CN105193847A - 一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂及其制备方法和医用敷料 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂及其制备方法和医用敷料。本发明提供的凝胶制剂，包括脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂。本发明开创性的采用脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂制成干细胞凝胶制剂，该制剂使用时不需要经过静脉回注，仅需要敷贴在创口处，进行简单包扎即可对创口起到修复效果。由于本发明提供的干细胞制剂不需要采用静脉回注的方式进行施药，因此避免了静脉回注造成的制剂中干细胞大量流失，从而使干细胞制剂表现出较好的创口修复效果。实验结果表明，将含有本发明提供的凝胶制剂的医用敷料敷贴在创口表面后，7d的创口愈合率大于80±7％，说明本发明提供的凝胶制剂对创口具有较好的修复效果。

Description

一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂及其制备方法和医用敷料

技术领域

本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂及其制备方法和医用敷料。

背景技术

干细胞是一种具有自我复制和分化潜能的细胞，多呈圆形或椭圆形，体积小，胞浆少，核/质比大。干细胞增殖速度较慢，自稳性好，利于自我复制和维持。由于增殖速度缓慢，使干细胞有充足的时间发现和纠正复制错误，避免自我突变，以便稳步进入特定的分化程序。一旦机体需要时，干细胞就可进入分化状态，此时增殖速度开始逐渐加快，以适应组织器官生长，发育和修复的需要。

干细胞根据分化潜能，可分为：1)单能干细胞：指干细胞分裂产生的子细胞只能分化成单一功能类型的细胞，如表皮干细胞只能分化产生角化表皮细胞，精原细胞只能分化产生精子；2)多能干细胞：指可具有分化成一种器官的两种或多种组织潜能的干细胞，如骨髓造血干细胞可分化产生定向干细胞，进一步分化后可产生红系、髓系、粒系等12种类型的血细胞，已用于治疗血液病；3)全能干细胞：指具有无限分化潜能的干细胞，如桑梓胚期、囊胚期胚胎干细胞可分为化成任何一种组织类型，可形成胚体、胚后期组织和器官，已用于转基因动物和克隆动物器官。

由于干细胞具有自我复制和分化的潜能，因此其对组织器官的损伤具有较好的修复效果。近年来，已有研究人员将干细胞制成液体制剂，并将其应用于创口的修复。但液体制剂需要采用静脉回注的方式进行使用，这种使用方式会导致制剂中的干细胞随血液流动而流失，使得制剂中的干细胞只有一部分能够归巢到“目的地”，从而降低了制剂对创口的修复效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂及其制备方法和医用敷料，本发明提供的凝胶制剂对创口的修复效果较好。

本发明提供了一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂，包括脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂。

优选的，所述脂肪干细胞在所述凝胶制剂中的含量为5×10⁵～5×10⁶个/mL。

优选的，所述白蛋白在所述凝胶制剂中的含量为5～20ng/mL。

优选的，所述明胶在所述凝胶制剂中的含量为30～50wt％。

本发明提供了一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：

a)、脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂混合，得到含有脂肪干细胞的凝胶制剂。

优选的，所述步骤a)具体为：

a1)、脂肪干细胞、白蛋白和部分溶剂混合，得到含白蛋白的脂肪干细胞悬液；

a2)、含白蛋白的脂肪干细胞悬液、明胶和余量的溶剂混合，得到含有脂肪干细胞的凝胶制剂。

优选的，所述脂肪干细胞按照以下方法获得：

b)、脂肪组织依次进行消化处理和离心分离，得到脂肪干细胞。

优选的，获得脂肪干细胞后，对其进行传代培养，获得P2～P5代脂肪干细胞。

本发明提供了一种医用敷料，包括：

医用敷料原料；

复合在医用敷料原料表面的修复层；

所述修复层由上述技术方案所述的凝胶制剂上述技术方案所述的方法制得凝胶制剂在医用敷料原料表面涂覆后，经过固化成形得到。

优选的，所述凝胶制剂在医用敷料表面的涂覆量为0.5～5mL/cm²。

与现有技术相比，本发明提供了一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂及其制备方法和医用敷料。本发明提供的凝胶制剂，包括脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂。本发明开创性的采用脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂制成干细胞凝胶制剂，该制剂使用时不需要经过静脉回注，仅需要敷贴在创口处，进行简单包扎即可对创口起到修复效果。由于本发明提供的干细胞制剂不需要采用静脉回注的方式进行施药，因此避免了静脉回注造成的制剂中干细胞大量流失，从而使干细胞制剂表现出较好的创口修复效果。实验结果表明，将含有本发明提供的凝胶制剂的医用敷料敷贴在创口表面后，7d的创口愈合率大于80±7％，说明本发明提供的凝胶制剂对创口具有较好的修复效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例7提供的在×4倍率下观察到的P2代脂肪干细胞的细胞形貌；

图2是本发明实施例7提供的在×10倍率下观察到的P2代脂肪干细胞的细胞形貌；

图3是本发明实施例7提供的在×4倍率下观察到的P5代脂肪干细胞的细胞形貌；

图4是本发明实施例7提供的在×10倍率下观察到的P5代脂肪干细胞的细胞形貌。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂，包括脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂。

本发明提供的凝胶制剂包括脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂。其中，所述脂肪干细胞是本发明提供的凝胶制剂的主要活性组分。在本发明中，所述脂肪干细胞的主要作用是通过与凝胶制剂中的其他组分协同作用实现创口部位的组织再生，从而达到修复创口的目的。在本发明提供的一个实施例中，所述脂肪干细胞在所述凝胶制剂中的含量为10⁴～10⁸个/mL；在本发明提供的另一个实施例中，所述脂肪干细胞在所述凝胶制剂中的含量为10⁵～10⁷个/mL；在本发明提供的其他实施例中，所述脂肪干细胞在所述凝胶制剂中的含量为5×10⁵～5×10⁶个/mL。

本发明对所述脂肪干细胞的来源没有特别限定，采用本领域技术人员熟知的脂肪干细胞的获取方式获得脂肪干细胞即可。在本发明提供的一个实施例中，可以按照以步骤获得脂肪干细胞：

脂肪组织依次进行消化处理和离心分离，得到脂肪干细胞。

在本发明提供的上述脂肪干细胞的获得方式中，首先对脂肪组织进行消化处理。所述消化处理使用的消化液优选为I型胶原酶溶液，所述I型胶原酶溶液中I型胶原酶的含量优选为0.1～0.5g/100mL，更优选为0.25g/100mL。所述消化处理的时间优选为0.5～2h，更优选为1～1.5h。所述消化处理的温度优选为30～40℃，更优选为37℃。消化处理结束后，向消化处理后的脂肪组织中加入培养液终止消化。所述终止消化所用的培养液优选为胎牛血清(FetalBovineSerum，简称FBS)。终止消化的脂肪组织进行离心分离。所述离心分离的离心力优选为100～400g，更优选为200～300g。所述离心分离的时间优选为3～10min，更优选为5～6min。离心分离结束后，弃上两层液体，剩余的细胞沉淀即为脂肪干细胞。

在本发明中，为了提高获得的脂肪干细胞的纯净度，优选对所述细胞沉淀进行重悬和离心分离。所述重悬采用的试剂优选为生理盐水。所述离心分离的离心力优选为100～400g，更优选为200～300g；所述离心分离的时间优选为3～10min，更优选为5～6min。离心分离结束后，弃上清，剩余的细胞沉淀即为纯净度较高的脂肪干细胞。

在本发明中，优选对获得的脂肪干细胞进行传代培养，获得P2～P5代脂肪干细胞，该过程具体为：

首先，将所述脂肪干细胞与培养液混合，得到细胞悬液。所述培养液优选为含胎牛血清(FetalBovineSerum，简称FBS)的DMEM-F12培养液。所述FBS在培养液中体积百分浓度优选为5～20％，更优选为10～15％。所述细胞悬液中的细胞密度优选为10⁴～10⁶个/mL，更优选为1×10⁵～3×10⁵个/mL。然后，对得到的细胞悬液进行培养。培养所述细胞悬液的温度优选为37℃；培养所述细胞悬液的CO₂体积浓度优选为5％；培养所述细胞悬液的湿度优选为95％～饱和湿度。培养过程中，需要定期更换培养液，优选在培养24h后首次更换培养液，之后每3～5d更换一次培养液。随着培养时间的推移，细胞悬液中的细胞融合度不断升高，待细胞融合度符合要求后，弃细胞悬液中的培养液。在本发明中，优选待细胞融合度达到80％后弃细胞悬液中的培养液。细胞悬液弃培养液之后，向其中加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)，之后弃PBS，反复数次。接着，对经过PBS处理的细胞进行消化处理。所述消化处理采用的消化液优选为胰酶消化液。所述胰酶消化液中胰酶的含量优选为0.1～0.5g/100mL，更优选为0.25g/100mL。所述消化处理的时间优选为1～5min，更优选为2～3min。消化处理过程中，脂肪干细胞的皱缩逐渐变圆，待细胞皱缩变圆后，使用培养液重悬脂肪干细胞，终止消化。所述培养液优选为含FBS的DMEM-F12培养液，其中，FBS在培养液中体积百分浓度优选为5～20％，更优选为10～15％。终止消化后，细胞悬液进行离心分离，所述离心分离的转速优选为1000～2000rpm/min，更优选为1500～1800rpm/min；所述离心分离的时间优选为2～10min，更优选为5～6min。离心分离后，弃上清，剩余的细胞沉淀使用培养液重悬，所述培养液优选为含FBS的DMEM-F12培养液，其中，FBS在培养液中体积百分浓度优选为5～20％，更优选为10～15％。重悬得到的细胞悬液中细胞的密度优选为5×10³～5×10⁴个/mL。之后对重悬得到的细胞悬液继续进行培养，细胞悬液中的细胞培养P2～P5代后，收集培养的细胞，即为P2～P5代脂肪干细胞。

在本发明中，优选对收集到的P2～P5代脂肪干细胞进行后处理，该过程具体为：

取所述P2～P5代脂肪干细胞进行消化处理。所述消化处理采用的消化液优选为胰酶消化液。所述胰酶消化液中胰酶的含量优选为0.1～0.5g/100mL，更优选为0.25g/100mL。之后使用培养液重悬脂肪干细胞，终止消化。所述培养液优选为含FBS的DMEM-F12培养液，所述FBS在培养液中体积百分浓度优选为5～20％，更优选为10～15％。最后对终止消化得到的细胞悬液进行离心分离，所述离心分离的转速优选为1000～2000rpm/min，更优选为1500～1800rpm/min；所述离心分离的时间优选为2～10min，更优选为5～6min。离心分离后，弃上清，剩余的细胞沉淀即为后处理的P2～P5代脂肪干细胞。

在本发明中，所述白蛋白又称清蛋白，其在本发明中的主要作用一方面是通过与制剂中的其他组分协同作用实现创口部位的组织再生，从而达到修复创口的目的；另一方面是为脂肪干细胞提供营养成分，提脂肪干细胞在凝胶制剂中的存活率的，进而提升凝胶制剂对创口的修复效果。在本发明提供的一个实施例中，所述白蛋白在所述凝胶制剂中的含量为1～50ng/mL；在本发明提供的另一个实施例中，所述白蛋白在所述生物制剂中的含量为5～20ng/mL。本发明对所述白蛋白的来源没有特别限定，采用市售商品即可。

在本发明中，所述明胶在本发明中的主要作用一方面是通过与制剂中的其他组分协同作用实现创口部位的组织再生，从而达到修复创口的目的；另一方面是提高本发明提供的制剂的黏度，使其成为固体状态。在本发明提供的一个实施例中，所述明胶在所述凝胶制剂中的含量为20～70wt％；在本发明提供的另一个实施例中，所述明胶在所述生物制剂中的含量为30～50wt％。本发明对所述明胶的来源没有特别限定，采用市售商品即可。

在本发明中，所述溶剂用于溶解生物制剂含有的上述各组分。在本发明提供的一个实施例中，所述溶剂为生理盐水。在本发明中，所述生理盐水是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液。所述生理盐水中氯化钠的浓度通常在0.9wt％左右。

本发明开创性的采用脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂制成干细胞凝胶制剂，该制剂使用时不需要经过静脉回注，仅需要敷贴在创口处，进行简单包扎即可对创口起到修复效果。在凝胶制剂敷贴于创口后，会在创口处逐渐溶解，从而使得制剂中的脂肪干细胞被释放出来，进而分化形成新生组织，实现对创口的修复。由于本发明提供的干细胞制剂不需要采用静脉回注的方式进行施药，因此避免了静脉回注造成的制剂中干细胞大量流失，从而使干细胞制剂表现出较好的创口修复效果。实验结果表明，将含有本发明提供的凝胶制剂的医用敷料敷贴在创口表面后，7d的创口愈合率大于80±7％，说明本发明提供的凝胶制剂对创口具有较好的修复效果。

本发明提供了一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：

a)、脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂混合，得到含有脂肪干细胞的凝胶制剂。

在本发明提供的制备方法中，直接将脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂混合，即可得到含有脂肪干细胞的凝胶制剂，该过程具体为：

a1)、脂肪干细胞、白蛋白和部分溶剂混合，得到含白蛋白的脂肪干细胞悬液；

a2)、含白蛋白的脂肪干细胞悬液、明胶和余量的溶剂混合，得到含有脂肪干细胞的凝胶制剂。

在本发明提供的上述制备方法中，首先将脂肪干细胞、白蛋白和部分溶剂混合。所述脂肪干细胞、白蛋白和部分溶剂混合的具体方式为：先将白蛋白和所述溶剂混合，得到白蛋白溶液；再使用所述白蛋白溶液重悬脂肪干细胞。其中，所述溶剂优选为生理盐水。所述脂肪干细胞优选按照以下方法获得：

b)、脂肪组织依次进行消化处理和离心分离，得到脂肪干细胞。

在本发明提供的上述脂肪干细胞的获得方式中，首先对脂肪组织进行消化处理。所述消化处理使用的消化液优选为I型胶原酶溶液，所述I型胶原酶溶液中I型胶原酶的含量优选为0.1～0.5g/100mL，更优选为0.25g/100mL。所述消化处理的时间优选为0.5～2h，更优选为1～1.5h。所述消化处理的温度优选为30～40℃，更优选为37℃。消化处理结束后，向消化处理后的脂肪组织中加入培养液终止消化。所述终止消化所用的培养液优选为胎牛血清(FetalBovineSerum，简称FBS)。终止消化的脂肪组织进行离心分离。所述离心分离的离心力优选为100～400g，更优选为200～300g。所述离心分离的时间优选为3～10min，更优选为5～6min。离心分离结束后，弃上两层液体，剩余的细胞沉淀即为脂肪干细胞。

在本发明中，为了提高获得的脂肪干细胞的纯净度，优选对所述细胞沉淀进行重悬和离心分离。所述重悬采用的试剂优选为生理盐水。所述离心分离的离心力优选为100～400g，更优选为200～300g；所述离心分离的时间优选为3～10min，更优选为5～6min。离心分离结束后，弃上清，剩余的细胞沉淀即为纯净度较高的脂肪干细胞。

在本发明中，优选对获得的脂肪干细胞进行传代培养，获得P2～P5代脂肪干细胞，该过程具体为：

首先，将所述脂肪干细胞与培养液混合，得到细胞悬液。所述培养液优选为含胎牛血清(FetalBovineSerum，简称FBS)的DMEM-F12培养液。所述FBS在培养液中体积百分浓度优选为5～20％，更优选为10～15％。所述细胞悬液中的细胞密度优选为10⁴～10⁶个/mL，更优选为1×10⁵～3×10⁵个/mL。然后，对得到的细胞悬液进行培养。培养所述细胞悬液的温度优选为37℃；培养所述细胞悬液的CO₂体积浓度优选为5％；培养所述细胞悬液的湿度优选为95％～饱和湿度。培养过程中，需要定期更换培养液，优选在培养24h后首次更换培养液，之后每3～5d更换一次培养液。随着培养时间的推移，细胞悬液中的细胞融合度不断升高，待细胞融合度符合要求后，弃细胞悬液中的培养液。在本发明中，优选待细胞融合度达到80％后弃细胞悬液中的培养液。细胞悬液弃培养液之后，向其中加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)，之后弃PBS，反复数次。接着，对经过PBS处理的细胞进行消化处理。所述消化处理采用的消化液优选为胰酶消化液。所述胰酶消化液中胰酶的含量优选为0.1～0.5g/100mL，更优选为0.25g/100mL。所述消化处理的时间优选为1～5min，更优选为2～3min。消化处理过程中，脂肪干细胞的皱缩逐渐变圆，待细胞皱缩变圆后，使用培养液重悬脂肪干细胞，终止消化。所述培养液优选为含FBS的DMEM-F12培养液，其中，FBS在培养液中体积百分浓度优选为5～20％，更优选为10～15％。终止消化后，细胞悬液进行离心分离，所述离心分离的转速优选为1000～2000rpm/min，更优选为1500～1800rpm/min；所述离心分离的时间优选为2～10min，更优选为5～6min。离心分离后，弃上清，剩余的细胞沉淀使用培养液重悬，所述培养液优选为含FBS的DMEM-F12培养液，其中，FBS在培养液中体积百分浓度优选为5～20％，更优选为10～15％。重悬得到的细胞悬液中细胞的密度优选为5×10³～5×10⁴个/mL。之后对重悬得到的细胞悬液继续进行培养，细胞悬液中的细胞培养P2～P5代后，收集培养的细胞，即为P2～P5代脂肪干细胞。

在本发明中，优选对收集到的P2～P5代脂肪干细胞进行后处理，该过程具体为：

取所述P2～P5代脂肪干细胞进行消化处理。所述消化处理采用的消化液优选为胰酶消化液。所述胰酶消化液中胰酶的含量优选为0.1～0.5g/100mL，更优选为0.25g/100mL。之后使用培养液重悬脂肪干细胞，终止消化。所述培养液优选为含FBS的DMEM-F12培养液，所述FBS在培养液中体积百分浓度优选为5～20％，更优选为10～15％。最后对终止消化得到的细胞悬液进行离心分离，所述离心分离的转速优选为1000～2000rpm/min，更优选为1500～1800rpm/min；所述离心分离的时间优选为2～10min，更优选为5～6min。离心分离后，弃上清，剩余的细胞沉淀即为后处理的P2～P5代脂肪干细胞。

待脂肪干细胞、白蛋白和部分溶剂混合均匀后，得到含白蛋白的脂肪干细胞悬液。将所述含白蛋白的脂肪干细胞悬液与明胶和余量的溶剂进行混合，所述含白蛋白的脂肪干细胞悬液与明胶和余量的溶剂混合的具体方式为：先将明胶和所述溶剂混合，得到明胶溶液；再将所述明胶溶液与含白蛋白的脂肪干细胞悬液混合。其中，所述溶剂优选为水或生理盐水。

待含白蛋白的脂肪干细胞悬液与明胶和余量的溶剂混合均匀后，得到含有脂肪干细胞的凝胶制剂。其中，所述脂肪干细胞在所述凝胶制剂中的含量优选为10⁴～10⁸个/mL，更优选为10⁵～10⁷个/mL，最优选为10⁵～5×10⁶个/mL；所述白蛋白在所述凝胶制剂中的含量优选为1～50ng/mL，更优选为5～20ng/mL；所述明胶在所述凝胶制剂中的含量优选为20～70wt％，更优选为30～50wt％。

采用本发明提供的方法能够制得干细胞凝胶制剂，该制剂使用时不需要经过静脉回注，仅需要敷贴在创口处，进行简单包扎即可对创口起到修复效果。由于本发明提供的方法制得的干细胞制剂不需要采用静脉回注的方式进行施药，因此避免了静脉回注造成的制剂中干细胞大量流失，从而使干细胞制剂表现出较好的创口修复效果。实验结果表明，将含有本发明制得的凝胶制剂的医用敷料敷贴在创口表面后，7d的创口愈合率大于80±7％，说明本发明提供的方法制得的凝胶制剂对创口具有较好的修复效果。

本发明提供了一种医用敷料，包括：

医用敷料原料；

复合在医用敷料原料表面的修复层；

所述修复层由上述技术方案所述的凝胶制剂或上述技术方案所述的方法制得凝胶制剂在医用敷料原料表面涂覆后，经过固化成形得到。

本发明提供的医用敷料包括医用敷料原料和复合在医用敷料原料表面的修复层。所述修复层由所述的凝胶制剂在医用敷料原料表面涂覆后，经过固化成形得到。

在本发明中，对所述医用敷料原料的材质和来源没有特别限定，优选为医用水凝胶敷料。在本发明提供的一个实施例中，所述医用水凝胶敷料由明胶溶液固化形成后制成。所述明胶溶液中明胶的含量优选为50～90wt％，更优选为70～80wt％。

在本发明中，所述修复层由上述技术方案公开的凝胶制剂在医用敷料原料表面涂覆后，经过固化成形得到。在本发明提供的一个实施例中，所述凝胶制剂在医用敷料表面的涂覆量为0.5～5mL/cm²；在本发明提供的另一个实施例中，所述凝胶制剂在医用敷料表面的涂覆量为1～2mL/cm²。

在本发明中，直接将所述凝胶制剂涂覆在医用敷料表面，待凝胶制剂固化成型后，即可得到本发明提供的医用敷料。制得医用敷料后，将其低温保存。所述低温保存的温度优选为0～4℃。在本发明中，低温保存医用敷料能够很好的保持脂肪干细胞的生物活性，显著提供其对创伤的修复效果。

本发明提供的医用敷料在医用敷料原料表面设置有修复层，修复层中含有脂肪干细胞、明胶和白蛋白等活性成分，能够很好的促进创口愈合，对创口实现较好的修复效果。

在本发明提供的优选实施方式中，所述医用敷料原料由明胶溶液固化制成。由于本发明修复层的主要成分也是明胶，这就使得医用敷料原料与修复层的结合性和一体性较好。同时，该医用敷料在低温下是固体状态，当温度高于35℃时，会逐渐融化，与皮肤完全贴合，从而提高了敷料对创口的修复效果。

实验结果表明，将本发明提供的医用敷料敷贴在创口表面后，7d的创口愈合率大于80±7％，说明本发明提供的医用敷料对创口具有较好的修复效果。为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。

实施例1

获得P2～P5代脂肪干细胞

首先将脂肪组织分装至50mL离心管中，加入等体积的Ⅰ型胶原酶溶液(I型胶原酶含量为0.25g/100mL)，充分混匀，封口，37℃消化1h。然后向消化后的脂肪组织中加入4mL的FBS终止消化，混匀，在200g离心5min。离心结束后，弃去上两层液体，用生理盐水重悬细胞，200g离心5min。离心结束后，弃去上清，获得脂肪干细胞。

使用含15％(体积百分浓度)FBS的DMEM-F12培养液(Gibco公司，批号：8115152)重悬上述获得的脂肪干细胞，以1×10⁵个/mL接种与培养瓶中。轻轻前后摇动培养瓶，使细胞悬液均匀分布于培养瓶底。将培养瓶做好标记并转移到37℃、5％CO₂、饱和湿度为95％的培养箱中培养。培养24h后首次换液，弃去悬浮细胞.，之后每3天换一次液。

在倒置显微镜下观察脂肪干细胞，若细胞融合达80％，则对脂肪干细胞进行传代处理，该过程为：

弃去培养基，加入PBS溶液5mL，轻轻前后摇动培养瓶，弃去PBS溶液，然后再加入PBS溶液5mL，轻轻前后摇动培养瓶，弃去PBS溶液。之后，每培养瓶加入2mL胰酶消化液(胰酶含量0.25g/100mL)，把培养瓶移入CO₂培养箱内消化2min，消化后取出，放置于显微镜下观察细胞形态。待80％脂肪干细胞皱缩变圆，且漂浮脱落后，将培养瓶中加入5mL15％(体积百分浓度)FBS的DMEM-F12培养液(Gibco公司，批号：8115152)，终止消化。终止消化的细胞悬液1500rpm/min离心5min，弃上清，细胞沉淀用15％(体积百分浓度)FBS的DMEM-F12培养液(Gibco公司，批号：8115152)重悬，重悬得到的细胞悬液的中的细胞密度为5×10⁴个/mL。之后将细胞悬液接种至10cm平皿，10mL/平皿。轻轻前后摇动平皿，使细胞悬液均匀分布于皿底。将平皿转移至37℃、5％CO₂、饱和湿度为95％的培养箱中传代培养，收集传代至P2～P5代的脂肪干细胞。

用胰酶消化液(胰酶含量0.25g/100mL)对将上述收集的P2～P5代的脂肪干细胞进行消化酶解，之后加入5mL15％(体积百分浓度)FBS的DMEM-F12培养液(Gibco公司，批号：8115152)终止酶解，1500rpm/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀，即为后续制备凝胶制剂所使得的P2～P5代脂肪干细胞。

根据2015年版中华人民共和国药典第4部通则3300的检测方法对收集的细胞沉淀进行病毒检测，结果为细胞沉淀的甲肝、乙肝、丙肝、梅毒和HIV均呈阴性。

实施例2

制备医用明胶敷料

将明胶(购买于西安天正药用辅料有限公司，批号：1405664)与水混合，得到明胶含量70wt％的明胶溶液。然后将明胶溶液入圆形的模具中，冷却形成，得到医用明胶敷料。

实施例3

制备含脂肪干细胞的医用敷料

1)制备凝胶制剂

1-1)成分设计

1-2)制备过程

按照上述成分设计将各组分进行混合，具体过程为：用一定量的生理盐水溶解白蛋白，得到白蛋白溶液；用所述白蛋白溶液重悬实施例1获得的脂肪干细胞，充分混合，得到脂肪干细胞悬液；将明胶和一定量的生理盐水混合，得到明胶溶液；将所述脂肪干细胞悬液与所述明胶溶液混合，得到含脂肪干细胞的凝胶制剂。

2)制备医用敷料

将上述凝胶制剂1mL，涂布在“1×1×0.2cm³的实施例2制得的医用明胶敷料上，放置在4℃环境下保存。

实施例4

制备含脂肪干细胞的医用敷料

1)制备凝胶制剂

1-1)成分设计

1-2)制备过程

按照上述成分设计将各组分进行混合，具体过程为：用一定量的生理盐水溶解白蛋白，得到白蛋白溶液；用所述白蛋白溶液重悬实施例1获得的脂肪干细胞，充分混合，得到脂肪干细胞悬液；将明胶和一定量的生理盐水混合，得到明胶溶液；将所述脂肪干细胞悬液与所述明胶溶液混合，得到含脂肪干细胞的凝胶制剂。

2)制备医用敷料

将上述凝胶制剂1mL，涂布在“1×1×0.2cm³的实施例2制得的医用明胶敷料上，放置在4℃环境下保存。

实施例5

制备含脂肪干细胞的医用敷料

1)制备凝胶制剂

1-1)成分设计

1-2)制备过程

按照上述成分设计将各组分进行混合，具体过程为：用一定量的生理盐水溶解白蛋白，得到白蛋白溶液；用所述白蛋白溶液重悬实施例1获得的脂肪干细胞，充分混合，得到脂肪干细胞悬液；将明胶和一定量的生理盐水混合，得到明胶溶液；将所述脂肪干细胞悬液与所述明胶溶液混合，得到含脂肪干细胞的凝胶制剂。

2)制备医用敷料

将上述凝胶制剂1mL，涂布在“1×1×0.2cm³的实施例2制得的医用明胶敷料上，放置在4℃环境下保存。

实施例6

制备含脂肪干细胞的医用敷料

1)制备凝胶制剂

1-1)成分设计

1-2)制备过程

按照上述成分设计将各组分进行混合，具体过程为：用一定量的生理盐水溶解白蛋白，得到白蛋白溶液；用所述白蛋白溶液重悬实施例1获得的脂肪干细胞，充分混合，得到脂肪干细胞悬液；将明胶和一定量的生理盐水混合，得到明胶溶液；将所述脂肪干细胞悬液与所述明胶溶液混合，得到含脂肪干细胞的凝胶制剂。

2)制备医用敷料

将上述凝胶制剂1mL，涂布在“1×1×0.2cm³的实施例2制得的医用明胶敷料上，放置在4℃环境下保存。

实施例7

脂肪干细胞质量检测

在显微镜下对实施例1获得的P2～P5代脂肪干细胞进行形貌观察，结果如图1～图4所示。其中，图1是本发明实施例7提供的在×4倍率下观察到的P2代脂肪干细胞的细胞形貌；图2是本发明实施例7提供的在×10倍率下观察到的P2代脂肪干细胞的细胞形貌；图3是本发明实施例7提供的在×4倍率下观察到的P5代脂肪干细胞的细胞形貌；图4是本发明实施例7提供的在×10倍率下观察到的P5代脂肪干细胞的细胞形貌。

由图1和图2可知，脂肪干细胞在P2细胞形态梭型，保持着旺盛增殖能力。由图3和图4可知，在P5时，细胞形态为梭型，体积小且均匀；细胞折光性强，胞浆丰富，可见明显的细胞核。说明P5代的脂肪干细胞仍保持着旺盛的增殖能力和良好的细胞状态。

实施例8

含脂肪干细胞的医用敷料质量检测

对实施例3～6制得的医用敷料进行微生物检测和内毒素检测检测。其中，微生物检测(细菌、真菌)根据2015年版中华人民共和国药典第4部通则1100进行检测；内毒素检测根据2015年版中华人民共和国药典第4部通则1143进行检测。

检测结果为实施例3～6制得的生物制剂在细菌、真菌和内毒素的检测中，均呈阴性。说明了该干细胞制剂的质量合格，可用于创口的修复。

实施例9

含脂肪干细胞的医用敷料的创口修复效果检测

取50只老鼠，将小鼠常规饲养7d后，腹腔注射1％戊巴比妥钠30mg/kg麻醉，剃去背部毛，在背中部制备一个1cm×1cm创面，深至皮下制备成机械损伤小鼠模型。之后将小鼠均分为5组，其中一组为阴性对照组，其余4组为实验组。阴性对照组用无菌纱布包扎伤口。4组实验组的小鼠伤口处分别敷贴实施例3～6制得的医用敷料，用医用胶布固定，3天后取下实验组小鼠伤口上剩余敷料，用无菌纱布继续包扎伤口。7天后观察阴性对照组和实验组小鼠的伤口愈合程度，结果如表1所示：

表1小鼠创口愈合率

从表1中可以看出，敷贴有本发明提供的医用敷料的小鼠的创口愈合率与阴性对照组具有显著差异，说明本发明提供的医用敷料可以对创口起到很好的修复效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂，包括脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂。

2.根据权利要求1所述的凝胶制剂，其特征在于，所述脂肪干细胞在所述凝胶制剂中的含量为5×10⁵～5×10⁶个/mL。

3.根据权利要求1所述的凝胶制剂，其特征在于，所述白蛋白在所述凝胶制剂中的含量为5～20ng/mL。

4.根据权利要求3所述的凝胶制剂，其特征在于，所述明胶在所述凝胶制剂中的含量为30～50wt％。

5.一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：

a)、脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂混合，得到含有脂肪干细胞的凝胶制剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)具体为：

a1)、脂肪干细胞、白蛋白和部分溶剂混合，得到含白蛋白的脂肪干细胞悬液；

a2)、含白蛋白的脂肪干细胞悬液、明胶和余量的溶剂混合，得到含有脂肪干细胞的凝胶制剂。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞按照以下方法获得：

b)、脂肪组织依次进行消化处理和离心分离，得到脂肪干细胞。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，获得脂肪干细胞后，对其进行传代培养，获得P2～P5代脂肪干细胞。

9.一种医用敷料，包括：

医用敷料原料；

复合在医用敷料原料表面的修复层；

所述修复层由权利要求1～4任一项所述的凝胶制剂或权利要求5～8任一项所述的方法制得凝胶制剂在医用敷料原料表面涂覆后，经过固化成形得到。

10.根据权利要求9所述的医用敷料，其特征在于，所述凝胶制剂在医用敷料表面的涂覆量为0.5～5mL/cm²。