JP4603883B2 - 脂肪組織由来の幹細胞および前記細胞から分化した細胞 - Google Patents
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Description
-第1に、前記細胞を単離することは、非常に困難である。実際、幹細胞は、生物体中で非常にまれであり、現在これらについてほとんど何も知られておらず、特に分子レベルでは、直接精製することは不可能である。生体染色を排除する能力に基づいて多分化能の細胞(「副次的な集団(side population)」の「SP」として既知の集団)を濃縮する方法がある(Goodell MAら、(1996), J Exp Med, vol 83, 1797-1806; Zhou Sら、(2001) Nature Medecine, vol 7, 1028-1034)。その他の方法では、細胞マーカーの有無に基づいたポジティブまたはネガティブ選択を含む。一例として、国際特許出願国際公開公報第01/11011号には、CD45+グリコホリンA+細胞の骨髄細胞の枯渇に続いて、成長因子の存在下においてCD45-/GlyA-細胞を培養することが記載されている。同様の方法が、Reyesら(Blood, November 2001, vol. 98, n° 9, 2615-2625)によって記載されている。
-第1に、種々の研究では、真の「幹」細胞で行われておらず、むしろ中間前駆体で行われていたものと思われ得る。この仮説は、幹細胞が可塑性に関して前駆体と容易に混同され得るという事実によっていっそう裏付けられる。さらに、前駆体による培養物の混入は、「幹」細胞と比較してこれらが豊富であることによって促進されるが、これらの寿命は制限される;
-第2に、培養条件が不適当であったので、「幹」細胞を未分化な状態でインビトロに維持することができなかったものと想定することも可能である。
自己複製:細胞の最初の特徴を変えることのなく分裂する能力。
幹細胞:高い自己複製能力を有し、テロメラーゼ活性を有し、かつ静止状態になることができる多分化能の細胞。
成体幹細胞:たとえば、新生児、子供、または成体に由来する胚幹細胞以外の幹細胞。
多能または多分化能:少なくとも2つの細胞型に分化することができること。
静止状態:細胞が非増殖性かつ非老化状態のままである能力。
を意味する。
a)脂肪組織試料の酵素消化;
b)脂肪細胞を除く(a)において得られた標品に存在する細胞タイプの全てを含む脂肪細胞のない細胞分画を回収することと;
c)工程(b)で得られた細胞分画のインビトロ培養を少なくとも12時間行うことと;
d)2つの細胞亜集団「CA」および「CS」を選択することと;
e)静止状態に入ることができる細胞集団が得られるまで集団「CA」を富ませることと、
f)選択的に、集団「CA」の幹細胞の増殖を誘導すること。
酵素消化工程は、好ましくは、脂肪組織試料を短期間、すなわち最大で10分、より好ましくは、5〜10分、または5〜8分間コラゲナーゼなどの酵素の標品と接触する状態にすることによって行われる。これにより、組織を完全に解離することができるが、特定の細胞型に対するダメージを回避し、したがって全ての細胞型においてより優れた生存度を生じる。
次いで、脂肪細胞を除去するために、酵素消化を受けた脂肪組織を処理する。次いで、脂肪細胞を除いて脂肪組織に存在する全ての細胞タイプ(たとえばプレ脂肪細胞、幹細胞、内皮細胞、周皮細胞、肥満細胞...)を含む脂肪細胞のない細胞分画を回収する。
次いで、工程(b)の間に得られた細胞分画を少なくとも12時間、たとえば12〜72時間、好ましくは12〜80時間培養する。
多分化能の幹細胞の濃縮工程は、培養工程(c)の開始時に、これらの接着速度の関数:
-l2時間よりも前に付着する付着する細胞集団CA
-よりゆっくりと(48〜72時間)付着する細胞集団CS、
として2つの細胞亜集団に分離することによって開始する
12時間の培養の後、集団CSは、培地中の懸濁液に存在するが、集団CAは、ディッシュに付着する。
i)それは多能であり、
ii)それはHLAクラスI陰性の表現型を有し、
iii)それは通常の核型を有し、
iv)その自己複製能力は、約40〜60回の集団倍加の間維持されており、
v)その増殖速度は、白血病抑制因子(LIF)による影響を受けない。
次いで、CAおよびCS集団を同一の条件で培養する。集団CAについては、この培養により、実質的に幹細胞の濃縮を生じる。この濃縮工程は、前駆体が幹細胞(これは、理論的には不死である)と比較して制限された寿命を有するという事実に基づく。最初の集団倍加の間に、前駆体を幹細胞よりも急速に増殖させ、次いで50〜80回の集団倍加までにこれらは死に始める。現段階で、集団は、幹細胞が非常に濃縮されている。
・約70%のコンフルエンスでの自発的な増殖の停止;
・コンフルエンスは、bFGFまたはその他の成長因子の存在下において現段階で達成されていてもよい。72時間から約36時間への集団倍加時間の減少が観察されてもよい;
・倍加時間に対するbFGFまたはその他の成長因子の効果は、可逆的である。
静止状態に達した後、CA集団の細胞増殖を、トリプシン処理および新たなディッシュ内での細胞希釈によって誘導する。望ましくは、細胞は、80%のコンフルエンスでトリプシン処理に供し、同一の新たな培養ディッシュ内でのに2〜10倍、好ましくは5〜10倍希釈する。
-組織の完全解離ができ、一方で特定の細胞タイプに対するダメージを防止する、コラゲナーゼなどの酵素的標品での迅速な消化(工程a);
-特定の細胞タイプの減少を回避するために、工程b)においてろ過工程がない;
-培養工程d)およびe)の間の高密度な細胞接種。実際は、多分化能の細胞は、その他の細胞タイプと比較して少ししか供給されない;
-2つの亜集団「CA」および「CS」の、これらの接着速度の関数としての隔離;
-細胞が静止状態になったあと、bFGFなどの成長因子の遅い使用(工程f)、
を含む。
通常の核型を有する。
i)少なくとも80回の集団倍加にわたって、および好ましくは少なくとも100回の集団倍加にわたって維持される自己複製の能力;
ii)有意なテロメラーゼ活性
iii)HLAクラスI陰性の表現型;
iv)通常の核型;
v)静止状態になる能力、
を有することを特徴とする細胞である。
829-841, June 29, (2001))、bFGFの存在下において再び増殖し始める。静止状態は、幹細胞に特異的な特徴である。一定数の集団倍加を越えると、「非幹」細胞は、老化する。静止状態は、理論的には無期限に維持することができる。本発明の細胞について、本発明者らは、最高1年間この状態を維持した。次いで、トリプシン処理および希釈によって、選択的に成長因子を添加することを伴って、増殖を誘導することができる。静止状態では、本発明の細胞は、コンフルエンスに達する前に、たとえば50%〜90%のコンフルエンスの間に、特に60%〜70%のコンフルエンスの間に自発的に増殖を停止する。
HLAクラスI陰性、
HLAクラスII陰性、
CD3陰性、
CD13陽性、
Oct-4陽性、
Rex-1陽性、
ABCG2陽性。
-DMEM培地/Ham's Fl2(vol/vol、1:1)抗生物質、例えば100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、
5μg/mlのヒトインスリン(Sigma)、
10μg/mlのヒト・トランスフェリン(Sigma)、
PPARγ活性化因子、たとえば1μMのBRL49653または2μmのシグリタゾン(Biomol)、
100〜250μMのイソブチル-メチルキサンチン(IBMX)、
0.2nmのデキサメサゾン、
1μMのトリヨードチロニン(T3 Sigma)を補ったもの。
-抗生物質、たとえば100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、
10%の脱補体した(decomplemented)ウシ胎仔血清、
0.1μMのデキサメサゾン(SIGMA)、
10mMのβーグリセロリン酸(SIGMA)
50μg/mlのアスコルビン酸(SIGMA)を補ったDMEM。
商品名Promo Cell販売される培地、または
DMEM培地
2%の脱補体した(decomplemented)ウシ胎仔血清
抗生物質(例えば100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン)。
抗生物質、10ng/mlのヒトVEGF121(SIGMA)を補ったDMEM培地。
また、本発明の細胞は、活性な薬剤、たとえば遺伝子産物、セリック(seric)抽出物、条件培地、動物または植物起源の産物、薬物ライブラリーなどの同定のためのスクリーニング系に使用することができる。
a)候補薬剤の存在下における中胚葉系統(たとえば脂肪細胞、骨芽細胞または筋細胞)の細胞に、これらを分化させることができる条件下で、本発明に従って幹細胞を培養することと、
b)候補薬剤の存在下における細胞の分化を候補薬剤の非存在下における分化と比較することと、
によって特徴づけられるスクリーニング法を含む。
a)本発明の幹細胞を、これらが脂肪細胞に分化することができる条件下で培養することと、
b)こうして得られた脂肪細胞を候補薬剤と接触させて、候補薬剤の脂肪分解活性を決定することと、
によって特徴づけられる方法を含む
また、本発明は、抗脂肪分解活性を有する可能性のある薬剤を同定することができるスクリーニング法であって:
a)本発明の幹細胞を、これらが脂肪細胞に分化することができる条件下で培養することと;
b)こうして得られた脂肪細胞を、脂肪分解性の薬剤の存在下において候補薬剤と接触させることと;
c)候補薬剤の抗脂肪分解活性を決定することと、
によって特徴づけられるスクリーニング法を含む。
a)本発明の幹細胞を、これらが脂肪細胞に分化することができる条件下で培養することと、
b)こうして得られた脂肪細胞を候補薬剤と接触させることと;
c)無処置の脂肪細胞と比較して候補薬剤のインスリン感受性を増加させる活性を決定することと、
によって特徴づけられるスクリーニング法を含む。
1.1.得られた脂肪組織試料に関する記述
6種の脂肪組織試料を1月〜7年歳の幼児から得た;性および解剖学的な位置は、異なっていた。
以下の実施例には、試料Primo1〜6から多分化能の幹細胞を得ることを記載する。前記幹細胞は、次の工程を行うことによって得られた:
・試料から多分化能の細胞を単離すること
・インビトロで多分化能の細胞の細胞培養を濃縮すること
・静止状態の幹細胞を得ること
・幹細胞の集中的な増殖を誘導すること
得られた幹細胞は、
・テロメラーゼ活性の測定
・種々の段階において核型を作製すること
・細胞可塑性(異なる細胞型への分化)を研究すること
・幹細胞をクローニングすること
によって特徴づけた。
手術後に、試料は、DMEM培地(ダルベッコ修正イーグル培地)+10%のウシ胎仔血清中に外界温度で貯蔵する。組織を37℃においてPBS(リン酸緩衝食塩水)でリンスして、次いで流して、計量する。次いで、酵素消化工程を最適化するために、試料を非常に細かく切る。
1.3.1静止幹細胞の集団を得る:
2つの亜集団(CAおよびCS)を同じ方法で培養において維持する。前記細胞は、初期段階(約50〜60回の集団倍加に対応する)では可塑性、増殖、および形態学に関して同様の特徴を有する。
静止状態のCA細胞集団を確立した後に、ヒトbFGF(塩基性線維芽細胞成長因子)を5ng/mlの培地の濃度で上記した培地に添加する。図2に示したように、CA集団の細胞のみが効率的にbFGFに反応する。対照的に、bFGFは、後期段階(すなわち、50回の集団倍加後)で、実際にCS集団に対して全く効果を有さなかった。
-bFGFは、細胞の形態の変化を引き起こす。静止状態のときに、これらは平らになり、拡張する。bFGFの存在下において、およびしたがって、増殖期において、これらは、線維芽細胞形態をとり(図3、図12)、
-さらに、bFGFの効果は可逆性である(図3)。
2つの亜集団CAおよびCSからの細胞を定期的に凍結してそれぞれの細胞集団の系統を構築し、引き続く細胞の移動の間にこれを発生させる。寒冷保存では、前記細胞の性質は変化しない。
2.1テロメラーゼ活性を決定するための方法:
テロメラーゼ活性は、Te1oTAGGGテロメラーゼPCR ElisaPLUSキット(Roche)を使用して定量する。
i)第1工程は、増幅/伸長工程(または、TRAPアッセイ法)であって、テロメラーゼがビオチン化されたプライマーの3'末端にテロメアモチーフ(TTAGGG)を付加する工程である。
Rocheによって販売される「Telo TAGGGテロメラーゼPCR Elisa Plus」キットを用いて、Primo2の2つの亜集団CAおよびCSに存在するテロメラーゼ活性を定量した。
核型により、中期に存在する染色体を観察すること、および分類することができる。
中期は、従来の細胞発生の技術を使用して得られる。紡錘体(fusorial)装置のブロッキングによって中期の細胞を蓄積(コルヒチンの存在下において3時間のインキュベーション)した後、低張液(75mMのKClを37℃で40分間)の作用によって細胞質において染色体の分散を行い、続いてメタノール/酢酸(3/1)で固定する。次いで、RHG-バンド形成技術を使用して染色体を同定する。
細胞核型を決定した。これらの核型は、bFGFの存在下または非存在下において2つの亜集団CAおよびCSで、および異なる継代(Primo2CAについてT21、T23、およびT34)で行った。
幹細胞可塑性を以下の技術を使用して評価する:
4.1細胞可塑性を評価するための方法:
4.1.1.異なる細胞型への分化のための条件:
細胞をトリプシン処理し、次いで20000細胞/cm2で接種する。細胞は、24〜48時間後にコンフルエンスに達する。コンフルエンスは、分化に重要な工程であるので、細胞を、分化(脂肪細胞、骨芽細胞、筋細胞)へ進む前にさらに24時間コンフルエンスで維持する。
コンフルエントな細胞は、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、5μg/mlのヒトインスリン(Sigma)、10μg/mlのヒトトランスフェリン(Sigma)、1μMのPPAR活性化因子(たとえばBRL49653)、100〜250μMのイソブチル-メチルキサンチン(IBMX)、および1μMのデキサメサゾンを補ったDMEM/Ham'sF12(体積/体積、1:1)培地中でインキュベートする。48〜72時間後に、この培地を上記した培地であるが、IBMXおよびデキサメサゾンを含まない培地に置換する。この分化培地を最適な脂肪細胞分化に対応する15〜20日間2〜3日ごとに置換する。
24時間にコンフルエントであった細胞をDMEM、100μ/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、10%の脱補体したウシ胎仔血清、0.1μMのデキサメサゾン(SIGMA)、10mMのβ-グリセロリン酸(SIGMA)、および50μMのアスコルビン酸(SIGMA)から成る骨芽細胞分化培地でインキュベートする。
24時間コンフルエントであった細胞をDMEM培地か、または2%の脱補体されたウシ胎仔血清および抗生物質(100μ/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン)の存在下においてPromoCell培地中でインキュベートする。培地は、3〜6週にわたって2-3日ごと、特に21日にわたって3日ごとに置換する。
細胞を10ng/mlのヒトVEGF121(SIGMA)を含むDMEM培地中に20000/cm2で接種する。分化培地は、21日間2〜3日ごと置換する。
i)オイルレッドO染色(脂肪細胞:細胞内脂質の染色)
PBS/0.25%のグルタルアルデヒド溶液において固定後、細胞をオイルレッドO溶液2%(重量/体積)溶液中において外界温度で5分間インキュベートする。次いで、細胞を洗浄し、70%のグリセリン中に保存する。
PBS/0.25%のグルタルアルデヒド溶液において固定後、細胞をアリザリンレッドO1%(重量/体積)溶液中において外界温度で5分間インキュベートする。次いで、細胞を水で洗浄し、乾燥状態で貯蔵する。
i)d'RNAの抽出
Tri Reagent (Euromedex, Ref TR-1 18)を使用して細胞のRNAを抽出する。
20μgのRNA/ウェルをが堆積したである抽出された使用する(Euromedex、ref跡-118)であるアガロースゲル(1.2%)/MOPS(1×)/ホルムアルデヒド(1.1M)に対して沈着させるを。MOPS(1×)遊走緩衝液中で電気泳動した後、RNAをナイロンHybondN+(Amersham Pharmacia)の膜へ転写する。
逆転写PCR反応は、QiagenからのOneStepRt-PCRキットを使用して行った。
この技術は、インビトロで筋細胞に分化できるPrimo2CA細胞の数を定量するために使用した。分析されたマーカーは、速い収縮のミオシンou FTミオシン(筋形成の後期マーカー)であった。
細胞を外界温度で10分間4%のパラホルムアルデヒドで固定する。所望のタンパク質が核にあるときは(たとえば、ミオゲニンなど)、細胞をPBS/0.l%トリトンX100の存在下において10分間透過化処理する。次いで、3%のH2O2と細胞を5分間インキュベートすることによって、内因性ペルオキシダーゼの活性をブロックする。
4.2.1初期継代における2つの細胞亜集団CAおよびCSの可塑性の結果
初期(たとえばT1、T5、T7、それぞれ3、15、および21回の集団倍加に対応する)において、CAおよびCS集団は、可塑性、形態学、および増殖に関して同じ特徴を有する。
Primo1CA(40回の集団倍加)、Primo3CA(25回の集団倍加)およびPrimo6CA(25回の集団倍加)について、オイルレッドO染色を含む実験の結果を図5(Primo2CAおよびPrimo2CSについて)および図14に示してある。さらに、それぞれ50回、40回、40回の集団倍加後のPrimo1CA、Primo3CA、およびPrimo6CAからの脂肪細胞を図13に示してある。図13および14の比較では、集団倍加が多いほどで、より分化が均質になることを示す。
図7は、CSおよびCA細胞の骨芽細胞への分化を示す。アリザリン染色。
Primo2CSの細胞は、20回の移動(約60回の集団倍加に対応する)後に老化する。これらは、同時にこれらの増殖能およびこれらの分化能を失う。
適切な培養条件下で、Primo2CA細胞は、筋細胞および内皮細胞に約3週後にインビトロで分化することができる。
筋細胞分化培地の存在下において4日後に、Primo2CA細胞は、ミオゲニン(免疫組織化学的なラベリング、図21参照)などの筋細胞分化の初期マーカーを発現する。7日後には、ミオゲニン発現はもはや検出できない。
「肢芽中胚葉」に属する脂肪細胞、骨芽細胞、および筋細胞細胞とは対照的に、内皮細胞は、内臓中胚葉に由来する。DMEMおよびhVEGF121(longlml)から成る培地中で21日間維持した後に、Primo2CA細胞は、フォンビルブラント因子、内皮細胞に特異的なマーカーを発現する(免疫組織化学、図23を参照)。
5.1脂肪細胞機能を特徴づけるための方法
5.1.1グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ活性(GPDH)の測定
第1に、GPDH活性が測定される細胞を溶解する。アッセイ法の原理は、以下のスキームに要約することができる:
この試験は、アドレナリン受容体アゴニストの存在下において脂肪細胞によって遊離される放射標識されたグリセリンを測定することからなる。使用される方法は、Bradley DCおよびKaslow HR (Anal Biochem, 1989, 180,11-16)によって記載されている。遊離したグリセリンは、グリセロキナーゼおよびATPおよびγ位に32PでラベルしたATPの存在下においてリン酸化される。次いで、残りのATPを90℃の酸性培地中で加水分解し、モリブデン酸アンモニウムおよびトリエチルアミンによって沈殿させる。32Pでラベルしたグリセロリン酸の形態で組み込まれた放射能をβカウンターで計数することによって推定し、検量線を使用して、pmolで値を表す。
5.2.1グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ活性(GPDH)
Primo2CA細胞(ヒトbFGFの存在下においてT24):
分化の11日後(2実験)
対照:77nmol/min/mgのタンパク質
PPARγ(BRL49653)のアゴニストの存在下において:290nmol/min/mgのタンパク質
分化の16日後(3実験)
対照:20nmol/min/mgのタンパク質
PPARγ(BRL49653)のアゴニストの存在下において:390nmol/min/mgのタンパク質
Primo2CS細胞(ヒトbFGFの存在下においてT22):
分化の13日後(3実験)
対照:22nmol/min/mgのタンパク質
PPARγ(BRL49653)のアゴニストの存在下において:30nmol/min/mgのタンパク質
5.2.2 Primo2CA細胞の脂肪分解能力
異なるβアドレナリン受容体に対して特異的なアゴニストで、Primo2CAT32細胞に対して脂肪分解を行った、すなわち:
イソプロテレノール:β1、β2アドレナリン作動性
ドブタミン:β1アドレナリン作動性
テルブタリン:β2アドレナリン作動性
CL316243 β3 アドレナリン作動性:
以下の脂肪分解率が得られた(グリセリン検量線を使用する):
対照:5.76nmol/min/mgのタンパク質
ドブタミン:60.lnmol/min/mgのタンパク質
テルブタリン:93.78nmol/min/mg:60.1nmol/min/mgのタンパク質
CL316243:17.1nmol/min/mgのタンパク質
結果は、図10に示してある。
6.1骨芽細胞の機能性を特徴づけるための方法
骨芽細胞によって分泌されるカルシウムを検出するために、上記した骨芽細胞分化培地で細胞を培養した。
骨芽細胞の機能性は、細胞外基質に結合するカルシウムを検出するための技術によって証明した(図11)。
本発明の幹細胞のHLAクラスI陰性の性質は、従来の単一ラベル系を使用するフローサイトメトリーによって証明した:
7.1単一ラベリング
細胞を単離し、次いでPBS中で洗浄する。遠心処理後、細胞を再懸濁し、4℃で30分間10μg/mlの濃度で一次抗体とインキュベートした。使用した抗体は、クラスIHLA分子に対して向けられたモノクローナル・マウス抗体(W6/32、Novocastra)またはネガティブ対照として使用したマウスIgG抗体(Santa Cruz)のいずれかである。それぞれの条件に使用した細胞数は、5×105〜106である。この分析のために以下の細胞を使用した:
HeLa:ヒト腫瘍細胞(HLAクラスI陽性:陽性対照)。
SVF:成体脂肪組織、集団倍加なし(HLAクラスI陽性)
Primo2CA:120回の集団倍加
Primo2CS:45回の集団倍加。
Primo2CA細胞を、限界希釈条件、すなわち24穴プレートのウェルにつき細胞の1/3にまき、次いで、5ng/mlのbFGFを含む10%のFCSの存在下において維持した。
本発明の幹細胞、特にクローンCA1由来の細胞(実施例7に記載したとおりに得られる)には、抗生物質抵抗性、ピューロマイシン、およびLTRプロモーターの制御下にリポーター遺伝子LacZの遺伝子を発現するレトロウイルスによって、21回の集団倍加段階で導入した。感染性のビリオンは、ベクターを発現しており、水疱性口内炎のためにウイルスのGタンパク質を含むプラスミドpFB-Neo-lacZおよびベクターPVPack-VSVGで同時トランスフェクトされたPVPackGPベクター(gagおよびpol配列を含む)によって安定にトランスフェクトされた293細胞から産生した。図17は、その後にピューロマイシンの存在下において選択された導入細胞は、β-ガラクトシダーゼ活性によってインサイチュウで示されるように、全てがLacZ遺伝子を発現する。
Oct-4は、マウス胚幹細胞に特異的に発現され、これらの多能性を維持するために不可欠な転写因子である。また、Oct-4は、ヒト胚幹細胞によって発現されることを示した。
本発明のCA細胞、特にPrimo2CA細胞の特徴付けは、フローサイトメトリーを使用して、表面マーカーに関してさらに調査した。
ラベリングのプロトコルは、上記した通りである(実施例7を参照されたい)。使用した抗体は、以下の通りであった:
フルオレッセイン(FITC)結合HLAクラスI;
フィコエリトリン(PE)結合HLA-DR(HLAクラスII組織);
PE結合CD-3(Tリンパ球の標識);
FITC結合CD13(骨髄の間質性細胞、内皮細胞、顆粒球/単球の初期前駆体、およびこれらの子孫のマーカー)
11.2表面マーカーに関する本発明のCA細胞の特性付けの結果:
Primo2CA細胞は、CD3、HLAクラスI、およびHLA-DRの発現について表面陰性である。対照的に、これらは、CD13陽性である(なかでも、骨髄間質細胞にマーカーを発現した(図20を参照されたい)。
実施例4では、本発明の細胞がインビトロで3週後に内皮細胞に、および筋細胞に分化することができることを証明した。
12.1.1.移植プロトコル
本発明のCA細胞(より具体的には、Primo2CA、Primo1CA、およびPrimo3CAの細胞)のインビボでの再生能を分析するために、mdxマウス動物モデル(C57BL/lOScSn DMDmdMDX/J)を使用した。
・80回から160回の間の集団倍加(より正確に言うと、80回の、120回の、160回の集団倍加)で得られたPrimo2CA細胞;
・50回および120回の集団倍加で得たPrimo1CA細胞;
・45回、80回、110回の集団倍加のPrimo3CA細胞。
12μMの連続切片は、凍結して、50、75、および100%のエタノール中で10分連続して通過させることによって脱水した筋肉から調製した。
スライドを、濃度増大(70、80、および100%)しながらエタノールの浴槽中で2分間連続して通過することによって脱水し、次いで70%のホルムアミド/2×SSC溶液(クエン酸塩加塩類溶液)中で73℃において2分30秒間変性させた。次いで、ハイブリダイゼーションへ進む前に、スライドを再水和された(100、80、および70%の濃度を減少したエタノール浴槽)。
ジストロフィンを再発現する筋線維と共にヒト核を共局在のために、本発明者らは、二重ラベリング(ジストロフィン/ヒト核)を行った。この目的のために、FISHでヒト核をラベルする前にジストロフィン検出工程を行った。
12.2.1インビボにおける筋肉再生能力
インビボにおける成体幹細胞の多能性に関する多くの研究では、特に前記細胞の融合力を証明した後が問題であった(Teradaら、Nature 2002 ; Wurmserら、Nature, 2002およびYingら、Nature, 2002)。さらに、特定の研究では、前記細胞が、これらを移植した組織に特異的なマーカーを発現する能力は、極めて珍しいイベントであることを示唆する(Wagersら、Science,2002; Morsheadら、Nature, 2002)。
大部分の体細胞とは対照的に、本発明のCA細胞は、HLAクラスIマーカー(実施例7を参照されたい)および表面HLAクラスIIマーカー(実施例11)がない。この極めて珍しい表現型は、本発明のCA細胞の非免疫原性を強く示差する。
本発明の種々の態様を図に示してある:
CAT14:継代14(42回の集団倍加に対応する)におけるPrimo2CA集団;
CST16:継代16(48回の集団倍加に対応する)におけるPrimo2CS集団。
hOC:脂肪細胞標識。
単一ラベル:FITC
1.HELA:ヒト腫瘍細胞。HLAクラスI陽性。
2.SVF:成体脂肪組織(集団倍加がない)。HLAクラスI陽性。
3.Primo2CA:120回の集団倍加。
4.Primo2CS:45回の集団倍加
黒線:マウスIgG:ネガティブ対照抗体
灰色の線:抗HLAクラスI W6/32抗体。
220塩基対断片のための内部プライマー5'-CACTCGGTTCTCGATACTGG-3'
-ABCG2のために:94℃、1分;60℃、1分;72℃、1分を31サイクル、
プライマー:5'-GGCCTCAGGAAGACTTATGT-3'および5'-AAGGAGGTGGTGTAGCTGAT-3'
-Rex-1のために:94℃、1分、60℃、1分、72℃、1分を31回のサイクル数;72℃、5分、1サイクル
プライマー:5'-CTCTCCAGTATGAACCAGG-3'および5'-GAAAGGATCAGAACAACAGC-3'
400塩基対断片のための内部プライマー5'-GGCATTGACCTATCAGATCC-3'。
赤:ヒト動原体
青:核(ヒトおよびマウス)
TA:前脛骨筋
G:腓腹筋
図24(10日):抗ジストロフィン抗体:NCL-DYS2
左側写真:無処置の前脛骨筋(対照);
中心の写真:シクロスポリン(移植の10日後)で処理したmdxマウスの前脛骨筋;
右側写真:免疫適格性のマウス(シクロスポリンなし)(移植の10日後)の前脛骨筋。
Claims (47)
i)形質転換されたHEK293T細胞株のテロメラーゼ活性の少なくとも20%から50%の有意な内因性テロメラーゼ活性、
ii)HLAクラスI陰性の表現型、
iii)正常な核型、
iv)50〜80回の集団倍加の後の静止状態になる能力、
v)少なくとも130回の集団倍加の間保存される自己複製の能力、
vi)60回の集団倍加において0.05%未満の、pH6における内因性のβ-ガラクトシダーゼ活性、
vii)白血病抑制因子の受容体(LIF-R)の非発現、
を有することを特徴とするヒト幹細胞。
HLAクラスI陰性;
HLAクラスII陰性;
CD3陰性;
CD13陽性。
HLAクラスI陰性、
HLAクラスII陰性、
CD3陰性、
CD13陽性、
LIF-R陰性、
Oct-4陽性、
Rex-1陽性、
ABCG2陽性、
ならびに正常な核型および形質転換されたHEK293T細胞株のテロメラーゼ活性の少なくとも20%から50%の有意な内因性テロメラーゼ活性、および60回の集団倍加において0.05%未満の、pH6における内因性のβ-ガラクトシダーゼ活性を有することと、
を特徴とする細胞。
a)10歳以下の子供に由来するヒト脂肪組織試料の酵素消化;
b)脂肪細胞のない細胞分画を、工程(a)において得られた前記消化された試料から回収すること、ここにおいて、前記細胞分画は、脂肪細胞を除く前記消化された試料に存在する細胞タイプの全てを含む;
c)工程(b)で得られた前記細胞分画のインビトロ培養を12時間行うこと;
d)工程(c)のインビトロ細胞培養物から、12時間以下の培養で接着する細胞を選択し、「CA」と名付けた細胞亜集団を得ること;
e)静止状態に入ることができる細胞集団が得られるまで50〜80回の集団倍加を行って集団「CA」を濃縮すること;
f)集団「CA」の幹細胞の増殖を誘導すること;および
g)工程f)にて得られた前記細胞集団を回収し、これによって幹細胞集団を回収すること。
a)請求項1、9もしくは24のいずれか1項に記載の幹細胞または請求項11に記載の細胞集団を、これらが前記中胚葉系統の細胞へ分化できる条件下で、前記候補薬剤の存在下において培養することと;
b)前記候補薬剤の存在下における細胞の分化を、前記候補薬剤の非存在下における分化と比較することと、
によって特徴付けられる方法。
a)これらが脂肪細胞に分化できる条件下で、請求項1、9もしくは24のいずれか1項に記載の幹細胞または請求項11に記載の細胞集団を培養することと、
b)こうして得られた前記脂肪細胞を候補薬剤と接触する状態にすることと、
c)前記候補薬剤の脂肪分解活性を評価することと、
によって特徴付けられる方法。
a)これらが脂肪細胞に分化できる条件下で、請求項1、9もしくは24のいずれか1項に記載の幹細胞または請求項11に記載の細胞集団を培養することと、
b)こうして得られた脂肪細胞を、脂肪分解性の薬剤の存在下において候補薬剤と接触する状態にすることと、
c)前記候補薬剤の抗脂肪分解活性を評価することと、
によって特徴付けられる方法。
a)これらが脂肪細胞に分化できる条件下で、請求項1、9もしくは24のいずれか1項に記載の幹細胞または請求項11に記載の細胞集団を培養することと、
b)得られた前記脂肪細胞を候補薬剤と接触する状態にすることと、
c)前記候補薬剤のインスリン増感作用活性を評価することと、
によって特徴付けられる方法。
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