본 중합체, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌이민 또는 이들의 유도체 등을 포함한다. 일부 경우에, 공중합체는 폴리(비닐 아세테이트-co-말레산 무수물), 폴리(스티렌-co-말레산 무수물), 폴리(에틸렌-co-아크릴산) 또는 이들의 유도체 등을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 심장 세포의 효능은 심장 동결손상에 대한 동물 모델에서 평가될 수 있으며, 이는 좌심실 벽 조직의 55%가 치료 없이 흉터 조직이 되는 원인이 된다 (Li 등, Ann. Thorac. Surg. 62:654, 1996; Sakai 등, Ann. Thorac. Surg. 8:2074, 1999, Sakai 등, Thorac. Cardiovasc. Surg. 118:715, 1999). 성공적인 치료는 수축기, 이완기 및 발달된 압력에 의해 결정되는 바와 같이, 흉터 영역을 줄이고 흉터 확장을 제한하며 심장 기능을 개선할 수 있다. 좌전하행동맥의 말단부에 색전 코일을 사용하여 심장 손상을 또한 모델링할 수 있으며 (Watanabe 등, Cell Transplant. 7:239, 1998), 치료의 효능은 조직학 및 심장 기능에 의해 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 투여는 대상체의 심장 조직으로의 이식, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 관상동맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 심근내 주사, 심내막 주사, 심외막 주사, 또는 주입을 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 심장 세포가 투여된 환자는 또한 심장 약물이 투여된다. 병용 요법에 사용하기에 적합한 심장 약물의 예시적인 예는 이에 제한되지는 않으나, 성장 인자, 성장 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 혈관신생제, 칼슘 채널 차단제, 항고혈압제, 항유사분열제, 수축촉진제, 항-동맥경화제, 항-응고제, 베타-차단제, 항-부정맥제, 항-염증제, 혈관확장제, 혈전용해제, 강심배당체, 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 원생동물을 억제하는 약제, 질산염, 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제, 안지오텐신 II 수용체 길항제, 뇌성 나트륨이뇨 펩티드 (BNP); 항종양제, 스테로이드 등을 포함한다.
본 발명의 방법에 따른 치료 효과는 다양한 방식으로 모니터링될 수 있다. 예를 들면, 심전도 (ECG) 또는 홀리어 모니터를 활용하여 치료의 효능을 결정할 수 있다. ECG는 심장 리듬 및 전기적 임펄스(electrical impulse)를 측정하는 것으로, 치료는 대상체의 심장에서 전기 전도의 저하를 개선 또는 유지, 예방, 또는 지연시켰는지의 여부를 결정하는 매우 효과적이고 비-침습적인 방법이다. 심장 이상, 부정맥 장애 등을 모니터링하기 위해 장기간 착용할 수 있는 휴대용 ECG인 홀리어 모니터의 사용은 또한 치료 효과를 평가하는 신뢰할 수 있는 방법이다. ECG 또는 핵 연구는 심실 기능의 개선을 결정하는 데 사용될 수 있다.
2. 만능 줄기 세포로부터 분화된 신경 세포
본 발명은 수용자 대상체로의 후속 이식 또는 생착을 위해 상이한 신경 세포 유형으로 분화될 수 있는 만능 줄기 세포를 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 분화 방법은 공지된 기술을 사용하여 원하는 세포 유형에 따라 달라진다. 예시적인 신경 세포 유형은 이에 제한되지는 않으나, 대뇌 내피 세포, 뉴런, 신경교 세포 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 신경 세포는 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 기타 신경퇴행성 질환 또는 병태, 주의력 결핍 과잉행동 장애 (ADHD), 투렛 증후군 (TS), 정신분열증, 정신병, 우울증, 기타 신경정신병적 장애를 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 신경 세포는 뇌졸중을 치료하거나 개선하기 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 뉴런 및 신경교 세포는 근위축성 축삭경화증 (ALS)을 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 대뇌 내피 세포는 뇌출혈의 증상 또는 효과를 완화시키기 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 도파민성 뉴런은 파킨슨병을 가진 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 노르아드레날린성 뉴런, GABA성 개재뉴런은 간질 발작을 경험한 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 운동 뉴런, 개재뉴런, 슈반 세포, 희돌기교세포, 및 미세아교세포는 척수 손상을 경험한 환자에게 투여된다.
일부 구현예에서, 대뇌 내피 세포 (EC), 이의 전구체 및 전구 세포는 대뇌 EC 또는 신경 세포의 생성을 촉진하는 하나 이상의 인자를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 표면 상의 만능 줄기 세포 (예를 들어, 유도 만능 줄기 세포)로부터 분화된다. 일부 경우에, 배지는 CHIR-99021, VEGF, 염기성 FGF, 및 Y-27632 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 신경 세포의 생존 및 기능성을 촉진하도록 설계된 보충제를 포함한다.
일부 구현예에서, 대뇌 내피 세포 (EC), 이의 전구체, 및 전구 세포는 비조건화 또는 조건화 배지에서 세포를 배양함으로써 표면 상의 만능 줄기 세포로부터 분화된다. 일부 경우에, 배지는 분화를 촉진하거나 가능하게 하는 인자 또는 소분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 VEGR, FGF, SDF-1, CHIR-99021, Y-27632, SB 431542, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자 또는 소분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 분화를 위한 표면은 하나 이상의 세포외 기질 단백질을 포함한다. 표면은 하나 이상의 세포외 기질 단백질로 코팅될 수 있다. 세포는 현탁액에서 분화된 다음 세포 생존을 촉진하기 위해 젤 매트릭스 형태, 예컨대, 매트리젤, 젤라틴, 또는 피브린/트롬빈 형태로 투입될 수 있다. 일부 경우에, 분화는 일반적으로 세포-특이적 마커의 존재를 평가함에 의해, 당업계에 공지된 바와 같이 검정된다.
일부 구현예에서, 대뇌 내피 세포는 CD31, VE 카드헤린, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자를 발현하거나 분비한다. 특정 구현예에서, 대뇌 내피 세포는 CD31, CD34, CD45, CD117 (c-kit), CD146, CXCR4, VEGF, SDF-1, PDGF, GLUT-1, PECAM-1, eNOS, 클라우딘-5, 오클루딘, ZO-1, p-당단백질, 폰 빌레브란드 인자, VE-카드헤린, 저밀도 지질단백질 수용체 LDLR, 저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질 1 LRP1, 인슐린 수용체 INSR, 렙틴 수용체 LEPR, 기저 세포 접착 분자 BCAM, 트랜스페린 수용체 TFRC, 최종 당화 산물-특이적 수용체 AGER, 레티놀 흡수를 위한 수용체 STRA6, 큰 중성 아미노산 수송체 작은 서브유닛 1 SLC7A5, 흥분성 아미노산 수송체 3 SLC1A1, 나트륨-결합 중성 아미노산 수송체 5 SLC38A5, 용질 운반체 패밀리 16 구성원 1 SLC16A1, ATP-의존성 트랜스로카제 ABCB1, ATP-ABCC2 결합 카세트 수송체 ABCG2, 다중약물 내성-관련 단백질 1 ABCC1, 소관 다중특이성 유기 음이온 수송체 1 ABCC2, 다중약물 내성-관련 단백질 4 ABCC4, 및 다중약물 내성-관련 단백질 5 ABCC5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 발현하거나 분비한다.
일부 구현예에서, 대뇌 EC는 밀착연접(tight junction)의 높은 발현, 높은 전기 저항, 낮은 천공, 작은 혈관주위 공간, 인슐린 및 트랜스페린 수용체의 높은 유병률, 및 높은 수의 미토콘드리아로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 것을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 대뇌 EC는 양성 선택 전략을 사용하여 선택되거나 정제된다. 일부 경우에, 대뇌 EC는 내피 세포 마커, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, CD31에 대해 분류된다. 즉, CD31 양성 대뇌 EC가 단리된다. 일부 구현예에서, 대뇌 EC는 음성 선택 전략을 사용하여 선택되거나 정제된다. 일부 구현예에서, 미분화 또는 만능 줄기 세포는 이에 제한되지는 않으나, TRA-1-60 및 SSEA-1을 포함하는 만능성 마커를 발현하는 세포를 선택함에 의해 제거된다.
일부 구현예에서, 뉴런, 이의 전구체, 및 전구세포는 GDNF, BDNF, GM-CSF, B27, 염기성 FGF, 염기성 EGF, NGF, CNTF, SMAD 억제제, Wnt 길항제, SHH 신호전달 활성자, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 만능 줄기 세포로부터 분화된다. 일부 구현예에서, SMAD 억제제는 SB431542, LDN-193189, 노긴 PD169316, SB203580, LY364947, A77-01, A-83-01, BMP4, GW788388, GW6604, SB-505124, 레르델리무맙, 메텔리무맙, GC-I008, AP-12009, AP-110I4, LY550410, LY580276, LY364947, LY2109761, SB-505124, E-616452 (RepSox ALK 억제제), SD-208, SMI6, NPC-30345, K 26894, SB-203580, SD-093, 액티빈-M108A, P144, 가용성 TBR2-Fc, DMH-1, 도르소모르핀 디하이드로클로라이드 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Wnt 길항제는 XAV939, DKK1, DKK-2, DKK-3, Dkk-4, SFRP-1, SFRP-2, SFRP-5, SFRP-3, SFRP-4, WIF-1, 소기(Soggy), IWP-2, IWR1, ICG-001, KY0211, Wnt-059, LGK974, IWP-L6 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, SHH 신호전달 활성자는 평활화 작용제 (SAG), SAG 유사체, SHH, C25-SHH, C24-SHH, 푸르모르파민, Hg--Ag 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 뉴런은 글루타메이트 이온성 수용체 NMDA 유형 서브유닛 1 GRIN1, 글루타메이트 디카르복실라아제 1 GAD1, 감마-아미노부티르산 GABA, 티로신 하이드록실라제 TH, LIM 호메오박스 전사 인자 1-알파 LMX1A, 포크헤드 박스 단백질 O1 FOXO1, 포크헤드 박스 단백질 A2 FOXA2, 포크헤드 박스 단백질 O4 FOXO4, FOXG1, 2',3'-고리형-뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라제 CNP, 수초 염기성 단백질 MBP, 튜불린 베타 사슬 3 TUB3, 튜불린 베타 사슬 3 NEUN, 용질 운반체 패밀리 1 구성원 6 SLC1A6, SST, PV, 칼빈딘, RAX, LHX6, LHX8, DLX1, DLX2, DLX5, DLX6, SOX6, MAFB, NPAS1, ASCL1, SIX6, OLIG2, NKX2.1, NKX2.2, NKX6.2, VGLUT1, MAP2, CTIP2, SATB2, TBR1, DLX2, ASCL1, ChAT, NGFI-B, c-fos, CRF, RAX, POMC, 하이포크레틴, NADPH, NGF, Ach, VAChT, PAX6, EMX2p75, CORIN, TUJ1, NURR1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다. 일부 구현예에서, 도파민성 뉴런은 CORIN, FOXA2, TUJ1, NURR1, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 줄기 세포는 도파민성 전구체를 포함하는 도파민성 뉴런으로 분화된다. 줄기 세포는 뉴런 분화를 유도하기 위한 보충제 또는 첨가제를 포함하는 분화 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, 세포는 기저판 세포(floor plate cell)를 유도하기 위한 보충제 또는 첨가제의 존재 하에서 배양된다. 일부 구현예에서, 보충제 또는 첨가제는 BMP 억제제 LDN193189, ALK-5 억제제 A83-01, 평활화(Smoothened) 작용제 푸르모르파민, FGF8, GSK3 억제제 CHIR99021, 신경교 세포주-유래 신경영양 인자, GDNF, 아스코르브산, 뇌-유래 신경영양 인자 BDNF, 디부티릴아데노신 고리형 모노포스페이트 dbcAMP, ROCK 억제제 Y-27632 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 시험관내 분화에 의해 저면역원성 유도 만능 줄기 세포 (HIP 세포)의 집단으로부터 저면역원성 도파민성 뉴런의 집단을 생산하는 방법은 (a) 소닉 헤지호그 (SHH), BDNF, EGF, bFGF, FGF8, WNT1, 레티노산, GSK3 억제제, ALK 억제제, 및 ROCK 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 제1 배양 배지에서 HIP 세포의 집단을 배양하여 미성숙 도파민성 뉴런의 집단을 생성하는 단계; 및 (b) 제1 배양 배지와 상이한 제2 배양 배지에서 미성숙 도파민성 뉴런의 집단을 배양하여 도파민성 뉴런의 집단을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, GSK 억제제는 CHIR-99021, 이의 유도체, 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, GSK 억제제는 약 2 mM 내지 약 10 pM 범위의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, ALK 억제제는 SB-431542, 이의 유도체, 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, ALK 억제제는 약 1 mM 내지 약 10 mM 범위의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지 및/또는 제2 배양 배지에는 동물 혈청이 없다.
일부 구현예에서, 저면역원성 도파민성 뉴런의 집단은 비-뉴런 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 단리된 저면역원성 도파민성 뉴런의 집단은 투여 전에 확장된다. 특정 구현예에서, 단리된 저면역원성 도파민성 뉴런의 집단은 투여 전에 확장되고 동결보존된다.
만능 줄기 세포를 분화시키는 방법은 예를 들어, Kikuchi 등, Nature, 2017, 548, 592-596; Kriks 등, Nature, 2011, 547-551; Doi 등, Stem Cell Reports, 2014, 2, 337-50; Perrier 등, Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101, 12543-12548; Chambers 등, Nat Biotechnol, 2009, 27, 275-280; 및 Kirkeby 등, Cell Reports, 2012, 1, 703-714에 기재되어 있다.
줄기 세포로부터 유래된 뉴런 및 이의 제조 방법에 대한 유용한 설명은 예를 들어, Kirkeby 등, Cell Rep, 2012, 1:703-714; Kriks 등, Nature, 2011, 480:547-551; Wang 등, Stem Cell Reports, 2018, 11(1):171-182; Lorenz Studer, Progress in Brain Research 중 "제8장 - Strategies for Bringing Stem Cell-Derived Dopamine Neurons to the clinic-The NYSTEM Trial", 2017, 230권, pg. 191-212; Liu 등, Nat Protoc, 2013, 8:1670-1679; Upadhya 등, Curr Protoc Stem Cell Biol, 38, 2D.7.1-2D.7.47; 미국공개특허 US20160115448호, 및 US8,252,586호; US8,273,570호; US9,487,752호 및 US10,093,897호에서 확인할 수 있으며, 상기 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 미세아교세포, 성상교세포, 희돌기교세포, 뇌실막 세포 및 슈반 세포를 포함하는 신경교 세포, 이의 신경교 전구체, 및 신경교 전구세포는 만능 줄기 세포를 치료학적으로 효과적인 신경교 세포 등으로 분화시킴으로써 생산된다. 저면역원성 만능 줄기 세포의 분화는 저면역원성 신경 세포, 예컨대 저면역원성 신경교 세포를 생성한다.
일부 구현예에서, 신경교 세포, 이의 전구체, 및 전구 세포는 레티노산, IL-34, M-CSF, FLT3 리간드, GM-CSF, CCL2, TGFbeta 억제제, BMP 신호전달 억제제, SHH 신호전달 활성자, FGF, 혈소판 유래 성장 인자 PDGF, PDGFR-알파, HGF, IGF-1, 노긴, 소닉 헤지호그 (SHH), 도르소모르핀, 노긴, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 포함하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양함으로써 생성된다. 특정 경우에, BMP 신호전달 억제제는 LDN193189, SB431542, 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 신경교 세포는 NKX2.2, PAX6, SOX10, 뇌유래 신경영양인자 BDNF, 뉴로트로핀-3 NT-3, NT-4, 표피 성장 인자 EGF, 모양체 신경영양인자 CNTF, 신경 성장 인자 NGF, FGF8, EGFR, OLIG1, OLIG2, 수초 염기성 단백질 MBP, GAP-43, LNGFR, 네스틴, GFAP, CD11b, CD11c, CX3CR1, P2RY12, IBA-1, TMEM119, CD45, 및 이들의 임의의 조합을 발현한다. 예시적인 분화 배지는 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 신경교 세포 유형의 생성을 촉진하거나 가능하게 할 수 있는 임의의 특정 인자 및/또는 소분자를 포함할 수 있다.
시험관 내 분화 프로토콜에 따라 생성된 세포가 신경교 세포 특성 및 특징을 나타내는지 결정하기 위해, 세포를 동물 모델에 이식할 수 있다. 일부 구현예에서, 신경교 세포는 면역력이 약화된(immunocompromised) 마우스, 예를 들어, 면역력이 약화된 쉬버러(shiverer) 마우스에 주입된다. 신경교 세포를 마우스의 뇌에 투여하고, 미리 선택된 일정 정도의 시간 후에 이식된 세포를 평가한다. 일부 경우에, 뇌에 이식된 세포는 면역염색 및 이미징 방법을 사용하여 시각화된다. 일부 구현예에서, 신경교 세포는 공지된 신경교 세포 바이오마커를 발현하는 것으로 결정된다.
줄기 세포로부터 신경교 세포, 이의 전구체 및 전구 세포를 생성하기 위한 유용한 방법은 예를 들어, US7,579,188호; US7,595,194호; US8,263,402호; US8,206,699호; US8,252,586호; US9,193,951호; US9,862,925호; US8,227,247호; US9,709,553호; US2018/0187148호; US2017/0198255호; US2017/0183627호; US2017/0182097호; US2017/253856호; US2018/0236004호; WO2017/172976호; 및 WO2018/093681호에서 확인된다.
일부 구현예에서, 만능 줄기 세포의 분화는 특이적이고, 원하는 계통 및/또는 관심 세포 유형으로 이들의 분화를 목표로 삼기 위해, 특정 세포 계통(들)을 생성하는 것으로 알려진 특정 인자에 세포를 노출시키거나 접촉시킴에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 말기 분화된 세포는 전문화된 표현형 특성 또는 특징을 나타낸다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 줄기 세포는 신경외배엽, 신경 세포, 신경 내분비, 도파민성, 콜린성, 세로토닌성 (5-HT), 글루타메이트성, GABA성, 아드레날린성, 노르아드레날린성, 교감 신경, 부교감 신경, 교감 말초 신경, 또는 신경교 세포 집단으로 분화된다. 일부 경우에, 신경교 세포 집단은 미세아교세포 (예를 들어, 아메바형, 분지형, 활성화된 식세포, 및 활성화된 비-식세포) 세포 집단 또는 거대 아교세포 (중추 신경계 세포: 성상교세포, 희돌기교세포, 뇌실막 세포, 및 방사형 아교세포; 및 말초 신경계 세포: 슈반 세포 및 위성 세포) 세포 집단, 또는 임의의 선행하는 세포의 전구체 및 전구 세포를 포함한다.
상이한 유형의 신경 세포를 생성하기 위한 프로토콜은 PCT 출원 WO2010144696호, 미국등록특허 제9,057,053호; 제9,376,664호; 및 제10,233,422호에 기재되어 있다. 저면역원성 만능 세포를 분화시키는 방법에 대한 추가 설명은 예를 들어, Deuse 등, Nature Biotechnology, 2019, 37, 252-258 및 Han 등, Proc Natl Acad Sci USA, 2019, 116(21), 10441-10446에서 확인할 수 있다. 신경 장애 또는 병태의 동물 모델에서 신경 세포 이식의 효과를 결정하는 방법은 하기 참고문헌에 기재되어 있다: 척수 손상의 경우 - Curtis 등, Cell Stem Cell, 2018, 22, 941-950; 파킨슨병의 경우 - Kikuchi 등, Nature, 2017, 548:592-596; ALS의 경우 - Izrael 등, Stem Cell Research, 2018, 9(1):152 및 Izrael 등, IntechOpen, DOI: 10.5772/intechopen.72862; 간질의 경우 - Upadhya 등, PNAS, 2019, 116(1):287-296.
척수 손상에 대한 신경 세포 이식의 효능은 예를 들어, McDonald, 등, Nat. Med., 1999, 5:1410) 및 Kim, 등, Nature, 2002, 418:50에 기재된 바와 같이, 급성 손상 척수에 대한 랫트 모델에서 평가할 수 있다. 예를 들면, 성공적인 이식은 5주 후에 이식-유래 세포가 병변에 존재하고, 성상교세포, 희돌기교세포 및/또는 뉴런으로 분화되어, 병변이 있는 말단에서 척수를 따라 이동하고, 보행, 조정력, 및 체중-부하의 개선을 보여줄 수 있다. 특정 동물 모델은 신경 세포 유형 및 치료될 신경 질환 또는 병태를 기반으로 하여 선택된다.
신경 세포는 의도된 조직 부위에 이식되고 기능적으로 결핍된 영역을 재구성 또는 재생하도록 허용하는 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 신경 세포는 치료 중인 질병에 따라, 중추 신경계의 실질조직 또는 척수강내 부위로 직접적으로 이식될 수 있다. 일부 구현예에서, 대뇌 내피 세포, 뉴런, 도파민성 뉴런, 뇌실막 세포, 성상교세포, 미세아교세포, 희돌기교세포, 및 슈반 세포를 포함하는 본원에 기재된 임의의 신경 세포는 정맥내, 척추내, 뇌실내, 척추강내, 동맥내, 근육내, 복강내, 피하, 근육내, 복강내, 안내, 구후부 및 이들의 조합의 방법으로 환자에게 주사된다. 일부 구현예에서, 세포는 일시 주사법(bolus injection) 또는 지속 주입법(continuous infusion)의 형태로 주사 또는 침착된다. 특정 구현예에서, 신경 세포는 뇌, 뇌에 위치, 및 이들의 조합으로 주사에 의해 투여된다. 예를 들어, 대상체의 두개골에 만든 천공을 통해 주사할 수 있다. 뇌에 신경 세포를 투여하기에 적합한 부위는 이에 제한되지는 않으나, 뇌실, 측뇌실, 대수조(cisterna magna), 피각, 기저핵, 해마 피질, 선조체, 뇌의 미상 영역 및 이들의 조합을 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 도파민성 뉴런을 포함하는 신경 세포의 추가 설명은 WO2020/018615호에서 확인되며, 본 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
3. 만능 줄기 세포로부터 분화된 내피 세포
본 발명은 대상체 (예를 들어, 수용자)로의 후속 이식 또는 생착을 위해 다양한 내피 세포 유형으로 분화될 수 있는 만능 줄기 세포를 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 분화 방법은 공지된 기술을 사용하여 원하는 세포 유형에 따라 달라진다. 예시적인 내피 세포 유형은 이에 제한되지는 않으나, 모세혈관 내피 세포, 혈관 내피 세포, 대동맥 내피 세포, 동맥 내피 세포, 정맥 내피 세포, 신장 내피 세포, 뇌 내피 세포, 간 내피 세포 등을 포함한다.
본원에 개괄된 내피 세포는 하나 이상의 내피 세포 마커를 발현할 수 있다. 상기 마커의 비-제한적인 예는 VE-카드헤린 (CD 144), ACE (안지오텐신-전환 효소) (CD 143), BNH9/BNF13, CD31, CD34, CD54 (ICAM-1), CD62E (E-셀렉틴), CD105 (엔도글린), CD146, 엔도칸 (ESM-1), 엔도글리x-1, 엔도뮤신, 에오탁신-3, EPAS1 (내피 PAS 도메인 단백질 1), 인자 VIII 관련 항원, FLI-1, Flk-1 (KDR, VEGFR-2), FLT-1 (VEGFR-1), GATA2, GBP-1 (구아닐레이트-결합 단백질-1), GRO-알파, HEX, ICAM-2 (세포간 접착 분자 2), LM02, LYVE-1, MRB (매직 라운드어바웃), 뉴클레오린, PAL-E (병리 해부학적 라이덴-내피), RTK, sVCAM-1, TALI, TEM1 (종양 내피 마커 1), TEM5 (종양 내피 마커 5), TEM7 (종양 내피 마커 7), 트롬보모듈린 (TM, CD141), VCAM-1 (혈관 세포 접착 분자-1) (CD106), VEGF (혈관 내피 성장 인자), vWF (폰 빌레브란드 인자), ZO-1, 내피 세포-선택적 접착 분자 (ESAM), CD102, CD93, CD184, CD304 및 DLL4을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 내피 세포는 장애/병태를 치료하거나, 장애/병태의 증상을 개선하는 데 유용한 관심 단백질을 암호화하는 외인성 유전자, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 효소, 호르몬, 수용체, 리간드, 또는 약물을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 내피 세포를 유전적으로 변형시키는 표준 방법은 예를 들어, US5,674,722호에 기재되어 있다.
상기 내피 세포는 질병의 예방 또는 치료에 유용한 폴리펩티드 또는 단백질의 구성적 합성 및 전달을 제공하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 폴리펩티드는 혈류 또는 개체의 신체의 다른 영역 (예를 들어, 중추 신경계)으로 직접적으로 분비된다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 인슐린, 혈액 응고 인자 (예를 들어, 인자 VIII 또는 폰 빌레브란드 인자), 알파-1 항트립신, 아데노신 데아미나제, 조직 플라스미노겐 활성자, 인터루킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3) 등을 분비하도록 변형될 수 있다.
특정 구현예에서, 내피 세포는 이식된 이식편의 맥락에서 이들의 성능을 개선시키는 방식으로 변형될 수 있다. 비-제한적인 예시적인 예는 관강내 혈전 형성을 방지하기 위한 혈전용해제의 분비 또는 발현, 평활근 비대로 인한 내강 협착을 방지하기 위한 평활근 증식 억제제의 분비, 및 내피 세포 증식을 자극하고, 이식편 내강의 내피 세포 라이닝(lining)의 정도 또는 지속 기간을 개선하기 위한 내피 세포 미토겐(mitogen) 또는 자가분비 인자의 발현 및/또는 분비를 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 내피 세포는 특정 기관 또는 사지에 치료적 수준의 분비형 생성물을 전달하는 데 활용된다. 예를 들어, 시험관 내에서 조작된 (형질도입된) 내피 세포가 늘어선 혈관 이식체를 특정 기관이나 사지로 이식할 수 있다. 형질도입된 내피 세포의 분비형 생성물은 관류 조직에 고농도로 전달되고, 이로써 표적화된 해부학적 위치에 원하는 효과를 달성한다.
다른 구현예에서, 내피 세포는 혈관형성 종양에서 내피 세포에 의해 발현될 때 혈관신생을 방해하거나 억제하는 유전자를 함유하도록 유전적으로 변형된다. 일부 경우에, 내피 세포는 또한 종양 치료 완료 시 이식된 내피 세포의 음성 선택을 허용하는 본원에 기재된 선택가능한 자살 유전자 중 임의의 하나를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 내피 세포는 혈관 손상, 심혈관 질환, 혈관 질환, 말초혈관질환, 허혈성 질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전증, 말초혈관 폐쇄성 질환, 고혈압, 허혈성 조직 손상, 재관류 손상, 사지 허혈, 뇌졸중, 신경병증 (예를 들어, 말초 신경병증 또는 당뇨병성 신경병증), 장기 부전 (예를 들어, 간부전, 신부전 등), 당뇨병, 류머티스성 관절염, 골다공증, 뇌혈관 질환, 고혈압, 협심증 및 관상동맥질환으로 인한 심근경색증, 신장 혈관성 고혈압, 신동맥 협착으로 인한 신부전, 하지의 파행, 다른 혈관 병태 또는 질병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈관 장애를 치료하기 위해 수용자 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 저면역원성 만능 세포는 말초 동맥 질환을 해결하기 위해 새로운 혈관을 형성하도록 내피 집락 형성 세포 (ECFC)로 분화된다. 내피 세포를 분화시키는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Prasain 등, doi: 10.1038/nbt.3048을 참조하고, 그 전체가, 그리고 구체적으로 인간 만능 줄기 세포로부터 내피 세포를 생성하기 위한 방법 및 시약에 대해, 및 이식 기술에 대해서도 본원에 참조로 포함된다. 분화는 일반적으로 내피 세포 관련 또는 특이적 마커의 존재를 평가함에 의해 또는 기능적으로 측정함에 의해, 당업계에 공지된 바와 같이 검정될 수 있다.
일부 구현예에서, 시험관내 분화에 의해 저면역원성 만능 세포의 집단으로부터 저면역원성 내피 세포의 집단을 생산하는 방법은 하기를 포함한다: (a) GSK 억제제를 포함하는 제1 배양 배지에서 HIP 세포의 집단을 배양하는 단계; (b) VEGF 및 bFGF를 포함하는 제2 배양 배지에서 HIP 세포의 집단을 배양하여 전-내피 세포의 집단을 생성하는 단계; 및 (c) ROCK 억제제 및 ALK 억제제를 포함하는 제3 배양 배지에서 전-내피 세포의 집단을 배양하여 저면역원성 내피 세포의 집단을 생성하는 단계.
일부 구현예에서, GSK 억제제는 CHIR-99021, 이의 유도체, 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, GSK 억제제는 약 1 mM 내지 약 10 mM 범위의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, ROCK 억제제는 Y-27632, 이의 유도체, 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, ROCK 억제제는 약 1 pM 내지 약 20 pM 범위의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, ALK 억제제는 SB-431542, 이의 유도체, 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, ALK 억제제는 약 0.5 pM 내지 약 10 pM 범위의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 2 pM 내지 약 10 pM의 CHIR-99021을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 50 ng/ml VEGF 및 10 ng/ml bFGF를 포함한다. 다른 구현예에서, 제2 배양 배지는 Y-27632 및 SB-431542를 더 포함한다. 다양한 구현예에서, 제3 배양 배지는 10 pM Y-27632 및 1 pM SB-431542를 포함한다. 특정 구현예에서, 제3 배양 배지는 VEGF 및 bFGF를 더 포함한다. 특정 경우에, 제1 배양 배지 및/또는 제2 배지에는 인슐린이 없다.
본 발명의 세포는 저면역원성 만능 세포의 심장 세포로의 분화를 지지 및/또는 촉진하기 위해 합성 표면과 같은 표면 상에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 표면은 이에 제한되지는 않으나, 선택된 하나 이상의 아크릴레이트 단량체의 단독중합체 또는 공중합체를 포함하는 중합체 재료를 포함한다. 아크릴레이트 단량체 및 메타크릴레이트 단량체의 비-제한적인 예는 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트, 글리세롤 디메타크릴레이트, 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트, 디(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트, 테트라(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트, 1,6-헥산디올 프로폭실레이트 디아크릴레이트, 네오펜틸 글리콜 디아크릴레이트, 트리메틸올프로판 벤조에이트 디아크릴레이트, 트리메틸올프로판 에톡실레이트(1 EO/QH) 메틸, 트리시클로[5.2.1.02,6]데칸 디메탄올 디아크릴레이트, 네오펜틸 글리콜 에톡실레이트 디아크릴레이트, 및 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트를 포함한다. 아크릴레이트는 당업계에 공지된 바와 같이 합성되거나 상업적 공급업체, 예컨대 Polysciences, Inc., Sigma Aldrich, Inc. 및 Sartomer, Inc.로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 내피 세포는 중합체 매트릭스 상에 시딩될 수 있다. 일부 경우에, 중합체 매트릭스는 생분해성이다. 적합한 생분해성 매트릭스는 당업계에 잘 알려져 있으며, 콜라겐-GAG, 콜라겐, 피브린, PLA, PGA, 및 PLA/PGA 공-중합체를 포함한다. 추가 생분해성 재료는 폴리(무수물), 폴리(하이드록시산), 폴리(오르토 에스테르), 폴리(프로필푸메레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리아미드, 폴리아미노산, 폴리아세탈, 생분해성 폴리시아노아크릴레이트, 생분해성 폴리우레탄 및 다당류를 포함한다.
비-생분해성 중합체도 역시 사용될 수 있다. 기타 비-생분해성이지만, 생체적합성 중합체는 폴리피롤, 폴리아닙네스, 폴리티오펜, 폴리스티렌, 폴리에스테르, 비-생분해성 폴리우레탄, 폴리우레아, 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리프로필렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 및 폴리(에틸렌 옥사이드)를 포함한다. 중합체 매트릭스는 임의의 형태, 예를 들어, 입자, 스펀지, 튜브, 구형, 스트랜드, 코일형 스트랜드, 모세관 네트워크, 필름, 섬유, 메쉬, 또는 시트로 형성될 수 있다. 중합체 매트릭스는 천연 또는 합성 세포외 기질 재료 및 인자를 포함하도록 변형될 수 있다.
중합체성 재료는 지지체 재료의 표면 상에 분산될 수 있다. 세포 배양에 적합한 유용한 지지체 재료는 세라믹 물질, 유리, 플라스틱, 중합체 또는 공-중합체, 이들의 임의의 조합, 또는 다른 재료 상의 하나의 재료의 코팅을 포함한다. 일부 경우에, 유리는 소다석회 유리, 파이렉스 유리, 바이코 유리, 석영 유리, 실리콘, 또는 이들의 유도체 등을 포함한다.
일부 경우에, 수지상 중합체를 포함하는 플라스틱 또는 중합체는 폴리(염화비닐), 폴리(비닐 알코올), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(비닐 아세테이트-말레산 무수물), 폴리(디메틸실록산)모노메타크릴레이트, 고리형 올레핀 중합체, 플루오로카본 중합체, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌이민 또는 이들의 유도체 등을 포함한다. 일부 경우에, 공중합체는 폴리(비닐 아세테이트-co-말레산 무수물), 폴리(스티렌-co-말레산 무수물), 폴리(에틸렌-co-아크릴산) 또는 이들의 유도체 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 저면역원성 내피 세포의 집단은 비-내피 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 단리된 저면역원성 내피 세포의 집단은 투여 전에 확장된다. 특정 구현예에서, 단리된 저면역원성 내피 세포의 집단은 투여 전에 확장되고 동결보존된다.
본 발명에 사용하기 위한 내피 세포의 추가 설명은 WO2020/018615호에서 확인되며, 본 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
4. 만능 줄기 세포로부터 분화된 갑상선 세포
일부 구현예에서, 만능 줄기 세포는 자가면역 갑상선염을 해결하기 위해 갑상선 호르몬을 분비할 수 있는 갑상선 전구 세포 및 갑상선 여포성 오르가노이드로 분화될 수 있다. 갑상선 세포를 분화시키는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Kurmann 등, Cell Stem Cell, 2015 Nov 5;17(5):527-42를 참조하고, 그 전체가, 그리고 구체적으로 인간 만능 줄기 세포로부터 갑상선 세포를 생성하기 위한 방법 및 시약에 대해, 및 이식 기술에 대해서도 본원에 참조로 포함된다. 분화는 일반적으로 갑상선 세포 관련 또는 특이적 마커의 존재를 평가함에 의해 또는 기능적으로 측정함에 의해, 당업계에 공지된 바와 같이 검정될 수 있다.
5. 만능 줄기 세포로부터 분화된 간세포
일부 구현예에서, 만능 줄기 세포는 간세포 기능 상실 또는 간경화를 해결하기 위해 간세포로 분화될 수 있다. HIP 세포를 간세포로 분화시키는 데 사용할 수 있는 많은 기술이 있으며; 예를 들어, Pettinato 등, doi: 10.1038/spre32888, Snykers 등, Methods Mol Biol 698:305-314 (2011), Si-Tayeb 등, Hepatology 51:297-305 (2010) 및 Asgari 등, Stem Cell Rev (:493- 504 (2013)을 참조하고, 이들 모두는 그 전체가, 그리고 구체적으로 분화를 위한 방법론 및 시약에 대해 본원에 참조로 포함된다. 분화는 일반적으로 알부민, 알파 태아단백질, 및 피브리노겐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 간세포 관련 및/또는 특이적 마커의 존재를 평가함에 의해, 당업계에 공지된 바와 같이 검정될 수 있다. 분화는 또한 암모니아 대사, LDL 저장 및 흡수, ICG 흡수 및 방출, 및 글리코겐 저장과 같은 기능적으로 측정될 수 있다.
6. 만능 줄기 세포로부터 분화된 췌장 섬 세포
본 발명은 대상체 (예를 들어, 수용자)로의 후속 이식 또는 생착을 위해 다양한 췌장 섬 세포 유형으로 분화될 수 있는 만능 줄기 세포를 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 분화 방법은 공지된 기술을 사용하여 원하는 세포 유형에 따라 달라진다. 예시적인 췌장 섬 세포 유형은 이에 제한되지는 않으나, 췌장 섬 전구 세포, 미성숙 췌장 섬 세포, 성숙 췌장 섬 세포 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 췌장 세포는 당뇨병을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 췌장 섬 세포는 본원에 기재된 저면역원성 만능 세포로부터 유래된다. 만능 줄기 세포를 췌장 섬 세포로 분화시키는 유용한 방법은 예를 들어, US9,683,215호; US9,157,062호; 및 US8,927,280호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생성된 췌장 섬 세포는 인슐린을 분비한다. 일부 구현예에서, 췌장 섬 세포는 내인성 췌장 섬 세포의 적어도 2가지 특성, 예를 들어, 글루코스에 반응하는 인슐린의 분비, 및 베타 세포 마커의 발현을 나타내지만, 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 베타 세포 마커 또는 베타 세포 전구체 마커는 이에 제한되지는 않으나, c-펩티드, Pdxl, 글루코스 수송체 2 (Glut2), HNF6, VEGF, 글루코키나제 (GCK), 프로호르몬 전환효소 (PC 1/3), Cdcpl, NeuroD, Ngn3, Nkx2.2, Nkx6.l, Nkx6.2, Pax4, Pax6, Ptfla, Isll, Sox9, Soxl7, 및 FoxA2를 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 췌장 섬 세포는 글루코스의 증가에 반응하여 인슐린을 생성한다. 다양한 구현예에서, 단리된 췌장 섬 세포는 글루코스의 증가에 반응하여 인슐린을 분비한다. 일부 구현예에서, 세포는 별개의 형태, 예컨대 조약돌 세포 형태 및/또는 약 17 pm 내지 약 25 pm의 직경을 갖는다.
일부 구현예에서, 저면역원성 만능 세포는 I형 당뇨병 (T1DM)을 해결하기 위한 이식을 위해 베타-유사 세포 또는 섬 오르가노이드로 분화된다. 세포 시스템은 T1DM을 해결하는 유망한 방법이며, 예를 들어, Ellis 등, Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2017 Oct;14(10):612-628을 참조하고, 본원에 참조로 포함된다. 추가적으로, Pagliuca 등 (Cell, 2014, 159(2):428-39)은 hiPSC로부터 β-세포의 성공적인 분화에 대해 보고하고, 상기 내용은 그 전체가, 그리고 구체적으로 인간 만능 줄기 세포로부터 기능적 인간 β 세포의 대규모 생산을 위해 본원에 개괄된 방법 및 시약에 대해 본원에 참조로 포함된다). 또한, Vegas 등은 인간 만능 줄기 세포로부터 인간 β 세포의 생산을 나타낸 후 숙주에 의한 면역 거부반응을 피하기 위해 캡슐화하고; Vegas 등, Nat Med, 2016, 22(3):306-11, 그 전체가, 그리고 구체적으로 인간 만능 줄기 세포로부터 기능적 인간 β 세포의 대규모 생산을 위해 본원에 개괄된 방법 및 시약에 대해 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 시험관내 분화에 의해 저면역원성 만능 세포의 집단으로부터 저면역원성 췌장 섬 세포의 집단을 생산하는 방법은 하기를 포함한다: (a) 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 전환 성장 인자 (TGF), 섬유아세포 성장 인자 (EGF), 표피 성장 인자 (EGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 소닉 헤지호그 (SHH), 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 전환 성장 인자-b (TORb) 슈퍼패밀리, 골형성 단백질-2 (BMP2), 골형성 단백질-7 (BMP7), GSK 억제제, ALK 억제제, BMP 1형 수용체 억제제, 및 레티노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자 중 하나 이상을 포함하는 제1 배양 배지에서 HIP 세포의 집단을 배양하여 미성숙 췌장 섬 세포의 집단을 생성하는 단계; 및 (b) 제1 배양 배지와 상이한 제2 배양 배지에서 미성숙 췌장 섬 세포의 집단을 배양하여 저면역원성 췌장 섬 세포의 집단을 생성하는 단계. 일부 구현예에서, GSK 억제제는 CHIR-99021, 이의 유도체, 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, GSK 억제제는 약 2 mM 내지 약 10 mM 범위의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, ALK 억제제는 SB-431542, 이의 유도체, 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, ALK 억제제는 약 1 pM 내지 약 10 pM 범위의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지 및/또는 제2 배양 배지에는 동물 혈청이 없다.
일부 구현예에서, 저면역원성 췌장 섬 세포의 집단은 비-췌장 섬 세포로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 단리된 저면역원성 췌장 섬 세포의 집단은 투여 전에 확장된다. 특정 구현예에서, 단리된 저면역원성 췌장 섬 세포의 집단은 투여 전에 확장되고 동결보존된다.
분화는 일반적으로 인슐린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 β 세포 관련 또는 특이적 마커의 존재를 평가함에 의해, 당업계에 공지된 바와 같이 검정될 수 있다. 분화는 또한 글루코스 대사 측정과 같은 기능적으로 측정될 수 있으며, 일반적으로, Muraro 등, Cell Syst. 2016 Oct 26; 3(4): 385-394.e3을 참조하고, 이로써 그 전체가, 그리고 구체적으로 본원에 개괄된 바이오마커에 대해 참조로 포함된다. 일단 베타 세포가 생성되면, 이들은 (본원에 논의된 바와 같이 세포 현탁액으로 또는 젤 매트릭스 내에서) 간문맥/간, 대망, 위장 점막, 골수, 근육 또는 피하 주머니로 이식될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 도파민성 뉴런을 포함하는 췌장 섬 세포의 추가 설명은 WO2020/018615호에서 확인되며, 본 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
7. 만능 줄기 세포로부터 분화된 망막 색소 상피 (RPE) 세포
본 발명은 대상체 (예를 들어, 수용자)로의 후속 이식 또는 생착을 위해 다양한 RPE 세포 유형으로 분화될 수 있는 저면역원성 만능 세포를 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 분화 방법은 공지된 기술을 사용하여 원하는 세포 유형에 따라 달라진다. 예시적인 RPE 세포 유형은 이에 제한되지는 않으나, 망막 색소 상피 (RPE) 세포, RPE 전구 세포, 미성숙 RPE 세포, 성숙 RPE 세포, 기능성 RPE 세포 등을 포함한다.
만능 줄기 세포를 RPE 세포로 분화시키는 유용한 방법은 예를 들어, US9,458,428호 및 US9,850,463호에 기재되어 있으며, 상기 개시는 명세서를 포함하여 이들 전체가 참조로 본원에 포함된다. 인간 유도 만능 줄기 세포로부터 RPE 세포를 생산하는 추가 방법은 예를 들어, Lamba 등, PNAS, 2006, 103(34): 12769-12774; Mellough 등, Stem Cells, 2012, 30(4):673-686; Idelson 등, Cell Stem Cell, 2009, 5(4): 396-408; Rowland 등, Journal of Cellular Physiology, 2012, 227(2):457-466, Buchholz 등, Stem Cells Trans Med, 2013, 2(5): 384-393, 및 da Cruz 등, Nat Biotech, 2018, 36:328-337에서 확인할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 RPE 세포는 습성 황반변성, 건성 황반변성, 연소성 황반변성 (예를 들어, 스타르가르트병, 베스트병, 및 연소성 망막분리증), 레버 선천성 흑암시(Leber's Congenital Ameurosis), 망막색소변성증(Retinitis Pigmentosa), 망막 박리(retinal detachment), 연령-관련 황반변성 (AMD), 초기 AMD, 중기 AMD, 후기 AMD, 비-신생혈관성 연령-관련 황반변성 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 눈 장애를 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
인간 만능 줄기 세포는 Kamao 등, Stem Cell Reports 2014:2:205-18에 개괄된 기술을 사용하여 RPE 세포로 분화되었으며, 이로써 그 전체가, 그리고 구체적으로 분화 기술 및 시약의 경우 개괄된 방법 및 시약에 대해 참조로 포함되며; 또한, Mandai 등, N Engl J Med, 2017, 376:1038-1046을 참조하고, 상기 내용은 RPE 세포의 시트를 생성하고 환자로 이식하기 위한 기술에 대해 그 전체가 본원에 포함된다. 분화는 일반적으로 RPE 관련 및/또는 특이적 마커의 존재를 평가함에 의해 또는 기능적으로 측정함에 의해, 당업계에 공지된 바와 같이 검정될 수 있다. 예를 들어, Kamao 등, Stem Cell Reports, 2014, 2(2):205-18을 참조하고, 상기 내용은 그 전체가, 그리고 구체적으로 결과 섹션의 첫 번째 단락에 개괄된 마커에 대해 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 시험관내 분화에 의해 저면역원성 만능 세포의 집단으로부터 저면역원성 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 집단을 생산하는 방법은 하기를 포함한다: (a) 액티빈 A, bFGF, BMP4/7, DKK1, IGF1, 노긴, BMP 억제제, ALK 억제제, ROCK 억제제, 및 VEGFR 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자 중 임의의 하나를 포함하는 제1 배양 배지에서 저면역원성 만능 세포의 집단을 배양하여 전-RPE 세포의 집단을 생성하는 단계; 및 (b) 제1 배양 배지와 상이한 제2 배양 배지에서 전-RPE 세포의 집단을 배양하여 저면역원성 RPE 세포의 집단을 생성하는 단계. 일부 구현예에서, ALK 억제제는 SB-431542, 이의 유도체, 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, ALK 억제제는 약 2 mM 내지 약 10 pM 범위의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, ROCK 억제제는 Y-27632, 이의 유도체, 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, ROCK 억제제는 약 1 pM 내지 약 10 pM 범위의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지 및/또는 제2 배양 배지에는 동물 혈청이 없다.
분화는 일반적으로 RPE 관련 및/또는 특이적 마커의 존재를 평가함에 의해 또는 기능적으로 측정함에 의해, 당업계에 공지된 바와 같이 검정될 수 있다. 예를 들어, Kamao 등, Stem Cell Reports, 2014, 2(2):205-18을 참조하고, 상기 내용은 그 전체가, 그리고 구체적으로 결과 섹션에 대해 본원에 참조로 포함된다.
본 발명에 사용하기 위한 RPE 세포의 추가 설명은 WO2020/018615호에서 확인되며, 본 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
치료적 적용을 위해, 개시된 방법에 따라 제조된 세포는 전형적으로 등장성 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 공급될 수 있고, 인간 투여를 위해 충분히 멸균된 조건 하에서 제조된다. 세포 조성물의 의약 제형의 일반적 원칙의 경우, "Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy," Morstyn & Sheridan 편저, Cambridge University Press, 1996; 및 "Hematopoietic Stem Cell Therapy," E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000을 참조한다. 세포는 유통 또는 임상 사용에 적합한 장치 또는 용기에 포장될 수 있다.
P. 세포 투여
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 분화된 저면역원성 만능 세포 유도체는 세포 유형 및 이들 세포의 궁극적인 용도 둘 다에 따라 달라지는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 이식될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 세포는 정맥내로 또는 환자의 특정 위치에 주사에 의해 이식될 수 있다. 특정 위치에 이식될 때, 세포는 이들이 고정되는 동안 분산을 방지하기 위해 젤 매트릭스에 현탁될 수 있다.
IV. 실시예
실시예 1
CD24-발현 세포의 대식세포 포식에 대한 CD24의 효과는 XCELLIGENCE 검정법을 사용하여 측정하였다. 간략하게, CD24를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입 (CD24 tg) 되거나 형질도입되지 않은 인간 B2M -/- CIITA -/- iPSC는 Essential 8 Flex 배지 (Thermo Fisher Scientific) 중에 희석된 피더-프리(feeder-free) 매트리젤 (hESC 인증됨, BD Biosciences, San Jose, CA)-코팅된 10 cm 디쉬 상에서 배양하였다. 배지는 24시간마다 교환하였으며, Versene (Gibco)을 1:6의 비율로 세포 계대 배양(passaging)에 사용하였다. 내피 세포로의 분화는 60% 컨플루언시(confluency)에서 시작되며, 배지는 5 μM CHIR-99021 (Selleckchem) 및 2% B-27 마이너스 인슐린을 함유하는 RPMI-1640 (둘 다 Gibco)으로 변경하였다. 2일째에, 배지를 환원 배지로 변경하였다: 2% B-27 마이너스 인슐린 (Gibco) 및 2 μM CHIR-99021을 함유하는 RPMI-1640. 배양 4일부터 7일까지, 세포를 RPMI-1640 EC 배지인, 2% B-27 마이너스 인슐린 뿐만 아니라 50 ng/ml 인간 혈관 내피 성장 인자 (VEGF; R&D Systems), 10 ng/ml 인간 섬유아세포 성장 인자 염기성 (FGFb; R&D Systems), 10 μM Y-27632 (Sigma-Aldrich), 및 1 μM SB 431542 (Sigma-Aldrich)를 함유하는 RPMI-1640에 노출시켰다. 내피 세포 클러스터는 7일째부터 볼 수 있으며, 세포는 보충제, 10% FCS hi (Gibco), 1% pen/strep, 25 ng/ml VEGF, 2　ng/ml FGFb, 10 μM Y-27632 (Sigma-Aldrich), 및 1 μM SB 431542 (Sigma-Aldrich)를 부가한 내피 세포 기저 배지 2 (PromoCell, Heidelberg, Germany)에서 유지하였다. 분화 프로토콜은 14일 후에 완료되며; 미분화 세포는 분화 과정 동안 분리된다. TRYPLE EXPRESS (Gibco)는 3~4일마다 세포를 1:3으로 계대 배양하는 데 사용하였다.
NK 세포 사멸 및 대식세포 사멸 검정법은 XCELLIGENCE MP 플랫폼 (ACEA BioSciences) 상에서 수행하였다. 특수한 96-웰 E-플레이트는 젤라틴 (Millipore)으로 코팅하였으며, 4 × 105 B2M -/- CIITA -/- CD24 tg 또는 4 × 105 B2M -/- CIITA -/- hiEC는 100 μl 세포-특이적 배지 내 플레이팅하였다. 세포 지수 값이 0.7에 도달한 후, 인간 NK 세포 또는 대식세포를 1 ug/ml 인간 IL-2 (PeproTech)와 함께 1:1의 이펙터 세포-대-표적 세포 (E:T) 비율로 첨가하였다. 음성 대조군으로서, 세포를 2% Triton X-100으로 처리하였다. 데이터는 RTCA 소프트웨어 (ACEA BioSciences)로 표준화되고 분석하였다. (CD24가 없는) B2M -/- CIITA -/- hiEC는 NK 세포와 대식세포에 의해 효과적으로 사멸된 반면, B2M -/- CIITA -/- CD24 tg hiEC는 대식세포에 의한 사멸로부터 보호되었다. 10 ug/ml의 항-CD24 항체 (Clone SN3, Novus Biologics)로 차단하면 보호 효과가 제거되었다. CD47 및 CD24 둘 다의 과발현은 B2M-/-CIITA-/- hiEC를 NK 세포 및 대식세포 둘 다에 의한 사멸로부터 보호한다.
실시예 2
대식세포 식세포작용은 또한 유세포 분석법을 사용하여 측정하였다. CD24를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입 (CD24 tg) 되거나 형질도입되지 않은 인간 B2M -/- CIITA -/- iPSC는 Essential 8 Flex 배지 (Thermo Fisher Scientific) 중에 희석된 피더-프리 매트리젤 (hESC 인증됨, BD Biosciences, San Jose, CA)-코팅된 10 cm 디쉬 상에서 배양하였다. 세포를 60% 컨플루언시에서 수확하고, 제조업체의 지침에 따라 PBS + 1:30,000 칼세인 AM에 세포를 현탁하여 37℃에서 15분 동안 칼세인 AM (Invitrogen)으로 형광 표지하였으며, 공동-배양 전에 40 ml PBS로 2회 세척하였다. 이후, 세포를 50 ng/ml 인간 TGFβ1 및 50 ng/ml 인간 IL-10으로 4일 동안 자극된 인간 대식세포와 함께 1:2의 이펙터-대-표적 세포 (E:T) 비율로 공동 배양하였다. 공동-배양 후, 식세포작용 검정법은 플레이트를 얼음 상에 위치시킴에 의해 중단시키고, 4℃에서 5분 동안 400g로 원심분리하였으며, A647-표지된 항-CD11b (클론 M1/70, BioLegend)로 염색하여 인간 대식세포를 식별하였다. 검정법은 Attune NxT 흐름 분석기에서 유세포 분석법에 의해 분석되었다. 식세포작용은 CD11b+칼시뉴린+대식세포의 수로 측정되며, 총 CD11b+대식세포의 백분율로 정량화되었다. (CD24가 없는) B2M -/- CIITA -/- hiEC는 현저하게 식균된 반면, B2M -/- CIITA -/- CD24 tg hiEC는 식세포작용으로부터 보호되었다. 10 ug/ml의 항-CD24 항체 (Clone SN3, Novus Biologics)로 차단하면 보호 효과가 제거되었다. 대식세포 식세포작용은 또한 유세포 분석법을 사용하여 측정하였다. CD24를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입 (CD24 tg) 되거나 형질도입되지 않은 인간 B2M -/- CIITA -/- iPSC는 Essential 8 Flex 배지 (Thermo Fisher Scientific) 중에 희석된 피더-프리 매트리젤 (hESC 인증됨, BD Biosciences, San Jose, CA)-코팅된 10 cm 디쉬 상에서 배양하였다. 세포를 60% 컨플루언시에서 수확하고, 제조업체의 지침에 따라 PBS + 1:30,000 칼세인 AM에 세포를 현탁하여 37℃에서 15분 동안 칼세인 AM (Invitrogen)으로 형광 표지하였으며, 공동-배양 전에 40 ml PBS로 2회 세척하였다. 이후, 세포를 50 ng/ml 인간 TGFβ1 및 50 ng/ml 인간 IL-10으로 4일 동안 자극된 인간 대식세포와 함께 1:2의 이펙터-대-표적 세포 (E:T) 비율로 공동 배양하였다. 공동-배양 후, 식세포작용 검정법은 플레이트를 얼음 상에 위치시킴에 의해 중단시키고, 4℃에서 5분 동안 400g로 원심분리하였으며, A647-표지된 항-CD11b (클론 M1/70, BioLegend)로 염색하여 인간 대식세포를 식별하였다. 검정법은 Attune NxT 흐름 분석기에서 유세포 분석법에 의해 분석되었다. 식세포작용은 CD11b+칼시뉴린+대식세포의 수로 측정되며, 총 CD11b+대식세포의 백분율로 정량화되었다. (CD24가 없는) B2M -/- CIITA -/- hiEC는 현저하게 식균된 반면, B2M -/- CIITA -/- CD24 tg hiEC는 식세포작용으로부터 보호되었다. 10 ug/ml의 항-CD24 항체 (Clone SN3, Novus Biologics)로 차단하면 보호 효과가 제거되었다.
모든 표제 및 섹션 명칭은 명확성 및 참조 목적을 위해서만 사용되고 임의의 방식으로도 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 예를 들어, 당업자는 본원에 기재된 본 발명의 사상 및 범주에 따라 적절하게 상이한 표제 및 섹션으로부터 다양한 측면을 조합하는 유용성을 인식할 것이다.
이로써 본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로, 모든 목적을 위해 이들 전체가 본원에 참조로 포함된다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 본 출원의 많은 변형 및 변경은 이의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 특정 구현예 및 실시예는 단지 예로서 제공되며, 본 출원은 청구범위가 부여하는 등가물의 전체 범주와 함께, 첨부된 청구범위의 조건에 의해서만 제한되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> SANA BIOTECHNOLOGY, INC. Schrepfer, Sonja Harr, Steve <120> CD24 EXPRESSING CELLS AND USES THEREOF <130> 122864-01-5007-WO <140> PCT/US20/47639 <141> 2020-08-24 <150> US 62/891,180 <151> 2019-08-23 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of CA-DUX4 <400> 1 atggcattgc ctacaccttc agactctacg ctgcctgcag aggctagggg aagaggtaga 60 cggcggcgat tggtgtggac tccatcacaa tccgaagctc ttcgcgcatg cttcgagcgc 120 aatccctatc cggggattgc cacaagggag aggcttgcac aggctatcgg aatcccggaa 180 ccgagagtgc agatctggtt ccaaaatgaa cgctctcggc agctcagaca gcatcgcagg 240 gagtcccgcc cgtggccagg aagaagggga ccacctgaag gaagaagaaa acgcacagcg 300 gtgactggca gccaaacggc tctgctgctc cgcgctttcg agaaagatcg gttccccgga 360 attgccgcac gcgaagaact cgccagagaa actgggctcc cagaatcacg aatacagatt 420 tggttccaga accgcagagc aagacaccca ggccaggggg gacgggcacc tgctcaggcc 480 ggtggactct gctctgctgc ccctgggggc ggccatccag caccttcctg ggtggctttc 540 gctcatactg gcgcttgggg taccgggctg cctgctccgc atgttccctg tgctccaggg 600 gccctcccgc agggagcgtt tgtttcccag gcagctaggg ctgcacctgc cctgcaacca 660 tcacaggcag cgccagctga aggcatcagc caacccgccc cagcccgcgg agattttgct 720 tatgcagcgc cagcacctcc agacggtgcc ctgagccacc cccaagcccc cagatggccc 780 cctcaccctg gtaagtcccg ggaagaccgc gatccccaac gagatggact gcccggtcct 840 tgcgctgtgg cccagccagg acctgctcaa gccggccctc aggggcaagg agtgctggcc 900 ccacctacaa gccagggatc tccctggtgg ggttggggac gcggacctca ggttgctgga 960 gccgcttggg agcctcaggc cggagctgca ccgccgccac aaccggcccc tcccgacgcg 1020 tcagcgtccg cccgacaagg ccagatgcag ggaatcccag cacctagcca agctcttcaa 1080 gagcctgccc cttggagcgc actgccgtgt gggctgctcc tggatgaact cctggctagc 1140 ccagaatttc tccagcaggc acagccactc ctggaaacag aagctccggg agagctcgaa 1200 gcctccgaag aagcagcaag cctggaggca cctctttccg aggaggagta tagagccctt 1260 ctggaagaac tttga 1275 <210> 2 <211> 689 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of GenBank Accession No. ACN62209.1 <400> 2 Met Gln Gly Arg Val Gln Ala Arg His Gly Ala Phe Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Arg Phe Gln Thr Gly His Thr Ala Asp Ser Pro Arg Cys Arg Thr Arg 20 25 30 Glu Ser Ile Val Arg Pro Ser Arg Arg Gly Gly Ile Ser Ser Leu Gly 35 40 45 Ser Arg Ser Gly Leu Leu Arg Gly Asn Glu Arg Glu Pro His Ala Cys 50 55 60 Val Cys Glu Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ile Ala Ser 65 70 75 80 Phe Thr Glu Arg Gly Pro Gly Thr Leu Lys Thr Pro Thr Glu Val Gln 85 90 95 Phe His Thr Pro Leu His Pro Pro Arg Leu Val Ser Pro Cys Cys Arg 100 105 110 Arg Val Gly Ala Gln Arg Ala Ala Ser Arg Ser Arg Gly Ile Pro Gly 115 120 125 Glu Val Arg Arg Ala Gly Pro Arg Asn Ala Pro Pro Ser Pro Leu Pro 130 135 140 Pro Leu Pro Val Pro Leu Arg Leu Ser Gly Pro Thr Thr Thr Thr Ala 145 150 155 160 Thr Thr Pro Ser Pro Thr Thr Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Ala Gly Pro Arg Pro Arg Arg Pro Gly Ser Leu Pro Gly 180 185 190 Trp Gly Gly Leu Ser Gln Gly Gly Ser Pro Pro Phe Met Lys Gly Trp 195 200 205 Ser Leu Pro Ala Cys Gly Pro Leu Gln Gly Arg Leu Ala Gly Trp Leu 210 215 220 Ala 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1 5 10 15 Gly Arg Gly Arg Arg Arg Arg Leu Val Trp Thr Pro Ser Gln Ser Glu 20 25 30 Ala Leu Arg Ala Cys Phe Glu Arg Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Thr 35 40 45 Arg Glu Arg Leu Ala Gln Ala Ile Gly Ile Pro Glu Pro Arg Val Gln 50 55 60 Ile Trp Phe Gln Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg 65 70 75 80 Glu Ser Arg Pro Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg 85 90 95 Lys Arg Thr Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala 100 105 110 Phe Glu Lys Asp Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala 115 120 125 Arg Glu Thr Gly Leu Pro Glu Ser Arg Ile Gln Ile Trp Phe Gln Asn 130 135 140 Arg Arg Ala Arg His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala 145 150 155 160 Gly Gly Leu Cys Ser Ala Ala Pro Gly Gly Gly His Pro Ala Pro Ser 165 170 175 Trp Val Ala Phe Ala His Thr Gly Ala Trp Gly Thr Gly Leu Pro Ala 180 185 190 Pro His Val Pro Cys Ala Pro Gly Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Val 195 200 205 Ser Gln Ala Ala Arg Ala Ala Pro Ala Leu Gln Pro Ser Gln Ala Ala 210 215 220 Pro Ala 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Sequence <220> <223> synthetic sequence of GenBank - AUA60622.1 <400> 6 Met Ala Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ser Thr Leu Pro Ala Glu Ala Arg 1 5 10 15 Gly Arg Gly Arg Arg Arg Arg Leu Val Trp Thr Pro Ser Gln Ser Glu 20 25 30 Ala Leu Arg Ala Cys Phe Glu Arg Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Thr 35 40 45 Arg Glu Arg Leu Ala Gln Ala Ile Gly Ile Pro Glu Pro Arg Val Gln 50 55 60 Ile Trp Phe Gln Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg 65 70 75 80 Glu Ser Arg Pro Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg 85 90 95 Lys Arg Thr Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala 100 105 110 Phe Glu Lys Asp Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala 115 120 125 Arg Glu Thr Gly Leu Pro Glu Ser Arg Ile Gln Ile Trp Phe Gln Asn 130 135 140 Arg Arg Ala Arg His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala 145 150 155 160 Gly Gly Leu Cys Ser Ala Ala Pro Gly Gly Gly His Pro Ala Pro Ser 165 170 175 Trp Val Ala Phe Ala His Thr Gly Ala Trp Gly Thr Gly Leu Pro Ala 180 185 190 Pro His Val Pro Cys Ala 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Ser Leu Glu Ala Pro Leu Ser Glu Glu Glu 405 410 415 Tyr Arg Ala Leu Leu Glu Glu Leu 420 <210> 7 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of GenBank - ADK24683.1 <400> 7 Met Ala Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ser Thr Leu Pro Ala Glu Ala Arg 1 5 10 15 Gly Arg Gly Arg Arg Arg Arg Leu Val Trp Thr Pro Ser Gln Ser Glu 20 25 30 Ala Leu Arg Ala Cys Phe Glu Arg Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Thr 35 40 45 Arg Glu Arg Leu Ala Gln Ala Ile Gly Ile Pro Glu Pro Arg Val Gln 50 55 60 Ile Trp Phe Gln Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg 65 70 75 80 Glu Ser Arg Pro Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg 85 90 95 Lys Arg Thr Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala 100 105 110 Phe Glu Lys Asp Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala 115 120 125 Arg Glu Thr Gly Leu Pro Glu Ser Arg Ile Gln Ile Trp Phe Gln Asn 130 135 140 Arg Arg Ala Arg His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala 145 150 155 160 Gly Gly Leu Cys Ser Ala Ala Pro Gly Gly Gly 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Arg 85 90 95 Lys Arg Thr Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala 100 105 110 Phe Glu Lys Asp Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Xaa Glu Glu Leu Ala 115 120 125 Arg Glu Thr Gly Leu Pro Glu Ser Arg Ile Gln Ile Trp Phe Gln Asn 130 135 140 Arg Arg Ala Arg His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala 145 150 155 160 Gly Gly Leu Cys Ser Ala Ala Pro Gly Gly Gly His Pro Ala Pro Ser 165 170 175 Trp Val Ala Phe Ala His Thr Gly Ala Trp Gly Thr Gly Leu Pro Ala 180 185 190 Pro His Val Pro Cys Ala Pro Gly Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Val 195 200 205 Ser Gln Ala Ala Arg Ala Ala Pro Ala Leu Gln Pro Ser Gln Ala Ala 210 215 220 Pro Ala Glu Gly Ile Ser Gln Pro Ala Pro Ala Arg Gly Asp Phe Ala 225 230 235 240 Tyr Ala Ala Pro Ala Pro Pro Asp Gly Ala Leu Ser His Pro Gln Ala 245 250 255 Pro Arg Trp Pro Pro His Pro Gly Lys Ser Arg Glu Asp Arg Asp Pro 260 265 270 Gln Arg Asp Gly Leu Pro Gly Pro Cys Ala Val Ala Gln Pro Gly Pro 275 280 285 Ala Gln Ala Gly Pro Gln Gly Gln Gly Val Leu Ala Pro Pro Thr Ser 290 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Asp Gly Ala Leu Ser His Pro Gln Ala 245 250 255 Pro Arg Trp Pro Pro His Pro Gly Lys Ser Arg Glu Asp Arg Asp Pro 260 265 270 Gln Arg Asp Gly Leu Pro Gly Pro Cys Ala Val Ala Gln Pro Gly Pro 275 280 285 Ala Gln Ala Gly Pro Gln Gly Gln Gly Val Leu Ala Pro Pro Thr Ser 290 295 300 Gln Gly Ser Pro Trp Trp Gly Trp Gly Arg Gly Pro Gln Val Ala Gly 305 310 315 320 Ala Ala Trp Glu Pro Gln Ala Gly Ala Ala Pro Pro Pro Gln Pro Ala 325 330 335 Pro Pro Asp Ala Ser Ala Ser Ala Arg Gln Gly Gln Met Gln Gly Ile 340 345 350 Pro Ala Pro Ser Gln Ala Leu Gln Glu Pro Ala Pro Trp Ser Ala Leu 355 360 365 Pro Cys Gly Leu Leu Leu Asp Glu Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Leu 370 375 380 Gln Gln Ala Gln Pro Leu Leu Glu Thr Glu Ala Pro Gly Glu Leu Glu 385 390 395 400 Ala Ser Glu Glu Ala Ala Ser Leu Glu Ala Pro Leu Ser Glu Glu Glu 405 410 415 Tyr Arg Ala Leu Leu Glu Glu Leu 420 <210> 12 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of GenBank - ADK24687.1 <400> 12 Met Ala Leu Pro Thr Pro Ser 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<211> 485 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of GenBank - ACP30487.1 <400> 13 Met Lys Gly Trp Ser Leu Pro Ala Cys Gly Pro Leu Gln Gly Arg Leu 1 5 10 15 Ala Gly Trp Leu Ala Val Arg Ala Gly Pro Leu Ala Ala Pro Ala Ala 20 25 30 Val His Ser Pro Ala Glu Val His Gly Ser Pro Pro Ala Ser Leu Cys 35 40 45 Pro Arg Pro Ser Val Lys Phe Arg Pro Gly Leu Thr Ala Met Ala Leu 50 55 60 Pro Thr Pro Ser Asp Ser Thr Leu Pro Ala Glu Ala Arg Gly Arg Gly 65 70 75 80 Arg Arg Arg Arg Leu Val Trp Thr Pro Ser Gln Ser Glu Ala Leu Arg 85 90 95 Ala Cys Phe Glu Arg Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Thr Arg Glu Arg 100 105 110 Leu Ala Gln Ala Ile Gly Ile Pro Glu Pro Arg Val Gln Ile Trp Phe 115 120 125 Gln Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg Glu Ser Arg 130 135 140 Pro Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg Lys Arg Thr 145 150 155 160 Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala Phe Glu Lys 165 170 175 Asp Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala Arg Glu Thr 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20 25 30 Ala Leu Arg Ala Cys Phe Glu Arg Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Thr 35 40 45 Arg Glu Arg Leu Ala Gln Ala Ile Gly Ile Pro Glu Pro Arg Val Gln 50 55 60 Ile Trp Phe Gln Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg 65 70 75 80 Glu Ser Arg Pro Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg 85 90 95 Lys Arg Thr Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala 100 105 110 Phe Glu Lys Asp Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala 115 120 125 Arg Glu Thr Gly Leu Pro Glu Ser Xaa Ile Gln Xaa Trp Phe Gln Asn 130 135 140 Arg Arg Ala Arg His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala 145 150 155 160 Gly Gly Leu Cys Ser Ala Ala Pro Gly Gly Gly His Pro Ala Pro Ser 165 170 175 Trp Val Ala Phe Ala His Thr Gly Ala Trp Gly Thr Gly Leu Pro Ala 180 185 190 Pro His Val Pro Cys Ala Pro Gly Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Val 195 200 205 Ser Gln Ala Ala Arg Ala Ala Pro Ala Leu Gln Pro Ser Gln Ala Ala 210 215 220 Pro Ala Glu Gly Val Ser Gln Pro Ala Pro Ala Arg Gly Asp Phe Ala 225 230 235 240 Tyr Ala Ala Pro Ala Pro Pro Asp Gly Ala Leu Ser His Pro Gln Ala 245 250 255 Pro Arg Trp Pro Pro His Pro Gly Lys Ser Arg Glu Asp Arg Asp Pro 260 265 270 Gln Arg Asp Gly Leu Pro Gly Pro Cys Ala Val Ala Gln Pro Gly Pro 275 280 285 Ala Gln Ala Gly Pro Gln Gly Gln Gly Val Leu Ala Pro Pro Thr Ser 290 295 300 Gln Gly Ser Pro Trp Trp Gly Trp Gly Arg Gly Pro Gln Val Ala Gly 305 310 315 320 Ala Ala Trp Glu Pro Gln Ala Gly Ala Ala Pro Pro Pro Gln Pro Ala 325 330 335 Pro Pro Asp Ala Ser Ala Ser Ala Arg Gln Gly Gln Met Gln Gly Ile 340 345 350 Pro Ala Pro Ser Gln Ala Leu Gln Glu Pro Ala Pro Trp Ser Ala Leu 355 360 365 Pro Cys Gly Leu Leu Leu Asp Glu Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Leu 370 375 380 Gln Gln Ala Gln Pro Leu Leu Glu Thr Glu Ala Pro Gly Glu Leu Glu 385 390 395 400 Ala Ser Glu Glu Ala Ala Ser Leu Glu Ala Pro Leu Ser Glu Glu Glu 405 410 415 Tyr Arg Ala Leu Leu Glu Glu Leu 420 <210> 16 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of GenBank - ADK24689.1 <220> <221> misc_feature <222> (140)..(140) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 16 Met Ala Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ser Thr Leu Pro Ala Glu Ala Arg 1 5 10 15 Gly Arg Gly Arg Arg Arg Arg Leu Val Trp Thr Pro Ser Gln Ser Glu 20 25 30 Ala Leu Arg Ala Cys Phe Glu Arg Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Thr 35 40 45 Arg Glu Arg Leu Ala Gln Ala Ile Gly Ile Pro Glu Pro Arg Val Gln 50 55 60 Ile Trp Phe Gln Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg 65 70 75 80 Glu Ser Arg Pro Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg 85 90 95 Lys Arg Thr Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala 100 105 110 Phe Glu Lys Asp Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala 115 120 125 Arg Glu Thr Gly Leu Pro Glu Ser Arg Ile Gln Xaa Trp Phe Gln Asn 130 135 140 Arg Arg Ala Arg His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala 145 150 155 160 Gly Gly Leu Cys Ser Ala Ala Pro Gly Gly Gly His Pro Ala Pro Ser 165 170 175 Trp Val Ala Phe Ala His Thr Gly Ala Trp Gly Thr Gly Leu Pro Ala 180 185 190 Pro 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Ser Glu Glu Ala Ala Ser Leu Glu Ala Pro Leu Ser Glu Glu Glu 405 410 415 Tyr Arg Ala Leu Leu Glu Glu Leu 420 <210> 17 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of GenBank - ADK24692.1 <400> 17 Met Ala Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ser Thr Phe Pro Ala Glu Ala Arg 1 5 10 15 Gly Arg Gly Arg Arg Arg Arg Leu Val Trp Thr Pro Ser Gln Ser Glu 20 25 30 Ala Leu Arg Ala Cys Phe Glu Arg Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Thr 35 40 45 Arg Glu Arg Leu Ala Gln Ala Ile Gly Ile Pro Glu Pro Arg Val Gln 50 55 60 Ile Trp Phe Gln Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg 65 70 75 80 Glu Ser Arg Pro Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg 85 90 95 Lys Arg Thr Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala 100 105 110 Phe Glu Lys Asp Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala 115 120 125 Arg Glu Thr Gly Leu Pro Glu Ser Trp Ile Gln Ile Trp Phe Gln Asn 130 135 140 Arg Arg Ala Arg His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala 145 150 155 160 Gly Gly Leu Cys Ser Ala 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Arg Leu Val Trp Thr Pro Ser Gln Ser Glu 20 25 30 Ala Leu Arg Ala Cys Phe Glu Arg Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Thr 35 40 45 Arg Glu Arg Leu Ala Gln Ala Ile Gly Ile Pro Glu Pro Arg Val Gln 50 55 60 Ile Trp Phe Gln Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg 65 70 75 80 Glu Ser Arg Pro Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg 85 90 95 Lys Arg Thr Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala 100 105 110 Phe Glu Lys Asp Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala 115 120 125 Arg Glu Thr Gly Leu Pro Glu Ser Xaa Ile Gln Xaa Trp Phe Gln Asn 130 135 140 Arg Arg Ala Arg His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala 145 150 155 160 Gly Gly Leu Cys Ser Ala Ala Pro Gly Gly Gly His Pro Ala Pro Ser 165 170 175 Trp Val Ala Phe Ala His Thr Gly Ala Trp Gly Thr Gly Leu Pro Ala 180 185 190 Pro His Val Pro Cys Ala Pro Gly Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Val 195 200 205 Ser Gln Ala Ala Arg Ala Ala Pro Ala Leu Gln Pro Ser Gln Ala Ala 210 215 220 Pro Ala Glu Gly Val Ser Gln Pro Ala Pro Ala Arg Gly Asp Phe Ala 225 230 235 240 Tyr Ala Ala Pro Ala Pro Pro Asp Gly Ala Leu Ser His Pro Gln Ala 245 250 255 Pro Arg Trp Pro Pro His Pro Gly Lys Ser Arg Glu Asp Arg Asp Pro 260 265 270 Gln Arg Asp Gly Leu Pro Gly Pro Cys Ala Val Ala Gln Pro Gly Pro 275 280 285 Ala Gln Ala Gly Pro Gln Gly Gln Gly Val Leu Ala Pro Pro Thr Ser 290 295 300 Gln Gly Ser Pro Trp Trp Gly Trp Gly Arg Gly Pro Gln Val Ala Gly 305 310 315 320 Ala Ala Trp Glu Pro Gln Ala Gly Ala Ala Pro Pro Pro Gln Pro Ala 325 330 335 Pro Pro Asp Ala Ser Ala Ser Ala Arg Gln Gly Gln Met Gln Gly Ile 340 345 350 Pro Ala Pro Ser Gln Ala Leu Gln Glu Pro Ala Pro Trp Ser Ala Leu 355 360 365 Pro Cys Gly Leu Leu Leu Asp Glu Leu Leu Ala Ser Leu Glu Phe Leu 370 375 380 Gln Gln Ala Gln Pro Leu Leu Glu Thr Glu Ala Pro Gly Glu Leu Glu 385 390 395 400 Ala Ser Glu Glu Ala Ala Ser Leu Glu Ala Pro Leu Ser Glu Glu Glu 405 410 415 Tyr Arg Ala Leu Leu Glu Glu Leu 420 <210> 21 <211> 422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of UniProtKB_Swiss-Prot - P0CJ87.1 <400> 21 Met Ala Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ser Thr Leu Pro Ala Glu Ala Arg 1 5 10 15 Gly Arg Gly Arg Arg Arg Arg Leu Val Trp Thr Pro Ser Gln Ser Glu 20 25 30 Ala Leu Arg Ala Cys Phe Glu Arg Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Thr 35 40 45 Arg Glu Arg Leu Ala Gln Ala Ile Gly Ile Pro Glu Pro Arg Val Gln 50 55 60 Ile Trp Phe Gln Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg 65 70 75 80 Glu Ser Arg Pro Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg 85 90 95 Lys Arg Thr Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala 100 105 110 Phe Glu Lys Asp Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala 115 120 125 Arg Glu Thr Gly Leu Pro Glu Ser Arg Ile Gln Ile Trp Phe Gln Asn 130 135 140 Arg Arg Ala Arg His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala 145 150 155 160 Gly Gly Leu Cys Ser Ala Ala Pro Gly Gly Gly His Pro Ala Pro Ser 165 170 175 Trp Val Ala Phe Ala His Thr Gly Ala Trp Gly Thr Gly Leu Pro Ala 180 185 190 Pro His Val Pro Cys Ala Pro Gly Ala Leu Pro 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Glu Glu Glu Tyr Arg 405 410 415 Ala Leu Leu Glu Glu Leu 420 <210> 22 <211> 422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of GenBank - ADK24714.1 <400> 22 Met Ala Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ser Thr Leu Pro Ala Glu Ala Arg 1 5 10 15 Gly Arg Gly Arg Arg Arg Arg Leu Val Trp Thr Pro Ser Gln Ser Glu 20 25 30 Ala Leu Arg Ala Cys Phe Glu Arg Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Thr 35 40 45 Arg Glu Arg Leu Ala Gln Ala Ile Gly Ile Pro Glu Pro Arg Val Gln 50 55 60 Ile Trp Phe Gln Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg 65 70 75 80 Glu Ser Arg Pro Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg 85 90 95 Lys Arg Thr Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala 100 105 110 Phe Glu Lys Asp Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala 115 120 125 Arg Glu Thr Gly Leu Pro Glu Ser Arg Ile Gln Ile Trp Phe Gln Asn 130 135 140 Arg Arg Ala Arg His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala 145 150 155 160 Gly Gly Leu Cys Ser Ala Ala Pro Gly Gly Gly His Pro Ala Pro Ser 165 170 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Ala Gln Pro Leu Leu Glu Thr Glu Ala Pro Gly Glu Leu Glu Ala Ser 385 390 395 400 Glu Glu Ala Ala Ser Leu Glu Ala Pro Leu Ser Glu Glu Glu Tyr Arg 405 410 415 Ala Leu Leu Glu Glu Leu 420 <210> 23 <211> 422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of GenBank - ADK24684.1 <400> 23 Met Ala Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ser Thr Leu Pro Ala Glu Ala Arg 1 5 10 15 Gly Arg Gly Arg Arg Arg Arg Leu Val Trp Thr Pro Ser Gln Ser Glu 20 25 30 Ala Leu Arg Ala Cys Phe Glu Arg Asn Pro His Pro Gly Ile Ala Thr 35 40 45 Arg Glu Arg Leu Ala Gln Ala Ile Gly Ile Pro Glu Pro Arg Val Gln 50 55 60 Ile Trp Phe Gln Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg 65 70 75 80 Glu Ser Arg Pro Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg 85 90 95 Lys Arg Thr Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala 100 105 110 Phe Glu Lys Asp Arg Phe Pro Gly Leu Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala 115 120 125 Arg Glu Thr Gly Leu Pro Glu Ser Arg Ile Gln Ile Trp Phe Gln Asn 130 135 140 Arg Arg Ala Arg His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala 145 150 155 160 Gly Gly Leu Cys Asn Ala Ala Pro Gly Gly Gly His Pro Ala Pro Ser 165 170 175 Trp Val Ala Phe Ala His Thr Gly Ala Trp Gly Thr Gly Leu Pro Ala 180 185 190 Pro His Val Pro Cys Ala Pro Gly Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Val 195 200 205 Ser Gln Ala Ala Arg Ala Ala Pro Ala Leu Gln Pro Ser Gln Ala Ala 210 215 220 Pro Ala Glu Gly Ile Ser Gln Pro Ala Pro Ala Arg Gly Asp Phe Ala 225 230 235 240 Tyr Ala Ala Pro Ala Pro Pro Asp Gly Ala Leu Ser His Pro Gln Ala 245 250 255 Pro Arg Trp Pro Pro His Pro Gly Lys Ser Arg Glu Asp Arg Asp Pro 260 265 270 Gln Arg Asp Gly Leu Pro Gly Pro Cys Ala Val Ala Gln Pro Gly Pro 275 280 285 Ala Gln Ala Gly Pro Gln Gly Gln Gly Val Leu Ala Pro Pro Thr Ser 290 295 300 Gln Gly Ser Pro Trp Trp Gly Trp Gly Arg Gly Pro Gln Val Ala Gly 305 310 315 320 Ala Ala Trp Glu Pro Gln Ala Gly Ala Ala Pro Pro Pro Gln Pro Ala 325 330 335 Pro Pro Asp Ala Ser Ala Arg Gln Gly Gln Met Gln Gly Ile Pro Ala 340 345 350 Pro Ser Gln Ala Leu Gln Glu Pro Ala Pro Trp Ser Ala Leu Pro Cys 355 360 365 Gly Leu Leu Leu Asp Glu Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Leu Gln Gln 370 375 380 Ala Gln Pro Leu Leu Glu Thr Glu Ala Pro Gly Glu Leu Glu Ala Ser 385 390 395 400 Glu Glu Ala Ala Ser Leu Glu Ala Pro Leu Ser Glu Glu Glu Tyr Arg 405 410 415 Ala Leu Leu Glu Glu Leu 420 <210> 24 <211> 356 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of GenBank - ADK24695.1 <400> 24 Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg Glu Ser Arg Pro 1 5 10 15 Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg Lys Arg Thr Ala 20 25 30 Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala Phe Glu Lys Asp 35 40 45 Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala Arg Glu Thr Gly 50 55 60 Leu Pro Glu Ser Arg Ile Gln Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ala Arg 65 70 75 80 His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala Gly Gly Leu Cys 85 90 95 Ser Ala Ala Pro Gly Gly Gly His Pro Ala Pro Ser Trp Val Ala Phe 100 105 110 Ala His Thr Gly Ala Trp Gly Thr Gly Leu Pro Ala Pro His Val Pro 115 120 125 Cys Ala Pro Gly Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Val Ser Gln Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Ala Pro Ala Leu Gln Pro Ser Gln Ala Ala Pro Ala Glu Gly 145 150 155 160 Ile Ser Gln Pro Ala Pro Ala Arg Gly Asp Phe Ala Tyr Ala Ala Pro 165 170 175 Ala Pro Pro Asp Gly Ala Leu Ser His Pro Gln Ala Pro Arg Trp Pro 180 185 190 Pro His Pro Gly Lys Ser Arg Glu Asp Arg Asp Pro Gln Arg Asp Gly 195 200 205 Leu Pro Gly Pro Cys Ala Val Ala Gln Pro Gly Pro Ala Gln Ala Gly 210 215 220 Pro Gln Gly Gln Gly Val Leu Ala Pro Pro Thr Ser Gln Gly Ser Pro 225 230 235 240 Trp Trp Gly Trp Gly Arg Gly Pro Gln Val Ala Gly Ala Ala Trp Glu 245 250 255 Pro Gln Ala Gly Ala Ala Pro Pro Pro Gln Pro Ala Pro Pro Asp Ala 260 265 270 Ser Ala Ser Ala Arg Gln Gly Gln Met Gln Gly Ile Pro Ala Pro Ser 275 280 285 Gln Ala Leu Gln Glu Pro Ala Pro Trp Ser Ala Leu Pro Cys Gly Leu 290 295 300 Leu Leu Asp Glu Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Leu Gln Gln Ala Gln 305 310 315 320 Pro Leu Leu Glu Thr Glu Ala Pro Gly Glu Leu Glu Ala Ser Glu Glu 325 330 335 Ala Ala Ser Leu Glu Ala Pro Leu Ser Glu Glu Glu Tyr Arg Ala Leu 340 345 350 Leu Glu Glu Leu 355 <210> 25 <211> 356 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of GenBank - ADK24699.1 <220> <221> misc_feature <222> (293)..(293) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (300)..(300) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 25 Asn Glu Arg Ser Arg Gln Leu Arg Gln His Arg Arg Glu Ser Arg Pro 1 5 10 15 Trp Pro Gly Arg Arg Gly Pro Pro Glu Gly Arg Arg Lys Arg Thr Ala 20 25 30 Val Thr Gly Ser Gln Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ala Phe Glu Lys Asp 35 40 45 Arg Phe Pro Gly Ile Ala Ala Arg Glu Glu Leu Ala Arg Glu Thr Gly 50 55 60 Leu Pro Glu Ser Arg Ile Gln Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ala Arg 65 70 75 80 His Pro Gly Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ala Gln Ala Gly Gly Leu Cys 85 90 95 Ser Ala Ala Pro Gly Gly Gly His Pro Ala Pro Ser Trp Val Ala Phe 100 105 110 Ala His Thr Gly Ala Trp Gly Thr Gly Leu Pro Ala Pro His Val Pro 115 120 125 Cys Ala Pro Gly Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Val Ser Gln Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Ala Pro Ala Leu Gln Pro Ser Gln Ala Ala Pro Ala Glu Gly 145 150 155 160 Ile Ser Gln Pro Ala Pro Ala Arg Gly Asp Phe Ala Tyr Ala Ala Pro 165 170 175 Ala Pro Pro Asp Gly Ala Leu Ser His Pro Gln Ala Pro Arg Trp Pro 180 185 190 Pro His Pro Gly Lys Ser Arg Glu Asp Arg Asp Pro Gln Arg Asp Gly 195 200 205 Leu Pro Gly Pro Cys Ala Val Ala Gln Pro Gly Pro Ala Gln Ala Gly 210 215 220 Pro Gln Gly Gln Gly Val Leu Ala Pro Pro Thr Ser Gln Gly Ser Pro 225 230 235 240 Trp Trp Gly Trp Gly Arg Gly Pro Gln Val Ala Gly Ala Ala Trp Glu 245 250 255 Pro Gln Ala Gly Ala Ala Pro Pro Pro Gln Pro Ala Pro Pro Asp Ala 260 265 270 Ser Ala Ser Ala Arg Gln Gly Gln Met Gln Gly Ile Pro Ala Pro Ser 275 280 285 Gln Ala Leu Gln Xaa Pro Ala Pro Trp Ser Ala Xaa Pro Cys Gly Leu 290 295 300 Leu Leu Asp Glu Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Leu Gln Gln Ala Gln 305 310 315 320 Pro Leu Leu Glu Thr Glu Ala Pro Gly Glu Leu Glu Ala Ser Glu Glu 325 330 335 Ala Ala Ser Leu Glu Ala Pro Leu Ser Glu Glu Glu Tyr Arg Ala Leu 340 345 350 Leu Glu Glu Leu 355 <210> 26 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of NCBI Reference Sequence - NP_001768.1 for CD47 isoform 1 precursor <400> 26 Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe 20 25 30 Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala 35 40 45 Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60 Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80 Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95 Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110 Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125 Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140 Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160 Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175 Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190 Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205 Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220 Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240 Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255 Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile 260 265 270 Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr 275 280 285 Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys 290 295 300 Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met 305 310 315 320 Asn Asp Glu <210> 27 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of NCBI Reference Sequence - NP_942088.1 for CD47 isoform 2 precursor <400> 27 Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe 20 25 30 Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala 35 40 45 Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60 Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80 Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95 Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110 Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125 Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140 Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160 Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175 Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190 Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205 Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220 Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240 Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255 Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile 260 265 270 Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr 275 280 285 Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn 290 295 300 Asn 305 <210> 28 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of NCBI Reference Sequence - NP_001278666.1 for signal transducer CD24 isoform a preproprotein <400> 28 Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly 20 25 30 Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro 35 40 45 Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Ala Ala Gly Gly Ala Leu Gln Ser 50 55 60 Thr Ala Ser Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr Ser 65 70 75 80 <210> 29 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of NCBI Reference Sequence - NP_001278667.1 for signal transducer CD24 isoform a preproprotein <400> 29 Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly 20 25 30 Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro 35 40 45 Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Ala Ala Gly Gly Ala Leu Gln Ser 50 55 60 Thr Ala Ser Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr Ser 65 70 75 80 <210> 30 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of NCBI Reference Sequence - NP_001278668.1 for signal transducer CD24 isoform b <400> 30 Met Val Gly Arg Phe Cys Pro Glu Ser Pro Pro Gly Phe Val Arg Val 1 5 10 15 Ala Ala Thr Ser Ala Val Ser Leu Asp Pro Pro Ser Gly Glu Pro Arg 20 25 30 Pro Gly Cys Gly Tyr Pro Gly Pro Arg Ser Ala Ala Ser Arg Val Tyr 35 40 45 Gly Cys Thr Ala Pro Ala Arg Glu Thr Gly Gly Trp Ala Trp Glu Thr 50 55 60 Leu Ala Gly Ala Gly Ala Lys Lys Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr 65 70 75 80 Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala 85 90 95 Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Ala Ala Gly Gly Ala Leu Gln 100 105 110 Ser Thr Ala Ser Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr 115 120 125 Ser <210> 31 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of NCBI Reference Sequence - NP_037362.1 for signal transducer CD24 isoform a preproprotein <400> 31 Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly 20 25 30 Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro 35 40 45 Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Ala Ala Gly Gly Ala Leu Gln Ser 50 55 60 Thr Ala Ser Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr Ser 65 70 75 80 <210> 32 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of Mature CD47 isoform 1 <400> 32 Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn 1 5 10 15 Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn 20 25 30 Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr 35 40 45 Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser 50 55 60 Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys 85 90 95 Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys 100 105 110 Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu Ile Val 115 120 125 Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe Gly Ile 130 135 140 Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr Ile Ala 145 150 155 160 Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val Gly Ala 165 170 175 Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr Gly Leu 180 185 190 Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His Tyr Tyr 195 200 205 Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala Ile Leu 210 215 220 Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu Ser Leu 225 230 235 240 Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly 245 250 255 Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys 260 265 270 Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys Ala Val 275 280 285 Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met Asn Asp 290 295 300 Glu 305 <210> 33 <211> 287 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of Mature CD47 isoform 2 <400> 33 Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn 1 5 10 15 Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn 20 25 30 Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr 35 40 45 Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser 50 55 60 Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys 85 90 95 Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys 100 105 110 Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu Ile Val 115 120 125 Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe Gly Ile 130 135 140 Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr Ile Ala 145 150 155 160 Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val Gly Ala 165 170 175 Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr Gly Leu 180 185 190 Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His Tyr Tyr 195 200 205 Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala Ile Leu 210 215 220 Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu Ser Leu 225 230 235 240 Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly 245 250 255 Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys 260 265 270 Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn Asn 275 280 285

Claims (173)

  1. MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현 및 세포에서 CD24의 발현을 증가시키는 변형을 포함하는 단리된 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 포함하는 것인, 단리된 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포는 CIITA 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 CIITA 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 더 포함하는 것인, 단리된 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 세포에서 CD47, DUX4, CD27, CD35, CD46, CD55, CD59, CD200, HLA-C, HLA-E, HLA-E 중쇄, HLA-G, PD-L1, IDO1, CTLA4-Ig, C1-억제제, IL-10, IL-35, FASL, CCL21, Mfge8, 및 Serpinb9로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 변형을 더 포함하는 것인, 단리된 세포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 세포는 세포에서 CD47의 발현을 증가시키는 변형을 더 포함하는 것인, 단리된 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 B2M 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 B2M 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 더 포함하는 것인, 단리된 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 NLRC5 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 더 포함하는 것인, 단리된 세포.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 세포.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 CIITA 유전자를 표적화하는 유전적 변형은 CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 포함하는 것인, 단리된 세포.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 B2M 유전자를 표적화하는 유전자 변형은 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 포함하는 것인, 단리된 세포.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전적 변형은 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 포함하는 것인, 단리된 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD24의 발현을 증가시키는 변형은 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인, 단리된 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열인, 단리된 세포.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열인, 단리된 세포.
  15. 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD47, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 변형은 CD47, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인, 단리된 세포.
  16. 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD47의 발현을 증가시키는 변형은 CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인, 단리된 세포.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터는 유도성 발현 벡터인, 단리된 세포.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터인, 단리된 세포.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD24의 발현을 증가시키는 변형은 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 세포의 선택된 유전자좌로 도입하는 것을 포함하는 것인, 단리된 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열인, 단리된 세포.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열인, 단리된 세포.
  22. 제4항 내지 제15항 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 변형은 CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 세포의 선택된 유전자좌로 도입하는 것을 포함하는 것인, 단리된 세포.
  23. 제22항에 있어서, 상기 CD47의 발현을 증가시키는 변형은 CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 세포의 선택된 유전자좌로 도입하는 것을 포함하는 것인, 단리된 세포.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 선택된 유전자좌 및/또는 CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 선택된 유전자좌는 세이프 하버 유전자좌인 것인, 단리된 세포.
  25. 제24항에 있어서, 상기 세이프 하버는 AAVS1 유전자좌, CCR5 유전자좌, CLYBL 유전자좌, ROSA26 유전자좌, 및 SHS231 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 세포.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 자살 스위치를 더 포함하는, 단리된 세포.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포, 분화된 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 전구 세포, 체세포, 1차 T 세포 및 키메라 항원 수용체 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 세포.
  28. CD24를 포함하는 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입함으로써, CD24를 포함하는 세포를 생산하는 것을 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열인, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열인, 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD24를 포함하는 세포는 CIITA 유전자를 표적화하기 위한 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 포함하는 CIITA 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 더 포함하는 것인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 유전적 변형은 CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산을 포함하는 것인, 방법.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터는 유도성 발현 벡터인, 방법.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터인, 방법.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD24를 포함하는 세포는 CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 벡터를 더 포함하는 것인, 방법.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 발현 벡터는 CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 제2 발현 벡터는 유도성 발현 벡터인, 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 발현 벡터는 바이러스 벡터인, 방법.
  39. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD24를 포함하는 세포는 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 포함하는 B2M 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 더 포함하는 것인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 유전적 변형은 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산을 포함하는 것인, 방법.
  41. 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD24를 포함하는 세포는 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 포함하는 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 더 포함하는 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 유전적 변형은 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산을 포함하는 것인, 방법.
  43. 제28항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포, 분화된 세포, 배아 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 전구 세포, 체세포, 1차 T 세포 및 키메라 항원 수용체 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  44. CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 줄기 세포의 선택된 유전자좌로 도입함으로써, 저면역원성 줄기 세포를 생산하는 것을 포함하는 저면역원성 줄기 세포를 제조하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열인, 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열인, 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, CIITA 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 줄기 세포로 도입하는 것을 포함하는, 줄기 세포에서 CIITA 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 생성하는 것을 더 포함하고, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 도입은 CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산을 도입하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  49. 제44항 내지 제48항에 있어서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 선택된 유전자좌는 세이프 하버 유전자좌인 것인, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 CD24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 세이프 하버 유전자좌는 AAVS1 유전자좌, CCR5 유전자좌, CLYBL 유전자좌, ROSA26 유전자좌, 및 SHS231 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  51. 제44항 내지 제50항에 있어서, CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 줄기 세포의 선택된 유전자좌로 도입하는 것을 더 포함하는 것인, 방법.
  52. 제44항 내지 제51항에 있어서, CD47을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 줄기 세포의 선택된 유전자좌로 도입하는 것을 더 포함하는 것인, 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 선택된 유전자좌는 세이프 하버 유전자좌인 것인, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 세이프 하버 유전자좌는 AAVS1 유전자좌, CCR5 유전자좌, CLYBL 유전자좌, ROSA26 유전자좌, 및 SHS231 유전자좌로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  55. 제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, B2M 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 줄기 세포로 도입하는 것을 포함하는, 줄기 세포에서 B2M 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 생성하는 것을 더 포함하고, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 도입은 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산을 도입하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  57. 제44항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, NLRC5 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 줄기 세포로 도입하는 것을 포함하는, 줄기 세포에서 NLRC5 유전자를 표적화하는 유전적 변형을 생성하는 것을 더 포함하고, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 도입은 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 가이드 리보핵산을 도입하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  59. 제44항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 자살 스위치를 포함하는 발현 벡터를 줄기 세포로 도입하는 것을 더 포함하는, 방법.
  60. 제44항 내지 제59항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 저면역원성 줄기 세포를 분화 조건하에서 배양함으로써, 분화된 저면역원성 세포를 제조하는 것을 포함하는 분화된 저면역원성 세포를 제조하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 분화 조건은 줄기 세포를 심장 세포, 신경 세포, 내피 세포, T 세포, 췌장 섬 세포, 망막 색소 상피 세포, 신장 세포, 간 세포, 갑상선 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 및 상피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 유형으로 분화시키기에 적합한 것인, 방법.
  62. 제60항 또는 제61항의 방법에 따라 제조된 분화된 저면역원성 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법.
  63. CD24를 발현하고, MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  64. CD24를 발현하고, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  65. CIITA를 발현하지 않고, CD24를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  66. B2M을 발현하지 않고, CD24를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  67. NLRC5를 발현하지 않고, CD24를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  68. CD24 및, CD47, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  69. CD24 및 CD47을 발현하고, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  70. CIITA를 발현하지 않고, CD24, 및 CD47, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 발현하고, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  71. CIITA를 발현하지 않고, CD24 및 CD47을 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  72. CIITA 및 B2M을 발현하지 않고, CD24를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  73. CIITA 및 B2M을 발현하지 않고, CD24, 및 CD47, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  74. CIITA 및 B2M을 발현하지 않고, CD24 및 CD47을 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  75. CIITA 및 NLRC5를 발현하지 않고, CD24를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  76. CIITA 및 NLRC5를 발현하지 않고, CD24, 및 CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  77. CIITA 및 NLRC5를 발현하지 않고, CD24 및 CD47을 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  78. CIITA, B2M 및 NLRC5를 발현하지 않고, CD24, 및 CD47, CD35, DUX4, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA4, C1-억제제, CD46, CD55, CD59 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  79. CIITA, B2M 및 NLRC5를 발현하지 않고, CD24 및 CD47을 발현하며, MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 세포.
  80. 제63항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포, 분화된 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 전구 세포, 체세포, 1차 T 세포 및 키메라 항원 수용체 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 세포.
  81. 분화 조건하에서 배양하여 심장 세포, 신경 세포, 내피 세포, T 세포, 췌장 섬 세포, 망막 색소 상피 (RPE) 세포, 신장 세포, 간 세포, 갑상선 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 및 상피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 분화된 세포를 생성함으로써, 제80항의 만능 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포.
  82. 외인성 CD24 폴리펩티드를 포함하는 단리된 줄기 세포.
  83. 제82항에 있어서, 상기 세포는 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 것인, 단리된 세포.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 상기 CD24 폴리펩티드는 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 세포.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는, 단리된 세포.
  86. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 MHC II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는, 단리된 세포.
  87. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 MHC 클래스 I 및 MHC II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는, 단리된 세포.
  88. 제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 CIITA의 감소된 발현을 갖는, 단리된 세포.
  89. 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 B2M의 감소된 발현을 갖는, 단리된 세포.
  90. 제82항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 NLRC5의 감소된 발현을 갖는, 단리된 세포.
  91. 제82항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, CIITA의 발현을 감소시키는 CIITA를 표적화하는 게놈 변형을 더 포함하는, 단리된 세포.
  92. 제82항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, B2M의 발현을 감소시키는 B2M을 표적화하는 게놈 변형을 더 포함하는, 단리된 세포.
  93. 제82항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, NLRC5의 발현을 감소시키는 NLRC5를 표적화하는 게놈 변형을 더 포함하는, 단리된 세포.
  94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈 변형은 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 포함하는 것인, 단리된 세포.
  95. 제94항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 세포.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 CIITA를 표적화하는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 단리된 세포.
  97. 제96항에 있어서, CIITA를 표적화하는 Cas 단백질에 의해 인식되는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 더 포함하는, 단리된 세포.
  98. 제97항에 있어서, 상기 CIITA를 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041호의 서열번호 5184 내지 36352로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 세포.
  99. 제94항 또는 제95항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 B2M을 표적화하는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 단리된 세포.
  100. 제99항에 있어서, B2M을 표적화하는 Cas 단백질에 의해 인식되는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 더 포함하는, 단리된 세포.
  101. 제100항에 있어서, 상기 B2M을 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041호의 서열번호 81240 내지 85644로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 세포.
  102. 제94항 또는 제95항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 NLRC5를 표적화하는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 단리된 세포.
  103. 제102항에 있어서, NLRC5를 표적화하는 Cas 단백질에 의해 인식되는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 더 포함하는, 단리된 세포.
  104. 제103항에 있어서, 상기 NLRC5를 표적화하는 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041호의 서열번호 36353 내지 81239로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 세포.
  105. 제82항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, CIITA의 발현을 감소시키는 유전자 발현 변형을 더 포함하는, 단리된 세포.
  106. 제82항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, B2M의 발현을 감소시키는 유전자 발현 변형을 더 포함하는, 단리된 세포.
  107. 제82항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, NLRC5의 발현을 감소시키는 유전자 발현 변형을 더 포함하는, 단리된 세포.
  108. 제105항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 발현 변형은 siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 안티센스 RNA, 및 기타 RNA-매개 억제 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함하는 것인, 단리된 세포.
  109. 제82항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 외인성 면역조절 인자를 더 포함하는, 단리된 세포.
  110. 제82항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 면역조절 인자를 더 포함하는, 단리된 세포.
  111. 제82항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 및 성체 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 세포.
  112. 분화 조건하에서 제82항 내지 제111항 중 어느 한 항의 줄기 세포로부터 생성된 단리된 세포.
  113. 제82항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 저면역원성인 것인, 단리된 세포.
  114. 외인성 CD24 폴리펩티드를 포함하는 줄기 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 CD24 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 CD24 폴리펩티드는 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  116. 제114항 또는 제115항에 있어서, 상기 발현 벡터는 유도성 발현 벡터인, 방법.
  117. 제114항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터인, 방법.
  118. 제114항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터는 세이프 하버 유전자좌를 특이적으로 표적화하는 것인, 방법.
  119. 제118항에 있어서, 상기 세이프 하버 유전자좌는 AAVS1 유전자좌인, 방법.
  120. 제114항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, CIITA 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포로 도입하는 것을 더 포함하는, 방법.
  121. 제114항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, B2M 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포로 도입하는 것을 더 포함하는, 방법.
  122. 제114항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, NLRC5 유전자를 선택적으로 불활성화시키는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포로 도입하는 것을 더 포함하는, 방법.
  123. 제120항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질, TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 호밍 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  124. 제120항 또는 제123항에 있어서, CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 도입하는 것을 더 포함하고, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
  125. 제124항에 있어서, 상기 CIITA 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041호의 서열번호 5184 내지 36352로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  126. 제121항 또는 제123항에 있어서, B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 도입하는 것을 더 포함하고, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 B2M 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041호의 서열번호 81240 내지 85644로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  128. 제122항 또는 제123항에 있어서, NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열을 도입하는 것을 더 포함하고, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 NLRC5 유전자를 특이적으로 표적화하기 위한 적어도 하나의 가이드 리보핵산 서열은 WO2016183041호의 서열번호 36353 내지 81239로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  130. 제114항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, CIITA의 발현을 감소시키는 유전자 발현 변형 분자를 세포로 도입하는 것을 더 포함하고, 상기 유전자 발현 변형 분자는 CIITA를 특이적으로 표적화하는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 안티센스 RNA, 및 기타 RNA-매개 억제 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함하는 것인, 방법.
  131. 제114항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, B2M의 발현을 감소시키는 유전자 발현 변형 분자를 세포로 도입하는 것을 더 포함하고, 상기 유전자 발현 변형 분자는 B2M을 특이적으로 표적화하는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 안티센스 RNA, 및 기타 RNA-매개 억제 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함하는 것인, 방법.
  132. 제114항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, NLRC5의 발현을 감소시키는 유전자 발현 변형 분자를 세포로 도입하는 것을 더 포함하고, 상기 유전자 발현 변형 분자는 NLRC5를 특이적으로 표적화하는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 안티센스 RNA, 및 기타 RNA-매개 억제 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함하는 것인, 방법.
  133. 제114항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역관용 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 도입하는 것을 더 포함하는, 방법.
  134. 제114항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 발현 벡터를 도입하는 것을 더 포함하고, 상기 제1 발현 벡터는 HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 제1 면역관용 폴리펩티드를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 제2 발현 벡터는 HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제, 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 면역관용 폴리펩티드를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 방법.
  135. 제133항 또는 제134항에 있어서, 상기 발현 벡터, 제1 발현 벡터, 및/또는 제2 발현 벡터는 유도성 발현 벡터인, 방법.
  136. 제133항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터, 제1 발현 벡터, 및/또는 제2 발현 벡터는 바이러스 벡터인, 방법.
  137. 제133항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터, 제1 발현 벡터, 및/또는 제2 발현 벡터는 세이프 하버 유전자좌를 특이적으로 표적화하는 것인, 방법.
  138. 제137항에 있어서, 상기 세이프 하버 유전자좌는 AAVS1 유전자좌인 것인, 방법.
  139. 제114항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 자살 스위치를 포함하는 발현 벡터를 줄기 세포로 도입하는 것을 더 포함하는, 방법.
  140. 제114항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 및 성체 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  141. 제114항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포는 비변형 줄기 세포에 비해 MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 것인, 방법.
  142. 제114항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포는 비변형 줄기 세포에 비해 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 것인, 방법.
  143. 제114항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포는 비변형 줄기 세포에 비해 MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원의 감소된 발현을 갖는 것인, 방법.
  144. 제114항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포는 저면역원성인 것인, 방법.
  145. 제114항 내지 제144항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 줄기 세포를 분화 조건하에서 배양함으로써, 분화된 세포를 제조하는 것을 포함하는 분화된 세포를 제조하는 방법.
  146. 제145항에 있어서, 상기 분화 조건은 줄기 세포를 심장 세포, 간 세포, 신장 세포, 췌장 세포, 신경 세포, 면역 세포, 중간엽 세포, 및 내피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 유형으로 분화시키기에 적합한 것인, 방법.
  147. 제145항 또는 제146항의 방법에 따라 제조된 분화된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법.
  148. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포.
  149. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포.
  150. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포.
  151. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 CIITA를 발현하는 줄기 세포.
  152. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 B2M을 발현하는 줄기 세포.
  153. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 NLRC5를 발현하는 줄기 세포.
  154. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 CIITA, B2M, NLRC5, 및 이들의 조합을 발현하는 줄기 세포.
  155. 외인성 CD24 폴리펩티드, 및 HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자를 발현하는 줄기 세포.
  156. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 CIITA를 발현하는 줄기 세포.
  157. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 B2M을 발현하는 줄기 세포.
  158. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 NLRC5를 발현하는 줄기 세포.
  159. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 CIITA, B2M, NLRC5, 및 이들의 조합을 발현하는 줄기 세포.
  160. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 I 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포.
  161. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 II 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포.
  162. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포.
  163. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 CIITA를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포.
  164. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 B2M을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포.
  165. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 NLRC5를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포.
  166. 외인성 CD24 폴리펩티드 및 감소된 발현 수준의 CIITA, B2M, NLRC5, 및 이들의 조합을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포.
  167. 외인성 CD24 폴리펩티드, 및 HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포.
  168. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 CIITA를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포.
  169. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 B2M을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포.
  170. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 NLRC5를 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포.
  171. 외인성 CD24 폴리펩티드, HLA-C, HLA-E, HLA-G, PD-L1, CTLA-4-Ig, C1-억제제 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역관용 인자, 및 감소된 발현 수준의 CIITA, B2M, NLRC5, 및 이들의 조합을 발현하는 줄기 세포로부터 생성된 분화된 세포.
  172. 제148항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 저면역원성인 것인, 줄기 세포.
  173. 제160항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 저면역원성인 것인, 분화된 세포.
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