CN111187751A

CN111187751A - 一种用于构建幼畜心肌炎细胞模型的细胞系及构建方法

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Publication number: CN111187751A
Application number: CN202010061679.0A
Authority: CN
Inventors: 王光祥; 王艳华; 张志东; 李彦敏; 杨能能
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2020-05-22

Abstract

本发明公开了一种用于幼畜心肌炎细胞模型的细胞系，属于生物医学技术领域。所述细胞系为豚鼠心肌细胞，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201932。同时提供了一种利用该细胞系建立口蹄疫病毒致幼畜心肌炎细胞模型的方法。与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明的细胞模型建立方法具有很好的重复性，在口蹄疫病毒易感试验动物——豚鼠心肌原代细胞获得后，可以直接使用口蹄疫病毒感染心肌原代细胞模型，进而在细胞水平和分子水平上对口蹄疫病毒对幼畜心肌炎致病机制进行深入研究。具有经济、省时、表现均一，且重复性好的优点。

Description

一种用于构建幼畜心肌炎细胞模型的细胞系及构建方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，更具体的说是涉及一种用于构建幼畜心肌炎细胞模型的细胞系及构建方法。

背景技术

口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot and mouthdisease virus,FMDV)感染动物引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。反刍动物、猪及超过70多种野生动物都易感FMDV，由于其传播速度快、感染性强，造成严重的经济和社会问题。

FMDV除引起偶蹄动物蹄、唇部水泡外还可引起幼畜的急性死亡，其致幼畜死亡的最主要原因是急性心肌炎。FMDV感染幼畜心脏致使心肌变性、坏死而出现灰白色或淡灰色斑点和条纹(又称虎斑心)多不表现出FMD特有的临床症状而急性死亡。在兽医临床上常见仔猪、羔羊和育肥牛因感染FMDV导致急性心肌炎而大批死亡的病例报道。

FMDV感染幼畜后导致心肌炎，但国内外关于口蹄疫病毒致幼畜心肌炎的致病机制研究都停留在组织水平。病毒感染引起心肌炎的发病机制尚不明确，目前普遍认为病毒性心肌炎，致病机制主要为：(1)病毒对心肌直接损伤；(2) 心肌细胞感染病毒后免疫损伤；(3)病毒感染细胞所致的心肌细胞凋亡。而关于FMDV致幼畜心肌炎致病机制细胞水平和分子水平的研究至今仍是空白。其原因主要是口蹄疫病毒致幼畜心肌炎细胞模型的建立存在困难，构建的细胞模型个体差异大、批次间差异大、对病毒不敏感，使研究心肌炎致病分子机制受到了限制。通常认为,成熟的心肌细胞是终末分化型细胞,不具备有丝分裂能力。成年动物心肌细胞中约有15％～20％较年轻的心肌细胞,保留着增殖的能力。但心肌细胞增殖潜能的大小尚未知晓,缺乏形态学和生物学资料，心肌细胞不易培养。

因此，提供一种差异小、对病毒敏感的构建幼畜心肌炎细胞模型的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种用于构建幼畜心肌炎细胞模型的细胞系及构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种豚鼠心肌细胞系，所述细胞系为豚鼠心肌细胞系，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2019年3月1 日，保藏编号为CCTCC NO：C201932，分类命名为豚鼠心肌细胞GPCM(Guinea pig Cardiomyocyte GPCM)。

豚鼠心肌细胞系在构建幼畜心肌炎细胞模型中的应用。

本发明所述豚鼠心肌细胞，可以直接使用口蹄疫病毒感染心肌原代细胞模型，进而在细胞水平和分子水平上对口蹄疫病毒对幼畜心肌炎致病机制进行深入研究。具有经济、省时、表现均一，且重复性好的优点。

优选的，包括如下步骤：

(1)向权利要求1所述细胞系中接种口蹄疫病毒，25cm²/瓶接种口蹄疫病毒液1毫升，吸附10～30分钟后加心肌细胞培养基CMM，调pH至7.0～7.2，之后加入加青霉素、链霉素各100IU/ml，于37℃、5％CO₂浓度培养箱中进行培养；

(2)经步骤(1)培养至细胞病变达到75％以上时，置-20℃反复冻融两次，待无菌检验、支原体检验、外源病毒检验合格后，幼畜心肌炎细胞模型构建完成。

优选的，步骤(1)所述口蹄疫病毒为O型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒或 Asia I型口蹄疫病毒。

优选的，步骤(2)所述所述幼畜心肌炎模型的病毒TCID₅₀≥6.00。

优选的，所述幼畜心肌炎细胞模型中的肌钙蛋白I、肌红蛋白浓度为与未接种细胞系中浓度相比均达到2倍以上。

一般认为病毒性心肌炎发病早期,病毒及其毒素进入血液循环形成病毒血症，其后病毒侵入心肌细胞增殖直接损害心肌，或通过触发机体免疫反应引起心肌细胞损伤。组织学特征为间质水肿，炎性细胞浸润，心肌细胞变性、凋亡、坏死及晚期纤维化形成瘢痕。由于病变部位供氧减少，细胞膜通透性增加，致使心肌细胞中蛋白标志物：肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(MYO)和肌酸激酶同工酶MB质量(CK-MB mass)和四种酶(肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸氨基转移酶(AST))等不断地释放入血而使其含量增高，检测血中这些物质的含量或活性，能够了解心肌细胞损伤与否及损伤的程度。心肌肌钙蛋白(cTn)是由三种不同基因控制的亚单位组成的蛋白复合物，包括cTnI、cTnT和cTnC。cTnI是心肌纤维上专有的收缩蛋白，其绝对的心肌特异性可以完全区分心肌和骨骼肌的损伤，并且在正常的血循环中不会出现，因此它更适合检测心肌坏死。MYO是一种含有亚铁血红素的氧结合蛋白，广泛分布于心肌和骨骼肌中，是即时的最易检出的心肌坏死时的生化标志物。CK-MB 主要位于心肌细胞中，多年来一直认为测定CK-MB是判断心肌损伤的重要检测手段。最初选用免疫抑制技术来测定CK-MB活性，但样品中的CK-BB、腺苷酸环化酶和巨CK等不能被抗-M抗体所中和，常引起CK-MB假性增高。因此，目前在人医临床上将肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(MYO)检测作为病毒性心肌炎检测金标准。综上所述，本发明在评估口蹄疫病毒致幼畜心肌炎细胞模型时将检测细胞培养上清中的肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(MYO)浓度，作为细胞模型的指标。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明的细胞模型建立方法具有很好的重复性，在口蹄疫病毒易感试验动物——豚鼠心肌原代细胞获得后，可以直接使用口蹄疫病毒感染心肌原代细胞模型，进而在细胞水平和分子水平上对口蹄疫病毒对幼畜心肌炎致病机制进行深入研究。具有经济、省时、表现均一，且重复性好的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1中豚鼠心肌原代细胞形态，其中A为培养第3 天的豚鼠心肌细胞；B为培养第4天的豚鼠心肌细胞；C为豚鼠心肌细胞吉姆萨染色结果；D为豚鼠心肌细胞HE染色结果。

图2附图为本发明实施例1中豚鼠心肌原代细胞鉴定，其中A为豚鼠心肌细胞间接免疫荧光；B为豚鼠心肌细胞间接免疫荧光和可视细胞叠加图；C为 BHK21细胞间接免疫荧光。

图3附图为本发明实施例2中豚鼠心肌原代细胞接种O型口蹄疫病毒后不同时间段细胞病变(CPE)，其中A为接种病毒后8h心肌细胞的CPE；B为接种病毒后12h心肌细胞的CPE；C为接种病毒后16h心肌细胞的CPE；D为豚鼠心肌对照细胞。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1豚鼠乳鼠心肌原代细胞的分离、培养及鉴定

(1)豚鼠乳鼠心肌原代细胞的制备

选取1日龄处死豚鼠乳鼠，在无菌条件下，摘取心脏，剥离心包膜，剪取心室组织，用加双抗D-hanks洗涤心室组织2～3次，剔除纤维结缔组织，只留心肌组织，将心肌组织剪成1～3mm的小块。加入D-hanks继续清洗，直至 D-hanks清亮干净，将清洗后心肌组织块放入离心管中，加入其10倍体积的复合酶消化液(复合酶消化液含0.1％质量浓度的Ⅱ型胶原酶和0.25％质量浓度的胰酶)，于4℃条件下消化12小时或过夜，用等体积的含10％血清的DMEM培养液终止消化。用吸管吹打数次后，用200目不锈钢网过滤。收集消化液于 1000rpm/min条件下离心10min，弃上清，之后用无血清培养液漂洗2次，加入含20％胎牛血清的CMM培养液制成心肌原代细胞悬液。台盼蓝染色判断细胞活力，血细胞计数板计数，当活细胞数达到90％以上时，进行心肌原代细胞的进一步分离纯化培养。

选择出生一日龄的豚鼠，同时选择心肌细胞培养基(CMM),来解决心肌细胞不容易培养的问题。

(2)心肌原代细胞的分离纯化培养

将心肌原代细胞悬液以5×10⁵个/ml的密度接种到培养瓶中，在5％CO₂、 37℃、饱和湿度培养箱中培养1h后，将培养上清吸出加入另一细胞瓶继续培养 1h后，将培养上清吸出，加入无菌离心管中以1000rpm/min离心10分钟，用含 20％FBS、0.1mM/L的5-嗅脱氧尿嘧啶(5-BrdU)的心肌细胞培养基CMM重悬细胞，以2×10⁵个细胞/ml浓度接种到培养瓶中，在5％CO₂、37℃、饱和湿度培养箱中培养。培养24h后更换成含20％FBS的心肌细胞培养基CMM，继续培养3～5日后，进行心肌细胞形态观察和鉴定。

(3)心肌细胞鉴定

①鉴定项目：体内成熟的心肌细胞呈圆杆状，沿一定方向排列，核椭圆，位于胞体中央。胚胎或新生心肌细胞呈圆形或卵圆形，核圆。二维培养条件下心肌细胞形态各异，镜下观察依据细胞形态很难将其与其它类型的细胞区别开来。节律性搏动是心肌细胞的特征之一。此外，特异性蛋白的免疫细胞化学染色是细胞鉴定的常用方法。中间纤维是细胞骨架中最稳定的成分，结蛋白 (Desmin)是心肌细胞中间纤维的主要成分，占其中的90％，该蛋白存在于横纹肌和各种平滑肌中。a-横纹肌肌动蛋白(a-Sareomeriaetin)仅存在于心肌和骨骼肌细胞中，不存在于平滑肌中。所以，利用免疫化学方法检测a-横纹肌肌动蛋白(a-Sareomeriaetin actin)来鉴定心肌细胞。

②鉴定方法：首先在6孔细胞培养皿中放入细胞爬片，接种细胞后培养4d，取出细胞爬片，用新鲜配制的50g/L多聚甲醛固定10min；PBS漂洗3次×5min；封闭山羊血清室温下孵育20min；a-Sareomeriaetin(abcam公司产品，1∶100稀释)鼠源单克隆抗体的一抗混合工作液，37℃孵育3h，PBS漂洗3次×5min；加入FITC标记山羊抗鼠IgG(abcam公司产品，1∶50稀释)二抗混合工作液37℃孵育30min，PBS漂洗3次×5min，荧光显微镜下随机选择10个视野，绿色荧光下观察心肌细胞染色结果，计算每视野中a-Sareomeriaetin阳性细胞和细胞总数，计算心肌细胞纯度。

③鉴定结果：

分离纯化培养的豚鼠心肌原代细胞呈长梭形或多角形、胞核小、胞浆致密。传代的心肌细胞未呈圆形，贴壁后生长逐渐呈梭形、多角形，胞核1～2个、呈圆形、具有1～2清晰的核仁，单个细胞自行蠕动，当生长成片后可见呈岛屿状搏动，搏动频率30～60次/min。

由图1A、B可知，培养3～5天铺满单层；由图1C结果可知，姆萨染色细胞核染成紫蓝色，细胞质染成淡紫色；由图1D可知，HE染色细胞形态饱满、细胞膜完整；透射电镜观察细胞完整，胞膜皱褶整齐，细胞中肌丝、线粒体清晰、分布均匀，细胞核完整。

由图2可知，间接免疫荧光检测心肌细胞特异的α-横纹肌肌动蛋白，分离纯化培养的心肌细胞，几乎都看到绿色荧光，而用BHK21(成纤维细胞)做阴性对照的细胞检测不到荧光，说明该方法较特异，分离纯化的豚鼠心肌细胞纯度较高。

将上述分离纯化的豚鼠心肌细胞进行保藏，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201932。

实施例2 O型口蹄疫病毒对豚鼠乳鼠心肌原代细胞的感染

(1)O型口蹄疫病毒对豚鼠心肌原代细胞的感染

用O型口蹄疫病毒(O/China/99/F13)接种铺满单层的豚鼠乳鼠心肌原代细胞，每瓶(75mL细胞瓶)接种1mL，同时设置对照组(加无血清心肌细胞培养基 CMM)。37℃、5％CO₂培养箱中培养感染1h，之后加入DMEM维持液9mL，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养观察。之后每隔1h观察培养过程豚鼠乳鼠心肌原代细胞的形态变化，感染O型口蹄疫病毒后细胞病变(cytopathic effect,CPE) 程度，CPE表示法:(±)<25％，(+)25％～50％，(++)51％～75％，(+++)>75％，(++++) 近100％。结果如图3所示。

由图3结果可知，接种O型口蹄疫病毒后8h，接种豚鼠乳鼠心肌原代细胞出现CPE，细胞变圆，成葡萄状分布，最终细胞崩解成碎片。16h病毒细胞CPE 达到80％以上，细胞单层脱落形成空斑。

收毒，冻融两次，测定病毒TCID₅₀为10^-6.0。说明，O型口蹄疫病毒对豚鼠乳鼠心肌原代细胞具有致病性。

(2)O型口蹄疫病毒感染后豚鼠乳鼠心肌原代细胞的形态学观察及心肌损伤标志物检测

将分离纯化的同代次的豚鼠乳鼠心肌原代细胞同时接种O型口蹄疫13代细胞毒(FMDV O/China/99/F13)，每瓶(75mL细胞瓶)接种1mL，同时设置对照组。在37℃、5％CO₂培养箱中培养感染1h，加DMEM维持液9mL。然后放 37℃、5％CO₂培养箱中继续培养。在继续培养3h、6h、12h、18h四个时间点分别采用全自动生化分析仪(美国Beckman公司)测定感染前后培养液中肌钙蛋白I (cTnI)、肌红蛋白(MYO)水平。数据均以x-±s表示,采用同批组间资料t检验。检测结果如表1所示。

表1 O型口蹄疫病毒感染心肌细胞后cTnI、MYO、CK-MB mass检测结果

注：cTnI＞0.1μg/L为阳性；CK-MB＞25IU/L为阳性；MYO＞85μg/L为阳性。

由表1结果可知，感染O型口蹄疫病毒后6h时，MYO和CK-MB mass检测为阳性，cTnI检测为阴性；到12h时后cTnI、MYO、CK-MBmass检测均为阳性。cTnI、MYO、CK-MBmass在细胞培养上清中浓度升高与心肌损伤程度大致平行，这就证明，O型口蹄疫病毒感染豚鼠心肌细胞后直接导致了心肌细胞的损伤。

实施例3 A型和AsiaI型口蹄疫病毒对豚鼠心肌原代细胞的感染

用A型口蹄疫病毒(FMDVA/HuBWH/CHA/2009/F18)和AsiaI型口蹄疫病毒(FMDVAsiaI/JSWX/F15)分别接种铺满单层的豚鼠乳鼠心肌原代细胞，每瓶(75mL细胞瓶)接种1mL，并设置对照组。37℃、5％CO₂培养箱中培养感染 1h，加DMEM维持液9mL。继续于37℃、5％CO₂培养箱中培养观察。每隔 1h观察培养过程形态变化，感染口蹄疫病毒后细胞病变(cytopathic effect,CPE) 程度，CPE表示法:(±)<25％，(+)25％～50％,(++)51％～75％,(+++)>75％,(++++) 近100％。

接毒后8～10h，接种细胞出现CPE，细胞变圆，成葡萄状分布，最终细胞崩解成碎片。16h病毒细胞达到80％以上，细胞单层脱落形成空斑。收毒，冻融两次，测定病毒TCID50均在为10^-6以上。说明，口蹄疫病毒对分离纯化培养的豚鼠心肌原代的CPE不分病毒型。

综上所述，该细胞模型的建立是成功的。利用该模型可以在细胞水平和分子水平上对口蹄疫致幼畜心肌炎致病机制进行更深入的研究。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种豚鼠心肌细胞系，其特征在于，所述细胞系为豚鼠心肌细胞系，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201932。

2.如权利要求1所述的豚鼠心肌细胞系在构建幼畜心肌炎细胞模型中的应用。

3.如权利要求2所述的豚鼠心肌细胞系在构建幼畜心肌炎细胞模型中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)向权利要求1所述细胞系中接种口蹄疫病毒，25cm²/瓶接种口蹄疫病毒液1毫升，吸附10～30分钟后加心肌细胞培养基CMM 10mL，调pH至7.0～7.2，之后加入加青霉素、链霉素各100IU/ml，于37℃、5％CO₂浓度培养箱中进行培养；

4.如权利要求2所述的豚鼠心肌细胞系在构建幼畜心肌炎细胞模型中的应用，其特征在于，步骤(1)所述口蹄疫病毒为O型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒或AsiaI型口蹄疫病毒。

5.如权利要求2所述的豚鼠心肌细胞系在构建幼畜心肌炎细胞模型中的应用，其特征在于，步骤(2)所述所述幼畜心肌炎模型的病毒TCID₅₀≥6.00。

6.如权利要求2所述的豚鼠心肌细胞系在构建幼畜心肌炎细胞模型中的应用，其特征在于，所述幼畜心肌炎细胞模型中的肌钙蛋白I、肌红蛋白浓度为与未接种细胞系中浓度相比均达到2倍以上。