TWI625134B

TWI625134B - 間質幹細胞萃取物及其用途

Info

Publication number: TWI625134B
Application number: TW103105080A
Authority: TW
Inventors: 林欣榮; 韓鴻志; 邱紫文; 林珀丞
Original assignee: 國璽幹細胞應用技術股份有限公司
Priority date: 2014-02-17
Filing date: 2014-02-17
Publication date: 2018-06-01
Also published as: US10639264B2; CN104840371B; TW201532629A; US20180250216A1; CN104840371A; US10022313B2; US20150231052A1

Abstract

一種間質幹細胞萃取物及其用途，其中該間質幹細胞萃取物係包含骨成形蛋白質-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)、基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、C-X-C趨化激素受體-4(C-X-C chemokine receptor type-4，CXCR4)、腦衍生神經滋長因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、及/或介白素-17(interleukin-17，IL-17)等趨化因子，該萃取物尤其適用於皮膚老化之修復。

Description

間質幹細胞萃取物及其用途

本發明係關於一種由間質幹細胞萃取而得之萃取物以及該萃取物之應用，尤其關於該萃取物於修復皮膚老化之應用，特別是使用該萃取物以促進皮膚中玻尿酸生成、促進皮膚中彈性蛋白生成、促進皮膚中膠原蛋白生成、促進皮膚中網狀蛋白生成、刺激施用部位之細胞增生、刺激施用部位之細胞分泌趨化因子(trophic factor)、及/或刺激內生性造血幹細胞聚集至施用部位並增生。本發明之間質幹細胞萃取物於與一加熱操作合併使用時，尤其可提供優異之修復皮膚老化的效果。

皮膚為人體最大的器官，覆蓋於人體表面，具有保護、感覺、調節體溫等功能，其構造由上而下，依次為表皮層(epidermis)、真皮層(dermis)及皮下組織(hypodermis)。一般人隨著年紀的增長，皮膚老化的表徵會漸漸出現，皮膚老化的原因可分為內因性及外因性。內因性之老化係指身體自然的老化過程，包括隨著年紀的增長，角質幹細胞會逐漸減少，造成基底層細胞紊亂、玻尿酸減少、以及保濕因子流失；荷爾蒙(例如皮脂腺)的分泌下降會減緩整體皮膚的新陳代謝，最終使得皮膚缺乏張力及彈性；真皮層之纖維母細胞(fibroblast)的機能衰退，而逐漸停止製造膠原蛋白及彈性蛋白，使得真皮層之結締組織進入退化階段，造成皮膚鬆弛、缺乏線條，甚至產生皺紋；真皮層結締組織之退化會影響皮膚的儲水功能，導致皮膚乾燥及缺水；以及，表皮層及真皮層逐漸萎縮，導致表皮防禦力下降且容易產生傷口，或者造成血管彈性變差，容易造成皮下出血。

外因性之老化則因皮膚直接與外界環境接觸，受到外在因素(例如日曬、污染、自由基傷害及抽菸)的刺激而造成的老化現象，包括細胞的更新與修復受到抑制、皮膚的保護功能變差、以及黑色素沉澱。其中，造成皮膚老化的首要因素即為日光曝曬所造成的紫外線損傷，日光可加速皮膚的老化速度5至10倍。一般日常生活中所接觸的紫外線，主要為長波紫外線及紫外線中的中波紫外線(UVB)，長時間接觸中波紫外線，會刺激真皮層的纖維母細胞產生膠原蛋白酶(collagenase)而分解膠原蛋白，造成膠原蛋白密度降低及彈性蛋白變性，使皮膚失去彈性；黑色素細胞的功能退化而導致膚色不均勻；以及，皮膚產生過多的自由基而導致曬斑及不平整的老人斑形成，甚至造成各種皮膚癌。

目前，已有許多預防及修復皮膚老化的方法，包括胞外支持基質補充療法、施打肉毒桿菌、以及物理性的剝脫性治療。其中，胞外支持基質補充療法包括於皮膚表面擦拭膠原蛋白、彈力素、黏多醣、玻尿酸、維他命E等，然因這些分子的結構太大，故無法被皮膚有效吸收、進入真皮層，且於體內維持時間通常不超過九個月，故治療效果有限。施打肉毒桿菌雖可改善皮膚鬆弛的老化現象，但該效果通常僅能維持3至6個月，且容易造成上眼瞼下垂、表情僵硬怪異，或是注射部位的肌肉無力等副作用。至於物理性的剝脫性治療，雖可去除老化角質，刺激新生皮膚增生，但容易產生創傷、皮膚恢復緩慢、術後併發症多等副作用。

有關皮膚老化之另一治療趨勢為細胞療法，主要係使用幹細胞來改善受損皮膚組織。舉例言之，脂肪幹細胞(Adipose-derived stem cell，ADSC)係由脂肪組織分離出的多潛能幹細胞(multipotent stem cell)，與臍帶幹細胞類似，屬於人體間質幹細胞的一種，具高可塑性，可分化成以下各種不同的組織細胞，例如：神經細胞、血管內皮細胞、心臟細胞、肝臟細胞、軟骨細胞、肌肉細胞等。以往人們因塑身而抽出的脂肪組織，大部分作為廢棄物而丟棄，然經研究證實，脂肪中含有大量的間質幹細胞，且該間質幹細胞具有體外增生及多重分化的潛力，能運用於組織與器官的再生與修復。其主要特性為：低侵入性取得，對人體無害、可於體外進行增生培養、可廣泛運用於身體之組織類型、以及可自動移至創傷部位並進行修補。

然而，目前細胞療法之應用仍仰賴以注射方式進入體內。最常使用的方式係於皮下注射一定量的幹細胞，此一侵入性之治療方式不僅存在一定的危險性，且會造成許多外傷的小孔，反而影響皮膚的美觀。另外，此傳統細胞療法係使用活細胞，於注射之前必須嚴格評估其安全性，且當施用於人類時，其細胞的來源必須為人類的幹細胞，故其應用性相當受限。

鑒於上述胞外基質補充療法、施打肉毒桿菌的效果有限及副作用，以及細胞療法之潛在風險與限制，故亟需發展一種可有效修復皮膚老化的簡易方式。

本發明即為解決上述問題所作的研究，本發明提供一種萃取自間質幹細胞的萃取物，其可透過簡易的局部塗抹方式而進入體內，有效促進皮膚中玻尿酸、彈性蛋白、膠原蛋白、及網狀蛋白之生成、刺激施用部位之細胞增生、刺激施用部位之細胞分泌趨化因子、以及刺激內生性造血幹細胞聚集至施用部位並增生。該萃取物於與一加熱操作合併使用時，可提供優異之修復皮膚老化的效果。

因此，本發明之一目的，在於提供一種間質幹細胞萃取物，其係包含選自以下群組之趨化因子：骨成形蛋白質-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)、基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、C-X-C趨化激素受體-4(C-X-C chemokine receptor type-4，CXCR4)、腦衍生神經滋長因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、介白素-17(interleukin-17，IL-17)、及前述之組合。

本發明之另一目的，在於提供一種使用上述間質幹細胞萃取物於製造用於修復皮膚老化之保養品、化妝品或藥劑的用途。

本發明之又一目的，在於提供一種套組，其係包含上述間質幹細胞萃取物以及一加熱工具。

本發明之又一目的，在於提供一種於一個體中修復皮膚老化之方法，其係包含對該個體施用一有效量之上述間質幹細胞萃取物，且視需要於該施用之前、之時、及/或之後進行一加熱操作。

本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。

第1圖顯示為根據本發明一具體實施態樣之間質幹細胞中之趨化因子表現量分析的照片圖；第2A圖顯示利用免疫組織化學染色分析(i)未做任何處理(即，「對照組」)、(ii)經加熱處理(即，「加熱組」)、或(iii)經合併加熱及間質幹細胞萃取物處理(即，「(加熱+間質幹細胞萃取物)組」)之大鼠皮膚之BrdU的染色圖(上)及染色定量統計直條圖(下)；第2B圖顯示利用免疫組織化學染色分析(i)未做任何處理、(ii)經加熱處理、或(iii)經合併加熱及間質幹細胞萃取物處理之大鼠皮膚之CD34的染色圖(上)及染色定量統計直條圖(下)；第3A圖顯示利用免疫組織化學染色分析(i)未做任何處理、(ii)經加熱處理、或(iii)經合併加熱及間質幹細胞萃取物處理之大鼠皮膚之玻尿酸的染色圖(上)及染色定量統計直條圖(下)；第3B圖顯示利用梅生三色染色/膠質纖維染色分析(i)未做任何處理、(ii)經加熱處理、或(iii)經合併加熱及間質幹細胞萃取物處理之大鼠皮膚之膠原蛋白的染色圖(上)及染色定量統計直條圖(下)；第3C圖顯示利用彈性蛋白染色及網狀蛋白染色分析(i)未做任何處理、(ii)經加熱處理、或(iii)經合併加熱及間質幹細胞萃取物處理之大鼠皮膚之彈性蛋白的染色圖(上)及染色定量統計直條圖(下)；以及第3D圖顯示利用彈性蛋白染色及網狀蛋白染色分析(i)未做任何處理、(ii)經加熱處理、或(iii)經合併加熱及間質幹細胞萃取物處理之大鼠皮膚之網狀蛋白的染色圖(上)及染色定量統計直條圖(下)。

以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「有效量」或「治療有效量」，係指投予至個體時，可有效至少部分改善懷疑個體之病情的化合物數量；所謂「個體」係指哺乳動物，哺乳動物可為人類或非人動物。

本發明提供一種間質幹細胞萃取物，其係包含選自以下群組之趨化因子：骨成形蛋白質-7、基質細胞衍生因子-1、血管內皮生長因子、C-X-C趨化激素受體-4、腦衍生神經滋長因子、介白素-17、及前述之組合。

本發明間質幹細胞萃取物係萃取自一源自動物組織之間質幹細胞，即，可為直接由取自動物組織之間質幹細胞所萃取提供者，亦可為先以取自動物組織之間質幹細胞進行培養，再萃取所培養之間質幹細胞而提供者。其中該組織包括臍帶、臍帶血、胎盤、華頓氏凝膠(Wharton’s jelly)、骨髓、血液、肌肉、脂肪、毛囊、及前述之組合。於本發明之部分特定具體實施態樣中，係採用萃取自一源自脂肪組織之間質幹細胞的幹細胞萃取物。

該直接取自動物組織之間質幹細胞可為動物自體產生者，亦可為藉由外力所誘導生成者。舉例言之，當使用取自骨髓或血液之間質幹細胞時，該間質幹細胞係可由動物自體產生或者由顆粒白血球刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor，GCSF)及/或介白素(interleukin)所誘導生成者。其中，用以誘導之顆粒白血球刺激因子及介白素可為例如：內生性顆粒白血球刺激因子及介白素、合成之顆粒白血球刺激因子及介白素、及前述之結構類似物。此外，所採用之介白素可為例如：介白素-3(IL-3)及介白素-6(IL-6)等。

可以任何合宜的方法製備本發明間質幹細胞萃取物。舉例言之，可使用一蛋白質裂解緩衝液以萃取一源自動物組織之間質幹細胞，提供本發明間質幹細胞萃取物。於本發明之部分具體實施態樣中，係以如下方式提供所欲間質幹細胞萃取物：- 將一間質幹細胞與一包含NP40裂解緩衝液(NP40 lysis buffer)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制劑、β-甘油磷酸鹽、以及釩化鈉之蛋白質裂解緩衝液混合，以進行細胞裂解，提供一細胞裂解液；以及- 離心分離該細胞裂解液，收集上清液，即該間質幹細胞萃取物。其中，為了避免萃取物中的有效成分變性，較佳係於例如4℃之低溫下進行此一離心分離，以維持萃取物有效成分之安定性。

由於本發明間質幹細胞萃取物係萃取自細胞的成分，所含有效成分(包括以下至少一者：骨成形蛋白質-7、基質細胞衍生因子-1、血管內皮生長因子、C-X-C趨化激素受體-4、腦衍生神經滋長因子、以及介白素-17)之分子結構較小，故於施用到皮膚表面時，容易進入皮膚，有效促進皮膚中玻尿酸生成、促進皮膚中彈性蛋白生成、促進皮膚中膠原蛋白生成、及促進皮膚中網狀蛋白生成、刺激施用部位之細胞增生、刺激施用部位之細胞分泌趨化因子、及/或刺激內生性造血幹細胞聚集至施用部位並增生。

於不受理論限制下，咸信本發明間質幹細胞萃取物係具有修復皮膚老化之功效，包括但不限於，促進傷口癒合、改善膚質(例如厚度、彈性、柔韌性、豐腴性、及保濕度)及皮膚鬆弛現象、減少皮膚皺紋及細紋、緊實皮膚、美白、以及減少皮膚黯沉及斑點。此外，本發明間質幹細胞萃取物亦可有效減少掉髮、促進毛囊細胞活化、促進毛囊細胞增生、及/或促進毛髮生長。

經發現，當於將本發明萃取物施用到皮膚表面之前、之時、及/或之後對皮膚進行一加熱操作，可藉助該加熱操作將毛孔打開而增加吸收效果，同時可刺激趨化因子釋放，吸引內生性幹細胞移入，修補並增加胞外基質，達到使皮膚年輕化的效果。

因此，本發明亦提供該間質幹細胞萃取物於修復皮膚老化之應用，包括使用該間質幹細胞萃取物於製造用於修復皮膚老化之保養品、化妝品或藥劑、提供包含該間質幹細胞萃取物及一加熱工具之套組、以及對有需要之個體投予該間質幹細胞萃取物以修復皮膚老化之方法。

本發明之保養品、化妝品、或藥劑可呈任何合宜的形式，並無特殊的限制。舉例言之，但不以此為限，該保養品、化妝品、或藥劑可呈供直接外用之乳液、乳霜、凝膠(例如水凝膠)、膏狀物(例如分散膏、軟膏)、噴霧劑、或溶液(例如洗液、懸浮液)等形式。或者，可將本發明之保養品製備成可供吞食或飲用的食品形式，例如健康食品、美容飲品等。此外，亦可將本發明之藥劑以口服或供皮下注射之形式提供。

以適於口服投藥之劑型為例，使用本發明間質幹細胞萃取物所製造之藥劑中可含有不會不利影響間質幹細胞萃取物之所欲活性的醫藥可接受載劑，例如：溶劑、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、潤滑劑、吸濕劑等。可採用任何合宜之方法，將該藥劑製成適於口服投藥的劑型，例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等等。

至於適於皮下注射之劑型，則可於使用本發明間質幹細胞萃取物所製造之藥劑中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、增溶劑、乳化劑、以及其他載劑等成分，以乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該藥劑。

視需要地，可於使用本發明間質幹細胞萃取物所製造之保養品、化妝品、或藥劑中另外含有調味劑、香料、調色劑、著色劑等添加劑，以提高該保養品、化妝品、或藥劑於施用時的口適感及/或視覺感受；另可添加合宜用量之保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等，以改善該保養品、化妝品、或藥劑的儲存性。此外，該保養品、化妝品、或藥劑可視需要另含一或多種其他活性成分，或與含該一或多種其他活性成分之藥物併用，以進一步加強該保養品、化妝品、或藥劑之功效或增加配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對間質幹細胞萃取物之所欲效益沒有不利的影響即可。

舉例言之，當製備減少皺紋之保養品、化妝品、或藥劑時，可添加任何合宜且適量的乳化劑、香料及/或其它可減少皺紋之活性成分。該活性成分可為例如：玻尿酸、彈性蛋白、膠原蛋白及/或趨化因子(如骨成形蛋白質-7、基質細胞衍生因子-1、血管內皮生長因子、C-X-C趨化激素受體-4、腦衍生神經滋長因子、及介白素-17)等。

當以外用方式施用本發明間質幹細胞萃取物所製造之保養品、化妝品、或藥劑於皮膚表面時，可於該保養品、化妝品、或藥劑施用之前、之時、及/或之後，對皮膚施用一加熱操作，以適度提高皮膚的溫度至如38℃或更高的溫度，但以不傷害皮膚之溫度為限。舉例言之，可於皮膚表面塗抹或噴用本發明保養品、化妝品、或藥劑之時，不待時間經過即進行加熱操作；亦可先於皮膚表面塗抹或噴用本發明保養品、化妝品、或藥劑，等待15至30分鐘之後再進行加熱操作；或者，可先進行加熱操作3至5分鐘，之後再於皮膚表面塗抹或噴用本發明保養品、化妝品、或藥劑，其後再施以加熱操作；又或者，可進行加熱操作以適度升高皮膚表面之溫度且持續加熱而維持皮膚表面的溫度，並於加熱期間塗抹或噴用本發明保養品、化妝品、或藥劑。

該加熱操作係透過直接接觸及/或非直接接觸之升溫手段而進行。舉例言之，但不以此為限，該直接接觸之升溫手段可為於皮膚表面施用面膜、置放暖暖包、熱毛巾、加熱墊片或加熱面板，從而透過面膜、暖暖包、熱毛巾、加熱墊片或加熱面板的使用，以適度提高皮膚的溫度。非直接接觸升溫手段之例子則包括蒸汽機(如：離子蒸氣美容機)及加熱燈的使用，透過蒸汽機所釋放出來的熱蒸汽或加熱燈所發射之光線，以加熱皮膚表面、提高皮膚之溫度。

於本發明之部分具體實施態樣中，係透過一加熱墊片之直接接觸之升溫手段而進行該加熱操作，以提高皮膚表面的溫度。其中該加熱操作係使皮膚表面溫度升高至不傷害皮膚的溫度，例如，達到約38℃或更高之適度溫度，如38至50℃。於本發明之部分具體實施態樣中，係透過加熱手段使皮膚表面溫度達到約39℃，並維持約1至2小時。

於本發明中，由於係使用幹細胞萃取物，直接利用當中的有效成分來提供所欲效益，而非如習知幹細胞療法係透過活細胞的施用以在體內分泌有效成分來提供，所以更容易控制所需的用量。可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率施用本發明間質幹細胞萃取物所製造之保養品、化妝品、或藥劑，端視投予個體之需求而異。舉例言之，當施用於皮膚表面以修復皮膚老化時，以間質幹細胞萃取物計，其用量為每天約0.01毫升/平方公分至約1毫升/平方公分，較佳為每天約0.05毫升/平方公分至約0.5毫升/平方公分，其中，該單位『毫升/平方公分』係指每平方公分體表面積個體所須之投藥量。惟，對於皮膚老化情形較嚴重之個體而言，其用量可視實際需要而酌增，例如增加至數倍或數十倍。於使用本發明間質幹細胞萃取物以修復皮膚老化之一具體實施態樣中，以間質幹細胞萃取物計，其用量為每天約0.1毫升/平方公分。

因此，本發明亦提供一種套組，其係包含(1)一加熱工具、以及(2)一間質幹細胞萃取物。其中，該加熱工具之選用係如上述有關加熱操作之升溫手段的說明，且該間質幹細胞萃取物之選用以及其施用型態與劑量，均如上述之說明。

此外，本發明亦提供一種於一個體中修復皮膚老化之方法，其係包含對該個體施用一有效量之間質幹細胞萃取物。其中，有關該間質幹細胞萃取物之選用以及其施用型態與劑量，亦均如上述之說明。

茲以下列實施例進一步例示說明本發明。該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示者。

[實施例]

實施例1：間質幹細胞之分離及培養

實驗(1)：自組織分離出間質幹細胞

以手術剪將來自不同人體之脂肪組織(例如NR0、NR1、NR2、NR3、NR4、AD03、AD61、BN08、以及MS14)剪成小塊(約0.5公分x0.5公分)，剪好的脂肪組織置於50毫升之離心管中，以25毫升含2%盤尼西林-鏈黴素之1X磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline，PBS)溶液清洗，並進行離心處理(室溫，400g，5分鐘)。離心之後移除上清液，再以25毫升含2%盤尼西林-鏈黴素之1X PBS溶液清洗，並進行離心處理(室溫，300g，5分鐘)。離心之後移除上清液，再加入20毫升含0.4毫克/毫升第四型膠原蛋白酶(購自Invitrogen)之1X PBS溶液，並置於振盪器作用1小時(37℃，40rpm)，待第四型膠原蛋白酶與脂肪組織充分作用後，進行離心處理(室溫，400g，5分鐘)。離心之後移除上清液與脂肪組織碎片，留下間質血管質部分(stromal vascular fraction，SVF)，其係含有大量的間質幹細胞，故又稱為「間質幹細胞群」。以20毫升含2%盤尼西林-鏈黴素之1X PBS溶液清洗該間質血管質部分，並進行離心處理(室溫，300g，5分鐘)。離心之後移除上清液，再以10毫升含2%盤尼西林-鏈黴素之1X PBS溶液清洗該間質血管質部分，並進行離心處理(室溫，300g，5分鐘)，離心之後移除上清液，以獲得間質幹細胞群，供以下實驗(2)之培養步驟使用。

重複上述操作，但分別使用臍帶及骨髓以置換脂肪組織，以得到分別由臍帶及骨髓所提供之間質幹細胞群。

實驗(2)：間質幹細胞之培養

於平底燒瓶中以無血清角質細胞培養液(keratinocyte-serum free medium，K-SFM，Gibco)為基礎培養基[添加5%胎牛血清(FBS，Hyclone)、25毫克牛腦下垂體萃取物(bovine pituitary extract，Gibco)、2.5微克重組表皮生長因子(recombinant epidermal growth factor，Gibco)、2毫莫耳濃度N-乙醯基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，Sigma)、0.2毫莫耳濃度L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(L-ascorbic acis 2-phosphate，Sigma)、以及1%盤尼西林-鏈黴素(penecillin-streptomycin，Biowest)]回溶從實驗(1)所得到的間質幹細胞群，可於該礎培養基中另添加表皮生長因子(recombinant epidermal growth factor，EGF)、B27、生物素標定之表皮生長因子(biotinylated epithelial growth factor，BEGF)、或肝素(Heparin)，並靜置於37℃、5%CO₂之培養箱內生長，以放大間質幹細胞之數量，供以下實施例使用。

實施例2：間質幹細胞中趨化因子之分析

(1)間質幹細胞之全細胞RNA之製備

針對實施例1所提供之間質幹細胞，先以0.1毫莫耳濃度之PBS溶液清洗1次，加入350微升含1%β-巰基乙醇之RLT緩衝液(QIAGEN，CA，USA)，並混合均勻，接著加入等體積(即，350微升)的70%酒精，均勻混合後，將混合液移至RNeasy mini colum(QIAGEN，CA，USA)，進行離心處理(12000rpm，15秒)。離心之後移除上清液，再加入700微升RW1緩衝液(QIAGEN，CA，USA)，進行離心處理(12000rpm，15秒)；離心之後移除上清液，再加入500微升RPE緩衝液(QIAGEN，CA，USA)，進行離心處理(12000rpm，15秒)；離心之後移除上清液，重複RPE緩衝液之步驟一次，並進行離心處理(12000rpm，1分鐘)以去除殘餘試劑。將RNeasy mini colum移至新的1.5毫升微量離心管，於RNeasy mini colum內膜的正中央加入30微升RNase free water(QIAGEN，CA，USA)，靜置5分鐘後，進行離心處理(12000rpm，1分鐘)，並收集流出之濾液(即，間質幹細胞之全細胞RNA，可保存於-80℃冰箱，供下述反轉錄聚合酶連鎖反應及膠體分析用)，並利用分光光度計(DU-800，Beckman)測量波長260奈米之吸光值，以估算RNA之濃度。

(2)反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)及膠體分析

將上述(1)所提供之全細胞RNA反轉錄成cDNA後，取2.5微升cDNA，並加入2.5微升如表1A所示之引子(10微微莫耳濃度)、7.5微升之去離子水、以及12.5微升之EconoTaq^® PLUS GREEN 2X Master Mix(Lucigen，Middleton，Wisconsin，USA)，再將前述樣品置於聚合酶連鎖反應器中，並設定反應條件如下：i)94℃，30秒、55℃，30秒、94℃，60秒，以上步驟進行30個循環；ii)72℃，10分鐘；iii)最後降溫至4℃以結束反應。將所得之聚合酶連鎖反應(PCR)產物，以1.5%瓊脂膠體進行30分鐘電泳(電壓：100伏特)，接著將該膠體置於溴化乙錠(ethidium bromide，EtBr)中染色10分鐘，再利用照膠系統(DOC PRINT DP-001FDC，VilberLourmat France)拍攝影像，結果示於第1圖，最後以軟體(Image J)定量基因表現量之強弱，結果示於表1B。

由第1圖及表1B可知，源自脂肪組織(即，NR0、NR1、NR2、NR3、NR4、AD03、AD61、BN08、以及MS14)之間質幹細胞、源自骨髓(BMSC)之間質幹細胞、以及源自華頓氏凝膠(WJ)之間質幹細胞的全細胞RNA中，皆可偵測到趨化因子之基因的表現。其中，以β-肌動蛋白之表現量作為內部控制組，骨成形蛋白質-7(BMP-7)、基質細胞衍生因子-1(SDF-1)、C-X-C趨化激素受體-4(CXCR4)、介白素-17(IL-17)等趨化因子，於源自脂肪組織之間質幹細胞的表現量，較如臍帶及骨髓之其他組織來源的間質幹細胞為高。此結果顯示，該等源自動物組織之間質幹細胞皆具有表現及分泌前述該等趨化因子的能力。

實施例3：間質幹細胞萃取物之製備

先以胰蛋白酶-二胺次乙基四醋酸(Trypsin-EDTA)懸浮上述實施例1所提供之間質幹細胞後，再將其移至離心管中，進行離心(室溫，400g，5分鐘)，離心之後移除上輕液，再加入一適量之預先配製之蛋白質裂解緩衝液[包含NP40裂解緩衝液(iNtron biotechnology，Korea)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制劑、β-甘油磷酸鹽、以及釩化鈉，用量配比為96：1：1：1：1]，並以微量吸管重複抽吸，以打破細胞，置於4℃震盪20分鐘後，再進行離心處理(4℃，12000至13000rpm，10分鐘)，離心之後收集上清液(即，間質幹細胞萃取物)，供下述實施例使用。

實施例4：間質幹細胞萃取物之施用

將F344大鼠分為三組，每組各3隻。於第一組中，在F344大鼠皮下注射一顆粒白血球刺激因子(GCSF)(50微克/公斤)，連續三天，接著將所欲取樣之部位的毛髮剔除，並使用一加熱墊片與所欲取樣之部位的皮膚直接接觸，以提高皮膚表面溫度達到約39℃，且維持一小時後，再以每平方公分0.1毫升之用量，將上述實施例3所提供之間質幹細胞萃取物均勻塗抹於該所欲取樣之部位，且每二天各加熱及塗抹一次，連續進行七天，此為「(加熱+間質幹細胞萃取物)組」。於第二組中進行相同操作，但僅施以加熱操作處理一小時，而未塗抹間質幹細胞萃取物，此為「加熱組」。第三組則未做任何處理，此為「對照組」。

實施例5：皮膚組織處理及切片

針對實施例4之(i)對照組、(ii)加熱組、以及(iii)(加熱+間質幹細胞萃取物)組，分別進行以下處理。先用電動剃毛刀將F344大鼠之取樣部位的毛髮剃除，再以75%酒精消毒手術部位，輕輕用解剖刀割取約1公分平方大小的皮膚組織，深度約8毫米，以達可見脂肪層為主。將取樣後之樣品以10%福馬林(neutral buffered formalin，Surgipath)作為固定液浸泡組織，使組織的蛋白質凝固保持原始狀態，移至組織脫水機(Leica TP1020)進行脫水。首先將含有皮膚組織的包埋盒(casette)，放入組織脫水機中依序將組織作固定、脫水、清洗及浸潤(灌蠟)處理，處理後組織中的水份將會被石蠟(paraffin)所取代。處理過程依序為：10%福馬林1小時(固定)；二次水30分鐘(浸洗)；80%酒精1小時(脫水)；95%酒精1小時(脫水)；95%酒精1小時(脫水)；100%酒精1小時(脫水)；100%酒精1小時(脫水)；100%酒精2小時(脫水)；二甲苯(xylene)1小時(清洗)；二甲苯2小時(清洗)；石蠟1小時(浸潤)；以及，石蠟2小時(浸潤)。將脫水完成的組織進行石蠟包埋(tissue block system TBS 88，Medite)成石蠟塊(paraffin block)後，以手搖式石蠟切片機(Shandon AS325，Leica，德國) 進行組織切片，每片厚度為3至5微米。

實施例6：皮膚組織染色及分析

分別針對實施例5所提供之(i)對照組、(ii)加熱組、以及(iii)(加熱+間質幹細胞萃取物)組的切片，進行以下染色及分析。

(1)免疫组織化學染色(Immunhistochemistry，IHC)

主要利用免疫組織螢光染色(Immunofluorescence，IF)偵測組織中特殊抗原表現。染色步驟依序如下：將皮膚組織切片(3微米/片(section))；放置55℃烤片30分鐘；以二甲苯脫蠟後以酒精使組織回水；將組織置於抗原恢復緩衝液中，並於121℃下加熱10分鐘。以厭水筆(DAKO pen)將組織區域圈住，再將組織置於含3%雙氧水之1X PBS溶液中，並室溫下浸泡該組織10分鐘，以除去內生性還原酶之活性。以清洗液(rinse buffer，1X PBS+0.3% TritonX-100)清洗一次，再於室溫下以含5%胎牛血清之1X PBS溶液處理該組織30分鐘，以阻斷抗體非專一性之鍵結。之後，以清洗液(1X PBS+0.05% TritonX-100)清洗一次，再加入適當稀釋之(1：100至1：200)一級抗體(溴化去氧尿嘧啶(Bromodeoxyuridine，BrdU)、玻尿酸以及CD44，Abcam)，並於室溫下作用2小時或於4℃下作用至隔夜。以清洗液(1X PBS+0.05% TritonX-100)清洗三次，再加入適當稀釋之二級抗體(1：5000)，於室溫下作用1小時。以清洗液(1X PBS+0.05% TritonX-100)清洗三次，加入DAB呈色劑(3,3’-Diaminobenzidine)(LSAB2 Kit，DAKO，加州，美國)呈色10分鐘，陽性反應呈紅棕色，若未有顏色出現即為陰性結果。以蘇木紫溶液染色1分鐘做細胞核對比染色(counter stain)，洗去過多之蘇木紫，再以自來水浸泡10分鐘。最後以酒精脫水，再以封片膠封片。

於抽風櫃乾燥後在顯微鏡下觀察結果並以CCD數位照相系統(OLYMPUS，DP70)照相，結果示於第2A、2B及3A圖及表2A、2B及3A。其中，第2A及2B圖分別顯示利用免疫組織化學染色分析細胞增生的指標(即，BrdU)以及內生性造血幹細胞的指標(即，CD34)；第3A圖顯示利用免疫組織化學染色分析玻尿酸(消除疤痕能力的指標)的結果；表2A、2B及3A分別為第2A、2B及3A圖的定量結果。

(2)梅生三色染色/膠質纖維染色(Masson’s trichrome Stain/gelatinous fiber stain)

梅生三色染色/膠質纖維染色為組織化學染色的一種，主要用以區別膠原纖維。在酸性環境下，對膠原纖維與肌肉纖維有選擇性染色。膠原纖維經酸處理後使猩紅(Biobrich Scarlet)由膠原滲出而被苯胺藍(aniline blue)染色，呈現藍色。染色步驟依序如下：將切片脫石蠟後，以Bouin’s溶液在56℃下浸泡1小時，再以蘇木紫溶液染色5分鐘(染細胞核)；以水流沖片沖洗15分鐘，再依序猩紅-酸性復紅(Biebrich Scarlet-Acid fuchsin；Sigma，HT15-1)染色15分鐘、以磷鉬酸-磷鎢酸(Phosphomolybdic acid-Phosphotungstic acid；Sigma，P7390、P4006)染色15分鐘、以苯胺藍(Sigma，M5528)染色5分鐘、以及以1%冰醋酸浸泡5分鐘。最後以酒精脫水，再以封片膠封片。

於抽風櫃乾燥一天後以顯微鏡觀察並以CCD數位照相系統(OLYMPUS，DP70)照相，結果示於第3B圖及表3B。其中，第3B圖顯示利用梅生三色染色/膠質纖維染色分析膠原蛋白(皮膚老化指標，其含量越少表示老化程度越高)的結果；表3B為第3B圖的定量結果。

(3)彈性蛋白染色(Elastic Stain(Modified Verhoff’s))及網狀蛋白染色(Reticular stain)

此為用於區別彈性蛋白及網狀蛋白之染色法，彈性蛋白及網狀蛋白經染色後呈現藍黑色。染色步驟如下：將皮膚組織切片(3微米/片(section))；放置55℃烤30分鐘；以二甲苯脫蠟後以酒精使組織回水；以活化的彈性蛋白染色溶液(working elastic stain solution)染色15分鐘；以流水沖洗1分鐘；以2%氯化鐵區分溶液(Ferric Chloride Differentiating Solution)染色20秒；以流水沖洗1分鐘；以5%硫代硫酸納溶液染色1分鐘；以流水沖洗1分鐘；以Van Gieson’s溶液染色3分鐘；最後以酒精脫水後，再以封片膠封片。

於抽風櫃乾燥一天後以顯微鏡觀察並以CCD數位照相系統(OLYMPUS，DP70)照相，結果示於第3C及3D圖、表3C及表3D。其中，第3C圖顯示利用彈性蛋白染色及網狀蛋白染色分析彈性蛋白(皮膚彈性指標)的結果；第3D圖顯示利用彈性蛋白染色及網狀蛋白染色分析網狀蛋白(皮膚彈性指標)的結果；表3C及表3D分別為第3C及3D圖的定量結果。

(4)試驗結果

(4-1)間質幹細胞萃取物可刺激施用部位之細胞增生以及刺激內生性造血幹細胞聚集至施用部位並增生

第2A及2B圖顯示為大鼠皮膚未經處理或經不同處理後，利用免疫組織化學染色分析細胞增生的指標(即，BrdU)以及內生性造血幹細胞的指標(即，CD34)，表2A及表2B則分別為第2A及2B圖的定量結果。

於第2A圖中，紅色箭頭所指即為BrdU所標記的細胞，結果顯示，未做任何處理之「對照組」中並未觀察到BrdU所標記的細胞，單獨使用加熱操作之「加熱組」僅可些微增加BrdU所標記的細胞數目，以「間質幹細胞萃取物」合併「加熱」處理之「加熱+間質幹細胞萃取物」組則顯示BrdU所標記的細胞數目顯著增加，由第2A圖及表2A可知，併用「間質幹細胞萃取物」與「加熱」處理時，可有效刺激皮膚組織之細胞的增生。

此外，由第2A圖亦觀察到，「對照組」的毛囊周圍幾乎沒有細胞增生，經合併「間質幹細胞萃取物」與「加熱」處理後，毛囊周圍則聚集許多增生的細胞，若以單一毛囊內褐色之細胞數目計，「對照組」與「加熱+間質幹細胞萃取物」組之比例為1：35。此結果顯示，本發明間質幹細胞萃取物亦有助於減少掉髮、促進毛囊細胞活化、促進毛囊細胞增生、及促進毛髮生長。

由第2B圖及表2B可知，相較於「對照組」及「加熱組」，「加熱+間質幹細胞萃取物」組的結果顯示，以「間質幹細胞萃取物」合併「加熱」處理後，CD34所標記的內生性造血幹細胞數目係顯著增加(第2B圖中紅色箭頭所指即為內生性造血幹細胞所聚集的位置)，此結果說明「間質幹細胞萃取物」與「加熱」併用，可有效刺激內生性造血幹細胞聚集至施用部位並增生。

(4-2)間質幹細胞萃取物可促進皮膚中玻尿酸、彈性蛋白、膠原蛋白、及網狀蛋白之生成

第3A圖顯示大鼠皮膚未經處理或經不同處理後，利用免疫組織化學染色分析玻尿酸(消除疤痕能力的指標)的結果，表3A則為第3A圖的定量結果。

由第3A圖及表3A可知，相較於「對照組」及「加熱組」，「加熱+間質幹細胞萃取物」組的結果顯示，以「間質幹細胞萃取物」合併「加熱」處理後，玻尿酸表現量明顯增加(如第3A圖中紅色箭頭所指位置)。此結果顯示，本發明間質幹細胞萃取物可有效促進玻尿酸生成。

第3B圖顯示大鼠皮膚未經處理或經不同處理後，利用梅生三色染色/膠質纖維染色分析膠原蛋白(皮膚老化指標，其含量越少表示老化程度越高)的結果，表3B則為第3B圖的定量結果。

由第3B圖及表3B可知，相較於「對照組」及「加熱組」，「加熱+間質幹細胞萃取物」組的結果顯示，以「間質幹細胞萃取物」合併「加熱」處理後，膠原蛋白的表現量明顯增加(如第3B圖中呈現藍色的部分)。此結果顯示，本發明間質幹細胞萃取物可有效促進膠原蛋白生成。

第3C圖顯示大鼠皮膚未經處理或經不同處理後，利用彈性蛋白染色及網狀蛋白染色分析彈性蛋白(皮膚彈性指標)的結果，表3C則為第3C圖的定量結果。

由第3C圖及表3C可知，相較於「對照組」及「加熱組」，「加熱+間質幹細胞萃取物」組的結果顯示，以「間質幹細胞萃取物」合併「加熱」處理後，彈性蛋白的表現量明顯增加(如第3C圖中黃色箭頭所指位置)。此結果顯示，本發明間質幹細胞萃取物可有效促進彈性蛋白生成。

第3D圖顯示大鼠皮膚未經處理或經不同處理後，利用彈性蛋白染色及網狀蛋白染色分析網狀蛋白(皮膚彈性指標)的結果，表3D則為第3D圖的定量結果。

由第3D圖及表3D可知，相較於「對照組」及「加熱組」，「加熱+間質幹細胞萃取物」組的結果顯示，以「間質幹細胞萃取物」合併「加熱」處理後，網狀蛋白的表現量明顯增加(如第3D圖中黃色箭頭所指位置)。此結果顯示，本發明間質幹細胞萃取物可有效促進網狀蛋白生成。

以上結果顯示，就生化功能而言，本發明間質幹細胞萃取物可促進皮膚中玻尿酸生成、促進皮膚中彈性蛋白生成、促進皮膚中膠原蛋白生成、及促進皮膚中網狀蛋白生成；就生理效果而言，則可改善皮膚堅實度或豐滿度、促進皮膚新陳代謝、及改善皮膚結構(包括使皮膚表皮層變薄及增加真皮層彈性)。經由上述作用機制，本發明間質幹細胞萃取物可達成淡化線紋、減少或預防皺紋、減少皮膚變色作用、及/或改善皮膚色調等修復皮膚老化之功效。

上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後附申請專利範圍所界定者。

<110> 國璽幹細胞應用技術股份有限公司

<120> 間質幹細胞萃取物於修復皮膚老化之用途

<130> 無

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BMP-7引子-順向序列

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BMP-7引子-反向序列

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SDF-1引子-順向序列

<400> 3

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SDF-1引子-反向序列

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CXCR4引子-順向序列

<400> 5

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CXCR4引子-反向序列

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-17引子-順向序列

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-17引子-反向序列

<400> 8

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-肌動蛋白引子-順向序列

<400> 9

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-肌動蛋白引子-反向序列

<400> 10

Claims

一種間質幹細胞萃取物，其係包含骨成形蛋白質-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)、基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、C-X-C趨化激素受體-4(C-X-C chemokine receptor type-4，CXCR4)、腦衍生神經滋長因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、以及介白素-17(interleukin-17，IL-17)，且係藉由包含以下步驟之方式而提供：(1)將一源自動物脂肪組織之間質幹細胞與一包含NP40裂解緩衝液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制劑、β-甘油磷酸鹽、以及釩化鈉之蛋白質裂解緩衝液混合，以進行細胞裂解，提供一細胞裂解液；以及(2)於不超過4℃之溫度下離心分離該細胞裂解液，收集上清液。
一種使用一間質幹細胞萃取物於製造用於修復皮膚老化之保養品、化妝品或藥劑的用途，其中該間質幹細胞萃取物係如請求項1所界定者。
如請求項2之用途，其中該保養品、化妝品或藥劑係呈一選自以下群組之型態：乳液、乳霜、凝膠、膏狀物、噴霧劑、及溶液，其中該凝膠係包含水凝膠；該膏狀物係包含分散膏、及軟膏；以及該溶液係包含洗液、及懸浮液。
如請求項2之用途，其中該保養品、化妝品或藥劑係以施用於皮膚表面。
如請求項2之用途，其中該保養品、化妝品或藥劑係與一加熱手段(a heating means)併用。
如請求項5之用途，其中該加熱手段係直接接觸之加熱手段及非直接接觸之加熱手段之至少一者。
如請求項6之用途，其中該直接接觸之加熱手段係選自以下群組之至少一者：面膜、暖暖包、熱毛巾、加熱墊片以及加熱面板。
如請求項6之用途，其中該非直接接觸之加熱手段係包含蒸氣加熱以及加熱燈照射之至少一者。
如請求項2至8中任一項之用途，其中該保養品、化妝品或藥劑係用於選自以下群組之至少一者：促進皮膚中玻尿酸生成、促進皮膚中彈性蛋白生成、促進皮膚中膠原蛋白生成、促進皮膚中網狀蛋白生成、刺激施用部位之細胞增生、刺激施用部位之細胞分泌趨化因子、及刺激內生性造血幹細胞聚集至施用部位並增生。
如請求項2至8中任一項之用途，其中該保養品、化妝品或藥劑係進一步用於選自以下群組之至少一者：減少掉髮、促進毛囊細胞活化、促進毛囊細胞增生、及促進毛髮生長。
一種套組，其係包含(1)一加熱工具、以及(2)一間質幹細胞萃取物，其中該幹細胞萃取物係如請求項1所界定者。
如請求項11之套組，其中該加熱工具係包含面膜、暖暖包、熱毛巾、加熱墊片以及加熱面板之至少一者。
如請求項11之套組，其中該加熱工具係包含面膜及暖暖包、熱毛巾之至少一者。