CN105079859B - 一种敷料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医用材料技术领域，公开了一种敷料及其制备方法。本发明所述敷料由细胞‑支架混合液和生长因子溶液组成；其中，所述细胞‑支架混合液由支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液组成；所述生长因子溶液包括生长因子EGF和生长因子hSCGF。与现有技术相比，本发明以人脐带间充质干细胞作为敷料的种子细胞采集简单，增值分化能力强，与生长因子共同作用，能促进细胞的增值，促进伤口快速愈合。本发明所述敷料的制备方法操作简单，适合规模化生产。本发明所述3D敷料的制备方法采用3D打印和干细胞技术相结合的方式，制备得到适合不同患者、不同部位以及溃疡程度的3D敷料，具有个性化优点，减少了免疫排斥反应，提高了组织相容性。

Description

一种敷料及其制备方法

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种敷料及其制备方法，尤其涉及一种治疗糖尿病足溃疡的敷料及其制备方法。

背景技术

随着社会进步和人们生活、饮食方式的转变，糖尿病发病率逐年增高。中国近期一项流行病学研究结果表明，中国的糖尿病患病率已达9.7％，高于世界平均水平6.4％。长期血糖增高，大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等。其中，糖尿病足是糖尿病最严重的并发症和非外伤性截肢的主要原因。随着我国人口老龄化的发展，糖尿病足发病率逐年增高，处理不当有可能会截肢或死亡，而85％截肢起因于溃疡。糖尿病足溃疡的发生使糖尿病患者生活质量降低，住院时间延长，给社会和家庭带来了巨大的经济负担，因此需对糖尿病足溃疡的防治进行综合评价，及早预防和治疗。

糖尿病足溃疡的治疗主要经过3个步骤：清创，抗生素治疗，必要时血管重建。目前，随着技术的发展和人们对糖尿病足溃疡认识的增加，越来越多的方法应用于临床。这些方法更快地促进伤口的愈合，降低了截肢率，改善了患者的生活质量。

目前临床上一般采用药物、血管搭桥、介入手术、超声消融等方法治疗糖尿病足，但是均具有一定的局限性，难以取得令人满意的疗效，因此迫切需要寻求新的治疗方法。

干细胞是一类具有自我复制能力和分化能力的多潜能细胞。在一定条件下可以分化成多种功能细胞，医学界称为“万用细胞”，因此备受关注。已有人采用干细胞的基因修饰以及细胞因子的联合运用等多种手段治疗糖尿病下肢血管病变，并表现出各自的优越性。而干细胞移植治疗中，虽然已证实骨髓间充质干细胞可以通过血管重建或介入方法治疗糖尿病足，但是采集外周血或骨髓干细胞风险较大、操作复杂，其自体干细胞数量、增值分化、黏附和成血管能力均较低，伤口愈合速度慢。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术的缺陷提供一种治疗糖尿病足溃疡敷料及其制备方法，本发明所述敷料能促进细胞的增殖，促进伤口快速愈合。

本发明提供了一种敷料，由细胞-支架混合液和生长因子溶液组成，其中所述细胞-支架混合液由支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液组成；所述生长因子溶液包括生长因子EGF和生长因子hSCGF。

其中，在一些实施方案中，所述细胞-支架混合液与生长因子溶液的体积比为(10-20):1。

在一些具体实施例中，所述细胞-支架混合液与生长因子溶液的体积比为10:1。在一些具体实施例中，所述细胞-支架混合液与生长因子溶液的体积比为20:1。在另一些具体实施例中，所述细胞-支架混合液与生长因子溶液的体积比为15:1。

在一些实施方案中，所述细胞-支架混合液中所述支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液的体积比为(5-7):(1-3)。

在一些具体实施例中，所述细胞-支架混合液中所述支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液的体积比为7:3。在一些具体实施例中，细胞-支架混合液中所述支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液的体积比为5:1。在另一些具体实施例中，细胞-支架混合液中所述支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液的体积比为5:3。

在一些实施方案中，所述细胞-支架混合液中所述人脐带间充质干细胞悬液中人脐带间充质干细胞的细胞浓度为(1-10)×10⁶个/mL。

在一些具体实施例中，所述细胞-支架混合液中所述人脐带间充质干细胞悬液中人脐带间充质干细胞的细胞浓度为1×10⁶个/mL。在一些具体实施例中，所述细胞-支架混合液中所述人脐带间充质干细胞悬液中人脐带间充质干细胞的细胞浓度为10×10⁶个/mL。在另一些具体实施例中，所述细胞-支架混合液中所述人脐带间充质干细胞悬液中人脐带间充质干细胞的细胞浓度为5×10⁶个/mL。

在一些实施方案中，本发明所述敷料中所述支架材料溶液由DMEM/F12培养基、I型鼠胶原、壳多糖、糖胺聚糖、海藻糖和戊二醛组成。

在一些优选实施方案中，所述支架材料溶液中所述I型鼠胶原占支架材料溶液0.8v/v％～1.2v/v％，壳多糖占支架材料溶液1v/v％～3v/v％，糖胺聚糖占支架材料溶液4v/v％～6v/v％，海藻糖占支架材料溶液1v/v％～5v/v％，戊二醛占支架材料溶液0v/v％～0.6v/v％，余量为DMEM/F12培养基。

在一些具体实施例中，所述支架材料溶液中所述I型鼠胶原占支架材料溶液1.0v/v％，壳多糖占支架材料溶液2v/v％，糖胺聚糖占支架材料溶液5v/v％，海藻糖占支架材料溶液3v/v％，戊二醛占支架材料溶液0.3v/v％，余量为DMEM/F12培养基。

在一些具体实施例中，所述支架材料溶液中所述I型鼠胶原占支架材料溶液0.8v/v％，壳多糖占支架材料溶液3v/v％，糖胺聚糖占支架材料溶液4v/v％，海藻糖占支架材料溶液5v/v％，戊二醛占支架材料溶液0.1v/v％，余量为DMEM/F12培养基。

在另一些具体实施例中，所述支架材料溶液中所述I型鼠胶原占支架材料溶液1.2v/v％，壳多糖占支架材料溶液1v/v％，糖胺聚糖占支架材料溶液6v/v％，海藻糖占支架材料溶液1v/v％，戊二醛占支架材料溶液0.6v/v％，余量为DMEM/F12培养基。

按照本发明，所述支架材料溶液中所述糖胺聚糖的种类为本领域技术人员熟知的任意一种糖胺聚糖即可，并无特殊的限制。本发明中所述糖胺聚糖优选6-硫酸软骨素、透明质酸、肝素复合物中至少一种。

在一些实施方案中，本发明所述敷料中所述生长因子溶液由生长因子EGF、生长因子hSCGF、赋形剂和水组成。

在一些优选实施方案中，本发明所述敷料中所述生长因子EGF占生长因子溶液的1wt％-5wt％，所述生长因子hSCGF占生长因子溶液的1wt％-10wt％，所述赋形剂占生长因子溶液的5wt％-10wt％，余量为水。

在一些具体实施例中，所述生长因子溶液中所述生长因子EGF占生长因子溶液的3wt％，所述生长因子hSCGF占生长因子溶液的5wt％，所述赋形剂占生长因子溶液的8wt％，余量为水。

在一些具体实施例中，所述生长因子溶液中所述生长因子EGF占生长因子溶液的1wt％，所述生长因子hSCGF占生长因子溶液的10wt％，所述赋形剂占生长因子溶液的5wt％，余量为水。

在一些具体实施例中，所述生长因子溶液中所述生长因子EGF占生长因子溶液的5wt％，所述生长因子hSCGF占生长因子溶液的1wt％，所述赋形剂占生长因子溶液的10wt％，余量为水。

按照本发明，所述生长因子溶液中所述赋形剂的种类为本领域技术人员熟知的任意一种赋形剂即可，并无特殊的限制。本发明中所述赋形剂优选甘露醇、海藻糖或蔗糖中至少一种。

本发明还提供了上述敷料的制备方法，包括

A)、将DMEM/F12、I型鼠胶原、壳多糖、糖胺聚糖、海藻糖及戊二醛混匀，调pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液；

B)、按支架材料溶液与人脐带间充质干细胞悬液的体积比为(5-7):(1-3)比例，在支架材料溶液中加入人脐带间充质干细胞悬液并混匀得到细胞-支架混合液；

C)、将生长因子EGF、生长因子hSCGF、赋形剂和水混匀溶解得到生长因子溶液；

D)、将细胞-支架混合液与生长因子溶液按(10-20):1比例混合得到敷料。

本发明还提供了一种3D敷料的制备方法，扫描糖尿病足溃疡表面图像获得溃疡表面图像，根据图像建立3D敷料模具；利用已经建好的3D敷料模具，将本发明所述敷料一层层喷涂在基材上，凝固后将敷料从基材上剥离，放在培养基中于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养10天。

在一些实施方案中，本发明所述3D敷料的制备方法中所述培养基为含10v/v％FBS和1v/v％双抗的DMEM/F12培养基。

本发明提供了一种敷料及其制备方法。本发明所述敷料由细胞-支架混合液和生长因子溶液组成；其中，所述细胞-支架混合液由支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液组成；所述生长因子溶液包括生长因子EGF和生长因子hSCGF。与现有技术相比，本发明以人脐带间充质干细胞作为敷料的种子细胞采集简单，增值分化能力强，与生长因子共同作用，能促进细胞的增值，促进伤口快速愈合。本发明所述敷料的制备方法操作简单，适合规模化生产。本发明所述3D敷料的制备方法，采用3D打印和干细胞技术相结合的方式，制备方法简单，制备得到适合不同的患者、患者的不同部位以及溃疡程度的3D敷料，具有个性化优点，减少了免疫排斥反应，提高了组织相容性。

附图说明

图1为实施例1中P3代人脐带间充质干细胞的细胞形态图，其中图a放大倍数为40倍，图b放大倍数为100倍；

图2示实施例1制得的人脐带间充质干细胞P2代细胞表面标志物的表达结果图，其中图a-c为对照细胞组，图d-f为实施例1制得的人脐带间充质干细胞P2代细胞；图a为FSC及SSC表达情况图，图b为HLA-DR及CD59表达情况图，图c为CD45及CD90表达情况图，图d为FSC及SSC表达情况图，图e为HLA-DR及CD59表达情况图，图f为CD45及CD90表达情况图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明进行详细描述。其中以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1、人脐带间充质干细胞分离

取人脐带组织块，平铺到培养皿中，加入完全培养基，转移至5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的CO₂培养箱中培养。前5-7天静置培养，培养液颜色改变，呈浅黄色，进行首次补液。当观察到每皿至少有5处爬出成片的细胞后，用移液管吸掉皿内培养基和组织块，进行换液处理，获得人脐带间充质干细胞原代细胞(P0)。

原代培养10-12天后，有部分细胞爬出形成克隆，继续培养，直到整个皿中出现至少5个克隆时，消化细胞传代。倒置显微镜下观察传代细胞，P3代人脐带间充质干细胞，结果如图1。

图1结果显示，P3代人脐带间充质干细胞增殖能力较强，生长速度较快，形态、大小均一，呈放射状至梭形整齐排列生长。冻存前，细胞折光性强，呈长梭形，无杂细胞，背景清晰，细胞纯度较高。

实施例2、人脐带间充质干细胞鉴定

取对数生长期P2的人脐带间充质干细胞，吸出培养基后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。1000rpm离心10min，弃上清，用4℃预冷的PBS洗涤细胞3次后重悬均匀，调整细胞浓度约为10⁵个/mL-10⁶个/mL。

取8个上样管，每管加入500μL的单细胞悬液，1号管标为标准对照，加入5μL PE标记的小鼠IgG₁抗体及5μL FITC标记的小鼠IgG₁抗体；其他各管分别加入5μL FITC或PE标记的小鼠抗人细胞表面分子CD59、CD105、CD45、CD90抗体工作液。室温，避光，孵育20min。PBS洗两遍，500μL的PBS重悬后，以不加任何抗体的细胞作为对照细胞组，流式细胞仪检测，结果见图2。

图2结果显示，P2的人脐带间充质干细胞表面抗原的CD59+-HLA-DR-表达量为97.6％，CD90+-CD45-表达量为99.4％，CD59和CD90呈阳性表达，而HLA-DR、CD45呈阴性表达，符合脐带间充质干细胞的特性。

实施例3、敷料

敷料由细胞-支架混合液和生长因子溶液组成，其中细胞-支架混合液与生长因子溶液的体积比为10:1。

细胞-支架混合液由支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液组成，所述支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液的体积比为7:3；所述人脐带间充质干细胞悬液中人脐带间充质干细胞的细胞浓度为1×10⁶个/mL；所述支架材料溶液由DMEM/F12培养基、I型鼠胶原、壳多糖、6-硫酸软骨素、海藻糖和戊二醛组成，所述I型鼠胶原占支架材料溶液1.0v/v％，壳多糖占支架材料溶液2v/v％，6-硫酸软骨素占支架材料溶液5v/v％，海藻糖占支架材料溶液3v/v％，戊二醛占支架材料溶液0.3v/v％，余量为DMEM/F12培养基。

生长因子溶液由生长因子EGF、生长因子hSCGF、赋形剂和水组成，其中生长因子EGF占生长因子溶液的3wt％，生长因子hSCGF占生长因子溶液的5wt％，甘露醇占生长因子溶液的8wt％，余量为水。

敷料的制备：

(1)人脐带间充质干细胞悬液的制备：分离后的人脐带间充质干细胞，吸去培养基，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。1000rpm离心10min，弃上清，用4℃预冷的PBS洗涤细胞3次后重悬均匀，调整细胞浓度约为10⁶个/mL。

(2)支架材料溶液的制备：在50ml离心管中，在冰浴条件下按配方量加入DMEM/F12、I型鼠胶原、壳多糖、6-硫酸软骨素、海藻糖及戊二醛，每一步充分搅拌混匀，最后用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。

(3)细胞-支架混合液的制备：按配方量在支架材料溶液中迅速加入人脐带间充质干细胞悬液并混匀得到细胞-支架混合液。

(4)生长因子溶液的制备：按配方量加入EGF、hSCGF、甘露醇、海藻糖和水，混匀溶解得到生长因子溶液。

(5)细胞-支架混合液与生长因子溶液按10:1比例混合得到敷料。

实施例4、敷料

敷料由细胞-支架混合液和生长因子溶液组成，其中细胞-支架混合液与生长因子溶液的体积比为20:1。

细胞-支架混合液由支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液组成，所述支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液的体积比为5:1；所述人脐带间充质干细胞悬液中人脐带间充质干细胞的细胞浓度为10×10⁶个/mL；所述支架材料溶液由DMEM/F12培养基、I型鼠胶原、壳多糖、6-硫酸软骨素、海藻糖和戊二醛组成，所述I型鼠胶原占支架材料溶液0.8v/v％，壳多糖占支架材料溶液3v/v％，透明质酸占支架材料溶液4v/v％，海藻糖占支架材料溶液5v/v％，戊二醛占支架材料溶液0.1v/v％，余量为DMEM/F12培养基。

生长因子溶液由生长因子EGF、生长因子hSCGF、赋形剂和水组成，其中生长因子EGF占生长因子溶液的1wt％，生长因子hSCGF占生长因子溶液的10wt％，海藻糖占生长因子溶液的5wt％，余量为水。

敷料的制备：

(1)人脐带间充质干细胞悬液的制备：分离后的人脐带间充质干细胞，吸去培养基，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。1000rpm离心10min，弃上清，用4℃预冷的PBS洗涤细胞3次后重悬均匀，调整细胞浓度约为10⁶个/mL。

(2)支架材料溶液的制备：在50ml离心管中，在冰浴条件下按配方量加入DMEM/F12、I型鼠胶原、壳多糖、透明质酸、海藻糖及戊二醛，每一步充分搅拌混匀，最后用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。

(3)细胞-支架混合液的制备：按配方量在支架材料溶液中迅速加入人脐带间充质干细胞悬液并混匀得到细胞-支架混合液。

(4)生长因子溶液的制备：按配方量加入EGF、hSCGF、海藻糖、海藻糖和水，混匀溶解得到生长因子溶液。

(5)细胞-支架混合液与生长因子溶液按20:1比例混合得到敷料。

实施例5、敷料

敷料由细胞-支架混合液和生长因子溶液组成，其中细胞-支架混合液与生长因子溶液的体积比为15:1。

细胞-支架混合液由支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液组成，所述支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液的体积比为5:3；所述人脐带间充质干细胞悬液中人脐带间充质干细胞的细胞浓度为5×10⁶个/mL；所述支架材料溶液由DMEM/F12培养基、I型鼠胶原、壳多糖、6-硫酸软骨素、海藻糖和戊二醛组成，所述I型鼠胶原占支架材料溶液1.2v/v％，壳多糖占支架材料溶液1v/v％，肝素复合物占支架材料溶液6v/v％，海藻糖占支架材料溶液1v/v％，戊二醛占支架材料溶液0.6v/v％，余量为DMEM/F12培养基。

生长因子溶液由生长因子EGF、生长因子hSCGF、赋形剂和水组成，其中生长因子EGF占生长因子溶液的5wt％，生长因子hSCGF占生长因子溶液的1wt％，蔗糖占生长因子溶液的10wt％，余量为水。

敷料的制备：

(1)人脐带间充质干细胞悬液的制备：分离后的人脐带间充质干细胞，吸去培养基，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。1000rpm离心10min，弃上清，用4℃预冷的PBS洗涤细胞3次后重悬均匀，调整细胞浓度约为10⁶个/mL。

(2)支架材料溶液的制备：在50ml离心管中，在冰浴条件下按配方量加入DMEM/F12、I型鼠胶原、壳多糖、肝素复合物、海藻糖及戊二醛，每一步充分搅拌混匀，最后用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。

(3)细胞-支架混合液的制备：按配方量在支架材料溶液中迅速加入人脐带间充质干细胞悬液并混匀得到细胞-支架混合液。

(4)生长因子溶液的制备：按配方量加入EGF、hSCGF、蔗糖、海藻糖和水，混匀溶解得到生长因子溶液。

(5)细胞-支架混合液与生长因子溶液按15:1比例混合得到敷料。

实施例6、3D敷料制备

(1)3D建模

3D建模是3D打印的前提，相当于平面印刷中的“原稿”，3D建模质量的好坏决定了3D打印的质量。一般现有的3D建模软件都可以实现建模，比较常用的比如CAD/CAM等矢量建模软件，都可以轻易地实现3D建模。

利用3D打印机内置的激光器对糖尿病足溃疡表面进行扫描，获得伤口的大小、形状、薄厚以及患者正常皮肤的表皮真皮厚度等数据，然后利用PlyEdit软件对扫描后的图像进行消除数字噪音等处理并对其进行编辑，使之产生一个连续的表面图像；利用Studio4.0软件将图像转化为立体光刻(.STL)文件并导入至Solid Works软件，使扫描后的溃疡表面图像转变为一个虚拟立体图像(或模块)，可以用来直接打印出对应的敷料，建立3D敷料模具。

(2)3D打印

利用已经建好的3D敷料模具，将敷料一层层喷涂在基材上，打印的层数和具体的量根据不同的患者、患者的不同部位而变化，打印完成后使之凝固50-60min，形成个性化3D敷料。

(3)打印后处理

待凝固后，敷料从基材上剥离下来，并放在培养基(DMEM/F12，10％FBS，1％双抗)中于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养10天后直接用于患者伤口。

实施例7、3D敷料体外评价

(1)力学性能评价

利用镊子夹，观察敷料是否破碎，以此来判断敷料的弹性和韧性；并且观察刚打印的敷料和培养10天后的敷料在形状、厚度、弹性上是否有明显的变化。

结果显示，敷料低温下呈液态，流动性良好。打印成3D敷料后静置60min后成胶，胶状的3D敷料机械强度良好，可用手术钳夹取，加入培养基后不松散，继续培养过程中未见破碎和大幅降解。

(2)体外降解性评价

支架材料采用戊二醛交联，戊二醛的用量不同，其体外降解时间也不同。按表1用量加入不同的戊二醛，同时按照实施例3的配方量加入其它支架材料，充分搅拌混匀后，用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4。形成戊二醛用量不同的支架材料溶液。

分别称取上述戊二醛用量不同的支架材料溶液2mg，置于盛有1.9mL Tris-CaCl2缓冲液(pH7.6)的试管中，并加入新配置的2mL(100U)胶原酶溶液，置于37℃温育，定时观察，每次三个平行实验，记下样品完全澄清的时间，取平均值。结果见表1。

表1 戊二醛用量对支架材料降解速率的影响

表1结果显示，戊二醛的用量不同，其体外降解时间也不同，随着戊二醛用量的增加，其体外降解时间也随之延长。表明降解时间可控制在比较宽的范围，可满足各类人群对支架材料降解速率的不同要求。

实施例8、对鼠糖尿病足溃疡的疗效

1、实验方法：

鼠糖尿病足溃疡模型40只，随机分为两组：对照组20只，使用市面上购买的普通湿性敷料；实验组20只，根据其溃疡表面按照实施例3的配方和实施例6方法打印出3D敷料，并贴于其溃疡表面。各组每3d换药一次，连续1个月，观察对照组和实验组的愈合时间及敷料的毒副作用。其中，疗效判定标准为：治愈：创口愈合；显效：创口愈合80％以上；有效：创口愈合40％以上；无效；死亡。

2、实验结果

2.1、副作用：治疗前后，实验组和对照组的溃疡面均未恶化，老鼠无死亡，说明实验组和对照组敷料均无毒副作用。

2.2、实验组和对照组的疗效比较结果见表2。

表2 实验组和对照组的疗效比较

组别

动物数/只

治愈/只

显效/只

有效/只

无效/只

有效率

治愈率

对照组

20

1

6

5

8

60％

5％

实验组

20

10b

5

3

2

90％b

50％

注：与对照组相比，^bP<0.05

由表2结果可以看出，实验组大鼠的总有效率和治愈率均显著高于对照组，具有统计学意义。

2.3实验组和对照组的平均痊愈时间(天)比较：

表3 实验组和对照组的平均痊愈时间比较

组别	清创阶段(天)	肉芽阶段(天)	上皮形成阶段(天)
				对照组	5.54±0.83	12.16±1.45	14.03±2.01
实验组	2.23±0.76a	8.16±1.22a	9.85±1.78a

注：与对照组相比，^aP<0.01，^bP<0.05

由表3可以看出，实验组和对照组平均痊愈时间(清创+肉芽+上皮形成)具有统计学意义，说明实验组有效率明显高于对照组。

按照实施例4的配方和实施例6方法打印出3D敷料与按照实施例5的配方和实施例6方法打印出3D敷料结果与上述结果相似。

Claims (9)

1.一种敷料，由细胞-支架混合液和生长因子溶液组成，其中所述细胞-支架混合液由支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液组成；所述生长因子溶液包括生长因子EGF和生长因子hSCGF；所述支架材料溶液由DMEM/F12培养基、I型鼠胶原、壳多糖、糖胺聚糖、海藻糖和戊二醛组成。

2.根据权利要求1所述的敷料，所述细胞-支架混合液与生长因子溶液的体积比为(10-20):1；所述细胞-支架混合液中所述支架材料溶液和人脐带间充质干细胞悬液的体积比为(5-7):(1-3)；所述细胞-支架混合液中所述人脐带间充质干细胞悬液中人脐带间充质干细胞的细胞浓度为(1-10)×10⁶个/mL。

3.根据权利要求1所述的敷料，所述支架材料溶液中所述I型鼠胶原占支架材料溶液0.8v/v％～1.2v/v％，壳多糖占支架材料溶液1v/v％～3v/v％，糖胺聚糖占支架材料溶液4v/v％～6v/v％，海藻糖占支架材料溶液1v/v％～5v/v％，戊二醛占支架材料溶液0v/v％～0.6v/v％，余量为DMEM/F12培养基。

4.根据权利要求1所述的敷料，所述糖胺聚糖选自6-硫酸软骨素、透明质酸、肝素复合物中至少一种。

5.根据权利要求1所述的敷料，所述生长因子溶液由生长因子EGF、生长因子hSCGF、赋形剂和水组成；所述生长因子溶液中所述生长因子EGF占生长因子溶液的1wt％-5wt％，所述生长因子hSCGF占生长因子溶液的1wt％-10wt％，所述赋形剂占生长因子溶液的5wt％-10wt％，余量为水。

6.根据权利要求5所述的敷料，所述赋形剂选自甘露醇、海藻糖或蔗糖中至少一种。

7.一种权利要求1所述敷料的制备方法，包括

A)、将DMEM/F12、I型鼠胶原、壳多糖、糖胺聚糖、海藻糖及戊二醛混匀，调pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液；

B)、按支架材料溶液与人脐带间充质干细胞悬液的体积比为(5-7):(1-3)比例，在支架材料溶液中加入人脐带间充质干细胞悬液并混匀得到细胞-支架混合液；

C)、将生长因子EGF、生长因子hSCGF、赋形剂和水混匀溶解得到生长因子溶液；

D)、将细胞-支架混合液与生长因子溶液按(10-20):1比例混合得到敷料。

8.一种3D敷料的制备方法，扫描糖尿病足溃疡表面图像获得溃疡表面图像，根据图像建立3D敷料模具；利用已经建好的3D敷料模具，将权利要求1所述敷料一层层喷涂在基材上，凝固后将敷料从基材上剥离，放在培养基中于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养10天。

9.根据权利要求8所述的制备方法，所述培养基为含10v/v％FBS和1v/v％双抗的DMEM/F12培养基。