CN1592781A - 脂肪衍生的干细胞和网格体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了脂肪衍生的干细胞(ADSCs)，富含脂肪衍生的干细胞的组分(ADSC－EF)和脂肪衍生的网格体，它们单独存在和与本发明的ADSCs混合。在一个方面，本发明提供了一种ADSC，它基本上不含脂肪细胞和红细胞，和结缔组织干细胞的克隆群体。该ADSCs可单独或者在生物学相容性组合物内使用以便在体内和体外产生分化的组织和结构。另外，可增殖并培养ADSCs以产生诸如激素的分子，和提供经适应的培养基用于支持其它细胞群体的生长和增殖。在另一方面，本发明提供了基本上不含细胞的脂肪衍生的网格体，它包括来自脂肪组织的细胞外基质材料。该网格体可用作基质以帮助细胞在体内或者体外生长和分化成原基或者甚至成熟的组织或结构。

Description

脂肪衍生的干细胞和网格体
本专利申请是2001年9月10日申请的美国申请流水号未知的部分继续申请(CIP)，所述美国申请相应于2000年3月10日申请的PCT申请号PCT/US00/06232，后者要求了1999年3月10申请的美国申请流水号60/123,711和1999年10月29日申请的美国申请流水号60/162,462的申请日优先权。所有上述申请的内容以其整体引入本专利申请以供参考。
在本申请全文中，引用了各种文献。这些文献的公开内容在本文中引用以其整体作为参考。
技术背景
在最近几年，主要从骨髓获得的间充质干细胞的鉴定导致了在组织再生和分化方面的进展。该细胞是在骨髓和骨外膜中发现的多能细胞，它们能够分化成各种间充质或结缔组织。例如，该骨髓衍生的干细胞在接触诸如5-氮胞苷的试剂时可被诱导发育成肌细胞(Wakitani等，Muscle Nerve，18(12)，1417-26(1995))。已表明该细胞可用于诸如软骨，脂肪，和骨骼的组织修复(参见，例如，美国专利号5,908,784，5,906,934，5,827,740，5,827,735)，且也有它们通过遗传修饰的应用(参见，例如，5,591,625)。尽管该细胞的鉴定导致了在组织再生和分化方面的进展，但是该细胞的使用受到一些技术障碍的阻碍。使用该细胞的一个缺点是它们非常稀少(表现为少到1/2,000,000个细胞)，使得获得和分离它们的任何方法都变得困难和昂贵。当然，骨髓的获取对于捐献者一般是痛苦的。而且，该细胞不经诱导分化难以培养，除非使用特异性筛选的血清批次，这对于该干细胞的使用又增加了成本和劳动。Peterson等的美国专利号6,200,606描述了从包括脂肪的组织分离CD34+骨骼或软骨前体细胞(属于中胚层起源)。
对于大量干细胞更容易获得的来源仍然存在需要，特别是可分化成不同胚层的多种谱系，且不需对培养材料进行昂贵预筛就可培养的细胞。
在组织工程中的其它进展表明细胞可在特别限定的培养物中生长以产生三维结构。空间限定一般通过使用各种无细胞网格体(lattices)或基质以支持并指导细胞生长和分化来实现。尽管该技术仍然处于其初期，但是动物模型中的实验证实可采用各种无细胞网格体材料以再生整体组织(参见，例如，Probst等，BJU Int.，85(3)，362-7(2000))。合适的网格体材料是从肿瘤细胞系分离的分泌的细胞外基质材料(例如，Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤分泌的基质-“基质胶(matrigel)”)。该材料含有IV型胶原和生长因子，且提供了细胞生长的优良基底(参见，例如，Vukicevic等，Exp.CellRes，202(1)，1-8(1992))。然而，由于该材料也促进一些细胞的恶性转化(参见，例如，Fridman，等，Int.J Cancer，51(5)，740-44(1992))，因此它不适合于临床应用。尽管已经开发了其它的人工网格体，但是体内使用时证实它们对细胞或者对患者有毒性。因此，仍然需要适合于在培养和生长细胞群体中用作基底的网格体材料。
发明概述
本发明提供了脂肪衍生的干细胞，脂肪衍生的干细胞组分，网格体，和获得该细胞，组分，和网格体的方法。在一个方面，本发明提供了基本上不含脂肪细胞和红细胞和结缔组织细胞群体的脂肪衍生的干细胞组分。本发明还提供了从该组分分离的干细胞，其中该干细胞是多能的。该多能干细胞具有分化成中胚层，外胚层，或内胚层的能力。该细胞可单独或者在生物学相容性组合物内使用，以便在体内和体外产生分化的组织和结构。另外，可增殖并培养该细胞以产生生长因子和提供经适应的培养基(conditioned culturemedia)用于支持其它细胞群体的生长和增殖。在另一方面，本发明提供了基本上不含细胞的脂肪衍生的网格体，它包括来自脂肪组织的细胞外基质材料。该网格体可用作基底以帮助细胞在体内或者体外生长和分化成原基(anlagen)或者甚至成熟的组织或结构。
脂肪组织丰富且代表了干细胞，组分，和网格体的可用来源。而且，该干细胞可在未分化状态下在不需预筛血清批次的培养条件下在培养基中传代；本发明的细胞可在比其它类型的干细胞花费少得多的条件下维持。本发明的这些和其它优势，以及附加的创造性特征从附图和下面的详细描述将是显而易见的。
附图说明
图1.脂肪衍生的干细胞在长期培养期间的形态学，生长动力学和衰老。A组：从脂肪抽吸术抽出的脂肪组织获得的脂肪衍生的干细胞(例如，经处理的脂肪抽吸物或PLA)的形态学。B组：延期培养从3个供体获得的脂肪衍生的干细胞(PLAs)，测量累积群体倍增且表示为传代数的函数。C组：通过在pH6.0染色β-半乳糖苷酶表达所检测的脂肪衍生的干细胞(PLA)培养物的衰老。显示了代表性的衰老细胞(箭头)。
图2.通过间接免疫荧光(IF)测定的脂肪衍生的干细胞(PLA)的组成。脂肪衍生的干细胞(PLA)和骨髓基质细胞(BMS)用下列抗体染色：1)抗-因子VIII(FVIII)；2)抗-平滑肌肌动蛋白(SMA)；和3)ASO2(ASO2)。显示了表达因子VIII和平滑肌肌动蛋白的细胞(箭头)。
图3.以流式细胞仪测定的脂肪衍生的干细胞(PLA)的组成。A组：使用前向和侧向散射(分别为FS和SS)对脂肪衍生的干细胞(PLA)样品进行流式细胞术。显示了代表性的脂肪衍生的干细胞样品。B组：用下列单克隆抗体染色测定来自一个供体的代表性脂肪衍生的干细胞(PLA)样品的细胞组成：抗-因子VIII(FVIII)，抗-平滑肌肌动蛋白(SMA)，ASO2和抗波形蛋白(间充质来源的细胞的附加标记)的单克隆抗体(VIM)。C组：收集了来自5个供体的流式细胞术数据，将每一种细胞特异性标记的阳性事件的平均数表示为脂肪衍生的干细胞(PLA)细胞总数的百分数。
图4.脂肪衍生的干细胞(PLA)经生脂培养基(AM)处理，积累了充满脂质的小滴。脂肪衍生的干细胞(PLA)，骨髓衍生的MSCs(MSC)，和3T3-L1脂肪细胞前体细胞(3T3-L1)在AM中培养两周并用油红O染色以鉴定充满脂质的细胞内液泡。在对照培养基中维持的未分化的PLA细胞(阴性对照(-vecontrol))染色为阴性对照。
图5.用成骨培养基(OM)诱导的脂肪衍生的干细胞(PLA)表达碱性磷酸酶且与钙化的细胞外基质(ECM)相连。在OM中培养脂肪衍生的干细胞(PLA)，骨髓衍生的MSCs(MSC)和人成骨细胞系(NHOst)以诱导骨生成。在2周时染色细胞的碱性磷酸酶活性(AP；红色)。在4周时检查钙化的细胞外基质(黑色区域)的存在(von Kossa)。检查在对照培养基中维持的未分化脂肪衍生干细胞的AP表达，以基质钙化作为阴性对照(-ve control)。
图6.用软骨形成培养基(CM)处理的脂肪衍生的干细胞(PLA)与富含蛋白聚糖的基质相连且表达II型胶原蛋白。使用微量(micromass)技术在CM中培养脂肪衍生的干细胞(PLA)和MSCs(MSC)2周以诱导软骨形成。固定细胞并在酸性条件下用阿尔新蓝(Alcian Blue)处理存在的硫酸蛋白聚糖(阿尔新蓝)。人软骨的石蜡切片用作阳性对照(软骨)，而在对照培养基中维持的未分化的PLAs经处理后作为阴性对照(-ve control)。另外，在PLA细胞和人软骨切片中检查软骨特异性II型胶原蛋白的表达(II型胶原蛋白)。用阿尔新蓝染色在对照培养基中培养的脂肪衍生的干细胞(阴性对照)并作为II型胶原蛋白表达的阴性对照。
图7.在生肌培养基(MM)中培养的脂肪衍生的干细胞(PLA)表达肌球蛋白重链和MyoD1。脂肪衍生的干细胞(PLA)用MM处理并用对骨骼肌肌球蛋白重链(肌球蛋白)或MyoD1(MyoD1)特异性的抗体染色。人骨骼肌细胞系(SKM)作为阳性对照来检查。另外，显示在脂肪衍生的干细胞培养物中存在多核细胞(PLA，插图框)。在未分化的脂肪衍生的干细胞(阴性对照)中也评估了肌球蛋白和MyoD1的表达作为阴性对照。
图8.脂肪衍生的干细胞(PLA)的生长动力学。A组：从各供体分离的脂肪衍生的干细胞一式三份以每孔1×104个细胞的密度接种。24小时后(第1天)和第1天后的每48小时(第3到11天)计算细胞数。表示相对于培养时间的各供体的平均细胞数。显示了来自4个代表性供体的生长曲线(20岁-空心方形，39岁-空心圆，50岁-空心三角，和58岁-交叉形)。结果表示为平均值±SEM。B组：从各生长曲线的对数期(即从第3天到第9天)计算所有供体的群体倍增并按年龄表示。计算回归线(n＝20；r＝0.62)。
图9.组织学证实脂肪衍生的干细胞(PLA)的脂肪形成和成骨分化。A：为了证实脂肪形成，用油红O在诱导后2周时染色细胞。显示了低和广泛的脂肪形成水平(1组-低；2组-高)。分析在非诱导型对照培养基中培养的脂肪衍生的干细胞作为阴性对照(3组)。B：为了定量生脂分化，在3个确定的区域内计数油红O阳性染色细胞的数量。每个供体分析两个样品。测定油红O阳性细胞的平均数，表示为脂肪衍生的干细胞总数的百分数，作为生脂分化的指标。分化按照年龄表示并计算回归线(n＝20；r＝0.016)。
图10.随着供体年龄增加成骨分化减少。A组：为了证实骨生成，在诱导后2周时染色脂肪衍生的干细胞(PLA)的碱性磷酸酶(AP)活性(1至3组)并在诱导后4周时使用von Kossa染色基质的钙化(4至6组)。显示了成骨分化水平(1/2组-低；4/5组-高)。分析在非诱导型对照培养基中培养的脂肪衍生的干细胞作为阴性对照(3和6组)。B组：为了定量成骨分化，在3个确定的区域内计数AP-阳性染色细胞的数量。每个供体分析两个样品。测定AP-阳性细胞的平均数，表示为脂肪衍生的干细胞总数的百分数，作为成骨分化的指标。分化按照年龄表示并计算回归线(n＝18；r＝-0.70)。C组：根据B组的结果，将供体库分成两个年龄组[(20至36岁(n＝7)和37至58岁(n＝11)]。计算每组的成骨分化的平均水平，并表示为脂肪衍生的干细胞总数的百分数。使用不配对(unpaired)的Student t检验假定不等方差(unequal variances)测定统计学显著性(p＜0.001)。分化表示为平均值±SEM。
图11.脂肪衍生的干细胞组分(PLA组分)中的骨原细胞数不随年龄明显改变。通过鉴定具有成骨潜能的细胞测定组分内的骨原细胞数。检查两组供体[A组＝20至39岁(n＝5)，B组＝40-58岁(n＝6)]。通过染色AP活性证实骨生成。计数含有超过10个AP-阳性细胞的集落(CFU/AP+)，平均以后作为各年龄组内成骨前体数的指标。使用不配对的Student t检验假定不等方差测定统计学显著性(p＝0.11)。值表示为平均CFU/AP+±SEM。
图12.放入微量培养物并用软骨形成培养基诱导的人脂肪衍生的干细胞(PLA)进行细胞缩合和结节形成。在微量条件下诱导的脂肪衍生的干细胞在pH1下用阿尔新蓝染色以检测硫酸蛋白聚糖的存在。A组：细胞缩合；(B组)嵴形成；(C组)显示了三维球状体的形成(放大率100X)；(D组)阴性对照(对照培养基)。
图13.来自脂肪衍生的干细胞(PLA)的结节石蜡切片的苏木精和伊红，Goldner′s三色染料，和阿尔新蓝染色。用软骨形成培养基处理微量培养物的脂肪衍生的干细胞以形成结节，将结节包埋于石蜡中并切片。结节切片使用常规苏木精和伊红染色(A和B组)和Goldner′s三色染料染色以检测胶原蛋白(绿色)(C和D组)。诱导2天的脂肪衍生的干细胞以200X的放大率显示(A和C组)且14天时以100X显示(B和D组)。另外，切片在pH1下用阿尔新蓝染色以检测高度硫酸化的蛋白聚糖。第二天的结节(E组)以200X的放大率显示且第十四天的结节(F组)以100X显示。
图14.从脂肪衍生的干细胞(PLA)分化的结节表达软骨素-4-硫酸和硫酸角蛋白以及软骨特异性的II型胶原蛋白。将从脂肪衍生的干细胞诱导2天(A和C组)和14天(B和D组)的结节包埋于石蜡中并切片。切片用抗硫酸蛋白聚糖软骨素-4-硫酸和硫酸角蛋白的单克隆抗体染色。切片也用抗II型胶原蛋白的单克隆抗体染色(E和F组)(放大率200X)。
图15.从脂肪衍生的干细胞诱导的结节的RT-PCR分析证实了II型和X型胶原蛋白的表达以及软骨特异性蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖的表达。通过RT-PCR分析在软骨形成培养基和非诱导型对照培养基中诱导2，7和14天的脂肪衍生的干细胞中I型(CN I)，II型(CN II)，和X型(CN X)胶原蛋白以及软骨特异性蛋白聚糖(PG)，聚集蛋白聚糖(AG)，和骨钙蛋白(OC)的表达。
图16.在生肌培养基中诱导的脂肪衍生的干细胞表达MyoD1。A至C组：脂肪衍生的干细胞(PLA)在MM中诱导1周(A组)，3周(B组)和6周(C组)后用抗MyoD1的抗体染色。显示了在阳性染色的PLA细胞的核中表达MyoD1(箭头，放大率200x)。D至F组：在非诱导型对照培养基(CM)中诱导1周(D组)，3周(E组)和6周(F组)的PLA细胞按上述进行处理作为阴性对照(放大率200x)。
图17.在生肌培养基中诱导的脂肪衍生的干细胞表达骨骼肌肌球蛋白重链。A至C组：脂肪衍生的干细胞(PLA)在MM中诱导1周(A组)，3周(B组)和6周(C组)后用抗肌球蛋白重链的抗体染色(肌球蛋白)。显示了肌球蛋白阳性染色的PLA细胞(箭头，放大率200x)。D至F组：在非诱导型CM中诱导1周(D组)，3周(E组)和6周(F组)的脂肪衍生的干细胞(PLA)按上述进行处理作为阴性对照(放大率200x)。
图18.在生肌培养基中培养的脂肪衍生的干细胞形成多核细胞。A组：用MM诱导后3周(1)和6周(2)时脂肪衍生的干细胞(PLA)的相差照片(放大率400x)。显示了多核细胞(箭头)。B组：在诱导后6周时用抗肌球蛋白重链的抗体免疫染色脂肪衍生的干细胞(PLA)。显示了表达肌球蛋白的多核细胞(箭头)。
图19：在MM中诱导的脂肪衍生的干细胞的RT-PCR分析。使用人MyoD1和肌球蛋白的引物对在MM(PLA-MM)或CM(PLA-CM)中诱导1，3和6周的脂肪衍生的干细胞进行RT-PCR。对在MM中诱导的人包皮成纤维(HFF)细胞也进行RT-PCR分析(HFF-MM)作为阴性对照。使用β-肌动蛋白的引物组进行双份反应作为内部对照。通过琼脂糖凝胶电泳分辨PCR产物并使用β-肌动蛋白水平补偿。
图20.MyoD1-阳性脂肪衍生的干细胞的比例随诱导时间而增加。直方图显示了在MM中诱导1，3和6周后MyoD1-阳性的脂肪衍生的干细胞(PLA)的平均数(％PLA细胞总数±SEM-影线柱)。也测量了用CM诱导脂肪衍生的干细胞后(黑色柱)和在MM中的HFF细胞(空心柱)观察到的MyoD1-阳性细胞的平均数。各实验的值在下面以表格的形式表示。使用单向ANOVA对1至6周的MyoD1值进行统计学比较(星号；P＜0.001，F＝18.9)。另外，进行ANOVA比较各时间点的实验值和对照值。显示了p-值(p＜0.0001)。
图21.在诱导的脂肪衍生的干细胞中观察到肌球蛋白表达的时间依赖型增加。直方图显示了在肌球蛋白培养基(MM)中诱导1，3和6周后肌球蛋白-阳性脂肪衍生的干细胞(PLA)的平均数(％PLA细胞总数±SEM-影线柱)。也测量了用对照培养基(CM)诱导脂肪衍生的干细胞(黑色柱)，和在肌球蛋白培养基(MM)中的人包皮成纤维细胞(HFF)(空心柱)观察到的肌球蛋白-阳性细胞的平均数。各实验的值在下面以表格的形式表示。使用单向ANOVA对1至6周的肌球蛋白值进行统计学比较(星号；P＜0.0001，F＝75.5)。另外，进行ANOVA比较各时间点的实验值和对照值。显示了p-值(p＜0.0001)。
图22.脂肪衍生的干细胞的长期软骨形成潜力。在微量条件下诱导第1代(A组)，3代(B组)，和15代(C组)的脂肪衍生的干细胞并在pH1下用阿尔新蓝染色以检测硫酸蛋白聚糖的存在。
图23.脂肪衍生的干细胞(PLA)表达特有的一组CD标记。处理来自人骨髓的PLA细胞和MSCs用于所示CD抗原的IF。用DAPI共染细胞以观察核(蓝色)并结合荧光图像。
图24.使用流式细胞术测定脂肪衍生的干细胞(PLA)和骨髓MSCs的CD标记谱。A组：使用前向和侧向散射通过FC分析脂肪衍生的干细胞以评估细胞大小和颗粒性(granularity)(分别为FSC-H和SSC-H)。分析MSCs作为对照。B组：固定PLA细胞并使用荧光染料偶联的第一抗体温育所示的CD标记。随后通过FC分析染色的PLA细胞。检查用荧光染料偶联的非特异性IgG染色的MSCs和PLA细胞，分别作为阳性和阴性对照。所有结果校正衰老(senescence)且代表总共105次事件(events)。
图25.成骨的脂肪衍生的干细胞(PLA)可通过明显的增生，合成和矿化状态来鉴定。收获脂肪衍生的干细胞并以每个分化时期两组4个培养板平板接种到35mm组织培养皿中。所有培养皿在对照培养基中维持直到达到约50％汇合。用成骨培养基(OM)诱导细胞并在所示天数计数细胞数。细胞数表示为脂肪衍生的干细胞数(#个细胞(105))并对分化时间绘图( A组)。对于各时间期，一个培养皿染色碱性磷酸酶(AP)活性，一个培养皿使用Von Kossa染料(VK)染色以检测磷酸钙(B组)。
图26.地塞米松和1，25-二羟维生素D3有差别地影响PLA骨生成：AP酶和磷酸钙定量。PLA细胞，MSCs和NHOsts的一式三份样品在含有10-7M地塞米松(OM/Dex)或10-8M 1，25-二羟维生素D3(OM/VD)的OM中诱导最多达6周。测定细胞的AP活性，总钙含量和总蛋白质。AP水平表示为每微克蛋白每分钟形成的对硝基苯酚nmol数(nmol对硝基苯酚/min/ug)。钙水平表示为每微克蛋白的钙mM数(mM Ca2+/ug)。分析未诱导的PLA细胞(对照)作为阴性对照。值表示为平均值±SD。
图27.骨诱导的PLA细胞表达与成骨分化一致的一些基因：RT-PCR和微阵列分析。 A组：PLA细胞在OM/Dex，OM/VD或非诱导型对照培养基(对照)中培养所示天数。分离总RNA，合成cDNA并对所示基因进行PCR扩增。MSCs在OM/Dex或OM/VD中诱导，NHOsts在OM/Dex中诱导2和3周作为对照。使用β-肌动蛋白的引物扩增双份反应作为内部对照。 B组：PLA细胞在OM/Dex中诱导3周或者在非诱导型对照培养基中维持。分离总RNA并使用含有基因OC，OP，ON，CBFA1，CNI和BSP的定制阵列进行微阵列分析。
图28.骨诱导的PLA细胞表达与成骨分化一致的一些蛋白：免疫荧光和Western分析。 A组：PLA细胞和MSCs在OM/Dex中诱导或者在非诱导型对照培养基(对照)中维持21天。处理细胞用于OC，OP和ON表达的IF。用DAPI共染细胞以观察核(蓝色)并结合荧光图像。 B组：PLA细胞在OM/Dex或者非诱导型对照培养基(对照)中培养7和21天。通过电泳分离细胞溶胞产物并使用抗OP(αOP)，ON(αON)，核心蛋白聚糖(αDEC)，双糖链蛋白聚糖(αBG)和CNI(αCNI)的抗体通过Westem印迹分析。运铁蛋白受体(αTfR)的表达用作内部对照。
图29.脂肪衍生的干细胞(PLA)的生脂分化伴随着生长停滞。收获脂肪衍生的干细胞并以每个分化时期一组四板平板接种到35mm组织培养皿中。所有培养皿在对照培养基中维持直到达到约80％汇合。用生脂培养基(AM)诱导细胞并在所示天数计数细胞数。细胞数表示为PLA细胞的数目(#个细胞(105))并相对于分化时间绘图( A组)。对于各时间期间，用油红O染色一个培养皿以检测脂类积累( B组)。
图30.脂肪形成PLA细胞表达GPDH活性。PLA细胞和3T3-L1细胞的一式三份样品在AM(分别为PLA-AM，3T3-AM)中诱导最多5周。测定细胞的GPDH活性和总蛋白。GPDH水平表示为每微克蛋白的单位GPDH(GPDH/ug)。分析未诱导的PLA细胞作为阴性对照(PLA-对照)。值表示为平均值±SD。
图31.脂肪衍生的干细胞表达与生脂分化一致的一些基因：RT-PCR。脂肪衍生的干细胞在AM(AM)中诱导或者在非诱导型对照培养基(对照)中维持所示天数。通过RT-PCR分析细胞的所示基因。MSCs和3T3-L1细胞在AM中诱导作为对照。使用β-肌动蛋白的引物扩增双份反应作为内部对照。
图32.诱导成为软骨形成谱系的脂肪衍生的干细胞与蛋白聚糖角质素和硫酸软骨素相关：免疫组织化学和二甲基二亚甲基蓝试验。 A组：在微量条件下脂肪衍生的干细胞(PLA)在软骨形成培养基(CM)中诱导或者在非诱导型对照培养基(对照)中维持7天。固定结节，包埋于石蜡中，切片并用阿尔新蓝染色以鉴定硫酸化的蛋白聚糖。也染色了切片的CNII，硫酸角质素(KS)和软骨素-4-硫酸(CS)的表达，接着用H & E复染。 B组：PLA细胞和NHCK细胞的一式三份样品在CM中诱导最多3周(分别为PLA-CM，NHCK-CM)。测定蛋白聚糖水平(硫酸角质素和硫酸软骨素)并表示为每微克总蛋白的蛋白聚糖微克数(ug PG/ug)。分析未诱导的脂肪衍生的干细胞(PLA-对照)作为阴性对照。值表示为平均值±SD。
图33.软骨形成PLA细胞表达与软骨分化一致的一些基因：RT-PCR。在微量培养条件下的PLA细胞在CM中诱导4，7，10和14天或者在非诱导型对照培养基中维持10天(对照)。通过RT-PCR分析细胞的所示基因。NHCK细胞在商品软骨形成前体培养基中诱导作为阳性对照。使用β-肌动蛋白的引物进行双份反应作为内部对照。
图34.诱导成为肌原性谱系的PLA细胞表达与生肌分化一致的一些基因：RT-PCR分析。PLA细胞在MM中诱导(PLA-MM)1，3和6周。通过RT-PCR分析细胞的MyoD1(MD1)，肌球蛋白(MYS)，肌细胞生成素(MG)和myf5(MYF5)表达。分析从人骨骼肌(SKM)制备的总RNA作为阳性对照。使用β-肌动蛋白的引物扩增双份反应作为内部对照。
图35.ADSCs表达与多谱系能力一致的多种标记。ADSC分离：PLA细胞以极低的汇合度平板接种以便产生分离的单个细胞。培养物在对照培养基中维持直到单个PLA细胞的增殖导致形成容易确定的集落。单个PLA-细胞衍生的集落称为脂肪衍生的干细胞(ADSCs)。使用无菌克隆环和0.25％胰蛋白酶/EDTA收获ADSCs。收获的ADSCs在克隆培养基(在F12/DMEM(1∶1)中含15％FBS，1％抗生素/抗真菌剂)中增殖。三-谱系的ADSC克隆在OM，AM和CM中分化且使用下列组织学和IH试验通过IH鉴定多谱系能力：碱性磷酸酶(骨生成)，油红O(脂肪形成)和阿尔新蓝(软骨形成)。
图36.从PLA群体分离多谱系克隆不改变CD标记的表达谱。从单个PLA细胞分离并增殖双谱系和三谱系克隆。处理该克隆群体，以便用IF测定所示CD标记的表达。用DAPI共染ADSCs以观察核(蓝色)并结合荧光图像。
图37.ADSCs表达与多谱系能力一致的多种基因。三谱系ADSC克隆在OM/VD(ADSC-骨骼)，AM(ADSC-脂肪)和CM(ADSC-软骨)，以及对照培养基(ADSC-对照)中培养，接着通过RT-PCR分析所示谱系特异性基因。分析β-肌动蛋白水平作为内部对照。
图38.PLA细胞在体外倾向于表现出神经形成能力。 A组：未诱导的PLA细胞(PLA-0小时)和用NM诱导2和8小时的PLA细胞(分别为PLA-2小时，PLA-8小时)的光学显微照片。 B组：PLA细胞在NM或对照培养基中维持5小时(分别为PLA-NM，PLA-对照)并通过IH分析下列谱系特异性标记的表达：NSE，trk-A，NeuN和MAP-2(神经细胞)，GFAP(星形胶质细胞)。还评定了用NGF处理的PC 12细胞作为阳性对照。 C组：PLA细胞在NM中诱导4.5和9小时并通过RT-PCR分析所示基因。另外，PLA细胞在NM中诱导9小时并在NPMM中维持1周(NPMM)。分析未诱导的PLA细胞(对照)作为阴性对照。检查PC12细胞与从人脑制备的总RNA(脑)一起作为阳性对照。
图39.从脂肪衍生的干细胞组分分离的克隆表现出神经形成潜力。使用免疫组织化学检查克隆的脂肪形成(油红O染色)，骨生成(碱性磷酸酶)，软骨形成(阿尔新蓝染色)，和神经形成(抗-trka表达)分化。
图40.脂肪衍生的干细胞(PLA)的成骨分化不明显改变CD标记的表达。PLA细胞( A组)和MSCs( B组)在OM中诱导3周(分别为PLA-骨骼，MSC-骨骼)，或者在非诱导型对照培养基中维持(PLA-对照，MSC-对照)。处理细胞以便用IF测定CD34，CD44，CD45和CD90的表达，用DAPI共染以观察核(蓝色)并结合荧光图像。
图41.生脂分化导致脂肪衍生的干细胞(PLA)CD标记谱的微妙变化。PLA细胞( A组)和MSCs( B组)在AM中诱导2周(分别为PLA-脂肪，MSC-脂肪)或者在非诱导型对照培养基中维持(PLA-对照，MSC-对照)。处理细胞以便用IF测定CD34，CD44，CD45和CD90的表达，用DAPI共染以观察核(蓝色)并结合荧光图像。为了观察脂肪细胞及其染色模式，将荧光图像与光学显微照片(插图)结合。表示了充满脂类的细胞(白色箭头-荧光图像；黑色箭头-插图)和成纤维细胞(实心)白色箭头-荧光图像；实心黑色箭头-插图)。
图42.分化改变了脂肪衍生的干细胞(PLA)上特异性CD标记的表达：流式细胞术。 A组：PLA细胞在对照培养基(对照)，或者在OM(成骨培养基)或AM(生脂培养基)中维持2周。使用前向和侧向散射通过FC分析细胞以评估细胞大小和颗粒性(分别为FSC-H和SSC-H)。 B和C组：PLA细胞在对照培养基(PLA-CM)，或者在OM(PLA-OM)或AM(PLA-AM)中维持2周。使用荧光染料偶联的第一抗体直接染色细胞的所示CD标记并通过FC分析。检查用荧光染料偶联的非特异性IgG染色的脂肪衍生的干细胞作为阴性对照。所有结果校正衰老且代表总共105次事件。
图43.脂肪衍生的干细胞(PLA)的分化导致ECM组成改变。PLA细胞在OM中诱导3周(PLA-骨骼)，在AM中诱导2周(PLA-脂肪)或者在对照培养基(PLA-对照)中维持。使用抗1型(CNI)，4型(CNIV)和5型(CNV)胶原蛋白的抗体处理细胞用于IF。用DAPI共染细胞以观察核(蓝色)并结合荧光图像。将荧光图像与光学显微照片(插图)结合。表示了充满脂类的PLA细胞(白色箭头-荧光图像；黑色箭头-插图)。也分析了成骨诱导的MSCs(MSC-骨骼)，脂肪诱导的MSCs(MSC-脂肪)和未诱导的MSCs(MSC-对照)。
发明详述
定义
本文使用的“干细胞”定义为可产生其本身和进一步分化的后代细胞的成年未分化细胞。
本文使用的细胞的“谱系(lineage)”定义为细胞的遗传性，即：它来源于何种细胞及它可产生何种细胞。细胞的谱系将细胞放在发育和分化的遗传模式中。
本文使用的术语“分化或分化的”定义为在细胞谱系内具有更定向(committed)(“已分化”)位置的细胞。“去分化的”定义为回复到细胞谱系内较不定向的位置的细胞。
本文使用的“分化成中胚层(或外胚层或内胚层)谱系的细胞”分别定义为变成定向到特定的中胚层，外胚层或内胚层谱系的细胞。分化成中胚层谱系或者产生特定的中胚层细胞的细胞例子包括，但不限于脂肪形成，软骨形成，心原性，皮原性(dermatogenic)，造血，血管原性，肌原性，肾原性，泌尿生殖原性，骨生成，心包原性，或者基质的细胞。
分化成外胚层谱系的细胞例子包括，但不限于表皮细胞，神经原性细胞，和神经胶质原性细胞。
分化成内胚层谱系的细胞例子包括，但不限于胸膜原性(pleurigenic)细胞，和肝原性细胞，产生肠内层的细胞，和产生胰原性(pancreogenic)和内脏原性(splanchogenic)细胞的细胞。
本文使用的“多能细胞”定义为可产生至少两种不同(基因型和/或表型)的进一步分化的后代细胞的较少分化的细胞。
“多谱系干细胞”或“多能干细胞”是指能繁殖其本身和来自不同发育谱系的至少两种进一步分化的后代细胞的干细胞。该谱系可来自相同胚层(即，中胚层，外胚层或内胚层)，或者来自不同胚层。从多谱系干细胞分化的具有不同发育谱系的两种后代细胞的例子是肌源细胞和脂肪形成细胞(两者都是中胚层起源，然而它们产生不同的组织)。另一例子是神经原性细胞(外胚层起源)和脂肪形成细胞(中胚层起源)。
本文使用的“脂肪组织”定义为由白色脂肪，黄色脂肪或褐色脂肪组成的具有初级代谢重要性的弥散型器官。脂肪组织具有脂肪细胞和基质。脂肪组织在动物的整个身体中均有发现。例如，在哺乳动物中，脂肪组织存在于网膜，骨髓，皮下间隙和大多数器官周围。
本文使用的“经适应的培养基”定义为特定细胞或细胞群体在其中培养，然后被取出的培养基。该细胞在所述培养基中培养时，它们分泌细胞成份，包括，但不限于激素，细胞因子，细胞外基质(ECM)，蛋白质，囊泡，抗体，和颗粒。该培养基加上该细胞成份即是经适应的培养基。
本文使用的“分离的”限定一种物质，例如从污染物(即不同于干细胞的物质)分离的脂肪衍生的干细胞。
本发明提供了脂肪衍生的干细胞(ADSCs)和从中胚层来源(例如，脂肪组织)获得它们和使用它们的方法。令人惊奇的是，本发明的ADSCs可分化成产生一种以上胚层类型的细胞，例如，中胚层，内胚层或外胚层，及其组合，且因此是“多谱系”或“多能”细胞。
在另一实施方案中，ADSCs可分化成来自不同胚层(例如内胚层和中胚层)的两种或多种不同谱系，例如肝细胞和脂肪细胞。
本发明的ADSCs可分化成两种或多种谱系的细胞，例如，脂肪形成，软骨形成，心原性，皮原性，造血，血管形成，肌源性，肾原性，神经原性，神经胶质原性，尿生殖原性，骨生成，心包原性，腹膜原性，胸膜原性，内脏原性，和基质发育表型。尽管该细胞可保留两种或多种这些不同的谱系(或发育表型)，但是优选的是，该ADSCs可分化成3种或更多种谱系。最优选的ADSCs可分化成4种或更多种谱系。
本发明的ADSCs具有分化成中胚层组织的能力，例如成熟脂肪组织，骨骼，心脏的各种组织(例如，心包，心外膜，心肌外膜，心肌，心包，瓣膜组织，等)，真皮结缔组织，血管组织(例如，血球，心内膜，血管上皮，等)，造血组织，肌肉组织(包括骨骼肌，心肌，平滑肌，等)，泌尿生殖组织(例如，肾，前肾，后肾和中肾管，后肾盲囊，输尿管，肾盂，集合小管，雌性生殖结构上皮(特别是输卵管，子宫，和阴道)，中胚层腺体组织(例如，肾上腺皮质组织)，和基质组织(例如，骨髓)。当然，由于ADSC可保留发育成成熟细胞的潜力，因此它也可通过分化成合适的前体细胞(例如，成脂肪细胞，成肌细胞，成骨细胞，等)实现其发育表型潜能。
在另一实施方案中，ADSCs具有分化成外胚层组织的能力，例如，神经原性组织，和神经胶质原性组织。
在另一实施方案中，ADSCs具有分化成内胚层组织的能力，例如胸膜原性组织，内脏原性组织，和肝原性组织，和胰原性组织。
在另一实施方案中，ADSCs具有脱分化成发育上未成熟的细胞类型的能力。脱分化成未成熟的细胞类型的ADSCs的例子包括胚胎细胞和胎儿细胞。
在另一实施方案中，本发明的ADSCs可产生来自一种或多种胚层的一种或多种细胞谱系，例如神经原性细胞(属于外胚层起源)和肌原性细胞(属于中胚层起源)。
本发明的ADSCs用于组织工程，伤口修复，体内和离体组织再生，组织移植，和需要可分化成各种表型和基因型，或者可支持体内或体外的其它细胞类型的细胞的其它方法。
本发明的一个方面涉及含有本发明的脂肪衍生的干细胞(ADSCs)的富含脂肪衍生的干细胞的组分(ADSC-EF)。优选的是，ADSC-EF基本上不含其它细胞类型(例如，脂肪细胞，红细胞，和其它基质细胞，等)和细胞外基质材料。更优选的是，ADSC-EF完全不含这些其它细胞类型和基质材料。ADSC-EF从哺乳动物脂肪组织获得。优选的实施方案包括从高等灵长类(例如，狒狒或猿)的脂肪组织获得的ADSC-EF。最优选的富含ADSC的组分使用本文所述的方法从人脂肪组织获得。
获得本发明的ADSC-EF和ADSCs的方法
本发明的ADSCs从脂肪组织分离。脂肪组织可通过任何合适的方法从动物获得。在任何该方法中第一步需要从来源动物分离脂肪组织。该动物可以是活的或者死亡的，前提是该动物内的脂肪基质细胞是活的。一般来说，人脂肪组织从活的供体使用诸如手术或抽吸脂肪切除术的熟知方法获得。获得人脂肪组织的优选方法是通过本领域熟知的切除术或吸脂方法。优选的是，本发明的ADSCs从吸脂吸出物获得。本发明的ADSCs存在于最初切除或者抽取的脂肪组织中，而不管获得该脂肪组织的方法。
标记为1′，2′，3′的分别来自不同患者的3份脂肪吸出物的保藏物按布达佩斯条约的规定于2001年9月7日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA20110-2209保藏，并给予ATCC保藏号＿，＿和＿。
无论如何获得，可处理脂肪组织从脂肪组织残留物中分离本发明的ADSCs。通过用诸如磷酸盐缓冲液(PBS)等生理学相容性溶液洗涤所得的脂肪组织，可获得含有ADSCs的ADSC-EF。洗涤步骤由用PBS漂洗脂肪组织，搅拌该组织，并使得该组织沉降组成。除了洗涤外，解离该脂肪组织。解离可通过酶降解和中和进行。作为选择，或者与该酶处理结合，可使用其它的解离方法，例如机械搅拌，超声波能，或者热能。在洗涤，解离，和沉降步骤后形成三层结构。顶层为游离脂肪层。中层包括网格体和脂肪细胞聚集体。该中层称为“脂肪衍生的网格体富集组分”。过滤该中层或者网格体富集组分以浓缩本发明的网格体。过滤方法包含将该中层流过大孔滤器。不能通过该滤器的物质包括本发明的网格体和脂肪细胞聚集体。脂肪衍生的网格体可通过手工与没有通过滤器的其它细胞分离。
底层含有ADSC-EF和本发明的ADSCs。进一步处理该底层以分离本发明的ADSCs。将底层的细胞组分浓缩成粒状沉淀。浓缩细胞的一种方法包括离心。
离心底层并保留沉淀。将沉淀命名为富含脂肪衍生的干细胞的组分(ADSC-EF)，它包含富含脂肪衍生的干细胞的组分(ADSC-EF)。ADSC-EF可能含有红细胞(RBCs)。在优选的方法中，可裂解并去掉RBCs。裂解并去掉RBCs的方法是本领域熟知的(例如，在低渗培养基中培养)。如果去掉了RBCs，那么无RBC的组分含有ADSC-EF组分和ADSCs。但不需要从ADSC-EF中去除RBCs。
将沉淀重悬且可进行洗涤(在PBS中)，离心，并重悬一次或连续多次以获得更高纯度的ADSCs。本发明的ADSC-EF可以是细胞的异源性群体，包括本发明的ADSCs和脂肪细胞。洗涤并重悬的沉淀中的细胞用于涂板。
重悬沉淀中的ADSCs可通过包括，但不限于，细胞分选，大小分级分离，颗粒性，密度，分子，形态学，和免疫组织化学的方法与重悬沉淀中的其它细胞分离。
在一个实施方案中，ADSCs可根据细胞大小和颗粒性与其它细胞分离，其中ADSCs小且无颗粒。作为选择，用于分离ADSCs与沉淀中的其它细胞的分子方法是通过测定端粒的长度。干细胞倾向于比分化细胞具有更长的端粒。
在另一实施方案中，用于分离ADSCs与沉淀中的其它细胞的生物化学方法是通过测定端粒酶活性。端粒酶活性可用作干细胞的特异性标记。
在另一实施方案中，ADSCs通过免疫组织化学与沉淀中的其它细胞分离，例如，通过淘选，使用磁珠，或者亲和色谱法。
另外，分离富含ADSC的组分与ADSCs的方法是使用合适的装置，其中的许多装置是本领域已知的(参见，例如，美国专利号5,786,207)。该装置可机械完成洗涤和解离步骤。
培养ADSCs
可培养ADSC-EF中的ADSCs，且如果需要，可测定其数目和活力，以估计产量。
在一个实施方案中，使用标准细胞培养基(例如，DMEM，一般添加5-15％(例如，10％)血清(例如，胎牛血清，马血清，等))培养该干细胞而不分化。优选的是，干细胞在该培养基中传代至少5次而不分化，同时仍然保留其发育表型，且更优选的是，该干细胞传代至少10次(例如，至少15次或甚至至少20次)，同时保留多能性。因此，无须特别筛选血清批次就可完成培养ADSCs，而不诱导分化。相反，间充质干细胞(例如，从骨髓衍生的)在上述相同培养条件下可分化。测量活力和产量的方法是本领域已知且可以采用的(例如，锥虫蓝排斥法)。
ADSCs可通过表型鉴定来分离，以此鉴定出具有两种或多种上述发育谱系的那些细胞。为了从表型上分离ADSCs与ADSC-EF，该细胞以所需密度平板接种，例如从约100个细胞/cm2到约100,000个细胞/cm2(例如，约500个细胞/cm2到约50,000个细胞/cm2，或者更具体地说，从约1,000个细胞/cm2到约20,000个细胞/cm2)。
在一个优选的实施方案中，ADSC-EF以较低密度(例如，约300个细胞/cm2)平板接种以利于ADSCs的克隆分离。例如，几天后，以该密度平板接种的ADSCs增殖(扩增)成ADSCs的克隆群体。
该ADSCs可用于使用克隆细胞群体的合适方法将多能ADSC克隆和增殖成克隆群体。克隆和增殖方法包括细胞或细胞的小聚集体的培养，物理挑选并接种进分开的平板(例如多孔平板的孔)中。作为选择，该干细胞可按统计学比例亚克隆到多孔平板上以利于将单个细胞放入各孔中(例如，从约0.1到约1个细胞/孔或者甚至约0.25到约0.5个细胞/孔，例如0.5个细胞/孔)。ADSCs可通过以低密度平板接种(例如，在培养皿或其它合适的基底中)并使用诸如克隆环的装置将它们与其它细胞分离进行克隆。另外，如果可利用照射原，通过允许细胞生长至单层，然后屏蔽一个细胞并照射单层内的剩余细胞可获得克隆。然后存活的细胞生长成克隆群体。尽管克隆群体的产量可在任何合适的培养基中扩增，但是克隆干细胞(例如本发明的干细胞或其它干细胞)优选的培养条件是约2/3的F12培养基+20％血清(优选胎牛血清)和用基质细胞(例如，来自吸脂吸出物的基质血管组分的细胞)条件培养的约1/3标准培养基，相对比例按容量测定。
无论如何，不论克隆与否，分离的ADSCs可在特定诱导培养基中培养以诱导ADSC分化并表达其多能性。ADSCs产生中胚层，外胚层和内胚层谱系，及其组合的细胞。因此，可处理多能ADSC衍生的一种或多种ADSCs以分化成各种细胞类型。
在另一实施方案中，ADSCs在确定成份培养基中培养以诱导生脂分化。诱导本发明的ADSCs呈现脂肪形成表型的具体培养基的例子包括，但不限于含有糖皮质激素(例如，地塞米松，氢化可的松，可的松，等)，胰岛素，提高细胞内的cAMP水平的化合物(例如，二丁酰-cAMP，8-CPI-cAMP(8-(4)氯苯硫)-腺苷3′，5′环单磷酸；8-溴-cAMP；二辛酰cAMP，毛喉素等)，和/或抑制cAMP降解的化合物(例如，磷酸二酯酶抑制剂，例如异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)，甲基异丁基黄嘌呤，茶碱，咖啡碱，吲哚美辛(indomethacin)，等)，和血清的培养基。因此，ADSCs与约1μM-约10μM胰岛素以及约10-9M-约10-6M(例如，约1μM)地塞米松接触可诱导生脂分化。该培养基也可包括其它试剂，例如吲哚美辛(例如，约100μM至约200μM)，如果需要，优选该培养基无血清。
在另一实施方案中，在DMEM，10％FBS，luM地塞米松，10uM胰岛素，200uM吲哚美辛，1％抗生素/抗真菌剂(ABAM)，0.5mM IBMX中培养的ADSCs呈现脂肪形成表型。
可诱导ADSCs成骨分化的培养基包含，但不限于约10-7M-约10-9M地塞米松(例如，约1μM)以及约10μM-约50μM抗坏血酸-2-磷酸和约10nM-约50nMβ-磷酸甘油。该培养基也可包含血清(例如，牛血清，马血清，等)。
在另一实施方案中，在DMEM，10％FBS，5％马血清，50μM氢化可的松，10-7M地塞米松，50uM抗坏血酸-2-磷酸，1％ABAM中培养的ADSCs呈现成骨表型。
可诱导本发明的ADSCs的生肌分化的培养基包括，但不限于，将细胞暴露于优选存在于富含血清的培养基(例如，含有约10％至约20％血清(牛，马血清，或其混合物))中的约10μM至约100μM氢化可的松中。可使用的其它糖皮质激素包括，但不限于，地塞米松。另外，可使用5′-氮胞苷代替糖皮质激素。
在另一实施方案中，在DMEM，10％FBS，10-7M地塞米松，50uM抗坏血酸-2-磷酸，10mMβ-磷酸甘油，1％ABAM中培养的ADSCs呈现生肌表型。
可诱导本发明的ADSCs的软骨形成分化的培养基包括，但不限于，将细胞暴露于约1μM到约10μM胰岛素和约1μM到约10μM运铁蛋白，约lng/ml到10ng/ml转化生长因子(TGF)β1，和约10nM到约50nM抗坏血酸-2-磷酸(50nM)中。对于软骨形成分化，优选以高密度(例如，以约几百万个细胞/ml或者使用微量培养技术)，并在低量血清(例如，从约1％到约5％)存在下培养该细胞。
在另一实施方案中，在DMEM，50uM抗坏血酸-2-磷酸，6.25ug/ml运铁蛋白，100ng/ml胰岛素生长因子(IGF-1)，5ng/ml TGF-β-1，5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；仅使用1周)中培养的ADSCs呈现软骨形成表型。
在另一实施方案中，ADSCs在诸如DMEM，无血清，和5-10mMβ-巯基乙醇的神经形成培养基中培养并呈现外胚层谱系。
ADSCs也可诱导脱分化成发育上更不成熟的表型(例如，胎儿或胚胎表型)。在将ADSC暴露于模拟胎儿和胚胎内条件的条件下时实现该诱导。例如，本发明的ADSCs，或ADSCs群体可与从胎儿或胚胎分离的细胞共培养，或者在胎儿血清存在下培养。
通过将ADSCs与来自各自胚层的成熟细胞，或其前体共培养可诱导本发明的ADSCs分化成中胚层，外胚层，或内胚层谱系。
在一个实施方案中，通过与分化的成熟细胞共培养将ADSCs诱导成特定细胞类型包括，但不限于，通过将ADSCs与肌细胞或肌细胞前体共培养诱导的生肌分化。通过与神经元或神经元前体共培养将ADSCs诱导成神经谱系，且通过与成熟的或前体胰细胞或者成熟肝细胞或其各自的前体共培养可将ADSCs诱导成内胚层谱系。
另外，ADSCs在经适应的培养基中培养并诱导分化成特定表型。经适应的培养基是用成熟细胞培养的培养基，该成熟细胞向培养基中提供细胞成份，例如细胞因子，生长因子，激素和细胞外基质。例如，与成熟肌细胞接触的培养基用于培养并诱导ADSCs分化成肌原性谱系。诱导特异性分化的经适应的培养基的其它例子包括，但不限于，在通过与心脏瓣膜细胞接触条件培养的培养基中培养以诱导分化成心脏瓣膜组织。另外，ADSCs在通过神经元条件培养的培养基中培养以诱导神经元谱系，或者通过肝细胞的条件培养以诱导内胚层谱系。
对于共同培养，需要将ADSCs和将要共培养的所需其它细胞处于两种细胞类型相接触的条件下。例如，通过将该细胞作为细胞的异源性群体接种到合适的培养基质上可实现这点。另外，可将ADSCs首先生长至汇合，将它作为在经适应的培养基内培养第二种所需细胞的基质。
诱导分化的其它方法是本领域已知的且可用于诱导ADSCs产生具有中胚层，外胚层或内胚层谱系的细胞。
在诱导分化的培养基中培养干细胞合适的时间(例如，几天至一周或更长时间)后，可试验ADSCs以确定事实上它们是否获得了所需谱系。
鉴定从本发明的ADSCs发育的分化细胞的方法包括，但不限于，组织学，形态学，生物化学和免疫组织化学方法，或者使用细胞表面标记，或者通过遗传学或分子方法，或者通过鉴定由分化细胞和由分化的ADSCs的诱导特性分泌的因子。
鉴定从本发明的ADSCs分化的中胚层细胞的分子标记包括，但不限于，MyoD，肌球蛋白，α-肌动蛋白，brachyury，xFOG，Xtbx5，FoxF1，XNkx-2.5。优选上述标记的哺乳动物同系物。
鉴定从本发明的ADSCs分化的外胚层细胞的分子标记包括，但不限于N-CAM，GABA和表皮特异性角蛋白。优选上述标记的哺乳动物同系物。
鉴定从ADSCs分化的内胚层细胞的分子标记包括，但不限于，Xhbox8，Endo1，Xhex，Xcad2，Edd，EF1-α，HNF3-β，LFABP，白蛋白，胰岛素。优选上述标记的哺乳动物同系物。
在一个实施方案中，分化的ADSCs的分子鉴定是通过测量端粒长度。未分化的干细胞比分化细胞具有更长的端粒；因此，可测定细胞的端粒酶活性水平。另外，可从ADSCs提取RNA或蛋白质并测定特异性表型标记指标的存在(通过Northern杂交，RT-PCR，Western印迹分析，等)。
在另一实施方案中，分别使用组织特异性抗体或染料通过免疫组织化学或组织学试验细胞可评估分化。例如，为了评估生脂分化，该分化的ADSCs用脂肪特异性染料(例如，油红O，safarin red，苏丹黑，等)或者用鉴定脂肪相关因子(例如，PPAR-γ，肥胖菌素，脂蛋白脂肪酶，等)的标记抗体或分子标记染色。
在另一实施方案中，通过用骨特异性染料(例如，碱性磷酸酶，von Kossa，等)或者用鉴定骨特异性标记(例如，骨钙蛋白，骨粘连蛋白，骨桥蛋白，I型胶原蛋白，骨形态发生蛋白，cbfa，等)的标记抗体或分子标记染色分化的ADSCs可评估骨发生。
通过鉴定传统形态学改变(例如，多核细胞，合胞体形成，等)，或者生化评定肌肉特异性因子(例如，myo D，肌球蛋白重链，等)的存在可评估肌发生。
软骨形成可以用软骨特异性染料(例如，阿尔新蓝)染色细胞来测定，或者用鉴定培养基中软骨特异性分子(例如，硫酸糖胺聚糖和蛋白聚糖，角蛋白，软骨素，II型胶原蛋白，等)的标记抗体或分子标记来测定。
可供选择的实施方案是采用本领域已知的评估发育表型的方法。例如，该细胞可通过大小和颗粒性进行分选。可使用该细胞作为免疫原产生单克隆抗体(Kohler和Milstein)，然后可使用该抗体结合给定的细胞类型。抗原性的关联可证实ADSC沿给定发育途径分化。
尽管可分离ADSC，但是优选它处在细胞群体中。本发明提供了确定的ADSCs群体。在一个实施方案中，该群体是异型的。在另一实施方案中，该群体是同型的。
在另一实施方案中，ADSCs的群体可支持细胞用于培养其它细胞。例如，可由ADSC群体支持的细胞包括其它类型的干细胞，例如神经干细胞(NSC)，造血干细胞(HPC，特别是CD34+干细胞)，胚胎干细胞(ESC)及其混合体。在另一实施方案中，该群体基本上是同型的，即基本上由本发明的脂肪衍生的干细胞组成。
ADSC-EF，ADSCs的用途和本发明的方法
ADSC-EF可用作本发明的ADSCs的来源。可将ADSC-EF导入受试者中用于组织再生，伤口修复或需要干细胞来源的其它应用。另外，可处理ADSC-EF以引起其中的ADSCs分化成所需细胞类型用于导入受试者。也可体外培养ADSC-EF以维持ADSCs来源，或者可诱导产生能发育成所需组织的其它分化的ADSCs。
ADSCs(和ADSCs的群体)可用于各种目的。ADSCs可支持其它细胞类型的生长和增殖。本发明包括在合适的培养基中使用ADSCs条件培养培养基的方法和以该方法产生的ADSC-经适应的培养基。一般来说，该培养基用于支持ADSCs的体外生长，它向培养基中分泌激素，细胞基质物质，和其它因子。在合适的期间(例如，一天或几天)后，将含有分泌因子的培养基与细胞分离并贮存备用。如果需要，ADSCs可连续再用于产生经适应的培养基。在其它应用中(例如，用于共培养ADSCs与其它细胞类型)，细胞可保留在经适应的培养基中。因此，本发明提供了使用该方法获得的ADSC-经适应的培养基，它可含有ADSCs，或者根据需要基本上不含ADSCs。
ADSC-经适应的培养基可用于支持所需细胞类型的生长和增殖，本发明提供了使用经适应的培养基培养细胞(特别是干细胞)的方法。该方法包括在该细胞保持活力的条件下在经适应的培养基中维持所需细胞。该细胞可在诸如本领域已知的任何合适的培养它们的条件下维持。期望的是，该方法允许细胞进行连续多个循环的有丝分裂以形成增殖的群体。确切的条件(例如，温度，CO2水平，搅拌，抗生素的存在，等)取决于培养基的其它组分和该细胞的类型。然而，优化这些参数在本领域的普通技术人员的能力范围内。
在另一实施方案中，ADSCs可被遗传修饰，例如，以便表达外源性基因(“转基因”)或者抑制内源性基因的表达，且本发明提供了遗传修饰该细胞和群体的方法。根据该方法，ADSC与含有包括转基因的核酸的基因转移载体接触，使得该核酸在适合于该转基因在细胞内表达的条件下导入细胞中。该转基因一般是一种表达盒，包含与合适的启动子可操作地相连的多核苷酸。该多核苷酸可编码蛋白，或者可编码生物学上有活性的RNA(例如，反义RNA或核酶)。因此，例如，该多核苷酸可编码提供毒素抗性，激素(例如肽类生长激素，激素释放因子，性激素，促肾上腺皮质激素，细胞因子(例如，干扰素，白细胞介素，淋巴因子)，等)，细胞表面结合的细胞内信号半分子(例如，细胞粘着分子，激素受体，等)，促进给定谱系分化的因子(例如，骨形态发生蛋白(BMP))等的基因。当然，如果需要采用基因转移技术传递给定转基因，其序列应是已知的。
在表达盒中，编码的多核苷酸与合适的启动子可操作地连接。合适的启动子的例子包括原核启动子和病毒启动子(例如，逆转录病毒ITRs，LTRs，立即早期病毒启动子(IEp)，例如疱疹病毒IEp(例如，ICP4-IEp和ICP0-IEp)，巨细胞病毒(CMV)IEp，和其它病毒启动子，例如劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子，和鼠白血病病毒(MLV)启动子)。其它合适的启动子是真核启动子，例如增强子(例如，兔β-珠蛋白调控元件)，组成型活性启动子(例如，β-肌动蛋白启动子，等)，信号特异性启动子(例如，诱导型启动子，例如应答RU486的启动子，等)，和组织特异性启动子。在预先确定的细胞环境中选择适合于启动基因表达的启动子是本领域的技术人员所熟知的。如果需要，表达盒可包含一个以上的编码核苷酸，且可包含其它元件(例如，多聚腺苷化序列，编码膜插入信号或分泌前导的序列，核糖体进入序列，转录调控元件(例如，增强子，沉默子，等)，等)。
含有转基因的表达盒应插入适合于将该转基因传递给细胞的遗传载体中。依赖于所需最终应用，可采用任何这种载体遗传修饰该细胞(例如，质粒，裸露DNA，诸如腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒，慢病毒，乳头瘤病毒，逆转录病毒等病毒，等)。可采用构建该载体内的所需表达盒的任何方法，其中许多方法是本领域熟知的(例如，直接克隆，同源重组，等)。当然，载体的选择很大程度上决定了用于将该载体导入细胞的方法(例如，通过原生质体融合，磷酸钙沉淀，基因枪，电穿孔，病毒载体感染，等)，该方法是本领域公知的。
可采用遗传改变的ADSCs作为生物反应器用于产生转基因产物。在其它实施方案中，采用遗传修饰的ADSCs将该转基因及其产物传递给动物。例如，一旦经过遗传修饰，可将ADSCs在足以使得转基因进行体内表达的条件下导入动物中。
除了用作遗传修饰的有用靶外，许多ADSCs和ADSCs的群体分泌激素(例如，细胞因子，肽或其它(例如，甘油一丁酸酯)生长因子，等)。一些细胞在开始分离时天然分泌该激素，且其它细胞可按本文所述遗传修饰成分泌激素。分泌激素的ADSCs可用于体内和体外的各种环境。例如，该细胞可用作生物反应器以提供给定激素的可用来源，且本发明涉及从该细胞获得激素的方法。根据该方法，可在适合于它们向培养基中分泌激素的合适条件下培养ADSCs。在合适的时间期间后，优选定期收获并处理培养基以便从培养基分离该激素。可使用任何标准方法(例如，凝胶或亲和色谱法，透析，冻干，等)从培养基纯化该激素，其中许多方法是本领域已知的。
在其它实施方案中，分泌激素的ADSCs(和群体)可用作治疗剂。一般来说，该方法包含将细胞体外转移到所需组织(例如，作为移植或植入前的移植物)或直接体内转移到动物组织。该细胞可通过任何合适的方法转移到所需组织，该方法一般根据组织类型而变化。例如，通过用含有该细胞的培养基漂洗移植物(或灌注它)可将ADSCs转移进移植物中。另外，可将ADSCs接种到组织内的所需位点以建立群体。使用诸如导管，套针，插管，移植片固定模(可与细胞一起植入)，等的装置可将细胞转移进体内位点。对于这些应用，优选该ADSC分泌细胞因子或生长激素，例如人生长因子，成纤维细胞生长因子，神经生长因子，胰岛素样生长因子，造血干细胞生长因子，成纤维细胞生长因子家族的成员，血小板衍生的生长因子家族的成员，血管和内皮细胞生长因子，TGFb家族的成员(包括骨形态发生因子)，或先天性疾病(例如，营养不良)特异性的酶。
在一个应用中，本发明提供了使用ADSCs促进患者伤口闭合的方法。根据该方法，可将分泌激素的ADSCs在该细胞足以产生激素的条件下转移到伤口附近。在伤口附近存在激素可促进伤口的闭合。该方法可同时促进外部(例如，表面)和内部伤口的愈合。可用本发明的方法促进其闭合的伤口包括，但不限于擦伤，撕脱，开放性气胸，烧伤，挫伤，枪弹伤，刀伤，开放性创伤，贯通伤口，穿破创伤，刺伤，串线创伤，戳伤，手术创伤，皮下创伤，或切线创伤。该方法不需达到伤口的完全愈合或闭合；只要该方法可促进任何程度的伤口闭合就已足够。在该方面，可单独或者作为其它方法的辅助采用该方法用于愈合创伤组织。
如果ADSCs分泌血管生成激素(例如，血管生长因子，血管和内皮细胞生长因子，等)，则它们(以及含有它们的群体)可用于诱导组织内的血管生成。因此，本发明提供了使用该ADSCs促进或抑制组织内新血管形成的方法。该组织内存在该激素可促进或抑制新血管形成。根据该方法，可将ADSC在该细胞足以产生血管生成激素的条件下导入需要的组织。该组织内存在该激素可促进组织内的新血管形成。
由于ADSCs具有发育表型，可将它们用于组织工程。在该方面，本发明提供了产生动物实体的方法，包括在ADSCs足以增殖并分化形成所需实体的条件下维持ADSCs。该实体可包括成熟组织，或者甚至完整器官，它包含本发明的细胞可分化的组织类型(如本文所述)。一般来说，该实体包括脂肪，软骨，心脏，真皮结缔组织，血液组织，肌肉，肾，骨骼，胸膜，内脏组织，血管组织，等。更典型的是，该实体包含这些组织类型的组合(即，一种以上的组织类型)。例如，该实体可包括所有动物器官(例如，心脏，肾)或肢体(例如，腿，翅膀，臂，手，足，等)或其部分。当然，在该细胞可分裂并分化产生该结构的几乎所有情况下，它们也可形成该结构的原基(anlagen)。在早期阶段，该原基可冷冻保藏用于将来产生所需成熟结构或器官。
为了产生该结构，ADSCs和群体可在适合于它们增殖并分裂形成所需结构的条件下维持。在一些应用中，一般在需要该新实体的位置通过将它们转移进动物(即，体内)可实现这点。因此，例如，本发明可帮助动物体内组织(例如，骨骼，肌肉，软骨，腱，脂肪，等)的再生，其中将ADSCs移植进该组织。在其它实施方案中，具体地说为了产生原基，可体外诱导ADSCs分化并增殖成组织。在该应用中，可在帮助形成有利于组织发育的三维结构的基质上培养ADSCs。因此，例如，可在生物相容性网格体上培养或接种ADSCs，例如，包含细胞外基质物质，合成多聚体，细胞因子，生长因子，等的网格体。该网格体可塑造成所需形状用于帮助组织类型的发育。另外，至少在该培养的早期，在该培养基和/或基质中添加促进合适的组织类型和结构发育的因子(例如，生长因子，细胞因子，细胞外基质物质，等)。事实上，在一些实施方案中，需要共培养ADSCs与各自组织类型的成熟细胞，或其前体，或者将该细胞与各自的经适应的培养基接触，如本文所述。
为了帮助将ADSCs和群体用于产生该动物实体和组织，本发明提供了包含ADSCs(和群体)和生物相容性网格体的组合物。一般来说，该网格体从多聚体材料形成，具有作为网格体或海绵体的纤维，一般具有约100μm到约300μm之间的目间隙。该结构提供了细胞可在其上生长和增殖的足够区域。期望的是，该网格体是在一段时间内可生物降解的，以便随着其发育可被动物体吸收。因此，合适的多聚体网格体可从诸如乙醇酸，乳酸，丙基延胡索酸，己内酯(caprolactone)，hyaluronan，透明质酸，等的单体形成。其它网格体可包括蛋白质，多糖，多羟基酸，聚原酸酯(polyorthoesters)，聚酐类，含磷氮链聚合物，或合成多聚体(特别是可生物降解的多聚体)。当然，形成该网格体的合适多聚体可包括一种以上的单体(例如，所示单体的组合)。另外，该网格体也可根据需要包含激素，例如生长因子，细胞因子，和形态发生素(例如，视黄酸，aracadonic acid，等)，所需细胞外基质分子(例如，纤连蛋白，层粘连蛋白，胶原蛋白，等)，或其它物质(例如，DNA，病毒，其它细胞类型，等)。
为了形成该组合物，可将ADSCs导入网格体中，使得它们可渗透进其中的间隙空间。例如，可将该基质浸泡在含有该细胞的溶液或悬液中，或者可将它们灌注或注射进该基质中。一个特别优选的组合物是由包含多聚体的悬液且还具有分散于其中的本发明的细胞通过交联形成的水凝胶。该形成方法允许细胞分散于整个网格体中，有利于细胞更均匀地在网格体中渗透。当然，该组合物也可包含所需表型的成熟细胞或其前体，特别是控制ADSCs的诱导使得在网格体内适当地分化(例如，作为在网格体内共培养该细胞的效果)。
该组合物可按任何合适的方式用于促进所需组织类型，结构，或原基的生长和产生。例如，该组合物可使用三维或定向(sterotactic)模型化技术构建。因此，例如，该组合物内的一层或一个区域可聚集定向用于成骨分化的细胞，且该组合物内的另一层或区域可聚集定向用于肌形成和/或软骨形成发育的细胞。将该区域互相之间并排起来有助于包含多种组织类型的复杂结构(例如，由肌肉包围的骨骼，例如在肢体中所发现的)的模拟和分化。为了指导所需结构的生长和分化，该组合物可按需要在生物反应器或培养箱中离体培养。在其它实施方案中，可在需要生长该组织或结构的位置将该结构直接植入宿主动物中。在还有另一实施方案中，可将该组合物植入宿主中(一般是动物，例如猪，狒狒，等)，其中它将生长并成熟直到可以使用。然后，从该宿主切除该成熟结构(或原基)并按需要植入宿主中。
适合于包含进该组合物中的网格体可来自任何合适的来源(例如，基质胶)，和存在合适网格体的一些商业来源(例如，合适的聚乙醇酸可从诸如Ethicon，N.J.的来源获得)。另一合适的网格体可来自于脂肪组织的无细胞部分-即，基本上不含细胞的脂肪组织细胞外基质物质，且本发明提供了该脂肪衍生的网格体。一般来说，该脂肪衍生的网格体包含诸如蛋白聚糖，糖蛋白，hyaluronins，纤连蛋白，胶原蛋白(I型，II型，III型，IV型，V型，VI型，等)等的蛋白质，它们用作细胞生长的优良底物。另外，该脂肪衍生的网格体可包含激素，优选细胞因子和生长因子，用于促进接种进基质的细胞的生长。
脂肪衍生的基质除了存在于无细胞部分中外，同样可按上文所述从脂肪组织分离。例如，可对脂肪组织或其衍生物(例如，上文所述方法的富含网格体的上清组分)进行超声波或热能和/或酶处理以回收该基质物质。另外，期望的是，该脂肪组织的细胞组分可通过例如，用脂肪酶，去污剂，蛋白酶处理，和/或通过机械或超声波破碎法(例如，使用匀浆器或超声波仪)破碎。尽管该分离的物质初步鉴定为粘性物质，但是根据所需的最终用途可随后按需要处理它。例如，可处理该粗制基质物质(例如，透析或者用蛋白酶或酸处理，等)以产生需要的网格物质。因此，该网格体可在水合形式中制备或者可干燥或冻干成基本上无水的形式或粉末。随后，该粉末可通过，例如，将其悬浮于合适的细胞培养基中再水化以用作细胞培养底物。在该方面，脂肪衍生的网格体可与诸如上文所述的其它合适的网格体物质混合。当然，本发明涉及包含脂肪衍生的网格体和诸如本发明的ADSCs以及其它细胞(特别是其它类型的干细胞)的细胞或细胞群体的组合物。
如上文所述，本发明的ADSCs，群体，网格体，和组合物可用于组织工程和再生。因此，本发明涉及具有任何本发明特征的一种可植入的结构(即，植入物)。该植入物的确切性质可根据其将要投入的用途而变化。该植入物可以是，或者包含所述的成熟组织，或者可包含未成熟的组织或网格体。因此，例如，一种类型的植入物可以是骨骼植入物，它包含进行(或定向于)骨生成分化的本发明细胞的群体，任选按上述接种在合适的大小和维数的网格体内。该植入物可注射或植入宿主内以支持患者内成熟骨骼组织的产生或再生。可使用相似的植入物支持患者内肌肉，脂肪，软骨，腱等的生长或再生。其它类型的植入物是原基(例如本文所述)，例如，肢芽，指芽，发育中的肾，等，它一旦植入患者中，将成熟成合适的结构。
脂肪衍生的网格体可方便地用作细胞培养试剂盒的组分。因此，本发明提供了包含本发明脂肪衍生的网格体和一种或多种其它成份的试剂盒，该成份例如水合剂(例如，水，生理学相容性盐水溶液，制备的细胞培养基，血清或其衍生物，等)，细胞培养基质(例如，培养皿，板，瓶，等)，细胞培养基(无论是液体或粉末的形式)，抗生素化合物，激素，等。尽管该试剂盒可包含任何该成份，但是优选包含在适当组合时支持所需细胞类型培养和生长所必需的所有成份。当然，如果需要，该试剂盒也可包含细胞(一般是冷冻的)，它可按本文所述接种进该网格体中。
尽管本发明的许多方面涉及组织生长和分化，本发明还有其它的应用。例如，脂肪衍生的网格体可用作实验试剂，例如在用于组织生长和分化的改进网格体和基底的开发中。该脂肪衍生的网格体在化妆上也可用于例如，隐藏皱纹，瘢痕，皮肤凹陷，等，或者用于组织增大。对于该应用，优选将网格体定型(stylized)并以单位剂量形式包装。如果需要，它可与载体(例如，诸如甘油或乙醇的溶剂)，香料，抗生素，着色剂，和化妆品通常采用的其它成份混合。该基底也可自体使用或者用作同种移植物，且它可用作软膏或者敷料，或者包含在其中用于促进伤口愈合。ADSCs也可用作实验试剂。例如，它们可用于帮助发现负责分化中早期事件的试剂。例如，可将本发明的细胞与培养基接触以诱导特定谱系的分化，然后测定基因的差异表达(例如，通过随机引物PCR或者电泳或蛋白质或RNA，等)。
作为分离本发明的ADSCs或脂肪衍生的网格体的任一步骤，本发明提供了用于从脂肪组织分离该试剂的试剂盒。该试剂盒可包含用于从患者分离脂肪组织的装置(例如，套管，针头，和抽吸器，等)，以及用于分离基质细胞(例如，通过本文所述的方法)的装置。例如，该试剂盒可用作ADSCs的直接来源，然后如果合适可从相同个体再导入ADSCs。因此，该试剂盒有助于分离脂肪衍生的干细胞用于甚至以相同的方法植入需要再生所需组织类型的患者中。在该方面，该试剂盒也可包含分化细胞的培养基，例如本文所述的那些培养基。如果合适，可将细胞与培养基接触以启动它们在患者体内按需要分化。另外，该试剂盒可用作ADSCs的方便来源用于体外操作(例如，按本文所述克隆或分化)。在另一实施方案中，该试剂盒可用于按本文所述分离脂肪衍生的网格体。
尽管在阅读上述详细描述后本领域的技术人员完全能够实施本发明，但是下面的实施例将帮助阐明一些其特征。具体地说，它们证实了基本上无成熟脂肪细胞的人脂肪衍生的干细胞的分离，该细胞的克隆群体的分离，该细胞体内和体外分化成具有中胚层表型，内胚层表型，和外胚层表型的所有细胞的能力，和该细胞支持其它类型的干细胞生长的能力。该实施例还证实了能够用作细胞培养的合适基底的基本上不含细胞的脂肪衍生的网格体的分离。当然，由于提供这些实施例纯粹用于说明目的，因此它们不应用于以限制性方式解释本发明的范围，而应作为一个整体理解为在本发明的上述描述基础上的扩展。
在这些实施例中使用的方法，例如手术，细胞培养，酶消化，组织学，和蛋白质和多核苷酸的分子分析，是本领域的普通技术人员所熟悉的。因此，为了简短，没有详细叙述该实验细节。
实施例1
本实施例证实了基本上无成熟脂肪细胞的人脂肪衍生的干细胞的分离。
从进行选择性手术的患者获得粗制的吸脂吸出物。在吸脂操作前，给患者施用肾上腺素以最小化吸出物被血液的污染。过滤该吸出物以分离相关脂肪组织块与相关液体废物。分离的组织用中性磷酸缓冲盐溶液彻底清洗，然后用0.075％w/v胶原酶在37℃间歇性搅拌的条件下酶促解离约20分钟。消化后，中和胶原酶，组织浆以约260g离心约10分钟，由此产生多层上清和细胞沉淀。取出上清并保存备用，将沉淀重悬于红细胞裂解溶液中并在约25℃下不搅拌温育约10分钟。温育后，中和培养基，细胞以约250g再次离心约10分钟。第二次离心后，悬浮细胞，并评估活力(使用锥虫蓝排斥法)和细胞数。然后，将它们以约1×106个细胞/100mm培养皿的密度进行平板接种。将它们在37℃下在DMEM+胎牛血清(约10％)中在约5％CO2的条件下培养。
大多数该细胞是贴壁的，小，单核，相对无粒的成纤维细胞样细胞，不含可见的脂滴且是CD34-阴性。大多数细胞用油红O和von Kossa染色为阴性。还测定了该细胞的端粒酶表达(使用商品TRAP测定试剂盒)，使用HeLa细胞和HN-12细胞作为阳性对照。使用人包皮成纤维细胞和HN-12加热的细胞提取物作为阴性对照。端粒产物在12.5％聚丙烯酰胺池中分离并通过磷光成像测定信号。在脂肪衍生的干细胞以及阳性对照中观察代表端粒酶活性的端粒梯度。在阴性对照中观察不到梯度。
因此，这些细胞不能鉴定为肌细胞，脂肪细胞，软骨细胞，骨细胞，或血细胞。这些结果证实了该脂肪衍生的细胞表达相似于以前对人干细胞报导的端粒酶活性。
然后将这些细胞的亚群体与下列培养基接触以评估其发育表型：
脂肪形成 骨生成 生肌 软骨形成
DMEM10％胎牛血清0.5mM异丁基甲基黄嘌呤1μM地塞米松10μM胰岛素200μM吲哚美辛1％ABAM DMEM10％胎牛血清5％马血清0.1μM地塞米松50μM抗坏血酸-2-磷酸10mMβ-磷酸甘油1％ABAM DMEM10％胎牛血清5％马血清50μM氢化可的松1％ABAM DMEM1％胎牛血清6.25μg/ml胰岛素6.25μg/ml运铁蛋白10ng/ml TGFβ150nM抗坏血酸-2-磷酸1％ABAM
将一个群体以高密度在软骨形成培养基中培养几周。用H&E，阿尔新蓝，甲苯蓝(toludene blue)，和Goldner′s三色染料染色2，7，和14天对组织培养物和石蜡切片进行组织学分析。使用抗软骨素-4-硫酸和硫酸角蛋白和II型胶原蛋白的抗体进行免疫组织化学。也对基质染色进行了定性评估。结果表明早在开始处理后48小时时形成具有软骨膜细胞的清楚边界的软骨球形结节。未处理的对照细胞没有表现出软骨形成分化的证据。这些结果证实了该干细胞具有软骨形成的发育表型。
培养一个群体直到接近汇合，然后与生脂培养基接触几周。在平板接种后的2和4周时通过油红O染色后比色测定相对混浊度来检查该群体。在2周时测定脂肪形成在进行且在4周时具有相当高水平(相对混浊度分别为1和5.3)。使用骨髓衍生的干细胞作为阳性对照，这些细胞表现出略微较小的脂肪形成潜力(相对密度分别为0.7和2.8)。
培养一个群体直到接近汇合，然后与成骨培养基接触几周。在平板接种后的2和4周时通过von Kossa染色后比色测定相对混浊度来检查该群体。在2周时测定骨生成在进行且在4周时具有相当高水平(相对混浊度分别为1.1和7.3)。使用骨髓衍生的干细胞作为阳性对照，这些细胞表现出略微较小的骨生成潜力(相对密度分别为0.2和6.6)。
培养一个群体直到接近汇合，然后与生肌培养基接触几周。在平板接种后的1，3，和6周时通过评估多核细胞和肌肉特异性蛋白(MyoD和肌球蛋白重链)的表达来检查该群体。人包皮成纤维细胞和骨骼成肌细胞用作对照。在与生肌培养基接触后在该干细胞群体中在所有时间点都发现表达MyoD和肌球蛋白的细胞，且该细胞的比例在3和6周时增加。在6周时观察到多核细胞。相反，成纤维细胞在任何时间点都没有表现出这些特性。
这些结果证实分离了基本上不含成熟脂肪细胞的人脂肪衍生的多能干细胞。
实施例2
本实施例证实了脂肪衍生的干细胞与5-氮胞苷反应不能分化。
在5-氮胞苷存在下培养按照实施例1获得的脂肪衍生的干细胞。与骨髓衍生的干细胞相比，与该试剂接触不能诱导生肌分化(参见Wakitani等，出处同上)。
实施例3
本实施例证实了从富含脂肪衍生的干细胞的组分产生人脂肪衍生的干细胞的克隆群体。
按照实施例1所述的方法分离的细胞以约5,000个细胞/100mm培养皿进行平板接种并按实施例1所述培养几天。在几个细胞分裂周期后，用克隆环挑出几个克隆并转移到48孔平板的孔中。培养这些细胞几周，每周更换两次培养基，直到它们为约80％至约90％汇合(在37℃下，约5％CO2中，在用实施例1中分离的细胞首先条件培养的2/3 F12培养基+20％胎牛血清和1/3标准培养基中，即“克隆培养基”)。随后，将各培养物转移到35mm培养皿上并生长，然后再转移到100mm培养皿中并生长至接近汇合。此后，冷冻一个细胞群体，并将剩下的群体以1000个细胞/孔平板接种到12孔平板上。
该细胞在克隆培养基中培养超过15代并按实施例1所述监测分化。在连续几轮培养后各克隆的未分化状态保持可靠。
然后建立该克隆的群体并按实施例1所述与脂肪形成，软骨形成，生肌，和骨生成培养基接触。观察到至少一个该克隆与各培养基接触时能够分化成骨骼，脂肪，软骨，和肌肉，且大多数克隆能够分化成至少三种类型的组织。该细胞发育成肌肉和软骨的能力进一步证实了这些脂肪衍生的干细胞的多能性。
这些结果证实了脂肪衍生的干细胞可维持未分化状态许多代而不需要特异性预筛的血清批次。该结果还证实了该细胞在这样广泛传代后保持多能性，证明该细胞确实是干细胞而不仅仅是定向的祖细胞。
实施例4
本实施例证实了来自富含脂肪衍生的干细胞的组分的脂肪衍生的干细胞可支持其它类型的干细胞的培养。
将人脂肪衍生的干细胞以约30,000/孔的密度传代到96孔平板上，培养一周，然后照射处理。然后将从脐带血分离的人CD34+造血干细胞接种进该孔中。共培养物在MyeloCult H5100培养基中维持，通过显微镜检主观监测细胞活力和增殖。共培养两周后，通过流式细胞术评估造血干细胞的CD34表达。
在与基质细胞共培养两周期间，造血干细胞形成大量圆细胞集落。流式细胞术分析揭示了62％的该细胞保持CD34+。根据显微镜观察，人脂肪衍生的基质细胞保持存活并支持脐带血衍生的人造血干细胞的生长。
这些结果证实了来自人皮下脂肪组织的基质细胞能够支持其它干细胞的离体维持，生长和分化。
实施例5
本实施例证实了来自富含脂肪衍生的干细胞的组分的脂肪衍生的干细胞可在体内分化。
将4组(A-D)各12只无胸腺小鼠分别皮下植入含有如下成份的羟基磷灰石/磷酸三钙立方块：A组含有按实施例1所述用成骨培养基预处理的脂肪衍生的干细胞。B组含有未处理的脂肪衍生的干细胞。C组含有成骨培养基但无细胞。D组含有非成骨培养基且无细胞。在每组中，在3周时处死6只小鼠，剩下的小鼠在植入后8周时处死。取出该立方块，固定，脱钙，并切片。各切片通过用苏木精和伊红(例如，H & E)，Mallory骨染料染色，和免疫染色骨钙蛋白进行分析。
在来自A组和B组的切片中观察到骨钙蛋白的骨样组织染色和Mallory骨染色的清楚区域。在A和B组中比在其它组中观察到显著更多的骨样组织(p＜0.05 ANOVA)，但在A和B组之间观察到骨生成无显著差异。另外，在3和8周之间在A和B组中注意到骨生长的定性增加。这些结果证实了脂肪衍生的干细胞可在体内分化。
实施例6
本实施例证实了基本上不含细胞的脂肪衍生的网格体的分离。
在一个方案中，在0.05％胰蛋白酶EDTA/100 U/ml脱氧核糖核酸酶中对实施例1的网格体富集组分进行酶消化3天以破坏细胞。每天在生理盐水中清洗残余物并加入新鲜酶。随后在生理盐水中清洗该物质并重悬于0.05％胶原酶和约0.1％脂肪酶中以部分消化存在的蛋白质和脂肪。温育持续2天。
在另一方案中，将实施例1保留的上清在EDTA中温育以除去任何上皮细胞。剩下的细胞使用含有1％NP40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，5mMEDTA，0.4M NaCl，50mM Tris-HCl(pH8)和蛋白酶抑制剂，和亮抑酶肽，胰凝乳蛋白酶抑制剂，抗蛋白酶，和胃蛋白酶抑制剂A各10μg/ml的缓冲液裂解。最后，将该组织在无二价阳离子的PBS中充分洗涤。
在两个制备方案中，均洗涤剩下的物质并鉴定为胶状物质。该物质的显微镜分析揭示它不含细胞，且由高含量的胶原蛋白(很可能是IV型)和广泛的各种生长因子组成。该物质的制品支持细胞生长，证实它是组织培养的优良底物。
实施例7
下面的描述提供了表现出中胚层多组织潜能的富含脂肪衍生的干细胞的组分，和分离所述干细胞的方法。
材料和方法
所有材料均从Sigma(St.Louis，MO)购买，除非另有说明。所有组织培养试剂均从Life Technologies(New York，NY)购买。胎牛血清(FBS)和马血清(HS)分别从Hyclone(Logan，UT)和Life Technologies购买。
细胞系：
正常人成骨细胞(NHOsts)，人骨骼肌(SkM)细胞和骨髓衍生的间充质干细胞(MSCs)群体从Clonetics(Walkersville，MD)购买。鼠3T3-L1脂肪细胞前体细胞系(Green H.，和Meuth，M.，1974，Cell3：127-133)从ATCC(RockVille，MD)获得。人包皮成纤维细胞(HFFs)从Cascade Biologics(Portland，OR)获得。
干细胞的分离和培养：
人脂肪组织可根据患者同意的方案，HSPC#98-08 011-02(加利福尼亚洲洛杉矶大学)在局部麻醉的情况下从选择性吸脂操作中获得。在该操作中，将中空的钝头套管通过小(～1cm)切口导入皮下空间。将套管挂接上温和的吸力并通过脂肪区移动，机械分裂脂肪组织。将生理盐水和血管收缩剂，肾上腺素的溶液注入脂肪区以最小化失血和外周血细胞对组织的污染。粗制的脂肪吸出物(约300cc)按照建立的方法处理以便获得基质血管组分(SVF)(Hauner H.，等，1987，J.Clin.Endocrinol.Metabol.64：832-835；Katz，A.J.，等，1999 Clin.Plast.Surg.26：587-603，viii)。为了分离SVF，将脂肪吸出物用等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤并用0.075％的胶原酶在37℃下消化细胞外基质(ECM)30分钟。用含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)中和酶活性并以1200xg离心10分钟获得高密度的SVF沉淀。将该沉淀重悬于160mM NH4Cl中并在室温下温育10分钟以裂解污染的红细胞。按上文的详细描述通过离心收集SVF，通过100μm尼龙网过滤以去掉细胞碎片并在37℃/5％CO2中在对照培养基(DMEM，10％FBS，1％抗生素/抗真菌剂溶液)中培养过夜。培养后，用PBS充分洗涤平板以去掉残留的非贴壁的红细胞。所得的细胞群体称为富含脂肪衍生的干细胞的组分(富含ADSC的组分)，以便将它与从切除的脂肪组织获得的SVF区别开。脂肪衍生的干细胞在非诱导型对照培养基中在37℃/5％CO2中维持。细胞的增殖和分化不需要特异性FBS血清批次。为了进行免疫荧光研究，按照Rickard等(Rickard D.J.，等，1996，J.Bone Min.Res.11：312-324)的方法从人骨髓吸出物获得MSCs群体并在对照培养基中维持。为了防止自发分化，将细胞维持在亚汇合水平。
干细胞的间接免疫荧光：
将干细胞和从人骨髓吸出物获得的MSCs平板接种到玻璃分室载玻片(chamber slide)上并在含有4％低聚甲醛的100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中固定15分钟。将细胞在含有100mM甘氨酸的PBS(PBS/甘氨酸)中洗涤10分钟并在免疫荧光封闭缓冲液(IBB；5％BSA，10％FBS，1X PBS，0.1％TritonX-100)中封闭1小时。随后细胞在含有下列细胞特异性单克隆抗体的IBB中温育1小时：1)抗平滑肌肌动蛋白(anti-SMA；Cedarlane Inc，Hornby Ont)，用于鉴定平滑肌细胞和周细胞(Skalli，O.，等，1986，J.Cell Biol.103：2787-2796；Schurch，W.，等，1987，Am J.Pathol 128：91-103；Nehls，A.和D.Drenckhahn 1991，J.Cell Biol.113：147-154；Barghom，A.等，1998，Pediatr.Pathol.Lab.Med.18：5-22))；2)抗-因子VIII(anti-FVIII；Calbiochem，SanDiego，CA)，用于鉴定内皮细胞(Jaffe，EA，等，1973，J.Clin.Envest.52：2757-2764；Nagle，RB，等，1987 Lymphology 20：20-24)；和3)ASO2(dianova，Hamburg，Germany)，用于鉴定成纤维细胞和间充质来源的细胞(Saalbach，A.，等，1996 J.Invest.Dermatol.106：1314-1319；Saalbach，A.，等，1997 Cell andTiss.Res.290：595-599)。细胞用PBS/甘氨酸充分洗涤并在含有FITC-偶联的第二抗体的IBB中温育1小时。细胞用PBS/甘氨酸洗涤并用含有DAPI的溶液固定以观察细胞核(VectaShield，Vector Labs，Burlingame，CA)。
流式细胞术：
来自5个供体的脂肪衍生的干细胞样品在分析前在对照培养基中培养72小时。流式细胞术在FACScan氩激光细胞计数器(BectonDickson，San Jose，CA)上进行。细胞在0.25％胰蛋白酶/EDTA中收获并在冰冷的2％甲醛中固定30分钟。固定后，在流式细胞术缓冲液(FCB；1XPBS，2％FBS，0.2％Tween-20)中洗涤细胞。细胞的等分试样(1×106个细胞)在含有抗因子VIII，平滑肌肌动蛋白或ASO2的单克隆抗体的FCB中温育。另外，细胞也用含有抗波形蛋白单克隆抗体(anti-VIM；Biogenesis，Brentwood，NH)的FCB温育，以鉴定间充质细胞(Lazarides，E.1982 Annu.Rev.Biochem.51：219-250；Suza，S.，等，1996 Eur.J.Cell Biol.70：84-91)。为了评估活力，收获双份样品，用冰冷的1％低聚甲醛固定30分钟，用0.05％Nonidet-40透化处理并用25μg/ml浓度的碘化丙锭(PI)温育。通过除去PI-阳性事件排除碎片和死亡细胞。由此校正所有随后的脂肪衍生的干细胞样品。
累积群体倍增：
脂肪衍生的干细胞在对照培养基中维持直到80％汇合。在汇合时收集细胞并使用公式logN1/logN2计算群体倍增，其中N1是传代前汇合时的细胞数，N2是传代后接种的细胞数。在维持直到第13代(约165天)的培养物中测定累积群体倍增。从3个供体获得的平均累积群体倍增表示为传代数的函数。
细胞衰老试验：
使用β-gal染色试验评估衰老，其中在pH6.0下在衰老细胞中检测到β-半乳糖苷酶活性而在增殖细胞中不存在(Dimri，GP，等，1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：9363-9367)。来自各次传代培养的细胞(第1代至第15代)在2％甲醛/戊二醛中固定5分钟并在β-Gal反应缓冲液(1mg/ml X-Gal，40mM柠檬酸/磷酸钠缓冲液(pH6.0)，亚铁氰化钾和高铁氰化钾各5mM，150mMNaCl和2mM MgCl2)中温育。通过光学显微镜检查鉴定衰老细胞(蓝色)。
证实脂肪衍生的干细胞的多谱系分化：
分析第1代的脂肪衍生的干细胞向脂肪形成，骨生成，软骨形成和生肌谱系分化的能力。为了诱导分化，用表1详细列出的特异性诱导培养基培养该干细胞。各培养基在以前描述并显示诱导MSCs的多谱系分化(Pittenge，MF.，等，1999 Science 284：143-147；Grigoradis，A.，等，1988 J.Cell Biol.106：2139-2151；Cheng，S-L.，等，1994 Endo 134：277-286；Loffler，G.，等，1987 Klin.Wochenschr.65：812-817；Hauner，H.，等，1987 J.Clin.Endocrinol.Metabol.64：832-835)。使用表2列出的组织学和免疫组织学试验证实分化。检查商业来源的骨髓衍生的MSCs和谱系特异性前体作为阳性对照。脂肪衍生的干细胞在对照培养基中维持并分析HFFs作为阴性对照。
1.脂肪形成：生脂分化通过在生脂培养基(AM)中培养干细胞2周进行诱导并使用油红O染料作为细胞内脂类积聚的指示剂进行评估(Preece，A.1972A Manual for Histologic Technicians，Boston，MA：Little，Brown，and Co.)。染色前，细胞在室温下在4％甲醛/1％钙中固定60分钟并用70％乙醇洗涤。细胞在2％(w/v)油红O试剂中室温下温育5分钟。通过用70％乙醇洗涤，接着用蒸馏水更换几次去掉剩余的染料。细胞用苏木精复染2分钟。
2.骨生成：骨分化通过在成骨培养基(OM)中培养干细胞最少2周进行诱导并通过von Kossa染色检查碱性磷酸酶(AP)活性和ECM钙化。为了检测AP活性，将细胞在OM中培养2周，用PBS漂洗并用1％AP溶液(1％萘酚(napthol)ABSI磷酸盐，1mg/ml坚牢红TR)在37℃下染色30分钟。对于von Kossa染色，将细胞在OM中培养4周并用4％低聚甲醛在室温下固定60分钟。细胞用蒸馏水漂洗，然后在无光条件下用1％(w/v)硝酸银溶液覆盖30分钟。将细胞用蒸馏水洗涤几次并在紫外光下显色60分钟。最后，细胞用乙醇中的0.1％伊红复染。
3.软骨形成：软骨形成分化使用微量培养技术(Ahrens，PB，等，1977Develop.Biol.60：69-82；Reddi，AH 1982 Prog.Clin.Biol.Res.110(partB)：261-268；Denker，AE.，等，1995 Differentiation 59：25-34)诱导。简单地说，将10μl浓缩的脂肪衍生的干细胞悬液(8×106个细胞/ml)平板接种到各孔的中央并使其在37℃下贴壁2小时。轻轻覆盖软骨形成培养基(CM)使其不破坏细胞结节，分析前培养物在CM中维持2周。使用组织学染料阿尔新蓝在酸性pH下证实软骨形成。干细胞结节用4％低聚甲醛在室温下固定15分钟并用更换几次PBS洗涤。研究显示了在pH为1和更低的水平下软骨基质中存在的硫酸蛋白聚糖的特异性染色(Lev，R.和S.Spicer 1964 J.Histochem.Cytochem.12：309-312)。据此，细胞用含有1％(w/v)阿尔新蓝(Sigma A-3157)的0.1N HCl(pH1.0)温育30分钟并用0.1N HCl洗涤5分钟以去掉过量染料。除了阿尔新蓝染色外，还测定了软骨特异性II型胶原蛋白同种型的表达。干细胞在4％低聚甲醛中室温下固定15分钟。细胞在0.2U/ml软骨素酶(chondroitinase)ABC中37℃下温育40分钟以帮助抗体接近II型胶原蛋白。细胞在PBS中漂洗并通过在含有3％过氧化氢的甲醇中温育10分钟消除内源性过氧化物酶活性。在PBS中洗涤后，通过在封闭缓冲液(PBS，含有10％马血清)中温育细胞1小时封闭非特异性位点。细胞随后在含有对人II型胶原蛋白特异性的单克隆抗体(ICN Biomedical，Costa Mesa，CA)的封闭缓冲液中温育1小时。在封闭缓冲液中彻底洗涤细胞并使用检测单克隆抗体的商品试剂盒按照厂商建议观察II型胶原蛋白(VectaStain ABC kit，Vector LabsInc.，Burlingame，CA)。
4.生肌：通过在生肌培养基(MM)中培养脂肪衍生的干细胞6周诱导生肌分化并通过免疫组织化学染色肌肉特异性转录因子，MyoD1和肌球蛋白重链来证实。细胞用PBS漂洗2次，用4％低聚甲醛固定20分钟并用PBS洗涤几次。细胞用含有3％过氧化氢的PBS温育10分钟以消除内源性过氧化物酶活性且通过在封闭缓冲液(PBS，10％HS，0.1％Triton X-100)中再温育60分钟封闭非特异性位点。细胞在封闭缓冲液中洗涤3次，每次5分钟并在含有抗骨骼肌肌球蛋白重链特异性单克隆抗体(Biomeda，Foster City，CA)或者抗MyoD1单克隆抗体(Dako Corp，Carpenteria，CA)的封闭缓冲液中温育1小时。细胞在封闭缓冲液中充分洗涤并使用VectaStain ABC试剂盒按照厂商的说明书观察单克隆抗体。细胞用苏木精复染3分钟。
结果
人脂肪组织通过抽吸辅助的脂肪切除术(即吸脂)获得并根据改良的方法(Katz，AJ，等，1999 Clin.Plast.Surg.26：587-603，viii)处理脂肪吸出物，以便获得含有推定的干细胞组分的处理的脂肪吸出物或PLA细胞(脂肪衍生的干细胞)群体。按常规处理300cc脂肪吸出组织产生2-6×108个细胞的干细胞样品。培养物在添加了10％胎牛血清(FBS)的DMEM中维持。添加FBS显示出对于人和动物MSC的贴壁和体外增殖是重要的(Haynesworth，SE，等，1992Bone 13：81-88；Lennon，DP，等，1995 Exp.Cell Res.219：211-222；Lennon，DP，等，1996 In Vitro Cell Dev.Biol.32：602-611)。然而，研究表明人MSCs的增殖和分化依赖于FBS的来源和品质，使得血清筛选成为关键(Lennon，DP，等，1995 Exp.Cell Res.219：211-222；Lennon，DP，等，1996 In Vitro CellDev.Biol.32：602-611)。该干细胞在体外容易增殖且表现出成纤维细胞样形态，与从骨髓和商业来源获得的MSCs一致(图1A)。该干细胞表现出不需要特定的血清批次用于增殖和多谱系分化。检验了来自3个厂商的10个FBS批次且表现出不改变干细胞的形态，增殖速率或其体外分化能力。
PLA的生长动力学和组成
从20个供体获得脂肪衍生的干细胞并在标准条件(即，10％FBS)下培养，使用几个血清来源和批次表现出平均群体倍增时间为60个小时。分离后，在干细胞培养物中观察到起始延滞时间为5至7天。然后细胞进入增生期，在48小时内达到汇合。为了检查干细胞培养物的长期生长动力学，我们测量了在多个供体中相对于传代数的累积群体倍增。与在起始培养物中观察到的延滞时间一致，在第一次传代前干细胞经历平均三次群体倍增(图1B)。在随后的传代中观察到平均1.5次群体倍增。观察了累积群体倍增与传代数之间的线性关系，在研究范围内显示出相对恒定的群体倍增率。另外，在后来的传代(培养物中P13＝165天)中观察到累积群体倍增无明显减少，表明干细胞培养物在延续培养期间保持其增殖潜力。
除了累积群体倍增，我们还在长期干细胞培养物中使用β-ga1染色方法检查了细胞衰老，其中在增殖细胞中不存在β-半乳糖苷酶表达，但是在pH6.0的衰老细胞中可检测到(Dimri，GP，等，1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：9363-9367)。使用该试验，在每次传代时检查干细胞培养物的衰老。第1代的干细胞培养物表现出无明显β-gal染色(图1C，P1)。在后来的传代中观察到β-gal染色增加，然而在10次传代中衰老细胞的百分数保持在5％以下且在第15代时增加到15％。综合起来，该数据表明脂肪衍生的干细胞样品在长期培养中相对稳定，保持恒定的群体倍增率且表现出低水平的衰老。
从切除的脂肪组织处理的SVF是包含肥大细胞，内皮细胞，周细胞，成纤维细胞和谱系定向型祖细胞，或脂肪细胞前体的异型群体(Pettersson，P.等，1984 Acta Med.Scand.215：447-453；Hauner，H.，等，1987 J.Clin.Endocrinol.Metabol.64：832-835)。这些组分也可能与从吸脂的脂肪组织获得的推定的干细胞组分一起存在。然而，没有关于该方面的文献公开。为了从表型上鉴定该干细胞，使用对确定的细胞表面标记特异性的抗体通过间接免疫荧光检查了来自几个供体的样品。也检查了从人骨髓吸出物获得的骨髓基质组分作为对照。为了鉴定内皮细胞，将干细胞与抗因子VIII的单克隆抗体温育(Jaffe，EA，等，1973 J.Clin.Invest.52：2757-2764；Nagle，RB，等，1987Lymphology 20：20-24)。使用抗平滑肌肌动蛋白的单克隆抗体鉴定平滑肌细胞(Lazarides，E.1982 Annu.Rev.Biochem.51：219-250；Suza，S.，等，1996 Eur.J.Cell Biol.70：84-91)。该抗体还显示出与移行周细胞(即，毛细管前和后的周细胞)和定向于平滑肌谱系的周细胞的收缩器反应(Nehls，A.和D.Drenckhahn 1991 J.Cell Biol.113：147-154；Herman，IM和PAD′Amore 1985 J.Cell Biol.101：43-52)。在干细胞组分中观察到低水平的内皮细胞，平滑肌细胞和周细胞(图2)。相比较，在处理的骨髓基质样品中没有观察到这些标记的染色。除了因子VIII和平滑肌肌动蛋白外，细胞也用对成纤维细胞和间充质细胞特异性的单克隆抗体(ASO2)温育(Saalbach，A.，等，1996 J.Invest.Dermatol.106：1314-1319；Saalbach，A.，等，1997 Cell and Tiss.Res.290：595-599)。大多数干细胞和骨髓基质细胞用ASO2染色为阳性，表明是间充质来源(图2，ASO2组)。
为了定量测定干细胞组成，使用上述细胞表面标记通过流式细胞术分析样品。获得样品并在对照培养基中培养72小时。使用前向和侧向散射设置测量细胞大小和颗粒性(图3A)。大多数干细胞样品由小而无颗粒的细胞组成。另外，该干细胞用抗因子VIII，平滑肌肌动蛋白和ASO2的单克隆抗体和抗波形蛋白的单克隆抗体温育，波形蛋白是主要在间充质来源的细胞中发现的中间丝状蛋白(Lazarides，E.1982 Annu.Rev.Biochem.51：219-250；Suza，S.，等，1996 Eur.J.Cell Biol.70：84-91)。使用碘化丙锭评估活力并校正样品的活力，非特异性荧光和自发荧光。显示了来自代表性患者的数据(图3B)。从5个供体采集流式细胞术数据，将每种细胞特异性标记的阳性事件数表示为干细胞总数的百分数。与免疫荧光数据一致，干细胞组分表达因子VIII(FVIII-阳性细胞＝干细胞总数的24.9％±8.2)和平滑肌肌动蛋白(SMA-阳性细胞＝PLA细胞总数的29.2％±2.1)(图3C)，表明该干细胞组分含有内皮细胞，平滑肌细胞，且很可能有周细胞。另外，大多数干细胞为ASO2染色阳性(ASO2-阳性细胞＝PLA细胞总数的85.0％±12.8)和波形蛋白阳性(VIM-阳性细胞＝总细胞数的63.2％±5.6)，表明细胞为间充质来源。综合起来，该结果表明干细胞组分是中胚层细胞或间充质细胞的相对均一群体，其中有少量的内皮细胞，周细胞和平滑肌细胞污染。
脂肪衍生的干细胞表现出多谱系潜能：
为了研究脂肪衍生的干细胞的多谱系能力，使用谱系特异性诱导因子(表1)使细胞向脂肪形成谱系，骨生成谱系，软骨形成谱系和生肌谱系分化。已经表明人和动物骨髓衍生的MSCs用合适的培养基添加剂可向脂肪形成，骨生成和软骨形成谱系分化(Pittenger，MF.，等，1999 Science 284：143-147；Grigoradis，A.，等，1988 J.Cell Biol.106：2139-2151；Cheng，S-L.，等，1994Endo 134：277-286；Loffler，G.，等，1987 Klin.Wochenschr.65：812-817；Hauner，H.，等，1987 J.Clin.Endocrinol.Metabol.64：832-835)。诱导后，使用组织学和免疫组织化学评估分化(表2)。商品MSCs和谱系定向型祖细胞用作阳性对照，同时检查在对照培养基中维持的该干细胞和HFF细胞作为阴性对照。
用含有cAMP兴奋剂和诸如异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)，吲哚美辛，胰岛素和地塞米松的诱导剂的脂肪形成诱导培养基处理的脂肪细胞前体和MSCs形成积聚脂类染料油红O的含有脂类的小滴(Pittenger，MF.，等，1999Science 284：143-147；Rubin，CS，等，1978 J.Biol.Chem.253：7570-7578；Deslex，S，等，1987 Int.J.Obesity 11：19-27)。为了测定PLA细胞是否经历脂肪形成，将细胞在含有这些试剂的培养基(生脂培养基，AM)中培养并用油红-O染色。在AM中培养的干细胞早在诱导后两周时可增殖地诱导向脂肪形成谱系(图4)。该细胞的主要组分含有积聚油红O的多个细胞内充满脂类的小滴。含有油红-O的干细胞表现出增殖形态，细胞内体积大多数(90-98％)被脂滴占据，与成熟脂肪细胞的表型一致。在35岁以下的6个供体中测量的生脂分化的平均水平为42.4％±10.6％(％油红O-阳性细胞/PLA细胞总数)。延长培养时间(即4周)导致分化细胞脱离培养板并飘浮到表面。分化的干细胞观察到的形态和脂类累积相似于在AM中处理骨髓衍生的MSCs和脂肪细胞前体细胞系，3T3-L1时观察到的结果。在未分化的干细胞或HFF阴性对照中没有观察到脂滴。与超过第三次传代培养后生脂分化突然减少的MSCs(Conget，PA和JJ Minguell 1999 J.Cell.Physiol.181：67-73)相反，该干细胞的脂肪形成潜力可在长期培养期间保持(即，第15代＝175天的培养物)。综合起来，该结果表明该干细胞进行生脂分化。
通过用低浓度的抗坏血酸，β-磷酸甘油和地塞米松处理细胞体外诱导骨原细胞和骨髓衍生的MSCs分化成成骨细胞(Pittenger，MF，等，1999 Science284：143-147；Cheng，S-L，等，1994 Endo 134：277-286；Conget，PA和JJMinguell 1999 J.Cell.Physiol.181：67-73)。这些细胞向未成熟的成骨细胞的早期分化通过碱性磷酸酶(AP)的酶活性鉴定，人MSCs早在4天时表达AP且在诱导后12天时观察到最大水平(Jaiswal，N，等，1997 J.Cell Biochem.64：295-312)。为了证实其骨生成能力，干细胞用成骨培养基(OM)处理14天并检查AP的表达。在OM中培养的干细胞形成密集的多层结节的广泛网络，它们为AP染色阳性(图5)。在6个供体中测量的AP阳性染色细胞的平均数为干细胞总数的50.2％±10.8％。在OM中维持的MSCs和NHOst阳性对照中也观察到AP的表达。相反，未分化的干细胞和HFF阴性对照没有显示出AP表达的证据。尽管在成骨组织中AP表达显著上调，但是在诸如软骨，肝脏和肾的一些非成骨细胞类型和组织中已经观察到其表达(Henthorn，PS，等，1988 J.Biol.Chem.263：12011；Weiss，MJ，等，1988 J.Biol.Chem.263：12002；Leboy，PS，等，1989 J.Biol.Chem.264：17281)。因此，AP表达通常与其它的成骨特异性标记结合用作骨生成的指标。一种该指标是形成钙化的细胞外基质(ECM)。成熟的成骨细胞分泌富含I型胶原蛋白的ECM，它在分化的后期钙化(Scott，DM 1980 Arch.Biochem.Biophys.201：384-391)。因此，为了证实成骨分化，使用von Kossa染料在干细胞中评估ECM基质的钙化。钙化表现为在细胞单层内的黑色区域。与骨生成一致，在OM中处理4周的干细胞中观察到指示钙化的ECM的一些黑色区域。在MSC和NHOst阳性对照中也鉴定到钙化，而在未分化的干细胞或HFF细胞中没有观察到钙化。干细胞的成骨潜力在长期培养期间可保持，晚至175天的培养物中也有细胞表达AP。综合起来，脂肪衍生的干细胞表达AP并产生钙化的ECM，这一点强烈提示这些脂肪衍生的干细胞可通过诱导而发展为成骨谱系。
软骨形成分化可使用微量培养技术在体外诱导，其中重复细胞缩合(软骨形成的关键性第一事件)(Ahrens P.B.，等，1977 Develop.Biol.60：69-82；Reddi A.H.1982 Prog.Clin.Biol.Res.110 Pt B：261-268；Denker，A.E.，等，1995 Differentiation 59，25-34；Tacchetti，C，等，1992 Exp Cell Res.200：26-33)。通过用地塞米松和TGFβ1处理细胞获得增强的分化(Iwasaki，M.等，1993Endocrinology 132：1603-1608)。在微量条件下用这些试剂培养的骨髓衍生的MSCs形成与富含II型胶原蛋白和硫酸蛋白聚糖的结构清楚的ECM相关的细胞结节(Pittenger，MF，等，1999 Science 284：143-147；Mackay，AM，等，1998 Tissue Eng.4：415-428)。这些硫酸蛋白聚糖可在酸性条件下使用阿尔新蓝染料特异性地检测(Lev，R和S.Spicer 1964 J.Histochem.Cytochem.12：309-312)。为了评估干细胞的软骨形成能力，细胞在含有地塞米松和TGFβ1的软骨形成培养基(CM)中通过微量培养。干细胞的微量培养导致形成与软骨形成分化一致的致密结节。干细胞结节与阿尔新蓝-阳性ECM相关，它是在基质内存在硫酸蛋白聚糖的指标(图6)。在微量培养MSC对照时也观察到软骨结节。为了证实阿尔新蓝对软骨基质的特异性，在酸性条件下用阿尔新蓝染色人软骨和骨骼切片。正如预期，人软骨切片用阿尔新蓝染色为阳性，而在骨骼切片中观察不到染色。除了在ECM内存在硫酸蛋白聚糖外，干细胞和人软骨切片都表达软骨特异性胶原蛋白II型同种型，而在未分化的干细胞中观察不到染色。与脂肪形成和成骨分化一致，干细胞在延期培养后(即，达到175天时)保留其软骨形成分化潜力。上述结果表明脂肪衍生的干细胞具有向软骨形成谱系分化的能力。
肌形成的特征在于有一个成肌细胞增殖期，随后表达肌肉特异性蛋白并融合形成多核肌管。早期生肌分化的特征在于表达一些生肌调节因子，包括生肌决定因子1(MyoD1；(Davis，R.L.，等，1987 Cell 51：987-1000；Weintraub，H.，等，1991 Science 251：761-763；Dias，P.，等，1994 Semin.Diagn.Pathol.11：3-14)。最终分化的成肌细胞可通过肌球蛋白的表达和多核的存在来鉴定(Silberstein，L.，等，1986 Cell 46：1075-1081)。肌肉前体和骨髓衍生的干细胞的增殖和生肌分化可通过地塞米松诱导并导致肌肉特异性蛋白的表达(Grigoradis，A，等，1988 J.Cell Biol.106：2139-2151；Ball，EH和BD Sanwal1980 J.Cell.Physiol 102：27-36；Guerriero，V和JR Florini 1980 Endocrinology106：1198-1202)。另外，在其转变成分化的肌管之前，已知加入氢化可的松刺激人成肌细胞的增殖(Zalin，RJ 1987 Exp.Cell Res.172：265-281)。为了检查干细胞是否经历肌形成，在地塞米松和氢化可的松存在下培养细胞6周，并用对MyoD1和肌球蛋白(重链)特异性的抗体温育。与早期生肌分化一致，用MM处理干细胞1周诱导MyoD1表达(图7)。处理更长时间(6周)的干细胞为肌球蛋白染色阳性。除了肌球蛋白表达外，也观察到存在具有多核的大型伸长细胞的分散“斑”，表明干细胞进行成肌细胞融合(PLA组，插图)。在人骨骼肌阳性对照细胞中也检测到MyoD1和肌球蛋白重链表达。使用生肌培养基，甚至在诱导6周时在MSC对照中也没有观察到生肌分化。这些细胞受到氢化可的松的有害影响且需要改变条件以诱导分化。在干细胞中的肌原性分化水平平均为12％。在未分化的干细胞和HFF阴性对照中都没有观察到多核形成，肌球蛋白重链和MyoD1表达。存在多核细胞和表达MyoD1和肌球蛋白重链表明脂肪衍生的干细胞具有进行生肌分化的能力。
                       表1：通过培养基添加物诱导谱系特异性分化
    培养基   培养基   血清 添加物
    对照   DMEM   10％FBS 无
    脂肪形成(AM)   DMEM   10％FBS 0.5mM异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)，1μM地塞米松，10μM胰岛素，200μM吲哚美辛，1％抗生素/抗真菌剂
    骨生成(OM)   DMEM   10％FBS 0.1μM地塞米松，50-抗坏血酸-2-磷酸，10mM β-磷酸甘油，1％抗生素/抗真菌剂
    软骨形成(CM)   DMEM   1％FBS 6.25μg/ml胰岛素，10ng/ml TGFβ1，50nM抗坏血酸-2-磷酸，1％抗生素/抗真菌剂
    生肌(MM)   DMEM   10％FBS5％HS 0.1μM地塞米松，50μM氢化可的松，1％抗生素/抗真菌剂
                          表2：分化标记和谱系特异性分化的测定
谱系 谱系特异性决定因素 组织学/免疫组织化学测定
脂肪形成 脂肪累积 油红O染色
骨生成 1.碱性磷酸酶活性2.钙化基质产生 1.碱性磷酸酶染色2.Von Kossa染色
软骨形成 1.富含硫酸蛋白聚糖的基质2.II型胶原蛋白合成 1.阿尔新蓝(pH1.0)染色2.II型胶原蛋白特异性单克隆抗体
生肌 1.多核形成2.骨骼肌肌球蛋白重链和MyoD1表达 1.相差显微镜2.肌球蛋白和MyoD1特异性单克隆抗体
讨论
总体来说，有两大类型的干细胞：即胚胎干细胞(ESCs)和自体干细胞。尽管由于其多能性在理论上有吸引力，但是由于细胞调控和伦理考虑方面的潜在问题，ESCs的实际用途受到限制。相反，自体干细胞因其本性而具有免疫相容性且没有与其用途相关的伦理争论。对于中胚层来源的组织工程，从骨髓获得的自体干细胞经实验证明是有希望的。人骨髓来源于胚胎的中胚层且由造血干细胞(HSCs)群体组成，受到间充质基质的支持(Friedenstein A.J.，等，1968 Transplantation 6：230-47；Friedenstein A.J.，等，1974Transplantation 17：331-40；Werts E.D.，等，1980 Exp.Hematol.8：423；DexterT.M.1982 J.Cell Physiol.1：87-94；Paul S.R.，等，1991 Blood 77：1723-33)。尽管HSCs的增殖和分化已有充分报导，而关于基质成份所知甚少。动物和人的骨髓基质在组成上是异源性的，含有一些细胞群体，包括称为间充质干细胞或MSCs的干细胞群体(Caplan AI 1991 J.Orthop.Res.9：641-650)。对MSCs的研究证实了它们分化成脂肪细胞(Beresford J.N.，等，1992 J.Cell Sci.102：341-351；Pittenger M.F.，等，1999 Science 284：143-147)，软骨细胞(CaplanA.I.1991 J.Orthop.Res.9：641-50；Pittenger M.F.，等，1999 Science 284：143-147；Berry L.，等，1992 J.Cell Sci.101：333-342；Johnstone B.，等，1998Exp.Cell Res.238：265-272；Yoo J.U.，等，1998 J.Bone Joint Surg.Am.80：1745-1757)，成肌细胞(Wakitani S.，等，1995 Muscle Nerve 18：1417-1426；Ferrari G.，等，1998 Science 279：1528-1530)和成骨细胞(Caplan A.I.1991 J.Orthop.Res.9：641-50；Pittenger M.F.，等，1999 Science 284：143-147；Grigoradis A.，等，1988 J.Cell Biol.106：2139-2151；Cheng S-L.，等，1994 Endo134：277-286，1994；Haynesworth S.E.，等，1992 Bone 13：81-8；Rickard D.J.，等，1996 J.Bone Min.Res.11：312-324；Prockop D.J.1997 Science 276：71-74；Dennis J.E.，等，1999 J.Bone Miner.Res.14：700-709)。这些细胞代表了将来组织工程战略的一种有希望的选择。然而，传统的骨髓获取方法疼痛，通常需要全身性或脊柱麻醉且经过处理可产生少量MSCs(每105个贴壁基质细胞中约有一个MSC(Pittenger，MF等，1999 Science 284：143-147；Rickard，DJ，等，J.Bone Min.Res.11：312-324；Bruder，SP，等，1997 J.Cell.Biochem.64：278-294))。从实际出发，低干细胞数目需要离体增殖步骤以获得临床上有效的细胞数。该步骤耗时，昂贵且有细胞污染和损失的危险。因此，自体干细胞的理想来源应当是容易获得，引起最小的患者不适而能够产生基本上足以避免在培养物中进行扩大增殖的细胞数。
我们报道了可从人脂肪吸出物处理具有多种中胚层谱系能力的细胞组分。该细胞组分是脂肪衍生的干细胞，命名为处理的脂肪吸出物(PLA)，它含有不需特定血清批次或培养基添加物就容易在体外增殖的成纤维细胞样细胞。该干细胞样品保持线性生长率而在延期培养期间没有明显的衰老。该干细胞群体在特性上是异源性的，其中大多数细胞是间充质来源。然而，也鉴定到污染的内皮，平滑肌和周细胞的细胞群体。该干细胞也表现出体外的多谱系潜力，在确定的谱系特异性分化因子存在下培养时向脂肪形成，骨生成，软骨形成和生肌谱系分化。该分化结果与骨髓衍生的MSCs和谱系定向型前体的谱系特异性分化中观察到的结果一致。
尽管该干细胞的明显多分化能力表明人吸脂的脂肪组织内存在干细胞群体，然而它并不确实。多谱系分化也可能是由于存在：(1)多谱系定向祖细胞；(2)来自其它来源的多能细胞(例如，周细胞，来自外周血的骨髓衍生的MSCs)；或者(3)上述情况的组合。
观察到的分化可能是由于干细胞组分内存在谱系定向型祖细胞，例如成骨细胞前体，成肌细胞前体或脂肪细胞前体。已知从切除的脂肪组织获得的细胞组分(即SVFs)含有分化成成熟脂肪细胞的脂肪细胞前体(Pettersson，P，等，1984 Acta Med.Scand.215：447-453；Pettersson，P，等，1985 Metabolism34：808-812)。可能观察到的该干细胞的生脂分化只是已有脂肪细胞前体的定型而不是多能细胞的分化。然而，我们相信这不是事实。从切除的脂肪组织获得的SVF仅有少到0.02％被鉴定为能够进行生脂分化的脂肪细胞前体(Pettersson，P，等，1984 Acta Med.Scand.215：447-453)。如果该干细胞组分内的脂肪细胞前体数与来自切除组织的SVF中测量的水平相当，可预期脂肪形成的水平相当低。然而，在该干细胞中观察到脂肪形成的程度显著(PLA细胞总数的约40％)且可引起其它细胞类型的分化。
吸脂期间对下面肌肉的损伤可向该干细胞组分中导入肌原性前体细胞或卫星细胞，导致观察到这些细胞的生肌分化。位于肌膜和肌肉纤维外层之间的肌原性前体细胞在其未分化状态是静止的且不表现区别特征，使得其鉴定困难。一些团体已尝试鉴定这些前体的特有标记，而成就有限。目前，已经使用生肌调节因子，MyoD1和肌细胞生成素的表达在胚胎发生期间和啮齿类再生成熟肌肉中鉴定卫星细胞(Cusella-DeAngelis，M.C.，等，1992 CellBiol.116：1243-1255；Grounds，M.D.，等，1992 Cell Tiss.Res.267：99-104；Sassoon，D.A.1993 Develop.Biol.156：11；Maley，M.A.L.，等，1994 Exp.CellRes.211：99-107；Lawson-Smith，M.J.和McGeachie，J.K.1998 J.Anat.192：161-171)。另外，在分化开始前在增殖的成肌细胞中已经鉴定到MyoD1表达(Weintraub，H，等，Science 251：761-763)。尽管这些标记尚未用于鉴定人类受试者的肌源性前体细胞，但是MyoD1在正常骨骼肌中早期生肌分化期间表达且已经用于鉴定人77-79中横纹肌肉瘤的骨骼肌起源(Dias，P.，等，1990 Am.J.Pathol.137：1283-1291；Rosai，J.，等，1991 Am.J.Surg.Pathol.15：974；Nakano，H.，等，2000 Oncology 58：319-323)。在非诱导型对照培养基中维持的干细胞无MyoD1表达(参见图28)，表明我们观察到的生肌分化不是由于该干细胞组分内存在肌原性前体细胞或增殖的成肌细胞。与此一致，吸脂套管的钝外形使其极其难以穿透围绕肌肉的纤维性筋膜腔和将这些前体细胞导入脂肪区。
人脂肪组织有血管形成，因此，它含有被诸如周细胞和骨髓衍生的MSCs等多能细胞污染的潜在全身性血管“管道”。吸脂期间破坏血液供应可导致释放周细胞，已知它在体内和体外都具有多谱系潜力(Schor，AM，等，1990 J.CellSci.97：449-461；Doherty，MJ 1998 J.Bone Miner.Res.13：828-838；Diefenderfer，DL和CT Brighton 2000 Biochem.Biophys.Res.Commun.269：172-178)。与此一致，我们的免疫荧光和流式细胞术数据表明该干细胞的一小部分由表达平滑肌肌动蛋白的细胞组成，该肌动蛋白是移行周细胞和定向于平滑肌谱系的周细胞的一种成份(Nehls，A.和D Drenckhahn 1991 J.CellBiol.113：147-154)。在干细胞中观察到的多谱系分化可能部分是由于存在周细胞。破坏血液供应也可能向该干细胞组分中导入MSCs。然而，文献中对于外周血中这些干细胞的存在有争议(Huss，R 2000 Stem Cells 18：1-9；Lazaras，HM，等，1997 J.Hematother.6：447-455)。如果外周血确实提供了MSCs的来源，我们观察到的多谱系分化可能是由于这些干细胞(MSCs)对脂肪组织的污染。然而，MSCs是人骨髓基质的一个小组分(每105个贴壁基质细胞约有1个MSC(Pittenger，MF，等，1999 Science 284：143-147；Rickard，DJ1996 J.Bone Min.Res.11：312-324；Bruder，SP，等，1997 J.Cell.Biochem.64：278-294)。如果这些细胞确实存在于外周血中，它们可能以比骨髓中甚至更小的量存在且这些细胞对脂肪衍生的干细胞组分的污染水平可忽略不计。
这些论据可支持吸脂的脂肪组织内存在多能干细胞群体，但要明确证实需要分离和鉴定由单个细胞衍生的多个克隆。初步数据证实了克隆的干细胞群体具有多谱系潜力，能够进行脂肪形成，骨生成，和软骨形成分化。
当前的研究证实了使用骨髓衍生的MSCs的阳性结果。MSCs可在体内分化成骨生成和软骨形成组织(Benayahu，D.等，1989 J.Cell Physiol 140：1-7；Ohgushi，HM 1990 Acta Orthop.Scand.61：431-434；Krebsbach，PH，等，1997Transplantation 63：1059-1069；Bruder，SP，等，1998 J.Orthop.Res.16：155-162)且初步数据表明这些细胞可用于修复骨骼和软骨缺陷(Wakitani，S.，等，1995Muscle Nerve 18：1417-1426；Krebsbach，PH，等，1997 Transplantation 63：1059-1069；Bruder，SP，等，1998 J.Orthop.Res.16：155-162；Bruder，等，1998Clin.Orthop.S247-56；Krebsbach，PH 1998 Transplantation 66：1272-1278；Johnstone和Yoo 1999 Clin.Orthop.S156-162)。从吸脂的脂肪组织获得的干细胞可提供多谱系中胚层干细胞的另一来源。与骨髓基质类似，这些数据表明脂肪组织可含有有效组分的具有多谱系能力的细胞。这些脂肪衍生的干细胞容易大量获得并且在获取过程中相关的发病率和不适最低。
实施例8
下面的描述提供了分化成成骨组织的脂肪衍生的干细胞，和分离所述干细胞的方法。该干细胞的成骨潜力随着供体年龄而减小。然而，脂肪形成不受供体年龄的影响。
材料和方法
脂吸出物的收集和处理：
人脂肪组织可根据患者同意的方案HSPC#98-08 011-02(加利福尼亚洲洛杉矶大学)在局部麻醉的情况下从选择性吸脂操作中获得。处理粗制的脂肪吸出物以获得脂肪衍生的干细胞群体(Zuk，P，等，2001 Tissue Engineering7：209-226)。简单地说，将粗制的脂肪吸出物用等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤并用0.075％的胶原酶在37℃下消化细胞外基质(ECM)30分钟。用含有10％胎牛血清(FBS；HyClone)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM；Life Technologies)中和酶活性并以1200xg离心10分钟。将该干细胞沉淀重悬于DMEM/10％FBS中并通过细胞过滤器过滤以去掉任何残留组织。细胞在37℃，5％CO2中在非诱导型对照培养基(DMEM，10％FBS，1％抗生素/抗真菌剂溶液)中培养过夜。培养后，用PBS充分洗涤平板以去掉残留的非贴壁的红细胞。该干细胞在对照培养基(表3)中在37℃/5％CO2中维持。为了防止自发分化，将细胞维持在亚汇合水平。
                       表3：通过培养基添加物诱导的谱系特异性分化
培养基 培养基 血清 添加物
对照 DMEM 10％FBS 无
脂肪形成(AM) DMEM 10％FBS 0.5mM异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)，1μM地塞米松，10μM胰岛素，200μM吲哚美辛，1％抗生素/抗真菌剂
骨生成(OM) DMEM 10％FBS 0.1μM地塞米松，50μM抗坏血酸-2-磷酸，10mMβ-磷酸甘油，1％抗生素/抗真菌剂
分化的诱导和分析：
1.生脂分化：将PLA细胞(第1代)以每孔4×104个细胞的密度接种进6孔平板(Costar，Cambridge，MA)中并在对照培养基中培养72小时。为了诱导生脂分化，将PLA细胞在生脂培养基(表3)中培养2周。PLA细胞以相同的密度在对照培养基中维持作为阴性对照。
油红O染色：在诱导后2周时通过用油红O染色鉴定细胞内脂泡证实脂肪形成。细胞在4％甲醛/1％钙中室温下固定60分钟并用70％乙醇洗涤。细胞在2％(w/v)油红O试剂(Sigma，St Louis，MO)中室温下温育5分钟。通过用70％乙醇洗涤，接着更换几次蒸馏水去掉过量的染料。细胞用苏木精复染1分钟。
2.成骨分化：将PLA细胞(第1代)以每孔1×104个细胞的密度接种进6孔平板中并在对照培养基中培养72小时。根据以前对骨髓衍生的间充质干细胞的研究(Pittenger，MF 1999 Science 284：143-147)，将PLA细胞在成骨培养基(表3)中维持最少2周以诱导骨生成。将PLA细胞在对照培养基中维持作为阴性对照。
碱性磷酸酶染色：碱性磷酸酶(AP)活性在诱导后14天时检查。用PBS洗涤PLA细胞并在含有1％(v/v)溶于二甲基亚砜(DMSO)的50mg/ml萘酚AS-Biphosphate(Sigma)溶液和1mg/ml坚牢红TR盐(Sigma)的0.05MTris-HCl(pH9)中37℃下温育30分钟。温育后，细胞用等体积8％的低聚甲醛固定10分钟，接着用蒸馏水漂洗。
Von Kossa染色：在诱导后4周时通过von Kossa染色检测细胞外基质钙化。将PLA细胞用4％低聚甲醛室温下固定1小时，随后在无光条件下用5％(w/v)硝酸银溶液(Sigma)温育30分钟。细胞用蒸馏水洗涤几次，在紫外光下显色60分钟并用含有0.1％伊红的乙醇复染。通过存在黑色细胞外沉积物鉴定基质钙化。
分化定量：
使用配备有Spot 2数码照相机和20X物镜(放大率200X)的ZeissAxioscope 2显微镜定量各供体中的脂肪形成和成骨分化水平。在各孔的3个恒定区域(例如，在3，6和9时钟位置)内计数来自每个供体的一式两份样品中的油红O-和AP-阳性细胞(分别为脂肪形成和骨生成)的总数。阳性染色细胞的总数表示为各区域内计数的PLA细胞总数的百分数。平均来自3个区域的值得到各供体的平均分化水平。平均分化水平相对于患者年龄表示。Von Kossa鉴定了基质产生的区域而不是单个分化的细胞，因此该染色方法用于证实成骨分化。
PLA样品内成骨前体细胞的定量：
为了评估PLA群体内的成骨前体细胞数，计数具有成骨活性的细胞并与患者年龄关联。具体地说，检查两个年龄组：A组＝20至39岁，B组＝40至60岁。将第一代PLA细胞(P1)接种到100mm培养皿上，按上述向成骨谱系诱导并染色AP活性以证实分化。通过计数AP-阳性集落形成单位(CFU/AP+)的数目测定各PLA样品内的前体细胞数。根据以前的研究，使用最少10个AP-阳性细胞鉴定CFU/AP+(Long，M，等，1999 J.Gerontol.A.Biol.Sci.Med.Soc.54：B54-62)。测定CFU/AP+的平均数并相对于年龄组表示。凭经验确定成骨分化所需的最佳PLA细胞数(每个培养皿平板接种1×104，5×104，1×105和5×105个细胞)。尽管以每个培养皿5×105个细胞时成骨分化水平最大，但是汇合水平妨碍精确的集落计数。因此使用每个培养皿1×105个细胞的密度获取数据。
生长动力学：
为了测量相对于供体年龄的PLA细胞生长动力学(群体倍增)，将来自各供体的PLA细胞(P1)以1×104个细胞的密度接种进多个培养皿中。平板接种24小时后和每隔48小时从一式三份样品测定细胞数直到第11天。获得生长曲线(细胞数对培养时间)并从对数期计算群体倍增。
统计分析：
通过线性回归分析(r值)测定相应于供体年龄在PLA细胞骨生成和脂肪形成中的显著差异。另外，使用不配对的Student t检验(假定不等方差)和单向方差分析(ANOVA)比较各供体年龄的平均分化水平。
结果
相应干供体年龄的PLA细胞生长动力学变化
起始PLA培养物在外观上相对同型，大多数细胞(85至90％)表现出成纤维细胞样形态。可鉴定到小部分内皮细胞，巨噬细胞和脂肪细胞前体(不超过总群体的10％)。PLA细胞在对照培养基中培养14天内达到80-90％汇合。从第一代PLA细胞培养物(P1)得到的生长曲线在各供体中的特征在于有一个起始延滞期(一般48小时)，接着是对数期(平均＝7天)和一个平台期。代表性的生长动力学曲线在图8A中显示。在任一供体中观察到延滞期和对数期的持续时间无明显差异。同样，在较年轻的患者(20岁与39岁)中观察到PLA的生长动力学无显著差异。然而，在老年患者中观察到PLA细胞的对数期缩短(例如，第13天：58岁-12.6×104个细胞，20岁-26.9×104个细胞)。根据生长动力学数据，从15个供体计算的平均PLA细胞群体倍增时间为52.67±8.67小时。PLA细胞群体倍增时间范围为从38到77小时(图8B：20岁与53岁)。群体倍增与供体年龄的回归分析产生r＝0.62(n＝15)的正相关，表明群体倍增随年龄增加(即，增殖潜力下降)的趋势。然而，使用不配对的t-检验，按十岁分组的供体(即20-30岁，30-40岁，40-50岁，50-60岁)的统计分析在群体倍增方面未表现出显著差异(p＞0.05)，表明PLA增殖不会随着供体年龄的增长而显著下降。
生脂分化潜力不随PLA年龄而改变
通过用脂类染料油红O染色细胞证实在PLA细胞中的脂肪形成和脂泡形成。在所有供体中，PLA细胞的低水平的生脂分化早在生脂培养基中诱导5天时就清晰可见。分化的细胞设定为具有与脂肪细胞一致的膨胀形态并积累被油红O染色的富含脂类的细胞内液泡(图9A，1和2组)。到诱导后第14天，分化细胞在细胞质内含有大型油红O-阳性脂滴。分化水平随不同供体而变化，几个供体表现出低水平的脂肪形成，其中容易鉴定含有中等量染料的个体油红O-阳性细胞(图9A，1组)。另外，一些供体表现出脂肪形成水平增强，其中油红O-阳性细胞数和染料积累显著增加(图9A，2组)。在非诱导型对照培养基中培养的细胞表现出无形态学改变且不积累油红O，证实了诱导型培养基条件的特异性(图9A，第3组)。为了测量生脂分化潜力相对于供体年龄的改变，在确定区域内直接计数油红O-阳性细胞的数目并表示为计数的PLA细胞总数的百分数。平均各个区域的值得到生脂分化的平均水平并相对于供体年龄表示(图9B)。生脂分化水平范围为总PLA细胞的4.51％到57.78％(n＝20)。计算的平均分化潜力为26.55％±18.14％。然而，分析获得了可忽略不计的回归值(r＝0.016)，表明随着供体年龄的增长不发生生脂分化的显著改变。
成骨分化随供体年龄而下降
为了证实骨生成，使用硝酸银/Von Kossa染料染色细胞的碱性磷酸酶(AP)活性和细胞外基质钙化。在成骨培养基中培养的PLA细胞早在诱导后4天时经历细胞形态的显著改变，从纺锤形向立方形，即成骨细胞的特征转变。在一些供体中通过AP-阳性细胞单层的形成鉴定到低水平的骨生成(图10A，1组)。在一些患者中通过存在具有不含细胞的清楚结节间区域的多层AP-阳性结节结构鉴定到更高水平的骨生成(图10A，2组)。除了AP活性外，在培养3周后明显有通过von Kossa染色检测的矿化区域，进一步证实了成骨分化(图10A，第4和5组)。对照的PLA细胞不表现出AP活性或基质矿化(图10A，第3和6组)。为了测量成骨分化随供体年龄的潜在变化，使用与计算脂肪形成水平相同的方法测定平均骨生成水平(即，AP-阳性细胞)。
与脂肪形成相反，在老年供体中观察到骨生成显著下降。成骨分化范围无从总PLA细胞的11.64％至64.69％(图10B)。对供体年龄和骨生成的回归分析得到明显的负相关(r＝-0.70，n＝19)，表明成骨分化相对于年龄下降。使用von Kossa染色观察到相似的趋势。令人感兴趣的是，在年龄超过36岁的供体中观察到成骨分化显著下降(图10B，虚线)。与此一致，当将受试者分成两个年龄组时观察到骨生成的显著差异(p＜0.001)。来自年轻年龄组的供体(20至36岁；n＝7)表现出平均骨生成潜力为50.7±10％(总PLA细胞)而在老年年龄组(37到58岁；n＝11)中测量到明显更低水平的骨生成(20.7±7.9％PLA细胞总数)(图10C)。根据该数据，来自年轻组的细胞表现出骨生成潜力增大2.4-倍，形成超过59％的AP阳性细胞。
PLA内成骨前体细胞的相对比例：
为了测定PLA骨生成的减少是否由于具有成骨潜力的PLA细胞数减少，相对于供体年龄计算了PLA内成骨前体细胞的相对比例。PLA细胞在成骨培养基中诱导2周并通过计算AP-阳性集落形成单位(CFU/AP+)的数目测定PLA内的前体细胞数(Grigoradis，A，等，1988 J.Cell Biol.106：2139-2151；Pittenger，MF，等，1999 Science 284：143-147；Jaiswal，N.，等，1997 J.CellBiochem.64：295-312)。在两个年龄组中计算前体细胞数(A组＝20-39岁，n＝5且B组＝40-58岁，n＝6)。与在老年PLA样品中观察到的成骨潜力减小一致，随着年龄的增长观察到CFU/AP+数略有减少。A组中CFU/AP+的平均数为每105个PLA细胞194±61个，而B组中的CFU/AP+数下降到每105个PLA细胞136±32个(图11)。尽管观察到骨原细胞的减少趋势，但是该减少在统计学上不显著(p＝0.11)，表明PLA细胞的成骨潜力下降可能不是由于成骨前体细胞数的下降直接引起。
讨论
间充质干细胞可从骨髓分离。间充质干细胞是骨髓基质的一种成份且具有分化成包括脂肪，骨骼和软骨的各种中胚层组织的能力(Grigoradis，A.，等，1988 J.Cell Biol.106：2139-2151；Caplan，A.l.1991 J.Orthop.Res.9：641-650；Beresford，J.N.，等，1992 J.Cell Sci.102：341-351；Berry，L.，等，1992 J.Cell Sci.101：333-342；Ferrari，G.，等，1998 Science 279：1528-1530；Johnstone，B.，等，1998 Exp.Cell Res.238：265-272；Pittenger，M.F.，等，1999 Science 284：143-147)。这种多谱系潜力在临床上可用于修复复杂的创伤后缺损和先天性缺损。事实上，一些体外和体内的研究表明了这些干细胞的临床潜力(Benayahu，D.，等，1989 J.Cell Physiol.140：1-7；Wakitani，S.，等，1995 MuscleNerve 18：1417-1426；Krebsbach，P.H.，等，1997 Transplantation 63：1059-1069；Bruder，S.P.，等，1998 Clin.Orthop.(355 Suppl)：S247-56；Johnstone，B.，和Yoo，J.U.1999 Clin.Orthop.(367 Suppl)：S156-62)。然而，骨髓的获取疼痛，需要全身性麻醉且处理时产生的间充质干细胞数目小(Pittenger，M.F.，等，1999Science 284：143-147；Rickard，DJ，等，1996 J.Bone Miner.Res.11：312-324；Bruder，SP，等，1997 J.Cell.Biochem.64：278-294)，因此在临床使用前需要一个离体增殖步骤。根据这些因素，多谱系干细胞的其它来源是令人期望的。我们鉴定了吸脂的人脂肪组织的基质血管组分中的干细胞群体(实施例7，参见上文)。该细胞群体称为处理的脂肪吸出物(PLA)，且在许多方面表现出相似于骨髓衍生的间充质干细胞。与间充质干细胞一样，PLA细胞在长期培养中稳定，容易体外增殖且具有分化成脂肪形成，成骨，肌源性和软骨形成细胞的多谱系潜力。
PLA细胞具有成纤维细胞样形态，在体外稳定增殖且以53小时的平均群体倍增时间增殖。以前的研究表明脂肪组织内的脂肪细胞的大小和数目随年龄而增加(Hauner，H.等，1987 J.Clin.Endocrinol.Metabol.64：832-835)，表明随着年龄的增长脂肪形成和脂肪贮存总体上增加。与这些研究相反，我们没有观察到PLA细胞的脂肪形成有明显的年龄相关性改变，表明老年人的PLA细胞的脂肪形成潜力不受年龄增长的影响。脂肪组织的发育需要一些生长因子和类固醇激素的活性(Hauner，H.等，1987 J.Clin.Endocrinol.Metabol.64：832-835)。因此，PLA细胞的脂肪形成潜力受到各供体内遗传背景和/或激素水平的影响。Proenza，等报道了通过改变包括脂蛋白脂肪酶，肾上腺素受体和解偶联蛋白的一些基因的表达可影响脂肪形成(Rickard，DJ，等，1996 J.Bone Miner.Res.11：312-324；Glowacki J.1995 Calcif.Tiss.Int.56 (Suppl1)：S50-51)。另外，Chen等表明在脂肪前体细胞中特异性肥胖相关性基因的表达与这些细胞分化成成熟脂肪细胞相关(Chen，X.，等，1997 Biochim.Biophys.1359：136-142)。因此，基因表达水平以及激素活性可随供体不同而不同，它影响PLA细胞的脂肪形成潜力并产生不同的脂肪形成水平，而与供体年龄无关。
与脂肪形成相反，观察到PLA的成骨潜力(通过AP活性测量)随着供体年龄增长而减小。回归分析发现了骨生成与供体年龄之间的明显负相关(r＝-0.70)。另外，当供体分成两个年龄组(20至36岁和37至58岁)时观察到骨生成的显著差异，来自年轻年龄组的细胞具有超过2倍的更大成骨潜力。
骨生成由三个时期确定：成骨前体细胞的增殖，这些前体细胞成熟为成骨细胞(伴随着基质沉积)和矿化期。每个时期都是必需的且可显著影响成熟骨骼的形成。在老年供体中观察到的骨生成减小可能是因为三种可能性：1)PLA细胞增殖减少，2)PLA-衍生的成骨前体细胞本身的数目减少或者3)成骨分化能力下降。如图8所示，在老年供体中PLA的群体倍增时间略有增加，表明老年PLA细胞的增殖能力随年龄而减小。然而，这种群体倍增时间的增加在统计学上不显著且很可能对成骨潜力的年龄依赖型减小无贡献。
为了确定我们的结果是否由PLA内成骨前体细胞数目的减少引起，测定了CFU/AP+集落的平均数。具有AP活性的集落认为是骨原细胞且以前用于测定骨髓中成骨前体细胞和/或干细胞的数目(Owen，TA，等，1990 J.CellPhysiol.143：420-430)。尽管动物研究表明骨髓中骨原细胞的数目随着年龄增长而减少(Bergman RJ，等，1996 J.Bone Miner.Res.11：568-577；Huibregtse，BA，等，2000 J.Orthop.Res.18：18-24))，而对于人类样品报导了不一致的结果。Glowacki和Rickard等的工作表明骨髓的骨原细胞无年龄相关性改变(Rickard，DJ，等，1996 J.Bone Miner.Res.11：312-324；Glowacki，J.1995 Calcif.Tiss.Int.56(Suppl 1)：S50-51))。与这些研究一致，我们发现CFU/AP+集落的数目随年龄有小而统计学上不显著的改变。这表明观察到的成骨潜力的年龄依赖型减小可能不是由PLA内成骨前体细胞和/或干细胞的数目下降引起。
PLA骨生成的减少可能是由成骨能力的丧失引起。一些因素可影响干细胞的成骨能力，包括：1.)细胞-细胞和细胞-基质的相互作用；和2.)生长因子和激素。Becerra等最近的研究证实老年间充质干细胞与大鼠去矿化骨基质的成骨反应显著减小(Becerra，J.，等，1996 J.Bone Miner.Res.11：1703-1714)，显示了MSC-基质相互作用的年龄相关性改变。同样，老年供体中成骨潜力的减小与细胞外基质的降解相关(Bailey，AJ，等，1999 Calcif.Tiss.Int.65：203-210)。PLA细胞周围的微环境可随年龄的增长而改变，它改变细胞-细胞和细胞-细胞外基质的相互作用，可抑制PLA细胞的成骨分化或者有利于它们分化成另一谱系(例如，脂肪形成谱系)。此外，PLA细胞的成骨潜力减小可能是由性别引起。本研究中的所有供体都是女性。公知的是女性的老化伴随着雌激素的丢失，与骨骼质量的减小相联系(Parfitt，AM 1990，参见 Bone，BK Hall编，Vol.1，351-431，New Jersey：Caldwell；Hahn，TJ 1993，参见 Textbook of Rheumatology，WN Kelly编，1593-1627，New York：Saunders)。由于骨细胞不增殖，因此骨改型和修复需要持续供给成骨细胞，其主要来源是骨髓基质。已知雌激素调节骨髓衍生的干细胞的分化，且循环雌激素水平降低与干细胞成骨潜力的丧失有关(Robinson，JA，等，1997Endocrinology 138：2919-2927；Ankrom，MA，等，1998 Biochem.J.333：787-794)。相似于骨髓干细胞，老年女性供体中PLA细胞的成骨能力的丧失可能仅仅反映了与雌激素丢失相关的改变。有可能PLA成骨潜力的下降可能是由于上述所有三种因素相当小的改变，它反映了在老年妇女中观察到的普遍现象。
成骨细胞数和骨形成活性的下降与骨髓腔脂肪形成的增加相联系，并对II型或年龄相关性骨质疏松症负责(Parfitt，AM 1990，参见 Bone，BK Hall编，Vol.1，351-431，New Jersey：Caldwell；Hahn，TJ 1993参见 Textbook of Rheumatology，WN Kelly编，1593-1627，New York：Saunders)。尽管目前的研究集中在骨髓衍生的间充质干细胞在骨质疏松症中的作用，然而脂肪衍生的PLA细胞的成骨能力的年龄相关性损失可为研究人员提供研究该疾病的另一种模型系统。另外，PLA细胞可提供用于治疗骨质疏松症和其它代谢性骨疾病的另一种基于活细胞的治疗范例。
干细胞的组织工程应用的用途受到干细胞数量，生长动力学和分化潜力的显著影响。这些因素中的每一种又受到供体年龄的影响。对骨髓衍生的间充质干细胞的一些研究报导了动物和人类模型中MSC数目，群体倍增和分化潜力随供体年龄的改变(Lansdorp，P.M.，等，1994 Blood Cells 20：376-380；Becerra，J.，等，1996 J.Bone Miner.Res.11：1703-1714；Bergman，R.J.，等，1996 J.Bone Miner.Res.11：568-77；Gazit，D.，等，1998 J.Cell Biochem.70：478-88；Oreffo，R.O.，等，1998 Clin.Sci(Colch.)94：549-555；D-Ippoliot，G.，等，1999 J.Bone Miner.Res.14：1115-1122；Long，M.W.，等，1999 J.Gerontol.A.Biol.Sci.Med.Soc.54：B54-62；Huibregtse，B.A.，等，2000 J.Orthop.Res.18：18-24)。我们通过测定相对于供体年龄的群体倍增，分化潜力和平均集落形成单位数鉴定了一些PLA群体。
实施例9
下面的描述提供了分化成软骨形成组织的脂肪衍生的干细胞，和分离所述干细胞的方法。
材料和方法：
试剂和抗体：
醋酸钠，牛血清白蛋白(BSA)，N-乙基马来酰亚胺(NEM)，6-氨基己酸，苯甲基磺酰氟(PMSF)，和盐酸苯甲脒均从Sigma(St.Louis，MO)购买。抗II型胶原蛋白(克隆II-4C11)，软骨素-4-硫酸，和硫酸角质素(克隆5-D-4)的单克隆抗体从ICN Biomedical(Aurora，Ohio)购买。
脂肪吸出物处理：
人吸脂的吸出物从年龄范围为20-55岁的10个健康的选择美容手术的患者获得，并处理以获得处理的脂肪吸出物(PLA)细胞群体。所有操作以协议号HSPC#98-08-011-02得到人类受试者保护委员会(HSPC)的批准。根据上文实施例7所述的方法处理粗制的脂肪吸出物。简单地说，将脂肪吸出物在磷酸盐缓冲液(PBS)中充分洗涤，然后用0.075％的胶原酶(Sigma，St.Louis，MO)在37℃下轻轻搅拌温育30分钟。通过加入等体积的Dulbecco′s改良的Eagle培养基(DMEM，Cellgro，Herndon，VA)和FBS中和胶原酶，细胞悬液以260g离心5分钟。所得的细胞沉淀重悬于1％的红细胞裂解缓冲液(0.16MNH4Cl)中以裂解污染的红细胞。该细胞悬液以260g离心5分钟以分离PLA组分。将PLA沉淀重悬于对照培养基(DMEM，10％FBS，和1％抗生素-抗真菌剂)中并在37℃，5％CO2中维持在亚汇合浓度。人包皮成纤维细胞(HFFs)同样用胶原酶通过酶促消化收获并在对照培养基中维持在亚汇合水平。
软骨形成分化
培养物增殖到第3代(P3)后，胰酶消化PLA细胞并以107个细胞/ml的浓度重悬于对照培养基中。使用略有改良的以前描述的微量培养技术(Ahrens，PB，等，1977 Dev.Biol.60：69-82；Denker，AE 1995 Differentiation 59：25-34)诱导软骨形成分化。将10微升小滴的PLA细胞悬液放在24-孔组织培养板各孔的中央并放在分室载玻片上。细胞放在培养箱中在37℃，5％CO2下2小时允许细胞贴壁。细胞团用对照培养基轻轻覆盖并培养过夜。用软骨形成培养基[含1％FBS的DMEM，添加有10ng/ml TGF-β1(R & D Systems，Minneapolis，MN)，6.25μg/ml胰岛素(Sigma)，和6.25μg/ml运铁蛋白(Sigma)]更换培养基。细胞团在软骨形成培养基中诱导6天。在第6天和随后，向软骨形成培养基混合物中加入50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸(Sigma)。在开始诱导后的第2，7，和14天时收获PLA细胞团用于分析。为了鉴定诱导软骨形成分化的最佳培养条件，PLA细胞也用单独0.1μM浓度的地塞米松(Sigma)与TGF-β1结合诱导。HFF细胞按上述在微量和单层条件下培养作为阴性对照。以单层培养物培养的PLA细胞不能形成三维结节且不能用于石蜡包埋和组织学及免疫组织学分析。
差别细胞密度平板接种：
为了评估软骨形成诱导与PLA细胞的关系，在软骨形成培养基中以每毫升1×105，1×106，2.5×106，5×106，1×107，2×107，和5×107个细胞(细胞/ml)的细胞浓度平板接种微量培养物。然后使微量培养物处于软骨形成培养条件中并关注结节形成的起始。
阿尔新蓝染色：
为了检测作为软骨基质特征的高度硫酸化蛋白聚糖的存在，使用阿尔新蓝在酸性pH下染色诱导的PLA细胞团(Lev，R和S Spicer 1964 J.HistochemCytochem.12：309)。微量培养物周含有4％低聚甲醛的PBS固定15分钟，接着在0.1N HCl中温育5分钟将pH降低到1。培养物用含1％阿尔新蓝8GX(Sigma)的0.1N HCl(pH1)染色过夜。细胞用0.1N HCl洗涤两次以去掉非特异性染色，然后空气干燥。为了进行石蜡切片，收获细胞结节，在PBS中洗涤两次并在4％低聚甲醛中固定1小时。将结节包埋于石蜡中并切成5微米切片。PLA结节的石蜡切片按所述制备并用标准阿尔新蓝染色法在pH1下染色以确定结节三维结构内硫酸化蛋白聚糖的空间分布。用Zeiss Axioskop II显微镜(Carl Zeiss，Munich，Germany)和Spot软件获取数字图像。
组织学和免疫组织化学：
使用标准苏木精和伊红(H & E)测定细胞形态和Goldner′s三色染料检测细胞外基质中存在的胶原蛋白来进行PLA石蜡切片的组织学评估。为了进行免疫组织化学，石蜡切片首先在二甲苯中脱蜡，然后在浓度递减的乙醇溶液(100％到70％)中水合。为了帮助抗体接近表位，将切片在0.5ml含软骨素酶ABC(Sigma)的50mM Tris(Gibco BRL)，pH8.0，含0.5mg/ml BSA，10mM NEM的30mM醋酸钠中37℃下预消化1小时。切片在3％H2O2中温育15分钟以终止内源性过氧化物酶活性，接着在10％马血清中温育以封闭非特异性结合。随后用稀释度分别为1∶10，1∶50，和1∶250的抗人II型胶原蛋白，软骨素-4-硫酸，和硫酸角质素的第一抗体37℃下温育切片1小时。以正常马血清代替单克隆抗体进行温育用作阴性对照。用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)按照厂商建议检测反应性。
cDNA合成和RT-PCR：
从未处理的PLA细胞，PLA结节，和HFFs分离总RNA。简单地说，使用下面的方法(RNA-Easy，Qiagen)分离RNA。用该RNA以及MMLV-RT酶(Promega)进行oligo dT-引发的cDNA合成。使用针对：人I型胶原蛋白α1链(CNI)，人II型胶原蛋白α1链(CNII)，人X型胶原蛋白α1链(CN X)，人大量聚集的蛋白聚糖或聚集蛋白聚糖(AG)和人骨钙蛋白(OC)设计的引物对进行等量cDNA的PCR扩增。使用的引物对从公开的GeneBank序列(表4)获得且序列如下：
                       表4：
基因 登录号# 引物#1 引物#2 预期产物大小
CNI NM_000088 5’-CAT CTC CCCTTC GTT TTT GA-3’ 5’-CTG TGG AGG AGGGTT TCA GA-3’ 598bp
CNII 已公开(148) 5’-CTG CTC GTCGCC GCT GTCCTT-3’ 5’-AAG GGT CCC AGGTTC TCC ATC-3’ IIA*：432bpIIA*：225bp
NX NM_000493 5’-TGG AGT GGGAAA AAG AGGTG-3’ 5’-GTC CTC CAA CTCCAG GAT CA-3’ 601bp
AG X17406 5’-GCA GAG ACGCAT CTA GAAATTG-3’ 5’-GGT AAT TGC AGGGAA CAT CAT T-3’ 504bp
OC X04143 5’-GCT CTA GAATGG CCC TCACAC TC-3’ 5’-GCG ATA TCC TAGACC GGG CCG TAG-3’ 310bp
*IIA型胶原蛋白接头-前体软骨细胞和间充质软骨细胞前体；IIB型-成熟软骨细胞(148)。
在关节软骨样品中证实II型胶原蛋白，X型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的引物对为阳性对照。每一引物对使用经计算的最佳退火温度(OLIGO引物分析软件，National Biosciences Inc.，Plymouth，MN)。模板扩增35个循环并使用常规琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
传代对PLA细胞的软骨形成潜力的影响
为了检查多次细胞传代对人PLA细胞的软骨形成潜力的影响，将单层培养物传代15次，在第一次，第三次和第15次传代时获取细胞组分。将细胞组分放入在软骨形成培养基中生长的微量培养物中并通过阿尔新蓝染色评估软骨形成分化。
PLA克隆分离
将新分离的PLA细胞以每100mm2组织培养皿100个细胞的密度进行平板接种以启动从单个细胞形成集落。培养物在对照培养基中增殖直到出现清楚的集落。使用无菌克隆环分离从单个PLA细胞产生的集落，然后用0.25％的胰蛋白酶消化收获。将分离的细胞接种进24-孔平板并增殖。按上述将PLA克隆向软骨形成谱系诱导并通过阿尔新蓝染色和II型胶原蛋白免疫组织化学证实软骨形成分化。
结果：
处理人脂肪吸出物以获得PLA细胞群体。将PLA放入添加了TGF-β1，胰岛素，运铁蛋白，和抗坏血酸的高密度微量培养物中以诱导软骨形成分化。使用标准组织学试验在2，7，和14天时通过组织学评估软骨形成。另外，用抗II型胶原蛋白，软骨素-4-硫酸，和硫酸角质素的抗体进行免疫组织化学。最后，进行RT-PCR分析以证实I型，II型，和X型胶原蛋白以及软骨特异性蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖的表达。
所有TGF-β1-处理的微量培养物在诱导48小时内形成三维球状体，用阿尔新蓝染色为阳性，表明形成软骨结节。免疫组织化学证实在结节的整个细胞外基质中存在II型胶原蛋白，软骨素-4-硫酸，和硫酸角质素。最后，RT-PCR分析证实了软骨特异性II型胶原蛋白，聚集蛋白聚糖，和软骨特异性蛋白聚糖的表达。
PLA细胞形成软骨形成结节
使用高密度微量培养技术，随后用促软骨形成因子诱导可将软骨前体间充质细胞和多谱系干细胞向软骨形成谱系诱导(Ahrens，PB，等，1977 Dev.Biol.60：69-82；Denker，AE，等，1995 Differentiation 59：25-34；Johnstone，B，等，1998 Exp.Cell Res.238：265-272)。与这些研究一致，在高密度微量条件下培养并用含有转化生长因子β1(TGF-β1)，胰岛素，和运铁蛋白的软骨形成培养基诱导的人处理的脂肪吸出物(PLA)细胞早在诱导后24小时时浓缩成三维球状体。在该时间期间，PLA结节裸眼观察为白色，圆形结构，直径测量为约1-2mm。在超过500个处理的微量培养物中100％形成结节。在未处理的微量培养物中偶尔(10％)形成小球状体且可能是培养条件本身的影响。在TGF-β1-处理或未处理的PLA单层培养物中没有观察到PLA结节。PLA结节的大小随培养时间而变大且在培养7天后在显微镜下观察到较小的相邻结节。在一些情况下，相邻的PLA结节随培养时间的延长而融合成更大的细胞聚集体且与提出的细胞相互作用和软骨形成所必需的募集反应一致(Ahrens，PB，等，1977 Dev.Biol.60：69-82)。
为了评估细胞数对PLA结节形成的影响，进行差别平板接种试验。在以不超过5×106个细胞/ml的密度平板接种的培养物中没有发现球状体形成的证据。以递增密度(即，超过1×107个细胞/ml)平板接种的PLA细胞更迅速地进行结节形成，且在某些情况下，更有可能在TGF-β1不存在的条件下进行球状体形成。向含有TGF-β1的软骨形成培养基中添加地塞米松显示出导致形成更大的软骨聚集体(Johnstone，B.，等，1998 Exp.Cell Res.238：265-272)。与此一致，与用TGF-β1刺激形成的结节相比添加地塞米松产生更大的球状体。单独用地塞米松处理的培养物不形成结节，表明TGF-β1对于PLA细胞的结节形成是决定性的。最后，在用软骨形成培养基处理的微量和单层HFF培养物中没有观察到结节形成的证据，证实了我们的软骨形成条件的特异性。
PLA结节含有硫酸蛋白聚糖丰富的细胞外基质
软骨基质含有极高数量的多阴离子硫酸化糖胺聚糖(GAGs)，例如，软骨素4-和6-硫酸，且通过用阿尔新蓝在低pH下阳性染色的能力来鉴定(R Lev和S Spicer 1964 J.Histochem.Cytochem.12：309)。为了证实PLA结节的软骨特性，对整体封固的平板接种在分室载玻片上的PLA结节和石蜡切片进行组织学分析。用软骨形成培养基开始处理PLA培养物导致在24小时内发生细胞缩合(图12，A组)。缩合的PLA细胞表现出低水平的阿尔新蓝染色，表明开始形成硫酸化细胞外基质。PLA缩合后形成嵴且阿尔新蓝染色增强，表明基质分泌增加(B组)。诱导后48小时后观察到强阿尔新蓝染色和球状体形成(C组)。相反，在微量培养物中未处理的PLA细胞不显示任何阳性阿尔新蓝染色区域(D组)。
除了整体封固的PLA样品外，制备PLA结节的石蜡切片以评估结节的三维结构。以苏木精和伊红染色分析的石蜡包埋的切片的形态学显示出在诱导后2天时围绕圆形细胞的内部核心有一个类似于软骨膜细胞的成纤维细胞样细胞的扁平外周层(图13，A组)。处理14天后，随着进入核心的细胞外基质沉积物的增加结节细胞减少更多(B组)。显示胶原蛋白基质存在(绿色)的Goldner′s三色染色证实了H & E染色模式(C和D组)。与在诱导后14天时结节核心中发现的更高水平的胶原蛋白(D组)相比，在2天时在结节切片中观察到微弱背景水平的胶原蛋白基质(C组)。石蜡切片的阿尔新蓝染色与整体封固的样品相似，证实了诱导2天后形成富含硫酸化蛋白聚糖的软骨基质(E组)。在诱导后14天时观察到中央核心区的染色强度增加(F组)，表明随着沿软骨细胞途径的细胞成熟，硫酸化蛋白聚糖的分泌增加。总之，我们的组织学染色结果证实形成与富含胶原蛋白和硫酸化蛋白聚糖的细胞外基质相关的软骨样PLA结节。
PLA结节表达软骨特异性蛋白：
使用免疫组织化学分析检测软骨组织高度特异性的细胞外基质成份II型胶原蛋白，和软骨蛋白聚糖的两种主要单体成份软骨素-4-硫酸和硫酸角质素的存在。诱导两天后，沿球状体的外周和在整个核心区可见与软骨素-4-硫酸和硫酸角质素有强免疫反应的区域且证实了我们的阿尔新蓝染色结果(图14，A和C组)。在两周的过程中注意到结节核心内软骨素-4-硫酸和硫酸角质素的表达明显增强(B和D组)。相反，在第二天在PLA结节中阳性II型胶原蛋白免疫反应性不明显(E组)。另外，在诱导后的第7天出现II型胶原蛋白表达，在第14天出现强表达(F组)。整体封固的TGF-β1-处理的PLA微量培养物也显示出强烈的II型胶原蛋白反应性，而未处理的微量PLA培养物显示无染色。另外，在正常马血清代替第一单克隆抗体温育的石蜡切片中观察到无染色，证实了II型胶原蛋白，软骨素-4-硫酸和硫酸角质素抗体的特异性。综合起来，免疫组织化学的结果支持组织学染色数据且表明在PLA结节中存在软骨基质。
单细胞衍生的克隆群体的软置形成分化：
PLA细胞的明显软骨形成分化可能由前体软骨形成细胞污染脂肪吸出物而不是由多能细胞的存在引起。因此，为了确定我们的结果是否由多能PLA细胞的分化引起，我们分离并证实了单细胞衍生的PLA克隆的多谱系潜力。证实了PLA的克隆群体(即脂肪衍生的中胚层干细胞或ADSCs)除了进行成骨和生脂分化外还有进行软骨形成分化的能力。诱导向成骨和脂肪形成谱系的PLA克隆群体展现出典型的谱系特异性组织学标记(碱性磷酸酶活性-骨生成；油红-O积累-脂肪形成)(数据未公开)。类似于异源PLA培养物，PLA克隆群体在软骨形成培养基中诱导48小时内也进行球状体形成。另外，PLA结节分泌富含II型胶原蛋白和高度硫酸化蛋白聚糖的细胞外基质。
延期培养后PLA细胞保留软骨形成潜力：
培养时间和传代次数可影响许多细胞类型的分化能力。为了评估传代对PLA细胞的软骨形成潜力的影响，将PLA细胞以单层培养物传代多达15次(培养175天)并在高密度条件下培养以诱导软骨形成。PLA细胞以其用软骨形成培养基诱导后形成三维球状体的能力证实在其整个延长培养期间保留其软骨形成分化潜力。最后，用阿尔新蓝染色阳性证实了早期和晚期传代的PLA结节都分泌富含高度硫酸化蛋白聚糖的细胞外基质(图22)。来自所有传代培养物(即P1至P15)的细胞结节具有极相似的外观：围绕圆形细胞的内部核心有一个类似于软骨膜的成纤维细胞样细胞的扁平外周层。
RT-PCR分析证实表达软骨特异性胶原蛋白：
使用对人I型胶原蛋白，II型胶原蛋白，和X型胶原蛋白，以及聚集蛋白聚糖和骨钙蛋白基因特异性的引物进行PLA结节的RT-PCR分析。分析在微量条件下培养的未处理的HFF和人PLA细胞作为阴性对照。PLA结节的RT-PCR分析证实仅在第7天和第14天表达II型胶原蛋白α1(CN II)(图15)。而且，在诱导7和14天之间观察到CN II表达减少。在两个时间点都观察到CN II的两个剪接变异体(IIA和IIB-显示了IIB型变异体)。
与第7天和第14天的结节相反，在第2天的结节中没有观察到CN II表达，证实了我们的免疫组织化学数据。正如预期，在HFF微量培养物中没有观察到CN II。然而，在未处理的PLA细胞中存在小量CN II mRNA。通过检查结节中大量聚集的蛋白聚糖，或聚集蛋白聚糖的表达进一步证实了软骨形成分化。表明聚集蛋白聚糖为软骨特异性并在软骨形成期间开始时积聚(Kosher，RA，等，1986 J.Cell Biol.102：1151-1156)。聚集蛋白聚糖的表达在诱导2和7天时都可观察到而在14天的PLA结节中不存在。聚集蛋白聚糖表达对处理的PLA结节具有特异性，因为在对照PLA细胞或HFF培养物中发现无表达。
通过评估I型和X型胶原蛋白的α1链的表达进行PLA结节的进一步鉴定。已知在骨组织中I型胶原蛋白表达上调且在软骨形成分化期间下调(Kosher，RA，等，1986 J.Cell Biol.102：1151-1156；Shukunami，C.，等，1998 Exp.Cell Res.241：1-11)。与此一致，仅在处理2天的PLA结节中观察到CN I表达。与CN II相似，在未处理的PLA细胞中观察到低水平的CN I，表明未分化的PLA细胞与胶原蛋白基质相关，该基质随着分化进行明显改型。在诱导后2天和7天时在PLA结节中没有观察到CN X表达但在第14天的时间点出现表达。在未处理的PLA细胞或HFF对照中没有观察到CN X。X型胶原蛋白为肥大软骨细胞特异性且可传导信号向软骨内骨化和骨形成进展(Linsenmayer，TF，等，1988 Pathol.Immunopathol.Res.7：14)。
为了证实PLA结节内不存在骨化和骨形成，使用骨特异性基因骨钙蛋白的引物进行RT-PCR分析(Price PA 1989 Connect.Tissue Res.21：51-57)。正如预期，在所有处理和未处理的PLA样品中不存在骨钙蛋白表达。综合起来，软骨特异性聚集蛋白聚糖，II型和X型胶原蛋白的表达，与I型胶原蛋白的表达减少一起证实了PLA细胞的软骨形成分化。
讨论
软骨缺陷的修复存在重大临床挑战。损伤的关节软骨具有有限的修复潜力且大型缺陷不能自发愈合。当损伤扩展到软骨下骨骼时，修复过程分散且原始关节软骨被纤维软骨和瘢痕组织替代，它们在结构上次于正常关节软骨的透明结构。
软骨缺损的常规处理形式包括骨髓刺激技术(例如，软骨下钻孔)和关节成形术(IH Beiser和OI Knat 1990 J.Foot Surg.29：595-601；Gilbert，JE 1998Am.J.Knee Surg.11：42-46；T Minas和S Nehrer 1997 Orthopedics 20：525-538；O′Driscoll，SW 1998 J.Bone Joint Surg.Am.80：1795-1812)。最近，开发了更新的方案，例如使用骨软骨，软骨膜，和骨膜同种移植物(Bouwmeester，SJ，等，1997 Int.Orthop.21：313-317；Carranza-Bencano，A，等，1999 Calcif.Tissue Int.65：402-407；Ghazavi，MT，等，1997 J.Bone Joint Surg.Br.79：1008-1013；Homminga，GN，等，1990 J.Bone Joint Surg.Br.72：1003-1007)。不幸的是，这些选择不能导致原始透明结构的完全再生。更重要的是，在长期时间内关节不能正常负重和进行身体活动。
基于细胞的组织工程策略为常规技术提供了一种有希望的选择。临床上通常采用的第一代组织工程策略是使用自体软骨细胞移植(Brittberg，M.，等，1994 New Engl.J.Med.331：889-95；Chen，FS，等，1997 Am.J.Orthop.26：396-406；Gilbert JE 1998 Am.J.Knee Surg.11：42-46；Richardson JB，等，1999J.Bone Joint Surg.Br.81：1064-1068)。然而，收获软骨细胞的供体位点可用性有限，需要漫长的体外培养增殖，和供体位点的发病限制了该技术的实用性。因此鉴定软骨细胞前体的其它来源是重要的。
已表明一些细胞类型进行体外和体内软骨形成，包括大鼠颅盖克隆细胞系和原代细胞，鼠胚胎C3H10T1/2细胞，和来自包括兔，大鼠，马，和山羊的一些动物的骨膜衍生的和骨髓衍生的前体细胞(Denker，AE，等，1995Differentiation 59：25-34；Fortier，LA，等，1998 Am J.Vet.Res.59：1182-1187；Grigoriadis，等，1996 Differentiaion 60：299-307；Grigoriadis，等，1988 J.Cell.Biol.106：2139-2151；Iwasaki，等，1995 J.Bone Joint Surg.Am.77：543-554；Johnstone，等，1998 Exp.Cell Res.238：265-272；Nakahara，等，1990 Bone 11：181-188；Shukunami，等，1996 J.Cell.Biol.133：457-468)。然而，仍然存在大量潜在的来自其它组织类型的骨软骨原前体贮备有待研究。在许多研究中报导了各种中胚层细胞类型的相互转变能力。具体地说，成熟人脂肪细胞和从骨髓分离的脂肪细胞都表现出分化成骨骼的潜力(Bennett，JH，等，1991 J.Cell Sci.99(Ptl)：131-139；Park，等，1999 Bone 24：549-554)。另外，成骨细胞转分化成软骨细胞且肌肉细胞能够定向软骨谱系(Manduca，等，1992 Eur.J.Cell Biol.57：193-201；Nathanson，MA 1985 Clin.Orthop.200：142-158；Sampath，等，1984 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3419-3423)。
在人骨髓中存在能够进行骨软骨形成分化的间充质干细胞已有充分报导(Mackay，等，1998 Tissue Eng.4：414-428；Pittinger，等，1999 Science 284：143-147；Yoo，等，1998 J.Bone Joint Surg.Am.80：1745-1757)。使用间充质干细胞的一些优势包括其在培养物中迅速增殖的能力，即使在多次传代后其分化成软骨形成细胞的能力，其再生能力，和所得的软骨形成细胞类型(即，软骨细胞前体，成熟软骨细胞，和肥大软骨细胞)范围广泛。研究人员预期干细胞衍生的分化软骨形成组织更接近于在发育的胚胎肢芽中所见的组织。另外，软骨细胞在培养物中增殖不充分，难以维持，且在单层培养物中增殖时脱分化(von der Mark，等，1977 Nature 267：531-532)。在组织工程中使用自体干细胞代替收获的软骨细胞在将来治疗软骨缺陷中可能是一种更有效的选择。不幸的是，供体位点可用性有限且与骨髓获取相关的不适和疼痛仍然是一个问题。
脂肪组织中存在能够分化成几种间充质组织的多能细胞群体可能是一个重要发现。脂肪组织可大量获取且相对容易获得。另外，吸脂操作具有最小的供体位点发病率和患者不适性。由于作为细胞来源的这些实际优势，我们寻求确定PLA细胞是否与骨髓和骨膜衍生的间充质干细胞一样代表具有进行软骨形成分化能力的细胞群体。
我们证实了多谱系人处理的脂肪吸出物(PLA)细胞的软骨形成潜力。在高密度微量培养物中用TGF-β1处理人PLA细胞导致形成具有软骨特征的三维细胞结节。下面几个发现支持该分化细胞的软骨形成特性：1)整体封固的PLA结节和组织学切片用阿尔新蓝染色为阳性，2)H & E形态学揭示围绕细胞减少的软骨形成核心有一个细胞软骨膜边界，3)Goldner′s三色染色显示出富含胶原蛋白的细胞外基质，4)免疫组织化学证实表达II型胶原蛋白，软骨素-4-硫酸，和硫酸角质素，和5)RT-PCR显示表达II型胶原蛋白以及软骨特异性聚集蛋白聚糖。
体内软骨发育的一个最早特征是形成细胞缩合体以提供骨骼原基(primordia)。软骨最初在这些缩合体的中央分化，接着是一个细胞分泌并被特征性细胞外基质包围的时期。与这些情况相似，体外软骨形成分化的特征在于形成称为球状体或结节的多层细胞聚集体。最初的结节形成后，接着是形成脊，基质积聚和相邻细胞的募集，导致原始结节扩大(Ahrens，等，1977Dev.Biol.60：69-82；Denker，等，1995 Differentiation 59：25-34；Stott，等，1999J.Cell Physiol.180：314-324；Tacchetti，等，1992 Exp.Cell Res.200：26-33；Tavella，等，1994 Exp.Cell Res.215：354-362)。与这些研究一致，PLA细胞在用含有TGF-β1的软骨形成培养基诱导24小时内开始缩合并在诱导后48小时为止形成清楚的三维球状体。在软骨形成培养基中处理培养物更长时间后，发现除了最初的软骨结节外还出现较小的相邻结节，表明存在成熟中的软骨结节通过可能的旁分泌生长因子信号进行进一步的软骨形成诱导。仅在以高于5×106个细胞/ml的细胞密度平板接种的微量培养物中有明显的PLA结节形成，与以前描述软骨形成需要高细胞密度的研究一致(Rodgers，等，1989 Cell Differ.Dev.28：179-187；Tsonis和Goetinck 1990 Exp.Cell Res.190：247-253)。
软骨由胶原蛋白纤维和蛋白聚糖的混合物组成，它们给组织提供高度抗张强度和内部溶胀压力。软骨中的主要胶原蛋白是II型胶原蛋白。尽管该胶原蛋白不是软骨特异性的，但它是该组织的重要特征，因为II型胶原蛋白由数目有限的非软骨形成细胞类型产生。使用一般对胶原蛋白特异性的Goldner三色染料阳性染色证实用软骨形成培养基诱导2天和14天后PLA结节内都有这些蛋白质。具体地说，用TGF-β1处理48小时的PLA结节与细胞外基质含有低水平的II型胶原蛋白相关联，表明PLA细胞进行初步软骨形成分化。II型胶原蛋白水平表现出随诱导时间而增加。除了II型胶原蛋白外，软骨基质还含有高水平的硫酸化GAGs，例如一般与诸如聚集蛋白聚糖的蛋白聚糖相关的软骨素-4-和-6-硫酸。与此一致，用阿尔新蓝进行的组织学染色证实早在诱导24小时时就存在硫酸化蛋白聚糖，并随着PLA结节变得更清楚(即，2天)而增加。在诱导14天之久也观察到增强的阿尔新蓝染色，位于结节核心并围绕单个的细胞。用对硫酸角质素和硫酸软骨素特异性的抗体染色结节时也观察到相似的结果证实及免疫组织化学研究证实存在这些成份，进一步支持在PLA结节内存在软骨形成细胞。
作为对我们的免疫组织化学结果的支持，RT-PCR分析也证实了在诱导7和14天的PLA结节中表达CN II，在第14天时观察到的该基因水平较低。在用软骨形成培养基诱导48小时后观察到无CN II表达。在PLA结节中CNII的表达是软骨形成表型的证据。我们的免疫组织化学结果表明在诱导的PLA结节中特异性地存在明显水平的硫酸软骨素和硫酸角质素。已知软骨素-4-和-6-硫酸是软骨特异性蛋白，即聚集蛋白聚糖的主要单体成份(Hall，BK1981 Histochem.J.13：599-614)。已表明聚集蛋白聚糖是软骨特异性的且在开始明显的软骨形成时积聚，与细胞缩合同步(Kosher，等，1986J.Cell Biol.102：1151-1156)。
我们通过评估聚集蛋白聚糖的表达证实了PLA结节的软骨形成特性。如图22所示，聚集蛋白聚糖的表达方式与第7天时的CN II重叠。另外，聚集蛋白聚糖的表达在CN II表达之前。然而，与CN II相反，在诱导14天的PLA结节中没有观察到聚集蛋白聚糖。聚集蛋白聚糖是软骨特异性蛋白，它由含有硫酸化蛋白聚糖结合位点的多结构域蛋白核心组成(Hardinghamn，等，1984 Prog.Clin.Biol.Res.151：17-29)。针对C-末端设计在该试验中用于检测聚集蛋白聚糖的引物，它含有G3球形结构域，即一种进行选择性剪接的位点，且在成熟软骨中经蛋白水解被裂解(Fulop，等，1993 J.Biol Chem.268：17377-17383)。因此在第14天的PLA结节中不存在聚集蛋白聚糖可能表示存在缺少C-末端的聚集蛋白聚糖的另一剪接形式。然而，使用针对N-末端设计的引物进行RT-PCR时在第14天也没有观察到聚集蛋白聚糖，表明在用软骨形成培养基诱导2周后聚集蛋白聚糖不再表达。
除了聚集蛋白聚糖和CN II外，PLA结节在不同时间点表达I型和X型胶原蛋白。第2天的PLA结节具有同时表达CN I和CN II的特征。然而，与聚集蛋白聚糖和CN II相反，CN I的表达方式受到极大限制并且在2天时间点以外不出现。令人感兴趣的是，在未处理的PLA对照细胞中同时观察到低水平的CN I和CN II。与此一致，在许多发育中的胚胎组织中同时发现I型和II型胶原蛋白mRNA且在软骨形成分化前在软骨前体间充质前体中可检测到基础水平的这些胶原蛋白亚型(Lisenmeyer，等，1973 Dev.Biol.35：232-239；Dessau，等，1980 J.Embryol.Exp.Morphol.57：51-60；Cheah，等，1991Development 111：945-953；Kosher和Solursh 1989 Dev.Biol 131：558-566；Poliard等，1995 J.Cell Biol.130：1461-1472)。最后，在第14天的结节中CNII表达减少与肥大软骨细胞的标志性胶原蛋白CN X的出现重合(Kirsch，等，1992 Bone Miner.18：107-117；Linsenmayer，等，1988 Pathol.Immunopathol.Res.7：14-19)。
X型胶原蛋白和肥大表型的出现在可能的结节骨化和骨形成之前。然而，PLA结节不表达骨钙蛋白，它是在向成骨谱系分化的细胞中表达的一种骨特异性基因(Price，等，1983 Biochem.Biophys.Res.Commun.117：765-771)。尽管表达X型胶原蛋白，但是在PLA结节中没有发现具有其特征性胞隙的成熟肥大细胞。然而，Denker等将C3H10T1/2鼠多能细胞放在微量培养物中并用TGF-β1处理时描述了相似的结果(Denker，等，1995 Differentiation 59：25-34)。用BMP-2(139)处理培养物时仅观察到肥大软骨细胞而没有结节。因此，用BMP-2诱导PLA微量培养物对于充分诱导肥大和诱导成熟软骨细胞的形成是必需的。
综合起来，我们的组织学，免疫组织化学，和RT-PCR数据证实PLA细胞向软骨形成谱系分化。然而，处理的脂肪吸出物是异源性的细胞群体且可能含有各种中胚层谱系的一些细胞类型。具体地说，在脂肪吸出物中可能存在能够自发分化的软骨形成前体，以及多能细胞的亚群体(即PLA干细胞)。从单个PLA细胞衍生的PLA克隆的分离及其多谱系分化(软骨形成，骨生成，和脂肪形成)证实了在该异源性细胞群体中存在多能干细胞(脂肪衍生的中胚层干细胞)。
为了将基于细胞的组织工程技术应用于临床情况，必需满足许多条件。用作细胞载体的细胞群体应当丰富且容易获得，在组织培养中能够增殖，通过多次传代后能够维持其分化能力，且表现出相当于天然目标组织的特性。在各种动物模型中已经成功地报导了使用从骨髓收获的干细胞治愈关节软骨缺陷(Angele，等，1999 Tissue Eng.5：545-554；Butnariu-Ephrat，M.，等，1996Clin.Orthop.330：234-43；Wakitani，等，1994 J.Bone Joint Surg.Am.76：579-592)。然而，骨髓获取疼痛且产生用于临床用途的干细胞数目低，通常需要体外增殖。脂肪组织丰富且容易以相对最小的不适感获得。可从相对少量的脂肪组织中大量收获PLA细胞(Zuk，P.，等，2001 Tissue Engineering 7：209-226)，因此，避免了对漫长培养增殖的需要。尽管选择性美容手术是脂肪吸出物的最常见的来源，但是对需要重建的非美容手术患者通过小孔插管也可获得足够的脂肪组织，使得该技术可用于广泛的各类患者。在本实施例中，证实了多能脂肪衍生的干细胞的软骨形成能力并显示该干细胞即使在长期培养后仍然保留其分化能力。最后，脂肪衍生的干细胞结节表现出与天然软骨组织一致的许多特性。
PLA细胞满足这些特性并且潜力丰富，使得这些多能细胞成为用于组织工程策略的理想系统。另外，这些细胞可适合于在体外培养试验和体内动物模型中研究软骨形成。软骨形成前体的鉴定对于关节软骨缺陷的修复具有重要意义。脂肪组织丰富且容易获得使其成为软骨重建的一种可行性选择(Asahina，等，1996 Exp.Cell Res.222：38-47；Atkinson，等，1997 J.Cell Biochem.65：325-339；Chimal-Monroy和Diaz de Leon 1999 Int.J.Dev.Biol.43：59-67；Denker，等，1999 Diffferentiation 64：67-76；Klein-Nulend，等，1998 Tissue Eng.4：305-313；Martin，等，1999 Exp.Cell Res.253：681-688；Quarto，等，1997Endocrinology 138：4966-4976；Shukunami，等，1998 Exp.Cell Res.241：1-11)。
实施例10
下面的描述提供了从脂肪组织分离干细胞的方法，其中该干细胞分化成肌源性组织。
方法
分化和组织培养试剂
氢化可的松，胶原酶和低聚甲醛从Sigma(St.Louis，MO)购买。马血清(HS)从Life Technologies(Grand Island，NY)购买。磷酸盐缓冲液(PBS)，0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA(胰蛋白酶/EDTA)，Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)和抗生素/抗真菌剂溶液从CellGro(Herndon，VA)购买。胎牛血清(FBS)从Hyclone(Logan，UT)购买。
PLA制备和培养
根据上文实施例7所述的方法，根据患者同意的方案HSPC#98-08011-02(加利福尼亚洲洛杉矶大学)处理从进行选择性抽吸辅助的脂肪切除术(SAL)的8个患者(平均年龄＝39.3岁，年龄范围为25-58岁)获得的人脂肪组织以获得处理的脂肪吸出物(PLA)细胞群体。简单地说，将粗制的吸脂吸出物用无菌PBS充分洗涤以去掉血细胞，生理盐水和局部麻醉剂。用0.075％的胶原酶在37℃下消化细胞外基质30分钟以释放细胞组分。用等体积的含10％FBS的DMEM灭活胶原酶。悬液以250xg离心10分钟以获得高密度PLA细胞沉淀。将沉淀重悬于DMEM/10％FBS中并加入红细胞裂解缓冲液(0.16M NH4Cl)10分钟以裂解污染的红细胞。经过再次离心步骤后，将PLA细胞沉淀重悬于DMEM/10％FBS中并以每个平板1×106个细胞的密度平板接种到100mm组织培养皿中。PLA细胞在对照培养基(CM-DMEM，10％FBS，1％抗生素-抗真菌剂)中37℃和5％CO2下维持。每周更换两次培养基。汇合的PLA培养物(约80％的汇合度)以1∶3的比例在胰蛋白酶/EDTA中传代。对于对照试验，将人包皮成纤维细胞系，HFF(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)和人骨骼肌细胞系，SKM(Clonetics，Walkersville，MD)分别在CM和生肌维持培养基(SKM-Clonetics)中37℃/5％CO2下维持。
生肌分化：
为了诱导最佳肌形成，将PLA细胞以1×104个细胞的密度平板接种到35mm组织培养皿上并在CM中培养过夜使其贴壁。通过在生肌培养基(MM＝添加了5％马血清和50μm氢化可的松以促进增殖的CM，增殖是生肌分化中的一个关键事件)中培养PLA细胞获得最佳肌形成(196)。PLA细胞在MM中诱导1，3和6周。每周更换两次培养基直到实验终止。SKM和HFF细胞在MM中诱导1，3和6周分别作为阳性和阴性对照。
免疫组织化学：
为了评估生肌分化，将PLA细胞以每孔5×103个细胞的密度接种到8孔分室载玻片上并在CM中使其贴壁过夜。细胞在MM中诱导1，3和6周。诱导后，细胞用PBS漂洗两次并用4％低聚甲醛4℃下固定20分钟。细胞用3％过氧化氢温育5分钟以消除内源性过氧化物酶活性。通过在封闭缓冲液(BB；PBS，1％HS，0.1％Triton X-100)中温育30分钟封闭非特异性表位。细胞用抗人MyoD1的单克隆抗体(Dako；Carpenteria，CA)或者抗人快缩骨骼肌肌球蛋白重链的单克隆抗体(Biomeda Corp.；Foster City，CA)4℃下温育过夜。温育后，细胞用BB洗涤并在室温下在含有与生物素偶联的马抗小鼠IgG第二抗体的BB中温育2小时。使用VectaStain ABC试剂盒(Vector Labs；Burlingame，CA)按照厂商说明书观察第二抗体。细胞用苏木精复染3分钟。按上述处理在MM中诱导的SKM细胞作为阳性对照。分析在CM中培养的PLA细胞和在MM中诱导的HFF细胞作为阴性对照。
RT-PCR分析：
从用MM处理1，3和6周的PLA细胞分离总RNA。按照上文实施例9所述的方法分离RNA。用5微克(5ug)总RNA以及鼠Maloney白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT；Promega；Madison，WI)进行oligo dT-引发的cDNA合成。所得的cDNA用作PCR分析的模板，该PCR使用针对人MyoD1(登录号NM 002478)和人骨骼肌肌球蛋白重链(登录号X03740)设计的引物对。使用的引物对和预期的PCR产物大小如下：MyoD1：5′-AAGCGCCATCTCTTGAGGTA-3′(正向引物)和5′-GCGCCTTTATTTTGATCACC-3′(反向引物)；500bp；肌球蛋白重链：5′-TGTGAATGCCAAATGTGCTT-3′(正向引物)和5’-GTGGAGCTGGGTATCCTTGA-3′(反向引物)；750bp。MyoD1和肌球蛋白使用Taq聚合酶(Promega)在100ul总反应体积中扩增35个循环。使用针对管家基因，β-肌动蛋白设计的引物进行一式两份反应作为内部对照。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。从在CM中培养的PLA细胞和在MM中诱导的HFF细胞获得的cDNA进行PCR扩增用作阴性对照。
免疫组织化学定量和数据分析：
为了定量肌形成，使用“Axioskop 2”倒置显微镜(Carl Zeiss Inc；Thornwood，NY)在200x放大率下手工计数各诱导时间点的总共500个PLA细胞并测定MyoD1和肌球蛋白阳性细胞的数目。MyoD1和肌球蛋白阳性细胞的数目表示为总共500个细胞的百分数(％PLA细胞总数)并用作生肌分化程度的指标。对8个患者进行所有试验并计算MyoD1和肌球蛋白阳性细胞的平均数，以及该平均值的标准误差(±SEM)。使用单向方差分析(ANOVA)分析上述实验和对照组中生肌分化的统计学显著性。p值不超过0.05认为有显著性。
结果
诱导的干细胞表达Mvod1和肌球蛋白重链：
与在先实施例一致，本试验中8个患者之间的PLA生长动力学和形态学无质的变化，表明分离的PLA群体在所有患者之间相对一致。PLA细胞从粗制脂肪吸出物分离并使用含氢化可的松的MM诱导。PLA细胞的肌形成对本试验所用的生肌条件具有特异性，因为在非诱导型对照培养基中，或在诱导其它中胚层谱系(即成骨和脂肪形成谱系)的培养基中观察到无分化。另外，在MM中诱导达6周的PLA细胞中注意到无成骨或生脂分化。
为了证实PLA的生肌潜力，通过免疫组织化学测定已确定的肌肉特异性标记的表达。生肌前体和干细胞分化成肌源性前体细胞可通过包括MyoD1，Myf-5，肌细胞生成素的一些转录因子和诸如肌球蛋白重链的结构蛋白的表达来证实(Butler-Browne，等，1990 Anat.Embryol.(Berl)181：513-522；Thornell，等，1984 J.Neurol.Sci.66：107-1 15；Megeney等，1996 Genes Dev.10：1173-1183；Seale和Rudnicki 2000 Dev.Biol.218：115-124；Tapscott，等，1988Science 242：405-411；Weintraub，等，1991 Science 251：761-766；Molkentin和Olson 1996 Curr.Opin.Genet.Dev.6：445-453)。定向生肌谱系可通过用对MyoD1特异性的单克隆抗体染色细胞来鉴定。在用MM诱导1，3和6周时观察到MyoD1在PLA细胞核中表达，表明在这些细胞中启动了生肌分化途径(图16，A至C组)。与PLA的结果相似，早在用MM诱导后1周时在阳性对照SKM细胞中就观察到MyoD1的核表达且到诱导6周为止在SKM细胞中观察到MyoD1表达增加。与诱导的PLA细胞相反，在用CM处理1，3和6周的PLA细胞中没有观察到MyoD1表达(图16，D至F组)。同样，在用MM处理的HFF细胞中观察到无MyoD1表达。在诱导的PLA细胞中表达MyoD1表明这些细胞起动了生肌分化程序。
为了进一步证实肌形成，用对骨骼肌肌球蛋白重链(肌球蛋白)特异性的单克隆抗体染色细胞以鉴定最终分化的成肌细胞(Butler-Browne，等，1990Anat.Embryol.(Berl)181：513-522；Thornell，等，1984 J.Neurol.Sci.66：107-115)。与MyoD1的核表达一致，用MM诱导的PLA细胞也表达肌球蛋白(图17，A至C组)。然而，与MyoD1相反，肌球蛋白表达局限于诱导后期的时间点(仅在3和6周时)，与该标记在成熟的，完全分化的成肌细胞中表达一致(Butler-Browne，等，1990 Anat.Embryol.(Berl)181：513-522；Thornell，等，1984 J.Neurol.Sci.66：107-115)。与我们的MyoD1结果相似，在CM中培养的PLA细胞(图17，D至F组)或用MM诱导的HFF细胞中观察到无肌球蛋白表达。在用MM诱导3和6周的SKM阳性对照中也观察到广泛的肌球蛋白表达。综合起来，在诱导的PLA细胞中MyoD1和肌球蛋白都表达表明这些细胞具有生肌潜力。
生肌前体的最终分化伴随着分化的成肌细胞融合成长型多核肌管。因此，我们检查了诱导的PLA培养物中推定的肌管形成。用MM处理PLA细胞最少3周导致形成长型多核细胞(图18A)。这些多核细胞的数目和大小随诱导时间的延长而逐渐增加，在诱导6周时在所有PLA培养物中都观察到多核细胞。在用MM诱导后1周时观察到无融合。另外，在CM中培养相似时间的PLA细胞或者用MM处理的HFF细胞没有观察到多核形成。为了证实这些推定的肌管的生肌起源，在诱导后6周的PLA培养物中检查了肌球蛋白的表达。如图18B所示，6周时的多核PLA细胞也表达肌球蛋白重链。用MM诱导时形成表达肌球蛋白的多核细胞表明PLA细胞进行融合形成肌管并进一步证实了其体外生肌潜力。
RT-PCR分析：
最后，使用RT-PCR证实了生肌分化(图19)。与我们的免疫组织化学数据一致，RT-PCR分析证实了在MM诱导1，3和6周的PLA细胞中表达MyoD1。相反，在CM培养的PLA细胞或用MM诱导的HFF细胞中都没有观察到MyoD1表达。在诱导3周时的PLA细胞中观察到低水平的肌球蛋白表达，而在用MM诱导后6周时发现该标记的表达增加。在诱导1周后在这些细胞中没有检测到肌球蛋白，这支持了免疫组织化学的结果。肌球蛋白的表达对诱导的PLA细胞具有特异性，因为在对照PLA细胞或在生肌诱导的HFF细胞中检测到无表达。该RT-PCR结果证实了我们的免疫组织化学数据且进一步证实了PLA细胞的生肌潜力。
定量PLA细胞的生肌分化：
为了测定诱导的PLA细胞的生肌分化程度，定量了免疫组织化学数据。为此，计数MyoD1或肌球蛋白阳性细胞的数目作为生肌标记表达水平的指标并表示为计数的总PLA细胞百分数±平均值的标准误差(％总PLA±SEM)。MM诱导的MyoD1阳性PLA细胞数在图20中显示。MM中诱导1周后观察到低水平的MyoD1阳性PLA细胞(4.11±0.51％PLA细胞总数)。到诱导后3周为止，10.11±3.85％的总PLA细胞为MyoD1阳性而在诱导后6周时15.37±4.33％的总PLA细胞为MyoD1阳性。根据该细胞计数，在诱导前3周内观察到MyoD1阳性细胞数增加2.4倍。与前3周相反，在生肌诱导的后3周MyoD1表达水平仅增加1.5倍。诱导前3周相对于后3周MyoD1阳性细胞数更大可能反映了该调控因子在生肌分化的早期起作用(Megeney，等，1996 Genes Dev.10：1173-1183；Seale和Rudnicki 2000 Dev.Biol.218：115-124；Tapscott，等，1988 Science 242：405-411；Weintraub，等，1991 Science251：761-766)。
与生肌诱导的PLA细胞相反，用CM处理PLA细胞或用MM处理HFF细胞时在任何时间点都没有观察到可评估的生肌分化，证实了该诱导条件的特异性。为了证实PLA细胞中MyoD1表达随时间的增加是否显著，使用单向ANOVA进行了统计学分析。比较了仅来自1至6周的MyoD1实验值，得出具有统计学显著性(P＜0.001；F＝18.9)。另外，使用不配对的t-检验分析1和3周的MyoD1水平证实有显著差异(p＝0.0021)。在3和6周之间测定到显著性水平降低(p＝0.0335)，这很可能反映了MyoD1在成肌细胞成熟中所起的作用降低。最后，使用单向ANOVA发现在各分化时间期间内实验组相对于对照组MyoD1的表达增加具有统计学显著性(p＜0.0001)。
用MM诱导时也观察到肌球蛋白阳性PLA细胞数的时间依赖型增加(图21)。在诱导后1周时观察到肌球蛋白的表达水平可忽略不计，这与成熟成肌细胞中该蛋白质的表达一致。诱导3周后，3.88±0.46％的计数总PLA细胞为肌球蛋白表达阳性，而在6周时8.42±0.71％为肌球蛋白阳性，在诱导的后3周中肌球蛋白阳性细胞数增加2.2倍。诱导后从3到6周中表达肌球蛋白的细胞数增加比对MyoD1测量的更大，这与从分化向成熟生肌细胞的转变一致(Butler-Browne，等，1990 Anat.Embryol.(Berl)181：513-522；Thornell，等，1984 J.Neurol.Sci.66：107-115)。在CM培养的PLA细胞或用MM诱导的HFF细胞中观察到无肌球蛋白表达，证实了该诱导条件的特异性。分析从1至6周肌球蛋白表达水平的增加证实具有统计学显著性(单向ANOVA-P＜0.0001；F＝75.5)。使用不配对的t-检验仅比较3和6周时的肌球蛋白表达水平也观察到具有统计学显著性(p＜0.0001)。在MyoD1试验中，对PLA和对照培养物的统计学分析证实具有统计学显著性(单向ANOVA-P＜0.0001)。最后，发现使用MyoD1和肌球蛋白表达水平测量的生肌分化水平在不同患者中都是一致的。而且，回归分析证实生肌分化与患者年龄无显著相关性(MyoD1，相关性＝0.27；肌球蛋白，相关性＝0.30)。
讨论
由于外伤，血管损伤，肿瘤切除或诸如肌肉营养不良的退化性肌肉疾病的肌肉损失提出了一个很少有解决方法的重要临床问题。对于病灶的肌肉损失，已进行了带血管的肌肉移植，但是现用的供体位点发病在美观和功能上都具有限制性。系统肌肉疾病，例如退化性肌肉损失，一般认为是致命的疾病，它导致进行性肌肉损失，隔膜麻痹或机能障碍及最终窒息。目前的治疗方案，例如基因治疗，至今已证明是不成功的。然而，最近组织工程领域的发展允许最终取代或修复病灶的和扩散的肌肉组织损失。
一般认为两种细胞类型是肌肉组织工程的候选细胞：即胚胎干细胞和出生后产生的祖细胞或干细胞。不幸的是，伦理争议和潜在的细胞调控问题限制了胚胎干细胞的使用(Baker，等，1996 Curr.Top.Dev.Biol.33：263-279；Dinsmore，等，1996 Cell Transplant 5：131-143；Lenoir，N.2000 Science 287：1425-1427；Rohwedel，等，1994 Dev.Biol.164：87-101；Young，FE 2000 Science287：1424)。通过成肌细胞转移疗法(MTT)已导入了出生后的骨骼肌祖细胞或卫星细胞用于治疗杜兴肌营养不良症(Karpati，等，1989 Am J.Pathol.135：27-32；Law，等，1988 Muscle Nerve 11：525-533；Rando，等，1995 Exp.Cell Res.220：383-389；Partridge，等，Nature 273：306-308)。尽管可能有益，但是主要由于细胞可用性(该细胞必须从活的供体肌肉组织获取)，以及随着年龄增长自我更新潜力下降限制了卫星细胞的实际使用(Rando，等，1994 J.Cell Biol.125：1275-1287；Satoh，等，1993 J.Histochem.Cytochem.41：1579-1582；Schultz和Lipton 1982 Mech.Ageing Dev.20：377-383)。除了卫星细胞外，也报导了骨髓衍生的间充质干细胞(MSCs)在特定培养条件下具有生肌能力(Ferrari，等，1998 Science 279：1528-1530；Wakitani，等，1995 Muscle Nerve 18：1417-1426)。
在本试验中，我们证实了从抽吸辅助的脂肪切除术(SAL)获得的人处理的脂肪吸出物(PLA)细胞具有体外生肌潜力。免疫组织化学和RT-PCR分析揭示了用MM诱导的PLA细胞表达MyoD1和肌球蛋白重链，它们是在骨骼肌前体进行分化和成熟时表达的标记。PLA细胞中MyoD1的表达在诱导的前3周最高，与其在生肌分化中的早期作用一致。还观察到肌球蛋白的时间依赖型增加，在分化后期(即，诱导后3至6周)观察到数目最多的肌球蛋白阳性细胞。该增加可能反映了PLA细胞成熟为成肌细胞。与最终分化和成肌细胞的融合一致，在诱导后3周时首先观察到表达肌球蛋白的长型多核肌管，这些多核细胞的数目和大小随时间的延长而增加。最后，免疫组织化学定量表明约15％的PLA细胞进行肌形成。
在出生后的生活中，成熟骨骼肌纤维如果损伤则不能再生。回应肌肉损伤，或者在具有慢性退化性肌病的个体中，位于肌肉纤维肉膜和基底层之间的卫星细胞活化成为生肌前体细胞。这些前体细胞分裂并融合以修复损伤的肌肉(Campion，DR 1984 Int.Rev.Cytol.87：225-251)。然而，成熟肌肉内卫星细胞的数目仅占总细胞数的1-5％且其自我更新潜力随年龄而降低(Schultz和Lipton 1982 Mech.Ageing Dev.20：377-383；Alameddine，等，1989 MuscleNerve 12：544-555)。对于病灶肌肉损失，已进行了带血管的肌肉移植，但是现用的供体位点的发病在美观和功能上都具有限制性。另外，对于全身性肌肉疾病，由于该疾病病变的扩散特性而不能使用自体骨骼肌组织移植。因此，需要其它基于细胞的治疗方案。
一个这样形成的治疗方案是成肌细胞转移疗法或MTT。成肌细胞转移疗法涉及移植大量数目的健康成肌细胞。该方法在1978年首次进行且已表明对杜兴肌营养不良患者是一种有希望的疗法(Karpati，等，1989 Am J.Pathol.135：27-32；Law，等，1988 Muscle Nerve 11：525-533；Rando，等，1995 Exp.CellRes.220：383-389；Partridge，等，Nature 273：306-308)。尽管肌肉组织的取代和增加在理论上是有益的，但是其成就有限(Rando，等，1994 J.Cell Biol.125：1275-1287；Satoh，等，1993 J.Histochem.Cytochem.41：1579-1582)。作为选择，多能干细胞成为了将来用于基于细胞的治疗策略的有希望的候选物，因为它们可在培养物中迅速增殖并保留分化成一些中胚层细胞类型的能力(Caplan 1991 J.Orthop.Res.9：641-650；Pittenger，等，1999 Science 284：143-147)。
以前的报导证实了中胚层干细胞可从出生前和出生后的生物体分离(Ferrari，等，1998 Science 279：1528-1530；Caplan 1991 J.Orthop.Res.9：641-650；Elmer，等，1981 Teratology 24：215-223；Swalla，等，1986 Dev.Biol.116：31-38；Hauschka，等，1974 Dev.Biol.37：345-68；Solursh，等，1981 Dev.Biol.83：9-19；Nakahara，等，1991 Exp.Cell Res.195：492-503；Goshima，等，1991 Clin.Orthop.274-283；Goshima，等，1991 Clin.Orthop.298-311；Benayahu，等，1989 J.Cell Physiol.140：1-7；Bennett，等，1991 J.Cell Sci.99：131-139；Calcutt，等，1993 Clin.Res.41：536A；Lucas，等，1992 In Vitro Cell Dev.Biol.28：154A；Lucas，等，1993 J.Cell Biochem.17E：122)。Williams等表明从骨骼肌组织分离的出生后的细胞具有脂肪形成，骨生成，软骨形成和生肌潜力(Williams，等，1999 Am Surg.65：22-26)。另外，一些小组已经证实了从人和动物骨髓获得的间充质干细胞(MSCs)分化成脂肪形成，骨生成和软骨形成谱系细胞(Pittenger，等，1999 Science 284：143-147；Grigoriadis，等，1988 J.CellBiol.106：2139-2151；Beresford，等，1992 J.Cell Sci.102：341-351；Cheng，等，1994 Endocrinology 134：277-286；Johnstone，等，1998 Exp.Cell Res.238：265-272；Yoo，等，1998 J.Bone Joint Surg.Am.80：1745-1757)。这些发现表明骨髓和骨骼肌可能是干细胞有希望的来源。然而，使用骨髓和骨骼肌作为生肌细胞的来源存在缺点。骨髓获取疼痛且产生的MSCs数目少，在临床使用前通常需要离体增殖。另外，在对患者无功能性损伤时从骨骼肌只能获得少量干细胞。
在本实施例中，我们证实了脂肪衍生的干细胞表达确定的生肌标记(MyoDl，肌球蛋白，多核化)，证实并定量了其生肌潜力。由于脂肪组织丰富且吸脂操作相对安全，带来的患者不适最小，因此，人脂肪衍生的干细胞可提供多谱系细胞的另一来源，与从骨髓和骨骼肌获得的干细胞一起用于治疗肌病。
尽管显示了在干细胞中表达生肌标记，但是不能证实这些细胞的准确起源。尽管不太可能，但是也有可能我们的结果是由于非脂肪组织来源的卫星细胞或生肌前体对脂肪区的污染。一种可能性是脂肪区被来自骨骼肌的生肌前体细胞污染。然而，用钝头吸脂插管可进入包埋于筋膜中的骨骼肌从技术的角度来看是极不可能的。另一可能性是脂肪区被来自外周血的MSCs污染。而对于外周血中存在MSCs有相矛盾的报导(Lazarus，等，1997 J.Hematother.6：447-455；Huss 2000 Stem Cell 18：1-9)，尽管我们相信在我们的研究中观察到的生肌水平与外周血可能贡献的MSCs的低百分比不一致。最后，尽管不存在明确的标记用于鉴定卫星细胞和生肌前体细胞，但是MyoD1是分化期间表达的最早标记之一且已被用于鉴定生肌前体细胞(Weintraub，等，1991Science 251：761-766；Grounds，等，1992 Cell Tiss.Res.267：99-104；Sassoon，DA 1993 Develop.Biol.156：11)。如图16所示，在未诱导的PLA培养物中没有观察到MyoD1表达，表明我们的结果不是由于在PLA中存在生肌前体细胞，而是由于多谱系干细胞的生肌分化。
骨骼肌组织工程的目标是治疗内在的骨骼肌疾病和外伤或局部缺血后的骨骼肌缺损。对这些疾病已有的医药和手术疗法既低效又不实用。在这些领域中使用人PLA细胞是有希望的。人PLA细胞丰富，容易以最小的发病率和不适感获得且表现出生肌潜力。因此，这些细胞对于生肌组织工程和修复具有重要应用。
尽管PLA细胞的生肌分化程度与观察到的脂肪形成和骨生成分化水平相比相当低(Zuk，P.，等，2001 Tissue Engineering 7：209-226)，但是应用诸如被动和主动机械力的外源因素(Periasamy，等，1989 Biochem.J.257：691-698；Vandenburgh和Kaufman 1981 J.Cell Physiol.109：205-214；Vandenburgh 1983J.Cell Physiol.116：363-37 1；Vandenburgh，等，1988 In Vitro Cell Dev.Biol.24：166-174；Vandenburgh 1989 In Vitro Cell Dev.Biol.25：607-616)和培养条件的优化可增进生肌分化，使得这些细胞在临床上有用。
实施例11
下面的描述提供了分化成成骨，软骨形成，脂肪形成，生肌和神经原性组织的脂肪衍生的干细胞。该描述还提供了分离所述干细胞和诱导其分化的方法。
材料和方法
所有材料都从Sigma(St.Louis，MO)，VWR(San Dimas，CA)和FisherScientific(Pittsburgh，PA)购买，除非另有说明。所有的组织培养试剂都从LifeTechnologies(New York，NY)购买。胎牛血清(FBS)和马血清(HS)分别从Hyclone(Logan，UT)和Life Technologies购买。1，25-二羟维生素D3从BioMol(Plymouth Meeting，PA)购买。
细胞系：
正常人成骨细胞(NHOsts)，来自膝盖的正常人软骨细胞(NHCK)和来自人骨髓的MSCs群体从Clonetics(Walkersville，MD)购买。鼠3T3-L1脂肪细胞前体细胞系(Green和Meuth 1974 Cell 3：127-133)从ATCC(Rockville，MD)获得。人神经内分泌细胞系PC 12由Harvey Herschman博士(UCLA，LosAngeles，CA)惠赠。
抗体：
抗人骨钙蛋白的单克隆抗体从TaKaRa Shizo Co.(Japan)购买。抗人骨桥蛋白(αOP-LF123)，骨粘连蛋白(αON-LF37)，双糖链蛋白聚糖(αBG-LF51)，核心蛋白聚糖(αDEC-LF136)和碱性磷酸酶(αAP)的多克隆抗体从LarryFisher博士(NIH)获得。抗MAP2(αMAP)，神经丝70(αNF70)和τ-tau(αtau)的单克隆抗体从Leinco Technologies(St.Louis，MO)购买。抗trk-a(αTRK)和NeuN(αNeu)的单克隆抗体分别从Santa Cruz Biotech(Santa Cruz，CA)和Chemicon(Temecula，CA)购买。抗胶质原纤维酸性蛋白(αGFAP)的多克隆抗体分别从Dako and Stressgen(Victoria，BC)购买。与碱性磷酸酶偶联的第二抗体从Zymed获得，而与FITC偶联的第二抗体从BioSource(Camarillo CA)购买。
细胞收获，培养和分化条件：
脂肪衍生的干细胞(PLA)从粗制脂肪吸出物获得并按以前的研究所述进行培养(Zuk，2001 Tissue Engineering 7(2)：209-226)。脂肪衍生的干细胞和3T3-L1细胞在非诱导型对照培养基(表5)中维持。NHOst，MSC和NHCK细胞在特化商品对照培养基(Clonetics)中维持。脂肪衍生的干细胞按表5所示向所需的间充质谱系诱导。使用添加了表5所示的生长因子的商品对照培养基诱导MSCs。使用生脂培养基(AM)诱导3T3-L1细胞。NHOst和NHCK细胞使用商业上可获得的诱导培养基(Clonetics)进行诱导。
组织学，免疫组织化学和间接免疫荧光：
间接免疫荧光(IF)：使用抗特异性CD标记的单克隆抗体按Zuk，P.等，2001 Tissue Engineering 7：209-226所述处理PLA细胞和MSCs用于IF(表6)。
组织学和免疫组织化学(IH)：为了证实谱系特异性分化，使用下列组织学试验：碱性磷酸酶(骨生成)，油红O(脂肪形成)和阿尔新蓝(软骨形成)按Zuk，P.等，2001 Tissue Engineering 7：209-226所述处理分化的细胞。另外，按以前在Zuk，P.等，2001 Tissue Engineering 7：209-226中所述以IH处理向软骨形成谱系诱导的PLA结节用于2型胶原蛋白，硫酸角质素(KS)和软骨素-4-硫酸(CS)的表达。
分光光度测定法：
碱性磷酸酶(AP)：PLA细胞的一式三份样品在成骨培养基(OM)中分化达6周。用PBS洗涤细胞并收获进PBS/0.1％Triton X-100(PBS/TX100)中。使用商品AP酶试剂盒(Sigma)测定AP酶活性并测量405nm下的吸光度。根据Bradford的方法(Bradford 1976 Anal.Biochem.72：248-254)使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce，Rockford，IL)测量各样品中的总蛋白。AP活性表示为产生的对硝基苯酚nmol数/分钟/ug蛋白。使用标准对硝基苯酚溶液校准该测定。测定分化的MSC和NHOst细胞作为阳性对照，而测定未诱导的PLA细胞作为阴性对照。值表示为平均值±SD。
总钙量(Ca 2+ )：PLA细胞的一式三份样品按上述在OM中分化。细胞用PBS(无Ca2+，无Mg2+)洗涤并收获进0.1N HCl中。细胞在4℃下提取最少4小时并以1000xg离心5分钟。上清中的总钙量使用Sigma试剂盒#587测定并在A575nm下测量。使用钙标准溶液校准该测定。测定总蛋白且样品表示为mM Ca/ug蛋白质。测定分化的MSC和NHOst细胞作为阳性对照，而测定未诱导的PLA细胞作为阴性对照。值表示为平均值±SD。
甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)：PLA细胞的一式三份样品在AM中分化达5周。细胞收获进25mM Tris-Cl，1mM EDTA(pH7.5)，0.1mM β-巯基乙醇中并超声处理5秒和40W使其裂解。悬液以10000xg离心并按照Wise和Green的方法(Wise，1979)通过测量A340nm下NADH的氧化测定上清中的GPDH。一个单位的GPDH定义为每分钟氧化1nmol的NADH。样品相对于蛋白质标准化并表示为单位GPDH/ug。测定分化的MSC和3T3-L1细胞作为阳性对照，而测定未诱导的PLA细胞作为阴性对照。值表示为平均值±SD。
二甲基二亚甲基蓝(DMMB)：PLA细胞的一式三份样品使用确定的微量方案(Ahrens，等，1977 Develop.Biol.60：69-82；Denker，等，1995 Differentiation59：25-34；Reddi，等，1982 Prog.Clin.Biol.Res.110(Part B)：261-268)在软骨形成培养基(CM)中分化达3周。收获PLA结节并按照Farndale等的方法(Farndate，等，1986 Biochimica et Biophysica Acta 883：173-177)测定硫酸化的糖胺聚糖硫酸角质素(KS)和硫酸软骨素(CS)。使用标准KS和CS溶液校准该试验。样品相对于蛋白质标准化并表示为每μg蛋白质的μg KS或CS。测定未诱导的PLA细胞作为阴性对照。值表示为平均值±SD。
RT-PCR分析：
PLA细胞向表5所列的5个谱系诱导确定的时间期限。使用商业上可得到的试剂盒(QiaEasy，Qiagen)从分化的细胞分离总细胞RNA。RNA使用寡聚-dT引物和MMLV-逆转录酶(Promega，Madison，WI)在42℃下逆转录60分钟。通过添加Taq缓冲液(Promega)，2.5mM MgCl2，1mM dNTPs和50pmol合适的引物组(表7)进行PCR扩增。混合物在94℃下温育1分钟并加入2.5个单位的Taq聚合酶(Promega)。PCR进行40个循环(1分钟-94℃，1分钟-57℃，1分钟-72℃；最终延伸-72℃下5分钟)。所有引物序列使用确定的GenBank序列和Primer3程序测定。用针对管家基因β-肌动蛋白设计的引物进行的PCR反应扩增35个循环作为内部对照。使用自动测序证实各PCR产物的序列。检查未诱导的PLA细胞作为阴性对照。分析谱系特异性细胞系作为成骨，脂肪形成和软骨形成谱系的阳性对照。逆转录人骨骼肌和脑的总RNA并通过PCR扩增分别作为生肌和神经原性谱系的阳性对照。
Western印迹：
分化PLA细胞并收获进1％SDS中。匀浆溶胞产物并测定总蛋白。来自各谱系的等量蛋白在SDS上样缓冲液(0.5M Tris-Cl(pH6.8)，1％SDS，1mMDTT，50％甘油，1％溴酚蓝)中100℃下变性5分钟。按照标准方法通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(10％分离胶，5％堆积胶)分离溶胞产物。蛋白质转移到硝酸纤维素膜上过夜并将膜在Western封闭缓冲液(WBB：5％无脂乳，1XPBS，0.1％Tween-20)中封闭最少60分钟。膜在添加了下列抗体：骨生成：αOP，αON，αCNI，αDEC和αBG，脂肪形成：αG4和αLEP的WBB中温育最少60分钟。膜也用抗运铁蛋白受体和可溶性热休克蛋白HSC70的抗体温育作为内部对照。膜用PBS/0.1％Tween-20洗涤最少3次，然后用添加了与碱性磷酸酶偶联的合适的第二抗体的WBB温育60分钟。按上述洗涤膜，并使用商品试剂盒(CSPD Ready-To-Use，Tropix，Bedford，MA)按照厂商建议显色第二抗体。也分析了未诱导的PLA细胞作为阴性对照。
神经原性分化：
免疫组织化学：亚汇合PLA细胞在预诱导培养基(DMEM，20％FBS，1mM β-巯基乙醇)中培养24小时。预诱导后，细胞在神经形成培养基(NM)中诱导达8小时并通过IH评估以测定特异性神经原性谱系(表8)。
RT-PCR：PLA细胞在预诱导培养基中预诱导24小时，接着在NM中诱导达9小时。收获PLA样品，分离RNA(QiaEasy，Qiagen)并按上文的详细描述通过RT-PCR分析特异性神经原性基因的表达(表7)。
PLA克隆的分离和分析：
克隆分离：以极低的汇合度平板接种PLA细胞以便产生分离的单个细胞。培养物在对照培养基中维持直到单个PLA细胞的增殖导致形成清楚的克隆。使用无菌克隆环和0.25％胰蛋白酶/EDTA收获单个PLA细胞衍生的克隆。收获的克隆在克隆培养基(15％FBS，1％抗生素/抗真菌剂的F12/DMEM(1∶1))中增殖。
多谱系能力的证实：按前面所述(参见组织学和免疫荧光)分析增殖克隆的多谱系潜力。
分子鉴定：按上面所述通过RT-PCR分析克隆的一些谱系特异性基因的表达。
结果
干细胞与MSCs有许多相似性：
为了进一步鉴定PLA群体，使用间接IF检查细胞并与商品人MSCs群体进行比较。已表明MSCs表达一组特有的细胞表面标记，该标记可用于帮助鉴定该干细胞群体(表6)(Bruder，等，1998 J.Orthop.Res.16：155-162；Cheng，等，1994 Endo 134：277-286；Jaiswal，等，1997 J.Cell Biochem.64：295-312；Pittenger，等，1999 Science 284：143-147)。与MSCs类似，PLA细胞表达一些这类蛋白(图23)，证实了这些细胞具有干细胞的特征。约100％的PLA和MSC培养物为CD29，CD44，CD90和CD105/SH2表达阳性，在两种细胞群体中都观察到这些标记分别具有高水平的表达。两种细胞群体也都表达SH3抗原，该抗原与SH2一起认为是MSCs的特异性标记(Haynesworth，等，1992 Bone 13：69-80)。另外，大多数PLA细胞和MSCs也为运铁蛋白受体，CD71阳性，表明这些细胞群体的一个组分在复制。PLA和MSCs不表达造血谱系标记，CD31和CD34。少数PLA样品显示出微弱的CD45染色，尽管CD45-阳性细胞的数目不超过PLA细胞总数的5％。与MSCs不同，在PLA细胞中观察到无粘连分子CD58的染色。CD标记表达的流式细胞术分析证实了IF的结果(图24)。综合起来，免疫荧光和流式细胞术结果证实了PLA群体和骨髓衍生的MSCs之间在CD表达谱中的一些相似性。
成骨诱导时PLA细胞经历不同的变化：
在本实施例中，我们证实了PLA细胞在成骨诱导时经历不同的增殖，合成和矿化期。为了进一步鉴定PLA细胞的成骨能力，测量骨诱导的PLA细胞的增殖并与AP活性和磷酸钙形成相关联(图25，A组)。在开始成骨分化时PLA细胞数增加(第1至第3天)，但是，观察到微弱的AP和Von Kossa染色(图25，B组)。从第3天到第9天观察到PLA细胞数线性增加且直到第13天观察到极弱的AP染色。PLA的增生率在第13和第15天之间短暂地保持平稳，这是在一些PLA群体中观察到的一种现象。在第15天和第19天之间发现AP活性显著增强且到诱导3周为止观察到首次出现磷酸钙沉积。从第15天到第25天测量到PLA增殖率提高且与AP和VK染色的时间依赖型增强一致。另外，在该时间期间还观察到多层结节结构的形成和基质合成增强。PLA细胞数从第25天起之后减少并伴随着形成缺乏贴壁细胞的节间区，以及基质矿化增加。综合起来，这些结果表明随着成骨分化的进展PLA细胞经历不同的增殖和代谢期。
碱性磷酸酶活性和基质矿化的时间依赖型增加：
体内骨形成是涉及形态发生素，激素和生长因子的复杂过程。最近的工作对诸如地塞米松(Dex)的合成糖皮质激素在介导骨生成中的效力提出了疑问。糖皮质激素表现出抑制包括骨钙蛋白，CBFA-1和CNI的一些成骨基因的作用(如Cooper，等，1999 J.Endocrinol.163：159-164中的综述)。已确定骨组织和骨原细胞是维生素D作用的靶子(Chen，等，1983 J.Biol.Chem.258：4350；Chen，等，1979 J.Biol.Chem.254：7491；Narbaitz，等，1983 Calcif. Tiss.Int.35：177)且该代谢产物通过人骨细胞群体刺激AP活性和CNI合成(Beresford，等，1986 Endo 119：1776-1785)。因此，使用两种成骨培养基组成：含有地塞米松(10-7M的Dex)或1，25-二羟维生素D3(10-8M的VD)诱导PLA细胞。使用商品试剂盒测量相对于时间的AP活性和Ca2+积聚并相对于蛋白质和/或时间标准化。
测量诱导的PLA，MSC和NHOst细胞的AP活性且在表9中提供了时期-特异性诱导水平。Dex或VD-诱导导致PLA细胞中的AP活性在3周时首先出现，而未分化的PLA细胞在所有时间点都表现出微弱的AP水平(图26，A组)。用Dex和VD刺激PLA细胞时从3到6周的AP活性都是双阶段型(bi-phasic)，在第21天和42天时具有峰值活性且在第35天水平降低。VD诱导PLA细胞导致在3，4和5周时酶活性更高，而在6周时测量到在两种诱导条件之间无显著差异。在VD-诱导的PLA细胞中在3周时检测到最大AP水平，而用Dex处理时检测到无明显的最大值。另外，在3周时PLA细胞表现出对VD刺激的反应更大，与Dex处理相比，在这些细胞中测量的酶诱导水平增强(17.2-倍诱导/Dex与71.3-倍诱导/VD)。与PLA细胞一样，在Dex-处理的MSCs中直到第21天才测量到微弱的AP活性。与PLA细胞相反，Dex刺激MSCs导致在3，4和5周时酶活性更高。在Dex和VD诱导下观察到的MSC的AP活性总体谱型与VD-诱导的PLA细胞相似(即，双阶段型)。然而，在MSCs中第28天时测量到水平降低而不是在第35天。另外，在分化后期(即5/6周)检测到MSCs中的最大酶活性。最后，正如在PLA细胞中的观察结果，诱导MSCs 2到3周导致诱导最大的AP活性。然而，地塞米松，而不是VD处理在这些细胞中对酶水平影响更大(54.2-倍诱导/Dex与1.1-倍诱导/VD)。AP酶活性的谱型与NHOst成骨细胞有显著的不同。在这些细胞中在第7天观察到最大AP水平且在该时间点之后酶水平下降，在6周时达到最低水平。在第35天和第42天时在VD处理的成骨细胞中可检测到微弱的酶活性。另外，在任一诱导条件下从第7天到第28天可测量到AP活性无显著差异。
用Dex或VD诱导PLA细胞和MSCs导致基质矿化的时间依赖型增强(图26和表10)。与AP活性一致，PLA细胞对VD-诱导的反应更大，产生的总体基质矿化增强更多(122-倍/VD与56-倍/Dex)，在6周时检测到最大水平。在VD-处理的MSCs中也观察到相似的效果，尽管早一周达到最大水平。与AP活性一样，在PLA细胞和MSCs中都直到3周时才观察到微弱的矿化。在PLA细胞中仅在6周时观察到诱导条件的明确效果，VD-处理的细胞与明显更多的磷酸钙相关联。与PLA细胞相反，在MSC样品中诱导条件明显影响矿化，且Dex处理导致在分化早期(3和4周)的钙水平更高，与在该诱导条件下AP的水平一致。在5和6周时该趋势逆转，VD导致矿化水平增强。令人感兴趣的是，在Dex-和VD-处理的MSCs中在28天时都观察到Ca2+减少且表现出与该时间点AP活性的减少相关。与PLA细胞和MSCs相反，在诱导的NHOst细胞中在2周时出现最大Ca2+积聚且在该时间点之外减少，与观察到的NHOst AP活性一致。与MSCs相似，Dex诱导导致除了第5周外在所有诱导点的Ca2+水平更高。对照成骨细胞与最低水平的Ca2+相关联，表明这些细胞无适当诱导时不自发矿化。综合起来，AP和Ca2+分光光度数据进一步证实了PLA细胞的成骨表型。
骨诱导的PLA细胞表达骨钙蛋白和CBFA-1:
为了在分子水平上证实PLA细胞的成骨表型，使用RT-PCR和Western印迹分析骨诱导的PLA细胞。对于RT-PCR分析，PLA细胞在含有Dex或VD的OM中诱导延长的时间期限。除了NHOst细胞外，还分析了Dex和VD-诱导的MSCs。成骨分化似乎不影响PLA细胞，因为β-肌动蛋白水平与对照细胞无显著差异(图27)。用Dex或VD诱导对检查的大多数基因的表达无显著影响。然而，在骨特异性基因OC的表达中观察到有显著影响。在Dex-处理的和对照PLA细胞中没有检测到OC表达，在对照和Dex-诱导的NHOst成骨细胞中也没有检测到。用VD处理PLA细胞产生双阶段型OC表达谱型。在诱导4和14天时检测到微弱水平的OC，而在第7天观察到显著增加。最后，从第21天到第42天检测到相对一致的OC表达水平。在PLA诱导的最后48小时中除去Dex并用VD代替足以克服Dex的影响并诱导明显水平的OC表达。与RT-PCR结果相反，使用基因微阵列分析检测到相对于未诱导的对照在Dex-处理的PLA细胞中OC表达轻微增加(图27，B组)。OC对骨诱导的MSCs无特异性，因为在对照MSCs中也观察到可检测的水平。Dex处理MSCs表现出在4和7天时OC水平增加，且与对照细胞一样，接着在2和4周时减少。不同于PLA细胞，VD诱导的MSCs不产生双阶段型OC表达谱型。相反，该基因的表达水平在4周诱导期间表现出维持恒定且与Dex处理相比升高。
除了OC外，使用RT-PCR在骨诱导的PLA细胞中观察到骨特异性转录因子CBFA1的表达。CBFA1在所有诱导时间点均表达且在Dex或VD诱导时观察到对表达无可识别的影响。另外，CBFA1表达对骨诱导的PLA细胞无特异性，因为在对照中发现较低水平的该基因。然而，使用基因阵列在骨诱导的PLA细胞中测量到CBFA1表达水平提高(约2倍)(图27，B组)。与PLA细胞相同，除了在未分化的MSC对照中以降低的水平表达外，在Dex-和VD-诱导的MSCs中各诱导时间点均表达CBFA1。在成骨细胞中CBFA1的表达更受限制，仅在骨诱导4周的NHOst细胞中检测到。在分化的和对照PLA细胞，MSCs和NHOst细胞中在所有时间点都观察到AP表达。除了CBFA1和AP外，在这些细胞中观察到高水平的CNI。尽管通过RT-PCR发现在Dex或VD诱导PLA细胞时CNI表达水平无明显差异，但是基因阵列分析证实了在成骨诱导时CNI水平下降(图27，B组)。除了OC，CBFA1，AP和CNI外，分化的PLA细胞，MSCs和NHOsts表达与骨分化一致的其它标记，包括OP和ON。与CNI所见一样，使用阵列在Dex-处理的PLA细胞中也测量到ON和OP水平降低(图27，B组)。与未诱导的对照相比在Dex-处理的PLA和MSCs中还观察到转录因子PPARγ1的表达增加。另外，在VD诱导PLA细胞的早期(第4天到第14天)发现PPARγ1的水平较低，接着在诱导4周后表达增加。成骨诱导不引起表达与脂肪和软骨分化一致的基因(分别为PPARγ2和CNII)。综合起来，在骨诱导的PLA细胞中骨特异性OC和成骨分化特征性的其它基因的表达进一步证实了这些细胞的成骨能力。
最后，通过免疫荧光分析和Western印迹在蛋白质水平上证实了PLA细胞的成骨分化。通过IF分析骨诱导的PLA细胞(OM/Dex)中OP，ON和OC的表达。也检查了在相同条件下诱导的MSCs作为对照。如图28所示，未诱导的和骨诱导的PLA细胞特异性地表达OP和ON(图28，A组)。除了清楚的核周集中外，OP在对照和诱导的细胞中均匀分布。可观察到无细胞外OP染色。在两种细胞类型中还观察到ON的点状细胞内分布方式。另外，在对照中还观察到该蛋白质的核染色增加。骨诱导时，在细胞集中区域的ON染色出现增加且在细胞内和细胞外都表达。在未诱导的细胞中观察到无OC表达并与RT-PCR结果一致。少量百分率的成骨PLA细胞表现出细胞内表达低水平的OC。在MSCs中观察到这些蛋白质的相似表达方式。对照和诱导的MSCs表达高水平的OP和ON。与PLA细胞一样，观察到ON的点状细胞内和核染色方式，且诱导时核染色减弱(图28，B组)。对照和诱导的MSCs在细胞内表达OP。然而，不同于PLA细胞，没有发现该蛋白质的核周集中。最后，与RT-PCR数据一致，对照和诱导的MSCs都表达OC。
为了通过Western分析证实成骨蛋白的表达，将PLA细胞在OM中维持7，14和21天并裂解。分析细胞溶胞产物的CNI，OP，ON，核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖的表达。另外，还分析了溶胞产物的运铁蛋白受体(TfR)作为内部对照。OC由于该蛋白质形状小(6kDa)而没有评估。成骨分化似乎不改变TfR的表达，因为在骨诱导的细胞和在对照培养基中维持3周的对照中看见的水平相当。在骨诱导的PLA细胞中在所有3个诱导时期都看见类似水平的CNI，核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。另外，在对照中也看见了这些蛋白，表明分化的和未分化的PLA细胞都与蛋白质ECM相关联。与这些基质蛋白一样，在分化细胞和未分化的对照中都看见了ON和OP。然而，PLA细胞在开始诱导时ON水平表现出下降且到3周为止恢复对照水平。另外，成骨诱导伴随着第21天的OP轻微增加。综合起来，免疫荧光和Western数据证实蛋白质的表达与PLA细胞的成骨分化一致。
PLA细胞进行生脂分化：
生脂分化与定向分化程序前的脂肪细胞前体生长停滞相关联(参见Ailhaud，等，1992 Annu.Rev.Nutr.12：207-233；MacDougald和Lane 1995 Annu.Rev.Biochem.64：345-373；Smyth，等，1993 J.Cell Sci.106：1-9的综述)。为了测定PLA增殖与生脂分化之间的相关性，将PLA细胞在AM中向脂肪形成谱系诱导达3周，测定细胞数，并使用油红O染色测定分化的程度。早在诱导4天时首先出现分化(即，出现细胞内脂肪泡)。与脂肪细胞前体的定型一致，在脂肪形成诱导过程中没有检测到明显的PLA细胞数增加(图29，A组)，尽管油红O染色/脂肪积聚水平发生时间依赖型增加(图29，B组)。在PLA细胞汇合且互相接触的培养物区域分化水平最高。这些结果表明PLA细胞定向脂肪形成谱系受到细胞-细胞接触的影响且与生长停滞同步。
诸如3T3-L1的脂肪细胞前体细胞系的脂肪转变也可通过包括甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)的脂肪生成酶活性的增加来鉴定(Wise，等，1979 J.Biol.Chem.254：273-275)。因此，用AM诱导PLA细胞并测定GPDH活性的水平。同样诱导3T3-L1细胞作为阳性对照。PLA和3T3-L1细胞的诱导初期(第4天至第7天)产生类似的GPDH活性且与对照PLA水平相似(图30)。诱导PLA细胞2周导致酶活性降低且观察到对照，诱导的PLA和3T3-L1细胞之间无显著差异。在脂肪诱导的MSCs中也观察到该降低。生脂分化2周后导致在诱导的PLA和3T3-L1细胞中GPDH活性特异性增加。酶活性在4和5周之间平稳且明显高于对照PLA细胞。GPDH活性的时间依赖型增加与脂肪诱导的培养物内充满脂类的PLA细胞百分比增加相关联(图29)且与这些细胞的生脂分化一致。
为了证实PLA脂肪形成，通过RT-PCR分析脂肪诱导的细胞。如图31所示，PLA诱导引起脂肪特异性转录因子PPARγ2表达。在第7天观察到PPARγ2表达且该水平在剩下的5周诱导期间似乎保持恒定。在未诱导的PLA细胞中没有检测到该基因的表达。除了PPARγ2外，在诱导的PLA细胞中表达低水平的脂肪形成基因LPL和aP2。在脂肪诱导的早期(4天)观察到低水平的这些基因且随后在1周时明显增加。在这些细胞中增加的水平维持5周诱导时间之久。在对照PLA细胞中也观察到LPL和aP2的基础表达，尽管比诱导样品的水平明显更低。与骨诱导的PLA细胞一样，在脂肪诱导细胞中表达PPARγ1。然而，该基因的表达方式似乎不同于骨诱导的细胞，在早期(第4到14天)观察到低水平的表达，接着从3到6周表达增加。MSCs的脂肪形成诱导产生相似的基因表达方式。与PLA细胞一样，PPARγ2表达对脂肪诱导的MSCs具有特异性且在诱导的最早期不出现。在对照MSCs中也观察到极低水平的aP2和LPL，且脂肪形成诱导7天后导致在这些基因中明显增加。然而，与PLA细胞相反，在对照MSCs中没有观察到PPARγ1。相反，该转录因子的表达局限于脂肪的-MSCs。另外，该基因的表达方式类似于PPARγ2，直到诱导1周时仍观察不到表达。最后，在向脂肪形成谱系诱导或者通过生长至汇合诱导的3T3-L1细胞中检查了这些基因的表达。在脂肪诱导的3T3-L1细胞中观察到aP2和LPL的表达，同时看见PPARγ2表达的明显抑制。PLA细胞，MSCs和3T3-L1细胞的生脂分化不引起骨特异性基因OC和软骨标记CNII的表达，证实了脂肪形成诱导条件的特异性。总之，脂肪诱导的PLA细胞中PPARγ2的限制性表达，以及诱导时aP2和LPL表达增加证实了这些细胞的体外脂肪形成能力。
软骨形成分化：
用CM在微量条件下培养对PLA细胞的诱导导致形成清楚的，致密的结节，与软骨形成诱导MSCs时所见一致(Johnstone，等，1998 Exp.Cell Res.238：265-272；Yoo，等，1998 J.Bone Joint Surg.Am.80：1745-1757)。PLA细胞的软骨形成分化依赖于细胞密度和诱导条件。具体地说，PLA结节仅在含有TGFβ1的诱导培养基中形成，同时加入地塞米松可增加TGFβ1诱导的PLA结节的大小。在地塞米松单独存在时没有观察到结节形成。在单层培养物中起动PLA软骨形成的尝试没有成功。为了评估软骨形成PLA细胞产生的ECM，通过IH检查结节中CNII和硫酸化蛋白聚糖的表达。在CM中诱导14天的PLA结节使用阿尔新蓝染色为阳性，该染色特异性地鉴定硫酸化蛋白聚糖(图32，A组，AB)。为了证实这点，14天的PLA结节使用对角质素和软骨素-4-硫酸(A组，分别为KS和CS)特异性的单克隆抗体染色也为阳性。在这些结节中还观察到CNII的表达。阿尔新蓝和CNII染色在人软骨切片中也检测到，而在对照培养基中维持的高密度PLA培养物中没有发现，这证实了我们的组织学和IH方法的特异性。
除了IH染色KS和CS外，使用定量二甲基二亚甲基蓝试验测量了这些硫酸化蛋白聚糖的水平(图32，B组)。试验前用木瓜蛋白酶预先消化PLA结节和NHCK对照以排除可能的蛋白质和糖蛋白干扰。在软骨形成诱导达2周的PLA结节中观察到KS和CS的时间依赖型增加。在3周时观察到两种PGs略有减少。在高密度条件下维持的未诱导的PLA细胞也与含有这些蛋白聚糖的ECM相关联。而且，在诱导4天和7天时对照PLA细胞与诱导的样品相比含有更多的KS和CS。然而，在第14和21天时在诱导的PLA细胞中观察到明显更多的蛋白聚糖积聚。
通过RT-PCR显示了在CM中处理PLA细胞2周导致与软骨形成一致的一些基因表达(图33)。在诱导的PLA细胞中特异性地观察到CNII表达且局限于第7和10天。RT-PCR分析证实了存在CMI的两种IIA和IIB剪接变异体，尽管在图33中仅显示了IIB变异体。对NHCK对照进行软骨形成诱导时也观察到低水平的CNII表达。使用针对大型蛋白聚糖，聚集蛋白聚糖(AG)的氨基末端设计的引物在诱导的PLA结节中观察到与CNII相似的表达方式。使用羧基末端引物也观察到该蛋白聚糖的表达(PG)。但是，使用羧基引物从第7天到第14天观察到PLA结节表达聚集蛋白聚糖。与该PLA结果一致，对NHCK对照的软骨形成诱导也导致使用两种引物组都表达聚集蛋白聚糖。最后，与CNII一样，聚集蛋白聚糖的表达对诱导的PLA结节和NHCK细胞具有特异性。除了CNII外，对PLA结节的软骨形成诱导还导致肥大软骨细胞标记CNX仅在第14天的特异性表达。与此相反，在NHCK对照中没有观察到CNX表达且可能是由于其来自于关节软骨。PLA细胞也与其它胶原蛋白类型相关联。诱导的和对照PLA细胞都表达CNI和CNIII。尽管检查的大多数PLA样品表现出限制性胶原蛋白表达方式(仅在第4天)，但是一些PLA样品表现出CNI和CNIII表达到第14天。诱导的PLA细胞也表达蛋白聚糖，核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖及基因Cbfa-1。这些基因的表达在整个诱导期都可观察到且在对照PLA细胞中也可看见。尽管核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖水平保持恒定，但是在诱导后期(即，第10天和14天)CBFA-1水平出现轻微减少。在任一时间点都没有看见OC表达，证实不存在成骨分化。综合起来，除了在ECM内存在硫酸角质素和硫酸软骨素外，在诱导的PLA结节中CNII，聚集蛋白聚糖和CNX的特异性表达证实了这些细胞的软骨形成表型。
PLA细胞表达Myod1，Myf5，肌细胞生成素和肌球蛋白转录子：
来自大鼠的MSCs显示出具有生肌潜力(Saito，1995；Wakitani，1995)。为了检查PLA细胞是否具有该能力，检查了细胞中早期生肌调控因子，myoD1和myf5，以及肌细胞生成素和生肌分化的后期标记肌球蛋白重链的表达。在所有诱导时间点均观察到myod1，肌细胞生成素和肌球蛋白的表达，而myf5的表达似乎仅局限于1和3周时(图34)。与myod1的生肌决定作用一致，在1周时观察到该基因的水平升高。另外，尽管肌细胞生成素水平似乎保持恒定，但是对于肌球蛋白检测到表达的时间依赖型增加，与该蛋白质在成熟成肌细胞中的表达一致。与PLA结果一致，在从人骨骼肌制备的总RNA样品中也观察到这4种生肌基因的表达。因此，这些生肌调控蛋白的表达表明PLA细胞可能进行生肌分化。
从单个PLA细胞产生的克隆具有多谱系能力：脂肪衍生的干细胞 (ADSCs)
PLA细胞中存在多种中胚层潜力是将这些细胞鉴定为干细胞的有力证据。然而，该现象可能仅仅是由于被谱系特异性前体细胞污染。为了确定情况是否就是这样，以足够低的汇合度培养PLA细胞以启动从单个PLA细胞产生的集落形成。分离了一些多谱系克隆且那些具有三谱系潜力的克隆称为脂肪衍生的干细胞或ADSCs。与PLA细胞一样，ADSCs具有成纤维细胞样的形态学。增殖后，没有观察到其它细胞形态学的证据，证实ADSC培养物的同种性。对500个PLA克隆分离物的分析证实了在检查的总克隆数的约6％中具有分化潜力。7个ADSC分离物表现出三谱系潜力，分化成成骨，脂肪形成和软骨形成谱系的细胞(表11)。除了三谱系ADSCs外，还分离了一些双谱系克隆(O/A，O/C和A/O)和单一脂肪形成谱系克隆(图35)。在所有PLA克隆群体中观察到通过组织学染色测量的分化水平的定性增加。最后，三谱系ADSCs的分离和增殖不改变通过IF显示的CD表达谱型，且在双谱系克隆中也没有检测到差别(图36)。三谱系ADSCs的RT-PCR分析证实了其多谱系潜力(图36)。
在OM/VD中诱导ADSCs2至4周导致OC表达且仅在3和4周时表达，与骨诱导的PLA细胞一致，其中在2周时检测不到OC表达。除了OC外，在所有诱导时间点可见ON，OP，CNI和AP的表达。与PLA细胞一样，OC的表达对诱导的ADSCs具有特异性，在诱导的和对照的克隆中都检测不到脂肪标记PPARγ2。脂肪诱导ADSCs2和4周导致aP2和LPL的特异性表达。令人感兴趣的是，在脂肪ADSCs中观察到PPARγ2显著减少，仅在4周时微弱表达。与在异源性PLA群体中所见一样，在脂肪形成ADSCs中检测不到成骨分化。最后，在软骨形成诱导2周时检测到聚集蛋白聚糖，CNX，核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖的表达。在该诱导时间点在这些细胞中没有观察到CNII的表达。与PLA细胞一样，聚集蛋白聚糖和CNX的表达局限于软骨形成ADSCs，也没有检测到OC表达。与IH数据一起，RT-PCR结果证实了ADSC分离物的多谱系能力且表明PLA群体的多谱系能力可能是由于存在推定的干细胞群体。
PLA细胞可能具有神经形成潜力：
中胚层产生一些结缔组织，而上面的外胚层是多种神经组织和细胞类型的前体。最近有证据表明MSCs可向非中胚层谱系诱导，分化成具有推定的神经形成潜力的细胞(Deng，等，2001 Biochem.Biophys.Res.Commun.282：148-152；Sanches-Ramos，等，2000 Exp.Neurol.164：247-256；Woodbury，等，2000 J.Neurosci.Res.61：364-370)。有可能PLA和MSCs之间的相似性可超出中胚层潜力。因此，根据Woodbury等的方法将PLA细胞向神经外胚层谱系诱导(Woodbury，等，2000 J.Neurosci.Res.61：364-370)并检查包括NSE，trk-a和MAP-2的神经标记的表达，或者分别为星形细胞和少突胶质细胞标记的GFAP和GalC的表达。为了诱导PLA细胞，用1mMβ-巯基乙醇(βME)和20％FBS预处理亚汇合的培养物最多24小时(预诱导)，接着在含有5-10mMβME的无血清培养基(神经形成培养基/NM)中诱导达8小时。预诱导没有改变PLA细胞的成纤维细胞样形态(图38，A组-PLA/0小时)。早在NM中诱导30分钟时就注意到形态学改变，有10％的培养物认定为神经元样表型。如果向NM中加入FBS观察到无形态学改变。诱导60分钟将神经元样细胞的比例增加到培养物的20％。诱导3小时将该表型增加到70％的最大值且超过该诱导时间没有观察到明显的增加。NM-诱导的PLA细胞进行回缩，形成具有多个突起的致密细胞体。随着诱导时间的延长细胞体变得更接近球形且细胞具有展现出的二级分支(A组-PLA/2小时与PLA/8小时)。在NM中诱导引起NSE，trk-a和NeuN的显著表达，与神经元谱系一致(B组)。事实上100％的PLA培养物对NSE和trk-a染色都为阳性。与NSE结果相反，不是所有的PLA细胞都表现出NeuN阳性，且可能代表了PLA培养物内一个更确定的神经元样细胞亚类。没有观察到成熟神经元标记MAP-2和NF-70的表达，表明诱导的PLA细胞表现为早期发育阶段。另外，诱导的PLA细胞不表达GalC和GFAP，分别表明PLA细胞不分化成少突胶质细胞和星形细胞。最后，对照PLA细胞不表达任何神经元，少突胶质细胞或星形细胞标记，证实了我们的诱导条件和染色方法的特异性。
为了进一步评估NM诱导时产生的谱系，通过RT-PCR分析PLA细胞(图38，C组)。在NM中诱导4.5小时的PLA细胞表达显著量的nestin，它是在神经干细胞和前体中以显著量表达的一种中间体丝状蛋白(Lendahl，1990)。在未诱导的PLA细胞和在从人脑制备的总RNA中也检测到Nestin表达。在NM-诱导的细胞或在脑中没有观察到ChaT，即一种末梢神经标记的表达。另外，NM-诱导的PLA细胞不表达GAD65，即一种成熟神经元标记，且与使用抗该神经元阶段的抗体(例如，MAP-2，NF-70)无IH染色一致。与IH结果中的所见一样，PLA细胞也不表达GFAP。在诱导9小时的PLA细胞中观察到相似的表达谱型。表达nestin，NSE，NeuN和trK-a，与无ChaT，或GFAP表达一起表明PLA细胞能够分化成早期神经元表型，即具有CNS的特征。因此在NM中培养的PLA可分化成外胚层谱系。另外，Lumelsky等(Lumelsky，N.，等，2001 Science 292：1389)的最近数据表明可诱导胚胎干细胞分化成表达nestin的细胞。nestin-阳性细胞也被鉴定为胰前体细胞。因此，Lumelsky的数据表明nestin-阳性细胞可分化成内胚层谱系和外胚层谱系。通过另外表达胰岛素，葡萄糖转运蛋白2，胰岛淀粉样多肽，GATA4，GATA6，白蛋白，酪氨酸氨基转移酶中的一种或多种可进一步证实内胚层表型。
                     表5：通过培养基添加诱导的谱系特异性分化
    培养基   培养基   血清 添加物
    对照   DMEM   10％FBS 无
    脂肪形成(AM)   DMEM   10％FBS 0.5mM异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)，1μM地塞米松，10μM胰岛素，200μM吲哚美辛，1％抗生素/抗真菌剂
    骨生成(OM)   DMEM   10％FBS 0.1μM地塞米松，50μM抗坏血酸-2-磷酸，10mMβ-磷酸甘油，1％抗生素/抗真菌剂
    软骨形成(CM)   DMEM   1％FBS 6.25μM/ml胰岛素，10ng/ml TGFβ1，50nM抗坏血酸-2-磷酸，1％抗生素/抗真菌剂
    生肌(MM)   DMEM   10％FBS5％HS 0.1μM地塞米松，50μM氢化可的松，1％抗生素/抗真菌剂
    神经形成(NM)   DMEM   无 5-10mMβ-巯基乙醇
                   表6：抗CD抗原的单克隆抗体：报导的细胞特异性和分布
    CD抗原   克隆 细胞特异性
    29     整联蛋白β1   MAR4 广泛分布-淋巴细胞，单核细胞，粒细胞，在红细胞中无
    31     PECAM-1   9G11 内皮细胞，血小板，单核细胞，粒细胞，造血细胞前体
    34     -   581 内皮细胞，一些组织成纤维细胞，造血细胞前体
    44     Pgp-1   G44-26 白细胞，红细胞，上皮细胞，血小板
    45     LCA   HI30 白细胞，造血细胞
    58     LFA-3   L306.4 广泛分布-造血细胞，内皮细胞，成纤维细胞
    71     TfR   H68.4 大多数分裂细胞
    90     Thy-1   5E10 未成熟的CD34+细胞，能长期培养的细胞，原始祖细胞
    105     Endoglin   - 内皮细胞，B细胞前体，MsCs
    SH3     -   - 间充质干细胞
                  表7：寡核苷酸引物序列和预期的PCR产物大小
  谱系   基因 寡核苷酸引物     产物大小
骨 骨粘连蛋白(ON) 5′TGTGGGAGCTAATCCTGTCC 400bp
3′T CAGGACGTTCTTGAGCCAGT
骨桥蛋白(OP) 5′GCTCTAGAATGAGAATTGCACTG 270bp
3′GTCAATGGAGTCCTGGCTGT
骨钙蛋白(OC) 5′GCTCTAGAATGGCCCTCACACTC 300bp
3′GCAATCCTAAGACCGGGGATAG
骨涎蛋白(BSP) 5′GCTCTAGAATGAAGACTGCTTTAATT 185bp
3′ACTGCCCTGAACTGGAAATC
  核结合因子α-1(CBFA-1) 5′CTCACTACCACACCTACCTG 320bp
3′TCAATATGGTCGCCAAACAGATTC
I型胶原蛋白(CNI)(α1链) 5′GAGAGAGAGGCTTCCCTGGT 300bp
3′CACAATACCACTCCGG
碱性磷酸酶(AP) 5′TGAAATATGCCCTGGAGC 475bp
3′TCACGTTGTTCCTGTTTAG
脂肪 aP2 5′TGGTTGATTTTCCATCCCAT 150bp
3′TACTGGGCCAGGAATTTGAT
LPL 5′GAGATTTCTCTGTATGGCACC 275bp
3′CTGCAAATGAGACACTTTCTC
  PPAR  Y1 5′GCTCTAGAATGACCATGGTTGAC
3′ATAAGGTGGAGATGCAGGCTC
PPAR  Y2 5′GCTGTTATGGGTGAAACTCTG
3′ATAAGGTGGAGATGCAGGTTC
PPAR  δ 5′GCCAACGGCAGTGGCTTTGTC
3′TTAGTACATGTCCTTGTAGATCTC
软骨 II型胶原蛋白(α1链) 5′ATGATTCGCCTCGGGGCTCC 260bp
3′TCCCAGGTTCTCCATCTCTG
聚集蛋白聚糖 5′GCAGAGACGCATCTAGAAATT 505bp
3′GGTAATTGCAGGGAACATCAT
核心蛋白聚糖 5′CCTTTGGTGAAGTTGGAACG 300bp
3′AGGAAGTCCGTTAGGG
双糖链蛋白聚糖 5′TGCAGAACAACGACATCTCC 475bp
3′AGCTTGGAGTAGCGAAGCAG
X型胶原蛋白 5′TGGAGTGGGAAAAAGAGGTG 600bp
3′GTTCMCTCAGGATCA
肌肉 MyoD1 5′AAGCGCCATCTCTTGAGGTA 500bp
3′GCGCCTTTATTTTGATCACC
Myf5 5′CCACCTCCAACTGCTCTGAT 250bp
3′GGAGTTCGAGGCTGTGAATC
肌细胞生成素 5′TGGGCGTGTAAGGTGTGTAA 130bp
3′TRGAXAGGTGCTTCTCTT
肌球蛋白 5′TGTGAATGCCAAATGTGCTT 750bp
3′GTGGAGCTGGGTATCCTTGA
神经 CHaT 5′TACAGGCTCCACCGAAGACT 375bp
3′AGCAGAACATCTCCGTGGTT
突触泡蛋白(SYN) 5′TTCAGGCTGCACCAAGTGTA 350bp
3′CAGGGTCTAGCTTCTA
  胶质原纤维酸性蛋白(GFAP) 5′AATGCTGGCTTCAAGGAGAC 405bp
3′CCAGCGACTCAATCTTCCTC
GAD65 5′TGGCGATGGGATATTTTCTC 300bp
3′GCACTCACGAGGAAAGGAAC
Nestin 5′GGAGTCGTTTCAGATGTGGG 240bp
3′AGCTCTTCAGCCAGGTTGTC
表8：评估PLA细胞的神经形成分化：抗体和确定的神经原性谱系
    抗体名称 蛋白质 谱系
    NeuN 神经元特异性核蛋白 神经元和神经祖细胞
    NF-70 神经丝70kDa 神经元
    trk-A trk-A(NGF受体) 神经元
    MAP2 微管相关蛋白-2 神经元(成熟)
    GalC 半乳糖脑苷脂 少突胶质细胞
    GFAP 胶质原纤维酸性蛋白 星形细胞
    τ-tau tau 神经元，少突胶质细胞，星形细胞
                       表9：碱性磷酸酶诱导水平
  细胞系     AP诱导(“x”-倍数)
    第14-21天     第21-28天     第28-35天     第35-42天
  PLA-Dex     +17.2     +1.6     -2.9     +3.2
  PLA-VD     +71.3     -1.3     -1.9     +1.9
  MSC-Dex     +54.2     -1.2     +2.7     NS
  MSC-VD     NS     -1.5     +3.5     +1.5
  NHOst-Dex     -1.4     NS     -2.8     -1.2
  NHOst-VD     +1.4     -2.2     -25.5     ND
“+”上调酶诱导
“-”下调酶诱导
NS检测到无显著差异
ND未测定
            表10：磷酸钙水平的定量
    细胞系     总钙含量变化(“x”-增加/减少的倍数)
    PLA-Dex     56
    PLA-VD     122
    MSC-Dex     12
    MSC-VD     67
    NHOst-Dex     ND
    NHOst-VD     ND
ND：未测定
                      表11：谱系特异性ADSC分化总结
  谱系特异性分化
  O，A，C   O，C   A，O   A，C   仅O   仅A   仅C
  #ADSC克隆   7   10   3   3   0   6   0
表12：对照PLA细胞上CD标记表达的流式细胞术分析
    CD抗原     几何平均数
    CD4     2.44
    CD8     2.31
    CD11c     2.49
    CD13     148.88
    CD14     2.43
    CD16     2.38
    CD19     2.92
    CD31     2.22
    CD33     2.61
    CD34     3.55
    CD44     16.92
    CD45     2.52
    CD49d     5.33
    CD56     2.66
    CD61     3.68
    CD62E     2.30
    CD71     3.76
    CD90     25.96
    CD104     2.31
    CD105     8.39
    CD106     2.45
    SH3     8.95
    STRO-1     31.26
    -ve     2.59
讨论
为了进一步证实PLA细胞是否提供间充质干细胞群体，我们对该细胞群体进行了广泛的分子和生化鉴定，且一些PLA克隆称为脂肪衍生的干细胞，或ADSCs。将PLA群体向包括骨骼和脂肪的多种中胚层谱系诱导，且通过RT-PCR，间接免疫荧光(IF)和Western印迹证实了谱系特异性基因和蛋白质的表达。另外，使用确定的生化试验测量了碱性磷酸酶，即一种骨代谢的标记，和脂肪生成酶甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)的活性，以及软骨形成诱导时硫酸化蛋白聚糖的积累。还使用组织学分析和RT-PCR证实了ADSCs的多谱系分化。最后，还检查了PLA细胞分化成神经原性谱系细胞的潜力。
我们已证实了从人脂肪吸出物获得的异源性PLA细胞群体及其克隆衍生物ADSCs的多谱系能力。与该研究一致，我们通过显示一些谱系特异性基因和蛋白的表达证实了PLA细胞和ADSC克隆能够进行成骨，脂肪形成，软骨形成和生肌分化。除了中胚层谱系外，PLA细胞似乎还向与神经原性表型一致的谱系分化。综合起来，分子和生化数据表明PLA细胞可提供从人脂肪组织分离的推定的干细胞群体。
PLA细胞表达相似于MSCs中观察到的CD标记的补体：
通过鉴定在细胞表面表达的特有蛋白质可实现对细胞群体的鉴定。后来一些小组根据其表达的细胞特异性蛋白(例如，STRO-1，SH2，SH3，SH4)和“聚簇指定(cluster designation)”(CD)标记鉴定了MSCs(Bruder，等，1998 J.Orthop.Res.16：155-162；Conget，等，1999 J.Cell Physiol. 181：67-73；Pittenger，等，1999 Science 284：143-147)。本研究证实了在PLA细胞上表达特有组合的细胞表面蛋白。而且，PLA和MSC群体表现出相似的表达谱型。与MSCs类似，PLA细胞通过IF显示出表达CD29，CD44，CD71，CD90，CD105/SH2，SH3和STRO-1，另外通过FC证实表达CD 13(图24)。与MSCs类似，PLA细胞在细胞表面不表达CDs 4，8，11，14，16，19，31，33，34，45，56，和62E(图24)。相似的CD谱型表明PLA细胞可能是类似于MSCs的干细胞群体。然而，该相似性程度表明PLA细胞可能仅仅是位于脂肪区的或者污染的MSC群体。脂肪切除术(Lipoplasty)引起多处血管破裂且尽管使用了血管收缩剂最小化失血，但是处理的PLA细胞团可能是从外周血途径获得的MSCs(Zvaifler，等，2000 Arthritis Res.2：477-488)。然而，在PLA和MSC群体之间似乎存在一些精细的区别。与MSCs相反，使用IF在PLA细胞上没有检测到CD58表达，而在MSCs上看见表达(图23)。另外，还报道了MSCs表达CD 104，CD 106和CD140a(Bruder，等，1998 J.Orthop.Res.16：155-162；Conget，等，1999 J.Cell Physiol.181：67-73；Pittenger，等，1999 Science 284：143-147)。使用IF或FC在PLA细胞上都没有检测到这些CD抗原的表达(表12)。这些区别表明PLA群体可能是一种不同的干细胞群体。然而，不能排除PLA细胞是MSCs的克隆变异体的可能性。
PLA细胞进行骨生成：
间充质形成(Mesengenic)过程包括：1)祖细胞的增殖，2)通过特定生长因子和细胞因子的作用定型这些细胞，3)谱系发展成表达特定基因的临时细胞类型和4)具有增殖停止和组织特异性产物的生物合成为特征的最终的分化(Bruder，等，1997 J.Cell Biochem.64：278-294；Caplan 1994 Clin.Plas.Surg.21：429-435；Jaiswal，等，1997 J.Cell Biochem.64：295-312)。骨生成密切遵循该方式，成骨前体细胞发育成有丝分裂型成骨细胞前体和分泌型成骨细胞，后者丧失其有丝分裂潜力并形成成熟骨细胞(Owen，等，1990 J.CellPhysiol.143：420-430；Stein，等，1989 Conncet.Tissue.Res.20：3-13)。因此，成骨分化的特征在于有增殖，基质合成/成熟和矿化的不同时期(Owen，等，1990 J.Cell Physiol.143：420-430)。与此一致，PLA细胞进行成骨分化时可观察到不同的时期。在诱导的第一周内测量到相对的线性生长率，该时期的特征在于AP活性和Ca2+沉积可忽略不计。在第9天和第13天之间增殖率增加且伴随着到第13天出现AP。在第13天和第15天之间增殖暂时停止且在该时间点期间没有观察到明显的AP染色增强。诱导超过2周后观察到细胞数增加和AP染色增强。这些发现与报导的颅盖培养物中的事件顺序相似，其中细胞首先增殖，然后表现出AP水平升高(Aronow，等，J.Cell.Physiol.143：213-221；Owen，等，1990 J.Cell Physiol.143：420-430)。另外，已推定糖皮质激素可刺激成骨祖细胞增殖(Shalhoub，等，1989 Biochem.28：5318-5322；Tenenbaum，等，1985 Endo 117：2211-2217)。除了AP活性外，到第3周看见明显的钙水平，且在PLA细胞中注意到矿化期开始。基质矿化增加伴随着AP染色的显著增强且与在大鼠颅盖培养物中发现的结果一致(Collin等，1992 Calcif.Tiss.Int.50：175-183；Shalhoub，等，1989 Biochem.28：5318-5322)。矿化增加还伴随着增殖停止(第25天)，接着PLA细胞数减少。该减少很可能是由于无机物沉积增加引起且与ECM的表观增加和形成无细胞的结节间区域同步。与此一致，已表明ECM形成导致大鼠成骨细胞(Owen，等，1990 J.Cell Physiol.143：420-430)和大鼠骨髓基质细胞(Malaval，等，1994J.Cell.Physiol.158：555-572)的增殖停止。综合起来，该结果表明PLA细胞在成骨分化期间具有不同的增殖，合成和矿化时期。
体内糖皮质激素过量和/或长期处理与骨形成的减少相关(Baylink 1983N.Engl.J.Med.309：306-308)，这很可能通过祖细胞向成骨细胞的转变减少引起(Chyun，等，1984 Endo.114：477-480)。与地塞米松相反，用维生素D代谢产物可处理可恢复体外骨衍生的细胞的骨矿化和骨形成(Beresford，等，1986 Endo.119：1776-1785；Kanis，等，1982，参见 Endocrinology of Calcium Metabolism，JA Parsons编，New York：Raven Press，第321页)。因此，检查了地塞米松和1，25-二羟维生素D3(VD)对PLA骨生成的影响。AP的骨/肾/肝同工型在碱性pH下催化无机和有机磷酸盐的裂解。尽管在体内骨生成期间其确切功能还不清楚，但是在成骨分化开始时成骨细胞前体和MSCs中的AP表达水平上调且认为该酶通过其焦磷酸酶活性在基质矿化中起关键性作用(McComb，等，1979  Alkaline Phosphatase，New York：Plenum Press；Robison1923 Biochem.J.17：286-293；Siffert 1951 J.Exp.Med.93：415-426)。因此，对AP水平和基质矿化的分析是骨生成的重要指标。据此，在诱导的PLA样品中测量了这些参数并与同样处理的MSCs和作为对照的人成骨细胞进行了比较。
尽管成骨分化对AP活性和基质矿化的总体影响在PLA细胞和MSCs中似乎相似，但是酶活性的动力学和对诱导条件的反应依赖于分化阶段而不同，表明这两个群体可能具有不同的表型。在PLA和MSC群体中诱导2至3周期间都出现AP活性。VD处理PLA细胞导致相对于Dex诱导在3周时的AP活性水平明显更高且诱导2至3周酶水平更高(17.2倍/Dex与71.3倍/VD)。在各分化阶段都发现该VD效果。相反，在MSCs中诱导条件的效应相反，Dex在各分化阶段产生更大的AP活性。除了在测量的酶活性和诱导水平中的差异外，AP活性的动力学在PLA细胞和MSCs之间有区别。在Dex和VD-诱导的PLA细胞中AP活性都是双阶段型。具体地说，在3和6周的诱导条件下都测量到峰值AP水平且在5周时检测到水平降低。与PLA细胞类似，在Dex-处理的MSCs中也观察到双阶段型反应。然而，AP活性的动力学在Dex-处理的MSCs中似乎加快，在3和5周时检测到峰值且在4周时酶减少。另外，VD刺激MSCs时没有观察到清楚的双阶段谱型，导致进一步证实了这两个细胞群体之间推测的区别。
PLA和MSC群体中双阶段型反应的原因还不清楚。使用大鼠颅盖模型的时间过程研究表明AP活性在多骨ECM沉积期间的早期达到峰值，且随后下调(Owen，等，1990 J.Cell Physiol.143：420-430；Rodan和Rodan 1984，参见 Bone and Mineral Research，W.A.，Amsterdam编：Elsevier SciencePublishers，第244-285页；Stein，等，1990 FASEB J.4：3111-3123)。在骨髓基质细胞培养物中观察到相似的谱型且与高度基质矿化和最终成骨分化成骨细胞相关联(Bruder和Caplan 1990 Bone 11：189-198；Jaiswal，等，1997 J.Cell Biochem.64：295-312；Malaval，等，1994 J.Cell.Physiol.158：555-572)。从4到5周观察到的PLA中AP活性降低与基质内磷酸钙水平升高相关联。然而，我们了解到没有关于在该基质合成期外定量AP水平的研究。因此，本研究首次检查了干细胞中在延长的时间期间内的AP活性。很可能PLA和MSC中AP活性的谱型代表了对成骨诱导的阶段特异性反应。与此一致，在VD-处理的未成熟骨肉瘤培养物中观察到AP增加(Majeska，等，1982 J.Biol.Chem.257：3362)，而在更多的成熟细胞中检测到剂量依赖型抑制，可认为该效应代表了一部分细胞回复成骨原细胞群体或者它们分化成骨细胞，即一种具有低AP活性的细胞群体。因此，PLA和MSC样品中AP水平的减少可能是由于一部分细胞最终分化，而第二个AP峰可能是由于一部分成骨祖细胞的延迟发育。
与AP结果一致，用VD诱导PLA细胞与地塞米松相比钙水平总体增加更多。与AP活性类似，在PLA细胞和MSCs之间观察到钙积聚有精细的区别。与AP数据一致，直到诱导3周时没有观察到PLA细胞的基质矿化。在此时间点之后，Dex刺激似乎对基质矿化的速率无明显影响。然而，在VD-处理的PLA样品中检测到显著增加，6周的样品含有明显更多的磷酸钙。尽管在3和6周之间的VD样品中AP无显著区别，但是仍然发生该矿化率的增加。另外，在4和5周之间的PLA细胞中观察到的AP活性降低没有转变成钙水平减少。相反，在这些细胞中无机物积聚继续增加。以前在人MSCs中已观察到该方式(Jaiswal，等，1997 J.Cell Biochem.64：295-312)。与PLA细胞一样，在MSCs中观察到矿化的时间依赖型增加，在VD-处理的样品中观察到总体增加更多。在这些细胞中基质矿化的方式与诱导前4周内AP的活性较好地相关。具体地说，在Dex-处理的MSCs中AP活性更高导致钙积聚更多。然而，诱导4至5周之间发生显著转变，在VD-处理的MSCs中AP活性的少量增加引起钙水平的显著增加。而且，在VD-诱导的MSCs中AP活性明显低于Dex-处理的细胞，另外VD处理产生明显更高的钙，这表明MSCs对VD超时诱导更敏感。综合起来，成骨诱导时出现AP和矿化ECM的积聚证实了PLA细胞的成骨表型。另外，在这两种标记的动力学和谱型中观察到的区别表明PLA群体可能不同于MSCs。
在骨生成期间，成骨细胞合成掺入周围ECM支架结构中的广大非蛋白分子库。该基质的组成成份，及其分泌动力学可帮助确定骨组织的特有特性且可用于证实成骨分化。然而，除了少量例外，实际的基质蛋白质不是骨骼所特有的。一个这种例外是蛋白质骨钙蛋白(OC)。作为一种含有三个γ-羧基谷氨酸残基的高度保守的蛋白质，OC是体外羟基磷灰石形成的抑制剂，表明该蛋白质参与矿化(Boskey，等，1985 Calc.Tiss.Int.37：75；Price，等，1976Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73：1447-1451)。与此一致，OC由成熟成骨细胞表达且在矿化期间其表达水平显著升高(Collin，等，1992 Calcif.Tiss.Int.50：175-183；Malaval，等，1994 J.Cell.Physiol.158：555-572；Owen，等，1990 J.CellPhysiol.143：420-430；Shalhoub，等，1992 J.Cell.Biochem.50：425-440；Stein，等，1990 FASEB J.4：3111-3123)。尽管认为OC是成骨细胞分化相对后期的标记，但是它在合成大量基质前在骨髓基质细胞培养物中骨形成的早期表达(Malaval，等，1994 J.Cell.Physiol.158：555-572)。与成骨分化一致，骨诱导的PLA细胞表达OC。然而，其表达依赖于骨诱导培养基的组成。具体地说，在未诱导的PLA细胞或在用含有地塞米松的OM诱导的PLA细胞中都没有观察到骨钙蛋白的表达。在Dex-处理的PLA细胞中缺乏OC表达可能是由于与糖皮质激素相关的抑制效应引起(Cooper，等，1999 J.Endocrinol.163：159-164)。与此一致，在用地塞米松诱导的大鼠MSCs和人骨细胞培养物中观察到微弱的OC水平(Beresford，等，1986 Endo.119：1776-1785；Leboy，等，1991 J.Cell Physiol.146：370-378)。另外，在本试验中诱导人成骨细胞系NHOst时没有观察到OC(图27)。与地塞米松诱导相反，仅在VD刺激时看见OC表达且与证实骨肉瘤细胞中OC表达的VD-依赖型增加(Price，等，1980J.Biol.Chem.225：11660-11663)及其对OC启动子的刺激(Lian，等，1988 Clin.Orthop.Rel.Res.226：276-291；Yoon，等，1988 Biochem.27：8521-8526)的研究一致。除了在VD诱导时出现外，还观察到OC清楚的双阶段表达方式。与骨髓MSCs一致，OC的出现与早在诱导4天时出现的分化阶段的开始相关联。诱导1周后检测到OC水平显著升高。诱导2周导致OC表达的明显抑制且随后在超过3周后表达增加。在3周时OC的再出现与周围ECM的合成和矿化同步且支持了OC在基质钙化中推测的作用。对于OC的双阶段谱型，出现与AP表达中所观察到的相似的效果：即对VD的发育阶段-特异性反应。除了VD外，一些其它的诱导剂也对骨生成产生阶段-特异性影响，包括TGFβ(Breen，等，1994 J.Cell.Biochem.160：323-335)。与VD诱导的PLA细胞类似，在MSCs中也检测到OC，但是观察到与在这些细胞中观察到的OC表达方式有一些区别。首先，与PLA培养物相反，在未诱导的MSCs中观察到低水平的OC表达。在对照MSCs中OC表达的基础水平极低且与大鼠MSCs培养物中组成型OC表达的报导一致(Malaval，等，1994 J.Cell.Physiol.158：555-572)。其次，在Dex-处理的MSCs中观察到OC表达。最后，尽管VD-诱导增加MSCs中的OC表达，但是没有观察到明显的双阶段谱型。综合起来，骨诱导的PLA细胞表达骨特异性OC证实了其成骨能力。另外，在MSCs和PLA细胞之间观察到的不同的OC表达方式和对诱导因子的分化反应进一步证实了这两个群体可能具有独特的表型。
除了OC外，骨诱导的PLA细胞也表达一些其它的成骨谱系特征性基因，包括OP，ON，CBFA1，AP和CNI。Cbfa-1(核结合因子-1或Osf-2)是由基因CBFA1编码的转录调控因子，该基因是小种牛(runt)结构域基因家族的一个成员(Kania，等，1990 Genes Dev.4：1701-1713)。从原代成骨细胞核提取物分离后，Cbfa1因子表现出与包括OC，OP，BSP和CNI型的一些成骨基因的启动子结合，因此充当成骨分化的总调节剂(Ducy，等，1997 Cell 89：747-754)。另外，人CBFA1的C-末端区的突变与锁骨颅骨发育异常(CCD)，即一种特征在于骨骼型式畸形的常染色体显性病症相关(Jones，等，1997Smith′s Recongizable Patterns of Human Malformation，第5版，Philadelphia：WB Saunders Company；Mondlos，等，1997 Cell 89：773-779；Otto，等，1997 Cell89：765-771)。与其建议的作用一致，Dex和VD-诱导的PLA细胞在所有诱导时间点都表达CBFA1且在两种诱导条件之间没有观察到表达水平的显著差异。与PLA的结果一致，CBFA1也在骨诱导的MSCs中表达且在NHOst细胞中局限于分化晚期。最后，未分化的PLA细胞和MSCs都表达低水平的该生长因子。然而，PLA细胞的成骨诱导导致使用基因阵列证实CBFA1的表达增加约2倍。另外，最近在发育的小鼠中的研究表明在成骨和软骨形成谱系的祖细胞中都表达Cbfal(Ducy，等，1997 Cell 89：747-754)。因此，在对照PLA细胞中CBFA1的表达可能代表了在具有祖细胞表型的细胞中的基础基因表达。
与CBFA1一样，在整个分化期间在对照和成骨诱导的PLA细胞，MSCs和NHOsts中观察到OP，ON，AP和CNI的表达。在这些细胞类型中在各诱导条件下使用RT-PCR检测的CNI表达似乎相当。然而，使用基因阵列在骨诱导的PLA细胞中检测到该基因的表达减少且与认为糖皮质激素对胶原蛋白表达的抑制效应一致(见Cooper，等，1999 J.Endocrinol.163：159-164的综述)。与其它基因一样，ON和OP表达似乎不受诱导条件的影响。另外，成骨诱导导致以微阵列测量时OP水平显著降低，且与诱导大鼠骨髓基质细胞时观察到的降低一致(Malaval，等，1994 J.Cell.Physiol.158：555-572)。然而不局限于成骨细胞，在骨组织中都发现高含量的OP和ON。因此，其表达与类似于OC的成骨细胞特异性基因一起证实了PLA细胞的成骨能力。除了这些成骨基因之外，骨诱导的PLA细胞表达一些其它基因，包括蛋白聚糖，核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖和转录因子PPARγ1和PPARδ。
除了RT-PCR结果外，使用IF和Western印迹还观察到成骨分化特征性的一些蛋白的表达。与RT-PCR数据一致，对照和骨诱导的PLA细胞表达与成骨表型一致的一些蛋白质，包括CNI，核心蛋白聚糖，双糖链蛋白聚糖，OP和ON。成骨诱导时没有观察到CM，核心蛋白聚糖，双糖链蛋白聚糖和ON表达的显著差异且在诱导3周后看见OP表达增加。使用IF在对照和骨诱导的PLA细胞中也观察到ON和OP的表达，在两种细胞群体之间检测到细胞内表达方式有区别。具体地说，在对照和诱导的PLA细胞中OP表达集中在核周位置，而在MSC样品中其分布似乎更均匀。在骨生成期间的MSCs中已观察到核周集中且它是分泌蛋白的特征(Zohar，等，1998 Eur.J.Oral Sci.106：401-407)。然而，与该研究相反，在我们的MSC群体中没有观察到OP的清楚核周集中且可能代表了一个克隆变异体或特异性培养条件。相反，在MSCs中OP集中到细胞表面和细胞突起处。在MSCs中已经观察到该集中分布且可能表明分化期间这些细胞进行细胞迁移(Zohar等，1998 Eur.J.OralSci.106：401-407)。在对照PLA和MSC样品中对于ON观察到相似的细胞内模式。在这些细胞中，ON以细点状方式分布于整个细胞中且在细胞核中也发现了低水平的ON。成骨诱导不改变MSCs中的该模式。然而，在PLA细胞分化时丧失核表达。而且，尽管事实上在所有对照PLA细胞中都发现了ON，但是，不是所有的骨诱导的PLA细胞都是ON-阳性。相反，在高细胞密度区域发现该蛋白质的表达。最后，在对照PLA细胞中没有观察到OC的表达，而在未分化的MSCs中检测到极低的水平，与RT-PCR分析结果一致。成骨诱导引起小部分成骨PLA细胞表达OC，而更大百分比的成骨MSCs表达该蛋白。OC的表达模式在成骨PLA和MSCs中都相似：分布于整个细胞中且沿细胞表面的确定区域集中。与CNI，OP和ON一起，OC的表达支持了RT-PCR数据且进一步证实了PLA细胞的体外成骨能力。
PLA细胞进行生脂分化：
培养物中脂肪细胞的分化依赖于许多因素，包括血清，激素添加物(胰岛素)和药物试剂(吲哚美辛，IBMX)(Green，等，1974 Cell 3：127-133；Russell，TR 1976 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73：4516-4520；Williams和Polakis 1977Biochem.Biophys.Res.Commun.77：175-186)。然而，与最终分化相反，脂肪形成程序的起动并不需要该脂肪形成剂而可能依赖于培养物汇合度的增加。而且，已知在大多数脂肪细胞前体定向脂肪形成谱系前必然发生汇合时的可逆性生长停止(Scott，等，1982，J.Cell Biol.94：400-405；Speigelman和Farmer 1982 Cell 29：53-60；Trayhurn和Ashwell 1987 Proc.Nutr.Soc.46：135-142)。随着生脂分化的进展，观察到增殖潜力丧失且复制潜力的不可逆丧失是脂肪细胞最终分化的特征。为了调查PLA细胞是否表现出相同特性，将PLA增殖与通过油红O积聚测量的脂肪形成相关联。与对脂肪细胞前体细胞系的研究一致，在汇合的PLA培养物中发生高水平的分化。分化的PLA细胞设定为形态更膨胀且早在诱导2周时开始积聚细胞内脂滴。分化进展时PLA细胞数无明显增加，表明细胞数和生长动力学与PLA脂肪形成相联系(图29)。
PLA-Cd标记和FCM-添加物(Supplements)
生脂分化伴随着一些分子和生化事件，包括催化葡萄糖转变成脂肪酸和甘油三酯的脂肪生成酶增加。甘油-3-磷酸(G3P)是脂肪组织中甘油三酯合成的主要底物且通过G3P的酶来源，磷酸甘油脱氢酶(GPDH)的显著增加可鉴定3T3细胞的脂肪转化(Kuri-Harcuch，等，1978 J.Biol Chem.252：2158-2160；Pairault Greem 1979 J.Biol.Chem.76)。据此，在脂肪诱导的PLA和3T3-L1细胞中测量了GPDH的活性。直到分化3周时在分化细胞和未诱导的对照之间没有检测到GPDH水平的显著差异。另外，分化的起始期与更高的基础GPDH水平相关联。脂肪诱导的PLA细胞中GPDH水平升高与油红O染色的出现相关联(图29)。诱导3至4周导致在分化的PLA细胞和3T3-L1对照中GPDH都显著增加且与脂类积聚的增加同步。再继续分化一周在这些细胞群体中的酶水平没有明显改变。在脂肪诱导的MSCs中也观察到相同方式的GPDH活性。因此，向脂肪形成谱系诱导的PLA细胞中GPDH酶活性的增加表明这些细胞可能在进行生脂分化。
与骨生成一样，脂肪形成的特征在于表达涉及脂肪合成和贮存的一组不同的基因。一种该基因，即PPARγ2，与PPARγ1和PPARδ一起，是PPAR核激素受体超家族的一个成员(综述参见(Fajas，等，1998 Curr.Biol.10：165-173))。PPARγ2已被鉴定为一种异二聚体复合物(具有ARF6和视网膜X受体)的一部分，该复合物充当组织特异性aP2基因的关键转录调控物(Totonoz，等，1995 Nucl.Acid Res.)。另外，PPARγ2在脂肪中特异性地以高水平表达且在培养的脂肪细胞系分化的早期被诱导(Totonoz，等，1994 GenesDev.8：1224-1234；Totonoz，等，1994 Cell 79：1147-1156)。与此一致，在脂肪诱导的PLA和MSC样品中特异性地检测到PPARγ2。通过缺乏该转录因子来鉴定这些细胞群体的起始分化(即，4天)且与以前来自分化的3T3脂肪细胞的结果一致(Totonoz，等，1994 Genes Dev.8：1224-1234；Totonoz，等，1994Cell 79：1147-1156)。诱导一周后观察到可检测的PPARγ2水平。然而，在脂肪诱导的PLA细胞中在该时间点的表达水平明显更高，表明PPARγ2表达的动力学在MSC和PLA群体之间略有区别。在PLA细胞和MSCs之间也观察到PPARγ1表达的区别。在PLA细胞和MSCs中观察到PPARγ1表达的相似时间依赖型增加。然而，MSCs的早期分化(即，4天)与该转录因子的缺乏相关联，而在诱导的PLA细胞中观察到低水平的该转录因子。另外，在对照MSCs中没有检测到PPARγ1。最后，尽管在未诱导的PLA细胞中看见可检测水平的PPARγ1，但是脂肪诱导与表达的显著增加相关联，该增加与生脂分化一致。
PPARγ2与生长停止和脂肪细胞前体早期定向脂肪形成谱系相关。该分化期也标志着基因LPL表达的时间点(Ailhaud，等，1992 Annu.Rev.Nutr.12：207-233；Fajas，等，1998 Curr.Biol.10：165-173)。LPL(脂蛋白脂肪酶)普遍表达，但在脂肪组织中明显上调。通过其水解甘油三酯，LPL可促进脂类的转换并影响包括HDL和LDL的一些甘油三酯富集的脂蛋白的代谢(Eisenberg，等，1984 J.Lipid Res.25：1017-1058)。与其普遍表达一致，未诱导的PLA和MSC对照表达低水平的LPL。然而，PLA细胞和MSCs的脂肪形成诱导与该基因的表达显著增加相关联。在诱导1周后观察到该增加且在剩下的分化期间水平保持相当。最后，脂肪细胞前体的延续分化导致表达晚期脂肪形成标记且与成熟脂肪细胞内的脂类积聚相关联(Ailhaud，等，1992 Annu.Rev.Nutr.12：207-233；Fajas，等，1998 Curr.Biol.10：165-173)。一种该晚期标记是脂肪酸结合蛋白aP2(Bernlohr，等，1984 Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：468-472；Bernlohr，等，1985 Biochem.Biophys.Res.Comun.132：850-855)。与以前的结果一致(Bernlohr，等，1985 Biochem.Biophys.Res.Comun.132：850-855)，在3T3-L1对照中与LPL和PPARγ2一起检测到aP2。然而，尽管其分类为脂肪细胞的晚期标记，但是在PLA细胞和MSCs中在整个脂肪形成诱导期间都观察到aP2的表达且在各诱导时间点的水平似乎相当。另外，aP2的表达在PPARγ2之前，与在脂肪细胞前体分化中观察到的表达方式直接相反(Totonoz，等，1994 Genes Dev.8：1224-1234；Totonoz，等，1994 Cell 79：1147-1156)。与其在脂肪形成中的功能一致，在未诱导的对照中发现极低水平的aP2。该组成型表达与在非脂肪的组织中aP2的表达一致(Zezulak和Green 1985 1985 Mol.Cell Biol.5：419-421)且相似于LPL的结果。综合起来，在脂肪诱导的PLA细胞中PPARγ2的脂肪形成特异性表达，与LPL和aP2的表达上调一起证实了这些细胞的脂肪形成能力。另外，脂肪形成能力与这些细胞的成骨潜力结合表明PLA细胞可能具有多谱系潜力。
PLA细胞进行软骨形成
细胞系的软骨形成分化需要高密度的培养物(Johnstone，等，1998 Exp.Cell Res.23 8：265-272)，重复细胞缩合过程(Fell 1925 J.Morphol.Physiol.40)，以及添加特异性的生长因子，例如TGFβ1，TGFβ3或BMP2(Johnstone，等，1998 Exp.Cell Res.238：265-272；Mackay，等，1998 Tissue Eng.4：415-428)。与此一致，在含有TGFβ1的CM中聚集培养PLA细胞导致早在诱导24小时时形成小而致密的微量体结节。诱导的PLA结节使用阿尔新蓝染料染色为阳性，与结节ECM内存在硫酸化蛋白聚糖一致且与上文实施例7所述的结果一致。阿尔新蓝染色似乎在结节的内部浓度更高且早在诱导3天时就清晰可见。与阿尔新蓝染色一致，PLA结节也含有硫酸角质素和软骨素-4-硫酸，即在软骨中以高含量表达的两种蛋白聚糖。与这些结果一致，在向软骨形成谱系诱导的人骨髓MSCs中也观察到KS和CS的表达(Yoo，等，1998 J.Bone Joint Surg.Am80：1745-1757；Yoo，等，1998 Clin.Orthop.S73-81)。除了硫酸化蛋白聚糖外，PLA结节也表达II型胶原蛋白，即软骨组织特征性的胶原蛋白同种型。最后，在高密度条件下培养并在非诱导型对照培养基中维持的PLA细胞不形成结节且没有任何软骨特异性组织学标记的染色，因此证实了我们的诱导条件的特异性。
硫酸化蛋白聚糖的定量使用异染性二甲基二亚甲基蓝试验完成(Famdale，等，1986 Biochimica et Biophysica Acta 883：173-177)。与我们的免疫组织化学结果一致，DMMB试验证实了在分化的PLA样品中存在硫酸化蛋白聚糖。
另外，在诱导达2周时观察到软骨形成的PLA结节内KS和CS的时间依赖型增加。在诱导的MSC培养物中也观察到类似的增加(Yoo，等，1998 J.Bone Joint Surg.Am 80：1745-1757；Yoo，等，1998 Clin.Orthop.S73-81)且表明PLA细胞积聚软骨组织特征性的ECM。诱导2周后PG水平轻微降低且可能表示软骨ECM的改型。在高密度条件下维持的非诱导型PLA细胞也与含有这些蛋白聚糖的ECM相关联。另外，在4和7天时的基础PG水平比诱导的PLA样品更高。然而，在第14和21天时在诱导的PLA结节中观察到明显更多的蛋白聚糖积聚。诱导的PLA结节中ECM内明显积聚KS和CS，以及组织学结果表明在高密度条件下培养时PLA细胞也具有体外软骨形成能力。
在CM中诱导PLA细胞导致表达与软骨形成一致的一些基因。在诱导的PLA细胞中特异性地观察到CNII的表达且该表达局限于第7天和10天，证实了我们的免疫组织化学结果。使用针对聚集蛋白聚糖(AG)，即在软骨中以高含量表达的一种大型蛋白聚糖的氨基末端设计的引物在PLA结节中观察到与CNII类似的限制性表达方式。使用针对羧基末端(PG)的引物在PLA样品中也观察到聚集蛋白聚糖的表达。然而，除了在第7和10天表达外，在第14天在这些结节中也检测到PG。与PLA结果一致，使用氨基和羧基端引物组在诱导的NHCK结节中都检测到聚集蛋白聚糖的表达。与CNII类似，聚集蛋白聚糖的表达对诱导的PLA和NHCK结节具有特异性。除了CNII外，软骨形成诱导PLA细胞导致CNX，即一种肥大软骨细胞标记的限制性表达。在第14天检测到CNX的表达且表明PLA结节发生超时肥大。诱导的NHCK样品也表达CNX，尽管水平更低。PLA结节也与包括CNI和CNIII的其它胶原蛋白类型相关联。尽管检查的大多数PLA样品表现出限制性胶原蛋白模式(仅在第14天)，但是到14天时在一些PLA样品中检测到CNI。在人MSC结节中也观察到由位于结节外部的成纤维细胞表达CNI，导致研究人员认为该区域由参与分化过程的软骨膜样细胞组成(Yoo，等，1998 J.Bone Joint Surg.Am 80：1745-1757；Yoo，等，1998 Clin.Orthop.S73-81)。与此一致，在高密度胚胎鸡肢芽细胞培养物和细胞聚集体中也观察到软骨膜样细胞(Osdoby和Caplan 1979 Devel.Biol.73：84-102；Tachetti，等，1987 J.CellBiol.106：999-1006)。因此，在选择的PLA样品中继续表达CNI可能是由于存在相似的细胞群体。
诱导的和对照PLA细胞也表达蛋白聚糖，核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖及基因CBFA1。核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖组成软骨ECM内的大多数富含小亮氨酸的蛋白聚糖且其在PLA结节内的表达进一步证实了软骨形成表型。除了其在骨生成期间表达外，最近还证实了CBFA-1在软骨细胞的肥大和最终分化中的作用(Enomoto，等，2000 J.Biol.Chem.275：8695-8702)。因此，CBFA-1，以及CNX的表达可能表示结节内PLA细胞的最终分化。软骨细胞肥大也可能先于软骨组织骨化。然而，在任何时间点都没有发现软骨形成的PLA或NHCK细胞表达骨特异性OC，证实了在PLA结节内不存在成骨分化。令人感兴趣的是，在CM中的MSCs微量培养物不会引起结节的形成且没有进行检查。综合起来，除了在ECM内存在硫酸角质素和软骨素-4-硫酸外，在诱导的PLA结节中CNII，聚集蛋白聚糖和CNX的特异性表达证实了这些细胞的软骨形成表型。而且，PLA细胞的软骨形成能力，与其成骨和脂肪形成潜力一起进一步证实了这些推定的干细胞的多谱系能力。
PLA细胞进行生肌分化：
RT-PCR分析向生肌谱系诱导的PLA细胞证实除了肌肉特异性蛋白，即肌球蛋白重链外，还表达包括转录因子MyoD1，肌细胞生成素和myf5的一些生肌基因。据认为生肌谱系的确定受到在增殖的成肌细胞中表达的MyoD1和myf-5的转录水平的控制(Atchley，等，Proc.Natl.Acad.Sci.91：11522-11526；Lassar，等，1994 Curr.Opin.Cell Biol.6：432-442；Weintraub，等，1994 Genes Dev.15：2203-2211)，而生肌分化程序的执行受到肌细胞生成素和MRF4表达的控制(emerson，等，1993 Curr.Opin.Genet.Dev.3：265-274；Olson，等，1996 Cell 5：1-4)。最后，通过肌球蛋白重链的表达可证实成肌细胞的最终分化。与这些发现一致，myf5的表达局限于生肌PLA诱导的前3周而在第一周内相对于剩下的分化期检测到MyoD1的表达增加。生肌诱导的PLA细胞也在整个6周的诱导期内以相对等量的水平表达肌细胞生成素。最后，在诱导6周时检测到肌球蛋白重链的表达增加，表明PLA细胞进行最终的分化。myf5的表达和肌形成进一步支持了该潜力，且与PLA细胞的成骨，脂肪形成和软骨形成能力一起显示了其分化成多种中胚层谱系的潜力。
PLA细胞可能具有神经形成潜力：
当分化成不同胚胎学谱系的细胞时干细胞的真正多能性得以实现。最近的报导公开了MSCs分化成神经细胞(Deng，等，1994 Genes Devel.8：3045-3057；Kopen，等，1999 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：3908-3913；Sanchez-Ramos，等，Exp.Neurol.164：247-256；Woodbury，等，2000 J.Neurosci.Res.61：364-370)和神经干细胞(NSCs)分化成造血细胞(Bjornson，等，1999Science 283：534-537)，表明干细胞群体可能不象以前认为的那样受限制。根据这些发现，我们调查了PLA细胞是否能诱导超出其推断的多谱系中胚层能力。最终，在已知诱导神经原性分化的培养基中培养PLA细胞(Vescovi，等，1999 Exp.Neurol.156：71-83；Woodbury，等，2000 J.Neurosci.Res.61：364-370)且通过染色包括NSE，trk-a和MAP-2的神经标记或分别作为星形细胞和少突胶质细胞标记的GFAP和GalC的表达来评估分化。形态学和组织学数据表明与MSCs一样，PLA细胞具有体外神经形成潜力。在NM中诱导PLA细胞最少30分钟导致形态学显著改变，出现具有设定为神经元样表型的细胞。NM-诱导的PLA细胞进行回缩，形成具有多个突起的致密细胞体。细胞体变得更接近球形且随着诱导时间的延长细胞突起表现出具有二级分支。在所有诱导的PLA培养物中都观察到具有该表型的PLA细胞的比例存在时间依赖型增加。对来自啮齿类和人类的MSCs进行神经形成诱导时观察到相似的形态学改变(Woodbury，等，2000 J.Neurosci.Res.61：364-370)。另外，该PLA形态学类似于NGF刺激PC 12细胞，即一种类似于原代交感神经元的神经内分泌细胞系时观察到的形态。
在神经诱导的PLA细胞中观察到的形态学改变伴随着诸如NSE，trk-a和NeuN的神经元特异性标记的表达增加，且不能引起表达星形细胞和少突胶质细胞的标记。另外，在PC 12培养物中也观察到这些标记的表达，表明PLA细胞可能呈现神经元样表型。与PLA结果一致，用β-ME诱导MSCs时观察到NSE，即神经特异性烯醇化酶，和trk-a的表达增加，约100％的神经元样MSCs对这些标记呈阳性(Woodbury，等，2000 J.Neurosci.Res.61：364-370)。与MSC研究一样，所有表现出神经元表型的PLA细胞都表达明显水平的NSE和trk-a。除了NSE外，也使用NeuN的表达来鉴定神经原性前体和MSCs中的神经元发育(SanchezRamos，等，2000 Exp.Neurol.164：247-256)。具体地说，NeuN在有丝分裂后的神经元中表达(Sarnat，等，1998Brain Res.20：88-94)且认为其出现与发育的神经元退出细胞周期和/或开始最终分化同步(Mullen，等，1992 Development 116：210-211)。神经元样PLA细胞内NeuN的表达，与存在NSE和trk-a一起进一步证实了在PLA细胞中发育成神经元表型。另外，NeuN的表达可能表示发育成有丝分裂后神经元表型。与NSE，trk-a和NeuN相反，没有观察到成熟神经元标记tau，MAP-2和NF-70的表达，表明诱导的PLA细胞表现为早期发育阶段。与此一致，一些小组在诱导的MSC培养物中没有观察到MAP-2表达且可能反映了使用的诱导条件或需要延长诱导时间(Deng，等，2001 Biochem.Biophys.Res.Commun.282：148-152；Sanchez-Ramos，等，2000 Exp.Neurol.164：247-256)。
最后，使用RT-PCR证实了PLA细胞推断的神经元潜力。与免疫组织化学结果一致，没有检测到GFAP的表达，证实了将PLA细胞诱导向神经元谱系的局限性。另外，检查了PLA细胞中基因nestin的表达。Nestin是一种中间体丝状蛋白，在CNS干细胞中(Lendahl，等，1990 Cell 60：585-595)，小鼠发育中的神经管内(Frederikson和McKay 1988 J.Neurosci.8：1144-1151)和向神经原性谱系诱导的MSCs中(Sanchez-Ramos，等，2000 Exp.Neurol.164：247-256)以高含量检测到。神经前体的分化导致nestin表达水平降低，表明该蛋白质可用作祖细胞表型的标记(Johe，等，1996 Genes Dev.10：3129-3140；Lendahl，等，1990 Cell 60：585-595)。对照PLA培养物中nestin的表达支持了在PLA内存在神经原性前体。然而，PLA细胞的分化没有引起nestin表达出现可评估的减少。这可能是由于两种可能性：1)PLA细胞仅分化成神经原性祖细胞群体或2)PLA细胞分化成保留nestin表达的早期神经元样细胞。与后者一致，在NGF-处理的PC 12对照中也检测到nestin表达。据此，与诱导的PLA细胞中表达NeuN，NSE和trk-a一起，导致我们支持后一种可能性且进行了进一步的研究。与我们的IH结果一致，RT-PCR分析没有检测到成熟神经元标记(GAD65)的表达，该标记在PC 12对照和脑中都可检测到。有可能诱导PLA细胞进入更成熟的阶段需要其它的生长因子或延长诱导时间。最后，用NM诱导PLA细胞似乎限制了其发育成具有CNS特征的细胞，因为该细胞没有表达ChaT，即一种外周神经的特异性标记。除了生肌细胞，新形成的内皮细胞，发育的晶状体中的上皮细胞和肝星形细胞外，在未诱导的MSCs中也观察到Nestin表达。这种广泛分布表明Nestin本身不能用作神经原性前体标记。然而，与表达诸如NeuN的其它神经元标记结合，可加强PLA细胞形成神经外胚层谱系前体的可能性。
ADSC克隆分离物证实了多谱系能力：
PLA细胞的多谱系分化可能由多谱系特异性前体的定型而不是由脂肪组织内存在的多能干细胞群体引起。因此，由单个PLA细胞产生的克隆分离物的多谱系分化对于将PLA细胞分类为干细胞来源是关键性的。与此一致，在培养基中增殖的单个PLA细胞分离物表现出体外多谱系能力，对碱性磷酸酶(骨生成)，油红O(脂肪形成)和阿尔新蓝(软骨形成)染色为阳性。克隆分析导致分离了一些谱系组合，包括三谱系(成骨，脂肪形成和软骨形成)，双谱系(成骨/脂肪形成，成骨/软骨形成)和单谱系(只有脂肪形成)。三谱系克隆后来称为脂肪衍生的干细胞(ADSCs)且使用RT-PCR分析多谱系潜力。与多谱系能力一致，ADSCs表达骨生成(OC，ON，OP，CNI和AP)，脂肪形成(PPARγ2，aP2和LPL)和软骨形成(AGG，CNX，核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖)的一些特征性基因。而且，使用IH发现一些三谱系ADSCs还表达神经元标记trk-a(图39)。根据这些结果，ADSCs表达多谱系特异性中胚层基因表明这些分离的克隆具有多能性且可认为是干细胞。
实施例12
下面提供了脂肪衍生的干细胞的分子和生化特征的描述。
材料和方法
所有材料都从Sigma(St.Louis，MO)，VWR(San Dimas，CA)和FisherScientific(Pittsburgh，PA)购买，除非另有说明。所有组织培养试剂都从LifeTechnologies(New York，NY)购买。胎牛血清(FBS)和马血清(HS)分别从Hyclone(Logan，UT)和Life Technologies购买。
抗体：
抗CD29，CD34，CD44，CD45，CD58，CD90，CD104，CD105和CD140a的单克隆抗体从Pharmingen(Bedford，MA)购买。抗CD31和CD71的单克隆抗体分别从R & D Systems(Minneapolis，MA)和Zymed(S.San Francisco，CA)获得。用于流式细胞术(FC)的FITC和PE-偶联的抗-CD抗体从Pharmingen购买。抗SH3抗原的单克隆抗体从SH3杂交瘤(ATCC)产生。Stro-1杂交瘤上清由JohnFraser博士(UCLA)惠赠。抗人胶原蛋白1(αCNI)和4(αCNIV)的单克隆抗体从Sigma购买。抗人胶原蛋白3(aCNIII)和胶原蛋白5(aCNV)的单克隆抗体从Biogenesis(Kingston，NH)购买。
细胞收获，培养和分化条件：
处理的脂肪吸出物(PLA)细胞从粗制脂肪吸出物获得且按以前所述培养(Zuk，P.等，2001 Tissue Engineering 7：209-226)。PLA细胞在非诱导型对照培养基(表13)中维持而MSCs在特化的对照培养基(Clonetics)中维持。使用表13列出的诱导培养基将PLA细胞向所需间充质谱系诱导。使用按表13所列添加了相同生长因子的商品对照培养基诱导MSCs。
PLA克隆的分离和分析：脂肪衍生的干细胞(ADSCs)：
ADSC分离：PLA细胞以极低的汇合度进行平板接种以产生分离的单个细胞。培养物在对照培养基中维持直到单个PLA细胞的增殖导致形成清楚的集落。单个PLA-细胞衍生的克隆称为脂肪衍生的干细胞(ADSCs)。使用无菌克隆环和0.25％胰蛋白酶/EDTA收获ADSCs。收获的ADSCs在克隆培养基(含有15％FBS，1％抗生素/抗真菌剂的F12/DMEM(1∶1))中增殖。
间接免疫荧光：
间接免疫荧光(IF)：使用表14列出的抗CD-标记抗体按以前所述(Zuk，P.等，2001，Tissue Engineering，7：209-226)处理PLA细胞，ADSCs和MSCs用于IF。另外，用从STRO-1和SH3杂交瘤细胞系产生的上清温育PLA细胞。为了测定分化的PLA细胞和MSCs的细胞特征，将细胞向成骨谱系诱导3周或者向脂肪形成谱系诱导2周并用抗-CD抗体温育。分化的细胞也使用抗人胶原蛋白1，4和5的抗体进行分析。
流式细胞术：
除了MSCs外，来自多个供体的PLA细胞在对照培养基中培养3周并按以前所述(Zuk，P.等，2001，Tissue Engineering，7：209-226)通过流式细胞术(FC)分析CD抗原的表达。分析前也在OM或AM中诱导PLA细胞2周。简单的说，用胰蛋白酶/EDTA在80％汇合度时收获细胞，洗涤并以1×106个细胞/ml的浓度重悬于流式细胞缓冲液(FCB)中。用饱和浓度的FITC-偶联(抗-CD14，44，45，61，71，90和105)或PE-偶联(抗-CD13，16，31，34，44，49d，56，62E和106)的抗体在4℃下染色100微升细胞制品(1×105个细胞)1小时。也用同种型匹配的IgG′s温育细胞作为对照以评估自身荧光。温育后，细胞用FCB洗涤3次并重悬用于分析。流式细胞术在FACStar流式细胞仪(Becton Dickson)上进行。表12中显示了从每10,000次事件的绝对细胞数计算的几何平均数。
结果
PLA细胞与MSCs具有许多相似性
本实施例中描述的结果证实了脂肪衍生的干细胞及其克隆分离物的多谱系潜力。为了进一步鉴定PLA群体，使用间接IF和FC检查细胞并与人MSCs的商业化群体比较。已表明MSCs表达一组特有的细胞表面标记，该标记可用于帮助鉴定该干细胞群体(表14)(Bruder，S.P.等，1998，Clin.Orthop.，S247-256；Conget，P. A.等，1999，J.Cell Physiol，181：67-73；Pittenger，M.F等，1999，Science，284：143-147)。与MSCs一样，PLA细胞表达几种该蛋白(图23和24)，证实了这些细胞鉴定为干细胞。约100％的PLA和MSC培养物中CD29，CD44，CD90和CD105/SH2的表达呈阳性，在两种细胞群体中都观察到各标记的高表达水平。两种细胞群体还表达SH3抗原，它与SH2一起认为是MSCs的特异性标记(Haynesworth，S.E.等，1992，Bone，13：69-80)。
另外，大多数PLA细胞和MSCs也为运铁蛋白受体CD71阳性，表明这些细胞群体的一部分在复制。PLA和MSCs不表达造血谱系标记，CD31和CD34。少数PLA样品表现出微弱的CD45染色，尽管该CD45-阳性细胞数不超过PLA细胞总数的5％。与MSCs不同，在PLA细胞中没有观察到粘连分子CD58的染色。随后通过FC证实了IF的结果(图24，B组)。MSC和PLA细胞都表现出相似的谱型，主要由相对较小的粒细胞群体组成(图24，A组)。然而，PLA群体的更大一部分似乎含有更大的粒细胞(见右上角)，而MSC群体的更大一部分含有较小的粒细胞。FC证实了在PLA和MSCs上都表达CD44，CD71，CD90和CD105且没有检测到明显水平的CD31，CD34，CD45和CD104。除了这些标记外，FC还在PLA细胞上测量到CD13，CD49d，SH3和STRO-1的表达而没有检测到CDs4，8，11，14，16，19，33，56，62E和106的表达(表12)。综合起来，免疫荧光和流式细胞术结果证实了PLA群体与骨髓衍生的MSCs之间在CD表达谱型上的一些相似性。
分化的PLA细胞的表型鉴定：
干细胞的分化可改变一些细胞表面和细胞内蛋白的表达。为了鉴定分化的PLA细胞，将来自相同患者的细胞在非诱导型对照培养基中维持或者向成骨和脂肪形成谱系诱导。随后通过IF分析对照和分化的PLA细胞并与作为对照的MSCs进行比较。该结果在表15中提供。在OM中诱导3周的PLA细胞出现增殖增加且与未分化的PLA细胞相比在CD标记谱型中没有表现出任何明显的差异。与对照PLA细胞一样，在成骨PLA细胞中没有观察到CD45的表达而检测到CD44和CD90的显著表达(图40，A组：PLA-骨)。然而，与对照细胞相反，成骨分化导致在局部区域表达CD34。与PLA细胞一样，除了CD34和CD45外，对照和骨诱导的MSCs的CD标记谱型相似。如图40，B组所示，在对照MSCs中没有观察到CD34和CD45的表达。然而，在OM中诱导时观察到CD34表达水平轻微增加，同时检测到CD45-阳性细胞数增加。
为了诱导生脂分化，将PLA细胞在AM中维持最少2周。为了将CD标记表达与细胞形态学相关联，用光学显微照片(插图)覆盖荧光显微照片。用AM诱导PLA细胞导致细胞形态膨大且积聚多个细胞内脂泡，与脂肪形成一致。这些含有脂类的PLA细胞认为是成熟脂肪细胞(白色箭头)(图41，A组：PLA-脂肪)。与骨生成一样，生脂分化似乎导致成纤维细胞样和含脂的PLA细胞中的CD34水平都轻微增加(图41，A组)。另外，脂肪形成的PLA培养物中一个微小的部分含有CD45-阳性细胞。然而，这些细胞不含成熟脂肪细胞的特征性脂泡(CD45-插图)。在脂肪形成PLA培养物中还检测到显著水平的CD44。然而，与其成纤维细胞样对应细胞相比，充满脂类的PLA细胞似乎表达更低水平的CD44(空心箭头-CD44阴性脂肪细胞，实心箭头-CD44阳性细胞)。另外，CD44染色水平在成纤维细胞中有变化，幅度为从强到弱或没有CD44表达。对于CD90也观察到相似的局限性，所有成纤维细胞都以相当的水平表达该蛋白。与PLA细胞一样，脂肪诱导的MSCs表达CD44和CD90且表现出CD34和CD45的染色增强(图41，B组和表16)。然而，不同于脂肪诱导的PLA细胞，成纤维细胞样和充满脂类的MSCs(分别为实心与空心箭头)似乎都以相似的水平表达CD44和CD90。
为了证实免疫荧光结果，在未诱导的和分化的PLA细胞上进行FC且计算各CD标记蛋白的几何平均值(图42)(表16)。成骨分化没有明显改变PLA群体的大小和颗粒性(图42，A组)。然而，脂肪形成导致PLA群体的大小和颗粒性显著增加，很可能反应了细胞形态膨大和形成细胞内脂泡。与免疫荧光结果一致，对照PLA细胞的CD34和CD45表达呈阴性(B组)，在这些细胞中也没有测量到CD14，CD16，CD31，CD34，CD45，CD56，CD61，CD62，CD105或CD106的表达(B组)。分化似乎增加CD34和CD61表达，且成骨分化时观察到增加更多。CD34表达增加与IF处理时观察到的染色增强一致(图40)。在骨诱导的PLA细胞中特异性地检测到CD56和CD49d略有增加。在脂肪诱导的PLA细胞中CD56的表达与对照无显著差异，而脂肪形成时检测到CD49d表达减少。FC也证实了对照细胞中CD13，CD44和CD90的表达(图42，C组)。骨生成显著增加这些标记的表达且在脂肪诱导的PLA细胞中测量到CD90进一步增加。最后，生脂分化导致CD13和CD44的表达减少到未分化的PLA细胞之下。CD44的减少与IF结果一致，其中在含脂PLA细胞中看见更低的表达水平。
诸如脂肪细胞和成骨细胞的中胚层衍生的细胞与广泛的细胞外基质(ECMs)相联系。为了评估分化的PLA细胞中ECM蛋白的表达，通过IF分析脂肪形成和成骨PLA细胞中ECM胶原蛋白的表达。该结果在表17中小结。大多数未分化的PLA细胞表达1和3型胶原蛋白(CM，CNIII)(图43，A组：PLA-对照)。成纤维细胞样PLA细胞中的CNI和CNIII局限于确定的核周集中区且总体上平均分布，同时细胞具有膨大的形态。与CNI和CMII相反，4和5型胶原蛋白(CNIV，CNV)的表达局限于PLA细胞集中和基质形成的确定培养区域。CNIV和CNV的表达方式具有纤维样特性，与这些蛋白质分泌进围绕这些细胞的细胞外空间一致。
PLA细胞的生脂分化抑制CNI和CNV表达(图43，A组：PLA-脂肪)。分化也似乎改变了CNIII的细胞内表达方式，它在整个成熟PLA脂肪细胞中平均再分配。另外，在脂肪形成的PLA样品中观察到更低水平的CNIV表达，在充满脂类的PLA细胞中观察到大多数CNIV荧光(见箭头；插图)。尽管成骨诱导时也观察到CNV表达的抑制，但是对于该谱系没有检测到CNI表达方式有显著差异(图43，A组；PLA-骨)。最后，骨生成似乎增加CNIV的表达水平且导致该胶原蛋白在PLA培养物内更广泛地分布。发现在对照MSCs中CNI，CNIII，CNIV和CNV的表达方式类似于对照PLA细胞(图43，B组：MSC-对照)。与PLA培养物一样，在脂肪诱导的MSC样品中检测到CNIII和CNIV。然而，CNIV似乎局限于细胞外纤丝而无细胞内分布(图43，B组：MSC-脂肪，见箭头)。与脂肪形成的PLA培养物相反，向该谱系诱导没有抑制MSCs中的CNI和CNV合成。相反，在细胞外纤丝中检测到这些胶原蛋白且在充满脂类的MSCs中也观察到微弱的CNI表达。最后，与骨诱导的PLA细胞相反，MSCs的成骨诱导没有改变CNI的细胞内表达方式或CNIV和CNV的合成和细胞外沉积(图43，B组；MSC-骨)。综合起来，免疫荧光数据表明PLA细胞的脂肪形成和成骨分化引起相关的ECM改型，导致基质似乎不同于MSCs。
PLA克隆分离物(ADSCs)表达相似的CD标记蛋白补体
PLA细胞的多谱系分化可能由多谱系特异性前体的定型而不是由脂肪组织内存在的多能干细胞群体引起。因此，由单个PLA细胞衍生的克隆分离物的多谱系分化对于将PLA细胞分类为干细胞来源是关键性的。与此一致，称为脂肪衍生的干细胞(ADSCs)的单个PLA细胞集落表现出体外多谱系能力(图35)。对500个ADSC分离物的分析证实了检查的总克隆数中约6％具有分化潜力。7个ADSC分离物表现出三谱系潜力，分化成成骨，脂肪形成和软骨形成谱系的细胞，总ADSCs数的约24％为分化潜力阳性(表11)。另外，在这些三谱系ADSC群体中也观察到通过组织学染色测量的分化水平的定性提高。除了三谱系ADSCs外，还分离了一些双谱系克隆(O/A，O/C和A/O)和单一脂肪形成谱系克隆。ADSCs的分离和增殖不改变该克隆的CD表达谱型，因为通过IF检测到CD表达无区别。另外，在三谱系和双谱系ADSC分离物之间也观察到无区别(图36)。与异源性PLA群体一样，ADSCs中CD29，CD44，CD71和CD90表达呈阳性，而没有观察到CD31，34，45和104的表达。因此，在异源性PLA细胞群体内存在多谱系ADSC分离物及其与PLA细胞相同的CD标记谱型进一步证实了这样的理论，即脂肪区是多能干细胞的一个来源。
                  表13：通过培养基添加物诱导谱系特异性分化
    培养基   培养基   血清   添加物
    对照   DMEM   10％FBS   无
    脂肪形成(AM)   DMEM   10％FBS   0.5mM异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)，1μM地塞米松，10μM胰岛素，200μM吲哚美辛，1％抗生素/抗真菌剂
    骨生成(OM)   DMEM   10％FBS   0.1μM地塞米松，50μM抗坏血酸-2-磷酸，10mMβ-磷酸甘油，1％抗生素/抗真菌剂
             表14：抗CD抗原的单克隆抗体：报导的细胞特异性和分布
CD抗原   克隆 细胞特异性
29   整联蛋白β1   MAR4 广泛分布-淋巴细胞，单核细胞，粒细胞，在红细胞中无
31   PECAM-1   9G11 内皮细胞，血小板，单核细胞，粒细胞，造血细胞前体
34   -   581 内皮细胞，一些组织成纤维细胞，造血细胞前体
44   Pgp-1   G44-26 白细胞，红细胞，上皮细胞，血小板
45   LCA   HI30 白细胞，造血细胞
58   LFA-3   L306.4 广泛分布-造血细胞，内皮细胞，成纤维细胞
71   TfR   H68.4 大多数分裂细胞
90   Thy-1   5E10 未成熟的CD34+细胞，能长期培养的细胞，原始祖细胞
104
105   Endoglin   - 内皮细胞，B细胞前体，MsCs
SH3   -   - 间充质干细胞
                     表15：分化的PLA和MSC群体的免疫荧光分析
  CD标记
  PLA   PLA-OM     PLA-AM   MSC  MSC-OM   MSC-AM
  CD29   阳性   阳性     阳性   阳性   阳性   阳性
  CD31   阴性   阴性     阴性   阴性   阴性   阴性
  CD34   阴性   +/-，局限性     阳性(弱)   阴性   阳性(弱)   阳性(弱)
  CD44   阳性   阳性     阳性，成纤维细胞   阳性   阳性   阳性
  CD45   阴性   阴性     +/-，成纤维细胞   阴性   阳性   阳性(弱)
  CD58   阴性   阴性     阴性   阳性   阳性   阳性
  CD71   阳性   阳性     阳性   阳性   阳性   阳性
  CD90   阳性   阳性     阳性，成纤维细胞   阳性   阳性   阳性
  CD105   阳性   阳性     阳性   阳性   阳性   阳性
阴性：没有观察到染色
+/-：观察到最小的染色(不超过群体的10％)
阳性：观察到染色
表16：成骨，脂肪形成和对照PLA细胞上CD标记表达的流式细胞术分析
    CD抗原     PLA-CM     PLA-OM     PLA-AM
    CD13     148.88     924.79     134.34
    CD14     2.43     3.54     3.08
    CD16     2.38     3.43     2.70
    CD31     2.22     2.92     2.53
    CD34     3.55     9.10     5.27
    CD44     16.92     64.62     8.76
    CD45     2.52     3.85     3.47
    CD49d     5.33     13.05     4.27
    CD56     2.66     4.86     2.72
    CD61     3.68     7.55     4.12
    CD62E     2.30     2.89     2.38
    CD90     25.96     45.32     46.53
    CD105     8.39     16.70     11.53
    CD106     2.45     3.27     2.51
    SH3     8.95     25.15     14.65
    -ve     2.59     3.57     3.08
           表17：细胞外基质胶原蛋白的免疫荧光染色模式：分化的效果
胶原蛋白类型 免疫荧光染色模式
PLA MSC PLA-脂肪 MSC-脂肪 PLA-骨 MSC-骨
1 点状+核周集中 点状+核周集中 无表达 弱细胞表达+丝状模式 点状+核周集中 点状+核周集中
4 丝状，位于确定区域 丝状模式 细胞内分布，仅在充满脂类的细胞中 丝状，表达减少 丝状，弱表达 丝状模式
5 丝状，位于确定区域 丝状模式 无表达 丝状模式 无表达 细胞内+丝状模式
讨论
在本试验中，使用免疫荧光与流式细胞术的结合对PLA和ADSC群体进行了更广泛的鉴定。尽管PLA细胞表达与MSCs相似的CD抗原补体(阳性：CD29，CD44，CD71，CD90，CD105，SH3，阴性：CD31，CD34，CD45)，但是通过免疫荧光检查时在PLA细胞上CD58，CD104和CD140a的表达有区别。流式细胞术还证实了表达CD13而不存在CD14，CD16，CD56和CD62E。使用流式细胞术可测定未诱导的和分化的PLA细胞之间的精细差别。具体地说，在成骨诱导时观察到CD 13，CD44和CD90增加，而在脂肪形成培养物中发现CD13和CD44水平更低。与此一致，IF分析表明充满脂类的PLA细胞(即，成熟脂肪细胞)内CD44的表达水平更低。成骨分化还导致CD34，CD49d，CD56和CD61轻微增加。使用免疫荧光证实了CD34表达，在成骨PLA培养物中观察到CD34-阳性区。ADSC克隆群体也表达与在异源性PLA群体中所观察到的相似的CD抗原补体，表明这些细胞的克隆分离和增殖不影响细胞表面蛋白的表达。最后，PLA细胞的分化还导致相关ECM改变且在分化的PLA和MSC培养物之间发现1，4和5型胶原蛋白的表达模式和水平有差异。综合起来，该数据表明PLA细胞可代表脂肪组织内的干细胞群体但属于与MSCs具有精细区别的群体。
尽管PLA细胞表达与MSCs，即一种确定的间充质干细胞群体相似的CD抗原补体，但是PLA细胞在CD58，CD104和CD140a的表达中表现出精细的区别。使用流式细胞术进一步证实了PLA细胞上的CD标记谱型。成骨和生脂分化没有明显改变CD谱型，但是与对照细胞相比，使用流式细胞术可测定到精细的区别。分化还导致相关ECM改变。最后，ADSC克隆群体表达与异源性PLA群体中所观察到的相似的CD抗原补体，表明从PLA中克隆分离多谱系群体不会影响细胞表面蛋白的表达。
通过鉴定在细胞表面表达的特有蛋白可进行细胞群体的鉴定。后来一些小组根据其细胞特异性蛋白(例如，STRO-1，SH2，SH3，SH4)的表达和“聚簇指定”(CD)标记谱型鉴定了MSCs(Bruder，S.P.等，1998，Clin.Orthop.，S247-256；Conget，P. A.等，1999，J.Cell Physiol，181：67-73；Pittenger，M.F等，1999，Science，284：143-147)。本试验证实了与MSCs一样，在PLA细胞上表达细胞表面蛋白的特有组合，两种群体表现出相似的表达谱型。与MSCs一样，通过IF结合FC显示了PLA细胞表达CD13，CD29，CD44，CD71，CD90，CD105/SH2和SH3。另外，PLA细胞在细胞表面上不表达CD14，CD16，CD31，CD34，CD45，CD56，和CD62E。CD谱型与MSCs的相似性导致证实了PLA细胞是一种干细胞群体的理论。然而，相似性程度可能表明PLA细胞仅仅是位于脂肪区内或污染的MSC群体。脂肪切除术导致多处血管破裂且尽管使用了血管收缩剂最小化失血，但是处理的PLA细胞团可能是从外周血来源获得的MSCs(Zvaifler，N.J.等，2000，ArthritisRes.，2：477-488)。然而，在PLA和MSC群体之间似乎具有一些精细的区别。与MSCs相反，使用IF在PLA细胞上没有检测到CD58的表达，而在MSCs上看到表达(图23)。另外，还报道了MSCs表达CD104，CD106和CD140a(Bruder，S.P.等，1998，Clin.Orthop.，S247-256；Conget，P.A.等，1999，J.Cell Physiol，181：67-73；Pittenger，M.F等，1999，Science，284：143-147)。使用IF或FC在PLA细胞上没有检测到这些CD抗原的表达(图23和24)。这些区别可能表明PLA群体代表了一个不同的干细胞群体。然而，不能完全排除PLA细胞是MSCs的克隆变异体的可能性。
PLA细胞的多谱系分化可能由多谱系特异性前体的定型而不是由脂肪组织内存在的多能干细胞群体引起。因此，由单个PLA细胞衍生的克隆分离物的多谱系分化对于将PLA细胞分类为干细胞来源是关键性的。与此一致，分离的ADSC表现出体外多谱系能力，使用组织学试验碱性磷酸酶(骨生成)，油红O(脂肪形成)和阿尔新蓝(软骨形成)染色呈阳性。观察到一些谱系组合，包括三谱系(成骨，脂肪形成和软骨形成)，双谱系(成骨/脂肪形成，成骨/软骨形成)和单谱系(只有脂肪形成)。ADSCs的分离和增殖不改变CD表达谱型且在任何三谱系和双谱系ADSC群体之间可检测到CD表达无区别。因此，存在多谱系ADSC分离物及其与异源性PLA细胞相同的CD标记谱型进一步证实了脂肪区是多能干细胞的来源的理论。
间充质前体和干细胞的分化导致一些细胞表面和细胞内蛋白的表达改变，因为这些细胞获得了新的命运和功能。为了评定这点，通过IF和FC检查了未分化的PLA细胞和向成骨和脂肪形成谱系诱导的细胞中CD标记谱型的任何改变。成骨分化没有明显改变PLA细胞的CD谱型(图2和表16和17)。间接IF证实了CD44和CD90的表达，且在成骨PLA和MSC培养物中都没有检测到CD34和CD45的表达。另外，成骨PLA和MSC培养物中CD29，CD71，CD105和SH3表达呈阳性，而没有检测到CD31的表达。然而，通过FC对成骨PLA培养物的进一步分析揭示了CD谱型的精细改变。具体地说，成骨诱导导致CD90和CD44表达水平分别增加1.8-倍和3.8-倍。CD44，即hyaluronan受体的表达增加很可能是骨生成时PLA细胞的基质合成增加和细胞-基质相互作用的结果。最近的工作还证实了在来自小鼠，大鼠和人的成骨细胞和成骨细胞样细胞上表达Thy-1/CD90。在成熟的最早期(增殖期)期间该蛋白质的表达显著增加且随着成骨细胞的成熟而减少。因此，成骨诱导PLA细胞时CD90的表达增加可能反映了在分化的最早期随着成骨PLA细胞的增殖该蛋白质的表达增加。除了CD44和CD90外，在成骨PLA细胞中也观察到金属蛋白酶，CD13/氨基肽酶N显著增加(6.2-倍)。除了其在粒细胞和单核细胞的定向祖细胞[Kishimoto，1997#1082]中表达外，在成纤维细胞，骨髓基质细胞和破骨细胞上也鉴定到CD13(Syrjala，M.等，1994，Br.J.Haematol.，88：679-684)。最近的工作鉴定了在细胞-细胞接触时CD13mRNA水平增加(Kehlen，A.等，2000，J.Cell Biochem，80：115-123；Reimann，D.等，1997，J.Immunol.，158：33425-3432)。因此，PLA细胞上CD13显著增加可能是由于成骨PLA培养物中细胞与细胞的接触增加引起。另外，在干细胞上诸如CD13的蛋白酶的表达增加也可能通过降解影响这些细胞发育的调控肽和增殖剂来参与分化(Young，H.E.等，1998，Wound Repair Regen，6：66-75；Young，H.E.等，1999，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，221：63-71)。
令人感兴趣的是，FC测量到成骨诱导时CD34，CD56，CD49d，CD61和CD105的表达轻微增加。除了CD105外，这些标记在未分化的PLA细胞和MSCs中不表达且其增加很可能是分化的结果。在骨诱导的PLA培养物中检测到CD34的表达增加2.6-倍。该增加与IF显示的成骨PLA培养物中出现CD34阳性区一致(图23)。IF分析成骨MSCs时也观察到CD34轻微增加(图40)。然而，该增加似乎是所有MSCs的总体表达水平增强的结果。成骨诱导还导致CD56表达增加1.8-倍。鉴定为神经细胞粘连分子(NCAM)的CD56在造血干细胞上表达(Kishimoto，T.等，1997， Leucocyte Typing VI.White Cell Differentiation Antigens.(Hamden，CT：Garland Publishing)，介导其与相邻细胞和周围基质的粘连(Lanier，L.L.等，1991，J.Immunol，146：4421-4426；Lanier，L.L.等，1989，J.Exp.Med.，183：681-689)。尽管其功能尚未证实，但是CD56可在非造血细胞中以相似的方式起作用。与此一致，成骨细胞表达NCAM，使用该粘连分子介导细胞和基质的相互作用且导致其分化(Lee，Y A.等，1992，J.Bone Miner.Res.，7：1435：1466)。因此，PLA细胞的成骨分化可诱导该CD蛋白质的水平升高，以便在分化期间调节细胞-细胞和细胞-基质间相互作用增加。相同的解释很可能适用于观察到的α4整联蛋白，CD49d增加3-倍。最后，在成骨PLA细胞中测量到CD 105表达的少量增加。分类为III型TGFβ3受体(Cheifetz，S.等，1992，J.Biol.Chem.，267：19027-19030)的CD105在包括内皮细胞，B-谱系前体，MSCs和从外周血分离的CD34+细胞亚类的广泛细胞类型中表达(Rokhlin，O.W.等，1995，J.Immunol.，154：4456-4465；Majumdar，M.K.等，1998，J.Cell Physiol.，176：57-66；Barry，F.P.等，1999，Biochem.Biophys.Res.Commun.，265：134-139；Pierelli，L.等，2000，Br.J.Hematol.，108：610-620)。尽管在骨发育期间对该蛋白质所知甚少，但是认为CD105的表达随着成骨前体向最终分化的进展而减少，并在成熟成骨细胞中消失(Haynesworth，S.E.等，1992，Bone，13：69-80)。因此，IF显示的CD105在成骨PLA和MSCs中的表达可能表明这些细胞代表了分化的早期阶段且没有达到其最终分化阶段。另外，FC测量的PLA细胞上CD105表达的轻微增加与CD34的增加相关联且可能反映了在成骨培养物中CD34+亚类的增加。
已表明PLA细胞的生脂分化导致形态膨大，以及积聚多个充满脂类的细胞内液泡(Zuk，P.等，2001，Tissue Engineering，7：209-226)。因此，脂肪诱导的PLA培养物是充满脂类的细胞(即成熟PLA脂肪细胞)和更多未成熟的成纤维细胞的异源性混合体。与此一致，FC鉴定脂肪形成的PLA培养物证实其向更大的，更多颗粒的细胞群体转变。IF分析证实了在脂肪形成的PLAs和MSCs上表达CD29，CD44，CD71，CD90和CD105(图41)。尽管在成纤维细胞和充满脂类的细胞中都发现相当水平的CD29，CD71和CD 105，但是在成熟的PLA脂肪细胞中观察到更低水平的CD44和CD90。与PLA培养物相反，在脂肪诱导的MSCs中通过IF没有检测到该局限性。尽管CD90的表达似乎在充满脂类的PLA细胞中减少，但是几乎100％的PLA成纤维细胞对CD90强烈染色且使用FC测量到该蛋白质增加1.8倍，相当于在成骨培养物中测量到的水平(1.75-倍)。与CD90相反，CD44-阳性PLA成纤维细胞的表达水平似乎有变化，细胞染色幅度从强烈到很少或无CD44。与此一致，FC证实了脂肪形成的PLA样品中CD44的表达减少48％。对于CD13/氨基肽酶N也测量到减少且这两种蛋白质的减少很可能反映了ECM改型为更符合脂肪组织的ECM。
与成骨PLA细胞一样，FC证实了在脂肪形成的PLA培养物中不存在CD14，CD16，CD31，CD45，CD62E和CD106，而在这些细胞中CD34，CD49d和CD61的表达轻微升高。尽管在脂肪形成诱导时FC没有检测到CD45明显增加，但是IF分析时观察到小部分该蛋白呈阳性的PLA细胞。在脂肪形成的PLA细胞中CD34的表达增加不如骨生成时测量到的一样大且IF分析证实了所有PLA形态表达CD34。然而，表达局限于具有成纤维细胞样形态的细胞。IF分析脂肪形成的MSCs时也检测到CD34和CD45都微弱表达，在成纤维细胞和充满脂肪的细胞中都观察到表达。
间充质前体分化成其谱系定向的细胞表型(即，成骨细胞，脂肪细胞)伴随着ECM的合成和改型。ECM组成和结构的变化赋予各组织其特并性特征且参与分化和组成型细胞类型的生长。例如，骨基质由无机羟基磷灰石以及有机成份组成，该有机成份包含蛋白聚糖和以I型胶原蛋白占大多数(有机成份的约90％)的胶原蛋白。软骨基质主要由2和10型胶原蛋白和多种硫酸化蛋白聚糖组成。脂肪ECMs包含多种胶原蛋白亚型(1到6)，层粘连蛋白和纤连蛋白。总之，这些胶原蛋白是各组织特有细胞外环境的一部分且对于组成型细胞的存活和功能是决定性的。据此，在对照和诱导的PLA细胞和MSCs中都检查了ECM胶原蛋白的表达。
除了CNIII外，未诱导的PLA细胞和MSCs都表达CNI，CNIV和CNV(图43)。在两种细胞群体中CNI和CNIII都表现出相似的染色模式且成骨诱导不改变这些胶原蛋白的细胞内分布。另外，在一些PLA和MSC样品中观察到CNI的定性增加。大量工作证实了1型胶原蛋白在成骨分化中的作用。例如，大鼠颅盖成骨细胞分化的早期阶段期间CNI水平升高且抑制该胶原蛋白完全抑制成骨分化(Stein，G S.等，1990，Faseb J.，4：3111-3123；Lynch，等，1995，Exp.Cell Res.，216：35-45)。诸如地塞米松，维生素D和甲状旁腺激素的已知影响骨生成的因素可直接影响CNI的水平。另外，在CNI基质中维持的骨髓基质细胞体外分化成成骨细胞并诱导体内骨形成，该效果在CNII，CNIII或CNV基质中未发现。因此，诱导前和骨诱导的PLA培养物中CNI的合成与该胶原蛋白在骨生成中的作用一致。另外，在骨诱导的PLA细胞和MSCs中都观察到相似的CM表达表明这些细胞类型的成骨分化以相似的机制运行。
除了CNI外，在对照PLA和MSC培养物中还观察到CNIV和CNV的表达，随着其分泌进细胞外环境以丝状方式分布。存在的这些胶原蛋白是成骨ECM的重要成份，因为在完整的骨髓基质，新形成的骨骼的成骨细胞和在基质细胞系衍生的STRO-1-阳性集落中都观察到这些胶原蛋白的表达。与诱导的MSC培养物相反，对PLA细胞的成骨诱导似乎明显减少CNIV合成且完全抑制CNV表达。
生脂分化导致PLA和MSC群体之间出现其它区别。与成骨培养物一样，对PLA细胞的脂肪形成诱导导致CNV表达的抑制。另外，脂肪形成还导致CNI的抑制。在脂肪诱导的MSCs中没有发现该抑制。相反，在脂肪形成的MSC群体中观察到CNIV合成水平降低，所有三种胶原蛋白类型(I，IV和V)都表现出丝状细胞外表达方式。尽管在充满脂类的MSCs中也观察到CNI的微弱细胞表达，但是CNIV和CNV的表达似乎保持在细胞外。与MSC样品一样，脂肪诱导的PLA细胞也表达CNIV。然而，这些细胞中CNIV的表达保持在细胞内且似乎仅仅在充满脂类的PLAs中表达。
与骨生成一样，一系列的证据表明诸如胶原蛋白的ECM成份参与脂肪形成。首先，ECM的改变导致脂肪生成酶表达所需的形态和细胞骨架改变(Kuri-Haruch，W.等，1984，Differentiation，28；Spiegelman，B.M.等，1983，Cell，357-666)。其次，3T3-L1细胞分化时CNI，CNIII和CNIV的表达显著改变(Weiner，F.R.等，1989，Biochem.，28：4094-4099)。最后，分化期间发育中的脂肪组织的ECM进行组织，据认为该事件由脂肪细胞本身介导(Nakajima，I.等，1998，Differentiation，63：193-200)。除了少量基底膜胶原蛋白IV型外，成纤维细胞和具有成纤维细胞形态的脂肪细胞前体合成并分泌I和III型胶原蛋白(Goldberg，B.，1977，PNAS，74：3322-3325；Alitano，K.等，1982，J.CellBiol.，94：497-505；Cryer，A.等，1982，Eur.J.Clin.，Invest.，12：235-238；Kuri-Harcuch，W.等，1984，Differentation，28；Liau，G等，1985，J.Biol.，Chem.，260：531-536)。随着这些细胞开始分化，在细胞形态，细胞骨架和分泌的ECM的水平和类型方面发生改变(Napolitano，L.，1963，J.Cell Biol.，18：663-679；Aratani，Y等，1988，J.Biol.Chem.，263：16163-16169；Weiher，F.R.等，1989，Biochem.，28：4094-4099)。这些改变又是其最终分化成脂肪细胞所必需的。
为了研究脂肪形成时ECM成份的合成和分布，建立了一些脂肪细胞前体细胞系，包括几个3T3变异体(Green，H.等，1974，Cell，3：127-133)和来自日本牛的克隆脂肪细胞前体细胞系(BIP细胞)(Aso，H.等，1995，Biochem.Biophys.Res.Commun.，213：369-374)。BIP细胞的脂肪转化导致产生与脂肪组织相似的ECM，其中脂肪细胞通过胶原蛋白I，II，IV，V和VI的丝状网络以及细胞内表达的CNIII互相连接(Nakaiima，I.等，1998，Differentiation，63：193-200)。与BIP细胞一样，脂肪诱导PLA细胞和MSCs导致CMII相似的细胞内分布。另外，CNI，CNIV和CNV的纤丝也与脂肪形成的MSCs相联系且似乎随机组织。表达相似的胶原蛋白及其在脂肪形成的MSCs中的随机组织与脂肪形成前体分化时观察到的结果一致且表明这些干细胞分化时可出现相当的ECM合成和改型。
然而，PLA细胞的生脂分化与一些脂肪细胞前体细胞系和MSCs存在一些区别。与包括来自牛的BIP细胞，和来自小鼠的3T3细胞的脂肪细胞前体细胞一样，分化前的PLA细胞合成CNI和CNV。然而，分化时不再观察到这些胶原蛋白。脂肪形成的PLA培养物中CNI和CNV消失可能代表了这些细胞特有的特异性改型途径。与此一致，分化期间发生的细胞周围环境的改变可改变细胞内环境并分泌降解周围ECM的MMPs。脂肪细胞前体也产生低水平的CNIV且脂肪形成时观察到显著增加(Aratani，Y等，1988，J.Biol.Chem.，263：16163-16169；Nakajima，I.等，1998，Differentiation，63：193-200)。尽管在脂肪形成的PLA培养物中观察到CNIV的定性增加，但是其丝状分布消失且该胶原蛋白局限于充满脂类的PLA细胞。与脂肪细胞前体和MSCs相比CNIV表达方式的改变还不清楚。
尽管对成熟脂肪细胞的EM观察鉴定到富含CNIV的基底膜与一些其它的丝状胶原蛋白相联系(Chase，W.H.，1959，J.Ultrastruc.Res.，2：283-287；Barnett，R.J.，1962， L.W.Kinsell，ed.(Springfielde IL：Charles C.Thomas)；Angel.，A.等，1970， B.Jeanrenaud and Hepp，D.，et ed.(Thiene，Stuttgard： Academic Press)，但是成熟脂肪细胞不合成胶原蛋白。另外，脂肪形成前体在汇合后的分化阶段期间丧失体外合成胶原蛋白的能力。然而，胶原蛋白合成对于最终脂肪细胞分化和三酰甘油积聚是关键的，这表明ECM的分化前表达决定了其最终表型。因此，PLA细胞和MSCs分化前表达的CNI，CNIII，CNIV和CNV可用于起动其分化程序。随着分化的进展和出现的充满脂类的细胞(即，成熟脂肪细胞)的增加，这些胶原蛋白的合成停止，产生脂肪组织特有的胶原ECM。对于MSC群体而言事情很可能就是这样。然而，在PLA培养物中不存在CNI和CNV可能由直接抑制合成或ECM的明显改型引起。PLA脂肪形成时胶原蛋白抑制的精确时间和/或可能存在的涉及胶原蛋白降解的试剂仍不清楚。
                        序  列  表
<110>Katz，Adam J.
     Llull，Ramon
     Futrell，J.William
     Hedrick，Marc H.
     Benha im，Prosper
     Lorenz，Hermann Peter
     Zhu，Min
<120>脂肪衍生的干细胞和网格体
<130>30448.77USI1
<140>09/952,522
<141>2001-09-10
<150>PCT/US00/06232
<151>2000-03-10
<150>60/123,711
<151>1999-03-10
<150>60/162,462
<151>1999-10-29
<160>58
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
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<223>人工序列的描述：人I型胶原蛋白α链正向引物
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<223>人工序列的描述：人I型胶原蛋白α链反向引物
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<223>人工序列的描述：人II型胶原蛋白α链反向引物
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<223>人工序列的描述：人X型胶原蛋白α链反向引物
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<223>人工序列的描述：人的大聚集蛋白聚糖正向引物
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<223>人工序列的描述：人的大聚集蛋白聚糖正向引物
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<223>人工序列的描述：骨粘连蛋白反向引物
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<223>人工序列的描述：骨桥蛋白反向引物
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<213>人工序列
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<223>人工序列的描述：骨涎蛋白正向引物
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<213>人工序列
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<223>人工序列的描述：骨涎蛋白反向引物
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<213>人工序列
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<223>人工序列的描述：核结合因子α-1正向引物
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核结合因子α-1反向引物
<400>22
tcaatatggt cgccaaacag attc                                             24
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：胶原蛋白I正向引物
<400>23
 gagagagagg cttccctggt                                                 20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：胶原蛋白I反向引物
<400>24
caccacgatc accactcttg                                                  20
<210>25
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：碱性磷酸酶正向引物
<400>25
tgaaatatgc cctggagc                                                    18
<210>26
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：碱性磷酸酶反向引物
<400>26
tcacgttgtt cctgtttag                                                   19
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：aP2正向引物
<400>27
tggttgattt tccatcccat                                                  20
<210>28
<211>20
<212>DNA
<21 3>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：aP2反向引物
<400>28
tactgggcca ggaatttgat                                                  20
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：LPL正向引物
<400>29
gagatttctc tgtatggcac c                                                21
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：LPL反向引物
<400>30
ctgcaaatga gacactttct c                                                21
<210>31
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PPAR γ1正向引物
<400>31
gctctagaat gaccatggtt gac                                              23
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PPAR γ1反向引物
<400>32
ataaggtgga gatgcaggct c                                                21
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PPAR γ2正向引物
<400>33
gctgttatgg gtgaaactct g                                                21
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PPAR γ2反向引物
<400>34
ataaggtgga gatgcaggtt c                                                21
<210>35
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PPAR δ正向引物
<400>35
gccaacggca gtggctttgt c                                                21
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PPAR δ反向引物
<400>36
t tagtacatg tccttgtaga tctc                                           24
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：胶原蛋白II正向引物
<400>37
atgattcgcc tcggggctcc                                                 20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：胶原蛋白II反向引物
<400>38
tcccaggttc tccatctctg                                                  20
<210>39
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：聚集蛋白聚糖正向引物
<400>39
gcagagacgc atctagaaat t                                                21
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：聚集蛋白聚糖反向引物
<400>40
ggtaattgca gggaacatca t                                                21
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核心蛋白多糖正向引物
<400>41
cctttggtga agttggaacg                                                  20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核心蛋白多糖反向引物
<400>42
aagatgtaat tccgtaaggg                                                  20
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Biglycan
     forward primer双糖链蛋白聚糖正向引物
<400>43
tgcagaacaa cgacatctcc                                                  20
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：双糖链蛋白聚糖反向引物
<400>44
agcttggagt agcgaagcag                                                  20
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Myf5正向引物
<400>45
ccacctccaa ctgctctgat                                                  20
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Myf5反向引物
<400>46
ggagttcgag gctgtgaatc                                                 20
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：肌细胞生成素正向引物
<400>47
tgggcgtgta aggtgtgtaa                                                  20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：肌细胞生成素反向引物
<400>48
ttgagcaggg tgcttctctt                                                  20
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CHaT正向引物
<400>49
tacaggctcc accgaagact                                                  20
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CHaT反向引物
<400>50
agcagaacat ctccgtggtt                                                  20
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：突触素正向引物
<400>51
ttcaggctgc accaagtgta                                                  20
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：突触素反向引物
<400>52
cagggtctct cagctccttg                                                  20
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：胶质原纤维酸性蛋白正向引物
<400>53
aatgctggct tcaaggagac                                                  20
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：胶质原纤维酸性蛋白反向引物
<400>54
 ccagcgactc aatcttcctc                                                 20
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：GAD65正向引物
<400>55
tggcgatggg atattttctc                                                  20
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：GAD65反向引物
<400>56
 gcactcacga ggaaaggaac                                                 20
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Nestin正向引物
<400>57
 ggagtcgttt cagatgtggg                                                 20
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Nestin反向引物
<400>58
agctcttcag ccaggttgtc                                                 20

Claims (43)

1.一种分离的脂肪衍生的干细胞(ADSC)。
2.权利要求1的干细胞，它可培养至少15代而不分化。
3.权利要求1的干细胞，它具有多能性。
4.权利要求3的干细胞，它可分化成中胚层，外胚层或内胚层。
5.来自受试者的脂肪组织样品的富含脂肪衍生的干细胞的组分(ADSC-EF)，所述的组分基本上不含脂肪细胞。
6.权利要求1的干细胞，它是人的。
7.权利要求1的干细胞，它是遗传修饰的。
8.含有多个权利要求1的细胞的确定细胞群体。
9.权利要求8的确定细胞群体，它是同质的。
10.权利要求8的确定细胞群体，它是异质的。
11.权利要求8的确定细胞群体，它是克隆的。
12.权利要求4的干细胞的后代细胞，它定向发育成中胚层细胞。
13.权利要求4的干细胞的后代细胞，它定向发育成外胚层细胞。
14.权利要求4的干细胞的后代细胞，它定向发育成内胚层细胞。
15.包含权利要求4的干细胞和分化的中胚层细胞的组织。
16.包含权利要求4的干细胞和分化的外胚层细胞的组织。
17.包含权利要求4的干细胞和分化成内胚层细胞的组织。
18.诱导中胚层组织的方法，包括在中胚层诱导培养基中培养权利要求4的干细胞。
19.诱导外胚层组织的方法，包括在外胚层诱导培养基中培养权利要求4的干细胞。
20.诱导内胚层组织的方法，包括在内胚层诱导培养基中培养权利要求4的干细胞。
21.在受试者中形成组织的方法，包括将权利要求12，13或14的后代细胞以足够量导入受试者中以便在所述受试者中形成中胚层，外胚层或内胚层组织。
22.在受试者中再生或修复组织的方法，包括将权利要求1，12，13或14的干细胞以足够量导入受试者中以便再生或修复组织。
23.获得富含脂肪衍生的干细胞的组分(ADSC-EF)的方法，包括处理来自受试者的脂肪组织样品以去掉脂肪细胞，形成富含脂肪衍生的干细胞的组分(ADSC-EF)。
24.用权利要求23的方法获得的富含脂肪衍生的干细胞的组分(ADSC-EF)。
25.通过从权利要求24的ADSC-EF分离所述细胞获得的脂肪衍生的干细胞(ADSCs)。
26.权利要求25的干细胞，其中所述的干细胞具有多能性。
27.权利要求26的干细胞，其中所述的干细胞分化成中胚层，外胚层，或内胚层。
28.脂肪衍生的网格体，含有脂肪组织细胞外基质而基本上不含细胞。
29.权利要求28的网格体，它是基本上无水的。
30.权利要求28的网格体，它是水合的。
31.一种组合物，它含有权利要求1的细胞和生物学相容的网格体。
32.一种组合物，它含有权利要求1的细胞和权利要求29或30的网格体。
33.权利要求3的干细胞的后代。
34.向动物传递转基因的方法，包括将含有选定转基因的权利要求1的干细胞导入受试者中，以便在该受试者中表达该转基因。
35.诱导权利要求1的细胞分化的方法，包括在合适的分化条件下在有效诱导分化的合适培养基中培养该细胞。
36.权利要求35的方法，其中所述的培养基是具体细胞类型的经适应的培养基。
37.诱导权利要求1的细胞分化的方法，包括将该细胞与所需谱系的细胞共培养。
38.使培养基适应的方法，包括将该培养基与权利要求1的细胞接触。
39.由权利要求38的方法获得的培养基。
40.从受试者的脂肪组织获得脂肪衍生的干细胞(ADSCs)的试剂盒，包括从脂肪组织分离ADSCs的工具。
41.权利要求40的试剂盒，它还包含从受试者分离脂肪组织的装置。
42.权利要求40的试剂盒，它还含有诱导脂肪衍生的干细胞分化的培养基。
43.权利要求40的试剂盒，它还包含培养ADSCs的培养基。
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