CN101917959A - 肽纳米粒子和其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供包括一种或一种以上肽的纳米粒子组合物。本发明可实现所述肽的经皮传递而无需进行肽修饰或无需对皮肤使用化学或机械研磨或破坏。

Description

肽纳米粒子和其用途

相关申请案

本申请案根据35U.S.C.§119(e)主张2006年12月1日申请的美国临时专利申请案U.S.S.N.60/872,206(“′206申请案”)的优先权。′206申请案的全部内容以引用的方式并入本文中。

背景技术

已显示肽对于皮肤具有有益的化妆和治疗效用。在实验模型中，已显示短肽(长度至多30个氨基酸)刺激皮肤细胞外基质中的胶原蛋白生长，这可改善皮肤的外观以及改善受损皮肤的愈合(片山(Katayama)等人，1993，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，268：9941；以引用的方式并入本文中)。也已显示经修饰的肽通过调节酶来减少皱纹外观，这些酶影响皮肤下层肌肉中促使皱纹形成的肌肉收缩(路波(Lupo)，2005，皮肤外科(Dermatol.Surg.)，31：832；以引用的方式并入本文中)。

然而，将肽穿过表皮屏障(角质层)经皮传递到生物作用位点，例如细胞外基质或下层肌肉，过去一直是实现这些肽在人类体内潜在化妆和治疗效用的一大难题(罗宾逊(Robinson)等人，2005，国际化妆品科学杂志(International J.Cosmetic Science)27：155；以引用的方式并入本文中)。为了实现肽在人类体内的经皮传递的传递，必须通过添加诸如(但不限于)乙酰基和/或棕榈酰基等化学部分来化学修饰肽(罗宾逊(Robinson)等人，见上)。这些化学修饰是不利的，因为其昂贵且耗时，这不利地影响含有这些肽的产品的工业生产。肽的化学修饰也会通过降低肽结合于具有生物活性的细胞受体位点处的能力(例如通过位阻影响)而降低肽的生物活性，使其不太有效。生物学上不太有效的肽将不足以实现化妆或治疗目的。相对而言，生物学上不太有效的肽将需要以较高含量投与来实现其所需生物效应(如果效应还有可能存在)，这对于产品的工业生产来说将是成本不利因素。

发明内容

本发明描述并入有未经修饰的短肽(2个到30个氨基酸长)的纳米粒子，这些未经修饰的短肽在皮肤(包括表皮和真皮)、皮下组织(包括脂肪组织)和相邻肌肉内为生物活性剂。

本发明的纳米粒子可施用于个体皮肤上。在一些实施例中，本发明的纳米粒子实现所并入的肽经皮传递到所述个体。

本发明的纳米粒子可以作为简单悬浮液或分散液形式施用于皮肤上，或与一种或一种以上赋形剂混合并制备为调配物，诸如(但不限于)柔肤水、营养水、洁肤液、洁面霜、乳液、润肤乳、按摩膏、润肤霜、底妆液、唇膏、面膜或面胶、清洁剂调配物(例如香波、漂洗剂、沐浴露、护发素和肥皂)和皮肤科用组合物(例如洗剂、软膏、凝胶、乳膏、贴片和喷雾)。

因此，本发明提供用于经皮传递未经修饰的肽的系统和组合物。本发明的许多优点之一是能够传递肽而无需注射也无需机械或化学研磨或改造皮肤。其它优点包括能够利用未经修饰的肽，从而简化本发明化妆用和/或药用制剂的生产并降低生产成本，而且保留肽的生物活性。

附图说明

图1是用肽纳米粒子处理的小鼠的组织学分析。展示用梅森三色染色法染色的皮肤组织的显微照片。对照组(不含五肽的纳米粒子调配物)平均组织学得分是2.33，最高可能得分4。处理组(含五肽的纳米粒子调配物)平均组织学得分是3.67，最高可能得分4。

具体实施方式

定义

研磨：如本文中所使用，术语“研磨”是指改造、破坏、除去或损坏皮肤表层的任何方法。在一些实施例中，研磨是指改造、破坏、除去或损坏皮肤表层的机械方法。在一些实施例中，研磨是指改造、破坏、除去或损坏皮肤表层的化学方法。仅举数例，诸如磨砂膏(exfoliant)、细粒(例如镁或铝粒子)、酸(例如α-羟基酸或β-羟基酸)、醇类等药剂可能引起研磨。一般来说，预期诸如那些(例如)由多诺万(Donovan)(例如美国专利公开案2004/009180和2005/175636和PCT公开案WO 04/06954；全部以引用的方式并入本文中)和格雷厄姆(Graham)(例如美国专利6,939,852和美国专利公开案2006/093624；全部以引用的方式并入本文中)等所描述的渗透增强剂可引起研磨。当然，所属领域的技术人员应了解，特定药剂在以一定浓度存在或结合一种或一种以上其它药剂时可能引起研磨，但在不同情况下可能不引起研磨。因此，特定材料是否是“研磨剂”需视情况而定。研磨可由所属领域的技术人员容易地加以评估，例如通过对皮肤的泛红或刺激的观察和/或对显示角质层的改造、破坏、除去或糜烂的皮肤的组织学检查。

氨基酸：如本文中所使用，术语“氨基酸”在其最广义上是指可并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸具有通用结构H₂N-C(H)(R)-COOH。在一些实施例中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的二十种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸外的任何氨基酸，不考虑其是以合成方式制备还是从天然来源获得。肽中包括羧基和/或氨基末端氨基酸在内的氨基酸可通过可改变肽的循环半衰期而不对其活性产生不利影响的甲基化、酰胺化、乙酰化和/或以其它化学基团取代来修饰。然而，如本文中所述，本发明特别针对“未经修饰的肽”，意思是尚未经化学修饰以便促进或实现经皮传递的肽。氨基酸可参与二硫键。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用这一术语的上下文中显而易见，其不是指游离氨基酸，就是指肽的残基。

动物：如本文中所使用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施例中，所述非人类动物是哺乳动物(例如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔子、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物包括(但不限于)哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可以是转基因动物、遗传工程动物和/或克隆动物(clone)。

约：如本文中所使用，术语“约”在应用于所关注的一个或一个以上值时是指类似于所述参考值的值。在某些实施例中，除非另有规定或由上下文显而易见(除了所述数目将超过可能值的100％)，否则术语“约”是指落在所述参考值的任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或1％以下内的值范围。

生物活性剂：如本文中所使用，短语“生物活性剂”是指在生物系统和/或生物体中具有活性的任何物质。举例来说，当向生物体投与时对所述生物体具有生物效应的物质被视为具有生物活性。在特定实施例中，当蛋白质或多肽具有生物活性时，所述蛋白质或多肽的共有蛋白质或多肽的至少一种生物活性的一部分通常被称为“生物活性”部分。

肉毒毒素(Botulinum toxin)：如本文中所使用，术语“肉毒毒素”是指由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生的任何神经毒素。除非另有指示，否则所述术语涵盖所述神经毒素的保留适当活性(例如肌肉松弛活性)的片段或部分(例如轻链和/或重链)。如本文中所使用，短语“肉毒毒素”涵盖肉毒毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。如本文中所使用，肉毒毒素也涵盖肉毒毒素复合物(即，例如300、600和900kD复合物)以及经纯化(即，例如经分离)的肉毒毒素(即，例如约150kD)。“经纯化的肉毒毒素”定义为与包括肉毒毒素复合物的蛋白质的其它蛋白质分离或实质上分离的肉毒毒素。经纯化的毒素的纯度可大于95％且纯度优选大于99％。所属领域的技术人员应了解本发明并不限于任何特定来源的肉毒毒素。举例来说，根据本发明使用的肉毒毒素可从肉毒梭菌分离，可以化学方式合成，可重组产生(即，在除肉毒梭菌外的宿主细胞或生物体中)等。

特征部分：如本文中所使用，短语物质的“特征部分”在最广义上是与相关完整物质共有一定程度的序列和/或结构一致性和/或至少一种功能特征的部分。举例来说，蛋白质或多肽的“特征部分”是含有共同成为蛋白质或多肽的特征的连续氨基酸段或一组连续氨基酸段的部分。在一些实施例中，每一所述连续段通常将含有至少2个、5个、10个、15个、20个或20个以上氨基酸。一般来说，特征部分是除以上所指定的序列一致性外与相关完整蛋白质共有至少一种功能特征的部分。在一些实施例中，特征部分可具有生物活性。

亲水性：如本文中所使用，“亲水性”物质是可溶于极性溶剂中的物质。在一些实施例中，亲水性物质可暂时与极性溶剂键结。在一些实施例中，亲水性物质通过氢键暂时与极性溶剂键结。在一些实施例中，极性溶剂为水。在一些实施例中，亲水性物质可以是离子型。在一些实施例中，亲水性物质可以是非离子型。在一些实施例中，与在油、非极性溶剂或疏水性溶剂中相比，亲水性物质可更易溶解于水、极性溶剂或亲水性溶剂中。在一些实施例中，与在水、极性溶剂或亲水性溶剂中相比，亲水性物质可更不易溶解于油、非极性溶剂或疏水性溶剂中。在一些实施例中，一种物质相对于另一物质是亲水性的，因为其比另一物质更易溶于水、极性溶剂或亲水性溶剂中。在一些实施例中，一种物质相对于另一物质是亲水性的，因为其比另一物质更不易溶于油、非极性溶剂或疏水性溶剂中。

疏水性：如本文中所使用，“疏水性”物质是可溶于非极性溶剂中的物质。在一些实施例中，疏水性物质受到极性溶剂排斥。在一些实施例中，极性溶剂为水。在一些实施例中，疏水性物质为非极性的。在一些实施例中，与在水、极性溶剂或亲水性溶剂中相比，疏水性物质可更易溶解于油、非极性溶剂或疏水性溶剂中。在一些实施例中，与在油、非极性溶剂或疏水性溶剂中相比，疏水性物质可更不易溶解于水、极性溶剂或亲水性溶剂中。在一些实施例中，一种物质相对于另一物质是疏水性的，因为其比另一物质更易溶于油、非极性溶剂或疏水性溶剂中。在一些实施例中，一种物质相对于另一物质是疏水性的，因为其比另一物质更不易溶于水、极性溶剂或亲水性溶剂中。

与...结合：如本文中所使用，短语“结合传递”是指两种或两种以上物质或药剂的共同传递。具体来说，根据本发明，所述短语在本文中提及生物活性剂与本发明的纳米粒子和/或纳米粒子组合物一起传递时使用。当一种物质或药剂与纳米粒子和/或纳米粒子组合物组合时；由纳米粒子囊封或完全包围时；包埋在纳米粒子胶束膜中时；和/或与纳米粒子胶束膜的外表面缔合时，所述物质或药剂与纳米粒子结合传递。欲与纳米粒子和/或纳米粒子组合物结合传递的物质或药剂可能与或可能不与所述纳米粒子和/或纳米粒子组合物共价键联。欲与本发明的纳米粒子和/或纳米粒子组合物结合传递的物质或药剂可能通过或可能不通过吸附力附着至所述纳米粒子和/或纳米粒子组合物。

经分离：如本文中所使用，术语“经分离”是指如下物质和/或实体：(1)已与最初产生时与其相关的至少一些组分分离(无论在自然界中和/或在实验环境中)；和/或(2)通过人工产生、制备和/或制造。经分离的物质和/或实体可与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或90％以上与其最初相关的其它组分分离。在一些实施例中，经分离的物质和/或实体的纯度大于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

微流体化：如本文中所使用，术语“微流体化”的意思是暴露于高剪切力下。在一些实施例中，所述暴露于高剪切力下是通过暴露于高压下来实现；在一些实施例中，所述高压在约15,000psi到约26,000psi的范围内。在一些实施例中，所述暴露于高剪切力下是通过空化(cavitation)来实现。在一些实施例中，所述暴露于高剪切力下是通过使样品通过诸如微流体化仪

(微流控公司(Microfluidics Corporation)/MFIC公司(MFIC Corporation))等仪器或可适用于形成均一纳米粒子组合物的其它类似装置来实现。在本发明的一些实施例中，通过暴露于高剪切力下少于约10分钟的时间来使样品微流体化。在一些实施例中，所述时间小于约9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟。在一些实施例中，时间在约1-2分钟的范围内。在一些实施例中，时间为约30秒。在本发明的一些实施例中，通过单次暴露于高剪切力下来使样品“微流体化”；所述实施例被称为“单程”微流体化。

纳米粒子：如本文中所使用，术语“纳米粒子”是指具有小于1000纳米(nm)直径的任何粒子。在一些实施例中，纳米粒子如美国国家科学基金会(National ScienceFoundation)所定义，具有小于300nm的直径。在一些实施例中，纳米粒子具有如美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)所定义，小于100nm的直径。在一些实施例中，纳米粒子为胶束，因为其包含通过胶束膜与本体溶液分隔的密封隔室。“胶束膜”包含已聚集包围并密封间隙或隔室(例如，以界定内腔)的两亲实体。

纳米粒子组合物：如本文中所使用，术语“纳米粒子组合物”是指含有至少一种纳米粒子的任何物质。在一些实施例中，纳米粒子组合物是均一的一组纳米粒子。在一些实施例中，纳米粒子组合物是分散液或乳液。一般来说，当组合至少两种不混溶的物质时，形成分散液或乳液。“水包油”分散液是油性粒子(或疏水性或非极性)分散于水性分散介质中的分散液。“油包水”分散液是水性(或亲水性或极性)粒子分散于油性分散介质中的分散液。所属领域的技术人员应了解分散液可由任何两种不混溶的介质形成且并不严格限于水性介质与油性介质的组合。因此，术语“分散介质”广泛适用于任何分散介质，尽管通常提及“水性”和“油性”类别。在一些实施例中，纳米粒子组合物是纳米乳液。在一些实施例中，纳米粒子组合物包含胶束。在一些特定实施例中，纳米粒子组合物包含如2007年11月30日申请的题为“两亲实体纳米粒子(AMPHIPHILICENTITY NANOPARTICLES)”的PCT申请案第PCT/US07/___号(以引用的方式并入本文中)中所述的两亲实体纳米粒子。在一些实施例中，纳米粒子组合物是稳定的。在一些实施例中，纳米粒子组合物包括一种或一种以上欲与纳米粒子结合传递的生物活性剂。

营养保健品(Nutraceutical)：如本文中所使用，术语“营养保健品”是指提供医学、健康或生物学益处的任何物质。在一些实施例中，营养保健品可以防病。在一些实施例中，营养保健品可以提供基础营养价值。在一些实施例中，营养保健品是食品或食品的一部分。在一些实施例中，营养保健剂可以是一类经分离的营养物、膳食补充剂、维生素、矿物质、草药、强化食品、医疗食品(healing food)、遗传工程食品和加工食品。营养保健品也可称为“植物化学食品”或“功能性食品”。

预混物：如本文中所使用，术语“预混物”是指随后用于产生根据本发明的纳米粒子组合物的组分的任何组合。举例来说，预混物是当经受高剪切力时产生根据本发明的纳米粒子的任何一组成分。在一些实施例中，预混物含有两种或两种以上不混溶的溶剂。在一些实施例中，预混物含有自组装成纳米粒子的组分。在一些实施例中，预混物含有自组装成胶束的组分。在一些实施例中，预混物含有如2007年11月30日申请的题为“两亲实体纳米粒子(AMPHIPHILIC ENTITY NANOPARTICLES)”的PCT申请案第PCT/US07/___________号(以引用的方式并入本文中)中所述的一种或一种以上两亲实体。在一些实施例中，预混物含有一种或一种以上未经修饰的肽；在一些实施例中，预混物含有至少一种其它生物活性剂。在一些实施例中，将预混物搅动、混合和/或搅拌；在一些实施例中，在经受高剪切力之前将预混物搅动、混合和/或搅拌。在一些实施例中，预混物包含至少一种溶解的组分(即，至少一种呈溶液形式的组分)；在一些所述实施例中，在实现所述溶解后使预混物经受高剪切力。

纯：如本文中所使用，如果一种物质和/或实体实质上不含其它组分，那么其是“纯”的。举例来说，含有大于约90％特定物质和/或实体的制剂通常被视为纯制剂。在一些实施例中，物质和/或实体的纯度为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

剪切力：如本文中所使用，术语“剪切力”是指与垂直于材料面的力相对而言，平行于材料面的力。在一些实施例中，使组合物暴露于高剪切力以便产生均一纳米粒子组合物。所属领域中已知的任何方法可用于产生高剪切力。在一些实施例中，使用空化产生高剪切力。在一些实施例中，使用高压均化产生高剪切力。替代地或另外，可通过暴露于高压(例如约15,000psi)下来施与高剪切力。在一些实施例中，所述高压在约18,000psi到约26,000psi的范围内；在一些实施例中，其在约20,000psi到约25,000psi的范围内。在一些实施例中，使用微流体化仪处理装置(微流控公司/MFIC公司)或其它类似装置产生高剪切力。微流体化仪

处理装置通过使组合物以高速度(通常范围为50m/s-300m/s)加速通过微通道(通常具有约75微米的尺寸)以将尺寸减小到纳米级范围来提供高压和所得高剪切速率。随着流体离开微通道，其形成射流，与来自相对微通道的射流碰撞。在通道中，流体经历比常规技术高几个数量级的高剪切(高达10⁷l/s)。射流碰撞使得在亚微米水平上混合。因此，在所述装置中，高剪切和/或冲击可实现粒径减小和多相混合。在本发明的一些实施例中，使样品暴露于高剪切力下少于约10分钟的时间。在一些实施例中，所述时间小于约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2或约1分钟。在一些实施例中，时间在约1到约2分钟或更短时间的范围内；在一些实施例中，时间为约30秒。在本发明的一些实施例中，通过单次暴露于高剪切力下来使样品“微流体化”；所述实施例在本文中被称为“单程”微流体化。

小分子：一般来说，在所属领域中“小分子”应理解为尺寸小于约5千道尔顿(Kd)的有机分子。在一些实施例中，小分子小于约3Kd、约2Kd或约1Kd。在一些实施例中，小分子小于约800道尔顿(D)、约600D、约500D、约400D、约300D、约200D或约100D。在一些实施例中，小分子是非聚合分子。在一些实施例中，小分子不为蛋白质、肽或氨基酸。在一些实施例中，小分子不为核酸或核苷酸。在一些实施例中，小分子不为糖类或多糖。

个体：如本文中所使用，术语“个体”或“患者”是指可投与本发明的组合物(例如)用于实验、诊断、预防和/或治疗目的的任何生物体。典型个体包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、非人类灵长类动物和人类；昆虫；蠕虫；等)。

实质上：如本文中所使用，术语“实质上”是指展现全部或接近全部范围或程度的所关注的特征或特性的定性条件。生物学领域的技术人员应理解生物学和化学现象很少(如果发生过)达到完全和/或进行到完全或者实现或避免绝对结果。因此，术语“实质上”在本文中用于捕捉许多生物学和化学现象中所固有的潜在完全性缺乏。

稳定：术语“稳定”在应用于本文中的纳米粒子组合物时的意思是在一段时间内所述组合物维持其物理结构的一个或一个以上方面(例如尺寸范围和/或粒子分布)。在本发明的一些实施例中，稳定的纳米粒子组合物是使平均粒径、最大粒径、粒径范围和/或粒径分布(即，超过指定尺寸和/或超出指定尺寸范围的粒子百分比)维持一段时间的纳米粒子组合物。在一些实施例中，所述时间为至少约1小时；在一些实施例中，时间为约5小时、约10小时、约一(1)天、约一(1)周、约两(2)周、约一(1)个月、约两(2)个月、约三(3)个月、约四(4)个月、约五(5)个月、约六(6)个月、约八(8)个月、约十(10)个月、约十二(12)个月、约二十四(24)个月或更长时间。在一些实施例中，时间在约一(1)天到约二十四(24)个月、约两(2)周到约十二(12)个月、约两(2)个月到约五(5)个月等的范围内。举例来说，如果使纳米粒子组合物经受长期储存、温度变化和/或pH值变化且群体中的大部分纳米粒子维持在规定范围内(即，例如在约10nm-120nm之间)的直径，那么纳米粒子组合物是稳定的。对于一些所述群体来说，大部分是大于约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％、约99.9％或99.9％以上。在本发明的一些实施例中，当纳米粒子组合物包含一种或一种以上生物活性剂(例如未经修饰的肽)时，如果在指定的一组条件下经过指定时间，纳米粒子组合物中的生物活性剂的浓度得到维持，那么组合物被视为稳定的。

实质上不含：当本发明的纳米粒子组合物中不超过约50％的粒子具有超出规定范围的直径时，所述组合物被称为“实质上不含”直径超出所述范围的粒子。在一些实施例中，不超过25％的粒子超出范围。在一些实施例中，不超过20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.5％以下的粒子具有超出规定范围的直径。

罹患：“罹患”疾病、病症或病状(例如面部皱纹)的个体已诊断患有或展现所述疾病、病症或病状的症状。

治疗有效量：如本文中所使用，术语“治疗有效量”的意思是当向罹患或易患疾病、病症和/或病状的患者投与时足以治疗所述疾病、病症和/或病状的本发明的纳米粒子组合物的量。

治疗剂：如本文中所使用，短语“治疗剂”是指当向个体投与时具有治疗效应和/或引起所需生物效应和/或药理效应的任何药剂。

治疗：如本文中所使用，术语“治疗”是指生物活性剂的任何投与，所述生物活性剂部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或病状的一种或一种以上症状或特征、延迟所述症状或特征的发作、降低所述症状或特征的严重性和/或降低所述症状或特征的发生率。所述治疗可针对未展现相关疾病、病症和/或病状的病征的个体和/或仅展现所述疾病、病症和/或病状的早期病征的个体。替代地或另外，所述治疗可针对展现相关疾病、病症和/或病状的一种或一种以上确定病征的个体。

有毒溶剂：如本文中所使用，术语“有毒溶剂”是指可改造、破坏、除去或损坏动物组织的任何物质。如所属领域的技术人员应理解，动物组织可包括活细胞、死细胞、细胞外基质、细胞连接(cellular junction)、生物分子等。仅举数例，有毒溶剂包括二甲亚砜、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、氯仿、四甲基甲酰胺、丙酮、乙酸酯和烷烃。

均一：术语“均一”在本文中提及纳米粒子组合物使用时，是指个别纳米粒子具有指定的粒子直径尺寸范围的纳米粒子组合物。举例来说，在一些实施例中，均一纳米粒子组合物是最小直径与最大直径之间的差不超过约600nm、约550nm、约500nm、约450nm、约400nm、约350nm、约300nm、约250nm、约200nm、约150nm、约100nm、约90nm、约80nm、约70nm、约60nm、约50nm或50nm以下的纳米粒子组合物。在一些实施例中，本发明的均一纳米粒子组合物中的粒子(例如含有未经修饰的肽的粒子)具有小于约600nm、约550nm、约500nm、约450nm、约400nm、约350nm、约300nm、约250nm、约200nm、约150nm、约130nm、约120nm、约115nm、约110nm、约100nm、约90nm、约80nm或80nm以下的直径。在一些实施例中，本发明的均一纳米粒子组合物中的粒子(例如含有未经修饰的肽的粒子)具有在约10纳米与约600纳米范围内的直径。在一些实施例中，本发明的均一纳米粒子组合物中的粒子(例如含有未经修饰的肽的粒子)具有在约10nm到约300nm、约10nm到约200nm、约10nm到约150nm、约10nm到约130nm、约10nm到约120nm、约10nm到约115nm、约10nm到约110nm、约10nm到约100nm或约10nm到约90nm范围内的直径。在一些实施例中，本发明的肉毒纳米粒子组合物中的粒子(例如含有未经修饰的肽的粒子)具有小于约300nm、约250nm、约200nm、约150nm、约130nm、约120nm、约115nm、约110nm、约100nm或约90nm的平均粒径。在一些实施例中，平均粒径在约10nm到约300nm、约50nm到约250nm、约60nm到约200nm、约65nm到约150nm、约70nm到约130nm的范围内。在一些实施例中，平均粒径为约80nm到约110nm。在一些实施例中，平均粒径为约90nm到约100nm。在一些实施例中，本发明的均一纳米粒子组合物中的大部分粒子(例如含有未经修饰的肽的粒子)具有指定尺寸以下或在指定范围内的直径。在一些实施例中，所述大部分是大于组合物中50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或99.9％以上的粒子。在本发明的一些实施例中，均一纳米粒子组合物是通过样品的微流体化来实现。在本发明的一些实施例中，均一纳米粒子组合物是通过暴露于高剪切力下(例如通过微流体化)来制备。

未经修饰的肽：如本文中所使用，术语“未经修饰的肽”是指尚未通过旨在实现肽的经皮传递的其它共价键结官能团的添加来化学修饰的肽。在一些实施例中，所述肽尚未经化学修饰来添加侧位乙酰基和/或棕榈酰基。在一些实施例中，肽尚未经化学修饰来添加任何官能性侧基。

实施例

纳米粒子

如本文所论述，本发明提供包括一种或一种以上未经修饰的肽的纳米粒子组合物。在一些实施例中，除所述未经修饰的肽外，所述纳米粒子组合物进一步包括一种或一种以上其它生物活性剂。在一些实施例中，纳米粒子组合物是用一种或一种以上其它组分调配，例如调配于医药或化妆用制剂中。在一些实施例中，所述医药或化妆用制剂经调配以实现未经修饰的肽(和/或一种或一种以上其它生物活性剂)的经皮传递。

在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物是稳定的。在一些实施例中，所述纳米粒子组合物是均一的。

在一些实施例中，均一纳米粒子组合物包含一群最小直径与最大直径之间的差不超过约600nm、约550nm、约500nm、约450nm、约400nm、约350nm、约300nm、约250nm、约200nm、约150nm或约100nm的粒子。

在一些实施例中，本发明的纳米粒子具有小于约1000nm、约600nm、约550nm、约500nm、约450nm、约400nm、约350nm、约300nm、约250nm、约200nm、约150nm、约130nm、约120nm、约115nm、约110nm、约100nm、约90nm、约80nm、约50nm或50nm以下的直径。

在一些实施例中，本发明的纳米粒子具有1nm到1000nm、1nm到600nm、1nm到500nm、1nm到400nm、1nm到300nm、1nm到200nm、1nm到150nm、1nm到120nm、1nm到100nm、1nm到75nm、1nm到50nm或1nm到25nm的直径。在一些实施例中，本发明的纳米粒子具有1nm到15nm、15nm到200nm、25nm到200nm、50nm到200nm或75nm到200nm的直径。

在一些实施例中，总粒子分布涵盖在指定的粒子直径尺寸范围内。在一些实施例中，小于50％、25％、10％、5％或1％的总粒子分布超出指定的粒子直径尺寸范围。在一些实施例中，小于1％的总粒子分布超出指定的粒子直径尺寸范围。在某些实施例中，纳米粒子组合物实质上不含直径大于300nm、250nm、200nm、150nm、120nm、100nm、75nm、50nm或25nm的粒子。

在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物中的纳米粒子具有小于约300nm、约250nm、约200nm、约150nm、约130nm、约120nm、约115nm、约110nm、约100nm、约90nm或约50nm的平均粒径。在一些实施例中，平均粒径在约10nm到约300nm、50nm到约250nm、60nm到约200nm、65nm到约150nm或70nm到约130nm的范围内。在一些实施例中，平均粒径为约80nm到约110nm。在一些实施例中，平均粒径为约90nm到约100nm。

在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物实质上不含直径超过300nm的粒子。具体来说，在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物中少于50％的纳米粒子具有超过300nm的直径。在一些实施例中，少于25％的粒子具有超过300nm的直径。在一些实施例中，少于20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.5％以下的粒子具有超过300nm的直径。此外，在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物中的纳米粒子具有在10nm到300nm范围内的直径。

在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物实质上不含直径超过200nm的粒子。具体来说，在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物中少于50％的纳米粒子具有超过200nm的直径。在一些实施例中，少于25％的粒子具有超过200nm的直径。在一些实施例中，少于20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.5％以下的粒子具有超过200nm的直径。此外，在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物中的纳米粒子具有在10nm到200nm范围内的直径。

在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物实质上不含直径超过120nm的粒子。具体来说，在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物中少于50％的纳米粒子具有超过120nm的直径。在一些实施例中，少于25％的粒子具有超过120nm的直径。在一些实施例中，少于20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.5％以下的粒子具有超过120nm的直径。此外，在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物中的纳米粒子具有在10nm到120nm范围内的直径。

在一些实施例中，本发明的组合物中的大部分纳米粒子具有指定尺寸以下或在指定范围内的直径。在一些实施例中，所述大部分是大于组合物中50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或99.9％以上的粒子。

ζ电势是剪切面处电势的量度。剪切面是将与固体表面(例如本发明的纳米粒子的表面)结合且展示弹性行为的一薄层液体与展示正常粘性行为的其余液体(例如液体分散介质)隔开的虚表面(imaginary surface)。在一些实施例中，本发明的纳米粒子具有在介于-50mV到+50mV之间的范围内的ζ电势。在一些实施例中，本发明的纳米粒子具有在介于-25mV到+25mV之间的范围内的ζ电势。在一些实施例中，本发明的纳米粒子具有在介于-10mV到+10mV之间的范围内的ζ电势。

在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物为乳液或分散液。一般来说，乳液或分散液由至少两种不混溶的物质形成，其中一种将构成分散介质，即，粒子(例如纳米粒子，其构成“经分散的介质”)分散于其中的液体介质。“水包油”分散液是油性粒子分散于水性分散介质中的分散液。“油包水”分散液是水性粒子分散于油性分散介质中的分散液。所属领域的技术人员应了解分散液可由任何两种不混溶性介质形成且并不严格限于水性介质与油性介质的组合。因此，术语“分散介质”广泛适用于任何分散介质，尽管通常提及“水性”和“油性”类别。举例来说，乳液或分散液可由疏水性/亲水性物质、极性/非极性物质等不混溶的组制备，不考虑所述物质严格来说是“水性”还是“油性”。

在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物包含胶束结构(例如所述纳米粒子为胶束)。在一些实施例中，所述胶束结构为交联结构。在一些实施例中，所述胶束结构不为交联结构。

在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物由组合组分的集合自组装。在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物是通过使组分组合(即，“预混物”)经受高剪切力来制备。在一些实施例中，高剪切力是通过高压、通过空化、通过均化和/或通过微流体化来施加。在一些实施例中，将组合的纳米粒子形成组分搅动、搅拌或者混合。在一些所述实施例中，在混合过之后使所述组分经受高剪切力。在一些特定实施例中，混合可执行一段时间，诸如小于1小时或大于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15小时。在一些实施例中，达到溶解。

在本发明的一些实施例中，纳米粒子组合物的制造包括透析组分的集合，例如以除去任何有机溶剂，和/或冷冻干燥以产生组合物。

在本发明的利用预混物的一些实施例中，应了解预混物组分可在施加高剪切力之前组装成粒子。至少一些所述粒子可以是微粒或甚至纳米粒子。在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物由预混物制备，其中预混物选自包含悬浮液或微乳液的群组。然而，在一些实施例中，在施加高剪切力之前，预混物中并不形成粒子结构。

在本发明的一些实施例中，最终纳米粒子组合物中所存在的组分在预混物中全部存在且经受高剪切力以产生纳米粒子组合物。在本发明的一些实施例中，最终纳米粒子组合物中所存在的一种或一种以上组分在预混物中不存在或者以小于最终纳米粒子组合物中的量存在于预混物中。也就是说，在本发明的一些实施例中，在使预混物经受高剪切应力后，向纳米粒子组合物中加入一种或一种以上物质。

在本发明的某些实施例中，在施加高剪切力之前将预混物制备为溶液。尤其，对于包括至少一种生物活性剂(例如未经修饰的肽)的纳米粒子组合物，常常需要先将生物活性剂溶解于预混物中，随后施加高剪切应力。因此，在许多实施例中，生物活性剂可溶于至少一种介质(或预混物中所用介质的组合)。在本发明的一些实施例中，所述溶解需要加热；在其它实施例中，其不需要加热。

在本发明的一些实施例中，纳米粒子组合物由包括以下在内的组分制备：一种或一种以上水性、极性或亲水性介质，一种或一种以上油性、非极性或疏水性介质，一种或一种以上胶束组分，一种或一种以上表面活性剂或乳化剂，一种或一种以上生物活性剂和/或一种或一种以上释放延迟剂等。

所属领域的技术人员应充分知道根据本发明可用作分散介质或欲分散的介质的合适水性介质。代表性所述水性介质包括(例如)水、生理盐水溶液(包括磷酸盐缓冲生理盐水)、注射用水、短链醇、5％葡萄糖、林格氏溶液(Ringer′s solution)(乳酸林格氏注射液、乳酸林格氏液加5％葡萄糖注射液、酰化林格氏注射液)、诺莫索-M(Normosol-M)、艾索里特E(Isolyte E)等等和其组合。

所属领域的技术人员也应充分知道根据本发明可用作分散介质或欲分散的介质的合适油性介质。在一些实施例中，所述油可包含一种或一种以上脂肪酸基团或其盐。在一些实施例中，所述脂肪酸基团可包含可消化的、长链(例如C₈-C₅₀)、经取代或未经取代的烃。在一些实施例中，所述脂肪酸基团可以是C₁₀-C₂₀脂肪酸或其盐。在一些实施例中，脂肪酸基团可以是C₁₅-C₂₀脂肪酸或其盐。在一些实施例中，脂肪酸基团可以是C₁₅-C₂₅脂肪酸或其盐。在一些实施例中，脂肪酸基团可以是不饱和的。在一些实施例中，脂肪酸基团可以是单不饱和的。在一些实施例中，脂肪酸基团可以是多不饱和的。在一些实施例中，不饱和脂肪酸基团的双键可呈顺式构象。在一些实施例中，不饱和脂肪酸基团的双键可呈反式构象。

在一些实施例中，脂肪酸基团可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸或木蜡酸中的一种或一种以上。在一些实施例中，脂肪酸基团可以是棕榈油酸、油酸、异油酸、亚油酸、α-亚麻油酸、γ-亚油酸、花生四烯酸、鳕油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或芥酸中的一种或一种以上。

在一些实施例中，油为液态甘油三酯。在某些实施例中，油为中链(例如6-12个碳)甘油三酯(例如拉布拉法WL 1349(Labrafac WL 1349)、椰子油、棕榈仁油、樟树核果油等)。在某些实施例中，油为短链(例如2-5个碳)甘油三酯。在某些实施例中，油为长链(例如大于12个碳)甘油三酯(例如大豆油、向日葵油等)。

用于本发明的合适的油包括(但不限于)杏仁油(almond oil)、杏核仁油(apricotkernel oil)、鳄梨油、巴巴苏油、香柠檬油、黑加仑籽油、琉璃苣油、杜松油、甘菊油、芥花籽油、葛缕子油、巴西棕榈油、蓖麻油、肉桂油、可可油、椰子油、鳕肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉树油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶醇油、葫芦油、葡萄籽油、榛果油、海索油、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴、夏威夷核油(kukui nut oil)、杂薰衣草油、熏衣草油、柠檬油、山苍子油(litsea cubeba oil)、澳洲坚果油(macademianut oil)、锦葵油、芒果籽油、白芒花籽油、矿物油、貂油、肉豆蔻油(nutmeg oil)、橄榄油、甜橙油、深海鱼油(orange roughy oil)、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀香油、山茶花油(sasquanaoil)、香薄荷油、沙棘油、芝麻油、乳木果油、硅油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、茶花油(tsubaki oil)、香根草油、胡桃油、小麦胚芽油和其混合物。用于本发明的合适的合成油包括(但不限于)：辛酸/癸酸甘油三酯、环聚二甲基硅氧烷(cyclomethicone)、癸二酸二乙酯、二甲硅油360(dimethicone 360)、肉豆蔻酸异丙酯、辛基十二烷醇、油醇和其组合。

适当的胶束组分可包括(例如)一种或一种以上两亲实体。适用的两亲实体包括天然实体、合成实体和含有天然与合成组分的实体。在一些实施例中，两亲实体可包含一种或一种以上聚合物和/或一种或一种以上具有聚合特性的化合物。

一般来说，两亲实体是同时具有疏水性与亲水性的实体。如所属领域的技术人员应了解，两亲实体可以许多不同方式包含在内。在一些实施例中，两亲实体可包含一种或一种以上自身具两亲性的个别化合物或分子。仅举数例，所述化合物或分子包括聚乙二醇(PEG)、磷脂、胆固醇、糖脂脂肪酸、胆汁酸和皂苷。根据美国食品与药品管理局(USFood and Drug Administration)，通常认为PEG用于食品、化妆品和药物是安全的。PEG可溶于水、无毒、无臭、润滑、不挥发和无刺激性。

在一些实施例中，两亲实体可包含一种或一种以上自身不具有两亲性但具有某种亲水或疏水特性的个别组分。在所述实施例中，两种或两种以上所述非两亲组分通常将相互缔合使得个别组分的组装物具有两亲性。所述缔合可能包括或可能不包括共价键联；所述缔合可包括非共价键结(例如通过静电相互作用、亲和力相互作用、疏水性相互作用、氢键结、范德华(Van der Waals)相互作用、离子相互作用、偶极-偶极相互作用等)。一般来说，所述缔合可包括任何相关力、键或粘着方法。

在一些实施例中，根据本发明使用的两亲实体可由两种或两种以上具有不同亲水性或疏水性程度的个别组分构成。在某些实施例中，两亲实体可包含至少一种亲水性组分和至少一种疏水性组分。在某些实施例中，“亲水性”和“疏水性”组分相对于彼此为亲水性或疏水性。

在一些实施例中，两种或两种以上不同亲水性或疏水性程度的组分可通过共价键而键结在一起以形成均聚物或共聚物。在一些实施例中，共聚物可以是嵌段共聚物。在一些实施例中，共聚物可以是接枝共聚物。

在一些实施例中，两亲实体可包含两亲嵌段共聚物或由两亲嵌段共聚物组成。在一些实施例中，两亲嵌段共聚物可以是二嵌段共聚物。在某些实施例中，两亲二嵌段共聚物可包含在链端共价连接的第一聚合物嵌段和第二聚合物嵌段。在特定实施例中，第一聚合物嵌段可包含亲水性组分的重复单元，且第二聚合物嵌段可包含疏水性组分的重复单元。在特定实施例中，第一聚合物嵌段可包含疏水性组分的重复单元，且第二聚合物嵌段可包含亲水性组分的重复单元。在一些实施例中，两亲嵌段共聚物可以是多嵌段共聚物。在某些实施例中，两亲嵌段共聚物可包含在链端共价连接的两种或两种以上聚合物的多个交替嵌段。在特定实施例中，两亲嵌段共聚物可包含在链端共价连接的多个交替的亲水性嵌段和疏水性嵌段。在特定实施例中，交替嵌段的每一嵌段可包含亲水性组分或疏水性组分的重复单元。

在一些实施例中，两亲实体可包含两亲接枝共聚物或由两亲接枝共聚物组成。在一些实施例中，两亲接枝共聚物可包含共价连接于其它聚合物嵌段的侧链的聚合物嵌段或由共价连接于其它聚合物嵌段的侧链的聚合物嵌段组成。在特定实施例中，每一聚合物嵌段可包含亲水性组分或疏水性组分的重复单元或由亲水性组分或疏水性组分的重复单元组成。在某些实施例中，两亲接枝共聚物可包含第一聚合物嵌段和共价连接于第一聚合物嵌段的侧链的第二聚合物嵌段，或由第一聚合物嵌段和共价连接于第一聚合物嵌段的侧链的第二聚合物嵌段组成。在某些实施例中，第一聚合物嵌段可包含亲水性组分的重复单元或由亲水性组分的重复单元组成，且第二嵌段可包含疏水性组分的重复单元。在某些实施例中，第一聚合物嵌段可包含疏水性组分的重复单元或由疏水性组分的重复单元组成，且第二聚合物嵌段可包含亲水性组分的重复单元。

在一些实施例中，两亲嵌段或接枝共聚物可包括包含多糖的重复单元的亲水性聚合物嵌段和包含聚酯或多糖的重复单元的疏水性聚合物嵌段。替代地或另外，两亲嵌段或接枝共聚物可包括包含多糖的重复单元的疏水性聚合物嵌段和包含聚酯或多糖的重复单元的亲水性聚合物嵌段。所述亲水性聚合物嵌段可含有任何类型的亲水性聚合物的重复单元，诸如多糖(例如支链淀粉(pullulan))或聚氧化烯烃(例如聚氧化乙烯)。疏水性聚合物嵌段可含有任何类型的疏水性聚合物的重复单元，诸如聚己内酯或聚酰胺(例如聚己内酰胺)。

在一些实施例中，两亲实体的亲水性部分可以是非离子型。在一些实施例中，两亲实体的亲水性组分包含一个或一个以上离子基团。一般来说，所述离子基团为亲水性的且可对两亲实体赋予亲水性质。

在一些实施例中，离子基团可以是阳离子。在一些实施例中，阳离子基团可以是铵离子(NH₄ ⁺)、硝鎓离子(NO₂ ⁺)、亚硝鎓离子(NO⁺)、水合氢离子(H₃O⁺)、亚汞离子(Hg₂ ²⁺)、磷鎓离子(PH₄ ⁺)、氧钒根离子(VO²⁺)或其盐。

在一些实施例中，离子基团可以是阴离子。在一些实施例中，阴离子基团可以是脂肪酸根、砷离子(As^3-)、叠氮根(N₃ ^-)、溴离子(Br^-)、氯离子(Cl^-)、氟离子(F^-)、氢离子(H^-)、碘离子(I^-)、氮离子(N^3-)、氧离子(O^2-)、磷离子(P^3-)、硒离子(Se^2-)、硫离子(S^2-)、过氧离子(O₂ ^2-)、砷酸根(AsO₄ ^3-)、亚砷酸根(AsO₃ ^3-)、硼酸根(BO₃ ^3-)、高溴酸根(BrO₄ ^-)、溴酸根(Bro₃ ^-)、亚溴酸根(BrO₂ ^-)、次溴酸根(BrO^-)、碳酸根(CO₃ ^2-)、碳酸氢根(HCO₃ ^-)、氯酸根(ClO₃ ^-)、高氯酸根(ClO₄ ^-)、亚氯酸根(ClO₂ ^-)、次氯酸根(ClO^-)、铬酸根(CrO₄ ^2-)、重铬酸根(Cr₂O₇ ^2-)、高氟酸根(BrO₄ ^-)、氟酸根(BrO₃ ^-)、亚氟酸根(BrO₂ ^-)、次氟酸根(BrO^-)、高碘酸根(IO₄ ^-)、碘酸根(IO₃ ^-)、亚碘酸根(IO₂ ^-)、次碘酸根(IO^-)、硝酸根(NO₃ ^-)、亚硝酸根(NO₂ ^-)、磷酸根(PO₄ ^3-)、磷酸氢根(HPO₄ ^2-)、磷酸二氢根(H₂PO₄ ^-)、亚磷酸根(PO₃ ^3-)、硅酸根(SiO₃ ^2-)、硫酸根(SO₄ ^2-)、硫代硫酸根(S₂O₃ ^2-)、硫酸氢根(HSO₄ ^-)、亚硫酸根(SO₃ ^2-)、亚硫酸氢根(HSO₃ ^-)、磺酸根(-S(＝O)₂-O^-)、乙酸根(C₂H₃O₂ ^-)、甲酸根(HCO₂ ^-)、草酸根(C₂O₄ ^2-)、草酸氢根(HC₂O₄ ^-)、柠檬酸根(C₆H₅O₇ ^3-)、琥珀酸根(C₄H₄O₄ ^2-)、富马酸根(C₄H₂O₄ ^2-)、苹果酸根(C₄H₅O₅ ^2-)、硫氢根(HS^-)、碲离子(Te^2-)、氨基负离子(NH₂ ^-)、氰酸根(OCN^-)、硫氰酸根(SCN^-)、氰根(CN^-)、氢氧根(OH^-)、高锰酸根(MnO₄ ^-)或其盐。

在一些实施例中，两亲实体的亲水性组分可包含核酸或由核酸组成。举例来说，核酸聚合物可包括DNA、RNA或其组合。在一些实施例中，核酸聚合物可以是寡核苷酸和/或多核苷酸。在一些实施例中，核酸聚合物可以是寡核苷酸和/或经修饰的寡核苷酸；反义寡核苷酸和/或经修饰的反义寡核苷酸；cDNA；基因组DNA；病毒DNA和/或RNA；DNA和/或RNA嵌合体；质粒；粘粒；基因片段；人工和/或天然染色体(例如酵母人工染色体)和/或其一部分；RNA(例如mRNA、tRNA、rRNA和/或核酶)；肽核酸(PNA)；包含核酸的合成类似物的多核苷酸，其可经修饰或未经修饰；各种结构形式的DNA，包括单链DNA、双链DNA、超螺旋DNA和/或三螺旋DNA；Z-DNA；和/或其组合。

在一些实施例中，两亲实体的亲水性组分可包含碳水化合物或由碳水化合物组成。在一些实施例中，碳水化合物可以是所属领域中已知的由通过糖苷键连接的单糖(或其衍生物)组成的多糖。这种糖可包括(但不限于)葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺和神经氨酸。在一些实施例中，聚合物可以是亲水性碳水化合物，包括胺化、羧化和硫酸化多糖。在一些实施例中，亲水性碳水化合物可以是以下一种或一种以上：支链淀粉、纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟基纤维素、甲基纤维素、葡聚糖、环葡聚糖、糖原、淀粉、羟乙基淀粉、角叉菜胶、糖基(glycon)、直链淀粉(amylose)、壳聚糖、N，O-羧甲基壳聚糖、海藻胶和海藻酸、淀粉、甲壳素、肝素、魔芋(konjac)、葡甘聚糖、石脐素、肝素、透明质酸、可得然胶(curdlan)和黄原胶(xanthan)。在一些实施例中，亲水性多糖可通过引入许多侧链疏水基来加以修饰以变成疏水性。在一些实施例中，疏水性碳水化合物可包括乙酸纤维素、支链淀粉乙酸酯、魔芋乙酸酯、直链淀粉乙酸酯和葡聚糖乙酸酯。

在一些实施例中，两亲实体的亲水性组分可包含树胶或由树胶组成，所述树胶包括(但不限于)黄原胶、海藻酸、刺梧桐胶、海藻酸钠和/或刺槐豆胶。

在一些实施例中，两亲实体的一种组分可包含蛋白质或由蛋白质组成。在一些实施例中，蛋白质是两亲实体的亲水性组分。在其它实施例中，蛋白质是两亲实体的疏水性组分。根据本发明可使用的示范性蛋白质包括(但不限于)白蛋白、胶原蛋白或聚(氨基酸)(例如聚赖氨酸)。

在一些实施例中，两亲实体的疏水性组分可包含一种或一种以上脂肪酸基团或其盐或由一种或一种以上脂肪酸基团或其盐组成。一般来说，所述基团通常具有疏水性且可对两亲实体赋予疏水性质。在一些实施例中，脂肪酸基团可包含可消化的、长链(例如C₈-C₅₀)、经取代或未经取代的烃。在一些实施例中，脂肪酸基团可以是C₁₀-C₂₀脂肪酸或其盐。在一些实施例中，脂肪酸基团可以是C₁₅-C₂₀脂肪酸或其盐。在一些实施例中，脂肪酸基团可以是C₁₅-C₂₅脂肪酸或其盐。在一些实施例中，脂肪酸基团可以是不饱和的。在一些实施例中，脂肪酸基团可以是单不饱和的。在一些实施例中，脂肪酸基团可以是多不饱和的。在一些实施例中，不饱和脂肪酸基团的双键可呈顺式构象。在一些实施例中，不饱和脂肪酸的双键可呈反式构象。

在一些实施例中，脂肪酸基团可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸或木蜡酸中的一种或一种以上。在一些实施例中，脂肪酸基团可以是棕榈油酸、油酸、异油酸、亚油酸、α-亚油酸、γ-亚油酸、花生四烯酸、鳕油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或芥酸中的一种或一种以上。

在一些实施例中，两亲实体的疏水性组分可包含一种或一种以上生物相容性和/或可生物降解的合成聚合物，或由一种或一种以上生物相容性和/或可生物降解的合成聚合物组成，所述合成聚合物包括(例如)聚碳酸酯(例如聚(1，3-二氧杂环己烷-2酮))、聚酸酐(例如聚(癸二酸酐))、聚羟基酸(例如聚(β-羟基烷酸酯))、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺(例如聚己内酰胺)、聚缩醛、聚醚、聚酯(例如聚丙交酯和聚乙交酯)、可生物降解的聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇和可生物降解的聚氨酯。举例来说，两亲实体可包含以下一种或一种以上可生物降解的聚合物：聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(己内酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(丙交酯-共-己内酯)、聚(乙交酯-共-己内酯)和聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)。

在一些实施例中，两亲实体的疏水性组分可包含一种或一种以上丙烯酸系聚合物或由一种或一种以上丙烯酸系聚合物组成。在某些实施例中，丙烯酸系聚合物包括(例如)丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物和包含一种或一种以上上述聚合物的组合。所述丙烯酸系聚合物可包含具有低含量的季铵基团的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的全聚合共聚物。

在一些实施例中，两亲实体的疏水性组分可包含聚酯或由聚酯组成。示范性所述聚酯包括(例如)聚亚烷基二醇、聚(乙交酯-共-丙交酯)、聚乙二醇化聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚乙二醇化聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乙二醇化聚(乙醇酸)、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物和其衍生物。在一些实施例中，聚酯包括(例如)聚酸酐、聚(原酸酯)、聚乙二醇化聚(原酸酯)、聚(己内酯)、聚乙二醇化聚(己内酯)、聚赖氨酸、聚乙二醇化聚赖氨酸、聚(亚乙基亚胺)、聚乙二醇化聚(亚乙基亚胺)和其衍生物。在一些实施例中，聚酯可包括(例如)聚己内酯、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]和其衍生物。

合适的表面活性剂或乳化剂包括(但不限于)：磷酸甘油酯；磷脂酰胆碱；二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)；二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)；二油酰氧基丙基三乙铵(DOTMA)；二油酰磷脂酰胆碱；胆固醇；胆固醇酯；二酰基甘油；二酰基甘油琥珀酸酯；二磷脂酰甘油(DPPG)；十六烷醇；诸如聚乙二醇(PEG)等脂肪醇；聚氧乙烯-9-月桂醚；诸如棕榈酸或油酸等表面活性脂肪酸；脂肪酸；脂肪酸酰胺；脱水山梨糖醇三油酸酯(斯潘(Span)85)甘胆酸盐；脱水山梨糖醇单月桂酸酯(斯潘20)；聚山梨酸酯20(吐温(Tween)-20)；聚山梨酸酯60(吐温-60)；聚山梨酸酯65(吐温-65)；聚山梨酸酯80(吐温-80)；聚山梨酸酯85(吐温-85)；聚氧乙烯单硬脂酸酯；表面活性素(surfactin)；泊洛沙姆(poloxomer)；诸如脱水山梨糖醇三油酸酯等脱水山梨糖醇脂肪酸酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)；心磷脂；磷脂酸；脑苷脂；磷酸二鲸蜡酯；二棕榈酰磷脂酰甘油；硬脂胺；十二烷胺；十六烷胺；乙酰基棕榈酸酯；甘油蓖麻醇酸酯；硬脂酸十六烷酯；泰洛沙泊(tyloxapol)；聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-单硬脂酸酯；和磷脂。所述表面活性剂组分可以是不同表面活性剂的混合物。这些表面活性剂可从天然来源提取和纯化或可在实验室中以合成方式制备。在一优选实施例中，表面活性剂可从市面上购得。

在本发明的某些实施例中，选择并调整用于制备本发明的纳米粒子组合物的组分的相对量以产生具有所需特征的纳米粒子。在一些实施例中，油和表面活性剂是以在介于0.25-10之间的范围内的比率来使用。在一些实施例中，油与表面活性剂的比率为约0.25∶1、约0.5∶1、约1∶1、约2∶1、约3∶1、约4∶1、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1、约9∶1或约10∶1。在一些实施例中，表面活性剂与油的比率为约0.5∶1、约1∶1、约2∶1、约3∶1、约4∶1、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1、约9∶1或约10∶1。在一些实施例中，油和表面活性剂是以在介于0.25-2之间的范围内的比率来使用。在一些实施例中，油与表面活性剂的比率为约0.25∶1、约0.5∶1、约1∶1或约2∶1。在一些实施例中，表面活性剂与油的比率为约0.5∶1、约1∶1或约2∶1。在某些实施例中，油与表面活性剂的比率为约1∶1。

在一些实施例中，用来制备纳米粒子的组合物中(例如预混物中)油的百分数在介于0％到30％之间的范围内。在一些实施例中，用来制备纳米粒子的组合物中(例如预混物中)油的百分数为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％或约30％。在一些实施例中，油的百分数为约8％。在一些实施例中，油的百分数为约5％。

在一些实施例中，当使用一种或一种以上两亲实体时，用来制备纳米粒子的组合物中(例如预混物中)两亲实体的百分数可在40％到99％、50％到99％、60％到99％、70％到99％、80％到99％、80％到90％或90％到99％的范围内。在一些实施例中，用来制备纳米粒子的组合物中(例如预混物中)两亲实体的百分数为约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。

预混物中具有表面活性剂活性的物质的百分数可在0％到99％、10％到99％、25％到99％、50％到99％或75％到99％的范围内。在一些实施例中，预混物中具有表面活性剂活性的物质的百分数可在0％到75％、0％到50％、0％到25％或0％到10％的范围内。在一些实施例中，用来制备纳米粒子的组合物中(例如预混物中)表面活性剂的百分数在介于0％-30％之间的范围内。在一些实施例中，表面活性剂的百分数为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％或约30％。在一些实施例中，表面活性剂的百分数为约8％。在一些实施例中，表面活性剂的百分数为约5％。

在一些实施例中，纳米粒子组合物不含有多于一种油。在一些实施例中，纳米粒子组合物可包含两种或两种以上油。在一些实施例中，纳米粒子组合物不含有多于一种表面活性剂。在一些实施例中，纳米粒子组合物可包含两种或两种以上表面活性剂。在一些实施例中，纳米粒子组合物完全不含有毒组分或实质上不含有毒组分。

在一些实施例中，纳米粒子组合物基本上由水、油、表面活性剂和至少一种生物活性剂(例如未经修饰的肽)组成。在一些实施例中，纳米粒子组合物基本上由水、油、表面活性剂、至少一种生物活性剂和至少一种用于产生和/或保存纳米粒子组合物的物质组成。

在一些实施例中，纳米粒子组合物由水、油、表面活性剂和未经修饰的肽组成。在一些实施例中，纳米粒子组合物由水、油、表面活性剂、未经修饰的肽和至少一种用于产生和/或保存纳米粒子的物质组成。

未经修饰的肽

各种肽中的任一种都可并入根据本发明的纳米粒子组合物中。在大多数实施例中，肽的长度小于约100个氨基酸；在一些实施例中，肽的长度小于约90个、约80个、约70个、约65个、约60个、约55个、约50个、约45个、约40个、约35个、约30个、约25个、约20个、约15个、约13个、约12个、约10个、约9个、约8个、约7个、约6个或约5个氨基酸。在一些特定实施例中，所述肽为五肽。在一些实施例中，欲并入纳米粒子组合物中的肽仅包含天然存在的氨基酸。在一些实施例中，肽包含一种或一种以上非天然存在的氨基酸。

根据本发明使用的未经修饰的短肽通常是在皮肤(包括表皮和真皮)、皮下组织(包括脂肪组织)和/或相邻肌肉内具有生物活性的肽。所述肽包括(但不限于)：促进细胞外基质产生的肽(例如，KTTKS，SEQ ID NO.：1；EYKTTKSSRL，SEQ ID NO.：2；VIEYKTTK，SEQ ID NO.：3；KTTK，SEQ ID NO.：4；GKTVIEYKTTKS，SEQ ID NO.：5；GKTVIEYKTTKSSRL，SEQ ID NO.：6；WGKTVIEYKTTKSSRLPIID，SEQ ID NO.：7；CTSHTGAWGKTVIEYKTTKS，SEQ ID NO.：8；TTKS，SEQ ID NO.：9)、可减少皱纹的肽(例如，EEMQRR，SEQ ID NO.：10)、改善创伤愈合的肽(例如，胃泌素释放肽，VGVAPG，SEQ ID NO.：11；YYRADA，SEQ ID NO.：12；GHK，SEQ ID NO.：13，干扰素，干扰素诱导剂)和治疗导致诸如肥厚性瘢痕、瘢痕瘤和局限性或系统性硬化症(硬皮病)等病状的细胞外基质过量积累的肽(例如，P144；TSLDASIIWAMMQN，SEQ IDNO.：14)(片山(Katayama)等人，见上；路波(Lupo)，见上；罗宾逊(Robinson)等人，见上；巴蒂亚(Bhartiya)等人，1992，细胞生理学杂志(J.Cell.Physiol)，150：312；和圣地亚哥(Santiago)等人，2005，实验皮肤病学杂志(J.Investigative Dermatology)，125：450；全部以引用的方式并入本文中)。关于肽缩写的定义参见下表1。

表1：肽缩写

俗名^a      符号^b      学名^c                     化学式

丙氨酸     Ala A      2-氨基丙酸                CH₃-CH(NH₂)-COOH

精氨酸     Arg R      2-氨基-5-胍基戊酸         H₂N-C(＝NH)-NH-[CH₂]₃-CH(NH₂)-COOH

天冬酰胺   Asn^d N^d    2-氨基-3-氨甲酰基丙酸     H₂N-CO-CH₂-CH(NH₂)-COOH

天冬氨酸   Asp^d D^d    2-氨基丁二酸              HOOC-CH₂-CH(NH₂)-COOH

半胱氨酸   Cys  C     2-氨基-3-巯基丙酸         HS-CH₂-CH(NH₂)-COOH

谷氨酰胺   Gln^d Q^d    2-氨基-4-氨甲酰基丁酸     H₂N-CO-[CH₂]₂-CH(NH₂)-COOH

谷氨酸    Glu^d E^d   2-氨基戊二酸             HOOC-[CH₂]₂-CH(NH₂)-COOH

甘氨酸    Gly  G    氨基乙酸                 CH₂(NH₂)-COOH

组氨酸    His  H    2-氨基-3-(1H-咪唑-4-基)-丙酸

异亮氨酸  Ile  I    2-氨基-3-甲基戊酸^e       C₂H₅-CH(CH₃)-CH(NH₂)-COOH

亮氨酸    Leu  L    2-氨基-4-甲基戊酸        (CH₃)₂CH-CH₂-CH(NH₂)-COOH

赖氨酸    Lys  K    2，6-二氨基己酸          H₂N-[CH₂]₄-CH(NH₂)-COOH

甲硫氨酸  Met  M    2-氨基-4-(甲硫基)丁酸    CH₃-S-[CH₂]₂-CH(NH₂)-COOH

苯丙氨酸  Phe  F    2-氨基-3-苯基丙酸        C₆H₅-CH₂-CH(NH₂)-COOH

脯氨酸    Pro  P    吡咯烷-2-甲酸            

丝氨酸    Ser  S    2-氨基-3-羟基丙酸        HO-CH₂-CH(NH₂)-COOH

苏氨酸    Thr  T    2-氨基-3-羟基丁酸        CH₃-CH(OH)-CH(NH₂)-COOH

色氨酸    Trp  W    2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酸

酪氨酸    Tyr  Y    2-氨基-3-(4-羟基苯基)-丙酸

缬氨酸    Val  V    2-氨基-3-甲基丁酸        (CH₃)₂CH-CH(NH₂)-COOH

其它组分

如本文所指示，本发明的纳米粒子组合物可含有一种或一种以上其它组分或与一种或一种以上其它组分组合。某些示范性所述其它组分在本文中论述。

生物活性剂

包括(例如)治疗、诊断、预防、营养、化妆用和/或皮肤科用药剂在内的任何生物活性剂都可根据本发明传递。所述生物活性剂可以是小分子、有机金属化合物、核酸、蛋白质(包括多聚蛋白质、蛋白质复合物等)、肽、脂质、碳水化合物、草药、激素、金属、放射性元素和化合物、药物、疫苗、免疫药剂等和/或其组合。所述生物药剂可囊封于本发明的纳米粒子中，吸附于本发明的纳米粒子的表面上，存在于本发明的纳米粒子的界面处和/或存在于本发明的纳米粒子的胶束膜中。

在一些实施例中，用于制备本发明的纳米粒子的组合物中(例如预混物中)和/或纳米粒子中的生物活性剂的百分数在0.1％-25％的范围内。在一些实施例中，生物活性剂的百分数在0.1％-20％、0.1％-15％、0.1％-10％、0.1％-5％或0.1％-1％的范围内。在一些实施例中，生物活性剂的百分数在1％-20％、5％-20％、10％-20％、15％-20％或15％-25％的范围内。在一些实施例中，生物活性剂的百分数小于0.1％。在一些实施例中，生物活性剂的百分数大于25％。在一些实施例中，生物活性剂的百分数为约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约18％、约20％、约20％、约1％、约2％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约18％、约20％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％或25％以上。

相关生物活性剂可根据任何可利用的方法或途径产生或获得。生物活性剂可含有或经修饰以含有一个或一个以上旨在促进其与本发明的纳米粒子结合使用或传递的部分。所述修饰应不会干扰药剂的生物活性。在一些实施例中，修饰可任选地在活体内被除去。举例来说，生物活性剂可标记可检测的标记且/或可呈“前体”形式提供，所述“前体”形式在传递后转化或修饰为活性形式。

在一些实施例中，生物活性剂是具有医药活性的小分子和/或有机化合物。在一些实施例中，所述生物活性剂是临床使用药物。在一些实施例中，所述药物是抗生素、抗病毒剂、麻醉剂、抗凝剂、抗癌剂、酶抑制剂、类固醇药剂、消炎剂、抗肿瘤剂、抗原、疫苗、抗体、解充血剂、抗高血压剂、镇静剂、节育剂、促孕剂、抗胆碱剂、止痛剂、抗抑郁药、抗精神病药、β-肾上腺素阻断剂、利尿剂、心血管活性剂、血管活性剂、非类固醇消炎剂等。适合于经皮投药的生物活性剂特别受人关注。

所传递的生物活性剂可以是医药活性剂的混合物。举例来说，局部麻醉剂可与诸如类固醇等消炎剂组合传递。局部麻醉剂也可与诸如肾上腺素等血管活性剂一起投与。再举一实例，抗生素可与通常由细菌产生使所述抗生素失活的酶的抑制剂(例如青霉素和克拉维酸(clavulanic acid))组合。

在一些实施例中，生物活性剂是诊断剂。在一些实施例中，诊断剂包括气体；用于正电子发射断层摄影术(positron emissions tomography，PET)、计算机辅助断层摄影术(computer assisted tomography，CAT)、单光子发射计算机断层摄影术、x射线、荧光检查和磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)的市售造影剂；和对比剂。适合用作MRI中的对比剂的材料的实例包括钆螯合物以及铁、镁、锰、铜和铬。适用于CAT和x射线成像的材料的实例包括以碘为主的材料。

在一些实施例中，生物活性剂是预防剂。在一些实施例中，预防剂包括疫苗。疫苗可包含经分离的蛋白质或肽、失活的生物体和病毒、死生物体和病毒、遗传改造的生物体或病毒，和细胞提取物。预防剂可与介白素、干扰素、细胞激素和诸如霍乱毒素、明矾、弗氏佐剂(Freund′s adjuvant)等佐剂组合。预防剂可包括诸如以下等细菌生物体的抗原：肺炎链球菌(Streptococccus pnuemoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、化脓性链球菌(Streptococcus pyrogenes)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)、淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)、变异链球菌(Streptococcusmutans)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、嗜肺性军团杆菌(Legionella pneumophila)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、问号钩端螺旋体(Leptospirosis interrogans)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、空肠弯曲菌(Camphylobacter jejuni)等等；诸如以下等病毒的抗原：天花、A型和B型流感、呼吸道融合病毒、副流感、麻疹、HIV、水痘-带状疱疹病毒、1型和2型单纯疱疹、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(Epstein-Barr virus)、轮状病毒、鼻病毒、腺病毒、乳头状瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、腮腺炎、狂犬病、风疹、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、马脑炎、日本脑炎(Japanese encephalitis)、黄热病、裂谷热(Rift Valley fever)、A型、B型、C型、D型和E型肝炎病毒等；诸如以下等真菌、原生和寄生生物的抗原：新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、白色念珠菌(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、星形诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、立氏立克次体(Rickettsia ricketsii)、斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydial psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydial trachomatis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、痢疾内变形虫(Entamoebahistolytica)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)等等。这些抗原可呈完全杀死的生物体、肽、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物或其组合的形式。

在一些实施例中，生物活性剂可以是蛋白质。如本文中所使用，术语“蛋白质”和“肽”可互换使用。在某些实施例中，肽的尺寸在约5个到约40个、约10个到约35个、约15个到约30个或约20个到约25个氨基酸的范围内。可使用来自多组肽的肽，这些组中的肽包含随机序列和/或序列已进行一致改变而提供最大多样化的一组肽。

在一些实施例中，生物活性剂可以是抗体。在一些实施例中，抗体可包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合(即“人类化”)抗体、单链(重组)抗体。在一些实施例中，抗体可具有减少的效应功能和/或双特异性分子。在一些实施例中，抗体可包括Fab片段和/或由Fab表达库所产生的片段。

在一些实施例中，生物活性剂可以是核酸。在一些实施例中，寡核苷酸包含DNA、RNA、嵌合混合物、衍生物、特征部分和/或其经修饰形式。本发明的寡核苷酸可以是单链和/或双链。寡核苷酸可例如在碱基部分、糖部分和/或磷酸盐骨架处进行修饰，以改进分子稳定性、杂交等。

在特定实施例中，核酸包含结合至翻译起始位点、转录起始位点和/或剪接位点的反义分子。反义寡核苷酸将结合至靶mRNA和/或阻止翻译。替代地或另外，反义寡核苷酸可结合至靶基因的DNA(诸如调控元件)。

在一些实施例中，核酸包含为催化裂解靶mRNA转录物而设计的核酶，可用于阻止靶mRNA的翻译和/或靶的表达(参见例如PCT公开案WO 90/11364；和萨瓦尔(Sarver)等人，1990，科学(Science)247：1222；全部以引用的方式并入本文中)。

替代地或另外，内源性靶基因的表达可通过靶向与靶基因的调控区(即，靶基因的启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列来减少，所述靶向形成阻止靶基因在体内的靶肌肉细胞中转录的三重螺旋结构(通常参见，海琳(Helene)，1991，抗癌药物设计(Anticancer Drug Des.)6：569；海琳(Helene)等人，1992，纽约科学院纪事(Ann，N.Y.Acad.Sci.)660：27；和马厄(Maher)，1992，生物测定(Bioassays)14：807；全部以引用的方式并入本文中)。

在一些实施例中，生物活性剂为营养保健剂。在一些实施例中，所述营养保健剂提供基础营养价值。在一些实施例中，营养保健剂提供健康或医疗益处。在一些实施例中，营养保健剂是膳食补充剂。

在一些实施例中，营养保健剂是维生素。在一些实施例中，维生素是以下一种或一种以上：维生素A(类视色素)、维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆辛)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸)、维生素B12(氰钴胺素)、维生素C(抗坏血酸)、维生素D、维生素E或维生素K。

在一些实施例中，营养保健剂是矿物质。在一些实施例中，矿物质是以下一种或一种以上：铋、硼、钙、氯、铬、钴、铜、氟、碘、铁、镁、锰、钼、镍、磷、钾、铷、硒、硅、钠、锶、硫、碲、钛、钨、钒或锌。

在一些实施例中，营养保健剂是必需氨基酸。在一些实施例中，氨基酸是以下一种或一种以上：精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸或缬氨酸。

在一些实施例中，营养保健剂可包括脂肪酸和/或ω-3脂肪酸(例如DHA或ARA)、水果和蔬菜提取物、叶黄素、磷脂酰丝氨酸、硫辛酸、褪黑素、葡萄糖胺、软骨素、真芦荟(aloe vera)、印度古蒿(guggul)、绿茶、番茄红素、有机食品(whole food)、食品添加剂、草药、植物营养素、抗氧化剂、水果的类黄酮成分、月见草油、亚麻籽油、鱼油和海洋动物油(例如鳕鱼油)以及益生菌。在一些实施例中，营养保健剂可包括经遗传工程化而具有所需的性质的生物工程食品(也称为“医药食品(pharmafood)”)。

示范性营养保健剂和膳食补充剂例如在罗伯茨(Roberts)等人(营养保健品：补充剂、草药、维生素和医疗食品的百科全书(Nutriceuticals：The Complete Encyclopedia ofSupplements，Herbs，Vitamins，and Healing Foods)，美国营养协会(American NutriceuticalAssociation)，2001；以引用的方式并入本文中)中有所揭示。营养保健剂和膳食补充剂在医生桌上参考手册-营养补充剂(Physicians′Desk Reference for NutritionalSupplements)，第1版，2001和医生桌上参考手册-中药(Physicians′Desk Reference forHerbal Medicines)，第1版，2001(全部以引用的方式并入本文中)中也有所揭示。

在一些实施例中，可将本发明的装载营养保健剂的纳米粒子并入食品中。举例来说，可将装载营养保健品的纳米粒子溶解于诸如饮料等液体中。

在一些实施例中，生物活性剂是化妆用和/或皮肤科用药剂。在一些实施例中，化妆用和/或皮肤科用药剂可包括维生素和其衍生物(例如维生素E和其酯、维生素C和其酯、维生素B、维生素A醇或视黄醇和其酯)、前维生素(例如泛醇、烟酰胺或麦角钙化甾醇)、抗氧化剂、酚系化合物(例如过氧化苯甲酰)、精油、保湿剂、防晒剂、增湿剂、蛋白质、神经酰胺和假神经酰胺。

在一些实施例中，生物活性剂可以是一种或一种以上肉毒毒素肽或蛋白质复合物。在一些实施例中，肉毒毒素可以是肉毒毒素血清型A、B、C₁、C₂、D、E、F或G中的一种或一种以上。在一些实施例中，肉毒毒素可以是经分离和/或经纯化的肉毒毒素。在一些实施例中，肉毒毒素可以是经部分分离和/或经部分纯化的肉毒毒素。在一些实施例中，肉毒毒素可以是天然肉毒复合物。在一些实施例中，肉毒毒素可与非毒素蛋白质缔合。在一些实施例中，肉毒毒素可以是重组制得的肉毒毒素。

所属领域的技术人员将认识到这是生物活性剂的示范性列举而非全面列举。任何生物活性剂都可囊封于纳米粒子中或结合至纳米粒子的表面。

释放延迟剂

在本发明的一些实施例，尤其那些含有一种或一种以上生物活性剂(例如未经修饰的肽)的实施例中，本发明的纳米粒子组合物进一步包括一种或一种以上释放延迟成分或用一种或一种以上释放延迟成分调配以允许药剂受控释放。所属领域中已知的任何释放延迟成分都适合用于制备本发明的纳米粒子。在一些实施例中，释放延迟成分是亲水性和/或疏水性聚合物。释放延迟成分包括(例如)纤维素或其衍生物、丙烯酸系聚合物、酯聚合物、以乙烯基-吡咯烷酮为主的聚合物、树胶、其它天然聚合物和/或这些物质的组合。

在一些实施例中，所述释放延迟成分是纤维素或其衍生物。在某些实施例中，所述纤维素或其衍生物包含羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基乙基纤维素、羟基乙基纤维素和羟丙基纤维素中的一种或一种以上。在某些实施例中，纤维素或其衍生物是甲基纤维素或其衍生物。在某些实施例中，纤维素或其衍生物是羟丙基甲基纤维素(hydroxypropyl methylcellulose，HPMC)。所属领域的技术人员应了解可使用其它纤维素类聚合物，包括其它烷基纤维素聚合物。

在一些实施例中，释放延迟成分是丙烯酸系聚合物。在某些实施例中，丙烯酸系聚合物包括(例如)丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物和包含一种或一种以上上述聚合物的组合。所述丙烯酸系聚合物可包含具有低含量的季铵基团的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的全聚合共聚物。

在一些实施例中，释放延迟成分是聚酯。在一些实施例中，聚酯包括(例如)聚亚烷基二醇、聚(乙交酯-共-丙交酯)、聚乙二醇化聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚乙二醇化聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乙二醇化聚(乙醇酸)、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物和其衍生物。在一些实施例中，聚酯包括(例如)聚酸酐、聚(原酸酯)、聚乙二醇化聚(原酸酯)、聚(己内酯)、聚乙二醇化聚(己内酯)、聚赖氨酸、聚乙二醇化聚赖氨酸、聚(亚乙基亚胺)、聚乙二醇化聚(亚乙基亚胺)和其衍生物。在一些实施例中，聚酯可包括(例如)聚己内酯、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]和其衍生物。

在一些实施例中，释放延迟成分是聚(乙烯基-吡咯烷酮)的交联聚合物。在一些实施例中，所述聚合物为交联聚维酮。在一些实施例中，聚合物为未交联的聚(乙烯基-吡咯烷酮)。在一些实施例中，聚合物为聚维酮。

在一些实施例中，释放延迟成分可以是天然聚合物。在一些实施例中，所述天然聚合物为树胶，包括(例如)黄原胶、海藻酸、刺梧桐胶、海藻酸钠和/或刺槐豆胶。在一些实施例中，天然聚合物可以是蛋白质(例如白蛋白)、脂质、核酸或碳水化合物。在一些实施例中，释放延迟成分为聚酯。在一些实施例中，聚酯包括(例如)聚亚烷基二醇、聚(乙交酯-共-丙交酯)、聚乙二醇化聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚乙二醇化聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乙二醇化聚(乙醇酸)、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物和其衍生物。在一些实施例中，聚酯包括(例如)聚酸酐、聚(原酸酯)、聚乙二醇化聚(原酸酯)、聚(己内酯)、聚乙二醇化聚(己内酯)、聚赖氨酸、聚乙二醇化聚赖氨酸、聚(亚乙基亚胺)、聚乙二醇化聚(亚乙基亚胺)和其衍生物。在一些实施例中，聚酯包括(例如)聚己内酯、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]和其衍生物。

在一些实施例中，释放延迟成分是聚(乙烯基-吡咯烷酮)的交联聚合物。在一些实施例中，所述聚合物为交联聚维酮。在一些实施例中，聚合物为未交联的聚(乙烯基-吡咯烷酮)。在一些实施例中，聚合物为聚维酮。在一些实施例中，释放延迟成分可以是天然聚合物。在一些实施例中，所述天然聚合物为树胶，包括(例如)黄原胶、海藻酸、刺梧桐胶、海藻酸钠和/或刺槐豆胶。在一些实施例中，天然聚合物可以是蛋白质(例如白蛋白)、脂质、核酸或碳水化合物。

调配剂

本发明的纳米粒子组合物可经调配用于向个体投药。在某些实施例中，本发明的纳米粒子组合物经调配用于施用于皮肤上以实现经皮传递到所述个体。举例来说，本发明的纳米粒子组合物可调配于旨在局部施用的化妆用或其它制剂中。

人类皮肤包含真皮和表皮。表皮具有数层组织，即角质层、透明层、颗粒层、棘层和基底层(按照从皮肤外表面向内的顺序鉴别)。角质层呈现为通常经皮传递药物且可能尤其经皮传递未经修饰的肽的最显著障碍。角质层通常为约10-15μm厚，且其由排列成数层的扁平、角质化细胞(角质细胞)组成。角质细胞之间的细胞间隙填满了脂质结构，且可在物质透过皮肤方面起重要作用(保罗伐(Bauerova)等人，2001，欧洲药物代谢与药物代谢动力学杂志(European Journal of Drug Metabolism andPharmacokinetics)，26：85；以引用的方式并入本文中)。

在角质层下面的表皮的其余部分为约150μm厚。真皮为约1mm-2mm厚且位于表皮下面。真皮受各种毛细管以及神经元过程所支配。

传统上，对经皮投与药物的尝试过去一直集中于增加角质层的渗透性。一些尝试包括使用增加分子穿过皮肤的渗透性的化学增强剂。一些尝试包括使用机械设备绕过角质层或切除角质层的部分。另外，尝试包括使用超声波或离子电渗来促进药物透过皮肤。在大多数情况下，目标是药剂(通常是小分子)穿过皮肤，通常使得药剂可传到真皮中的毛细管床，在那里药剂可全身性地并入个体体内以实现治疗效应。

本发明尤其提供经皮投与未经修饰的肽的方法，所述方法不需要使用研磨剂或其它破坏剂(无论是化学、机械、电、磁等)。更确切地说，本发明者已意外地发现，并入本发明的纳米粒子组合物中的肉毒毒素可有效地经皮传递而无需其它使角质层可渗透或破坏角质层的步骤。将所述药剂或步骤与本发明的肉毒纳米粒子组合物一起使用不必排除在本发明的所有实施例外，但也不是必需的。

因此，本发明提供通过局部施用本发明的纳米粒子组合物来投与未经修饰的肽的方法。在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物直接施用于皮肤上且吸收穿过表皮层。在一些实施例中，所述纳米粒子组合物可渗透皮肤的表层，包括角质层、皮肤小孔和/或皮腺，而不使用化学或机械皮肤渗透增强剂或其它引起研磨的药剂。

所属领域的技术人员应了解用于局部投药的本发明的组合物可制备为化妆用调配物，诸如柔肤水、营养液型乳液、洁肤液、洁面霜、乳液、润肤乳、按摩膏、润肤霜、底妆液、唇膏、面膜或面胶、清洁剂调配物(例如香波、漂洗剂、沐浴露、护发素或肥皂)或皮肤科用组合物(例如洗剂、软膏、凝胶、乳膏、贴片或喷雾)。

本发明的纳米粒子组合物的所述调配物通常包括与一种或一种以上诸如填充剂、螯合剂、软化剂、着色材料(例如颜料和染料)和芳香剂等赋形剂的组合。

在一些实施例中，本发明的纳米粒子组合物调配为乳膏。术语“乳膏”是指通常经调配用于施用于皮肤上的可涂开的组合物。乳膏通常含有基于油和/或脂肪酸的基质。根据本发明调配的乳膏可含有纳米粒子且能够在局部投药后(例如所述纳米粒子)实质上完全透过皮肤。所述乳膏也可充当所并入物质(例如肉毒毒素)的载剂。

所属领域的技术人员应了解本发明的纳米粒子组合物可并入诸如贴片等装置中。

各种经皮贴片结构为此项技术所已知；所属领域的技术人员应了解本发明的纳米粒子组合物可以容易地并入各种所述结构的任一种中。在一些实施例中，经皮贴片可进一步包含多个从贴片贴于皮肤的一面延伸的针，其中所述针从贴片延伸突出到皮肤的角质层。在一些实施例中，所述针并不刺破血管。

在本发明的一些实施例中，纳米粒子组合物可提供于贴片中的储槽中以使施加于贴片的压力引起未经修饰的肽从贴片(任选地可通过针)导出且透过角质层。

在本发明的一些实施例中，经皮贴片包括粘着剂。粘性贴片的一些实例众所周知(例如，参见美国专利Des.296,006；6,010,715；5,591,767；5,008,110；5,683,712；5,948,433；和5,965,154；其全部以引用的方式并入本文中)。粘性贴片的特征通常在于具有将贴于个人皮肤上的粘着层、用于容纳药剂的储槽或储库、和防止药物从储槽中漏出的外表面。贴片的外表面通常无粘性。

所属领域的技术人员应了解，经皮贴片只不过是可用来投与本发明的纳米粒子组合物的一个装置实例。再举几个其它的实例，可使用不需先将组合物施用于人的手指上(此举可能对手指产生不希望的麻痹)就可施用组合物的装置。合适的装置包括刮勺、药签、无针注射器和粘性贴片。使用刮勺或药签等可能需要将装置插入含有组合物的容器中。使用注射器可通过用组合物填充注射器来实现。接着组合物可由刮勺或药签局部涂开，或者可从注射器排至个人皮肤上。

在本发明的许多实施例中，可能需要限制未经修饰的肽仅传递到所欲传递区域。在一些实施例中，所述限制传递可通过使用处于施用装置中的本发明的纳米粒子组合物来实现，所述装置允许将组合物施用于皮肤上的靶位点而不将组合物施用于皮肤的非靶位点区域。显然，为此目的可使用经皮贴片。替代地或另外，如果仅欲将经修饰的肽局部施用于所选区域，那么可对其它区域进行覆盖或预处理或者进行其它保护以免暴露。

例证

以下实例仅打算提供本发明所涵盖的特定实施例的说明。这些实例无论如何不打算限制本发明。

实例1：五肽纳米粒子调配物

本实例提供包含纳米乳液的肽纳米粒子组合物，所述纳米乳液含有已知对皮肤结构具有生物活性的五肽KTTKS(SEQ ID NO.：1)(片山(Katayama)等人，见上)。

五肽纳米乳液制剂制备如下：

·在无菌小瓶中将800mg大豆油和800mg吐温80搅拌5分钟；

·添加具有0.0001g肽KTTTS(SEQ ID NO.：1)的8.4ml水且搅拌20分钟；

·将样品均化1分钟；

·搅拌样品20分钟；且

·于23,000psi下将样品微流体化一次。

使用能够分析介于约0.6nm-6000nm之间的粒子的马尔文纳米粒度分析仪(MalvernNano S particle sizer)来评估所得五肽纳米乳液的粒径。所述五肽纳米乳液制剂具有两个粒径峰，平均粒径106nm(表2)。

表2：五肽纳米粒子的粒径分布

尺寸范围	粒子百分数
10-20nm	1.3％
21-100nm	30.2％
101-120nm	10.4％
121-150nm	22.4％
151-200nm	19.3％
201-300nm	14.7％
301-400nm	1.7％

总计

100.0％

实例2：五肽纳米粒子调配物和经皮渗透与生物效应

本实例提供包含纳米乳液的肽纳米粒子，所述纳米乳液含有已知对皮肤结构具有生物活性的五肽KTTKS(SEQ ID NO.：1)(片山(Katayama)等人，见上；以引用的方式并入本文中)。本实例证明经皮施用肽纳米粒子(在此情况下为KTTKS(SEQ ID NO.：1))对皮肤的生物功效。

材料和方法

五肽纳米乳液制剂制备如下：

·在无菌烧杯中将5.6g拉布拉法WL 1349油和5.6g吐温80搅拌5分钟；

·将58.8g试剂级水置于独立烧杯中；将0.010g肽KTTTS(SEQ ID NO.：1)加入所述水中且搅拌20分钟；

·将第一烧杯的内含物加入所述烧杯的内含物(即，水和肽)中且接着搅拌20分钟；且

·于23,000psi下将整个样品微流体化一次。

使用能够分析介于约0.6nm-约6000nm之间的粒子的马尔文纳米粒度分析仪(Malvern Nano S particle sizer)来评估所得五肽纳米乳液的粒径。所述五肽纳米乳液制剂具有114.4nm的平均粒径。约95％的粒子尺寸小于130nm。

接着将五肽纳米乳液与等体积的护肤霜(浅色PCCA粉底霜(Base PCCA VanishingCream Light))混合且接着涡旋成均匀乳膏以得到“处理乳膏”。

除了在过程中不添加肽，通过与处理乳膏相同的方法制备“对照乳膏”。

购得十只斯维丝韦勃斯特(Swiss Webster)小鼠，每只体重约20克。到达后，使所有动物适应其笼子一周(如下文所定义，分组圈养，每组每笼5只小鼠)且配备标准笼子垫料和普瑞纳5001(Purina 5001)饲料。一周后，应用以下处理范例：

处理范例

第1组(对照)：每天，历时8周，用戴手套的手指将75μl对照乳膏施用于5只小鼠中每一只的背部直到看不到乳膏。在第一次处理前两天和此后以一周为间隔用电动剃刀刮去小鼠背部的毛。

第2组(处理)：每天，历时8周，用戴手套的手指将75μl处理乳膏施用于5只小鼠中每一只的背部直到看不到乳膏。在第一次处理前两天和此后以一周为间隔用电动剃刀刮去小鼠背部的毛。

评估

将来自用对照乳膏或处理乳膏处理过的各小鼠背部的皮肤保存且接着用梅森三色组织学染色(Masson′s Trichrome histologic stain)进行处理。使用染色强度的1到4组织学等级，在400倍的放大倍数下评估染色强度：1＝几乎无染色，胶原原纤维非常细，2＝很少染色和很小胶原原纤维宽度，3＝中等染色和中等原纤维宽度，和4＝强烈染色和宽原纤维。

结果

组织学评估

用梅森三色染色法染色的皮肤组织的平均组织学得分在对照组中是2.33，最高可能得分4。比较之下，处理组中小鼠染色皮肤的平均组织学得分是3.67，最高可能得分4。这表示处理组的胶原蛋白染色强度相对于对照组增加57％。参见图1，对照组和处理组每一者的皮肤组织试样的显微照片实例。

皮肤厚度作用的评估

在检查经切片且置于玻璃载片上的小鼠背部皮肤的组织学横切面后，使用测定各皮层的深度(以mm计)的皮层厚度测试(Skin Layer Thickness Test)来测量皮肤厚度的厚度。

细胞外基质产生的评估

胶原蛋白是细胞外基质的内含物的主要组分。在经切片且置于玻璃载片上的小鼠背部皮肤的两个独立测试中，使用两种独立的胶原蛋白组织学染色(天狼星红(Picro SiriusRed)和花梨木(Pterocarpus Osun))来评估胶原蛋白含量。

通过使用免疫印迹(Western Blot)技术检测小鼠背部皮肤的均化制剂的羟脯氨酸含量来评估胶原蛋白含量。羟脯氨酸含量代表胶原蛋白含量。

结论

结果显示，通过组织学评估，处理组的胶原蛋白平均在统计学上比对照组多。这些对照数据显示，局部五肽纳米乳液制剂与无所述五肽的对照乳膏相比，对皮肤具有可测量的生物效应。先前研究已显示所述肽在无化学修饰下无法渗透完整皮肤(片山(Katayama)等人，见上)。因此，这些数据显示，本发明的纳米乳液调配物使未经修饰的肽能够渗透，从而对皮肤产生与肽的已知生物作用相一致的效应：增加皮肤中的胶原蛋白产生和所引起的皮肤厚度增加。

预期结果显示，处理组的皮肤平均在统计学上比对照组厚。预期结果显示，处理组的胶原蛋白平均在统计学上比对照组多，且如通过两种组织学染色和羟脯氨酸的免疫印迹测量法所测量。

实例3：通过经皮施用肽纳米粒子对小鼠达到的皮肤变厚和细胞外基质刺激效应：纳米粒子中不同浓度的肽的效应

本实例证明改变纳米粒子中肽的浓度对经皮施用肽纳米粒子对皮肤的生物功效的影响。

材料和方法

重复实例3所描述的实验，除了处理乳膏中肽的浓度以倍数10减少或增加。

结果和结论

预期结果显示，那些用增加10倍的肽浓度处理的小鼠的皮肤平均在统计学上比那些用增加的肽浓度处理的小鼠厚。预期结果显示，那些用增加10倍的肽浓度处理的小鼠的胶原蛋白平均在统计学上比那些用降低的肽浓度处理的小鼠多，如通过两种组织学染色和羟脯氨酸的免疫印迹测量法所测量。总体来说，预期这些对照数据表明，肽纳米乳液对皮肤的生物效应视所并入的肽的浓度而变化。

实例4：向人类个体投与五肽纳米粒子以减少皮肤细纹

本实例证明经皮施用肽纳米粒子对人类皮肤的生物功效。

材料和方法

制备根据实例1或2制备的五肽纳米乳液，且与等体积的护肤霜(浅色PCCA粉底霜)混合且接着涡旋成均匀乳膏以得到“处理乳膏”。

通过将与实例1相同量的五肽混合到相同量的水中且接着和与用于制备处理乳膏相同量的护肤霜一起涡旋来制备“非纳米处理乳膏”。

通过将与实例1或2相同量的水和与用于制备处理乳膏相同量的护肤霜一起涡旋来制备“对照乳膏”。

将30位具有显著面部细纹(诸如在具有光损伤皮肤的人中观察到)的健康人类个体纳入双盲、安慰剂对照、左右随机的半边脸研究。所有个体都由对处理情况不知情的观察者用五级分制分级。所述等级的得分0为正常皮肤，得分5为严重面部细纹和皱纹(主要在眼周或“鱼尾纹”区)。也就毛孔大小(小到大)和光滑度(光滑到粗糙/粗纹)方面评估面颊皮肤纹理。仅纳入初始检查得分2.5或2.5以上的个体。将使用标准化视图与距离和照明条件对个体面部照相。

处理范例

患者同意不使用任何面部护肤产品3周，除了对照乳膏，其可间隔12小时每日使用两次。在这一初始“洗净”期后，给各患者两管标有“右”和“左”的乳膏，各管数字代码唯一。指导患者在右边脸使用右管而在左边脸使用左管，间隔12小时每日两次。指导患者将“豌豆大小”量的乳膏(约0.4g)施用于每边脸。还指导患者不能使用其它面部护肤产品。10位个体(对照组)右管含有对照乳膏且左管含有对照乳膏。10位个体(非纳米处理组)右管含有对照乳膏且左管含有非纳米处理乳膏。10位个体(纳米处理组)右管含有对照乳膏且左管含有纳米处理乳膏。

评估

在洗净期后开始处理方案后4、8和12周时，对个体进行观察并照相。另外，对个体的处理情况不知情的观察者以及个体自己用上述等级对右边脸和左边脸的每一边皮肤纹理进行打分。

结果和结论

预期结果显示，纳米处理组的右侧与左侧面部纹理得分之间的差平均在统计学上大于对照组和非纳米处理组的右侧与左侧得分之间的差(显示皮肤外观改善)。总体来说，预期这些对照数据显示，与无所述五肽的对照乳膏和具有不在纳米粒子调配物中的相同五肽的简单乳膏(非纳米乳膏)相比，局部五肽纳米乳液制剂对皮肤具有可测量的化妆作用。

等效物和范围

上文是关于本发明的某些非限制性优选实施例的描述。所属领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文中描述的本发明的特定实施例的许多等效物。所属领域的技术人员应了解，在不脱离如附加权利要求书中所定义的本发明的精神或范围的情况下，可对本描述进行各种变化和修改。

在权利要求书中，除非相反地指出或从上下文中显而易见，否则诸如“一”和“所述”等词可意指一或大于一。除非相反地指出或从上下文中显而易见，否则在一群组中的一个或一个以上成员之间包括“或”的权利要求或描述，视为满足给定产物或方法中存在、采用一个、一个以上或全部群组成员，或者一个、一个以上或全部群组成员与给定产物或方法有关。本发明包括给定产物或方法中存在、采用正好一个群组成员，或者正好一个群组成员与给定产物或方法有关的实施例。本发明还包括给定产物或方法中存在、采用多于一个或全部群组成员，或者多于一个或全部群组成员与给定产物或方法有关的实施例。此外，应了解，本发明涵盖一个或一个以上权利要求书或说明书的相关部分的一个或一个以上限制、要素、条款、描述性术语等引入另一权利要求中的所有变化、组合和排列。举例来说，任何附属于另一权利要求的权利要求可经修改以包括附属于同一基本权利要求的任何其它权利要求中所见的一个或一个以上限制。此外，当权利要求书描述组合物时，应了解，除非另有指示或除非所属领域的技术人员显而易见将出现矛盾或不一致，否则包括出于本文所揭示的目的而使用所述组合物的方法，且包括根据本文所揭示的制备方法或所属领域中已知的其它方法中的任一种来制备所述组合物的方法。举例来说，应了解，本发明的任何组合物可用于抑制任何位置处和/或由本文中所论述或所属领域中已知的任何原因所致的粘着的形成、进展和/或复发。还应了解，根据本文所揭示的制备组合物的方法所制得的任何组合物可用于抑制任何位置处和/或由本文中所论述或所属领域中已知的任何原因所致的粘着的形成、进展和/或复发。另外，本发明涵盖根据本文所揭示的制备组合物的任何方法所制得的组合物。

当以列举形式，例如以马库西群组(Markush group)形式提供要素时，应了解也揭示所述要素的每个子群组，且可从群组中除去任何要素。还应注意术语“包含”旨在为开放式的且允许包括其它要素或步骤。应了解，一般来说，当本发明或本发明的方面以包含特定要素、特征、步骤等提及时，本发明或本发明的方面的某些实施例由所述要素、特征、步骤等组成或基本上由所述要素、特征、步骤等组成。为简易起见，本文中未立刻特定地陈述那些实施例。因此，对于本发明的包含一个或一个以上要素、特征、步骤等的每一实施例来说，本发明还提供由那些要素、特征、步骤等组成或基本上由那些要素、特征、步骤等组成的实施例。

当给出范围时，端点包括在内。此外，应了解除非另有指示或另外从上下文和/或所属领域的技术人员的了解中显而易见，否则以范围形式表述的值可假定为本发明的不同实施例中规定范围内的任何特定值，除非本文另外明确规定，否则达范围下限的十分之一。还应了解除非另有指示或另外从上下文和/或所属领域的技术人员的了解中显而易见，否则以范围表达的值可假定为给定范围内的任何子范围，其中子范围的端点以与所述范围的下限的十分之一相同的精度表达。

另外，应了解本发明的任何特定实施例可明确地从任一个或一个以上权利要求排除。本发明的组合物和/或方法的任何实施例、要素、特征、应用或方面(例如任何肽、任何肽修饰、任何纳米粒子、任何纳米乳液、任何表面活性剂、任何油、任何预混物组分、任何制备纳米乳液的方法、任何治疗方法等)可从任一个或一个以上权利要求排除。为了简洁起见，本文中未明确陈述排除一个或一个以上要素、特征、目的或方面的所有实施例。

Claims (80)

1.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含至少一种在皮肤、皮下组织或相邻肌肉内具有生物活性的长度介于2个与30个氨基酸之间的未经修饰的肽。

2.根据权利要求1所述的悬浮液或分散液，其中所述大部分粒子具有介于约10纳米与约250纳米之间的直径范围。

3.根据权利要求1所述的悬浮液或分散液，其中所述大部分粒子具有介于约10纳米与约200纳米之间的直径范围。

4.根据权利要求1所述的悬浮液或分散液，其中所述大部分粒子具有介于约10纳米与约150纳米之间的直径范围。

5.根据权利要求1所述的悬浮液或分散液，其中所述大部分粒子具有介于约10纳米与约120纳米之间的直径范围。

6.根据权利要求1所述的悬浮液或分散液，其中所述大部分粒子具有介于约10纳米与约100纳米之间的直径范围。

7.根据权利要求1所述的悬浮液或分散液，其中所述大部分粒子具有介于约10纳米与约50纳米之间的直径范围。

8.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含KTTKS的未经修饰的肽。

9.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含EYKTTKSSRL的未经修饰的肽。

10.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含VIEYKTTK的未经修饰的肽。

11.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含KTTK的未经修饰的肽。

12.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含GKTVIEYKTTKS的未经修饰的肽。

13.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含GKTVIEYKTTKSSRL的未经修饰的肽。

14.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含WGKTVIEYKTTKSSRLPIID的未经修饰的肽。

15.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含CTSHTGAWGKTVIEYKTTKS的未经修饰的肽。

16.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含TTKS的未经修饰的肽。

17.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含EEMQRR的未经修饰的肽。

18.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含胃泌素释放肽的未经修饰的肽。

19.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含VGVAPG的未经修饰的肽。

20.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含YYRADA的未经修饰的肽。

21.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含GHK的未经修饰的肽。

22.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含TTKS的未经修饰的肽。

23.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含干扰素的未经修饰的肽。

24.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含干扰素诱导剂的未经修饰的肽。

25.一种包含一群粒子的纳米粒子悬浮液或分散液，其中大部分粒子具有介于约10纳米与约300纳米之间的直径，且其中所述纳米粒子包含氨基酸序列包含P144的未经修饰的肽。

26.根据权利要求1至18中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中所述纳米粒子是纳米乳液。

27.根据权利要求26所述的悬浮液或分散液，其中所述纳米乳液包含至少一种油、至少一种表面活性剂、水和所述未经修饰的肽。

28.根据权利要求26所述的悬浮液或分散液，其中所述纳米乳液包含一种油、一种表面活性剂、水和所述未经修饰的肽。

29.根据权利要求26所述的悬浮液或分散液，其中所述纳米乳液包含一种油、一种表面活性剂、水和所述未经修饰的肽。

30.根据权利要求27至29中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中所述油选自由以下组成的群组：杏仁油(almond oil)、杏核仁油(apricot kernel oil)、鳄梨油、巴巴苏油、香柠檬油、黑加仑籽油、琉璃苣油、杜松油、甘菊油、芥花籽油、葛缕子油、巴西棕榈油、蓖麻油、肉桂油、可可油、椰子油、鳕肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉树油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶醇油、葫芦油、葡萄籽油、榛果油、海索油、荷荷巴、夏威夷核油(kukui nut oil)、杂薰衣草油、熏衣草油、柠檬油、山苍子油(litsea cubeba oil)、澳洲坚果油(macademia nut oil)、锦葵油、芒果籽油、白芒花籽油、貂油、肉豆蔻油(nutmeg oil)、橄榄油、甜橙油、深海鱼油(orange roughy oil)、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀香油、山茶花油(sasquana oil)、香薄荷油、沙棘油、芝麻油、乳木果油、硅油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、山茶油(tsubaki oil)、香根草油、胡桃油和小麦胚芽油；硬脂酸丁酯；辛酸甘油三酯；癸酸甘油三酯；环聚二甲基硅氧烷(cyclomethicone)；癸二酸二乙酯；二甲硅油360(dimethicone 360)；肉豆蔻酸异丙酯；矿物油；辛基十二烷醇；油醇；硅油；短链甘油三酯；中链甘油三酯；拉布拉法WL 1349(Labrafac WL 1349)；长链甘油三酯；其饱和油；和其不饱和油。

31.根据权利要求27至29中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中所述油是大豆油。

32.根据权利要求27至29中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中所述油是中链甘油三酯。

33.根据权利要求27至29中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中所述油是拉布拉法WL 1349。

34.根据权利要求27至29中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中所述表面活性剂选自由以下组成的群组：磷酸甘油酯；磷脂酰胆碱；二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)；二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)；二油酰氧基丙基三乙铵(DOTMA)；二油酰磷脂酰胆碱；胆固醇；胆固醇酯；二酰基甘油；二酰基甘油琥珀酸酯；二磷脂酰甘油(DPPG)；十六烷醇；脂肪醇，诸如聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9-月桂醚；表面活性脂肪酸，诸如棕榈酸或油酸；脂肪酸；脂肪酸甘油单酯；脂肪酸甘油二酯；脂肪酸酰胺；脱水山梨糖醇三油酸酯(斯潘(Span)85)甘胆酸盐；脱水山梨糖醇单月桂酸酯(斯潘20)；聚山梨酸酯20(吐温(Tween)-20)；聚山梨酸酯60(吐温-60)；聚山梨酸酯65(吐温-65)；聚山梨酸酯80(吐温-80)；聚山梨酸酯85(吐温-85)；聚氧乙烯单硬脂酸酯；表面活性素(surfactin)；泊洛沙姆(poloxomer)；脱水山梨糖醇脂肪酸酯，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)；心磷脂；磷脂酸；脑苷脂；磷酸二鲸蜡酯；二棕榈酰磷脂酰甘油；硬脂胺；十二烷胺；十六烷胺；乙酰基棕榈酸酯；甘油蓖麻醇酸酯；硬脂酸十六烷酯；肉豆蔻酸异丙酯；泰洛沙泊(tyloxapol)；聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-单硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性剂特性的合成和/或天然清洁剂；脱氧胆酸盐；环糊精；离液盐；和离子配对剂。

35.根据权利要求27至29中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中所述表面活性剂是吐温。

36.根据权利要求27至35中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中表面活性剂与油的比率以重量计在介于0.5∶1与约2∶1之间的范围内。

37.根据权利要求27至35中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中表面活性剂与油的比率以重量计为约0.25∶1。

38.根据权利要求27至35中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中表面活性剂与油的比率以重量计为约0∶5∶1。

39.根据权利要求27至35中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中表面活性剂与油的比率以重量计为约1∶1。

40.根据权利要求27至35中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中表面活性剂与油的比率以重量计为约2∶1。

41.根据权利要求27至35中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中表面活性剂与油的比率以重量计为约3∶1。

42.根据权利要求1至18中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其中所述纳米粒子是纳米胶束。

43.根据权利要求1至42中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，其进一步包含至少一种与所述悬浮液或分散液一起形成乳膏、油、软膏、凝胶、喷雾、唇膏或防晒剂的额外组分。

44.一种方法，其包含以下步骤：

提供个体；和

向所述个体的皮肤投与一定量的根据权利要求1至43中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，以获得化妆或治疗益处。

45.一种方法，其包含以下步骤：

提供个体；和

向所述个体的皮肤投与一定量的根据权利要求1至43中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，以有效使所述个体的皮肤或皮下组织变厚。

46.一种方法，其包含以下步骤：

提供罹患、易患或展现皮肤细纹的至少一种症状的个体；和

向所述个体的皮肤投与一定量的根据权利要求1至43中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，以有效治疗、减轻、改善、缓解所述皮肤细纹、延迟所述皮肤细纹的发作、抑制所述皮肤细纹的进展、降低所述皮肤细纹的严重性或降低所述皮肤细纹的发生率。

47.一种方法，其包含以下步骤：

提供罹患、易患或展现面部皱纹的至少一种症状的个体；和

向所述个体的皮肤投与一定量的根据权利要求1至43中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，以有效治疗、减轻、改善、缓解面部皱纹、延迟面部皱纹的发作、抑制面部皱纹的进展、降低面部皱纹的严重性或降低面部皱纹的发生率。

48.一种方法，其包含以下步骤：

提供个体；和

向所述个体的皮肤投与一定量的根据权利要求1至43中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，以有效改善所述个体的皮肤外观。

49.一种方法，其包含以下步骤：

提供个体；和

向所述个体的皮肤投与一定量的根据权利要求1至43中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，以有效维持所述个体的皮肤外观。

50.一种方法，其包含以下步骤：

提供遭受创伤的个体；和

向所述个体的皮肤投与一定量的根据权利要求1至43中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，以有效治疗、减轻、改善、缓解所述创伤、抑制所述创伤的进展或降低所述创伤的严重性。

51.一种方法，其包含以下步骤：

提供罹患、易患或展现肥厚性瘢痕、瘢痕瘤、局限性硬化症、系统性硬化症或特征为细胞外基质过量积累的其它病状中的至少一种症状的个体；和

向所述个体的皮肤投与一定量的根据权利要求1至43中任一权利要求所述的悬浮液或分散液，以有效治疗、减轻、改善、缓解至少一种与以下疾病相关的症状、延迟所述症状的发作、抑制所述症状的进展、降低所述症状的严重性或降低所述症状的发生率：肥厚性瘢痕、瘢痕瘤、局限性硬化症、系统性硬化症或特征为细胞外基质过量积累的其它病状。

52.根据权利要求44至51中任一权利要求所述的方法，其中所述投与步骤是用手执行。

53.根据权利要求44至51中任一权利要求所述的方法，其中所述投与步骤是用戴手套的手指执行。

54.根据权利要求44至51中任一权利要求所述的方法，其中所述投与步骤是用无防护的手指执行。

55.根据权利要求44至51中任一权利要求所述的方法，其中所述投与步骤是用装置执行。

56.根据权利要求44至51中任一权利要求所述的方法，其中所述投与步骤是用粘性贴片执行。

57.根据权利要求44至51中任一权利要求所述的方法，其中所述投与步骤是用刮勺执行。

58.根据权利要求44至51中任一权利要求所述的方法，其中所述投与步骤是用药签执行。

59.根据权利要求44至51中任一权利要求所述的方法，其中所述投与步骤是用无针注射器执行。

60.根据权利要求44至51中任一权利要求所述的方法，其中所述投与步骤是用装置来执行，所述装置允许将所述悬浮液或分散液施用于所述皮肤的靶位点而不将所述悬浮液或分散液施用于所述皮肤的非靶位点。

61.根据权利要求44至60中任一权利要求所述的方法，其中所述未经修饰的肽全部渗透所述皮肤。

62.根据权利要求44至60中任一权利要求所述的方法，其中至少99％的所述未经修饰的肽渗透所述皮肤。

63.根据权利要求44至60中任一权利要求所述的方法，其中至少95％的所述未经修饰的肽渗透所述皮肤。

64.根据权利要求44至60中任一权利要求所述的方法，其中至少90％的所述未经修饰的肽渗透所述皮肤。

65.根据权利要求44至60中任一权利要求所述的方法，其中至少75％的所述未经修饰的肽渗透所述皮肤。

66.根据权利要求44至60中任一权利要求所述的方法，其中至少50％的所述未经修饰的肽渗透所述皮肤。

67.根据权利要求44至60中任一权利要求所述的方法，其中至少25％的所述未经修饰的肽渗透所述皮肤。

68.根据权利要求44至60中任一权利要求所述的方法，其中至少10％的所述未经修饰的肽渗透所述皮肤。

69.根据权利要求44至60中任一权利要求所述的方法，其中至少1％的所述未经修饰的肽渗透所述皮肤。

70.一种方法，其包含以下步骤：

提供一种包含油、表面活性剂、水和未经修饰的肽的预混物；和

在达到根据权利要求1至43中任一权利要求所述的悬浮液或分散液的时间和条件下使所述预混物经受高剪切力或高压均化。

71.根据权利要求70所述的方法，其中使所述预混物经受高剪切力或高压均化的所述步骤是通过微流体化来实现。

72.根据权利要求70所述的方法，其中所述预混物中油与表面活性剂的比率以重量计在介于约0.5∶1与约2∶1之间的范围内。

73.根据权利要求70所述的方法，其中所述预混物中油与表面活性剂的比率以重量计为约0.25∶1。

74.根据权利要求70所述的方法，其中所述预混物中油与表面活性剂的比率以重量计为约0∶5∶1。

75.根据权利要求70所述的方法，其中所述预混物中油与表面活性剂的比率以重量计为约1∶1。

76.根据权利要求70所述的方法，其中所述预混物中油与表面活性剂的比率以重量计为约2∶1。

77.根据权利要求70所述的方法，其中所述预混物中油与表面活性剂的比率以重量计为约3∶1。

78.一种鉴别能改善皮肤外观的未经修饰的肽的方法，其包含以下步骤：

提供：

至少一个皮肤样品；和

至少一种悬浮液或分散液，其中所述悬浮液或分散液包含至少一种未经修饰的肽；

向所述皮肤样品投与所述悬浮液或分散液；和

监测所述悬浮液或分散液相对于对照物质的作用而言对所述皮肤样品的外观的作用。

79.根据权利要求78所述的方法，其中所述对照物质是改善所述皮肤样品的外观的物质。

80.根据权利要求78所述的方法，其中所述对照物质是不改善所述皮肤样品的外观的物质。

Images