JP5778412B2 - Cgrp応答調節剤の評価又は選択方法 - Google Patents
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Description
1)CGRP応答調節剤の評価又は選択方法であって、以下:
血管平滑筋由来の細胞を培養し、再分化した血管平滑筋細胞を調製する工程;
当該再分化した血管平滑筋細胞を試験物質と接触させる工程;
当該再分化した血管平滑筋細胞におけるCGRP応答を測定する工程;
当該測定されたCGRP応答に基づいて、当該試験物質をCGRP応答調節剤として評価又は選択する工程、
を包含する、方法。
2)前記再分化した血管平滑筋細胞を調製する工程が、前記血管平滑筋由来の細胞を2000〜8000cells/cm2の密度で増殖培地で培養し、次いで分化培地で少なくとも7日間培養して血管平滑筋細胞に再分化させる工程である、1)に記載の方法。
3)前記再分化した血管平滑筋細胞をCGRPと接触させる工程をさらに包含する、1)又は2)記載の方法。
4)前記再分化した血管平滑筋細胞におけるCGRP受容体の活性を測定する工程が、当該細胞内のサイクリックAMPを測定する工程である、1)又は2)記載の方法。
5)前記再分化した血管平滑筋細胞をホスホジエステラーゼ阻害剤と接触させる工程をさらに包含する、4)記載の方法。
6)前記血管平滑筋由来の細胞がヒト正常冠状動脈平滑筋細胞である1)記載の方法。
例えば、CGRP応答促進としては、CGRP受容体発現の促進;CGRP受容体活性の向上;CGRPとその受容体との結合の促進;CGRP受容体アゴニスト作用;Gタンパク質活性の増強;アデニレートシクラーゼ活性の増強;細胞内cAMPの増加;プロテインキナーゼA活性の増強;及びK+チャネル開口促進等が挙げられる。また例えば、CGRP応答抑制としては、CGRP受容体発現の抑制;CGRP受容体活性の抑制;CGRPとその受容体との結合の阻害;CGRP受容体アンタゴニスト作用;Gタンパク質活性化の抑制;アデニレートシクラーゼ活性化の抑制;細胞内cAMPの増加の抑制、プロテインキナーゼA活性化の抑制、及びK+チャネル開口抑制等が挙げられる。
好ましくは、「細胞のCGRP応答」は、CGRPにより引き起こされる細胞内cAMPの増加の程度を指標として決定され得る。従って、好ましくは、CGRP応答促進及び抑制とは、それぞれCGRPにより惹起される細胞内cAMPの増加を促進及び抑制することをいう。
まず、血管平滑筋由来細胞を増殖培地で播種し、分化用培養細胞を調製する。増殖培地としては血管平滑筋細胞用の増殖培地として通常使用されている培地であれば、特に限定されない。例えば、増殖培地としては、クラボウ社のHuMedia-SB2等の基礎培地500mlに、FBS 25ml、hEGF 0.5ml、hFGF-B 0.5ml、インスリン0.5ml、抗菌剤0.5mlを添加したものを使用することができる。当該平滑筋由来細胞は、増殖培地に、2000〜8000cells/cm2、好ましくは4000±2000cells/cm2、より好ましくは4000±1000cells/cm2の密度、さらに好ましくは4000±500cells/cm2の密度で播種される。
次いで、増殖培地に播種した平滑筋由来細胞を、通常の条件(例えば、37℃、5%CO2)下で、当該細胞が培養基板(例えば、フラスコ、ペトリ皿又は培養プレートの表面等)に接着するまで培養する。このとき、当該培養は、接着した細胞の増殖が始まる前に終えることが望ましい。したがって、増殖培地における好ましい培養期間は、数時間〜24時間であるが、これに限定されない。
上記手順により、血管平滑筋由来細胞から分化用培養細胞を調製する。一態様において、調製された分化用培養細胞は、血管平滑筋由来細胞の初代培養細胞である。好ましくは、当該初代培養細胞は、ヒト正常冠状動脈平滑筋細胞から培養された初代培養細胞である。
上記の手順により血管平滑筋由来細胞を再分化させて、再分化した血管平滑筋細胞を得ることができる。得られた当該再分化させた血管平滑筋細胞は、CGRP応答性を有する。
好ましくは、CGRPは、当該再分化した血管平滑筋細胞を試験物質と1日〜数日間、好ましくは約2日間接触させた後に、当該細胞に1〜60分間、より好ましくは5〜30分間接触する。例えば、分化用培養細胞を分化培地で5〜8日間培養した後、当該培養物に試験物質を添加し、さらに2日間培養した後、当該培養物にCGRPを添加し、1〜60分間、より好ましくは5〜30分間インキュベートすればよい。あるいは、再分化した血管平滑筋細胞をCGRP及び試験物質にともに接触させる場合は、再分化した血管平滑筋細胞の培養物にCGRP及び試験物質を添加し、1〜60分間、より好ましくは5〜30分間インキュベートすればよい。
例えば、探索すべきCGRP応答調節剤がCGRP受容体発現調節剤である場合、当該細胞をCGRPと接触させることなく、単純に試験物質と1時間〜数日間、好ましくは数時間〜約2日間接触させればよい。また、探索すべきCGRP応答調節剤がCGRP受容体のアゴニストの場合は、当該細胞をCGRPと接触させることなく、単純に試験物質と1分〜数十分、好ましくは5分から60分程度接触させればよい。
(1)方法
細胞の調製
正常ヒト冠状動脈平滑筋細胞(HCASMC;クラボウ社、細胞lot# 4C0915)を増殖用培地(基礎培地HuMedia-SB2 500mlにFBS 25ml、hEGF 0.5ml、hFGF-B 0.5ml、インスリン 0.5ml、抗菌剤 0.5mlを添加したもの;クラボウ社)で培養した。継代には0.025%トリプシン/0.01%EDTAを用いた。HCASMCを4000cells/cm2の密度で増殖用培地を含む48ウェルプレートに播種し、15時間培養した。培養後の細胞は、プレート表面に接着しており、且つ増殖が始まっていないことが確認できた。この細胞を、分化用培養細胞として取得した。分化用培養細胞の培地を分化用培地(基礎培地HuMedia-SB2 500mlにFBS 5ml、ヘパリン 0.5ml、抗菌剤 0.5mlを添加したもの;クラボウ社)に交換し、同じ分化培地で培養培地を1日おきに交換しながら10日間培養した(分化培地培養物)。なお、分化培地培養物のコントロールとして増殖用培地でさらに10日間培養したHCASMCを同時に調製した(増殖培地培養物)。
上記で得られた両培養物を、ホスホジエステラーゼ阻害剤(PDI)IBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine、500μM;シグマ社)及びRo-20-1724(100μM;和光純薬工業株式会社)を含む基礎培地(Humedia-SB2;クラボウ社)で2回洗浄し、さらに同培地を200μl添加して37℃にて60分間培養し、細胞内に阻害剤を浸透させた。培地を除去してCGRP(株式会社ペプチド研究所)10若しくは100nM、及びホスホジエステラーゼ阻害剤IBMX 500μM、Ro-20-1724 100μMを含む基礎培地を添加し、37℃にて30分間培養した。CGRPを添加しない場合(0nM CGRP)をコントロールとした。ポジティブコントロールとしては、CGRPの代わりに、非特異的アデニレートシクラーゼ活性化剤フォルスコリン(シグマ社)10μMを添加した。cAMP測定EIAキット(cAMP EIA (non-acetylation);GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)に付属の細胞溶解液を添加することにより反応を停止させた後、同付属の取扱説明書に記載の方法に従って細胞内cAMP濃度([cAMP]i)を測定した。
増殖培地培養物と分化培地培養物におけるCGRP応答の測定結果を、それぞれ図1A及びBに示す。増殖培地培養物ではCGRP応答は観察されなかった(A)一方、分化培地培養物ではコントロールに対して有意に高いCGRP応答が観察された(B)。この結果から、分化培地培養物の細胞がCGRP応答を有する血管平滑筋細胞に再分化していることが示された。
正常ヒト冠状動脈平滑筋細胞(HCASMC;クラボウ社、細胞lot# 625723)を4000cells/cm2の密度で、増殖用培地(基礎培地HuMedia-SB2 500mlにFBS 25ml、hEGF 0.5ml、hFGF-B 0.5ml、インスリン 0.5ml、抗菌剤 0.5mlを添加したもの;クラボウ社)を含む48ウェルプレートに播種し、15時間培養した後、培地を分化用培地(基礎培地HuMedia-SB2 500mlにFBS 5ml、ヘパリン 0.5ml、抗菌剤 0.5mlを添加したもの;クラボウ社)に交換した。同じ分化培地で培養培地を1日おきに交換しながら5〜9日間細胞を培養した。
CGRPの濃度を100nMとしたこと以外は実施例1と同様の手順で、細胞のCGRP応答([cAMP]i)を測定した。結果を図2に示す。7日目以降、CGRP応答([cAMP]i)が安定して観察されることが示された。
分化培地での培養期間が7日間であったこと以外は、実施例2と同様の手順で細胞を調製した。
CGRPの濃度及び添加時間を0.01〜1000nM、及び10分間としたこと以外は実施例1と同様の手順で、細胞のCGRP応答([cAMP]i)を測定した。
結果を図3に示す。細胞のCGRP応答は添加したCGRPの用量依存的に増加した。
正常ヒト冠状動脈平滑筋細胞(HCASMC;クラボウ社、細胞lot# 4C0915)を4000cells/cm2の密度で増殖培地に播種し、実施例2と同様の手順で細胞を調製した。分化培地での培養期間は7日間とした。
CGRP 5nM若しくは10nM、又はさらにCGRP8-37(CGRPアンタゴニスト:株式会社ペプチド研究所)1μMを10分間添加したこと以外は実施例1と同様の手順で、細胞のCGRP応答([cAMP]i)を測定した。CGRPを添加しない場合をコントロールとした。
結果を図4に示す。CGRPアンタゴニストCGRP8-37を添加することにより、細胞のCGRP応答が有意に抑制された。
Claims (6)
- CGRP応答調節剤の評価又は選択方法であって、以下:
血管平滑筋由来の細胞を培養し、再分化した血管平滑筋細胞を調製する工程;
当該再分化した血管平滑筋細胞を試験物質と接触させる工程;
当該再分化した血管平滑筋細胞におけるCGRP応答を測定する工程;
当該測定されたCGRP応答に基づいて、当該試験物質をCGRP応答調節剤として評
価又は選択する工程、
を包含し、
当該再分化した血管平滑筋細胞を調製する工程が、当該血管平滑筋由来の細胞を4000±500cells/cm 2 の密度で増殖培地に播種、培養し、次いで分化培地で少なくとも7日間培養して血管平滑筋細胞に再分化させる工程である、
方法。 - 前記再分化した血管平滑筋細胞をCGRPと接触させる工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記再分化した血管平滑筋細胞におけるCGRP受容体の活性を測定する工程が、当該細胞内のサイクリックAMPを測定する工程である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記再分化した血管平滑筋細胞をホスホジエステラーゼ阻害剤と接触させる工程をさらに包含する、請求項3に記載の方法。
- 前記血管平滑筋由来の細胞がヒト正常冠状動脈平滑筋細胞である請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 前記分化培地が、基礎培地500mlに対してFBS 5ml及びヘパリン0.5mlを含む培地である、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
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