CN106110303A - 一种祛疤组合物和敷料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种祛疤组合物，包括间充质干细胞培养液、表皮细胞生长因子、维生素C和维生素E；所述表皮细胞生长因子的质量浓度为10～50ng/mL，维生素C的质量浓度为5～50mg/mL，维生素E的质量浓度为5～50mg/mL；所述间充质干细胞培养液为P1～P5代的间充质干细胞依次经过混合培养基和无酚红培养基培养后得到；所述混合培养基包括培养基DMEM/F12和胎牛血清。本发明采用间充质干细胞培养液，获取简单，免疫原性低，对人体无害，且间充质干细胞在培养过程中会分泌活性物质到培养液中，配合维生素C、维生素E和表皮细胞生长因子，能够有效淡化疤痕，修复皮肤创面。本发明还提供一种敷料。

Description

一种祛疤组合物和敷料
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种祛疤组合物和敷料。
背景技术
青春期留下的痘疤，给人留下不可磨灭的“青春印记”。随着现代社会的进步，爱美不仅代表一种权利，也表示一种对自我的尊重，如何淡化这种令人不愉快的“青春印记”成了许多爱美人士关心的话题。
祛疤可通过药物、激光或者手术的方式达到目的，手术激光方式存在一定的危险性，目前市场上的药物祛疤产品大多采用一些含有苯环的有机大分子化工产品或者添加一些激素以增强祛疤效果，如公开号为CN105055235A的中国专利，采用了二甲基硅油、羟苯乙酯酸和三乙醇胺等化学物质，不可避免的对皮肤具有一定的损伤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种祛疤组合物和敷料，本发明中的祛疤组合物的用料对人体安全，且祛疤效果好。
本发明提供一种祛疤组合物，包括：间充质干细胞培养液、表皮细胞生长因子、维生素C和维生素E；
所述表皮细胞生长因子的质量浓度为10～50ng/mL，维生素C的质量浓度为5～50mg/mL，维生素E的质量浓度为5～50mg/mL；
所述间充质干细胞培养液为P1～P5代的间充质干细胞依次经过混合培养基和无酚红培养基培养后得到；
所述混合培养基包括DMEM/F12培养基和胎牛血清。
优选的，所述表皮细胞生长因子的质量浓度为20～40ng/mL。
优选的，所述维生素C的质量浓度为10～40mg/mL。
优选的，所述维生素E的质量浓度为10～40mg/mL。
优选的，所述祛疤组合物的pH值为7.2～7.4。
优选的，所述间充质干细胞培养液按照以下步骤制得：
将P1～P5代的间充质干细胞使用混合培养基培养，待所述间充质干细胞处于指数生长期且汇合度达到70～90％后，去除所述混合培养基的上清物，得到第一培养物；
将得到的第一培养物加入无酚红培养基中培养48～96小时，收集第二培养物，将第二培养物离心后取上清液，得到间充质干细胞培养液。
本发明提供一种敷料，由敷料溶液依次经3D打印和固化得到，
所述敷料溶液包括支架成分和上文所述的祛疤组合物；
所述支架成分包括I型胶原蛋白、壳多糖、糖胺聚糖、海藻糖和戊二醇。
优选的，所述I型胶原在敷料溶液中的质量分数为0.8～1.2％；
所述壳多糖在敷料溶液中的质量分数为0.5～3％；
所述糖胺聚糖在敷料溶液中的质量分数为4～6％；
所述海藻糖在敷料溶液中的质量分数为1～5％；
所述戊二醇在敷料溶液中的质量分数为0.1～0.6％。
优选的，所述3D打印按照疤痕大小、形状、薄厚以及皮肤表皮的真皮厚度进行建模打印。
优选的，所述固化的时间为30～60min；
所述固化的温度为0～10℃。
本发明提供一种祛疤组合物，包括间充质干细胞培养液、表皮细胞生长因子、维生素C和维生素E；所述表皮细胞生长因子的质量浓度为10～50ng/mL，维生素C的质量浓度为5～50mg/mL，维生素E的质量浓度为5～50mg/mL；所述间充质干细胞培养液为P1～P5代的间充质干细胞依次经过混合培养基和无酚红培养基培养后得到；所述混合培养基包括培养基DMEM/F12和胎牛血清。本发明采用间充质干细胞培养液，获取简单，且免疫原性低，对人体无害，并且间充质干细胞在培养过程中会分泌活性物质到培养液中，配合维生素C、维生素E和表皮细胞生长因子，能够有效抑制疤痕处色素的沉积，滋养肌肤，促进细胞的新陈代谢，从而达到淡化疤痕，修复皮肤创面的功效。
具体实施方式
本发明提供了一种祛疤组合物，包括：间充质干细胞培养液、表皮细胞生长因子、维生素C和维生素E；
所述表皮细胞生长因子的质量浓度为10～50ng/mL，维生素C的质量浓度为5～50mg/mL，维生素E的质量浓度为5～50mg/mL；
所述间充质干细胞培养液为P1～P5代的间充质干细胞依次经过混合培养基和无酚红培养基培养后得到；
所述混合培养基包括DMEMF12培养基和胎牛血清。
在本发明中，所述间充质干细胞培养液为将间充质干细胞在培养基中进行培养的到的培养液，在本发明中，所述间充质干细胞可以来自脂肪、脐带、脐血、牙髓或羊膜等，在间充质干细胞的培养过程中，间充质干细胞会分泌活性物质到培养液中，如血管内皮生长因子(vEGF)、胎盘生长因子(PGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)等在内的各种生长因子，这些活性物质对淡化疤痕，皮肤的创面修复有着很好的功效。
在本发明中，所述间充质干细胞培养液优选按照以下步骤制备得到：
将P1～P5代的间充质干细胞使用混合培养基培养，待所述间充质干细胞处于指数生长期且汇合度达到70～90％后，去除所述混合培养基的上清，得到第一培养物；
将得到的第一培养物加入无酚红培养基中培养48～96小时，收集第二培养物，将第二培养物离心后取上清，得到间充质干细胞培养液。
本发明优选采用P1～P5代的间充质干细胞，具体的，P1、P2、P3、P4和P5代的间充质干细胞均可；所述混合培养基优选包括DMEMF12培养基和胎牛血清(FBS)，更优选为DMEM/F12培养基和10％FBS的混合物；本发明对所述混合培养基的用量没有特殊的限制。所述无酚红培养基优选采用无酚红培养基1640，所述无酚红培养基的用量优选为0.1～0.2mL/cm2，更优选为0.15～0.18mL/cm2；所述细胞在无酚红培养基中的培养时间优选为48～96小时，更优选为55～85小时，最优选为60～72小时；所述培养液的离心力优选为200～400g，更优选为250～350g，最优选为300～320g；所述培养液的离心时间优选为5～10min，更优选为6～9min，最优选为7～8min；离心后取得的培养液上清，优选过0.22μm的滤膜，得到间充质干细胞培养液。具体的，在本发明的实施例中，可采用GIBCO提供的11835030型号的无酚红1640；GIBCO提供的11320033型号的DMEM/F12；GIBCO提供的10099141型号的胎牛血清。
在本发明中，所述表皮细胞生长因子(EGF)在所述祛疤组合物中的质量浓度为10～50ng/mL，优选为15～45ng/mL，更优选为20～40ng/mL，具体的，在本发明的实施例中，可以是10ng/mL，30ng/mL或50ng/mL。本发明对所述表皮细胞生长因子的来源没有特殊的限制，在本发明的实施例中，可采用成都泽光生物科技有限公司提供的ZG-DGFYL-7-09型号的表皮细胞生长因子。
在本发明中，所述维生素C在所述祛疤组合物中的质量浓度为5～50mg/mL，优选为10～45mg/mL，更优选为15～40mg/mL，具体的，在本发明的实施例中，可以是5mg/mL，20mg/mL，或50mg/mL。本发明对所述维生素C的来源没有特殊的限制，具体的，在本发明的实施例中，可采用SIGMA试剂公司提供的A5960型号的维生素C。
在本发明中，所述维生素E在所述祛疤组合物中的质量浓度为5～50mg/mL，优选为10～45mg/mL，更优选为15～40mg/mL，具体的，在本发明的实施例中，可以是5mg/mL，20mg/mL，或50mg/mL。本发明对所述维生素E的来源没有特殊的限制，具体的，在本发明的实施例中，可采用SIGMA试剂公司提供的T3634型号的维生素E。
本发明同时添加维生素C、维生素E和EGF，抑制减少疤痕处色素的沉淀，滋养肌肤，促进细胞增殖代谢。
在本发明中，所述祛疤组合物的pH值优选为7.2～7.4。
本发明还提供了一种敷料，由敷料溶液依次经3D打印和固化得到，
所述敷料溶液包括支架成分和上文所述的祛疤组合物；
所述支架成分包括I型胶原蛋白、壳多糖、糖胺聚糖、海藻糖和戊二醇。
在本发明中，所述祛疤组合物中各组分在所述敷料溶液中的含量与上文中祛疤组合物中各组分在祛疤组合物中的含量一致，如，EGF在祛疤组合物中的质量浓度为10～50ng/mL，EGF在敷料溶液中的质量浓度也是10～50ng/mL。
在本发明中，所述支架成分用于在固化形成敷料时赋予敷料一定的形状，所述I型胶原蛋白在所述敷料溶液中的质量分数优选为0.8～1.2％，具体的，在本发明的实施例中，可以是0.8％、1％或1.2％；所述壳多糖在敷料溶液中的质量分数为1～3％，更优选为1.5～2％，具体的，在本发明的实施例中，可以是1％或2％；所述碳胺聚糖在所述敷料溶液中的质量分数优选为4～6％，更优选为5％；所述糖胺聚糖优选为6-硫酸软骨素(10～40wt％)、透明质酸(20～80wt％)和肝素复合物(10～40wt％)的混合物；所述海藻糖在所述敷料溶液中的质量分数优选为1～5％，更优选为2～4％，具体的，在本发明的实施例中，可以是1％或3％；所述戊二醇在所述敷料溶液中的质量分数优选为0.1～0.6％，更优选为0.2～0.5％，具体的，可以是0.3％或0.6％。本发明对所述I型胶原蛋白、壳多糖、糖胺聚糖、海藻糖和戊二醇的来源没有特殊的限制。具体的，在本发明的实施例中，可采用河南正兴食品添加剂有限公司提供的16032210型号的6-硫酸软骨素；西安泽邦生物科技有限公司提供的XAZB-003型号的透明质酸；SIGMA试剂公司提供的H3149型号的肝素复合物；西安双德生物技术有限公司提供的1398641型号的壳多糖；SIGMA试剂公司提供的C9879型号的I型胶原蛋白；日本林源牌的6138234型号的海藻糖；台湾艾比克(THB)提供的331045型号的戊二醇。
本发明优选采用氢氧化钠溶液调节所述敷料溶液的pH值，将其调至7.2～7.4，优选为7.3，所述氢氧化钠溶液的摩尔浓度优选为0.5～2mol/L，更优选为1mol/L。
本发明优选采用3D打印机内置的激光器对患者疤痕表面进行扫描，获得伤口的大小、形状、薄厚以及患者正常皮肤的表皮真皮厚度等数据，然后利用PlyEdit软件对扫描后的图像进行消除数字噪音等处理并对其进行编辑，使之产生一个连续的表面图像；利用Studio4.0软件将图像转化为立体光刻(.STL)文件并导入至Solid Works软件，使扫描后的溃疡表面图像转变为一个虚拟立体图像(或模块)，用于打印出对应的敷料。
本发明利用已经建好的3D敷料模块，将上文中的敷料溶液喷涂在基材上，打印的层数和具体的量根据不同的患者、患者的不同部位而变化，打印完成后使之在室温下凝固30～60min，优选为40～50min，形成敷料。
在本发明中，所述3D打印的方法为3D打印技术的常规方法，本发明对所述3D打印机的型号没有特殊的限制。
待凝固，将所述辅料从基材上剥离下来，即可直接作用于患者的疤痕处。
本发明采用3D打印和干细胞技术相结合的方式，打印3D敷料，所取得的敷料是根据不同的患者、患者的不同部位以及疤痕大小专门设计，具有个性化优点，减少免疫排斥反应，提高组织相容性。
本发明提供一种祛疤组合物，包括：间充质干细胞培养液、表皮细胞生长因子、维生素C和维生素E；所述表皮细胞生长因子的质量浓度为10～50ng/mL，维生素C的质量浓度为5～50mg/mL，维生素E的质量浓度为5～50mg/mL；所述间充质干细胞培养液为P1～P5代的间充质干细胞依次经过混合培养基和无酚红培养基培养后得到；所述混合培养基包括培养基DMEMF12和胎牛血清。
相对于现有技术，本发明中的敷料具有以下优点：
(1)本发明选用间充质干细胞条件培养基，细胞采集简单，容易获得、免疫原性低，无伦理问题。
(2)本发明采用3D打印和干细胞技术相结合的方式，打印3D敷料，所取得的敷料是根据不同的患者、患者的不同部位以及疤痕大小专门设计，具有个性化优点，减少免疫排斥反应，提高组织相容性。
(3)本发明同时添加维生素C、维生素E和EGF，抑制减少疤痕处色素的沉淀，滋养肌肤，促进细胞增殖代谢。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种祛疤组合物和辅料进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
在以下实施例中，所述脐带间充质干细胞来自广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司的人类干细胞库。
采用GIBCO提供的11835030型号的无酚红1640；GIBCO提供的11320033型号的DMEM/F12；GIBCO提供的10099141型号的胎牛血清；
SIGMA试剂公司提供的A5960型号的维生素C；SIGMA试剂公司提供的T3634型号的维生素E；
采用河南正兴食品添加剂有限公司提供的16032210型号的6-硫酸软骨素；西安泽邦生物科技有限公司提供的XAZB-003型号的透明质酸；SIGMA试剂公司提供的H3149型号的肝素复合物；西安双德生物技术有限公司提供的1398641型号的壳多糖；SIGMA试剂公司提供的C9879型号的I型胶原蛋白；日本林源牌的6138234型号的海藻糖；台湾艾比克(THB)提供的331045型号的戊二醇。
实施例1
1.干细胞条件培养基的收集
取P3代的脐带间充质干细胞，使用DMEMF12+10％FBS培养，当细胞处于指数生长期，汇合度达到80％，去培养上清，用PBS洗两遍后，加入0.15mL/cm2的无酚红1640静置培养72h后，收集条件培养基，收集到的条件培养基300g离心5min，取上清，过0.22μm滤膜，所得即为干细胞条件培养基，备用。
2.3D建模
利用3D打印机内置的激光器对患者疤痕表面进行扫描，获得伤口的大小、形状、薄厚以及患者正常皮肤的表皮真皮厚度等数据，然后利用PlyEdit软件对扫描后的图像进行消除数字噪音等处理并对其进行编辑，使之产生一个连续的表面图像；利用Studio4.0软件将图像转化为立体光刻(.STL)文件并导入至Solid Works软件，使扫描后的溃疡表面图像转变为一个虚拟立体图像(或模块)，可以用来直接打印出对应的敷料。
3.敷料成分的处理
在冰浴条件下先后加入上述间充质干细胞条件培养基、EGF(30ng/mL)、维生素C(20mg/mL)、维生素E(20mg/mL)、I型胶原1.0％、壳多糖2％、糖胺聚糖5％(6-硫酸软骨素、透明质酸、肝素复合物)、海藻糖3％及戊二醇0.3％，每一步充分搅拌混匀，并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.3，形成敷料溶液。
4.3D打印敷料
利用已经建好的3D敷料模块，将敷料溶液喷涂在基材上，进行打印，打印完成后使至凝固50min，形成个性化3D敷料。
5.打印后处理
待凝固后，敷料从基材上剥离下来后直接用于患者疤痕处。
一、体外评价
取实施例1所制作的3D敷料作体外评价
力学性能评价
利用镊子夹，观察3D敷料是否破碎，以此来判断敷料的弹性和韧性；并且观察刚打印的敷料的形状、厚度、弹性。
结果显示：
3D敷料低温下呈液态，流动性良好；打印成3D敷料后静置60min后成胶，胶状的3D敷料机械强度良好，可用手术钳夹取。
体外降解性评价
称取2mg实施例1中的支架材料置于盛有1.9mL Tris-CaCl2缓冲液(pH7.6)的试管中，并加入新配置的2mL(100U)胶原酶溶液，置于37℃温育，定时观察，每次三个平行实验，记下样品完全澄清的时间，取平均值。
结果显示：
本支架材料采用戊二醇交联，戊二醇的用量不同，其体外降解时间也不同，可控制在比较宽的范围，可满足各类人群对支架材料降解速率的不同要求。随着戊二醇用量的增加，其体外降解时间也随之延长。结果见表1。
表1本发明实施例1中敷料的体外降解时间
二、3D打印敷料淡化疤痕效果测试
招募存在痘疤的志愿者40人，随机分为两组：每组20人。对照组使用祛疤常用的芦荟凝胶(广州赛莱拉生物科技有限公司的天然原汁芦荟胶)，根据其溃疡表面按照实施例1的配方打印出3D敷料，并贴于其疤痕表面。每天夜间敷药6小时，连续1个月，观察对照组和实验组疤痕的淡化情况。连续使用期间，两组均未发现痘疤情况加重，感染以及其他的不良事件发生。效果可分为治愈：痘疤消失；显效：痘疤位置平整肤色自然；有效：痘疤肉眼可辨减轻；无效：与使用前无明显区别；结果参见表2。
表2本发明实施例1辅料的祛疤效果
由表中可以看出，实验组的总有效率和治愈率均显著高于对照组(P<0.05)，具有统计学意义。
实施例2
1.干细胞条件培养基的收集
取P3代的脐带间充质干细胞，使用DMEMF12+10％FBS培养，当细胞处于指数生长期，汇合度达到90％，去培养上清，用PBS洗两遍后，加入0.1mL/cm2的无酚红1640静置培养72h后，收集条件培养基,收集到的条件培养基200g离心5min，取上清，过0.22μm滤膜，所得即为干细胞条件培养基，备用。
2.3D建模
利用3D打印机内置的激光器对患者疤痕表面进行扫描，获得伤口的大小、形状、薄厚以及患者正常皮肤的表皮真皮厚度等数据，然后利用PlyEdit软件对扫描后的图像进行消除数字噪音等处理并对其进行编辑，使之产生一个连续的表面图像；利用Studio4.0软件将图像转化为立体光刻(.STL)文件并导入至Solid Works软件，使扫描后的溃疡表面图像转变为一个虚拟立体图像(或模块)，可以用来直接打印出对应的敷料。
3.敷料成分的处理
在冰浴条件下先后加入间充质干细胞条件培养基、EGF(10ng/mL)、维生素C(50mg/mL)、维生素E(5mg/mL)、I型胶原0.8％、壳多糖1％、糖胺聚糖6％(6-硫酸软骨素、透明质酸、肝素复合物)、海藻糖1％及戊二醇0.6％，每一步充分搅拌混匀，并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2，形成敷料溶液。
4.3D打印敷料
利用已经建好的3D敷料磨具，将敷料溶液喷涂在基材上，进行打印，打印完成后使至凝固60min，形成个性化3D敷料。
5.打印后处理
待凝固后，敷料从基材上剥离下来后直接用于患者疤痕处。
按照实施例1中的淡化疤痕效果的测试方法，招募的6个患者连续使用一月后，4人显效，使用部位痘印颜色变淡与周围肤色相近，皮肤平整。1人有效，肉眼可见痘印减轻，1人没明显改善，但也没有痘印加重或感染等不良情况出现。
实施例3
1.干细胞条件培养基的收集
取P3代的脐带间充质干细胞，使用DMEMF12+10％FBS培养，当细胞处于指数生长期，汇合度达到80％，去培养上清，用PBS洗两遍后，加入0.2mL/cm2的无酚红1640静置培养72h后，收集条件培养基,收集到的条件培养基400g离心5min,取上清，过0.22μm滤膜，所得即为干细胞条件培养基，备用。
2.3D建模
利用3D打印机内置的激光器对患者疤痕表面进行扫描，获得伤口的大小、形状、薄厚以及患者正常皮肤的表皮真皮厚度等数据，然后利用PlyEdit软件对扫描后的图像进行消除数字噪音等处理并对其进行编辑，使之产生一个连续的表面图像；利用Studio4.0软件将图像转化为立体光刻(.STL)文件并导入至Solid Works软件，使扫描后的溃疡表面图像转变为一个虚拟立体图像(或模块)，可以用来直接打印出对应的敷料。
3.敷料成分的处理
在冰浴条件下先后加入间充质干细胞条件培养基、EGF(50ng/mL)、维生素C(5mg/mL)、维生素E(50mg/mL)、I型胶原1.2％、壳多糖1％、糖胺聚糖6％(6-硫酸软骨素、透明质酸、肝素复合物)、海藻糖1％及戊二醇0.6％，每一步充分搅拌混匀，并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.4，形成敷料溶液。
4.3D打印敷料
利用已经建好的3D敷料模块，将敷料溶液喷涂在基材上，进行打印，打印完成后使至凝固50min，形成个性化3D敷料。
5.打印后处理
待凝固后，敷料从基材上剥离下来后直接用于患者疤痕处。
按照实施例1中的淡化疤痕效果的测试方法，招募的6个患者连续使用一月后，1人痘印完全消失，3人显效，使用部位痘印颜色变淡与周围肤色相近，皮肤平整，2人有效，肉眼可见痘印减轻。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种祛疤组合物，包括：间充质干细胞培养液、表皮细胞生长因子、维生素C和维生素E；
所述表皮细胞生长因子的质量浓度为10～50ng/mL，维生素C的质量浓度为5～50mg/mL，维生素E的质量浓度为5～50mg/mL；
所述间充质干细胞培养液为P1～P5代的间充质干细胞依次经过混合培养基和无酚红培养基培养后得到；
所述混合培养基包括DMEM/F12培养基和胎牛血清。
2.根据权利要求1所述的祛疤组合物，其特征在于，所述表皮细胞生长因子的质量浓度为20～40ng/mL。
3.根据权利要求1所述的祛疤组合物，其特征在于，所述维生素C的质量浓度为10～40mg/mL。
4.根据权利要求1所述的祛疤组合物，其特征在于，所述维生素E的质量浓度为10～40mg/mL。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的祛疤组合物，其特征在于，所述祛疤组合物的pH值为7.2～7.4。
6.根据权利要求1～4任意一项所述的祛疤组合物，其特征在于，所述间充质干细胞培养液按照以下步骤制得：
将P1～P5代的间充质干细胞使用混合培养基培养，待所述间充质干细胞处于指数生长期且汇合度达到70～90％后，去除所述混合培养基的上清物；
往细胞中加入无酚红培养基，培养48～96小时，收集培养液，将培养液离心后取上清液，得到间充质干细胞培养液。
7.一种敷料，由敷料溶液依次经3D打印和固化得到，
所述敷料溶液包括支架成分和权利要求1～6任意一项所述的祛疤组合物；
所述支架成分包括I型胶原蛋白、壳多糖、糖胺聚糖、海藻糖和戊二醇。
8.根据权利要求7所述的敷料，其特征在于，所述I型胶原在敷料溶液中的质量分数为0.8～1.2％；
所述壳多糖在敷料溶液中的质量分数为0.5～3％；
所述糖胺聚糖在敷料溶液中的质量分数为4～6％；
所述海藻糖在敷料溶液中的质量分数为1～5％；
所述戊二醇在敷料溶液中的质量分数为0.1～0.6％。
9.根据权利要求7所述的敷料，其特征在于，所述3D打印按照疤痕大小、形状、薄厚以及皮肤表皮的真皮厚度进行建模打印。
10.根据权利要求7所述的辅料，其特征在于，所述固化的时间为30～60min；
所述固化的温度为0～10℃。
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