JP2022546317A - Ｃｄ２４発現細胞およびそれらの用途 - Google Patents

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Abstract

本明細書に開示されるのは、ＣＤ２４を発現する細胞を含む細胞ならびにそれらの使用および生成の関連する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される細胞は、１つ以上のＭＨＣ Ｉおよび／またはＭＨＣ ＩＩヒト白血球抗原を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は低免疫原性である。【選択図】図１Ｇ

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年８月２３日に出願された米国仮出願第６２／８９１，１８０号の優先権を主張し、その開示は、その全体が本明細書に組み込まれる。
がんおよび変性疾患は、ヒトの健康に不均衡な脅威をもたらす。多くの場合、加齢に関連して、これらの疾患は、影響を受けた組織および器官の進行性の悪化をもたらし、最終的には、影響を受けた対象の障害および死をもたらす。再生医療の有望さは、疾患細胞または失われた細胞を新しい健康な細胞に置き換えることである。過去５年間で、再生医療の新しいパラダイムが出現しており、これは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の使用は、患者に移植するためのあらゆる成人細胞型を生成することである。原則として、ｈＰＳＣベースの細胞治療は、すべてではないにしてもほとんどの変性疾患を治療する可能性があるが、そのような治療の成功は、対象の免疫応答によって制限される場合がある。
免疫拒絶を克服すると考えられている戦略には、ＨＬＡ適合（例えば、一卵性双生児または臍帯血バンク）、対象への免疫抑制剤の投与、遮断抗体、骨髄抑制／混合キメリズム、ＨＬＡ適合幹細胞リポジトリ、および自己幹細胞療法が挙げられる。
細胞置換療法に関連する免疫拒絶反応を克服するための新しいアプローチ、組成物および方法の必要性が残っている。
一態様では、本明細書で提供されるのは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現、ならびに細胞におけるＣＤ２４の発現を増加させるための改変を含む単離された細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼによるＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する遺伝子改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞におけるＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ―Ｇ、ＰＤ―Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されるものの発現を増加させるための改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞におけるＣＤ４７の発現を増加させるための改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼによるＢ２Ｍ遺伝子を標的化する遺伝子改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＬＲＣ５遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼによるＮＬＲＣ５遺伝子を標的化する遺伝子改変をさらに含む。
いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるＢ２Ｍ遺伝子を標的化する遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるＮＬＲＣ５遺伝子を標的化する遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２４の発現を増加させるための改変は、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の発現を増加させるための改変は、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現を増加させるための改変は、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態では、記載されたポリペプチドのいずれかの発現を増加させるための発現ベクターは、誘導性発現ベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２４の発現を増加させるための改変は、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列を細胞の選択された遺伝子座に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるポリペプチドの発現を増加させるための改変は、ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、細胞の選択された遺伝子座に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現を増加させるための改変は、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を細胞の選択された遺伝子座に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列についての選択された遺伝子座ならびに／またはＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列についての選択された遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。いくつかの実施形態では、セーフハーバーは、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、細胞は、誘導性自殺スイッチをさらに含む。
いくつかの実施形態では、上記の細胞は、幹細胞、分化細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、前駆細胞、体細胞、一次Ｔ細胞およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞からなる群から選択される。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、ＣＤ２４を含む細胞（例えば、ＣＤ２４ポリペプチド）を調製する方法であり、この方法は、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを細胞に導入し、それによってＣＤ２４を含む細胞を産生することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２４を含む細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化するための、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択されるレアカットエンドヌクレアーゼを含むＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する遺伝子改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、誘導性発現ベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２４を含む細胞は、ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の発現ベクターは、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の発現ベクターは、誘導性発現ベクターである。いくつかの実施形態では、第２の発現ベクターはウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２４を含む細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択されるレアカットエンドヌクレアーゼを含むＢ２Ｍ遺伝子を標的化する遺伝子改変をさらに含む。場合によっては、遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２４を含む細胞は、ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択されるレアカットエンドヌクレアーゼを含むＮＬＲＣ５遺伝子を標的化する遺伝子改変をさらに含む。場合によっては、遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸を含む。
いくつかの実施形態では、上記の細胞は、幹細胞、分化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、成体幹細胞、前駆細胞、体細胞、一次Ｔ細胞、およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞からなる群から選択される。
本明細書で提供されるのは、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列を幹細胞の選択された遺伝子座に導入し、それによって低免疫原性幹細胞を産生する、低免疫原性幹細胞を調製する方法である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼを幹細胞に導入することを含む、幹細胞においてＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する遺伝子改変を生成することをさらに含み、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼの導入することは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列についての選択された遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列についてのセーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、低免疫原性幹細胞を調製する方法は、ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、幹細胞の選択された遺伝子座に導入することをさらに含む。ある特定の実施形態では、この方法は、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を幹細胞の選択された遺伝子座に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、選択された遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、低免疫原性幹細胞を調製する方法は、Ｂ２Ｍ遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼを幹細胞に導入することを含む、幹細胞においてＢ２Ｍ遺伝子を標的化する遺伝子改変を生成することをさらに含み、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼの導入することは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するために、少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む。
いくつかの実施形態では、低免疫原性幹細胞を調製する方法は、ＮＬＲＣ５遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼを幹細胞に導入することを含む、幹細胞においてＮＬＲＣ５遺伝子を標的化する遺伝子改変を生成することをさらに含み、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼの導入することは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するため少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む。
いくつかの実施形態では、低免疫原性幹細胞を調製する方法は、誘導性自殺スイッチを含む発現ベクターを幹細胞に導入することをさらに含む。
いくつかの態様では、提供されるのは、分化条件下で、本明細書に開示される任意の方法に従って調製された低免疫原性幹細胞を培養し、それにより分化した低免疫原性細胞を調製することを含む、分化低免疫原性細胞を調製する方法である。
いくつかの実施形態では、分化条件は、心臓細胞、神経細胞、内皮細胞、Ｔ細胞、膵島細胞、網膜色素上皮細胞、腎細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、血液細胞、および上皮細胞からなる群から選択される細胞型への幹細胞の分化に適切である。
いくつかの態様では、提供されるのは、本明細書に開示される方法に従って調製された分化した低免疫原性細胞の集団を投与することを含む、細胞治療を必要とする患者を治療する方法である。
本明細書で提供されるのは、ＣＤ２４を発現し、かつＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＤ２４を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡを発現せず、ＣＤ２４を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、Ｂ２Ｍを発現せず、ＣＤ２４を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＮＬＲＣ５を発現し、ＣＤ２４を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＤ２４と、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つとを発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＤ２４およびＣＤ４７を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡを発現せず、ＣＤ２４と、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドとを発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡを発現せず、ＣＤ２４およびＣＤ４７を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを発現せず、ＣＤ２４を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを発現せず、ＣＤ２４と、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドとを発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを発現せず、ＣＤ２４およびＣＤ４７を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５を発現せず、ＣＤ２４を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５を発現せず、ＣＤ２４と、ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドとを発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５を発現せず、ＣＤ２４およびＣＤ４７を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、およびＮＬＲＣ５を発現せず、ＣＤ２４と、ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドとを発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、およびＮＬＲＣ５を発現せず、ＣＤ２４およびＣＤ４７を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する細胞である。
いくつかの実施形態では、上記の細胞のうちのいずれか１つは、幹細胞、分化細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、前駆細胞、体細胞、一次Ｔ細胞およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞からなる群から選択される。
また、本明細書で提供されるのは、心臓細胞、神経細胞、内皮細胞、Ｔ細胞、膵島細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、腎臓細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、血液細胞、および上皮細胞からなる群から選択される分化細胞を生成する分化条件下で培養することによって、本明細書に記載される任意の多能性幹細胞または人工多能性幹細胞から生成された分化細胞である。
本開示の一態様では、本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチドを含む単離された幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するＣＤ２４ポリペプチドをコードするヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド）配列を発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するＣＤ２４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択されるＣＤ２４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現する。
いくつかの実施形態では、単離された細胞は、ＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する。他の実施形態では、細胞は、ＭＨＣ ＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する。さらに他の実施形態では、細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣ ＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＩＩＴＡの低下した発現を有する。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍの低下した発現を有する。特定の実施形態では、細胞は、ＮＬＲＣ５の低下した発現を有する。
いくつかの実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡの発現を低下させるために、ＣＩＩＴＡを標的化するゲノム改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、ゲノム改変は、レアカットエンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質またはＣＩＩＴＡを標的化するＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。場合によっては、細胞は、ＣＩＩＴＡを標的化するＣａｓタンパク質によって認識された少なくとも１つのガイドリボ核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡを標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択され、その配列表を含む開示は、その全体が参照により組み込まれる。
他の実施形態では、単離された細胞は、Ｂ２Ｍの発現を低下させるためにＢ２Ｍを標的化するゲノム改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、ゲノム改変は、レアカットエンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質またはＢ２Ｍを標的化するＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。場合によっては、細胞は、Ｂ２Ｍを標的化するＣａｓタンパク質によって認識された少なくとも１つのガイドリボ核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍを標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択され、配列表を含むその開示は、その全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、単離された細胞は、ＮＬＲＣ５の発現を低下させるためにＮＬＲＣ５を標的化するゲノム改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、ゲノム改変は、レアカットエンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質またはＮＬＲＣ５を標的化するＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。場合によっては、細胞は、ＮＬＲＣ５を標的化するＣａｓタンパク質によって認識された少なくとも１つのガイドリボ核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＲＣ５を標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号３６３５３～８１２３９からなる群から選択され、配列リストを含む開示は、その全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡの発現を低下させるために、遺伝子発現改変をさらに含む。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍの発現を低下させるための遺伝子発現改変をさらに含む。他の実施形態では、細胞は、ＮＬＲＣ５の発現を低下させるための遺伝子発現改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子発現改変は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および別のＲＮＡ媒介阻害分子からなる群から選択される１つを含む。
いくつかの実施形態では、単離された細胞は、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される外因性免疫調節因子をさらに含む。他の実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の外因性免疫調節因子をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される単離された細胞は、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、および成体幹細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、分化条件下で本明細書に記載される任意の幹細胞から生成された単離された細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、低免疫原性である、例えば、投与時に患者に対して低免疫原性である単離された細胞である。
一態様では、本明細書に提供されるには、外因性ＣＤ２４ポリペプチドを含む幹細胞を調製する方法であって、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するＣＤ２４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２４ポリペプチド配列は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択される。別の態様では、本明細書に提供されるには、外因性ＣＤ２４ポリペプチドを含む幹細胞を調製する方法であって、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するＣＤ２４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２４ポリペプチド配列は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ２４ポリヌクレオチドの発現ベクターは、誘導性発現ベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、セーフハーバー遺伝子座を特異的に標的化する。特定の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座はＡＡＶＳ１遺伝子座である。
いくつかの実施形態では、幹細胞を調製する方法は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。場合によっては、この方法はまた、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を導入することも含み、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択され、配列リストを含むその開示は、その全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、この方法は、Ｂ２Ｍ遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。場合によっては、この方法はまた、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を導入することも含み、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択され、配列リストを含むその開示は、その全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、この方法は、ＮＬＲＣ５遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。場合によっては、この方法はまた、ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を導入することも含み、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号３６３５３～８１２３９からなる群から選択され、配列リストを含むその開示は、その全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＩＩＴＡの発現を低下させるために遺伝子発現改変分子を細胞に導入することをさらに含み、遺伝子発現改変分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびＣＩＩＴＡを特異的に標的化する別のＲＮＡ媒介阻害分子からなる群から選択される１つを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、Ｂ２Ｍの発現を低下させるために遺伝子発現改変分子を細胞に導入することをさらに含み、遺伝子発現改変分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびＢ２Ｍを特異的に標的化する別のＲＮＡ媒介阻害分子からなる群から選択される１つを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＮＬＲＣ５の発現を低下させるために遺伝子発現改変分子を細胞に導入することをさらに含み、遺伝子発現改変分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびＮＬＲＣ５を特異的に標的化する別のＲＮＡ媒介阻害分子からなる群から選択される１つを含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１－阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される免疫寛容原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも２つの発現ベクターを導入することをさらに含み、第１の発現ベクターは、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１－阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される第１の免疫寛容原性ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、第２の発現ベクターは、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１－阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される異なる免疫寛容原性ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクター、第１の発現ベクター、および／または第２の発現ベクターは、誘導性発現ベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現ベクター、第１の発現ベクター、および／または第２の発現ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクター、第１の発現ベクター、および／または第２の発現ベクターは、セーフハーバー遺伝子座を特異的に標的化する。場合によっては、セーフハーバー遺伝子座はＡＡＶＳ１遺伝子座である。
いくつかの実施形態では、方法は、誘導性自殺スイッチを含む発現ベクターを幹細胞に導入することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、上記の幹細胞は、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、および成体幹細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、改変されていない幹細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する。いくつかの実施形態では、幹細胞は、改変されていない幹細胞と比較して、ＭＨＣ ＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する。いくつかの実施形態では、幹細胞は、改変されていない幹細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣ ＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、分化細胞を調製する方法であって、分化条件下で、本明細書に記載の幹細胞のいずれか１つまたは本明細書に概説される方法に従って調製された幹細胞のいずれか１つを培養し、それによって分化細胞を調製することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、分化条件は、幹細胞を、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、および内皮細胞からなる群から選択される細胞型に分化させるのに適切である。
別の態様では、限定されないが、細胞補充療法などの細胞ベースの療法を必要とする患者を治療する方法が本明細書に提供される。この方法は、本明細書に概説される任意の方法に従って調製された分化細胞の集団を投与することを含む。
本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原を発現する幹細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原を発現する幹細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、ならびに低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩヒト白血球抗原を発現する幹細胞である。
本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのＣＩＩＴＡを発現する幹細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのＢ２Ｍを発現する幹細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのＮＬＲＣ５を発現する幹細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、ならびに低下した発現レベルのＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、およびそれらの組み合わせを発現する幹細胞である。
本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子を発現する幹細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＣＩＩＴＡとを発現する幹細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＢ２Ｍとを発現する幹細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＮＬＲＣ５とを発現する幹細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、およびそれらの組み合わせとを発現する幹細胞である。
本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原を発現する幹細胞から生成された分化細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原を発現する幹細胞から生成された分化細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、ならびに低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩヒト白血球抗原を発現する幹細胞から生成された分化細胞である。
本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのＣＩＩＴＡを発現する幹細胞から生成された分化細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのＢ２Ｍを発現する幹細胞から生成された分化細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのＮＬＲＣ５を発現する幹細胞から生成された分化細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、ならびに低下した発現レベルのＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、およびそれらの組み合わせを発現する幹細胞から生成された分化細胞である。
本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子とを発現する幹細胞から生成された分化細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＣＩＩＴＡとを発現する幹細胞から生成された分化細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＢ２Ｍとを発現する幹細胞から生成された分化細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＮＬＲＣ５とを発現する幹細胞から生成された分化細胞である。本明細書で提供されるのは、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、およびそれらの組み合わせとを発現する幹細胞から生成された分化細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明の幹細胞は、低免疫原性であり、例えば、投与時に患者に対して低免疫原性である。いくつかの実施形態では、本発明の分化した細胞は、低免疫原性であり、例えば、投与時に患者に対して低免疫原性である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞療法（場合によっては、細胞置換療法）を必要とする患者を治療する方法であって、外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原を発現する幹細胞から生成された分化した細胞を含む分化した細胞の集団を投与することを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞療法（場合によっては、細胞置換療法）を必要とする患者を治療する方法であって、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原を発現する幹細胞から生成された分化細胞を含む分化細胞の集団を投与することを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞療法（場合によっては、細胞置換療法）を必要とする患者を治療する方法であって、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、ならびに低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩヒト白血球抗原を発現する幹細胞から生成された分化した細胞を含む分化した細胞の集団を投与することを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞療法（場合によっては、細胞置換療法）を必要とする患者を治療する方法であって、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのかつＣＩＩＴＡを発現する幹細胞から生成された分化した細胞を含む分化した細胞の集団を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞療法を必要とする患者を治療する方法であって、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのＢ２Ｍを発現する幹細胞から生成された分化した細胞を含む分化した細胞の集団を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞療法を必要とする患者を治療する方法であって、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、および低下した発現レベルのＮＬＲＣ５を発現する幹細胞から生成された分化した細胞を含む分化した細胞の集団を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞療法を必要とする患者を治療する方法であって、外因性ＣＤ２４ポリペプチド、ならびに低下した発現レベルのＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、およびそれらの組み合わせを発現する幹細胞から生成された分化した細胞を含む分化した細胞の集団を投与することを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞療法（場合によっては、細胞置換療法）を必要とする患者を治療する方法であって、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子とを発現する幹細胞から生成された分化細胞を含む分化細胞の集団を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞療法を必要とする患者を治療する方法であって、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＣＩＩＴＡとを発現する幹細胞から生成された分化細胞を含む分化細胞の集団を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞療法を必要とする患者を治療する方法であって、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＢ２Ｍとを発現する幹細胞から生成された分化細胞を含む分化細胞の集団を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞療法を必要とする患者を治療する方法であって、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＮＬＲＣ５とを発現する幹細胞から生成された分化細胞を含む分化細胞の集団を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞療法を必要とする患者を治療する方法であって、外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、およびそれらの組み合わせとを発現する幹細胞から生成された分化細胞を含む分化細胞の集団を投与することを含む、方法である。
低免疫原性細胞、その産生方法、およびその使用方法の詳細な説明は、２０１５年５月９日に提出されたＷＯ２０１６／１８３０４１、２０１８年１月１４日に提出されたＷＯ２０１８／１３２７８３、および２０１８年３月２０日に提出されたＷＯ２０１８／１７５３９０に記載されており、配列表および図面を含むその開示が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の他の目的、利点および実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
配列番号１～３３に示すように、ＤＵＸ４ポリヌクレオチドならびにＤＵＸ４、ＣＤ４７、およびＣＤ２４ポリペプチドの配列を示す。
Ｉ．導入
ゲノム編集および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成、それに続くそのようなｉＰＳＣの分化は、多能性、エピジェネティックな状態、分化の能力、およびゲノムの安定性に関して、費用と時間がかかり、非常に変動しやすいプロセスのままである。さらに、ゲノム編集および長期培養中に発生する変化は、適応免疫応答を引き起こし、自家幹細胞由来の移植または外植片でさえ免疫拒絶をもたらすことが見出されている。幹細胞由来の移植片の対象の免疫拒絶の問題を克服するために、本発明者らは、移植可能な細胞型のための実行可能な供給源を表す低免疫原性細胞（例えば、低免疫原性多能性細胞、低免疫原性分化細胞、低免疫原性初代Ｔ細胞など）を本明細書で開発および開示した。そのようなＣＤ２４発現細胞は、レシピエント対象への投与時に適応免疫拒絶および自然免疫拒絶から保護される。有利なことに、本明細書に開示される細胞は、対象の遺伝的体質に関係なく、レシピエント対象の免疫系によって拒絶されない。そのような細胞は、レシピエント対象への投与時に適応免疫拒絶および自然免疫拒絶から保護される。
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞を発現するＣＤ２４は、自然免疫細胞拒絶を受けない。場合によっては、低免疫原性細胞は、ＮＫ細胞媒介性溶解の影響を受けない。場合によっては、低免疫原性細胞は、マクロファージ貪食の影響を受けない。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、免疫抑制剤をほとんどまたは全く必要とせずにレシピエント対象に移植される、万能的に適合性のある細胞または組織（例えば、万能ドナー細胞または組織）の供給源として有用である。そのような低免疫原性細胞は、移植時に細胞特異的な特性および特徴を保持する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、ＭＨＣ不適合の同種レシピエントにおける免疫拒絶を回避する幹細胞またはその分化した誘導体である。場合によっては、本明細書に概説される幹細胞から産生された分化細胞は、ＭＨＣ不適合の同種レシピエントに投与される（例えば、移植またはグラフトされる）ときに免疫拒絶を回避する。言い換えれば、幹細胞およびそのような幹細胞に由来する分化細胞（その子孫を含む）は、低免疫原性である。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性幹細胞は、野生型幹細胞と比較して、免疫原性が低下している（例えば、少なくとも２．５％～９９％低い免疫原性）。場合によっては、低免疫原性幹細胞は、野生型幹細胞と比較して免疫原性を欠如している。幹細胞またはその分化した誘導体は、レシピエント患者への移植または生着のための万能ドナー細胞として好適である。いくつかの実施形態では、そのような細胞は、患者に対して非免疫原性である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、免疫原性が低下した幹細胞である。そのような幹細胞は、多能性幹細胞の可能性および分化能を保持している。
提供される方法は、限定されないが多能性幹細胞などの細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現および／またはＭＨＣクラスＩＩ発現の不活性化または除去に有用である。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼシステム）を利用するゲノム編集技術もまた、ヒト幹細胞において重要な免疫遺伝子の発現を低下または排除するために使用される（例えば、重要な免疫遺伝子のゲノムＤＮＡを欠失させることによって）。ある特定の実施形態では、ゲノム編集技術または他の遺伝子調節技術は、免疫寛容誘導因子をヒト細胞に挿入し、それらおよびそれらから調製された分化細胞を低免疫原性細胞にするために使用される。このように、低免疫原性細胞は、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ発現の発現を低下または排除を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象において非免疫原性である（例えば、免疫応答を誘導しない）。
ゲノム編集技術により、目的の遺伝子座部位での二本鎖ＤＮＡ切断が可能になる。これらの制御された二本鎖切断は、特定の遺伝子座部位での相同組換えを促進する。このプロセスは、染色体などの核酸分子の特定の配列を、その配列を認識して、それに結合し、核酸分子の二本鎖切断を誘導するエンドヌクレアーゼで標的化することに焦点を当てている。二本鎖切断は、エラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え（ＨＲ）のいずれかによって修復される。
特定の実施形態の実施は、特に反対に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を使用し、その多くは、例示の目的で以下に説明されている。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどのジャーナルのモノグラフを参照されたい。
ＩＩ．定義
細胞を特性化するために本明細書で使用される場合、「低免疫原性」という用語は、一般に、そのような細胞が移植される対象による免疫拒絶の傾向が少ないことを意味する。例えば、変更されていないまたは改変されていない野生型細胞と比較して、そのような低免疫原性細胞は、約２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以下、そのような細胞が移植された対象による免疫拒絶の傾向が少ない。いくつかの態様では、ゲノム編集技術は、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ遺伝子の発現を調節するために使用され、したがって、低免疫原性細胞を生成する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、ＭＨＣ不適合の同種レシピエントにおける免疫拒絶を回避する。場合によっては、本明細書に概説される低免疫原性幹細胞から産生された分化細胞は、ＭＨＣ不適合の同種レシピエントに投与される（例えば、移植またはグラフトされる）ときに免疫拒絶を回避する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、Ｔ細胞媒介性適応免疫拒絶および／または自然免疫細胞拒絶から保護される。
細胞の低免疫原性は、適応免疫応答および自然免疫応答を誘発する細胞の能力など、細胞の免疫原性を評価することによって決定することができる。そのような免疫応答は、当業者によって認識されているアッセイを使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、免疫応答アッセイは、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞死滅、ＮＫ細胞増殖、ＮＫ細胞活性化、およびマクロファージ活性化に対する低免疫原性細胞の効果を測定する。場合によっては、低免疫原性細胞およびその誘導体は、対象への投与時に、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞による死滅の減少を受ける。場合によっては、細胞およびその誘導体は、改変されていない細胞または野生型細胞と比較して、マクロファージの貪食が減少していることを示す。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、対応する改変されていない野生型細胞と比較して、レシピエント対象において免疫応答の低下または減少を誘発する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、非免疫原性であるか、またはレシピエント対象において免疫応答を誘発することができない。
本明細書で使用される「免疫抑制因子」または「免疫調節因子」または「免疫寛容原性因子」には、低免疫因子、補体阻害剤、および投与、移植、または生着時に、宿主もしくはレシピエント対象の免疫系によって認識される細胞の能力を調節または影響する他の因子が挙げられる。
本明細書で使用される「免疫シグナル伝達因子」は、場合によっては、免疫シグナル伝達経路を活性化する分子、タンパク質、ペプチドなどを指す。
本明細書で使用される「セーフハーバー遺伝子座」は、導入遺伝子または外因性遺伝子の安全な発現を可能にする遺伝子座を指す。例示的な「セーフハーバー」遺伝子座には、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子、アルブミン遺伝子、ＳＨＳ２３１遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子、およびＲｏｓａ遺伝子（例えば、ＲＯＳＡ２６）が挙げられる。
本開示の目的のための「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびにそのような調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接しているかどうかにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに限定されない。
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれる情報を遺伝子産物に変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡもしくは他のタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質の直接転写産物であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、ならびに編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、および例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリストイル化、ならびにグリコシル化によって改変されたタンパク質も挙げられる。
遺伝子発現の「調節」とは、遺伝子の発現レベルにおける変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。調節はまた完全であってもよく、すなわち、遺伝子発現が完全に不活性化されるか、または野生型レベル以上に活性化される。またはそれは部分的であってもよく、遺伝子発現が部分的に低下されるか、または部分的に野生型レベルのある部分に活性化される。
「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「作動的に連結されたｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ」という用語は、２つ以上の構成要素（配列要素など）の並置に関して相互交換可能に使用され、ここで、これらの構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、他の構成要素のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能をこれらの構成要素のうちの少なくとも１つが媒介し得る可能性を許容するように、配置される。例示として、転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の有無に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、プロモーターなどの転写調節配列が、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、一般に、コード配列とシスで作動可能に連結されるが、このコード配列に直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、エンハンサーとコード配列とが連続していない場合であっても、コード配列に作動可能に連結した転写調節配列である。
「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に移入させることができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向することが可能であり、標的細胞に遺伝子配列を移入させることができる、任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語には、クローニング、発現ビヒクル、および組み込みベクターが含まれる。ベクターまたは構築物を細胞に導入するための方法は、当業者に知られており、脂質媒介性移入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔法、直接注入、細融合、パーティクルガン法、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入法およびウイルスベクター媒介性移入法が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「多能性幹細胞」は、３つの胚葉：内胚葉（例えば、胃連結、胃腸管、肺など）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器組織）または外胚葉（例えば、表皮組織および神経系組織）のいずれかに分化する可能性を有する。本明細書で使用される「多能性幹細胞」という用語はまた、「人工多能性幹細胞」、または「ｉＰＳＣ」、または非多能性細胞に由来する一種の多能性幹細胞を包含する。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、多能性細胞ではない細胞から産生または生成される。言い換えれば、多能性幹細胞は、非多能性細胞の直接的または間接的な子孫であり得る。親細胞の例には、様々な手段によって多能性の未分化表現型を誘導するように再プログラムされた体細胞が含まれる。このような「ｉＰＳ」または「ｉＰＳＣ」細胞は、特定の調節遺伝子の発現を誘導することによって、または特定のタンパク質の外因性の適用によって作製することができる。ｉＰＳ細胞を誘導するための方法は当技術分野で知られており、以下でさらに記載されている。（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７（１１）：２６６７－７４（２００９）、Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７）：７９５（２００８）、Ｗｏｌｔｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５８（７２３９）：７６６－７７０（２００９）、およびＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：３８１－３８４（２００９）を参照されたく、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成は、以下に概説されている。本明細書で使用される場合、「ｈｉＰＳＣ」は、ヒト人工多能性幹細胞である。
「ＨＬＡ」または「ヒト白血球抗原」複合体は、ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。ＨＬＡ複合体を構成するこれらの細胞表面タンパク質は、抗原に対する免疫応答の調節に関与している。ヒトには、クラスＩおよびクラスＩＩの２つのＭＨＣ、「ＨＬＡ－Ｉ」および「ＨＬＡ－ＩＩ」がある。ＨＬＡ－Ｉには、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃの３つのタンパク質が含まれ、細胞内からペプチドを提示し、ＨＬＡ－Ｉ複合体によって提示される抗原は、キラーＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞としても知られる）を引き付ける。ＨＬＡ－Ｉタンパク質は、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と関連している。ＨＬＡ－ＩＩには、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱおよびＨＬＡ－ＤＲの５つのタンパク質が含まれており、これらは細胞外からＴリンパ球に抗原を提示する。これは、ＣＤ４＋細胞（Ｔヘルパー細胞としても知られる）を刺激する。「ＭＨＣ」または「ＨＬＡ」のいずれかの使用は、遺伝子がヒト（ＨＬＡ）またはマウス（ＭＨＣ）のどちらに由来するかに依存するので、限定することを意味するものではないことを理解されたい。したがって、これは哺乳動物細胞に関連するので、これらの用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「グラフト」、「投与」、「導入」、「移植（ｉｍｐｌａｎｔｉｎｇ）」および「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）」という用語、ならびにそれらの文法的変形は、所望の部位に導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、対象への細胞（例えば、本明細書に記載の細胞）の配置の関連において互換的に使用される。細胞は、所望の部位に直接移植することができるか、あるいは、移植された細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部が生存し続ける対象の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、最短で数時間、例えば、２４時間から数日、最長で数年になり得る。いくつかの実施形態では、細胞はまた、所望の部位以外の位置、例えば、脳内または皮下で、例えば、カプセル内で投与（例えば、注射）されて、移植された細胞を移植位置に維持し、移植された細胞の移動を回避することができる。
単離された細胞に適用される「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、細胞を任意の種類のプロセスもしくは条件に供すること、または細胞に対して任意の種類の操作もしくは手順を実行することを含む。対象に適用される場合、これらの用語は、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、Ｂ２Ｍ）が本明細書に記載の方法に従ってエクスビボで変更された細胞または細胞集団を個体に投与することを指す。個体は通常、病気であるかもしくは負傷しているか、または集団の平均的なメンバーと比較して病気になるリスクが高く、そのような注意、配慮、もしくは管理を必要としている。
本明細書で使用される場合、「治療すること」および「治療」という用語は、対象が少なくとも１つの症状の軽減、または疾患の改善、例えば、有益なもしくは望ましい臨床結果を有するように、本明細書に記載の方法に従ってエクスビボで変更された標的ポリヌクレオチド配列を有する有効量の細胞を対象に投与することを指す。本発明の目的のために、有益なもしくは望ましい臨床結果には、検出可能であろうと検出不能であろうと、１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延もしくは緩徐、病状の改善もしくは緩和、および寛解（部分的もしくは全体的）が挙げられるが、これらに限定されない。治療することはまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存期間を延長することを含む。したがって、当業者は、治療が病状を改善する可能性があるが、疾患の完全な治癒ではない可能性があることを認識している。本明細書で使用される場合、「治療」という用語は予防を含む。あるいは、病気の進行が低下または停止した場合、治療は「有効」である。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存期間を延長することも意味する。治療が必要なものには、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害とすでに診断されているもの、および遺伝的感受性または他の要因のためにそのような障害を発症する可能性が高いものが含まれる。
疾患または障害の「治療」、「予防」もしくは「改善」とは、そのような疾患または障害の発症を遅延もしくは予防し、そのような疾患または障害に関連する状態の進行、悪化もしくは低下、進行もしくは重症度を逆転、緩和、改善、阻害、減速または停止することを意味する。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％軽減される。
本明細書で使用される「がん」という用語は、その独自の特性（例えば、正常な制御の喪失）が無秩序な増殖、分化の欠如、局所組織浸潤、および転移をもたらす細胞の過剰増殖として定義される。本発明の方法に関して、がんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管、または肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢、または胸膜のがん、鼻、鼻腔、または中耳のがん、口腔がん、外陰がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸部がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液体腫瘍、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜がん、網がん、および腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、固形がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、膀胱がんのうちのいずれかを含む任意のがんであり得る。本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、特に明記されていない限り、悪性タイプの細胞または組織の異常な増殖を指し、良性型組織を含まない。
「慢性感染性疾患」という用語は、感染が持続している感染性因子によって引き起こされる疾患を指す。このような疾患には、肝炎（Ａ、Ｂ、またはＣ）、ヘルペスウイルス（ＶＺＶ、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－６、ＨＳＶ－ＩＩ、ＣＭＶ、ならびにＥＢＶなど）、およびＨＩＶ／ＡＩＤＳを挙げることができる。非ウイルス性の例には、アスペルギルス症、カンジダ症、コクシジオイデス症などの慢性真菌性疾患、ならびにクリプトコッカス症およびヒストプラズマ症に関連する疾患を挙げることができる。慢性細菌感染性病原体の限定的な例は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであり得る。いくつかの実施形態では、障害は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である。いくつかの実施形態では、障害は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である。
「自己免疫疾患」という用語は、対象が自身の組織に対して破壊的な免疫応答を開始する任意の疾患または障害を指す。自己免疫障害は、神経系、胃腸系、および内分泌系の疾患、ならびに皮膚および他の結合組織、眼、血液および血管を含むがこれらに限定されない、対象（例えば、ヒト）のほぼすべての臓器系に影響を与える可能性がある。自己免疫疾患の例には、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、グレーブス病、強皮症、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、および糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。
追加または代替の態様では、本発明は、例えば、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムなどのヌクレアーゼシステムを利用して、当業者が利用できる任意の方法で標的ポリヌクレオチド配列を変更することを企図する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１）ならびにＴＡＬＥＮを利用する方法の例が本明細書で詳細に説明されているが、本発明はこれらの方法／システムの使用に限定されないことを理解されたい。当業者に知られている標的細胞における発現を低下または除去するための標的化の他の方法、例えば、Ｂ２Ｍを本明細書で利用することができる。
本発明の方法を使用して、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更することができる。本発明は、任意の目的のために細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更することを企図する。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、変異体細胞を産生するように変更される。本明細書で使用される場合、「変異体細胞」は、その元の遺伝子型とは異なる結果として生じる遺伝子型を有する細胞を指す。場合によっては、「変異体細胞」は、例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して正常に機能する遺伝子が変更された場合に、変異表現型を示す。他の例では、例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが変異体遺伝子型を修正するために使用される場合、「変異体細胞」は野生型表現型を示す。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子変異を修正または修復するために（例えば、細胞に正常な表現型を回復するために）変更される。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子変異を誘導するために（例えば、遺伝子またはゲノム要素の機能を破壊するために）変更される。
いくつかの実施形態では、変更はインデルである。本明細書で使用される場合、「インデル」は、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせから生じる変異を指す。当業者によって理解されるように、ゲノム配列のコード領域におけるインデルは、インデルの長さが３の倍数でない限り、フレームシフト変異をもたらすであろう。いくつかの実施形態では、変更は点変異である。本明細書で使用される場合、「点変異」は、ヌクレオチドのうちの１つを置き換える置換を指す。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、任意の長さのインデルまたは標的ポリヌクレオチド配列における点変異を誘導することができる。
本明細書で使用される場合、「ノックアウト」は、標的ポリヌクレオチド配列の機能を妨害する方法で、標的ポリヌクレオチド配列の全部または一部を欠失することを含む。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能的ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン）の標的ポリヌクレオチド配列にインデルを誘導することにより標的ポリヌクレオチド配列を変更することによって達成することができる。当業者は、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、本明細書に記載の詳細に基づいて標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトする方法を容易に理解するであろう。
いくつかの実施形態では、変更は、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部のノックアウトをもたらす。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトすることは、様々な用途に有用であり得る。例えば、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、研究目的のためにインビトロで実行することができる。エクスビボの目的のために、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を治療または予防するために（例えば、エクスビボで細胞内の変異体対立遺伝子をノックアウトし、ノックアウトされた変異体対立遺伝子を対象に導入することによって）有用であり得る。
本明細書における「ノックイン」とは、宿主細胞に遺伝的機能を付加するプロセスを意味する。これにより、ノックインされた遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはコードされたタンパク質のレベルが上昇する。当業者によって理解されるように、これは、遺伝子の１つ以上の追加のコピーを宿主細胞に付加すること、またはタンパク質の発現を増加させる内因性遺伝子の調節成分を変更することを含むいくつかの方法で達成することができる。これは、プロモーターを改変すること、異なるプロモーターを付加すること、エンハンサーを付加すること、または他の遺伝子発現配列を改変することによって達成され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変更または改変は、標的または選択されたポリヌクレオチド配列の発現の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変更または改変は、標的または選択されたポリペプチド配列の発現の低下をもたらす。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変更または改変は、標的または選択されたポリヌクレオチド配列の発現の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変更または改変は、標的または選択されたポリペプチド配列の発現の増加をもたらす。
「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「低下（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、および「減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」という用語はすべて、本明細書では一般に、統計的に有意な量の減少を意味するために使用される。ただし、誤解を避けるために、「減少する」、「低下した」、「低下」、および「減少」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、もしくは最大１００％を含む減少（すなわち、参照サンプルと比較して非存在のレベル）、あるいは参照レベルと比較して１０～１００％の間の任意の減少を意味する。
「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語はすべて、本明細書では、一般に統計的に有意な量の増加を意味するために使用される。誤解を避けるために、「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、もしくは最大１００％を含む増加、あるいは参照レベルと比較した１０～１００％の間の任意の増加、あるいは少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍の増加、あるいは参照レベルと比較して２倍から１０倍以上の間の任意の増加を意味する。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、参照される分子または参照されるポリペプチドが目的の細胞に導入されることを意味することを意図している。ポリペプチドは、例えば、染色体への組み込みなどによる細胞の遺伝物質へのコード化核酸の導入によって、またはプラスミドもしくは発現ベクターなどの非染色体遺伝物質として導入することができる。したがって、コード化核酸の発現に関して使用される用語は、発現可能な形態のコード化核酸の細胞への導入を指す。「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つ以上の遺伝的、生化学的または他の方法によって細胞に導入することができる分子、構築物、因子などである。「細胞内の通常の存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、ニューロンの胚発生中にのみ存在する分子は、成体ニューロン細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能しているバージョン、または正常に機能している内因性分子の機能不全のバージョンを含み得る。
外因性分子または因子は、とりわけ、コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるような小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記の分子の任意の改変誘導体、または上記の分子の１つ以上を含む任意の複合体などの高分子であり得る。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖にすることができ、直鎖状、分岐状、または環状にすることができ、任意の長さのものとすることができる。核酸には、二本鎖を形成することができるもの、ならびに三本鎖を形成する核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
「内因性」という用語は、細胞内に存在する参照される分子またはポリペプチドを指す。同様に、コード化核酸の発現に関して使用される場合の用語は、細胞内に含まれ、外因的に導入されないコード化核酸の発現を指す。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連する「同一性」パーセントという用語は、以下に記載の配列比較アルゴリズムのうちの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴＰ、およびＢＬＡＳＴＮ、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）を使用して、または目視検査によって測定される、最大の対応物と比較され、アライメントされる場合、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。用途に応じて、「同一性」パーセントは、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在し得るか、あるいは、比較される２つの配列の全長にわたって存在し得る。配列比較では、典型的には、１つの配列が、試験配列と比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似の方法を検索することによって、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．））のコンピュータ化された実装によって、または目視検査（一般に、以下のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，を参照されたい）によって行われ得る。
配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適切なアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公開されている。
「対象」および「個体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、動物、例えば、細胞を得ることができる、および／または本明細書に記載の細胞による予防的治療を含む治療が提供されるヒトを指す。ヒトの対象などの特定の動物に固有のこれらの感染症、状態、または病状の治療については、対象という用語はその特定の動物を指す。本明細書で互換的に使用される「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」には、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類などの哺乳動物が含まれる。「対象」という用語は、哺乳動物、爬虫類、両生類、および魚を含むが、これらに限定されないあらゆる脊椎動物も包含する。しかしながら、有利には、対象は、ヒトなどの哺乳動物、または飼いならされた哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマなどの他の哺乳動物、または生産哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタなどである。
請求項はいかなる選択的な要素も除外するように作成することができることに留意されたい。そのため、この記載は、請求項要素の列挙、または「否定的な」制限の使用に関連して、「だけ」、「のみ」などの排他的な用語の使用に対して先の記載として役立つことを意図している。本開示を読めば当業者には明らかであろうが、本明細書に記載され、例示されている個々の実施形態は、それぞれ、別個の構成要素および特徴を有しており、この構成要素および特徴は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されてもよく、またはそのような特徴と組み合わせてもよい。あらゆる列挙された方法は、列挙されたイベントの順序、または論理的に可能な他の順序で実行してよい。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料も本発明の実施または試験に使用してもよいが、代表的な例示的な方法および材料をここに記載する。
本発明を説明する際には、以下の用語が、使用され、以下に示されるように、定義される。
本発明をさらに説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、よって当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを目的とするものではないことも理解されるべきである。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じである。値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値と、その指定範囲の任意の他の指定値または介在値とは、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は独立して、そのより小さい範囲に含まれ得、また、本発明に包含され、指定範囲内の任意の具体的に除外された制限値に従う。指定範囲が制限値の一方または両方を含む場合、それらの含まれた制限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。特定の範囲は、「約」という用語が先行する数値で本明細書に示される。「約」という用語は、その後に続く正確な数字およびその用語の後に続く数字に近いか、またはほぼその数字である数字を文字通り支持するために本明細書で使用される。ある数字が、具体的に引用されている数字に近いか、またはほぼその数字であるかを決定する際に、その近いかまたはほぼ引用されていない数字は、提示されている文脈において、具体的に引用されている数字と実質的に等価を提供する数字であり得る。
本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されるのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。さらに、引用された各刊行物、特許、または特許出願は、刊行物が引用されたものに関連する主題を開示および説明するために参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も、出願日より前のその開示のためのものであり、本明細書に記載の発明が、先行発明のためにかかる刊行物に先行する権利が与えられていないことを認めるものと解釈するべきではない。さらに、提示される公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。
ＩＩＩ．実施形態の詳細な説明
Ａ．低免疫原性細胞
本明細書で提供されるのは、ＣＤ２４の発現を増加させるための改変およびＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現を調節する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の改変を含む細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、外因性ＣＤ２４ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞はまた、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９５からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現を増加させるための改変も含む。いくつかの実施形態では、記載される細胞は、外因性ＣＤ２４およびＣＤ４７ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＤＵＸ４ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＣＤ２７ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＣＤ３５ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＣＤ４６ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＣＤ５５ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＣＤ５９ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＣＤ２００ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＨＬＡ－Ｃポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＨＬＡ－Ｅポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＨＬＡ－Ｅ重鎖ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＨＬＡ－Ｇポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＰＤ－Ｌ１ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＩＤＯ１ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＣＴＬＡ４ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＣ１－阻害剤ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＩＬ－１０ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＩＬ－３５ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＦＡＳＬポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＣＣＬ２１ポリペプチド、外因性ＣＤ２４およびＭｆｇｅ８ポリペプチド、ならびに外因性ＣＤ２４およびＳｅｒｐｉｎｂ９５ポリペプチドなどを含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＨＣ Ｉおよび／またはＭＨＣ ＩＩの発現を調節する１つ以上の標的化ポリヌクレオチド配列のゲノム改変を含む。いくつかの態様では、遺伝子編集システムは、１つ以上の標的化ポリヌクレオチド配列を改変するために使用される。いくつかの実施形態では、標的化ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、およびＮＬＲＣ５からなる群から選択される１つ以上である。ある特定の実施形態では、細胞のゲノムは、ＨＬＡ発現の重要な構成要素を低下または欠失するように変更されている。
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子が編集されてゲノムＤＮＡの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。ある特定の態様では、本開示は、遺伝子が編集されてゲノムＤＮＡの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、１つ以上の遺伝子が編集されてゲノムＤＮＡの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、１つ以上の遺伝子が編集されてゲノムＤＮＡの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む幹細胞（例えば、多能性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞）またはその集団を提供する。
ある特定の実施形態では、ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩの発現は、ゲノムＤＮＡの隣接するストレッチを標的化および欠失し、それにより、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、およびＮＬＲＣ５からなる群から選択される標的遺伝子の発現を低下または排除することによって調節される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞および方法は、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列を切断するためにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびにＢ２ＭおよびＮＬＲＣ５などであるがこれらに限定されない１つ以上の追加の標的ポリヌクレオチド配列を変更するためにそのような細胞のゲノムを編集することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞および方法は、Ｂ２Ｍ遺伝子配列を切断するためにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびにＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５などであるがこれらに限定されない１つ以上の追加の標的ポリヌクレオチド配列を変更するためにそのような細胞のゲノムを編集することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞および方法は、ＮＬＲＣ５遺伝子配列を切断するためにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびにＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡなどであるがこれらに限定されない１つ以上の追加の標的ポリヌクレオチド配列を変更するためにそのような細胞のゲノムを編集することを含む。
ある特定の実施形態では、ＭＨＣ Ｉの発現は、ＤＵＸ４の発現を過剰発現または増加させることによって調節される。場合によっては、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、ＤＵＸ４タンパク質配列を維持しながらＣｐＧ部位の総数を減らすための１つ以上の塩基置換を含むコドン変更配列である。場合によっては、コドン変更配列は、配列番号１である。他の場合では、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～２５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。場合によっては、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～２５からなる群から選択される配列を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ＤＵＸ４の発現が増加した本明細書に記載の細胞はまた、ＣＤ２４を過剰発現する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞としては、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの子孫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるように改変された幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、および造血幹細胞）またはその集団を提供する。
いくつかの実施形態では、一次Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、およびそれらの組み合わせを含む群から選択される。
いくつかの実施形態では、一次Ｔ細胞は、レシピエント対象（例えば、細胞を投与された患者）とは異なる１つ以上のドナー対象からの一次Ｔ細胞のプールからのものである。一次Ｔ細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００以上のドナー対象から取得し、一緒にプールすることができる。いくつかの実施形態では、一次Ｔ細胞は、１つ以上の個体から採取され、いくつかの例では、一次Ｔ細胞または一次Ｔ細胞のプールは、インビトロで培養される。いくつかの実施形態では、一次Ｔ細胞または一次Ｔ細胞のプールは、ＣＤ２４、および場合によっては、ＣＤ４７も外因的に発現するように操作され、インビトロで培養される。
ある特定の実施形態では、一次Ｔ細胞または一次Ｔ細胞のプールは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作される。ＣＡＲは、当業者に知られているもののいずれかであり得る。有用なＣＡＲには、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、およびＢＣＭＡを含む群から選択された抗原に結合するものが含まれる。場合によっては、ＣＡＲは、チサゲンレクルユーセル（ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ）およびアキシカブタジンシロルーセル（ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ）、または現在臨床試験で研究中の他のものなど、ＦＤＡ承認のＣＡＲ－Ｔ細胞療法で使用されるものと同じまたは同等である。
いくつかの実施形態では、一次Ｔ細胞または一次Ｔ細胞のプールは、改変されていない一次Ｔ細胞と比較して、内因性Ｔ細胞受容体の発現の低下を示すように操作されている。ある特定の実施形態では、一次Ｔ細胞または一次Ｔ細胞のプールは、改変されていない一次Ｔ細胞と比較して、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、またはＣＴＬＡ４とＰＤ１の両方の発現の低下を示すように操作されている。Ｔ細胞を含む細胞を遺伝子改変する方法は、例えば、ＷＯ２０１６／１８３０４１において詳細に記載されており、本開示は、表、付録、配列表および図を含むその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、（ａ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む第１世代のＣＡＲ、（ｂ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも２つのシグナル伝達ドメインを含む第２世代のＣＡＲ、（ｃ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む第３世代のＣＡＲ、ならびに（ｄ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、３つまたは４つのシグナル伝達ドメイン、およびＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含む第４世代のＣＡＲを含む群から選択されるＣＡＲを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、（ａ）新生細胞に特徴的な抗原を標的化する抗原結合ドメイン、（ｂ）Ｔ細胞に特徴的な抗原を標的化する抗原結合ドメイン、（ｃ）自己免疫疾患または炎症性疾患に特徴的な抗原を標的化する抗原結合ドメイン、（ｄ）老化細胞に特徴的な抗原を標的化する抗原結合ドメイン、（ｅ）感染症に特徴的な抗原を標的化する抗原結合ドメイン、および（ｆ）細胞の細胞表面抗原に結合する抗原結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない群から選択される。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体、抗原結合部分またはそのフラグメント、ｓｃＦｖ、およびＦａｂを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９またはＢＣＭＡに結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＦＭＣ６３などであるがこれに限定されない抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＦｃεＲＩγ、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ２Ｂ、およびそれらの機能的バリアントを含む群から選択される１つを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。例えば、シグナル伝達ドメインには、共刺激ドメインを含めることができる。または、シグナル伝達ドメインには、１つ以上の共刺激ドメインを含めることができる。ある特定の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。他の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。場合によっては、ＣＡＲが２つ以上の共刺激ドメインを含む場合、２つの共刺激ドメインは同じではない。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、同じではない２つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、サイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、および／またはＴ細胞活性化中のＣＡＲ Ｔ細胞持続性を増強する。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、サイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、および／またはＴ細胞活性化中のＣＡＲ Ｔ細胞持続性を増強する。
本明細書に記載されるように、第４世代のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、３つまたは４つのシグナル伝達ドメイン、およびＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含有することができる。場合によっては、サイトカイン遺伝子は、低免疫原性細胞の内因性または外因性サイトカイン遺伝子である。場合によっては、サイトカイン遺伝子は、炎症誘発性サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＴＮＦ、ＩＦＮ－ガンマ、およびそれらの機能的フラグメントを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子またはその機能的ドメインもしくはフラグメントを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータドメイン、または免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、もしくはそれらの機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、または免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、もしくはそれらの機能的バリアント、および（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、または４－１ＢＢドメイン、もしくはそれらの機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、または免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、もしくはそれらの機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくはその機能的バリアント、および（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、またはＣＤ１３４ドメイン、もしくはそれらの機能的バリアントを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、または免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、もしくはそれらの機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくはその機能的バリアント、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、またはＣＤ１３４ドメイン、もしくはそれらの機能的バリアント、および（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、（ｉｉ）ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインまたはその機能的バリアント、（ｉｉｉ）４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはその機能的バリアント、ならびに（ｉｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインまたはその機能的バリアントを含む。
ＣＡＲ構築物を導入するか、またはＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するための方法は、当業者によく知られている。詳細な説明は、例えば、Ｖｏｒｍｉｔｔａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１８，５３，１６２－１８１、およびＥｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５４３，１１３－１１７で見出される。
いくつかの実施形態では、一次Ｔ細胞に由来する細胞は、例えば、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子（例えば、Ｔ細胞受容体アルファ定常領域（ＴＲＡＣ）またはＴ細胞受容体ベータ定常領域（ＴＲＢＣ））の破壊による内因性Ｔ細胞受容体の発現低下を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする外因性核酸（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ２４、ＣＤ４７、または本明細書に開示される別の免疫寛容原性因子）は、破壊されたＴ細胞受容体遺伝子に挿入される。
いくつかの実施形態では、一次Ｔ細胞に由来する細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）および／またはプログラム細胞死（ＰＤ１）の発現の低下を含む。ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ならびにＣＴＬＡ４およびＰＤ１の両方の発現を低下または排除する方法は、限定されないが、レアカットエンドヌクレアーゼおよびＲＮＡサイレンシングまたはＲＮＡ干渉技術を利用する遺伝子改変技術など、当技術分野で認識されるいずれかを含むことができる。レアカットエンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、任意のＣａｓタンパク質、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。
いくつかの実施形態では、記載される操作された細胞の集団は、レシピエント対象への投与時に、免疫活性化のレベルの低下を誘発するか、または免疫活性化を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象において、全身性ＴＨ１活性化のレベルの低下を誘発するか、または全身性ＴＨ１活性化を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象において、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の免疫活性化のレベルの低下を誘発するか、またはＰＢＭＣの免疫活性化を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象への投与時に、細胞に対するドナー特異的ＩｇＧ抗体のレベルの低下を誘発するか、またはドナー特異的ＩｇＧ抗体を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象において、細胞に対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体産生のレベルの低下を誘発するか、またはＩｇＭおよびＩｇＧ抗体産生を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象への投与時に、細胞の細胞傷害性Ｔ細胞死滅のレベルの低下を誘発する。
Ｂ．ＣＤ２４
いくつかの態様では、本開示は、免疫寛容原性因子（例えば、免疫調節ポリペプチド）ＣＤ２４を発現するように改変された幹細胞（例えば、多能性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＣＤ２４を発現するように幹細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、幹細胞は、外因性ＣＤ２４を発現する。場合によっては、幹細胞は、ヒトＣＤ２４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現する。
熱安定性抗原または小細胞肺がんクラスター４抗原とも呼ばれるＣＤ２４は、グリコシル化グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型表面タンパク質である（Ｐｉｒｒｕｃｃｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８６，１３６，３７７９－３７８４、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１７，５７，８００－８０６）。それは、自然免疫細胞上のＳｉｇｌｅｃ－１０に結合する。最近、Ｓｉｇｌｅｃ－１０を介したＣＤ２４が自然免疫チェックポイントとして機能することが示された（Ｂａｒｋａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１９，５７２，３９２－３９６）。
いくつかの実施形態では、本明細書で概説される細胞は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）を有するＣＤ２４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）を有するＣＤ２４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択される配列を有するＣＤ２４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１２７８６６６．１、ＮＰ＿００１２７８６６７．１、ＮＰ＿００１２７８６６８．１、およびＮＰ＿０３７３６２．１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）を有する、ＣＤ２４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＣＤ２４ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１２７８６６６．１、ＮＰ＿００１２７８６６７．１、ＮＰ＿００１２７８６６８．１、およびＮＰ＿０３７３６２．１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１２７８６６６．１、ＮＰ＿００１２７８６６７．１、ＮＰ＿００１２７８６６８．１、およびＮＰ＿０３７３６２．１に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤ２４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００１２９７３７．１、ＮＭ＿００１２９７３８．１、ＮＭ＿００１２９１７３９．１、およびＮＭ＿０１３２３０．３に記載される配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００１２９７３７．１、ＮＭ＿００１２９７３８．１、ＮＭ＿００１２９１７３９．１、およびＮＭ＿０１３２３０．３に記載されるヌクレオチド配列を含む。
別の実施形態では、ＣＤ２４タンパク質発現は、ＣＤ２４タンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、外因性ＣＤ２４ ｍＲＮＡの存在を確認する。
Ｃ．ＣＩＩＴＡ
ある特定の態様では、本明細書に開示される発明は、クラスＩＩトランスアクチベータ（ＣＩＩＴＡ）発現を標的化および調節（例えば、低下または排除）することによって、ＭＨＣ ＩＩ遺伝子の発現を調節（例えば、低下または排除）する。いくつかの態様では、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して起こる。ＣＩＩＴＡは、ＬＲまたはヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのタンパク質のメンバーであり、ＭＨＣエンハンセオソームと結合することによってＭＨＣ ＩＩの転写を調節する。
いくつかの実施形態では、本発明の標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡの相同体である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのオルソログである。
いくつかの態様では、ＣＩＩＴＡの発現の低下または排除は、以下のＭＨＣクラスＩＩ：ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上の発現を低下または排除する。
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録１または表１２の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択され、本開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載されている。一実施形態では、ＰＣＲによるＣＩＩＴＡ遺伝子の結果として生じる遺伝子改変およびＨＬＡ－ＩＩ発現の低下は、ＦＡＣＳ分析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質発現は、ＣＩＩＴＡタンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、不活性化遺伝子改変の存在を確認する。
Ｄ．Ｂ２Ｍ
ある特定の態様では、本明細書に開示される発明は、アクセサリー鎖Ｂ２Ｍの発現を標的化および調節（例えば、低下または排除）することによって、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子の発現を調節（例えば、低下または排除）する。いくつかの態様では、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して起こる。Ｂ２Ｍの発現を調節（例えば、低下または欠失）することにより、ＭＨＣ－Ｉ分子の表面輸送がブロックされ、そのような細胞は、レシピエント対象に移植されたときに免疫寛容を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、投与時にレシピエント対象または患者において低免疫原性であるとみなされる。
いくつかの実施形態では、本発明の標的ポリヌクレオチド配列はＢ２Ｍのバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍの相同体である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのオルソログである。
いくつかの態様では、Ｂ２Ｍの発現の減少または排除は、以下のＭＨＣ Ｉ分子－ＨＬＡーＡ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上の発現を低下または排除する。
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化する遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるＢ２Ｍ遺伝子を標的化する遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録２または表１５の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択され、本開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｂ２Ｍ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載されている。一実施形態では、ＰＣＲによるＢ２Ｍ遺伝子の結果として生じる遺伝子改変およびＨＬＡ－Ｉ発現の低下は、ＦＡＣＳ分析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、Ｂ２Ｍタンパク質発現は、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、不活性化遺伝子改変の存在を確認する。
Ｅ．ＮＬＲＣ５
ある特定の態様では、本明細書に開示される発明は、ＮＬＲファミリー、ＣＡＲＤドメイ含有５／ＮＯＤ２７／ＣＬＲ１６．１（ＮＬＲＣ５）の発現を標的化および調節（例えば、低下または排除）することによって、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子の発現を調節（例えば、低下または排除）する。いくつかの態様では、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して起こる。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉを介した免疫応答の重要な調節因子であり、ＣＩＩＴＡと同様に、ＮＬＲＣ５はＩＦＮ－γによって高度に誘導され、核に移行することができる。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子のプロモーターを活性化し、ＭＨＣ－ＩならびにＭＨＣ－Ｉ抗原提示に関与する関連遺伝子の転写を誘導する。
いくつかの実施形態では、本発明の標的ポリヌクレオチド配列はＮＬＲＣ５のバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＬＲＣ５の相同体である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＬＲＣ５のオルソログである。
いくつかの態様では、ＮＬＲＣ５の発現の減少または排除は、以下のＭＨＣ Ｉ分子－ＨＬＡーＡ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上の発現を低下または排除する。
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＬＲＣ５遺伝子を標的化する遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるＮＬＲＣ５遺伝子を標的化する遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録３または表１４の配列番号３６３５３～８１２３９からなる群から選択され、本開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＮＬＲＣ５遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載されている。一実施形態では、ＰＣＲによるＮＬＲＣ５遺伝子の結果として生じる遺伝子改変およびＨＬＡ－Ｉ発現の低下は、ＦＡＣＳ分析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、ＮＬＲＣ５タンパク質発現は、ＮＬＲＣ５タンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、不活性化遺伝子改変の存在を確認する。
Ｆ．ＣＤ４７
いくつかの実施形態では、細胞は、外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび外因性ＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、多能性細胞または多能性細胞から生成された分化細胞は、外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび外因性ＣＤ４７ポリペプチドを含む。
いくつかの態様では、本開示は、免疫寛容原性因子（例えば、免疫調節ポリペプチド）ＣＤ４７を発現するように改変された細胞またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＣＤ４７を発現するように細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、幹細胞は、外因性ＣＤ４７ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを発現する。場合によっては、細胞は、ヒトＣＤ４７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現する。
ＣＤ４７は白血球表面抗原であり、細胞接着およびインテグリンの調節において役割を果たす。それは細胞の表面上で発現し、循環細胞に細胞を食べないように信号を送る。
いくつかの実施形態では、本明細書で概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１７６８．１およびＮＰ＿９４２０８８．１ならびに配列番号３２および３３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）を有するＣＤ４７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１７６８．１およびＮＰ＿９４２０８８．１ならびに配列番号３２および３３に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００１７７７．３およびＮＭ＿１９８７９３．２に記載される配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）を有するＣＤ４７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００１７７７．３およびＮＭ＿１９８７９３．２に記載されるＣＤ４７のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１７６８．１およびＮＰ＿９４２０８８．１ならびに配列番号３２および３３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）を有するＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１７６８．１およびＮＰ＿９４２０８８．１ならびに配列番号３２および３３に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどの遺伝子編集システムは、ＡＡＶＳ１遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座への免疫寛容原性因子の挿入などの免疫寛容原性因子の挿入を容易にするために使用される。いくつかの場合には、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列は、限定されないがＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、またはＳＨＳ２３１遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座に挿入される。
別の実施形態では、ＣＤ４７タンパク質発現は、ＣＤ４７タンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、外因性ＣＤ４７ ｍＲＮＡの存在を確認する。
Ｇ．ＤＵＸ４
いくつかの態様では、本開示は、ＤＵＸ４などの免疫寛容原性または免疫抑制因子遺伝子の発現を増加させるように改変されたゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＤＵＸ４の増加した発現を提供するように細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。一態様では、本開示は、外因的に発現されたＤＵＸ４タンパク質を含む細胞またはその集団を提供する。いくつかの態様では、ＤＵＸ４の発現の増加は、以下のＭＨＣ Ｉ分子－ＨＬＡーＡ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上の発現を低下または排除する。
いくつかの実施形態では、細胞は、外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび外因性ＤＵＸ４ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、多能性細胞または多能性細胞から生成された分化細胞は、外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび外因性ＤＵＸ４ポリペプチドを含む。
ＤＵＸ４は、胚組織および人工多能性幹細胞で活性があり、正常で健康な体細胞では沈黙している転写因子である（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＥＬｉｆｅ４；Ｄｅ Ｉａｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，４９，９４１－９４５；Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，４９，９２５－９３４、Ｓｎｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ，ｅ１００１１８１、Ｗｈｉｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ）。ＤＵＸ４の発現は、ＩＦＮ－ガンマを介した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ遺伝子発現（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃの発現）の誘導をブロックするように作用する。ＤＵＸ４の発現は、ＭＨＣクラスＩによる抑制された抗原提示に関係している（Ｃｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ，２０１９，５０，１－１４）。ＤＵＸ４は、卵割期の遺伝子発現（転写）プログラムにおいて転写因子として機能する。その標的遺伝子としては、コーディング遺伝子、ノンコーディング遺伝子、および反復要素が挙げられるが、これらに限定されない。
ＤＵＸ４には少なくとも２つのアイソフォームがあり、最長のアイソフォームはＤＵＸ４のＣ末端転写活性化ドメインを構成する。アイソフォームは、選択的スプライシングによって産生される。例えば、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，２２，３８－５１、Ｓｎｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ，ｅ１００１１８１を参照されたい。ＤＵＸ４の活性なアイソフォームは、そのＮ末端のＤＮＡ結合ドメインと、そのＣ末端の活性化ドメインと、を含む。例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，４４，５１６１－５１７３を参照されたい。
ＤＵＸ４のＣｐＧモチーフの数を減らすと、ＤＵＸ４導入遺伝子のサイレンシングが減少することが示されている（Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１６，２５（２０）：４４１９－４４３１）。配列番号１は、ＤＵＸ４タンパク質配列を保存しながら、ＣｐＧ部位の総数を減らすための１つ以上の塩基置換を含むＤＵＸ４のコドン変更配列を表す。核酸配列は、Ａｄｄｇｅｎｅから、カタログ番号９９２８１で市販されている。
ある特定の態様では、少なくとも１つ以上のポリヌクレオチドを利用して、細胞、例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞へのＤＵＸ４の挿入を容易にすることができる。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどの遺伝子編集システムは、ＡＡＶＳ１遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座への免疫寛容原性因子の挿入などの免疫寛容原性因子の挿入を容易にするために使用される。いくつかの場合には、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、限定されないがＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、またはＳＨＳ２３１遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座に挿入される。
いくつかの場合には、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１である。いくつかの実施形態では、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５からなる群から選択されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。
他の実施形態では、免疫寛容原性因子の発現は、発現ベクターを使用して促進される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＤＵＸ４タンパク質配列を維持しながらＣｐＧ部位の総数を減らすための１つ以上の塩基置換を含むコドン変更配列であるＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、ＤＵＸ４のコドン変更配列は、配列番号１である。他の実施形態では、発現ベクターは、配列番号１であるＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５からなる群から選択されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
ＤＵＸ４発現の増加は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳアッセイ、イムノアッセイなどの既知の技術を使用してアッセイすることができる。
Ｈ．追加の免疫寛容原性因子
ある特定の実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子をゲノム編集細胞に挿入または再挿入して、ユニバーサルドナー幹細胞、ユニバーサルドナーＴ細胞、またはユニバーサルドナー細胞などの免疫特権のあるユニバーサルドナー細胞を作製することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される低免疫原性細胞は、１つ以上の免疫寛容原性因子を発現するようにさらに改変されている。例示的な免疫寛容原性因子としては、限定されないが、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９のうちの１つ以上が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどの遺伝子編集システムは、ＡＡＶＳ１遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座への免疫寛容原性因子の挿入などの免疫寛容原性因子の挿入を容易にするために使用される。いくつかの場合には、本明細書に記載される任意の免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチド配列は、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、またはＳＨＳ２３１遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座に挿入される。
いくつかの態様では、本開示は、細胞ゲノムがＣＤ４７を発現するように改変されているゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＣＤ４７を発現するように細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。ある特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸を利用して、細胞株へのＣＤ４７の挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１８３０４１の表２９の配列番号２００７８４～２３１８８５からなる群から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、細胞ゲノムがＨＬＡ－Ｃを発現するように改変されているゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示はＨＬＡ－Ｃを発現するように細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。ある特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸を利用して、細胞株へのＨＬＡ－Ｃの挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１８３０４１の表１０の配列番号３２７８～５１８３からなる群から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、細胞ゲノムがＨＬＡ－Ｅを発現するように改変されているゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示はＨＬＡ－Ｅを発現するように細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。ある特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸を利用して、細胞株へのＨＬＡ－Ｅの挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１８３０４１の表１９の配列番号１８９８５９～１９３１８３からなる群から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、細胞ゲノムがＨＬＡ－Ｆを発現するように改変されているゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示はＨＬＡ－Ｆを発現するように細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。ある特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸を利用して、細胞株へのＨＬＡ－Ｆの挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１８３０４１の表４５の配列番号６８８８０８～３９９７５４からなる群から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、細胞ゲノムがＨＬＡ－Ｇを発現するように改変されているゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示はＨＬＡ－Ｇを発現するように細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。ある特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸を利用して、幹細胞株へのＨＬＡ－Ｇの挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１８３０４１の表１８の配列番号１８８３７２～１８９８５８からなる群から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、細胞ゲノムがＰＤ－Ｌ１を発現するように改変されているゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＰＤ－Ｌ１を発現するように細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。ある特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸を利用して、幹細胞株へのＰＤ－Ｌ１の挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１８３０４１の表２１の配列番号１９３１８４～２００７８３からなる群から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、細胞ゲノムがＣＴＬＡ４－Ｉｇを発現するように改変されているゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＣＴＬＡ４－Ｉｇを発現するように細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。ある特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸を利用して、幹細胞株へのＣＴＬＡ４－Ｉｇの挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸は、配列表を含む、ＷＯ２０１６／１８３０４１に開示されたいずれかから選択される。
いくつかの態様では、本開示は、細胞ゲノムがＣＩ－阻害剤を発現するように改変されているゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示はＣＩ－阻害剤を発現するように細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。ある特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸を利用して、幹細胞株へのＣＩ－阻害剤の挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸は、配列表を含む、ＷＯ２０１６／１８３０４１に開示されたいずれかから選択される。
いくつかの態様では、本開示は、細胞ゲノムがＩＬ－３５を発現するように改変されているゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来またはそれから産生された分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＩＬ－３５を発現するように細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。ある特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸を利用して、幹細胞株へのＩＬ－３５の挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸は、配列表を含む、ＷＯ２０１６／１８３０４１に開示されたいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、発現ベクターを使用して細胞において発現される。例えば、細胞内でＣＤ４７を発現させるための発現ベクターは、ＣＤ４７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７ポリペプチドは、配列番号３２または配列番号３３のアミノ酸配列を含む。発現ベクターは、誘導性発現ベクターであり得る。発現ベクターは、レンチウイルスベクターなどであるがこれに限定されないウイルスベクターであり得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞ゲノムが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸ－ＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＬＲＣ５、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸ－ＡＰ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＮＦＹ－Ｂ、ＰＤ－Ｌ１、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ１、ＴＡＰ１、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、Ｂ７－１、ＣＤ４７、Ｂ７－２、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＬＦＡ－１、ＳＴ２、ＨＬＡ－Ｆ、ＣＤ３０、Ｂ７－Ｈ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＬＴ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ５８、ＣＤ２、ＨＥＬＩＯＳ、およびＩＤＯ１からなる群から選択されるポリペプチドのうちのいずれか１つを発現するように改変されているゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来または産生された分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸ－ＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＬＲＣ５、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸ－ＡＰ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＮＦＹ－Ｂ、ＰＤ－Ｌ１、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ１、ＴＡＰ１、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、Ｂ７－１、ＣＤ４７、Ｂ７－２、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＬＦＡ－１、ＳＴ２、ＨＬＡ－Ｆ、ＣＤ３０、Ｂ７－Ｈ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＬＴ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ５８、ＣＤ２、ＨＥＬＩＯＳ、およびＩＤＯ１からなる群から選択されるポリペプチドのうちのいずれか１つを発現するように細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。ある特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸を利用して、幹細胞株への選択されたポリペプチドの挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸は、その開示が、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録１～４７および配列表に開示されたいずれか１つから選択される。
Ｉ．例示的な実施形態
いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４の発現の増加、ならびにＭＨＣクラスＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４の発現の増加、ならびにＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４の発現の増加、ならびにＭＨＣクラスＩＩおよびＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低下を示す。
いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４の発現の増加、ならびにＢ２Ｍの発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４の発現の増加、ならびにＣＩＩＴＡの発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４の発現の増加、ならびにＮＬＲＣ５の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４の発現の増加、ならびにＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡのうちの１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４の発現の増加、ならびにＢ２ＭおよびＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４の発現の増加、ならびにＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低下を示す。本明細書に記載される細胞のいずれかはまた、限定されないが、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択される１つ以上の因子の発現の増加を示すことができる。
いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＭＨＣクラスＩ複合体のうちの１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＭＨＣクラスＩＩ複合体のうちの１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＭＨＣクラスＩＩおよびＭＨＣクラスＩＩ複合体のうちの１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２Ｍの発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＣＩＩＴＡの発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＮＬＲＣ５の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡのうちの１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２ＭおよびＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、細胞およびその集団は、ＣＤ２４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低下を示す。本明細書に記載される細胞のいずれかはまた、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択される１つ以上の発現の増加を示すことができる。
当業者は、操作もしくは改変された遺伝子、タンパク質または分子の発現の増加または減少などの発現レベルを、同等の非操作もしくは非改変細胞を参照または比較できることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、ＣＤ２４の発現が増加した操作された幹細胞は、改変されていない幹細胞と比較してより高いレベルのＣＤ２４タンパク質を有する改変された幹細胞を指す。
Ｊ．遺伝子組換えの方法
いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、レアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入される。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成することができる。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質を介したトランスフェクション、電気穿孔法、およびウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように、改変されたＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように、改変されたｍＲＮＡ（例えば、合成の改変されたｍＲＮＡ）を含む。
本発明は、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用して当業者が利用できる任意の方法で標的ポリヌクレオチド配列を変更することを企図する。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更することができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することができる。このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、様々なＣａｓタンパク質を使用することができる（Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２００５；１（６）ｅ６０）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更できるようにするこのようなＣａｓタンパク質の分子機構としては、ＲＮＡ結合タンパク質、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ならびにポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩシステムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲＩＩ型システムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲＶ型システムである。
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、細胞内の任意の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。当業者は、任意の特定の細胞において改変される望ましい標的ポリヌクレオチド配列が、ゲノム配列の発現が障害に関連するか、さもなければ病原体の細胞への侵入を促進する任意のゲノム配列に対応し得ることを容易に理解するであろう。例えば、細胞内で変化することが望ましい標的ポリヌクレオチド配列は、疾患に関連する一塩基多型を含むゲノム配列に対応するポリヌクレオチド配列であり得る。そのような例では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、細胞を野生型対立遺伝子で置き換えることにより、細胞内の疾患に関連するＳＮＰを修正することができる。別の例として、細胞への病原体の侵入または増殖に関与する標的遺伝子のポリヌクレオチド配列は、病原体が細胞に侵入し、細胞内で増殖するのを防ぐために標的遺伝子の機能を破壊するための欠失または挿入に適した標的であり得る。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳動物ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物のゲノム配列である。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに対してハイブリダイズすることができる少なくとも１つ～２つのリボ核酸と、含む。本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された一連のアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸のポリマー）を指すために互換的に使用され、改変アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化、など）およびアミノ酸類似体が含まれる。例示的なポリペプチドまたはタンパク質としては、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、パラログ、フラグメントおよび他の同等物、バリアント、および上記の類似体が含まれる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。場合によっては、置換および／または改変は、タンパク質分解を防止もしくは低下し、かつ／または細胞内のポリペプチドの半減期を延長することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ペプチド結合置換（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素など）を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、代替アミノ酸（例えば、Ｄ－アミノ酸、ベータ－アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど）を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、部分（例えば、ペグ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、エンドキャッピングなど）を含むように改変を含むことができる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、コアＣａｓタンパク質を含む。例示的なＣａｓコアタンパク質には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８およびＣａｓ９が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉサブタイプ（ＣＡＳＳ２としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｅ．Ｃｏｌｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、およびＣａｓ５ｅが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｙｐｅｓｔサブタイプ（ＣＡＳＳ３としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｙｐｅｓｔサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、およびＣｓｙ４が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｎｍｅｎｉサブタイプ（ＣＡＳＳ４としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｎｍｅｎｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質にはＣｓｎ１およびＣｓｎ２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄｖｕｌｇサブタイプ（ＣＡＳＳ１としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｄｖｕｌｇサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、およびＣａｓ５ｄが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｔｎｅａｐサブタイプ（ＣＡＳＳ７としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｔｎｅａｐサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃａｓ５ｔが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質を含む。Ｈｍａｒｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質にはＣｓｈ１、Ｃｓｈ２、およびＣａｓ５ｈが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ａｐｅｒｎサブタイプ（ＣＡＳＳ５としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ａｐｅｒｎサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、およびＣａｓ５ａが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｍｔｕｂｅサブタイプ（ＣＡＳＳ６としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｍｔｕｂｅサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、およびＣｓｍ５が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質を含む。例示的なＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質には、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、およびＣｍｒ６が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｋｌｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７１，２１９－２２５（２０１９）、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６５，４８－５３（２０１９）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質のいずれか１つまたはその機能的部分を含む。本明細書で使用される場合、「機能的部分」は、少なくとも１つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体を形成し、標的ポリヌクレオチド配列を切断するその能力を保持するペプチドの部分を指す。いくつかの実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結されたＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結されたＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られる）タンパク質機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、機能的ドメインは複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。
いくつかの実施形態では、外因性Ｃａｓタンパク質は、ポリペプチド形態で細胞に導入され得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドに共役または融合させることができる。本明細書において使用される場合、「細胞透過性ポリペプチド」および「細胞透過性ペプチド」は、細胞中への分子の取り込みを促進するそれぞれポリペプチドまたはペプチドを指す。細胞透過性ポリペプチドは、検出可能な標識を含有することができる。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、荷電したタンパク質（例えば、正電荷、負電荷または全体として中性電荷を持つ）に共役または融合させることができる。そのような連結は共有結合であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞に透過するＣａｓタンパク質の能力を有意に増加させるために正に超荷電した（ｓｕｐｅｒｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ）ＧＦＰに融合させることができる（Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１０；５（８）：７４７－５２）。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞へのその進入を促進するためにタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合させることができる。例示的なＰＴＤとしては、Ｔａｔ、オリゴアルギニン、およびペネトラチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＴＤに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ｔａｔドメインに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、正に超荷電したＧＦＰに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ＰＴＤに融合したＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ｔａｔドメインに融合したＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ペネトラチンドメインに融合したＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、正に超荷電したＧＦＰに融合したＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入される。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成することができる。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質を介したトランスフェクション、電気穿孔法、およびウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように、改変されたＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように、改変されたｍＲＮＡ（例えば、合成の改変されたｍＲＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１～２つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるように、改変された核酸（例えば、合成の改変されたｍＲＮＡ）によってコードされる。
本発明の方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸の使用を想定する。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つはｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、単一のリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、Ｃａｓタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸の両方は、Ｃａｓタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。本発明のリボ核酸は、当業者により理解されるように、用いられる特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、および標的ポリヌクレオチドの配列に応じて様々な異なる標的モチーフにハイブリダイズするように選択することができる。１～２つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択することができる。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸は、細胞中のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較したときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸は、細胞中のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較したときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されたデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計されている。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸の各々は、標的モチーフ間に位置する変異体対立遺伝子に隣接するＣａｓタンパク質によって認識されたデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計されている。
いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸の各々は、Ｃａｓタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖上の配列に相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列に相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列に相補的ではなく、かつ／またはハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の重複する標的モチーフに相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフを相殺するために相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸および少なくとも１～２つのリボ核酸をコードする核酸は、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞に導入される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１～２つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるように、改変された核酸（例えば、合成の改変されたｍＲＮＡ）によってコードされる。
本明細書に記載の遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの標的化に有用な例示的なｇＲＮＡ配列を表１に提供する。配列は、２０１６年５月９日に出願されたＷＯ２０１６／１８３０４１に見出すことができ、表、付属書、および配列表を含む開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Figure 2022546317000002
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）方法論を使用して作製される。
「ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）とは、典型的には転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来する核酸結合ドメインと、核酸標的配列を切断するための１つのヌクレアーゼ触媒ドメインとからなる融合タンパク質を意図する。触媒ドメインは、好ましくはヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは、例えばＩ－ＴｅｖＩ、ＣｏｌＥ７、ＮｕｃＡおよびＦｏｋ－Ｉのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。特定の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、例えば、Ｉ－ＣｒｅＩおよびＩ－ＯｎｕＩまたはそれらの機能的バリアントのようなメガヌクレアーゼに融合させることができる。より好ましい実施形態では、該ヌクレアーゼは、単量体のＴＡＬＥ－ヌクレアーゼである。単量体ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、ＷＯ２０１２／１３８９２７に記載されているＩ－ＴｅｖＩの触媒ドメインと操作されたＴＡＬリピートの融合など、特定の認識および切断のために二量体化を必要としないＴＡＬＥ－ヌクレアーゼである。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、細菌種Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のタンパク質であり、複数の反復配列を含み、各反復は、核酸標的化配列の各ヌクレオチド塩基に特異的な１２位および１３位に２残基（ＲＶＤ）を含む。同様の塩基対塩基特異的核酸結合特性（ｍｏｄｕｌａｒ ｂａｓｅ－ｐｅｒ－ｂａｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）（ＭＢＢＢＤ）を備えた結合ドメインは、異なる細菌種で本出願人によって最近発見された新しいモジュラータンパク質からも誘導することができる。新しいモジュラータンパク質には、ＴＡＬ反復よりも多くの配列変動性を示すという利点がある。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴを認識するためのＮＳ、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＩＧ、Ｇを認識するためのＮＫ、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、およびＴを認識するためのＹＧ、Ａを認識するためのＴＬ、ＡまたはＧを認識するためのＶＴならびにＡを認識するためのＳＷである。別の実施形態では、重要なアミノ酸１２および１３は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣおよびＧに対するそれらの特異性を調節するために、特にこの特異性を高めるために、他のアミノ酸残基に対して変異させることができる。ＴＡＬＥＮキットは市販されている。
いくつかの実施形態では、細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して操作される。「ジンクフィンガー結合タンパク質」は、亜鉛イオンの配位によるタンパク質構造の安定化の結果として、好ましくは配列特異的な方法で、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質に結合するタンパク質またはポリペプチドである。ジンクフィンガー結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略されることがよくある。個々のＤＮＡ結合ドメインは、通常「フィンガー」と呼ばれる。ＺＦＰには、少なくとも１本のフィンガー通常は２本のフィンガー、３本のフィンガー、または６本のフィンガーがある。各フィンガーは、２～４塩基対のＤＮＡ、通常は３～４塩基対のＤＮＡに結合する。ＺＦＰは、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。各フィンガーは通常、約３０アミノ酸、亜鉛キレート、ＤＮＡ結合サブドメインで構成されている。研究によると、このクラスの単一のジンクフィンガーは、単一のベータターンの２つのシステイン残基とともに亜鉛と配位した２つの不変のヒスチジン残基を含むアルファヘリックスからなる（例えば、Ｂｅｒｇ ＆ Ｓｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１０８１－１０８５（１９９６）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して作製される。そのようなホーミングエンドヌクレアーゼは当技術分野において周知である（Ｓｔｏｄｄａｒｄ ２００５）。ホーミングエンドヌクレアーゼはＤＮＡ標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖分解を生成させる。ホーミングエンドヌクレアーゼは非常に特異的であり、長さが１２～４５塩基対（ｂｐ）の範囲で、通常は長さが１４～４０ｂｐの範囲のＤＮＡ標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、またはＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼに相当し得る。本発明による好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩバリアントであり得る。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、メガヌクレアーゼを使用して作製される。メガヌクレアーゼは、定義上、大きな配列を認識する配列特異的エンドヌクレアーゼである（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｂ．Ｓ．ａｎｄ Ｂ．Ｌ．Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００１，２９，３７５７－３７７４）。それらは生細胞内の固有の部位を切断することができ、それによって切断部位の近くで遺伝子ターゲティングを１０００倍以上増強する（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１，５０３４－５０４０、Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，１４，８０９６－８１０６、Ｃｈｏｕｌｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５，１５，１９６８－１９７３、Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，５０５５－５０６０、Ｓａｒｇｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，１７，２６７－７７、Ｄｏｎｏｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１９９８，１８，４０７０－４０７８、Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，９３－１０１、Ｃｏｈｅｎ－Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，１４４４－１４４８）。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、免疫寛容原性因子などのポリペプチドの発現をノックダウン（例えば、減少、排除、または阻害）するために、ＲＮＡサイレンシングまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して作製される。有用なＲＮＡｉ法には、合成ＲＮＡｉ分子、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩ相互作用ＮＲＡ（ｐｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用するもの、および当技術分野で認められている他の一過性ノックダウン法が挙げられる。配列特異的ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを含むＲＮＡｉ用試薬は市販されている。例えば、ＣＩＩＴＡ ｓｉＲＮＡを導入するか、ＣＩＩＴＡ ｓｈＲＮＡ発現ウイルスを細胞に導入することにより、ＣＩＩＴＡを多能性幹細胞でノックダウンすることができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ干渉は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、およびＮＬＲＣ５からなる群から選択される少なくとも１つの発現を低下または阻害するために使用される。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、１つ以上の免疫因子（標的ポリペプチドを含む）の発現を低下させるように遺伝子改変されて、免疫特権のある細胞または低免疫原性細胞を作製する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞）は、１つ以上の標的ポリヌクレオチドの発現を低下させるための１つ以上の遺伝子改変を含む。そのような標的ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非限定的な例としては、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢＭ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸ－ＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＲＦＸ５、ＲＦＸ－ＡＰ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ１、およびＴＡＰ１が挙げられる。
いくつかの態様では、遺伝子改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して起こる。１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの発現を調節する（例えば、低下または欠失する）ことにより、そのような細胞は、レシピエント対象に移植されたときに減少した免疫活性化を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、投与時にレシピエント対象または患者において低免疫原性であるとみなされる。
Ｋ．免疫寛容原性因子の過剰発現の方法
本明細書で提供されるのは、レシピエント対象への投与時に免疫応答を誘発または活性化しない細胞である。上記のように、いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエントにおける免疫認識および免疫寛容に影響を与える遺伝子および寛容原性（例えば、免疫）因子の発現を増加させるように改変される。
ある特定の実施形態では、本明細書に列挙された１つ以上の標的タンパク質の発現を調節する遺伝子改変を有する本明細書に開示される細胞のいずれか（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、一次Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞）はまた、１つ以上の免疫寛容原性因子を発現するように改変されている。例示的な免疫寛容原性因子としては、限定されないが、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦａｓＬ、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９のうちの１つ以上が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦａｓＬ、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９を含む群から選択される。
ヒトＣＤ２７（ＣＤ２７Ｌ受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー７、ＴＮＦＳＦ７、Ｔ細胞活性化抗原Ｓ１５２、Ｔｐ５５、およびＴ１４としても知られている）に関する有用なゲノム、ポリペプチド、およびポリペプチド情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ１２Ｐ００８１４４、ＨＧＮＣ Ｎｏ．１１９２２、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９３９、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ２６８４２、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＭ＿００１２４２．４ およびＮＰ＿００１２３３．１で提供される。
ヒトＣＤ４６に関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０１Ｐ２０７７５２、ＨＧＮＣ Ｎｏ．６９５３、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４１７９、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１５５２９、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＭ＿００２３８９．４、ＮＭ＿１５３８２６．３、ＮＭ＿１７２３５０．２、ＮＭ＿１７２３５１．２、ＮＭ＿１７２３５２．２ ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＭ＿１７２３５３．２、ＮＭ＿１７２３５９．２、ＮＭ＿１７２３６１．２、ＮＰ＿００２３８０．３、ＮＰ＿７２２５４８．１、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＰ＿７５８８６１．１、ＮＰ＿７５８８６２．１、ＮＰ＿７５８８６３．１、ＮＰ＿７５８８６９．１、およびＮＰ＿７５８８７１．１で提供される。
ヒトＣＤ５５（補体崩壊促進因子としても知られる）に関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチド情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０１Ｐ２０７３２１、ＨＧＮＣ Ｎｏ．２６６５、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １６０４、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０８１７４、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＭ＿０００５７４．４、ＮＭ＿００１１１４７５２．２、ＮＭ＿００１３００９０３．１、ＮＭ＿００１３００９０４．１、ＮＰ＿０００５６５．１、ＮＰ＿００１１０８２２４．１、ＮＰ＿００１２８７８３２．１、およびＮＰ＿００１２８７８３３．１で提供される。
ヒトＣＤ５９に関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ１１Ｍ０３３７０４、ＨＧＮＣ Ｎｏ．１６８９、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９６６、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１３９８７、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿０００６０２．１、ＮＭ＿０００６１１．５、ＮＰ＿００１１２０６９５．１、ＮＭ＿００１１２７２２３．１、ＮＰ＿００１１２０６９７．１、ＮＭ＿００１１２７２２５．１、ＮＰ＿００１１２０６９８．１、ＮＭ＿００１１２７２２６．１、ＮＰ＿００１１２０６９９．１、ＮＭ＿００１１２７２２７．１、ＮＰ＿９７６０７４．１、ＮＭ＿２０３３２９．２、ＮＰ＿９７６０７５．１、ＮＭ＿２０３３３０．２、ＮＰ＿９７６０７６．１、およびＮＭ＿２０３３３１．２で提供される。
ヒトＣＤ２００に関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチド情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０３Ｐ１１２３３２、ＨＧＮＣ Ｎｏ．７２０３、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４３４５、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ４１２１７、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００１００４１９６．２、ＮＭ＿００１００４１９６．３、ＮＰ＿００１３０５７５７．１、ＮＭ＿００１３１８８２８．１、ＮＰ＿００５９３５．４、ＮＭ＿００５９４４．６、ＸＰ＿００５２４７５３９．１、およびＸＭ＿００５２４７４８２．２で提供される。
ヒトＨＬＡ－Ｃに関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０６Ｍ０３１２７２、ＨＧＮＣ Ｎｏ．４９３３、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ３１０７、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１０３２１、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００２１０８．４およびＮＭ＿００２１１７．５で提供される。
ヒトＨＬＡ－Ｅに関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０６Ｐ０４７２８１、ＨＧＮＣ Ｎｏ．４９６２、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ３１３３、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１３７４７、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００５５０７．３およびＮＭ＿００５５１６．５で提供される。
ヒトＨＬＡ－Ｇに関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０６Ｐ０４７２５６、ＨＧＮＣ Ｎｏ．４９６４、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ３１３５、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１７６９３、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００２１１８．１およびＮＭ＿００２１２７．５で提供される。
ヒトＰＤ－Ｌ１またはＣＤ２７４に関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチド情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０９Ｐ００５４５０、ＨＧＮＣ Ｎｏ．１７６３５、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ２９１２６、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ９ＮＺＱ７、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００１２５４６３５．１、ＮＭ＿００１２６７７０６．１、ＮＰ＿０５４８６２．１、およびＮＭ＿０１４１４３．３で提供される。
ヒトＩＤＯ１に関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチド情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０８Ｐ０３９８９１、ＨＧＮＣ Ｎｏ．６０５９、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ３６２０、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１４９０２、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００２１５５．１およびＮＭ＿００２１６４．５で提供される。
ヒトＩＬ－１０に関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチド情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０１Ｍ２０６７６７、ＨＧＮＣ Ｎｏ．５９６２、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ３５８６、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ２２３０１、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿０００５６３．１およびＮＭ＿０００５７２．２で提供される。
ヒトＦａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ１７８、ＴＮＦＳＦ６などとして知られている）に関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチド情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０１Ｐ１７２６２８、ＨＧＮＣ Ｎｏ．１１９３６、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ３５６、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ４８０２３、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿０００６３０．１、ＮＭ＿０００６３９．２、ＮＰ＿００１２８９６７５．１、およびＮＭ＿００１３０２７４６．１で提供される。
ヒトＣＣＬ２１に関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０９Ｍ０３４７０９、ＨＧＮＣ Ｎｏ．１０６２０、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ６３６６、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｏ００５８５、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００２９８０．１およびＮＭ＿００２９８９．３で提供される。
ヒトＣＣＬ２２に関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチド情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ１６Ｐ０５７３５９、ＨＧＮＣ Ｎｏ．１０６２１、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ６３６７、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｏ００６２６、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００２９８１．２、ＮＭ＿００２９９０．４、ＸＰ＿０１６８７９０２０．１、およびＸＭ＿０１７０２３５３１．１で提供される。
ヒトＭｆｇｅ８に関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチド情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ１５Ｍ０８８８９８、ＨＧＮＣ Ｎｏ．７０３６、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４２４０、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ０８４３１、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００１１０８０８６．１、ＮＭ＿００１１１４６１４．２、ＮＰ＿００１２９７２４８．１、ＮＭ＿００１３１０３１９．１、ＮＰ＿００１２９７２４９．１、ＮＭ＿００１３１０３２０．１、ＮＰ＿００１２９７２５０．１、ＮＭ＿００１３１０３２１．１、ＮＰ＿００５９１９．２、およびＮＭ＿００５９２８．３で提供される。
ヒトＳｅｒｐｉｎＢ９に関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチド情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０６Ｍ００２８８７、ＨＧＮＣ Ｎｏ．８９５５、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ５２７２、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ５０４５３、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００４１４６．１、ＮＭ＿００４１５５．５、ＸＰ＿００５２４９２４１．１、およびＸＭ＿００５２４９１８４．４で提供される。
ヒトＣＤ３５（補体受容体１型（ＣＲ１）、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体（Ｃ３ＢＲ）、Ｃ４Ｂｒ、ｋｎｏｐｓ血液型抗原、およびＣ３結合ドメインとしても知られる）に関する有用なゲノム、ポリヌクレオチド、およびポリペプチド情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０１Ｐ２０７４９６、ＨＧＮＣ Ｎｏ．２３３４、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １３７８、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１７９２７、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏｓ．ＮＰ＿０００５６４．２、ＮＭ＿０００５７３．３、ＮＰ＿０００６４２．３、およびＮＭ＿０００６５１．４で提供される。
遺伝子および因子（タンパク質）の発現を調節するための方法には、ゲノム編集技術、およびＲＮＡまたはタンパク質発現技術などが含まれる。これらの技術のすべてについて、本明細書に概説されるような組換え核酸を生成するために、周知の組換え技術が使用される。
ある特定の実施形態では、免疫寛容原性因子をコードする組換え核酸は、発現構築物中の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節ヌクレオチド配列は、一般に、治療される宿主細胞およびレシピエントに適切である。様々な宿主細胞について、多くの種類の適切な発現ベクターおよび適切な調節配列が当技術分野において既知である。典型的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。当技術分野において既知である構成的または誘導性プロモーターもまた企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または２つ以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドなどのエピソーム上の細胞に存在し得るか、または発現構築物は染色体に挿入され得る。特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択可能なマーカー遺伝子を含む。ある特定の実施形態は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたバリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本明細書で使用するための調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメントが挙げられる。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換される宿主細胞、発現されることが望まれる特定のバリアントポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、または抗生物質マーカーなどの、コードされる他のタンパク質の発現の選択のために設計される。
適切な哺乳動物プロモーターの例としては、例えば、以下の遺伝子からのプロモーター：ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（ＷＯ９７／１５６６４）、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のロングターミナルリピート領域、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルスロングターミナルリピート領域、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターが挙げられる。他の異種哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリン、または熱ショックプロモーターである。追加の実施形態では、哺乳動物宿主細胞で使用するためのプロモーターは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２，２１１，５０４）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得ることができる。さらなる実施形態では、異種哺乳動物プロモーターが使用される。例としては、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、および熱ショックプロモーターが挙げられる。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして便利に得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３－１２０（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、Ｈｉｎｄｌｌｌ Ｅ制限フラグメントとして便利に得られる（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２））。前述の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＣＤ２４、ＣＤ４７、または別の免疫寛容原性因子）の発現は、（１）内因性ＣＤ２４、ＣＤ４７、または他の遺伝子に特異的な部位特異的結合ドメインと、（２）転写活性化因子と、を含有する融合タンパク質またはタンパク質複合体の発現によって増加される。
いくつかの実施形態では、調節因子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などの部位特異的ＤＮＡ結合核酸分子から構成される。いくつかの実施形態では、この方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）としても知られる、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはＺＦＰを含む融合タンパク質などの部位特異的ＤＮＡ結合標的タンパク質によって達成される。
いくつかの態様では、調節因子は、標的領域で遺伝子に特異的に結合またはハイブリダイズする、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合核酸を使用するなどの部位特異的結合ドメインを含む。いくつかの態様では、提供されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、改変されたヌクレアーゼなどの部位特異的ヌクレアーゼに結合または複合体化される。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、メガヌクレアーゼなどの改変されたヌクレアーゼのＤＮＡ標的化タンパク質、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系などのクラスター化された規則的配置短鎖反復回文配列核酸（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ系、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含む融合を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を欠如するように改変される。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレアーゼは、触媒的に死んだｄＣａｓ９である。
いくつかの実施形態では、部位特異的結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、およびＩ－ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列である。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５－１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５－１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３およびｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅも参照されたい。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９；Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９－６６、米国特許公開第２００７／０１１７１２８号を参照されたい。
ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、およびＣＲＩＳＰＲシステム結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つ以上のアミノ酸の変更）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。設計の合理的な基準は、既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計の情報とバインディングデータを格納するデータベース内の情報を処理するための置換ルールおよびコンピュータ化されたアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたく、またＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６ならびに米国公開第２０１１／０３０１０７３号も参照されたい。
いくつかの実施形態では、部位特異的結合ドメインは、配列特異的にＤＮＡに結合する１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはそのドメインを含む。ＺＦＰまたはそのドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡに結合する、より大きなタンパク質内のタンパク質またはドメインであり、その構造の結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域は、亜鉛イオンの配位によって安定化される。
ＺＦＰの中には、個々のフィンガーの組み立てによって生成される、通常９～１８のヌクレオチド長の特定のＤＮＡ配列を標的化する人工ＺＦＰドメインがある。ＺＦＰには、シングルフィンガードメインの長さが約３０アミノ酸で、亜鉛を介して１つのベータターンの２つのシステインと配位する２つの不変のヒスチジン残基を含有し、２、３、４、５、または６フィンガーを有するアルファヘリックスを含有する。一般に、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックスの４つのヘリックス位置（－１、２、３、および６）でアミノ酸置換を行うことによって変更することができる。したがって、いくつかの実施形態では、ＺＦＰまたはＺＦＰ含有分子は、天然に存在しない、例えば、選択された標的部位に結合するように操作される。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照されたく、これらすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
多くの遺伝子特異的に操作されたジンクフィンガーが市販されている。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と共同で、ジンクフィンガー構築用のプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ））を開発し、研究者がジンクフィンガーの構築および検証を完全にバイパスできるようにし、数千のタンパク質に特異的に標的化されたジンクフィンガーを提供する（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（７），３９７－４０５）。いくつかの実施形態では、市販のジンクフィンガーが使用されるか、または特注設計される。
いくつかの実施形態では、部位特異的結合ドメインは、転写活性化因子様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質などの、天然に存在するまたは操作された（天然には存在しない）転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。
いくつかの実施形態では、部位特異的結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する。一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」は、集合的に、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現またはその活性の指向に関与する転写物および他の因子、例として、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「ダイレクトリピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡによりプロセシングされる部分ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「スペーサー」とも称される）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物を指す。
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向するために標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有するポリヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、約または約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれを超える。いくつかの例では、ｇＲＮＡの標的化ドメインは、標的核酸上の標的配列に対して、例えば、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％相補的、例えば、完全に相補的である。
いくつかの実施形態では、標的部位は、標的遺伝子の転写開始部位の上流にある。いくつかの態様では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位に隣接している。いくつかの態様では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ休止部位に隣接している。
いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、転写開始、１つ以上の転写エンハンサーまたはアクチベーターの結合、および／またはＲＮＡポリメラーゼを促進するために、標的遺伝子のプロモーター領域を標的化するように構成される。１つ以上のｇＲＮＡを使用して、遺伝子のプロモーター領域を標的化することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子の１つ以上の領域を標的化することができる。ある特定の態様では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）のいずれかの側の６００塩基対以内にある。
エキソン配列ならびにプロモーターおよびアクチベーターを含む調節領域の配列を含む、遺伝子を標的化する配列であるか、またはそれを含むｇＲＮＡ配列を設計または同定することは、当業者のレベルの範囲内である。ＣＲＩＳＰＲゲノム編集用のゲノムワイドなｇＲＮＡデータベースが公開されており、これは、ヒトゲノムまたはマウスゲノムの遺伝子の構成的エキソンにある例示的なシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）標的配列を含有する（例えば、ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｇＲＮＡ－ｄａｔａｂａｓｅ．ｈｔｍｌを参照されたく、Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１：７８３－４；ｗｗｗ．ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰ／；ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／も参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、非標的遺伝子への最小限のオフターゲット結合を有する配列であるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、調節因子は、機能的ドメイン、例えば、転写活性化因子をさらに含む。
いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、標的遺伝子の１つ以上の転写制御因子などの１つ以上の調節因子であるかまたはそれを含み、それにより、上で提供されたような部位特異的ドメインがそのような遺伝子の発現を促進することが認識される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、標的遺伝子の発現を促進する。いくつかの場合には、転写活性化因子は、異種トランス活性化ドメインの全部または一部であるか、またはそれらを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、単純ヘルペス由来のトランス活性化ドメイン、Ｄｎｍｔ３ａメチルトランスフェラーゼドメイン、ｐ６５、ＶＰ１６、およびＶＰ６４から選択される。
いくつかの実施形態では、調節因子は、ジンクフィンガー転写因子（ＺＦ－ＴＦ）である。いくつかの実施形態では、調節因子は、ＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ（ＶＰＲ）である。
ある特定の実施形態では、調節因子は、転写調節ドメインをさらに含む。一般的なドメインとしては、例えば、転写因子ドメイン（アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、がん遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）、ＤＮＡ修復酵素およびそれらに関連する因子ならびに改変因子、ＤＮＡ再配列酵素およびそれらに関連する因子ならびに改変因子、クロマチン関連タンパク質とその改変因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）、ならびにＤＮＡ改変酵素（例えば、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌなど）などのメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）およびそれらの関連する因子ならびに改変因子が挙げられる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１３／０２５３０４０号を参照されたい。
活性化を達成するために好適なドメインとしては、ＨＳＶ ＶＰ １６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２－５９６２（１ ９７）を参照されたい）、核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３－３８３（１９９８）を参照されたい）、核因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ ＆ Ｂａｎｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０－５６１８（１９９８）ａｎｄ Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７－２９４２（１９９７））、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３－２８（１９９８））、またはＶＰ６４などの人工キメラ機能ドメイン（Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４６２３－３３）、ならびにデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８，６４３９－６４４７）が挙げられる。追加の例示的な活性化ドメインとしては、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、Ｓｐｌ、ＡＰ－２、およびＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ ｅｔａｌ，ＥＭＢＯＪ．１１，４９６１－４９６８（１９９２）ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ－２が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９－３４７、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２３：２５５－２７５、Ｌｅｏ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１－１１、Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ－Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７－８９、ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３－１２、Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７－２８３、およびＬｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９－５０４を参照されたい。追加の例示的な活性化ドメインとしては、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃｌ、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、－６，－１、および－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、およびＴＲＡＢ１が挙げられるが、これらに限定されない、例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ、（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１－２９、Ｏｋａｎａｍｉ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７－９９、Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ，（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８－３０９、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０：４１９－４２９、Ｕｌｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４－５８４９、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ－Ｈａｕｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１－８、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３－４４、およびＨｏｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８－１５，３５３を参照されたい。
遺伝子リプレッサーを作製するために使用できる例示的な抑制ドメインとしては、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－ベータ－誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌなど）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１－４５４、Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４３－４４６、Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４７－４５０、およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８－３４２を参照されたい。追加の例示的な抑制ドメインとしては、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５－３２１、およびＷｕ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１９－２７を参照されたい。
場合によっては、ドメインは染色体の後成的制御に関与している。いくつかの実施形態では、ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、例えば、ＭＹＳＴファミリーメンバーＭＯＺ、Ｙｂｆ２／Ｓａｓ３、ＭＯＦ、およびＴｉｐ６０、ＧＮＡＴファミリーメンバーＧｃｎ５またはｐＣＡＦ、ｐ３００ファミリーメンバーＣＢＰ、ｐ３００またはＲｔｔｌ０９などの核局在化Ａ型である（Ｂｅｍｄｓｅｎ ａｎｄ Ｄｅｎｕ（２００８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ｌ８（６）：６８２－６８９）。他の例では、ドメインは、クラスＩ（ＨＤＡＣ－ｌ、２、３、および８）、クラスＩＩ（ＨＤＡＣ ＩＩＡ（ＨＤＡＣ－４、５、７および９）、ＨＤ ＡＣ ＩＩＢ（ＨＤＡＣ ６および１０））、クラスＩＶ（ＨＤＡＣ－ｌ １）、クラスＩＩＩ（サーチュイン（ＳＩＲＴｓ）としても知られる；ＳＩＲＴ１－７）などのヒストンデアセチラーゼ（ＨＤ ＡＣ）である（ Ｍｏｔｔａｍａｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０（３）：３８９８－３９４１を参照されたい）。いくつかの実施形態で使用される別のドメインは、ヒストンホスホリラーゼまたはキナーゼであり、例としては、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＤＮＡ－ＰＫ、Ｂｕｂｌ、ＶｐｒＢＰ、ＩＫＫ－ａ、ＰＫＣｐｉ、Ｄｉｋ／Ｚｉｐ、ＪＡＫ２、ＰＫＣ５、ＷＳＴＦおよびＣＫ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、メチル化ドメインが使用され、Ｅｚｈ２、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲＭＴ２／６、ＣＡＲＭ１、ｓｅｔ７／９、ＭＬＬ、ＡＬＬ－１、Ｓｕｖ３９ｈ、Ｇ９ａ、ＳＥＴＤＢ１、Ｅｚｈ２、Ｓｅｔ２、Ｄｏｔｌ、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲ－Ｓｅｔ７およびＳｕｖ４－２０ｈなどの群から選択され得る、ＳＵＭＯ化およびビオチン化に関与するドメイン（Ｌｙｓ９、１３、４、１８および１２）もいくつかの実施形態で使用され得る（レビューは、Ｋｏｕｓａｒｉｄｅｓ（２００７）Ｃｅｌｌ １２８：６９３－７０５を参照されたい）。
融合分子は、当業者に周知であるクローニングおよび生化学共役反応の方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子はまた、任意に、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０培地Ｔ抗原からのものなど）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよび血球凝集素など）を含む。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、翻訳リーディングフレームが融合の構成要素間で保存されるように設計されている。
一方では機能ドメイン（またはその機能フラグメント）のポリペプチド成分と、他方では非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレーター、マイナーグルーブバインダー、核酸）との間の融合が、当業者に既知の生化学的共役の方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）Ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照されたい。マイナーグルーブバインダーとポリペプチドとの間の融合を行うための方法および組成物が記載されている。Ｍａｐｐ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３９３０－３９３５。同様に、ポリペプチド成分機能ドメインと関連してｓｇＲＮＡ核酸成分を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦおよびヌクレアーゼもまた、当業者に既知であり、本明細書に詳述されている。
本明細書に記載のポリヌクレオチドを細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成することができる。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質を介したトランスフェクション、電気穿孔法、およびウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞に導入される。
一旦変更されると、本明細書に記載の分子のいずれかの発現の存在は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳアッセイなどの既知の技術を使用してアッセイすることができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、「自殺遺伝子」または「自殺スイッチ」を含む低免疫原性多能性細胞を提供する。これらは、低免疫原性多能性細胞が望ましくない方法で増殖および分裂した場合に死を引き起こす可能性のある「安全スイッチ」として機能するように組み込まれている。「自殺遺伝子」除去アプローチは、特定の化合物によって活性化された場合にのみ細胞死をもたらすタンパク質をコードする遺伝子導入ベクターに自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、無毒の化合物を高毒性の代謝物に選択的に変換する酵素をコードし得る。その結果、酵素を発現している細胞が特異的に排除される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子はヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であり、トリガーはガンシクロビルである。他の実施形態では、自殺遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉシトシンデアミナーゼ（ＥＣ－ＣＤ）遺伝子であり、トリガーは５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である（Ｂａｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２０（１０）：１９３２－１９４３（２０１２）、Ｘｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．８：７３－８（１９９８）、両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）
他の実施形態では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼタンパク質である。誘導性カスパーゼタンパク質は、アポトーシスを誘導することができるカスパーゼタンパク質の少なくとも一部を含む。好ましい実施形態では、誘導性カスパーゼタンパク質は、ｉＣａｓｐ９である。これは、一連のアミノ酸を介してヒトカスパーゼ９をコードする遺伝子に接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質ＦＫＢＰ１２の配列を含む。ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖは、低分子二量体化剤ＡＰ１９０３に高い親和性で結合する。したがって、本発明におけるｉＣａｓｐ９の自殺機能は、二量体化誘導化合物（ＣＩＤ）の投与によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、小分子薬物ＡＰＩ９０３である。二量体化はアポトーシスの急速な誘導を引き起こす。（ＷＯ２０１１／１４６８６２、Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６５；１８（２０１１）、Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：９１３－９２４（２００７）を参照されたい（これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。）
Ｌ．人工多能性幹細胞の生成
本発明は、低免疫原性多能性細胞を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、多能性幹細胞を生成することを含む。マウスおよびヒトの多能性幹細胞（一般にｉＰＳＣ、マウス細胞の場合はｍｉＰＳＣ、またはヒト細胞の場合はｈｉＰＳＣと称される）の生成は、当技術分野において一般的に知られている。当業者によって理解されるように、ｉＰＣＳを生成するための様々な異なる方法が存在する。最初の誘導は、４つの転写因子、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４のウイルス導入を使用して、マウスの胚性または成体の線維芽細胞から行われた（その全体が、特にそこに概説されている技術について、参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６（２００６）を参照されたい）。それ以来、多くの方法が開発されてきた（レビューについては、Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ７（１）：１１６－１２５（２０１５）を、またＬａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ ａｎｄ Ｖｅｒｍｕｒｉ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０１３を参照されたく、これら両方は、参照によりその全体が、特にｈｉＰＳＣを生成するための方法について（例えば、後者の参考文献の第３章を参照）明示的に本明細書に組み込まれる）。
一般に、ｉＰＳＣは、宿主細胞における１つ以上の再プログラミング因子の一過性発現によって生成され、通常はエピソームベクターを使用して導入される。これらの条件下では、少量の細胞が誘導されてｉＰＳＣになる（一般に、選択マーカーが使用されていないため、このステップの効率は低くなる）。細胞が「再プログラム化」されて多能性になると、それらはエピソームベクターを失い、内因性遺伝子を使用して因子を産生する。
当業者によっても理解されるように、使用できるまたは使用できる再プログラミング因子の数は変化し得る。一般に、使用する再プログラミング因子が少ないと、細胞の多能性状態への変換効率が低下し、ならびに「多能性」も低下し、例えば、再プログラミング因子が少ないと、完全に多能性ではなく、より少ない細胞型にだけ分化し得る細胞をもたらすることができる。
いくつかの実施形態では、単一の再プログラミング因子、ＯＣＴ４が使用される。他の実施形態では、２つの再プログラミング因子、ＯＣＴ４およびＫＬＦ４が使用される。他の実施形態では、３つの再プログラミング因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２が使用される。他の実施形態では、４つの再プログラミング因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２およびｃ－Ｍｙｃが使用される。他の実施形態では、ＳＯＫＭＮＬＴ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、およびＳＶ４０Ｌ Ｔ抗原から選択される５、６、または７つの再プログラミング因子を使用することができる。一般に、これらの再プログラミング因子遺伝子は、当技術分野において既知であり、市販されているようなエピソームベクターで提供される。
一般に、当技術分野において既知であるように、ｉＰＳＣは、本明細書に記載の再プログラミング因子を一時的に発現することにより、血球、線維芽細胞などであるがこれらに限定されない非多能性細胞から作製される。
Ｍ．低免疫原性表現型および多能性の保持のためのアッセイ
低免疫原性細胞が生成されたら、ＷＯ２０１６／１８３０４１およびＷＯ２０１８／１３２７８３に記載されているように、それらの低免疫原性および／または多能性の保持についてアッセイすることができる。
いくつかの実施形態では、低免疫原性は、ＷＯ２０１８／１３２７８３の図１３および図１５に例示されるようないくつかの技術を使用してアッセイされる。これらの技術には、同種異系宿主への移植および宿主の免疫系から逃れる低免疫原性の多能性細胞増殖（例えば、奇形腫）のモニタリングが含まれる。場合によっては、低免疫原性の多能性細胞誘導体は、ルシフェラーゼを発現するように形質導入され、その後、生物発光イメージングを使用して追跡することができる。同様に、そのような細胞に対する宿主動物のＴ細胞および／またはＢ細胞応答を試験して、細胞が宿主動物において免疫反応を引き起こさないことを確認する。Ｔ細胞機能は、Ｅｌｉｓｐｏｔ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、またはマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によって評価され得る。Ｂ細胞応答または抗体応答は、ＦＡＣＳまたはＬｕｍｉｎｅｘを使用して評価される。追加的または代替的に、ＷＯ２０１８／１３２７８３の図１４および図１５に一般的に示されているように、細胞は、自然免疫応答、例えば、ＮＫ細胞死滅を回避するそれらの能力についてアッセイされ得る。
いくつかの実施形態では、細胞の免疫原性は、当業者に認められているＴ細胞増殖アッセイ、Ｔ細胞活性化アッセイ、およびＴ細胞死滅アッセイなどのＴ細胞イムノアッセイを使用して評価される。いくつかの場合には、Ｔ細胞増殖アッセイは、細胞をインターフェロン－ガンマで前処理し、細胞を標識Ｔ細胞と共培養し、事前に選択した時間後にＴ細胞集団（または増殖Ｔ細胞集団）の存在をアッセイすることを含む。いくつかの場合には、Ｔ細胞活性化アッセイは、Ｔ細胞を本明細書に概説される細胞と共培養し、Ｔ細胞におけるＴ細胞活性化マーカーの発現レベルを決定することを含む。
本明細書に概説される細胞の免疫原性を評価するために、インビボアッセイを実行することができる。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の生存および免疫原性は、同種異系のヒト化免疫不全マウスモデルを使用して決定される。場合によっては、低免疫原性多能性幹細胞を同種異系のヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに移植し、細胞拒絶反応、細胞生存率、および奇形腫形成についてアッセイされる。場合によっては、移植された低免疫原性多能性幹細胞またはその分化細胞は、マウスモデルにおいて長期生存を示す。
細胞の低免疫原性を含む免疫原性を決定するための追加の技術は、例えば、Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３７，２５２－２５８およびＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１９，１１６（２１），１０４４１－１０４４６に記載されており、図、図表の凡例、および方法の説明を含む開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
同様に、多能性の保持はいくつかの方法で試験される。一実施形態では、多能性は、本明細書に一般的に記載され、ＷＯ２０１８／１３２７８３の図２９に示されるような特定の多能性特異的因子の発現によってアッセイされる。追加的または代替的に、多能性細胞は、多能性の指標として１つ以上の細胞型に分化する。
当業者によって理解されるように、多能性細胞におけるＭＨＣＩ機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ Ｉ）の成功した減少は、当技術分野において既知である以下の技術、例えば、ヒト主要組織適合遺伝子ＨＬＡクラスＩ抗原のアルファ鎖に結合する市販のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体を使用する、例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識抗体を使用するＦＡＣＳ技術を使用して測定することができる。
さらに、細胞を試験して、ＨＬＡＩ複合体が細胞表面に発現していないことを確認することができる。これは、上記のように、１つ以上のＨＬＡ細胞表面成分に対する抗体を使用するＦＡＣＳ分析によってアッセイすることができる。
多能性細胞またはその誘導体におけるＭＨＣＩＩ機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ ＩＩ）の低下の成功は、タンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ技術、ＲＴ－ＰＣＲ技術などの当技術分野で知られている技術を使用して測定することができる。
さらに、細胞を試験して、ＨＬＡ ＩＩ合体が細胞表面に発現していないことを確認することができる。この場合も、このアッセイは当技術分野で知られているように行われ（例えば、ＷＯ２０１８／１３２７８３の図２１を参照）、一般に、ヒトＨＬＡクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、およびほとんどのＤＱ抗原に結合する市販の抗体に基づくウエスタンブロットまたはＦＡＣＳ分析のいずれかを使用して行われる。
ＨＬＡ ＩおよびＩＩ（またはＭＨＣ ＩおよびＩＩ）の低下に加えて、本発明の低免疫原性細胞は、マクロファージ食作用およびＮＫ細胞死滅に対する低下した感受性を有する。結果として生じる低免疫原性細胞は、１つ以上のＣＤ２４導入遺伝子の発現により、免疫マクロファージおよび自然免疫経路を「回避する」。
Ｎ．低免疫原性多能性幹細胞の維持
低免疫原性多能性幹細胞が生成されると、ｉＰＳＣ細胞の維持で知られているように、それらは未分化状態を維持することができる。例えば、細胞は、分化を防ぎ、多能性を維持する培地を使用して、マトリゲル上で培養することができる。さらに、それらは多能性を維持するための条件下で培地に入れることができる。
Ｏ．多能性幹細胞の分化
本発明は、レシピエント対象へのその後の移植のために異なる細胞型に分化することができる多能性幹細胞を提供する。分化は、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価することによって、当技術分野において既知であるようにアッセイすることができる。当業者によって理解されるように、分化した低免疫原性多能性細胞誘導体は、細胞型およびこれらの細胞の最終的用途の両方に依存する当技術分野において既知の技術を使用して移植することができる。
１．多能性幹細胞から分化した心臓細胞
本発明は、対象（例えば、レシピエント）へのその後の移植または生着のために異なるタイプの心臓細胞に分化することができる多能性幹細胞を提供する。当業者によって理解されるように、既知の方法を使用する分化のための方法は、所望のタイプの細胞に依存する。例示的な心臓細胞のタイプとしては、心筋細胞、結節性心筋細胞、伝導性心筋細胞、作動性心筋細胞、心筋細胞前駆細胞、心臓幹細胞、心房心臓幹細胞、心室心臓幹細胞、心外膜細胞、造血細胞、血管内皮細胞、心内膜内皮細胞、心臓弁間質細胞、心臓ペースメーカー細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、心筋細胞前駆体は、成熟（最終段階の）心筋細胞を含む子孫を生じさせることができる（脱分化または再プログラミングなしで）細胞を含む。心筋細胞前駆細胞は、多くの場合、ＧＡＴＡ－４、Ｎｋｘ２．５、および転写因子のＭＥＦ－２ファミリーから選択された１つ以上のマーカーを使用して特定することができる。場合によっては、心筋細胞は、次のリスト：心臓トロポニンＩ（ｃＴｎｌ）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、筋節ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ－４、Ｎｋｘ２．５、Ｎ－カドヘリン、β２－アドレナリン受容体、ＡＮＦ、転写因子のＭＥＦ－２ファミリー、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ－ＭＢ）、ミオグロビン、または心房ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）からの１つ以上のマーカー（場合によっては少なくとも３つまたは５つのマーカー）を発現する未成熟心筋細胞または成熟心筋細胞を指す。いくつかの実施形態では、心臓細胞は、自発的な周期的収縮活動を示す。いくつかの場合には、その心臓細胞が適切なＣａ２＋濃度および電解質バランスを有する適切な組織培養環境で培養されると、細胞が細胞の１つの軸にわたって周期的に収縮し、その後培地に追加の成分を追加する必要なく、収縮から解放されるのを観察することができる。いくつかの実施形態では、心臓細胞は、低免疫原性心臓細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の心臓細胞は、小児心筋症、加齢性心筋症、拡張心筋症、肥大性心筋症、拘束性心筋症、慢性虚血性心筋症、周産期心筋症、炎症性心筋症、特発性心筋症、他の心筋症、心筋虚血性再灌流障害、心室機能不全、心不全、うっ血性心不全、冠状動脈疾患、末期心臓病、アテローム性動脈硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、胸膜血管、リウマチ性心疾患、動脈炎、心臓血管疾患、心筋梗塞、心筋虚血、うっ血性心不全、心筋梗塞、心臓虚血、心臓損傷、心筋虚血、血管疾患、後天性心臓病、先天性心臓病、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患、刺激伝導系機能不全、冠状動脈絹不全、肺高血圧症、心不整脈、筋ジストロフィー、筋肉量異常、筋肉変性、心筋炎、感染性心筋炎、薬物または毒素誘発性筋肉異常、過敏性心筋炎、および自己免疫性心内膜炎からなる群から選択される心臓障害を治療するためにレシピエント対象に投与される。
いくつかの実施形態では、インビトロ分化によって低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞の集団から低免疫原性心臓細胞の集団を産生する方法は、（ａ）ＨＩＰ細胞の集団を、ＧＳＫ阻害剤を含む培養培地中で培養することと、（ｂ）ＨＩＰ細胞の集団を、ＷＮＴアンタゴニストを含む培養培地中で培養して、前心臓細胞の集団を産生することと、（ｃ）前心臓細胞の集団を、インスリンを含む培養培地中で培養して、低免疫性心臓細胞の集団を産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、またはそのバリアントである。場合によっては、ＧＳＫ阻害剤は、約２ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＷＮＴアンタゴニストは、ＩＷＲ１、その誘導体、またはそのバリアントである。場合によっては、ＷＮＴアンタゴニストは、約２ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度である。
いくつかの実施形態では、低免疫原性心臓細胞の集団は、非心臓細胞から単離される。いくつかの実施形態では、低免疫原性心臓細胞の単離された集団は、投与前に増殖される。ある特定の実施形態では、低免疫原性心臓細胞の単離された集団は、投与前に増殖され、凍結保存される。
人工多能性幹細胞または多能性幹細胞を心臓細胞に分化させるための他の有用な方法は、例えば、ＵＳ２０１７／０１５２４８５、ＵＳ２０１７／００５８２６３、ＵＳ２０１７／０００２３２５、ＵＳ２０１６／０３６２６６１、ＵＳ２０１６／００６８８１４、ＵＳ９，０６２，２８９、ＵＳ７，８９７，３８９、およびＵＳ７，４５２，７１８に記載されている。誘導された多能性幹細胞または多能性幹細胞から心臓細胞を産生するための追加の方法は、例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００６，１５（５）：６３１－９、Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１２，１０：１６－２８、およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１５，ｌ５（２）：３６５－３７５に記載されている。
様々な実施形態では、低免疫原性心臓細胞は、ＢＭＰ経路阻害剤、ＷＮＴシグナル伝達活性化因子、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤、ＷＮＴアゴニスト、ＷＮＴアンタゴニスト、Ｓｒｃ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＣＫ活性化因子、サイトカイン、成長因子、心臓向性物質、化合物などを含む培地中で増殖させることができる。
ＷＮＴシグナル伝達活性化因子としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられるが、これに限定されない。ＰＣＫ活性化因子としては、ＰＭＡが挙げられるが、これに限定されない。ＷＮＴシグナル伝達阻害剤にとしては、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）、およびＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）、ならびにＸＡＶ９３９から選択される化合物が挙げられるが、これらに限定されない。Ｓｒｃ阻害剤としては、Ａ４１９５９が挙げられるが、これに限定されない。ＥＧＦＲ阻害剤には、ＡＧ１４７８が挙げられるが、これに限定されない。
ｉＰＳＣから心臓細胞を生成するための薬剤の非限定的な例としては、アクチビンＡ、ＢＭＰ－４、Ｗｎｔ３ａ、ＶＥＧＦ、可溶性フリズルドタンパク質、シクロスポリンＡ、アンギオテンシンＩＩ、フェニレフリン、アスコルビン酸、ジメチルスルホキシド、５－アザ－２’－デオキシシチジンなどが挙げられる。
本発明の細胞は、低免疫原性多能性細胞の心臓細胞への分化を支持および／または促進するために、合成表面などの表面上で培養することができる。いくつかの実施形態では、表面は、選択された１つ以上のアクリレートモノマーのホモポリマーまたはコポリマーが挙げられるが、これらに限定されないポリマー材料を含む。アクリレートモノマーおよびメタクリレートモノマーの非限定的な例としては、テトラ（エチレングリコール）ジアクリレート、グリセロールジメタクリレート、１，４－ブタンジオールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ジ（エチレングリコール）ジメタクリレート、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、１，６－ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、トリメチロールプロパンベンゾエートジアクリレート、トリメチロールプロパンエイホキシレート（１ＥＯ／ＱＨ）メチル、トリシクロ［５．２．１．０２，６］デカンジメタノールジアクリレート、ネオペンチルグリコールエキソキシレートジアクリレート、およびトリメチロールプロパントリアクリレートが挙げられる。アクリレートは、当技術分野において既知であるように合成したか、またはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．およびＳａｒｔｏｍｅｒ，Ｉｎｃ．などの商業ベンダーから入手した。
ポリマー材料は、支持材料の表面に分散させることができる。細胞を培養するのに適した有用な支持材料としては、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーもしくはコポリマー、それらの任意の組み合わせ、またはある材料の別の材料へのコーティングが挙げられる。場合によっては、ガラスには、ソーダ石灰ガラス、パイレックスガラス、バイコールガラス、石英ガラス、シリコン、またはこれらの派生物などが挙げられる。
場合によっては、樹枝状ポリマーを含むプラスチックまたはポリマーには、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（酢酸ビニル－無水マレイン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミンまたはこれらの誘導体などが挙げられる。場合によっては、コポリマーには、ポリ（酢酸ビニル－コ－無水マレイン酸）、ポリ（スチレン－コ－無水マレイン酸）、ポリ（エチレン－コ－アクリル酸）またはこれらの誘導体などが挙げられる。
本明細書に記載されるように調製された心臓細胞の有効性は、心臓凍結損傷の動物モデルで評価することができ、これにより、左心室壁組織の５５％が治療なしで瘢痕組織になる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６２：６５４，１９９６；Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．８：２０７４，１９９９，Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１８：７１５，１９９９）。治療の成功によって、収縮期、拡張期、および発生した圧力によって決定されるように、瘢痕の面積を減らし、瘢痕の拡大を制限し、心臓機能を改善することができる心臓損傷は、左動脈前下行枝の遠位部分にある塞栓コイルを使用してモデル化することもでき（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７：２３９，１９９８）、治療の有効性は組織学および心機能によって評価することができる。
いくつかの実施形態では、投与は、対象の心臓組織への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠状動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、または注入を含む。
いくつかの実施形態では、操作された心臓細胞を投与された患者はまた、心臓薬も投与される。併用療法での使用に適した心臓薬の実例としては、成長因子、成長因子をコードするポリヌクレオチド、血管新生剤、カルシウムチャネル遮断薬、降圧薬、抗有糸分裂薬、変力薬、抗アテローム発生薬、抗凝固薬、ベータ遮断薬、抗不整脈薬、抗炎症薬、血管拡張薬、血栓溶解薬、強心配糖体、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、原虫を阻害する薬剤、硝酸塩、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、抗腫瘍剤、ステロイドなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の方法による治療の効果は、様々な方法で監視することができる。例えば、心電図（ＥＣＧ）またはホリエモニターを使用して、治療の有効性を判断することができる。ＥＣＧは、心拍リズムおよび電気インパルスの尺度であり、治療によって対象の心臓の電気伝導の低下が改善または維持、防止、または遅延したかどうかを判断するための非常に効果的かつ非侵襲的な方法である。心臓の異常や不整脈障害などを監視するために長期間着用できる携帯型ＥＣＧであるホリエモニターの使用も、治療の有効性を評価するための信頼できる方法である。ＥＣＧまたは核医学検査は、心室機能の改善を判断するために使用することができる。
２．多能性幹細胞から分化した神経細胞
本発明は、レシピエント対象へのその後の移植または生着のために異なるタイプの神経細胞に分化することができる多能性幹細胞を提供する。当業者によって理解されるように、既知の方法を使用する分化のための方法は、所望のタイプの細胞に依存する。例示的なタイプの神経細胞としては、脳内皮細胞、ニューロン、グリア細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、神経細胞は、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、他の神経変性疾患または状態、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、他の神経精神障害を治療するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の神経細胞は、脳卒中を治療または改善するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、ニューロンおよびグリア細胞は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、脳内皮細胞は、脳出血の症状または影響を軽減するために投与される。いくつかの実施形態では、ドーパミン作動性ニューロンは、パーキンソン病の患者に投与される。いくつかの実施形態では、ノルアドレナリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、てんかん発作を経験した患者に投与される。いくつかの実施形態では、運動ニューロン、介在ニューロン、シュワン細胞、希突起膠細胞、およびミクログリアが、脊髄損傷を経験した患者に投与される。
いくつかの実施形態では、脳内皮細胞（ＥＣ）、その前駆体、およびその前駆細胞は、細胞を、脳ＥＣまたは神経細胞の生成を促進する１つ以上の因子を含む培地中で培養することによって、表面上で多能性幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞）から分化される。場合によっては、培地は、次のうちの１つ以上、ＣＨＩＲ－９９０２１、ＶＥＧＦ、塩基性ＦＧＦ、およびＹ－２７６３２を含む。いくつかの実施形態では、培地は、神経細胞の生存および機能性を促進するように設計された補助物質を含む。
いくつかの実施形態では、脳内皮細胞（ＥＣ）、前駆体、およびそれらの前駆細胞は、非馴化培地または馴化培地で細胞を培養することにより、表面上の多能性幹細胞から分化される。場合によっては、培地は、分化を促進または促進する因子または小分子を含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＶＥＧＲ、ＦＧＦ、ＳＤＦ－１、ＣＨＩＲ－９９０２１、Ｙ－２７６３２、ＳＢ ４３１５４２、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の因子または小分子を含む。いくつかの実施形態では、分化のための表面は、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む。表面は、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質でコーティングすることができる。細胞は懸濁状態で分化し、マトリゲル、ゼラチン、またはフィブリン／トロンビンの形などのゲルマトリックスの形になり、細胞の生存を促進する。いくつかの場合には、分化は、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価することによって、当技術分野において既知であるようにアッセイすることができる。
いくつかの実施形態では、脳内皮細胞は、ＣＤ３１、ＶＥカドヘリン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される因子を発現または分泌する。ある特定の実施形態では、脳内皮細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７（ｃキット）、ＣＤ１４６、ＣＸＣＲ４、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ－１、ＰＤＧＦ、ＧＬＵＴ－１、ＰＥＣＡＭ－１、ｅＮＯＳ、クローディン－５、オクルディン、ＺＯ－１、ｐ－糖タンパク質、フォンウィルブランド因子、ＶＥ－カドヘリン、低密度リポタンパク質受容体ＬＤＬＲ、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１ ＬＲＰ１、インスリン受容体ＩＮＳＲ、レプチン受容体ＬＥＰＲ、基底細胞接着分子ＢＣＡＭ、トランスフェリン受容体ＴＦＲＣ、終末糖化産物特異的受容体ＡＧＥＲ、レチノール取り込み受容体ＳＴＲＡ６、大中性アミノ酸トランスポーター小サブユニット１ ＳＬＣ７Ａ５、興奮性アミノ酸トランスポーター３ ＳＬＣ１Ａ１、ナトリウム結合中性アミノ酸トランスポーター５ＳＬＣ３８Ａ５、溶質キャリアファミリー１６メンバー１ ＳＬＣ１６Ａ１、ＡＴＰ依存性トランスロカーゼＡＢＣＢ１、ＡＴＰ－ＡＢＣＣ２結合カセットトランスポーターＡＢＣＧ２、多剤耐性関連タンパク質１ ＡＢＣＣ１、小管多重特異性有機アニオントランスポーター１ ＡＢＣＣ２、多剤耐性関連タンパク質４ＡＢＣＣ４、および多剤耐性関連タンパク質５ ＡＢＣＣ５からなる群から選択される因子のうちの１つ以上を発現または分泌する。
いくつかの実施形態では、脳ＥＣは、密着結合の高発現、高電気抵抗、低開窓、小さな血管周囲空間、インスリンおよびトランスフェリン受容体の高い有病率、ならびに多数のミトコンドリアからなる群から選択される特徴のうちの１つ以上を特徴とする。
いくつかの実施形態では、脳ＥＣは、正の選択戦略を使用して選択または精製される。場合によっては、脳ＥＣは、ＣＤ３１などの内皮細胞マーカーに対して分類されるが、これに限定されない。言い換えれば、ＣＤ３１陽性の脳ＥＣが分単離される。いくつかの実施形態では、脳ＥＣは、ネガティブセレクション戦略を使用して選択または精製される。いくつかの実施形態では、未分化または多能性幹細胞は、ＴＲＡ－１－６０およびＳＳＥＡ－１が含まれるが、これらに限定されない多能性マーカーを発現する細胞を選択することによって除去される。
いくつかの実施形態では、ニューロン、それらの前駆体および前駆細胞は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ２７、塩基性ＦＧＦ、塩基性ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、ＳＭＡＤ阻害剤、Ｗｎｔアンタゴニスト、ＳＨＨシグナル伝達活性化因子、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の因子を含む培地中で細胞を培養することによって、多能性幹細胞から分化される。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＤ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ－１９３１８９、ノギンＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ３６４９４７、Ａ７７－０１、Ａ－８３－０１、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８、ＧＷ６６０４、ＳＢ－５０５１２４、レルデリムマブ、メテリムマブ、ＧＣ－Ｉ００８、ＡＰ－１２００９、ＡＰ－１１０Ｉ４、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５８０２７６、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ－５０５１２４、Ｅ－６１６４５２（ＲｅｐＳｏｘ ＡＬＫ阻害剤）、ＳＤ－２０８、ＳＭＩ６、ＮＰＣ－３０３４５、Ｋ ２６８９４、ＳＢ－２０３５８０、ＳＤ－０９３、ａｃｔｉｖｉｎ－Ｍ１０８Ａ、Ｐ１４４、可溶性ＴＢＲ２－Ｆｃ、ＤＭＨ－１、ドルソモルフィン二塩酸塩およびそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニストは、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１、ＤＫＫ－２、ＤＫＫ－３、ＤＫＫ－４、ＳＦＲＰ－１、ＳＦＲＰ－２、ＳＦＲＰ－５、ＳＦＲＰ－３、ＳＦＲＰ－４、ＷＩＦ－１、Ｓｏｇｇｙ、ＩＷＰ－２、ＩＷＲ１、ＩＣＧ－００１、ＫＹ０２１１、Ｗｎｔ－０５９、ＬＧＫ９７４、ＩＷＰ－Ｌ６およびそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達活性化因子は、平滑化アゴニスト（ＳＡＧ）、ＳＡＧ類似体、ＳＨＨ、Ｃ２５－ＳＨＨ、Ｃ２４－ＳＨＨ、プルモルファミン、Ｈｇ－－Ａｇおよびそれらの誘導体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ニューロンは、グルタミン酸イオノトロピック受容体ＮＭＤＡ型サブユニット１ ＧＲＩＮ１、グルタミン酸デカルボキシラーゼ１ ＧＡＤ１、ガンマアミノ酪酸ＧＡＢＡ、チロシンヒドロキシラーゼＴＨ、ＬＩＭホメオボックス転写因子１－アルファ ＬＭＸ１Ａ、フォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１ ＦＯＸＯ１、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２ ＦＯＸＡ２、フォークヘッドボックスタンパク質Ｏ４ ＦＯＸＯ４、ＦＯＸＧ１、２’，３’－環状－ヌクレオチド３’－ホスホジエステラーゼＣＮＰ、ミエリン塩基性タンパク質ＭＢＰ、チューブリンベータ鎖３ ＴＵＢ３、チューブリンベータ鎖３ ＮＥＵＮ、溶質キャリアファミリー１メンバー６ ＳＬＣ１Ａ６、ＳＳＴ、ＰＶ、カルビンジン、ＲＡＸ、ＬＨＸ６、ＬＨＸ８、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＤＬＸ５、ＤＬＸ６、ＳＯＸ６、ＭＡＦＢ、ＮＰＡＳ１、ＡＳＣＬ１、ＳＩＸ６、ＯＬＩＧ２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．２、ＶＧＬＵＴ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１、ＤＬＸ２、ＡＳＣＬ１、ＣｈＡＴ、ＮＧＦＩ－Ｂ、ｃ－ｆｏｓ、ＣＲＦ、ＲＡＸ、ＰＯＭＣ、ｈｙｐｏｃｒｅｔｉｎ、ＮＡＤＰＨ、ＮＧＦ、Ａｃｈ、ＶＡＣｈＴ、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２ｐ７５、ＣＯＲＩＮ、ＴＵＪ１、ＮＵＲＲ１、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ドーパミン作動性ニューロンは、ＣＯＲＩＮ、ＦＯＸＡ２、ＴＵＪ１、ＮＵＲＲ１、およびそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上のマーカーを発現する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される幹細胞は、ドーパミン作動性ニューロンに分化され、ドーパミン作動性前駆細胞を含む。幹細胞は、神経分化を誘導するための補助物質または添加剤を含む分化培地中で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、床板細胞を誘導するために補助物質または添加剤の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、補助物質または添加剤としては、ＢＭＰ阻害剤ＬＤＮ１９３１８９、ＡＬＫ－５阻害剤Ａ８３－０１、平滑化アゴニストプルモルファミン、ＦＧＦ８、ＧＳＫ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１、グリア細胞株由来神経栄養因子、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、脳由来神経栄養因子ＢＤＮＦ、ジブチリルアデノシン環状一リン酸ｄｂｃＡＭＰ、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、インビトロ分化によって低免疫原性人工多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）の集団から低免疫原性ドーパミン作動性ニューロンの集団を産生する方法は、（ａ）ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ８、ＷＮＴ１、レチノイン酸、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される１つ以上の因子を含む第１の培養培地中でＨＩＰ細胞の集団を培養し、未成熟ドーパミン作動性ニューロンの集団を産生することと、（ｂ）未成熟ドーパミン作動性ニューロンの集団を、第１の培地とは異なる第２の培地中で培養して、ドーパミン作動性ニューロンの集団を産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、またはそのバリアントである。場合によっては、ＧＳＫ阻害剤は、約２ｍＭ～約１０ｐＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、またはそのバリアントである。場合によっては、ＡＬＫ阻害剤は、約１ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、第１の培養培地および／または第２の培養培地は、動物血清を含まない。
いくつかの実施形態では、低免疫原性ドーパミン作動性ニューロンの集団は、非ニューロン細胞から単離される。いくつかの実施形態では、低免疫原性ドーパミン作動性ニューロンの単離された集団は、投与前に増殖される。ある特定の実施形態では、低免疫原性ドーパミン作動性ニューロンの単離された集団は、投与前に増殖され、凍結保存される。
多能性幹細胞を分化させるための方法は、例えば、Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５４８，５９２－５９６、Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，５４７－５５１、Ｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，３３７－５０、Ｐｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００４，１０１，１２５４３－１２５４８、Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，２７，２７５－２８０、およびＫｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１２，１，７０３－７１４に記載されている。
幹細胞に由来するニューロンおよびその作製方法の有用な説明は、例えば、Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２０１２，１：７０３－７１４、Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４８０：５４７－５５１、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１８，１１（１）：１７１－１８２、Ｌｏｒｅｎｚ Ｓｔｕｄｅｒ，「Ｃｈａｐｔｅｒ ８－Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｂｒｉｎｇｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ－Ｔｈｅ ＮＹＳＴＥＭ Ｔｒｉａｌ」ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，ｖｏｌｕｍｅ ２３０，ｐｇ．１９１－２１２、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２０１３，８：１６７０－１６７９、Ｕｐａｄｈｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，３８，２Ｄ．７．１－２Ｄ．７．４７、米国公開出願第２０１６／０１１５４４８号、ならびにＵＳ８，２５２，５８６、ＵＳ８，２７３，５７０、ＵＳ９，４８７，７５２およびＵＳ１０，０９３，８９７に見出すことができ、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ミクログリア、星状細胞、希突起膠細胞、上衣細胞およびシュワン細胞を含むグリア細胞、そのグリア前駆体、およびグリア前駆細胞は、多能性幹細胞を治療的に有効なグリア細胞などに分化させることによって産生される。低免疫原性多能性幹細胞の分化は、低免疫原性グリア細胞などの低免疫原性神経細胞を産生する。
いくつかの実施形態では、グリア細胞、その前駆体、および前駆細胞は、レチノイン酸、ＩＬ－３４、Ｍ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＣＬ２、ＴＧＦベータ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達活性化因子、ＦＧＦ、血小板由来成長因子ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ－アルファ、ＨＧＦ、ＩＧＦ－１、ノギン、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ドルソモルフィン、ノギン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の薬剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することによって生成される。ある特定の例では、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、脳由来神経栄養因子ＢＤＮＦ、ニュートロトロフィン－３ ＮＴ－３、ＮＴ－４、上皮成長因子ＥＧＦ、繊毛神経栄養因子ＣＮＴＦ、神経成長因子ＮＧＦ、ＦＧＦ８、ＥＧＦＲ、ＯＬＩＧ１、ＯＬＩＧ２、ミエリン塩基性タンパク質ＭＢＰ、ＧＡＰ－４３、ＬＮＧＦＲ、ネスチン、ＧＦＡＰ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＩＢＡ－１、ＴＭＥＭ１１９、ＣＤ４５、およびそれらの任意の組み合わせを発現する。例示的な分化培地は、当業者により認識されているグリア細胞型の生成を促進または可能にし得る任意の特定の因子および／または小分子を含むことができる。
インビトロ分化プロトコルに従って生成された細胞がグリア細胞の特徴および特徴を示すかどうかを決定するために、細胞を動物モデルに移植することができる。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、免疫不全マウス、例えば、免疫不全シベラー（ｓｈｉｖｅｒｅｒ）マウスに注射される。グリア細胞はマウスの脳に投与され、事前に選択された時間の後に、移植された細胞が評価される。場合によっては、脳に生着した細胞は、免疫染色およびイメージング法を使用して可視化される。いくつかの実施形態では、グリア細胞が既知のグリア細胞バイオマーカーを発現することが決定される。
幹細胞からグリア細胞、前駆細胞、およびその前駆細胞を生成するための有用な方法は、例えば、ＵＳ７，５７９，１８８、ＵＳ７，５９５，１９４、ＵＳ８，２６３，４０２、ＵＳ８，２０６，６９９、ＵＳ８，２５２，５８６、ＵＳ９，１９３，９５１、ＵＳ９，８６２，９２５、ＵＳ８，２２７，２４７、ＵＳ９，７０９，５５３、ＵＳ２０１８／０１８７１４８、ＵＳ２０１７／０１９８２５５、ＵＳ２０１７／０１８３６２７、ＵＳ２０１７／０１８２０９７、ＵＳ２０１７／２５３８５６、ＵＳ２０１８／０２３６００４、ＷＯ２０１７／１７２９７６、およびＷＯ２０１８／０９３６８１に見出される。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞の分化は、特定の、所望の系統および／または目的の細胞型にそれらの分化を標的化するために、特定の細胞系統を産生することが知られている特定の因子に細胞を曝露または接触させることによって実行される。いくつかの実施形態では、最終分化細胞は、特殊な表現型の特性または特徴を示す。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の幹細胞は、神経外胚葉性、神経性、神経内分泌性、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性（５－ＨＴ）、グルタミン酸作動性、ＧＡＢＡ作動性、アドレナリン作動性、ノルアドレナリン作動性、交感神経性ニューロン、副交感神経性ニューロン、交感神経性末梢ニューロン、またはグリア細胞集団に分化する。場合によっては、グリア細胞集団は、ミクログリア（例えば、アメーバ様、分岐、活性化食細胞、および活性化非食細胞）細胞集団またはマクログリア（中枢神経系細胞：星状細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、および放射状グリア）；ならびに末梢神経系細胞：シュワン細胞および衛星細胞）細胞集団、または先行する細胞のいずれかの前駆体および前駆細胞を含む。
異なるタイプの神経細胞を生成するためのプロトコルは、ＰＣＴ出願第２０１０／１４４６９６号、米国特許第９，０５７，０５３号、同第９，３７６，６６４号、および同第１０，２３３，４２２号に記載されている。低免疫原性多能性細胞を分化させるための方法の追加の説明は、例えば、Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３７，２５２－２５８およびＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１９，１１６（２１），１０４４１－１０４４６に見出すことができる。神経障害または神経学的状態の動物モデルにおける神経細胞移植の効果を決定するための方法は、以下の参考文献に記載されている：脊髄損傷については－Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１８，２２，９４１－９５０、パーキンソン病については－Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５４８：５９２－５９６、ＡＬＳについては－Ｉｚｒａｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１８，９（１）：１５２およびＩｚｒａｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＩｎｔｅｃｈＯｐｅｎ，ＤＯＩ：１０．５７７２／ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．７２８６２、てんかんについては－Ｕｐａｄｈｙａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１９，１１６（１）：２８７－２９６。
脊髄損傷に対する神経細胞移植の有効性は、例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９９，５：１４１０）およびＫｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８：５０によって記載されるように、急性脊髄損傷についてのラットモデルにおいて評価することができる。例えば、移植が成功すると、２～５週間後に病変中に存在し、星状細胞、希突起膠細胞、および／またはニューロンに分化し、病変端から脊髄に沿って移動し、歩行、協調、および体重負荷が改善する移植由来細胞が見られる場合がある。特定の動物モデルは、神経細胞のタイプおよび治療される神経疾患または状態に基づいて選択される。
神経細胞は、それらが意図された組織部位に生着し、機能的に欠損した領域を再構成または再生することを可能にする方法で投与することができる。例えば、神経細胞は、治療されている疾患に応じて、中枢神経系の実質または髄腔内部位に直接移植することができる。いくつかの実施形態では、脳内皮細胞、ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、上衣細胞、星状細胞、ミクログリア細胞、希突起膠細胞、およびシュワン細胞を含む本明細書に記載の神経細胞のいずれかが、静脈内、脊髄内、脳室内、髄腔内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、筋肉内、腹腔内、眼内、眼球後部およびそれらの組み合わせを経て患者に注射される。いくつかの実施形態では、細胞は、ボーラス注射または持続注入の形で注射または沈着される。ある特定の実施形態では、神経細胞は、脳への注射によって、脳に適切に配置されることによって、およびそれらの組み合わせによって投与される。注射は、例えば、対象の頭蓋骨に作られた穿頭孔を通して行うことができる。神経細胞を脳に投与するのに好適な部位としては、脳室、側脳室、大槽、被殻、基底核、海馬皮質、線条体、脳の尾状領域、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明で使用するためのドーパミン作動性ニューロンを含む神経細胞の追加の説明は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見出され、本開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
３．多能性幹細胞から分化した内皮細胞
本発明は、対象（例えば、レシピエント）へのその後の移植または生着のために異なるタイプの内皮細胞に分化することができる多能性幹細胞を提供する。当業者によって理解されるように、既知の方法を使用する分化のための方法は、所望のタイプの細胞に依存する。内皮細胞の例示的なタイプとしては、毛細血管内皮細胞、血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、動脈内皮細胞、静脈内皮細胞、腎内皮細胞、脳内皮細胞、肝臓内皮細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に概説される内皮細胞は、１つ以上の内皮細胞マーカーを発現することができる。そのようなマーカーの非限定的な例としては、ＶＥ－カドヘリン（ＣＤ１４４）、ＡＣＥ（アンギオテンシン変換酵素）（ＣＤ１４３）、ＢＮＨ９／ＢＮＦ１３、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－１）、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ－セレクチン）、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１４６、エンドカン（ＥＳＭ－Ｉ）、エンドグリックス－Ｉ、エンドムチン、エオタキシン－３、ＥＰＡＳ１（内皮ＰＡＳドメインタンパク質１）、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、ＦＬＩ－１、Ｆｌｋ－１（ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ－２）、ＦＬＴ－１（ＶＥＧＦＲ－１）、ＧＡＴＡ２、ＧＢＰ－１（グアニル酸結合タンパク質－１）、ＧＲＯ－アルファ、ＨＥＸ、ＩＣＡＭ－２（細胞間接着分子２）、ＬＭ０２、ＬＹＶＥ－１、ＭＲＢ（マジックラウンドアバウト）、ヌクレオリン、ＰＡＬ－Ｅ（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｃｈｅ ａｎａｔｏｍｉｅ Ｌｅｉｄｅｎ－内皮）、ＲＴＫ、ｓＶＣＡＭ－１、ＴＡＬＩ、ＴＥＭ１（腫瘍内皮マーカー１）、ＴＥＭ５（腫瘍内皮マーカー５）、ＴＥＭ７（腫瘍内皮マーカー７）、トロンボモジュリン（ＴＭ、ＣＤ１４１）、ＶＣＡＭ－１（血管細胞接着分子－１）（ＣＤ１０６）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ｖＷＦ（フォンウィルブランド因子）、ＺＯ－１、内皮細胞選択的接着分子（ＥＳＡＭ）、ＣＤ１０２、ＣＤ９３、ＣＤ１８４、ＣＤ３０４、およびＤＬＬ４が挙げられる。
いくつかの実施形態では、内皮細胞は、酵素、ホルモン、受容体、リガンド、または障害／状態の治療もしくは障害／状態の症状の改善に有用な薬物などであるがこれらに限定されない、目的のタンパク質をコードする外因性遺伝子を発現するように遺伝子改変される。内皮細胞を遺伝子改変するための標準的な方法は、例えば、ＵＳ５，６７４，７２２に記載されている。
そのような内皮細胞は、疾患の予防または治療に有用なポリペプチドまたはタンパク質の構成的合成および送達を提供するために使用することができる。このようにして、ポリペプチドは、個体の血流または身体の他の領域（例えば、中枢神経系）に直接分泌される。いくつかの実施形態では、内皮細胞は、インスリン、血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子またはフォンウィルブランド因子）、アルファ－１アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３）などを分泌するように改変され得る。
ある特定の実施形態では、内皮細胞は、移植された移植片との関連において、それらの性能を改善する方法で改変され得る。非限定的な実例としては、管腔内血餅形成を防止するための血栓溶解剤の分泌または発現、平滑筋肥大による管腔狭窄を防止するための平滑筋増殖の阻害剤の分泌、および内皮細胞の増殖を刺激し、移植片内腔の内皮細胞の内層の範囲または持続時間を改善するための内皮細胞マイトジェンまたはオートクリン因子の発現および／または分泌が挙げられる。
いくつかの実施形態では、操作された内皮細胞は、特定の器官または四肢への治療レベルの分泌産物の送達のために利用される。例えば、インビトロで操作された（形質導入された）内皮細胞で裏打ちされた血管インプラントは、特定の器官または四肢に移植することができる。形質導入された内皮細胞の分泌産物は、灌流された組織に高濃度で送達され、それにより、目標とされた解剖学的位置に所望の効果を達成する。
他の実施形態では、内皮細胞は、血管新生腫瘍において内皮細胞によって発現される場合に血管新生を破壊または阻害する遺伝子を含有するように遺伝子改変される。場合によっては、内皮細胞はまた、腫瘍治療の完了時に移植された内皮細胞の負の選択を可能にする、本明細書に記載の選択可能な自殺遺伝子のうちのいずれか１つを発現するように遺伝子改変され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の内皮細胞は、血管損傷、心臓血管疾患、血管疾患、末梢血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、高血圧、虚血性組織損傷、再灌流損傷、四肢虚血、脳卒中、ニューロパシー（例えば、末梢ニューロパシーまたは糖尿病性ニューロパシー）、臓器不全（例えば、肝不全、腎不全など）、糖尿病、関節リウマチ、骨粗鬆症、脳血管疾患、高血圧、冠状動脈疾患による腹膜および心筋梗塞、腎血管高血圧、腎動脈狭窄による腎不全、下肢の閉塞、他の血管状態または疾患からなる群から選択される血管障害を治療するためにレシピエント対象に投与される。
いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、末梢動脈疾患に対処するための新しい血管を形成するために、内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）に分化される。内皮細胞を分化させる技術が知られている。例えば、参照によりその全体が、特にヒト多能性幹細胞から内皮細胞を生成するための方法および試薬について、ならびに移植技術について本明細書に組み込まれる、Ｐｒａｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０４８を参照されたい。分化は、一般に、内皮細胞関連または特定のマーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。
いくつかの実施形態では、インビトロ分化によって低免疫原性多能性細胞の集団から低免疫原性内皮細胞の集団を産生する方法は、（ａ）ＨＩＰ細胞の集団を、ＧＳＫ阻害剤を含む第１の培養培地中で培養することと、（ｂ）ＨＩＰ細胞の集団を、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む第２の培養培地中で培養して、前内皮細胞の集団を産生することと、（ｃ）前内皮細胞の集団を、ＲＯＣＫ阻害剤およびＡＬＫ阻害剤を含む第３の培養培地中で培養して、低免疫性内皮細胞の集団を産生することと、を含む。
いくつかの実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、またはそのバリアントである。場合によっては、ＧＳＫ阻害剤は、約１ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、その誘導体、またはそのバリアントである。場合によっては、ＲＯＣＫ阻害剤は、約１ｐＭ～約２０ｐＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、またはそのバリアントである。場合によっては、ＡＬＫ阻害剤は、約０．５ｐＭ～約１０ｐＭの範囲の濃度である。
いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、２ｐＭから約１０ｐＭのＣＨＩＲ－９９０２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む。他の実施形態では、第２の培養培地は、Ｙ－２７６３２およびＳＢ－４３１５４２をさらに含む。様々な実施形態では、第３の培養培地は、１０ｐＭのＹ－２７６３２および１ｐＭのＳＢ－４３１５４２を含む。ある特定の実施形態では、第３の培養培地は、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦをさらに含む。特定の例では、第１の培養培地および／または第２の培地は、インスリンを含まない。
本発明の細胞は、低免疫原性多能性細胞の心臓細胞への分化を支持および／または促進するために、合成表面などの表面上で培養することができる。いくつかの実施形態では、表面は、選択された１つ以上のアクリレートモノマーのホモポリマーまたはコポリマーが挙げられるが、これらに限定されないポリマー材料を含む。アクリレートモノマーおよびメタクリレートモノマーの非限定的な例としては、テトラ（エチレングリコール）ジアクリレート、グリセロールジメタクリレート、１，４－ブタンジオールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ジ（エチレングリコール）ジメタクリレート、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、１，６－ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、トリメチロールプロパンベンゾエートジアクリレート、トリメチロールプロパンエイホキシレート（１ＥＯ／ＱＨ）メチル、トリシクロ［５．２．１．０２，６］デカンジメタノールジアクリレート、ネオペンチルグリコールエキソキシレートジアクリレート、およびトリメチロールプロパントリアクリレートが挙げられる。アクリレートは、当技術分野において既知であるように合成したか、またはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．およびＳａｒｔｏｍｅｒ，Ｉｎｃ．などの商業ベンダーから入手した。
いくつかの実施形態では、内皮細胞は、ポリマーマトリックス上に播種され得る。いくつかの場合には、ポリマーマトリックスは生分解性である。好適な生分解性マトリックスは当技術分野で周知であり、コラーゲン－ＧＡＧ、コラーゲン、フィブリン、ＰＬＡ、ＰＧＡ、およびＰＬＡ／ＰＧＡコポリマーが挙げられる。追加の生分解性材料としては、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフメレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、生分解性ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタンおよび多糖類が挙げられる。
非生分解性ポリマーも同様に使用することができる。他の非生分解性であるが生体適合性のポリマーとしては、ポリピロール、ポリアニブネス、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、非生分解性ポリウレタン、ポリ尿素、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート、およびポリ（エチレンオキシド）が挙げられる。ポリマーマトリックスは、任意の形状、例えば、粒子、スポンジ、チューブ、球、ストランド、コイル状ストランド、毛細管ネットワーク、フィルム、繊維、メッシュ、またはシートとして形成することができる。ポリマーマトリックスは、天然または合成の細胞外マトリックス材料および因子を含むように改変することができる。
ポリマー材料は、支持材料の表面に分散させることができる。細胞を培養するのに適した有用な支持材料としては、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーもしくはコポリマー、それらの任意の組み合わせ、またはある材料の別の材料へのコーティングが挙げられる。場合によっては、ガラスには、ソーダ石灰ガラス、パイレックスガラス、バイコールガラス、石英ガラス、シリコン、またはこれらの派生物などが挙げられる。
場合によっては、樹枝状ポリマーを含むプラスチックまたはポリマーには、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（酢酸ビニル－無水マレイン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミンまたはこれらの誘導体などが挙げられる。場合によっては、コポリマーには、ポリ（酢酸ビニル－コ－無水マレイン酸）、ポリ（スチレン－コ－無水マレイン酸）、ポリ（エチレン－コ－アクリル酸）またはこれらの誘導体などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、低免疫原性内皮細胞の集団は、非内皮細胞から単離される。いくつかの実施形態では、低免疫原性内皮細胞の単離された集団は、投与前に増殖される。ある特定の実施形態では、低免疫原性内皮細胞の単離された集団は、投与前に増殖され、凍結保存される。
本発明で使用するための内皮細胞の追加の説明は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見出され、本開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
４．多能性幹細胞から分化した甲状腺細胞
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、自己免疫性甲状腺炎に対処するために甲状腺ホルモンを分泌することができる甲状腺前駆細胞および甲状腺濾胞性器官に分化することができる。甲状腺細胞を分化させる技術は、当技術分野において既知である。例えば、参照によりその全体が、特にヒト多能性幹細胞から甲状腺細胞を生成するための方法および試薬について、ならびに移植技術について本明細書に組み込まれる、Ｋｕｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、２０１５ Ｎｏｖ ５：１７（５）５２７－４２を参照されたい。分化は、一般に、甲状腺細胞関連または特定のマーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。
５．多能性幹細胞から分化した肝細胞
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、肝細胞機能の喪失または肝硬変に対処するために肝細胞に分化され得る。ＨＩＰ細胞を肝細胞に分化させるために使用できる技術はたくさんあり、例えば、Ｐｅｔｔｉｎａｔｏ ｅｔ ａｌ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｐｒｅ３２８８８，Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６９８：３０５－３１４（２０１１）、Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５１：２９７－３０５（２０１０）およびＡｓｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ（：４９３－５０４（２０１３）を参照されたく、これらはすべて、参照によりその全体が、特に分化のための方法論および試薬について、本明細書に組み込まれる。分化は、一般に、アルブミン、アルファフェトプロテイン、およびフィブリノーゲンが挙げられるが、これらに限定されない肝細胞関連および／または特定のマーカーの存在を評価することによって、当該技術分野において既知であるようにアッセイされる。分化は、アンモニアの代謝、ＬＤＬの貯蔵および取り込み、ＩＣＧの取り込みおよび放出、ならびにグリコーゲンの貯蔵など、機能的に測定することもできる。
６．多能性幹細胞から分化した膵島細胞
本発明は、対象（例えば、レシピエント）へのその後の移植または生着のために異なるタイプの膵島細胞に分化することができる多能性幹細胞を提供する。当業者によって理解されるように、既知の方法を使用する分化のための方法は、所望のタイプの細胞に依存する。膵島細胞の例示的なタイプとしては、膵島前駆細胞、未成熟膵島細胞、成熟膵島細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の膵臓細胞は、糖尿病を治療するために対象に投与される。
いくつかの実施形態では、膵島細胞は、本明細書に記載される低免疫原性多能性細胞に由来する。多能性幹細胞を膵島細胞に分化させるための有用な方法は、例えば、ＵＳ９，６８３，２１５、ＵＳ９，１５７，０６２、およびＵＳ８，９２７，２８０に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって産生される膵島細胞は、インスリンを分泌する。いくつかの実施形態では、膵島細胞は、内因性膵島細胞の少なくとも２つの特徴、例えば、グルコースに応答したインスリンの分泌、およびベータ細胞マーカーの発現を示すが、これらに限定されない。
例示的なベータ細胞マーカーまたはベータ細胞前駆体マーカーとしては、ｃ－ペプチド、Ｐｄｘｌ、グルコーストランスポーター２（Ｇｌｕｔ２）、ＨＮＦ６、ＶＥＧＦ、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、プロホルモン変換酵素（ＰＣ １／３）、Ｃｄｃｐｌ、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｇｎ３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．ｌ、Ｎｋｘ６．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、Ｐｔｆｌａ、Ｉｓｌｌ、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘｌ７、およびＦｏｘＡ２が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、単離された膵島細胞は、グルコースの増加に応答してインスリンを産生する。様々な実施形態では、単離された膵島細胞は、グルコースの増加に応答してインスリンを分泌する。いくつかの実施形態では、細胞は、敷石（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）細胞の形態および／または約１７ｐｍ～約２５ｐｍの直径などの別個の形態を有する。
いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に対処するための移植のために、ベータ様細胞または膵島オルガノイドに分化される。細胞系は、Ｔ１ＤＭに対処するための有望な方法であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１７ Ｏｃｔ；１４（１０）：６１２－６２８を参照されたい。さらに、Ｐａｇｌｉｕｃａら（Ｃｅｌｌ，２０１４，１５９（２）：４２８－３９）は、ｈｉＰＳＣからのβ細胞の分化の成功について報告している（その内容は、その全体が、特に、ヒト多能性幹細胞から機能的なヒトβ細胞を大規模に生産するためにそこで概説された方法および試薬について、本明細書に組み込まれる）。さらに、Ｖｅｇａｓらは、ヒト多能性幹細胞からのヒトβ細胞の産生と、それに続く宿主による免疫拒絶を回避するためのカプセル化を示している（その全体が、特に、ヒト多能性幹細胞から機能的なヒトβ細胞を大規模に生産するためにそこで概説された方法および試薬について、本明細書に組み込まれる、Ｖｅｇａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２０１６ ２２（３）：３０６ー１１）。
いくつかの実施形態では、インビトロ分化によって低免疫原性多能性細胞の集団から低免疫原性膵島細胞の集団を産生する方法は、（ａ）ＨＩＰ細胞の集団を、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＥＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、形質転換増殖因子－ｂ（ＴＯＲｂ）スーパーファミリー、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ２）、骨形成タンパク質－７（ＢＭＰ７）、ＧＳＫ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ１型受容体阻害剤、ならびにレチノイン酸からなる群から選択される１つ以上の因子を含む第１の培養培地中で培養して、未成熟膵島細胞の集団を産生することと、（ｂ）未成熟膵島細胞の集団を第１の培養培地とは異なる第２の培養培地で培養して、低免疫膵島細胞の集団を産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、またはそのバリアントである。場合によっては、ＧＳＫ阻害剤は、約２ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、またはそのバリアントである。場合によっては、ＡＬＫ阻害剤は、約１ｐＭ～約１０ｐＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、第１の培養培地および／または第２の培養培地は、動物血清を含まない。
いくつかの実施形態では、低免疫原性膵島細胞の集団は、非膵島細胞から単離される。いくつかの実施形態では、低免疫原性膵島細胞の単離された集団は、投与前に増殖される。ある特定の実施形態では、低免疫原性膵島細胞の単離された集団は、投与前に増殖され、凍結保存される。
分化は、一般に、インスリンが挙げられるが、これに限定されないβ細胞関連または特定のマーカーの存在を評価することによって、当該技術分野において既知であるようにアッセイされる。分化は、グルコース代謝の測定など、機能的に測定することもでき、その全体、特にそれに概説されたバイオマーカーについて、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｒａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ．２０１６ Ｏｃｔ ２６；３（４）：３８５－３９４．ｅ３を参照されたい。ベータ細胞が生成されると、それらは門脈／肝臓、腹膜、胃腸粘膜、骨髄、筋肉、または皮下嚢に（細胞懸濁液として、または本明細書で論じられるようにゲルマトリックス内のいずれかとして）移植することができる。
本発明で使用するためのドーパミン作動性ニューロンを含む膵島細胞の追加の説明は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見出され、本開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
７．多能性幹細胞から分化した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞
本発明は、対象（例えば、レシピエント）へのその後の移植または生着のために異なるタイプのＲＰＥ細胞に分化することができる低免疫原性多能性幹細胞を提供する。当業者によって理解されるように、既知の方法を使用する分化のための方法は、所望のタイプの細胞に依存する。ＲＰＥ細胞の例示的なタイプとしては、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、ＲＰＥ前駆細胞、未成熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞、機能的ＲＰＥ細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
多能性幹細胞をＲＰＥ細胞に分化させるための有用な方法は、例えば、ＵＳ９，４５８，４２８およびＵＳ９，８５０，４６３に記載されており、これらの本開示は、明細書を含めて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヒト人工多能性幹細胞かＲＰＥ細胞を産生するための追加の方法は、例えば、Ｌａｍｂａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００６，１０３（３４）：１２７６９－１２７７４、Ｍｅｌｌｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１２，３０（４）：６７３－６８６、Ｉｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００９，５（４）：３９６－４０８、Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１２，２２７（２）：４５７－４６６、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ，２０１３，２（５）：３８４－３９３、およびｄａ Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１８，３６：３２８－３３７に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＰＥ細胞は、滲出型黄斑変性症、乾性黄斑変性症、若年性黄斑変性症（例えば、シュタルガルト病、ベスト病、および若年性網膜色素変性症）、レーバー先天性黒内障、網膜色素変性症、網膜剥離、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、初期ＡＭＤ、中期ＡＭＤ、後期ＡＭＤ、非血管新生性加齢性黄斑変性症などからなる群から選択される眼障害を治療するために対象に投与される。
ヒト多能性幹細胞は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４：２：２０５－１８（その全体が、特に分化技術および試薬についてそこで概説されている方法および試薬について、参照により本明細書に組み込まれる）に概説されている技術を使用して、ＲＰＥ細胞に分化されており、またＭａｎｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０１７，３７６：１０３８－１０４６（その内容は、ＲＰＥ細胞のシートを生成するための技術および患者への移植についてその全体が本明細書に組み込まれる）も参照されたい。分化は、一般に、ＲＰＥ細胞関連および／または特定のマーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。例えば、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ、２０１４，２（２）：２０５－１８を参照されたく、その内容は、その全体が、特に、結果のセクションの最初の段落で概説されているマーカーについて、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、インビトロ分化によって低免疫原性多能性細胞の集団から低免疫原性網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の集団を産生する方法は、（ａ）アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４／７、ＤＫＫ１、ＩＧＦ１、ノギン、ＢＭＰ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＶＥＧＦＲ阻害剤からなる群から選択される因子のいずれか１つを含む第１の培養培地中で低免疫原性多能性細胞の集団を培養し、前ＲＰＥ細胞の集団を産生することと、（ｂ）前ＲＰＥ細胞の集団を、第１の培養培地とは異なる第２の培養培地中で培養して、低免疫原性ＲＰＥ細胞の集団を産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、またはそのバリアントである。場合によっては、ＡＬＫ阻害剤は、約２ｍＭ～約１０ｐＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、その誘導体、またはそのバリアントである。場合によっては、ＲＯＣＫ阻害剤は、約１ｐＭ～約１０ｐＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、第１の培養培地および／または第２の培養培地は、動物血清を含まない。
分化は、一般に、ＲＰＥ細胞関連および／または特定のマーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当該技術分野において既知であるようにアッセイすることができる。例えば、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ、２０１４，２（２）：２０５－１８を参照されたく、その内容は、その全体が、特に、結果のセクションについて、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明で使用するためのＲＰＥ細胞の追加の説明は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見出され、本開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
治療用途の場合、開示された方法に従って調製された細胞は、典型的には、等張性賦形剤を含む医薬組成物の形態で供給されることができ、ヒト投与のために十分に無菌である条件下で調製される。細胞組成物の薬用製剤の一般原則については、“Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，”ｂｙ Ｍｏｒｓｔｙｎ ＆ Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６、および“Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ ＆ Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００を参照されたい。細胞は、流通または臨床使用に適した装置または容器に包装することができる。
Ｐ．細胞の投与
当業者によって理解されるように、分化した低免疫原性多能性細胞誘導体は、細胞型およびこれらの細胞の最終的用途の両方に依存する当技術分野において既知の技術を使用して移植することができる。一般に、本発明の細胞は、静脈内に、または患者の特定の位置に注射することのいずれかで移植することができる。特定の位置に移植する場合、細胞をゲルマトリックスに懸濁して、細胞が保持されている間の分散を防ぐことができる。
ＩＶ．実施例
実施例１
ＣＤ２４発現細胞のマクロファージ貪食に対するＣＤ２４の効果は、ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥアッセイを使用して測定される。簡単に説明すると、ＣＤ２４（ＣＤ２４ｔｇ）を発現するレンチウイルスベクターで形質導入された、または形質導入されていないヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、希釈したフィーダーフリーマトリゲル（ｈＥＳＣ樹立、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でコーティングした１０ｃｍの皿上で培養する。培地を２４時間ごとに交換し、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）を、１：６の比率での細胞継代用に使用する。内皮細胞への分化は６０％の集密度で開始し、培地は２％のＢ－２７からインスリンを差し引いたもの（両方ともＧｉｂｃｏ）および５μＭのＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含有するＲＰＭｌ－１６４０に変更する。２日目に、培地を還元培地：２％のＢ－２７からインスリンを差し引いたものおよび２μＭのＣＨＩＲ－９９０２１を含有するＲＰＭｌ－１６４０に変更する。培養４日目から７日目まで、細胞を、ＲＰＭｌ－１６４０ ＥＣ培地、２％Ｂ－２７－インスリン＋５０ｎｇ／ｍｌヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍｌヒト線維芽細胞増殖因子塩基性（ＦＧＦｂ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭのＹ－２７６３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１μＭのＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＰＭｌ－１６４０に曝露した。内皮細胞クラスターは７日目から見え、細胞は内皮細胞基礎培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に補助物質、１０％のＦＣＳ ｈｉ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、２ｎｇ／ｍｌのＦＧＦｂ、１０μのＭ Ｙ－２７６３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１μＭのＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えたものの中で維持する。分化プロトコルは１４日後に完了し、未分化細胞は分化過程で分離する。ＴＲＹＰＬＥ ＥＸＰＲＥＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）を、３～４日ごとに１：３で細胞を継代するために使用する。
ＮＫ細胞死滅およびマクロファージ死滅アッセイは、ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥ ＭＰプラットフォーム（ＡＣＥＡ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）で実行する。特別な９６ウェルＥプレートをゼラチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でコーティングし、４×１０５Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ２４ ｔｇまたは４×１０５Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｈｉＥＣを、１００μｌの細胞特異的培地に播種する。細胞指数値が０．７に達した後、１ｕｇ／ｍｌのヒトＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を使用して、エフェクター細胞と標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比率が１：１になるようにヒトＮＫ細胞またはマクロファージを添加する。陰性対照として、細胞を２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で処理する。データを標準化し、ＲＴＣＡソフトウェア（ＡＣＥＡ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｈｉＥＣ（ＣＤ２４なし）はＮＫ細胞とマクロファージによって効果的に死滅されるが、Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ２４ ｔｇ ｈｉＥＣは、マクロファージによる死滅から保護される。１０ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ２４抗体（Ｃｌｏｎｅ ＳＮ３、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）による遮断により、保護効果が除去された。ＣＤ４７とＣＤ２４の両方の過剰発現は、Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｈｉＥＣをＮＫ細胞とマクロファージの両方による死滅から保護する。
実施例２
マクロファージの食作用もフローサイトメトリーを使用して測定される。ＣＤ２４（ＣＤ２４ｔｇ）を発現するレンチウイルスベクターで形質導入された、または形質導入されていないヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、希釈したフィーダーフリーＭＡＴＲＩＧＥＬ（ｈＥＳＣ樹立、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でコーティングした１０ｃｍの皿上で培養する。細胞を６０％の集密度で回収し、製造元の指示に従って細胞をＰＢＳ＋１：３０，０００カルセインＡＭに３７℃で１５分間懸濁し、共培養の前に４０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄することにより、カルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で蛍光標識する。次に、細胞をエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比率１：２で、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＧＦβ１および５０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１０で４日間刺激したヒトマクロファージと共培養する。共培養後、プレートを氷上に置き、４℃で４００ｇで５分間、遠心分離し、Ａ６４７標識抗ＣＤ１１ｂ（Ｃｌｏｎｅ Ｍ１／７０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、ヒトマクロファージを同定することにより、食作用アッセイを停止させる。アッセイを、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローアナライザーでのフローサイトメトリーによって分析する。食作用は、ＣＤ１１ｂ＋カルクニューリン＋マクロファージの数として測定され、ＣＤ１１ｂ＋マクロファージ全体のパーセンテージとして定量化する。Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｈｉＥＣ（ＣＤ２４なし）は大幅に食作用を受けるが、Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ２４ ｔｇ ｈｉＥＣは、食作用から保護される。１０ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ２４抗体（Ｃｌｏｎｅ ＳＮ３、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）による遮断により、保護効果が除去される。マクロファージの食作用もフローサイトメトリーを使用して測定される。ＣＤ２４（ＣＤ２４ｔｇ）を発現するレンチウイルスベクターで形質導入された、または形質導入されていないヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、希釈したフィーダーフリーＭＡＴＲＩＧＥＬ（ｈＥＳＣ樹立、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でコーティングした１０ｃｍの皿上で培養する。細胞を６０％の集密度で回収し、製造元の指示に従って細胞をＰＢＳ＋１：３０，０００カルセインＡＭに３７℃で１５分間懸濁し、共培養の前に４０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄することにより、カルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で蛍光標識する。次に、細胞をエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比率１：２で、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＧＦβ１および５０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１０で４日間刺激したヒトマクロファージと共培養する。共培養後、プレートを氷上に置き、４℃で４００ｇで５分間、遠心分離し、Ａ６４７標識抗ＣＤ１１ｂ（Ｃｌｏｎｅ Ｍ１／７０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、ヒトマクロファージを同定することにより、食作用アッセイを停止させる。アッセイを、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローアナライザーでのフローサイトメトリーによって分析する。食作用は、ＣＤ１１ｂ＋カルクニューリン＋マクロファージの数として測定され、ＣＤ１１ｂ＋マクロファージ全体のパーセンテージとして定量化する。Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｈｉＥＣ（ＣＤ２４なし）は大幅に食作用を受けるが、Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ２４ ｔｇ ｈｉＥＣは、食作用から保護される。１０ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ２４抗体（Ｃｌｏｎｅ ＳＮ３、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）による遮断により、保護効果が除去される。
すべての見出しおよび節の表記は、明確さおよび参照目的のために使用されているにすぎず、決して限定するものとみなされるべきではない。例えば、当業者であれば、本明細書に記載の本発明の趣旨および範囲に従って、必要に応じて異なる見出しおよび節からの様々な態様を組み合わせることの有用性を認識するであろう。
本明細書に引用されるすべての参考文献は、各個々の刊行物または特許または特許出願が参照によりその全体がすべての目的のために組み込まれているかのように具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照によりそれらの全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
当業者に明らかであるように、本出願の趣旨および範囲から逸脱することなく、本出願の多くの修正および変形が加えられてもよい。本明細書に記載の特定の実施形態および実施例はほんの一例として提供されており、本出願は、特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲に加えて、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。

Claims (173)

  1. 単離された細胞であって、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現、ならびに前記細胞におけるＣＤ２４の発現を増加させるための改変を含む、単離された細胞。
  2. 前記細胞が、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を含む、請求項１に記載の単離された細胞。
  3. 前記細胞が、ＣＩＩＴＡ遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼによる前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する遺伝子改変をさらに含む、請求項１または２に記載の単離された細胞。
  4. 前記細胞が、前記細胞におけるＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されるポリペプチドの発現を増加させるための改変をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  5. 前記細胞が、前記細胞におけるＣＤ４７の発現を増加させるための改変をさらに含む、請求項４に記載の単離された細胞。
  6. 前記細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼによる前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化する遺伝子改変をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  7. 前記細胞が、ＮＬＲＣ５遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼによる前記ＮＬＲＣ５遺伝子を標的化する遺伝子改変をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  8. 前記レアカットエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項３～７のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  9. 前記レアカットエンドヌクレアーゼによる前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する前記遺伝子改変が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、請求項３～８のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  10. 前記レアカットエンドヌクレアーゼによる前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化する前記遺伝子改変が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、請求項６～９のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  11. 前記レアカットエンドヌクレアーゼによる前記ＮＬＲＣ５遺伝子を標的化する前記遺伝子改変が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  12. ＣＤ２４の発現を増加させるための前記改変が、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、前記細胞に導入することを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  13. ＣＤ２４をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項１２に記載の単離された細胞。
  14. ＣＤ２４をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である、請求項１２または１３に記載の単離された細胞。
  15. ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現を増加させるための前記改変が、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される前記１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、前記細胞に導入することを含む、請求項４～１４のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  16. ＣＤ４７の発現を増加させるための前記改変が、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、前記細胞に導入することを含む、請求項４～１５のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  17. 前記発現ベクターが、誘導性発現ベクターである、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  18. 前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  19. ＣＤ２４の発現を増加させるための前記改変が、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列を、前記細胞の選択された遺伝子座に導入することを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  20. ＣＤ２４をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項１９に記載の単離された細胞。
  21. ＣＤ２４をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である、請求項１９または２０に記載の単離された細胞。
  22. ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現を増加させるための前記改変が、ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される前記１つ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、前記細胞の選択された遺伝子座に導入することを含む、請求項４～１５または１９～２１のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  23. ＣＤ４７の発現を増加させるための前記改変が、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を、前記細胞の選択された遺伝子座に導入することを含む、請求項２２に記載の単離された細胞。
  24. ＣＤ２４をコードする前記ポリヌクレオチド配列についての前記選択された遺伝子座ならびに／またはＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つをコードする前記ポリヌクレオチド配列についての前記選択された遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  25. 前記セーフハーバーが、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択される、請求項２４に記載の単離された細胞。
  26. 誘導性自殺スイッチをさらに含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  27. 前記細胞が、幹細胞、分化細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、前駆細胞、体細胞、一次Ｔ細胞およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  28. ＣＤ２４を含む細胞を調製する方法であって、前記方法が、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、前記細胞に導入し、それによってＣＤ２４を含む前記細胞を産生することを含む、方法。
  29. ＣＤ２４をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項２８に記載の方法。
  30. ＣＤ２４をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. ＣＤ２４を含む前記細胞が、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化するための、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択されるレアカットエンドヌクレアーゼを含む前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する遺伝子改変をさらに含む、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記遺伝子改変が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記発現ベクターが、誘導性発現ベクターである、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. ＣＤ２４を含む前記細胞が、ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターをさらに含む、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記第２の発現ベクターが、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記第２の発現ベクターが、誘導性発現ベクターである、請求項３５または３６に記載の方法。
  38. 前記第２の発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. ＣＤ２４を含む前記細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択されるレアカットエンドヌクレアーゼを含む前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化する遺伝子改変をさらに含む、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記遺伝子改変が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. ＣＤ２４を含む前記細胞が、ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択されるレアカットエンドヌクレアーゼを含む前記ＮＬＲＣ５遺伝子を標的化する遺伝子改変をさらに含む、請求項２８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記遺伝子改変が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸を含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記細胞が、幹細胞、分化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、成体幹細胞、前駆細胞、体細胞、一次Ｔ細胞およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項２８～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 低免疫原性幹細胞を調製する方法であって、ＣＤ２４をコードするポリヌクレオチド配列を、前記幹細胞の選択された遺伝子座に導入し、それによって低免疫原性幹細胞を産生することを含む、方法。
  45. ＣＤ２４をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項４４に記載の方法。
  46. ＣＤ２４をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号２８～３１からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である、請求項４４または４５に記載の方法。
  47. ＣＩＩＴＡ遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼを幹細胞に導入することを含む、前記幹細胞において前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する遺伝子改変を生成することをさらに含み、前記レアカットエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記レアカットエンドヌクレアーゼの前記導入することが、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む、請求項４７に記載の方法。
  49. ＣＤ２４をコードする前記ポリヌクレオチド配列についての前記選択された遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項４４～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. ＣＤ２４をコードする前記ポリヌクレオチド配列についての前記セーフハーバー遺伝子座が、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、前記幹細胞の選択された遺伝子座に導入することをさらに含む、請求項４４～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を、前記幹細胞の選択された遺伝子座に導入することをさらに含む、請求項４４～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記選択された遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項５１または５２に記載の方法。
  54. 前記セーフハーバー遺伝子座が、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. Ｂ２Ｍ遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼを幹細胞に導入することを含む、前記幹細胞において前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化する遺伝子改変を生成することをさらに含み、前記レアカットエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項４４～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記レアカットエンドヌクレアーゼの前記導入することが、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む、請求項５５に記載の方法。
  57. ＮＬＲＣ５遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼを幹細胞に導入することを含む、前記幹細胞において前記ＮＬＲＣ５遺伝子を標的化する遺伝子改変を生成することをさらに含み、前記レアカットエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項４４～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記レアカットエンドヌクレアーゼの前記導入することが、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 誘導性自殺スイッチを含む発現ベクターを前記幹細胞に導入することをさらに含む、請求項４４～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 分化した低免疫原性細胞を調製する方法であって、分化条件下で、請求項４４～５９のいずれか一項に記載の方法に従って調製された前記低免疫原性幹細胞を培養し、それにより分化した低免疫原性細胞を調製することを含む、方法。
  61. 前記分化条件が、心臓細胞、神経細胞、内皮細胞、Ｔ細胞、膵島細胞、網膜色素上皮細胞、腎細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、血液細胞、および上皮細胞からなる群から選択される細胞型への幹細胞の分化に適切である、請求項６０に記載の方法。
  62. 細胞療法を必要とする患者を治療する方法であって、請求項６０または６１に記載の方法に従って調製された分化した低免疫原性細胞の集団を投与することを含む、方法。
  63. ＣＤ２４を発現し、かつＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  64. ＣＤ２４を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  65. ＣＩＩＴＡを発現せず、ＣＤ２４を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  66. Ｂ２Ｍを発現せず、ＣＤ２４を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  67. ＮＬＲＣ５を発現せず、ＣＤ２４を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  68. ＣＤ２４と、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドとを発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  69. ＣＤ２４およびＣＤ４７を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  70. ＣＩＩＴＡを発現せず、ＣＤ２４と、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドとを発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  71. ＣＩＩＴＡを発現せず、ＣＤ２４およびＣＤ４７を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  72. ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを発現せず、ＣＤ２４を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  73. ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを発現せず、ＣＤ２４と、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドとを発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  74. ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを発現せず、ＣＤ２４およびＣＤ４７を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  75. ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５を発現せず、ＣＤ２４を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  76. ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５を発現せず、ＣＤ２４と、ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドとを発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  77. ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５を発現せず、ＣＤ２４およびＣＤ４７を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  78. ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、およびＮＬＲＣ５を発現せず、ＣＤ２４と、ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＤＵＸ４、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドとを発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  79. ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、およびＮＬＲＣ５を発現せず、ＣＤ２４およびＣＤ４７を発現し、かつＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、細胞。
  80. 前記細胞が、幹細胞、分化細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、前駆細胞、体細胞、一次Ｔ細胞およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項６３～７９のいずれか一項に記載の細胞。
  81. 心臓細胞、神経細胞、内皮細胞、Ｔ細胞、膵島細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、腎臓細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、血液細胞、および上皮細胞からなる群から選択される分化細胞を生成する分化条件下で培養することによって、請求項８０に記載の多能性幹細胞または人工多能性幹細胞から生成された、分化細胞。
  82. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドを含む、単離された幹細胞。
  83. 前記細胞が、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤ２４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現する、請求項８２に記載の単離された細胞。
  84. 前記ＣＤ２４ポリペプチドが、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択される、請求項８２または８３に記載の単離された細胞。
  85. 前記細胞が、ＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、請求項８２～８４のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  86. 前記細胞が、ＭＨＣ ＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、請求項８２～８５のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  87. 前記細胞が、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣ ＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、請求項８２～８６のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  88. 前記細胞が、ＣＩＩＴＡの低下した発現を有する、請求項８２～８７のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  89. 前記細胞が、Ｂ２Ｍの低下した発現を有する、請求項８２～８８のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  90. 前記細胞が、ＮＬＲＣ５の低下した発現を有する、請求項８２～８９のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  91. ＣＩＩＴＡの発現を低下させるためにＣＩＩＴＡを標的化するゲノム改変をさらに含む、請求項８２～９０のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  92. Ｂ２Ｍの発現を低下させるためにＢ２Ｍを標的化するゲノム改変をさらに含む、請求項８２～９１のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  93. ＮＬＲＣ５の発現を低下させるためにＮＬＲＣ５を標的化するゲノム改変をさらに含む、請求項８２～９２のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  94. 前記ゲノム改変が、レアカットエンドヌクレアーゼを含む、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  95. 前記レアカットエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項９４に記載の単離された細胞。
  96. 前記レアカットエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質またはＣＩＩＴＡを標的化するＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項９４または９５に記載の単離された細胞。
  97. ＣＩＩＴＡを標的化する前記Ｃａｓタンパク質によって認識された少なくとも１つのガイドリボ核酸配列をさらに含む、請求項９６に記載の単離された細胞。
  98. ＣＩＩＴＡを標的化するための前記少なくとも１つのガイドリボ核酸配列が、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択される、請求項９７に記載の単離された細胞。
  99. 前記レアカットエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質またはＢ２Ｍを標的化するＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項９４または９５に記載の単離された細胞。
  100. Ｂ２Ｍを標的化する前記Ｃａｓタンパク質によって認識された少なくとも１つのガイドリボ核酸配列をさらに含む、請求項９９に記載の単離された細胞。
  101. Ｂ２Ｍを標的化するための前記少なくとも１つのガイドリボ核酸配列が、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択される、請求項１００に記載の単離された細胞。
  102. 前記レアカットエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質またはＮＬＲＣ５を標的化するＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項９４または９５に記載の単離された細胞。
  103. ＮＬＲＣ５を標的化する前記Ｃａｓタンパク質によって認識された少なくとも１つのガイドリボ核酸配列をさらに含む、請求項１０２に記載の単離された細胞。
  104. ＮＬＲＣ５を標的化するための前記少なくとも１つのガイドリボ核酸配列が、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号３６３５３～８１２３９からなる群から選択される、請求項１０３に記載の単離された細胞。
  105. ＣＩＩＴＡの発現を低下させるための遺伝子発現改変をさらに含む、請求項８２～１０４のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  106. Ｂ２Ｍの発現を低下させるための遺伝子発現改変をさらに含む、請求項８２～１０５のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  107. ＮＬＲＣ５の発現を低下させるための遺伝子発現改変をさらに含む、請求項８２～１０６のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  108. 前記遺伝子発現改変が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および別のＲＮＡ媒介阻害分子からなる群から選択される１つを含む、請求項１０５～１０７のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  109. ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される外因性免疫調節因子をさらに含む、請求項８２～１０８のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  110. ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の外因性免疫調節因子をさらに含む、請求項８２～１０９のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  111. 前記細胞が、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、および成体幹細胞からなる群から選択される、請求項８２～１１０のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  112. 分化条件下で請求項８２～１１１のいずれか一項に記載の幹細胞から生成された、単離された細胞。
  113. 前記細胞が、低免疫原性である、請求項８２～１１２のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  114. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドを含む幹細胞を調製する方法であって、前記方法が、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤ２４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入することを含む、方法。
  115. 前記ＣＤ２４ポリペプチドが、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１からなる群から選択される、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記発現ベクターが、誘導性発現ベクターである、請求項１１４または１１５に記載の方法。
  117. 前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１１４～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記発現ベクターが、セーフハーバー遺伝子座を特異的に標的化する、請求項１１４～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記セーフハーバー遺伝子座が、ＡＡＶＳ１遺伝子座である、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼを、前記細胞に導入することをさらに含む、請求項１１４～１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記Ｂ２Ｍ遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼを細胞に導入することをさらに含む、請求項１１４～１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. 前記ＮＬＲＣ５遺伝子を選択的に不活性化するレアカットエンドヌクレアーゼを細胞に導入することをさらに含む、請求項１１４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. 前記レアカットエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１２０～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を導入することをさらに含み、前記レアカットエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１２０または１２３に記載の方法。
  125. 前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的化するための前記少なくとも１つのガイドリボ核酸配列が、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択される、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を導入することをさらに含み、前記レアカットエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１２１または１２３に記載の方法。
  127. 前記Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための前記少なくとも１つのガイドリボ核酸配列が、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択される、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を導入することをさらに含み、前記レアカットエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１２２または１２３に記載の方法。
  129. 前記ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための前記少なくとも１つのガイドリボ核酸配列が、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号３６３５３～８１２３９からなる群から選択される、請求項１２８に記載の方法。
  130. ＣＩＩＴＡの発現を低下させるために遺伝子発現改変分子を前記細胞に導入することをさらに含み、前記遺伝子発現改変分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびＣＩＩＴＡを特異的に標的化する別のＲＮＡ媒介阻害分子からなる群から選択される１つを含む、請求項１１４～１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. Ｂ２Ｍの発現を低下させるために遺伝子発現改変分子を前記細胞に導入することをさらに含み、前記遺伝子発現改変分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびＢ２Ｍを特異的に標的化する別のＲＮＡ媒介阻害分子からなる群から選択される１つを含む、請求項１１４～１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. ＮＬＲＣ５の発現を低下させるために遺伝子発現改変分子を前記細胞に導入することをさらに含み、前記遺伝子発現改変分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびＮＬＲＣ５を特異的に標的化する別のＲＮＡ媒介阻害分子からなる群から選択される１つを含む、請求項１１４～１３１のいずれか一項に記載の方法。
  133. ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１－阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される免疫寛容原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入することをさらに含む、請求項１１４～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 少なくとも２つの発現ベクターを導入することをさらに含み、前記第１の発現ベクターが、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１－阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される第１の免疫寛容原性ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、前記第２の発現ベクターが、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１－阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される異なる免疫寛容原性ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、請求項１１４～１３３のいずれか一項に記載の方法。
  135. 前記発現ベクター、前記第１の発現ベクター、および／または前記第２の発現ベクターが、誘導性発現ベクターである、請求項１３３または１３４に記載の方法。
  136. 前記発現ベクター、前記第１の発現ベクター、および／または前記第２の発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１３３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記発現ベクター、前記第１の発現ベクター、および／または前記第２の発現ベクターが、セーフハーバー遺伝子座を特異的に標的化する、請求項１３３～１３６のいずれか一項に記載の方法。
  138. 前記セーフハーバー遺伝子座が、ＡＡＶＳ１遺伝子座である、請求項１３７に記載の方法。
  139. 誘導性自殺スイッチを含む発現ベクターを前記幹細胞に導入することをさらに含む、請求項１１４～１３８のいずれか一項に記載の方法。
  140. 前記幹細胞が、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、および成体幹細胞からなる群から選択される、請求項１１４～１３９のいずれか一項に記載の方法。
  141. 前記幹細胞が、改変されていない幹細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、請求項１１４～１４０のいずれか一項に記載の方法。
  142. 前記幹細胞が、改変されていない幹細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、請求項１１４～１４１のいずれか一項に記載の方法。
  143. 前記幹細胞が、改変されていない幹細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩヒト白血球抗原の低下した発現を有する、請求項１１４～１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 前記幹細胞が、低免疫原性である、請求項１１４～１４３のいずれか一項に記載の方法。
  145. 分化細胞を調製する方法であって、分化条件下で、請求項１１４～１４４のいずれか一項に記載の方法に従って調製された幹細胞を培養し、それにより分化細胞を調製することを含む、方法。
  146. 前記分化条件が、幹細胞を、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、および内皮細胞からなる群から選択される細胞型に分化させるのに適切である、請求項１４５に記載の方法。
  147. 細胞療法を必要とする患者を治療する方法であって、請求項１４５または１４６に記載の方法に従って調製された分化細胞の集団を投与することを含む、方法。
  148. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原を発現する、幹細胞。
  149. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原を発現する、幹細胞。
  150. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドならびに低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩヒト白血球抗原を発現する、幹細胞。
  151. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび低下した発現レベルのＣＩＩＴＡを発現する、幹細胞。
  152. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび低下した発現レベルのＢ２Ｍを発現する、幹細胞。
  153. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび低下した発現レベルのＮＬＲＣ５を発現する、幹細胞。
  154. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドならびに低下した発現レベルのＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、およびそれらの組み合わせを発現する、幹細胞。
  155. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子とを発現する、幹細胞。
  156. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＣＩＩＴＡとを発現する、幹細胞。
  157. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＢ２Ｍとを発現する、幹細胞。
  158. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＮＬＲＣ５とを発現する、幹細胞。
  159. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、およびそれらの組み合わせとを発現する、幹細胞。
  160. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原を発現する幹細胞から生成された、分化細胞。
  161. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原を発現する幹細胞から生成された、分化細胞。
  162. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドならびに低下した発現レベルのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩヒト白血球抗原を発現する幹細胞から生成された、分化細胞。
  163. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび低下した発現レベルのＣＩＩＴＡを発現する幹細胞から生成された、分化細胞。
  164. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび低下した発現レベルのＢ２Ｍを発現する幹細胞から生成された、分化細胞。
  165. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドおよび低下した発現レベルのＮＬＲＣ５を発現する幹細胞から生成された、分化細胞。
  166. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドならびに低下した発現レベルのＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、およびそれらの組み合わせを発現する幹細胞から生成された、分化細胞。
  167. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子とを発現する幹細胞から生成された、分化細胞。
  168. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＣＩＩＴＡとを発現する幹細胞から生成された、分化細胞。
  169. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＢ２Ｍとを発現する幹細胞から生成された、分化細胞。
  170. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＮＬＲＣ５とを発現する幹細胞から生成された、分化細胞。
  171. 外因性ＣＤ２４ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子と、低下した発現レベルのＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、およびそれらの組み合わせとを発現する幹細胞から生成された、分化細胞。
  172. 前記細胞が、低免疫原性である、請求項１４８～１５９のいずれか一項に記載の幹細胞。
  173. 前記細胞が、低免疫原性である、請求項１６０～１７２のいずれか一項に記載の分化細胞。
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