CN107375903A - 皮肤修复喷雾及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于皮肤修复技术领域，具体涉及皮肤修复喷雾及其制备方法和用途，其由以下质量分数的组分组成：人干细胞因子5.0×10^‑3～1.0×10^‑2％、维生素C 0.5～2％、稳定剂1～3％、甘油单油酸酯1～3％、乙醇1～5％、聚乙二醇400 5～12％和水余量。本发明皮肤修复喷雾主要活性成分为人干细胞因子和维生素C，辅以稳定剂、分散介质乙醇以及释放调节剂聚乙二醇，各组分相互作用，对糖尿病难愈性溃疡具有很好的愈合作用，并且其体系稳定，可持续长久地发挥疗效。

Description

皮肤修复喷雾及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于皮肤修复技术领域，具体涉及皮肤修复喷雾及其制备方法和用途。

背景技术

糖尿病难愈性溃疡是由糖尿病微血管病变与神经病变所引起的常见糖尿病并发症之一。据WHO最新统计，中国糖尿病患者已达9240万，约超过15％的糖尿病患者发生足溃疡，80％的糖尿病患者会因足溃疡而导致截肢，给患者带来巨大的伤害。自体皮肤移植在糖尿病皮肤溃疡的治疗中取得了很大的成功，但是新增手术创伤以及自体皮肤来源不足限制了其在临床上的应用。

目前，传统的创伤修复材料对普通的皮肤创伤具有很好的治疗作用，但是对于糖尿病导致的创面经久不愈治疗作用不大。一方面是因为糖尿病皮肤创伤会有持续的炎症反应，普通的创伤修复材料没有能够很好的抑制炎症反应；另一方面是，在选用细胞因子联合生物材料治疗重症皮肤创伤时，由于细胞因子在水溶液中的不稳定性，易失去活性，导致疗效不高。

近年来，随着组织工程学研究的不断深入，干细胞及其分泌物受到前所未有的重视。它可以透过皮肤表层细胞阻碍而被深层皮肤细胞所吸收，有效激活基底层的、不再分化的原始干细胞，增强皮肤细胞的分裂增殖能力和新陈代谢功能，所以干细胞生长因子的应用为糖尿病引发的反复的皮肤感染的愈合提供了可能。

目前还未有将干细胞生长因子用于糖尿病难愈性溃疡的报道。

发明内容

本发明旨在提供一种皮肤修复喷雾及其制备方法和用途，其对糖尿病引起的皮肤反复感染、创面经久难愈具有很好的疗效。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：皮肤修复喷雾，由以下质量分数的组分组成：人干细胞因子5.0×10^-3～1.0×10^-2％、维生素C 0.5～2％、稳定剂1～3％、甘油单油酸酯1-3％、乙醇1-5％、聚乙二醇400 5～12％和水余量。

进一步地，所述皮肤修复喷雾由以下质量分数的组分组成：人干细胞因子0.8×10^-2％、维生素C 1％、稳定剂2％、甘油单油酸酯2％、乙醇3％、聚乙二醇400 8％和水余量。

进一步地，所述皮肤修复喷雾由以下质量分数的组分组成：人干细胞因子5.0×10^-3％、维生素C 0.5％、稳定剂1％、甘油单油酸酯1％、乙醇1％、聚乙二醇400 5％和水余量。

进一步地，所述皮肤修复喷雾由以下质量分数的组分组成：人干细胞因子1.0×10^-2％、维生素C 2％、稳定剂3％、甘油单油酸酯3％、乙醇5％、聚乙二醇400 12％和水余量。

进一步地，所述稳定剂由以下浓度的组分组成：人脐带间充质干细胞碎片0.1～2mg/mL、牛磺酸1～3mg/mL和α-酮戊二酸1×10^-3～3×10^-3mol/L。

进一步地，所述稳定剂由以下浓度的组分组成：人脐带间充质干细胞碎片1.2mg/mL、牛磺酸1.5mg/mL和α-酮戊二酸2×10^-3mol/L。

进一步地，所述人脐带间充质干细胞碎片由以下步骤制得：

取人脐带间充质干细胞于37℃水浴中迅速解冻；取离心管装入10ml含体积分数为10％FBS的DMEM/F12培养基，将上述解冻后的细胞转移到离心管中，轻轻吹打均匀，1200转/分离心3～5min后收集细胞，使用D-Hank′s平衡盐溶液洗涤细胞，离心粉碎，即得。

相应地，本发明还提供了一种制备上述皮肤修复喷雾的方法，包括以下步骤：

将聚乙二醇400、甘油单油酸酯以及乙醇混合均匀后，加入稳定剂，涡旋混匀后，加入人干细胞因子和维生素C水溶液，不断涡旋使其形成均一稳定的溶液，即得。

本发明另一目的在于提供上述皮肤修复喷雾在治疗糖尿病难愈性溃疡中的用途。

人干细胞因子在体系中不稳定，易失去活性，影响疗效。发明人经过长期的经验积累和大量的试验研究，终于得到一种优良的稳定剂，其由人脐带间充质干细胞碎片、牛磺酸和α-酮戊二酸组成。试验证明，加入该稳定剂后，在4℃、-20℃以及常温的条件保存30天后干细胞生长因子含量仍然保持在较高的水平，与对照组相比具有极显著差异，而令人意想不到的是，不加入稳定剂的皮肤修复喷雾在同样的环境下保存后，干细胞因子的含量有显著下降。

本发明具有以下优点：

1)本发明皮肤修复喷雾主要活性成分为人干细胞因子和维生素C，辅以稳定剂、分散介质乙醇以及释放调节剂聚乙二醇，各组分相互作用，对糖尿病难愈性溃疡具有很好的愈合作用，并且其体系稳定，可持续长久地发挥疗效。

2)经试验证明，含有稳定剂的皮肤修复喷雾在4℃、-20℃以及常温的条件下保存30天后干细胞生长因子含量仍然保持在较高的水平，与对照组相比具有极显著差异，分别仅仅下降了22.1％、14.3％以及29％，而不加入稳定剂的修复喷雾在同样的条件下保存后，干细胞因子的含量有明显下降。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

人干细胞因子购自于江苏普罗赛生物技术有限公司；人脐带间充质干细胞购于湖南丰晖生物科技有限公司，细胞代数为P2代，细胞活力＞90％。

实施例1、人脐带间充质干细胞碎片的制备

取购买得到的人脐带间充质干细胞于37℃水浴中迅速解冻；取离心管装入10ml含体积分数为10％FBS的DMEM/F12培养基，将上述解冻后的细胞转移到离心管中，轻轻吹打均匀，1200转/分离心5min后收集细胞，使用D-Hank′s平衡盐溶液洗涤细胞，离心粉碎，即得。

本发明实施例2～4配方修复喷雾配方及用量

制备方法：

将聚乙二醇400、甘油单油酸酯以及乙醇混合均匀后，加入稳定剂，涡旋混匀得一混合液；取人干细胞因子和维生素C溶于水形成水溶液，将水溶液与上述混合液混合，不断涡旋使其形成均一稳定的溶液，即得。

对比例1、皮肤修复喷雾

对比例1与实施例2的区别在于：去掉维生素C，人干细胞因子的含量增加至1.008％，其余参数及操作如实施例2。

对比例2、皮肤修复喷雾

对比例2与实施例2的区别在于：去掉人干细胞因子，维生素C的含量增加至1.008％，其余参数及操作如实施例2。

对比例3、皮肤修复喷雾

对比例3与实施例2的区别在于：不含稳定剂，其余参数及操作如实施例2。

试验一、本发明皮肤修复喷雾促进糖尿病难愈性溃疡修复试验

1.1试验材料：南京大学模式动物中心提供的C57BKS.Cg-m+/+Lepr^db基因型Ⅱ型糖尿病小鼠60只。

1.2外伤型溃疡模型：小鼠用戊巴比妥钠45mg/kg腹腔注射麻醉，背部用脱毛剂脱毛，在背部左右两侧各做一个直径1.8cra圆形标记，用碘伏皮肤消毒后沿标记线将全层皮肤切除，形成面积约2.45cm²的新鲜创面；创面按压止血，暴露治疗，编号并单笼饲养，给普通鼠粮自由摄取。

1.3试验分组和给药方法：取上述造模成功后的小鼠60只，在不禁食状态下检查血糖水平，将血糖水平接近的动物分为一组，共分为6组：空白对照组(10只，涂抹生理盐水)、阳性对照组(10只，涂抹中国专利申请CN106492269A所述温敏水凝胶)、实施例2组(10只，伤口处喷涂实施例2皮肤修复喷雾)、对比例1组(10只，伤口处喷涂对比例1皮肤修复喷雾)、对比例2组(10只，伤口处喷涂对比例2皮肤修复喷雾)和对比例3组(10只，伤口处喷涂对比例3皮肤修复喷雾)。每组每日给药1次，连续给药21天。创面形成后当天开始治疗，治疗前用双氧水冲洗伤口并用碘伏消毒创面。各自治疗组一侧创面涂对应受试药物，另一侧涂以等体积溶媒作为对照，空白对照组一侧创面涂以等体积生理盐水，另一侧不做任何处理。

1.4统计创伤面积收缩率：给药后每天观察创口愈合情况，并统计两种创伤类型治疗前后创面面积，计算创面面积收缩率，结果如表1所示。

创面面积收缩率＝治疗前后创面面积差/治疗前创面面积×100％

表1对Ⅱ型糖尿病小鼠皮肤外伤性溃疡的治疗作用

从表1可以明显看出，试验第3天，实施例2组的创伤面积收缩明显快于其余各组，到试验的第21天，创伤面积收缩率达到98.3％。对比例1～3组从试验第三天开始，创伤面积收缩率与空白对照组相比，均有一定程度上的提高，其中从对比例1和2组试验结果看可以看出，不论是去掉维生素C还是人干细胞因子，都一定程度上降低了本发明修复喷雾的治疗效果，其第21天创面收缩率与实施例2相比有显著下降。这说明，在一定程度上，维生素C与人干细胞因子组合使用具有协同增效的作用。

从对比例3组的试验结果可知，稳定剂的存在有无，也会一定程度上影响皮肤喷雾的治疗效果。

从阳性对照组试验结果可以看出，现有的创伤修复产品对糖尿病难愈性溃疡的治疗作用不大，而本发明在治疗糖尿病难愈性溃疡具有显著的效果。

对各用药组小鼠的愈合时间统计得出：空白对照组平均愈合时间为40±1天；实施例2组小鼠平均愈合时间为22±1天；对比例1～3组平均愈合时间分别是26±1天，33±1天，27±1天，而阳性对照组平均愈合时间32天±1天。

试验二、不同稳定剂组成对皮肤修复喷雾稳定性的影响

按下表2设置不同稳定剂组成制备得到各皮肤修复喷雾，人干细胞生长因子在皮肤喷雾中的浓度为8μg/L，将各皮肤修复喷雾置于-4℃、20℃以及常温的条件下储藏30d，采用ELISA方法检测干细胞生长因子的含量，试剂盒购自美国RapidBio公司，实验操作按试剂盒说明进行，试验结果如表3所示。

表2不同稳定剂组成

表3试验结果

注：与对照组同项相比，^**P＜0.01，^*P＜0.05。

由表3可知，与不含有稳定剂的对照组相比，A～D组在-4℃、20℃以及常温的条件下储藏30d后干细胞生长因子的含量均高于对照组。特别值得说明的是，A组在4℃、-20℃以及常温的条件保存30天后干细胞生长因子含量仍然保持在较高的水平，与对照组相比具有极显著差异，分别仅仅下降了22.1％、14.3％以及29％。B～D组干细胞生长因子含量与A组相比均有所下降，尤其是B组下降幅度最大，在4℃、-20℃以及常温的条件保存30天后分别下降了54.3％、39.1％和63.8％，这表明，稳定剂组成的改变均会对干细胞因子的活性构成显著的影响。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (7)

1.皮肤修复喷雾，其特征在于，由以下质量分数的组分组成：人干细胞因子5.0×10^-3～1.0×10^-2％、维生素C 0.5～2％、稳定剂1～3％、甘油单油酸酯1-3％、乙醇1-5％、聚乙二醇400 5～12％和水余量。

2.如权利要求1所述的皮肤修复喷雾，其特征在于，由以下质量分数的组分组成：人干细胞因子0.8×10^-2％、维生素C 1％、稳定剂2％、甘油单油酸酯2％、乙醇3％、聚乙二醇4008％和水余量。

3.如权利要求1或2所述的皮肤修复喷雾，其特征在于，所述稳定剂由以下浓度的组分组成：人脐带间充质干细胞碎片0.1～2mg/mL、牛磺酸1～3mg/mL和α-酮戊二酸1×10^-3～3×10^-3mol/L。

4.如权利要求3所述的皮肤修复喷雾，其特征在于，所述稳定剂由以下浓度的组分组成：人脐带间充质干细胞碎片1.2mg/mL、牛磺酸1.5mg/mL和α-酮戊二酸2×10^-3mol/L。

5.如权利要求3或4所述的皮肤修复喷雾，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞碎片由以下步骤制得：

取人脐带间充质干细胞于37℃水浴中迅速解冻；取离心管装入10ml含体积分数为10％FBS的DMEM/F12培养基，将上述解冻后的细胞转移到离心管中，轻轻吹打均匀，1200转/分离心3～5min后收集细胞，使用D-Hank′s平衡盐溶液洗涤细胞，离心粉碎，即得。

6.一种制备如权利要求1～5任一所述的皮肤修复喷雾的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将聚乙二醇400、甘油单油酸酯以及乙醇混合均匀后，加入稳定剂，涡旋混匀后，加入人干细胞因子和维生素C水溶液，不断涡旋使其形成均一稳定的溶液，即得。

7.如权利要求1～5任一所述的皮肤修复喷雾或如权利要求6制备得到的皮肤修复喷雾在治疗糖尿病难愈性溃疡中的用途。