CN106924719A - 含人干细胞因子的皮肤修复液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物制剂领域,具体涉及含人干细胞因子的皮肤修复液及其制备方法,由以下质量分数的原料组成:人干细胞因子1.0×10‑3~0.1%、稳定剂1~5%、莎梵婷40~80%、聚乙二醇400 5~20%和水余量。本发明皮肤修复液主要活性成分为人干细胞因子,对糖尿病皮肤创伤修复就有很好的愈合作用,并且其体系稳定,可持续长久地发挥疗效。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域,具体涉及含人干细胞因子的皮肤修复液及其制备方法。
背景技术
糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病对患者最大的威胁来自其慢性并发症,主要表现为视网膜病变、糖尿病性肾病、糖尿病神经病变和反复的皮肤感染。其中反复的皮肤感染体现在经久不愈的创面及皮肤自发溃疡,这不仅困扰着临床医生,也是医学界面临的重大难题。糖尿病慢性并发症已成为糖尿病患者致残和致死的主要原因,也是医疗费用增加的主要因素,带给患者无可磨灭的痛苦。
目前,传统的创伤修复材料对普通的皮肤创伤具有很好的治疗作用,但是对于糖尿病导致的创面经久不愈治疗作用不大。一方面是因为糖尿病皮肤创伤会有持续的炎症反应,普通的创伤修复材料没有能够很好的抑制炎症反应;另一方面是,在选用细胞因子联合生物材料治疗重症皮肤创伤时,由于细胞因子在水溶液中的不稳定性,易失去活性,导致疗效不高。
近年来,随着组织工程学研究的不断深入,干细胞及其分泌物受到前所未有的重视。它可以透过皮肤表层细胞阻碍而被深层皮肤细胞所吸收,有效激活基底层的、不再分化的原始干细胞,增强皮肤细胞的分裂增殖能力和新陈代谢功能,所以干细胞生长因子的应用为糖尿病引发的反复的皮肤感染的愈合提供了可能。
目前还未有将干细胞生长因子用于糖尿病皮肤创伤修复的报道。
发明内容
本发明旨在提供一种含人干细胞因子的皮肤修复液及其制备方法,其对糖尿病引起的皮肤反复感染、创面经久不愈具有很好的疗效。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案:含人干细胞因子的皮肤修复液,由以下质量分数的组分组成:人干细胞因子1.0×10-3~0.1%、稳定剂1~5%、莎梵婷40~80%、聚乙二醇4005~20%和水余量。
进一步地,所述皮肤修复液由以下质量分数的组分组成:人干细胞因子3.0×10-3~0.08%、稳定剂2~5%、莎梵婷50~80%、聚乙二醇4005~10%和水余量。
进一步地,所述稳定剂由以下浓度的组分组成:人胎盘间充质干细胞碎片0.5~3mg/mL、牛磺酸2~6mg/mL和α-酮戊二酸1×10-3~5×10-3mol/L。
进一步地,所述稳定剂由以下浓度的组分组成:人胎盘间充质干细胞碎片1~2mg/mL、牛磺酸2~4mg/mL和α-酮戊二酸2×10-3~5×10-3mol/L。
进一步地,所述稳定剂由以下浓度的组分组成:人胎盘间充质干细胞碎片1.5mg/mL、牛磺酸3.5mg/mL和α-酮戊二酸3.5×10-3mol/L。
进一步地,所述人胎盘间充质干细胞碎片由以下步骤制得:
S1、胎盘标本处理:取健康母体胎盘,检验检疫合格后,将胎盘组织进行组织消化,得细胞悬液;
S2、不连续Percoll梯度密度分离:在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液,每个密度5mL,再缓缓加入5mL细胞悬液,使用水平离心机室温下1200g离心20min,小心弃除离心管20mL刻度以上的液体,收集12.5~20.0mL刻度的细胞层和12.5~7.5mL刻度的液体,分别放入不同离心管里,用D-H ank’s液稀释5倍后,室温下1000g离心15min;
S3、纯化:用含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF配制成悬浮液,将密度梯度离心后的滋养细胞进行重悬,用差速贴壁法去除成纤维细胞后计数;
S4、传代与鉴定:将上述滋养细胞接种于加入含有体积分数15%FBS的DMEM/F12培养液,放置于37℃、体积分数5%的CO2饱和湿度培养箱内培养,每3d补加新鲜培养液,按1×104cell/cm2传代培养,培养液换为体积分数10%FBS的DMEM/F12培养基,细胞代数记为P1代,待细胞达到70~90%融合后,消化,按1×104cell/cm2传代培养,细胞代数记为P2代,收集P2代细胞,通过流式细胞仪鉴定,鉴定符合要求后使用D-Hank′s平衡盐溶液洗涤细胞,离心粉碎,即得。
进一步地,所述的皮肤修复液为液体制剂。
相应地,本发明还提供了一种制备上述的皮肤修复液的方法,包括以下步骤:
将聚乙二醇400和莎梵婷混合均匀后,加入稳定剂,涡旋混匀后,加入人干细胞因子水溶液,不断涡旋使其形成均一稳定的溶液,即得。
本发明另一目的在于提供上述的含有干细胞因子的皮肤修复液在促进糖尿病皮肤创伤修复中的用途。
人干细胞因子在水溶液中不稳定,易失去活性,影响疗效。发明人经过长期的经验积累和大量的试验研究,终于得到一种优良的稳定剂,其由人胎盘间充质干细胞碎片、牛磺酸和α-酮戊二酸组成。试验证明,加入该稳定剂后,在4℃保存30天后,本发明皮肤修复液中的干细胞因子仍然可以刺激HDF细胞(人真皮成纤维细胞)细胞增殖,其疗效仍然保持良好,而令人意想不到的是,不加入稳定剂的修复液在同样的环境下保存后,干细胞因子的活性有明显下降。
本发明的修复液中通过进一步地加入莎梵婷,可以减少聚乙二醇的用量,降低其对药物活性的影响,同时莎梵婷是一种新型的环脂肽类生物表面活性剂,分子式为C53H93N7O13,其能够促进各有效成分与皮肤的贴合,促进皮肤对活性成分的吸收,从而进一步提升疗效。
本发明具有以下优点:
1)本发明皮肤修复液主要活性成分为人干细胞因子,对糖尿病皮肤创伤修复就有很好的愈合作用,其体系稳定,可持续长久地发挥疗效。
2)经试验证明,含有稳定剂的皮肤修复液在4℃保存30天后,皮肤修复液中的干细胞因子仍然可以刺激HDF细胞(人真皮成纤维细胞)细胞增殖,而不加入稳定剂的修复液在同样的环境下保存后,干细胞因子的活性有明显下降。
3)本发明进一步地加入莎梵婷,一方面能够减少聚乙二醇的用量,降低其对药物活性的影响,另一方面莎梵婷能够促进各有效成分与皮肤的贴合,促进皮肤对活性成分的吸收,提升疗效。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
人干细胞因子购自于江苏普罗赛生物技术有限公司。
实施例1、人胎盘间充质干细胞碎片的制备
(1)胎盘标本处理:从广东省广州市三甲医院妇产科手术台获得足月、剖宫产、健康母体胎盘,经检验检疫合格后(证实无HIV、HBV等传染性疾病),在无菌条件下剥除母体蜕膜,剪取小块胚胎蜕膜侧胎盘组织,放入含抗生素的D-Hank′s液中,洗尽血液,剔除血管,并剪成1.0~2.0mm3小块,用含质量百分比0.25%的胰蛋白酶和质量百分比0.02%EDTA的消化液消化,得细胞悬浮液;
(2)不连续Percoll梯度密度分离:在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液,每个密度5mL,再缓缓加入5mL细胞悬液,使用水平离心机室温下1200g离心20min,小心弃除离心管20mL刻度以上的液体,收集12.5~20.0mL刻度的细胞层和12.5~7.5mL刻度的液体;在离心管15~20mL刻度处可见明显的白色云雾状细胞层,此处对应的Percoll相对密度为1.046~1.059,是滋养细胞存在的区域;离心管10mL刻度附近可见不明显的细胞层,此处密度为1.072,是淋巴细胞和胎盘间充质干细胞存在的区域;分别放入不同离心管里,用D-Hank’s液稀释5倍后,室温下1000g离心15min,离心管底可见白色细胞团;
(3)纯化:用含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF配制成悬浮液,将密度梯度离心后的滋养细胞进行重悬,用差速贴壁法去除成纤维细胞后计数,获得的滋养细胞量可达6.15)×108个;
(4)传代与鉴定:将上述滋养细胞接种于加入含有体积分数15%FBS的DMEM/F12培养液放置于37℃、体积分数5%的CO2饱和湿度培养箱内培养,每3d补加新鲜培养液,按1×104cell/cm2传代培养,培养液换为体积分数10%FBS的DMEM/F12培养基,细胞代数记为P1代;待细胞达到70~90%融合后,消化,按1×104cell/cm2传代培养,细胞代数记为P2代,收集P2代细胞;通过流式细胞仪鉴定细胞表面抗原,检测结果显示得到的细胞与人胎盘间充质干细胞特征一致,说明分离培养细胞为人胎盘间充质干细胞;使用D-Hank′s平衡盐溶液洗涤细胞,离心粉碎,即得。
本发明实施例2~4修复液配方及用量
制备方法:
将聚乙二醇400和莎梵婷混合均匀后,加入稳定剂,涡旋混匀后,加入人干细胞因子水溶液,不断涡旋使其形成均一稳定的溶液,即得。
对比例1、含人干细胞因子的皮肤修复液
对比例1与实施例2的区别在于:用十二烷基硫酸钠替换莎梵婷,其余参数及操作如实施例2。
对比例2、含人干细胞因子的皮肤修复液
对比例2与实施例2的区别在于:莎梵婷的用量为82%,其余参数及操作如实施例2。
试验一、本发明修复液促进糖尿病皮肤创伤修复试验
1.1试验材料:南京大学模式动物中心提供的C57BKS.Cg-m+/+Leprdb基因型Ⅱ型糖尿病小鼠60只。
1.2皮肤损伤模型的建立:先用脱毛膏将小鼠背部双侧毛发脱除,再用皮肤打孔器在双侧做8mm的圆形全层皮肤切除伤口。
1.3试验分组和给药方法:取上述皮肤损伤模型的小鼠60只,随机分为6组:空白对照组(10只,不加任何处理)、阳性对照组(10只,涂抹中国专利申请CN106492269A所述温敏水凝胶)、实施例2组(10只,伤口处涂抹实施例2皮肤修复液)、实施例3组(10只,伤口处涂抹实施例3皮肤修复液)、对比例1组(10只,伤口处涂抹对比例1皮肤修复液)和对比例2组(10只,伤口处涂抹对比例2皮肤修复液)。
1.4统计结果:给药后每天观察创口愈合情况,并统计愈合率,结果如表1所示。
表1 试验结果
注:与对照组相比,**P<0.01,*P<0.05。
从表1可以明显看出,涂抹本发明实施例2~4皮肤修复液后第7天愈合率较对照组明显显著(**P<0.01),尤其是涂抹后第14天,愈合率达到了90%以上,而对照组仅仅为50%左右,并且所有试验小鼠均存活至试验完成。
对比例1组为各组愈合率最差,这说明,与常规的表面活性剂十二烷基硫酸钠相比,莎梵婷更适于应用于本发明修复液体系。
对比例2组愈合率较实施例2组有所下降,这说明,莎梵婷的用量对本发明修复液的疗效也有一定的影响。
从阳性对照组试验结果可以看出,现有的创伤修复产品对糖尿病皮肤创伤修复的治疗作用不大。
试验二、不同稳定剂组成对皮肤修复液稳定性的影响
按下表2设置不同稳定剂组成制备得到各皮肤修复液,将各皮肤修复液置于4℃的条件下储藏5d、15d、30d后收集各组细胞因子,洗净,备用;检测各皮肤修复液中干细胞因子的生物活性。
试验方法:取对数生长HDF细胞(人真皮成纤维细胞)1×106细胞/mL,以每孔1×105细胞/孔加入96孔培养板中,12h加入上述收集得到的各组细胞因子,继续培养6h后加入细胞裂解液再培养4h,OD570nm比色,试验重复试验结果如表3所示。
表2 不同稳定剂组成
表3 试验结果
由表3可知,与不含有稳定剂的对照组相比,A~D组的OD570nm值明显增加,特别值得说明的是,A组在4℃保存30天后OD570nm值仍保持在较高水平,这说明,在4℃保存30天后,本发明皮肤修复液中的干细胞因子仍然可以刺激HDF细胞(人真皮成纤维细胞)细胞增殖。
B~D组OD570nm值与A组相比均有所下降,尤其是B组下降幅度最大,这表明,稳定剂组成的改变均会对干细胞因子的活性有明显影响。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1.含人干细胞因子的皮肤修复液,其特征在于,由以下质量分数的组分组成:人干细胞因子1.0×10-3~0.1%、稳定剂1~5%、莎梵婷40~80%、聚乙二醇4005~20%和水余量。
2.如权利要求1所述的皮肤修复液,其特征在于,由以下质量分数的组分组成:人干细胞因子3.0×10-3~0.08%、稳定剂2~5%、莎梵婷50~80%、聚乙二醇4005~10%和水余量。
3.如权利要求1或2所述的皮肤修复液,其特征在于,所述稳定剂由以下浓度的组分组成:人胎盘间充质干细胞碎片0.5~3mg/mL、牛磺酸2~6mg/mL和α-酮戊二酸1×10-3~5×10-3mol/L。
4.如权利要求3所述的皮肤修复液,其特征在于,所述稳定剂由以下浓度的组分组成:人胎盘间充质干细胞碎片1~2mg/mL、牛磺酸2~4mg/mL和α-酮戊二酸2×10-3~5×10- 3mol/L。
5.如权利要求3所述的皮肤修复液,其特征在于,所述稳定剂由以下浓度的组分组成:人胎盘间充质干细胞碎片1.5mg/mL、牛磺酸3.5mg/mL和α-酮戊二酸3.5×10-3mol/L。
6.如权利要求3~5任一所述的皮肤修复液,其特征在于,所述人胎盘间充质干细胞碎片由以下步骤制得:
S1、胎盘标本处理:取健康母体胎盘,检验检疫合格后,将胎盘组织进行组织消化,得细胞悬液;
S2、不连续Percoll梯度密度分离:在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液,每个密度5mL,再缓缓加入5mL细胞悬液,使用水平离心机室温下1200g离心20min,小心弃除离心管20mL刻度以上的液体,收集12.5~20.0mL刻度的细胞层和12.5~7.5mL刻度的液体,分别放入不同离心管里,用D-Hank’s液稀释5倍后,室温下1000g离心15min,
S3、纯化:用含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF配制成悬浮液,将密度梯度离心后的滋养细胞进行重悬,用差速贴壁法去除成纤维细胞后计数;
S4、传代与鉴定:将上述滋养细胞接种于加入含有体积分数15%FBS的DMEM/F12培养液,放置于37℃、体积分数5%的CO2饱和湿度培养箱内培养,每3d补加新鲜培养液,按1×104cell/cm2传代培养,培养液换为体积分数10%FBS的DMEM/F12培养基,细胞代数记为P1代,待细胞达到70~90%融合后,消化,按1×104cell/cm2传代培养,细胞代数记为P2代,收集P2代细胞,通过流式细胞仪鉴定,鉴定符合要求后使用D-Hank′s平衡盐溶液洗涤细胞,离心粉碎,即得。
7.如权利要求1所述的皮肤修复液,其特征在于,所述的皮肤修复液为液体制剂。
8.一种制备如权利要求1~7任一所述的皮肤修复液的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将聚乙二醇400和莎梵婷混合均匀后,加入稳定剂,涡旋混匀后,加入人干细胞因子水溶液,不断涡旋使其形成均一稳定的溶液,即得。
9.如权利要求1~8任一所述的皮肤修复液在促进糖尿病皮肤创伤修复中的用途。
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