DE69634303T2 - Chondrogene in vitro induktion von menschlichen mensenchymalen stammzellen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Verfahren und Zusammensetzungen zur Einleitung mesenchymaler Vorläuferzellen unter in vitro-Kultivierung in die Differenzierung über spezifische Zellabstammungs-Signalwege und insbesondere die Einleitung einer solchermaßen gesteuerten Stammbaumabfolge, die vor oder zum Zeitpunkt der Implantation in einen Empfänger oder Wirt stattfindet, für die therapeutische Behandlung pathologischer Zustände beim Menschen und anderen Spezies.
  • Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind die bildenden, pluripotenten Stammzellen oder embryoartigen Zellen, die sich im Knochenmark, Blut, der Dermis und dem Periosteum befinden, und die in der Lage sind, zu spezifischen Typen mesenchymaler Gewebe oder Bindegewebe, einschließlich Fettgewebe, Knochengewebe, Knorpelgewebe, elastischen Geweben, Muskelgewebe und faserigen Bindegeweben, auszudifferenzieren. Der spezifische Differenzierungssignalweg, den diese Zellen einschlagen, ist von verschiedenen Einflüssen abhängig, von mechanischen Einflüssen und/oder endogenen bioaktiven Faktoren, wie etwa Wachstumsfaktoren, Zytokinen und/oder lokalen Bedingungen der Mikroumgebung, die von den Wirtsgeweben geschaffen werden. Obwohl diese Zellen normalerweise in sehr geringer Häufigkeit im Knochenmark vorhanden sind, ist ein Verfahren für die Isolierung, Reinigung und mitotische Vermehrung einer Population dieser Zellen in Gewebekultur beschrieben in Caplan et al., US-Patente Nr. 5,197,985 und 5,226,914.
  • Bei pränatalen Organismen ist die Differenzierung der MSCs in spezialisierte Bindegewebszellen wohlbekannt; beispielsweise differenzieren sich mesenchymale Zellen des Hühnerembryos, Mausembryos oder der menschlichen Gliederknospe zu Knorpeln, Knochen und anderen Bindegeweben (Caplan Al, in: 39th Annual Symposium of the Society for Developmental Biology, herausgegeben von S. Subtelney und U. Abbott, S. 3768, New York, Alan R Liss Inc, 1981; Elmer et al., Teratology, 24: 215–223, 1981; Hauschka SD, Dev Biol, 37: 345–368, 1974; Solursh et al., Dev Biol, 83: 9–19, 1981; Swalla et al., Dev Biol, 116: 31–38, 1986). Zusätzlich wurde für eine klonale Calvaria (Schädeldach)-Zellinie des Rattenfötus gezeigt, dass diese zu Muskel, Fettgewebe, Knorpel und Knochen differenziert (Goshima et al., Clin Orthop Rel Res, 269: 274–283, 1991). Die Existenz von MSCs bei postnatalen Organismen ist in geringem Maße mit der Zielsetzung untersucht worden, die Differenzierung post-embryonaler Zellen zu verschiedenen mesodermalen Phänotypen zu zeigen. Die wenigen Studien, die durchgeführt wurden, beinhalten die Bildung von Knochen und Knorpel durch Knochenmarkzellen nach deren Einschluss in Diffusionskammern und deren in vivo-Transplantation (Ashton et al., Clin Orthop Rel Res, 151: 294–307, 1980; Bruder et al., Bone Mineral, 11: 141–151, 1990). Kürzlich hat man Zellen aus dem Periosteum des Huhns isoliert, in Kultur vermehrt, und, bei in vitro-Bedingungen hoher Dichte, gezeigt, dass diese zu Knorpel und Knochen ausdifferenzieren können (Nakahara et al., Exp Cell Res, 195: 492–503, 1991). Für aus dem Knochenmark der Ratte erhaltene mesenchymale Zellen ist gezeigt worden, dass diese die Kapazität besitzen, sich zu Osteoblasten und Chondrozyten zu differenzieren, wenn sie in vivo implantiert werden (Dennis et al., Cell Transpl, I.2332, 1991); Goshima et al., Clin Orthop Rel Res, 269: 274–283, 1991). Obwohl ein indirekter Anhaltspunkt für ihre Befähigung zur Knorpelbildung aus Implantationsstudien gewonnen wurde, ist kein in vitro-System entwickelt worden, in dem diese Zellen zu Chondrozyten (Knorpelzellen) ausdifferenzieren.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist von den Erfindern beobachtet worden, dass bei einer Assoziation humaner mesenchymaler Stammzellen in einem dreidimensionalen Format diese Stammzellen dazu induziert werden können, den Signalweg der Chondrogenese (Knorpelbildung) einzuschlagen und sich an diesem entlang zu differenzieren, wenn sie in vitro mit bestimmten chondro-induzierenden Mitteln oder Faktoren in Kontakt gebracht werden. Das dreidimensionale Format ist für die in vitro-Chondrogenese der Erfindung entscheidend, und die Zellen werden bevorzugt miteinander verdichtet, beispielsweise als gepackte oder pelletierte Zellmasse. Es ist anzunehmen, dass dieser in vitro-Prozess das rekapituliert, was in vivo stattfindet, und dazu verwendet werden kann, um die molekularen Ereignisse zu definieren, die bei dem Prozess der Chondrogenese von Bedeutung sind.
  • Somit stellt die Erfindung in einem Aspekt eine Zusammensetzung für die in vitro-Chondrogenese ausgehend von humanen mesenchymalen Vorläuferzellen und die in vitro-Bildung von humanen Chondrozyten hieraus bereit, wobei die Zusammensetzung isolierte humane mesenchymale Stammzellen in einem dreidimensionalen Format und wenigstens ein chondro-induzierendes Mittel in Kontakt mit diesen beinhaltet. Die mesenchymalen Stammzellen sind bevorzugt isolierte, in Kultur vermehrte humane mesenchymale Stammzellen in einer chemisch-definierten, serumfreien Umgebung, und sie sind zu enger Nähe verdichtet, wie etwa in der Form einer dreidimensionalen Zellmasse, z.B. als gepackte Zellen oder als Zentrifugations-Zellpellet.
  • Das chondro-induzierende Mittel wird vorzugsweise einzeln oder in Kombination ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (i) einem Glucokortikoid, wie etwa Dexamethason, (ii) einem Mitglied der transformierenden Wachstumsfaktor-β-Superfamilie, wie etwa einem Bone morphogenetic Protein (bevorzugt BMP-2 oder BMP-4), TGF-β1, Inhibin A oder einem chondrogenen stimulierenden Aktivitäts-Faktor; (iii) einem Bestandteil der collagenösen extrazellulären Matrix, wie etwa Collagen I (insbesondere in Form eines Gels); und (iv) einem Vitamin A-Analogon, wie etwa Retinsäure. Besonders bevorzugt ist die Kombination von Dexamethason und TGF-β1.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung von Chondrozyten aus mesenchymalen Stammzellen durch In-Kontakt-Bringen der mesenchymalen Stammzellen mit einem chondro-induzierenden Mittel in vitro bereit, wobei die Stammzellen in einem dreidimensionalen Format assoziiert sind.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Induzieren der Chondrogenese bei mesenchymalen Stammzellen durch In-Kontakt-Bringen der mesenchymalen Stammzellen mit einem chondro-induzierenden Mittel in vitro bereit, wobei die Stammzellen in einem dreidimensionalen Format assoziiert sind.
  • Bei den obigen Verfahren sind die mesenchymalen Stammzellen bevorzugt isolierte, in Kultur vermehrte humane mesenchymale Stammzellen in einer chemisch-definierten serumfreien Umgebung, und sie sind zu enger Nähe verdichtet, wie etwa in der Form einer dreidimensionalen Zellmasse, z.B. als gepackte Zellen oder als Zentrifugations-Zellpellet. Weiterhin umfasst das In-Kontakt-Bringen vorzugsweise das Kultivieren eines Pellets aus humanen mesenchymalen Vorläuferzellen in einem chemisch-definierten serumfreien Medium, umfassend: (1) ein chemisch-definiertes minimal-essentielles Medium; (2) Ascorbat oder ein Analoges davon; (3) eine Eisenquelle; (4) Insulin oder einen insulinartigen Wachstumsfaktor; und (5) wenigstens ein chondro-induzierendes Mittel oder einen chondro-induzierenden Faktor. Die obigen Verfahren können vorzugsweise auch Schritte beinhalten, bei denen die Zellen mit der chondro-induzierenden Zusammensetzung kultiviert und danach in einem starren, porösen Gefäß, wie etwa einem Keramikwürfel, angeordnet werden.
  • Es ist auch möglich, eine isolierte, nicht-kultivierte, inhomogene humane mesenchymale Stammzellpräparation für die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung zu verwenden. MSCs können als nicht-kultivierte, inhomogene Präparationen z.B. durch Dichtegradienten-Zentrifugation aus Geweben wie Knochenmark, Blut (einschließlich peripherem Blut), dem Periosteum und der Dermis und aus anderen Geweben mit mesodermalen Ursprüngen isoliert werden. Diesbezüglich ist herausgefunden worden, dass diese mesenchymalen Stammzellen, obwohl sie normaler Weise, beispielsweise im Knochenmark, in äußerst geringen Mengen vorkommen, und mengenmäßig stark mit dem Alter abnehmen (d.h. von etwa 1/10.000 Zellen bei einem relativ jungen Patienten bis zu lediglich 1/2.000.000 bei einem älteren Patienten), als humane mesenchymale Stammzellpräparationen aus Gewebe, insbesondere aus Knochenmark, isoliert werden können, um so weitgehend frei von anderen Zelltypen des Knochenmarks zu sein. Dies ist so zu verstehen, dass die isolierte Fraktionierungs-Präparation Zellen umfassen wird, von denen wenigstens etwa 90% und bevorzugt wenigstens etwa 95% humane mesenchymale Stammzellen sind.
  • Die Abfolge der Ereignisse, die bei der Induktion der Chondrogenese stattfindet und die Produktion von Chondrozyten bei den obigen in vitro-Verfahren ähneln denjenigen bei der Chondrogenese während der embryonalen Gliedmaßenbildung. Da alle Bestandteile des Systems definiert sind, kann das System als wertvolles Forschungswerkzeug für Studien über die Wirkungen von Wachstumsfaktoren, etc., auf das Fortschreiten der Chondrogenese verwendet werden. Es ist auch anwendbar bei Studien der molekularen Kontrolle der Säuger-Chondrogenese aus Vorläuferzellen.
  • Die Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf eine kurze Beschreibung einer jeden der Figuren, die in keiner Weise eine Einschränkung des Schutzbereichs der Erfindung darstellen, weiter beschrieben.
  • 1: Toluidinblau-Färbung eines Schnitts durch einen mit mesenchymalen Vorläuferzellen beladenen Collagen-Schwamm, der drei Wochen nach der subkutanen Implantation in eine Nacktmaus geerntet wurde. Aus Kaninchen-Knochenmark stammende Zellen wurden vor der Ladung in den Schwamm für 14 Tage in Monolayer-Kultur herangezogen.
  • 2A–2C: Toluidinblau-Färbung von Schnitten pelletierter, aus Kaninchen-Knochenmark stammender mesenchymaler Vorläuferzellen aus +DEX-Kulturen an den Tagen 7 (2A), 14 (2B) und 21 (2C).
  • 3A–3G: Immunhistochemie von Pellet-kultivierten, aus Kaninchen-Knochenmark stammenden mesenchymalen Vorläuferzellen. Immunfärbung für Typ II-Collagen an den Tagen 7 (3A), 14 (3B) und 21 (3C). 3D ist ein Schnitt eines Tag 21-Pellets, das für Typ X-Collagen immungefärbt ist. Die Immunfärbung wird auch für Glykosaminoglycane gezeigt: Chondroitinsulfat (7-D-4 in 3E; 3-B-3(+) in 3F) und Keratansulfat (5-D-4 in 3G).
  • 4: Northern Hybridisierung von RNA aus mesenchymalen Vorläuferzellen des Kaninchens mit Matrixmolekül-Sonden. Zelluläre Gesamt-RNA aus von Kaninchen-Knochenmark stammenden mesenchymalen Vorläuferzellen (Spuren 1, 3) und dermalen Fibroblasten des Kaninchens (Spuren 2, 4) wurden hybridisiert mit einer humanen Collagen α1(I)-Sonde (Spuren 1, 2) und einer Kaninchen-spezifischen Sonde für Collagen α2(I) (Spuren 3, 4). Es waren keine mRNA-Banden detektierbar, wenn dieselben Blots einer erneuten Sondenreaktion mit Sonden für humanes α1(II) und Kaninchen-spezifisches Aggrecan- und Verbindungsprotein unterzogen wurden.
  • Die Erfindung wird nun in größerem Detail im Hinblick auf die zahlreichen Ausführungsformen und Beispiele zu ihrer Unterstützung beschrieben.
  • Diese Erfindung besitzt zahlreiche Verwendungen und Vorteile. Ein derartiger Vorteil liegt in der Fähigkeit, die MSC-Differenzierung vor der Rück-Implantierung in autologe Wirte zu steuern und zu beschleunigen. Beispielsweise werden MSCs, die in vitro dazu veranlasst werden, chondrogene Zellen zu werden, an einer Implantationsstelle schneller und gleichförmiger Knorpelmatrix synthetisieren als MSCs, die zunächst in die Entwicklungslinie eingegliedert werden müssen und dann die Schlüsselschritte der Differenzierung durchlaufen. Eine derartige ex vivo-Behandlung stellt auch eine gleichförmige und kontrollierte Applikation bioaktiver Faktoren bei gereinigten MSCs sicher, was zu einem gleichförmigen Eintritt in die Abstammungslinie und zu einer gleichförmigen Differenzierung führt. Die in vivo-Verfügbarkeit endogener bioaktiver Faktoren kann nicht so problemlos sichergestellt oder kontrolliert werden. Ein Vorbehandlungsschritt wie der hier eingeschlossene vermeidet dies. Zusätzlich werden durch die Vorbehandlung der MSCs vor der Implantation potentiell schädliche Nebenwirkungen vermieden, die mit der systemischen oder lokalen Applikation exogener bioaktiver Faktoren verbunden sind. Eine weitere Verwendung dieser Technik liegt in der Fähigkeit, Geweberegeneration auf Basis desjenigen Differenzierungsstadiums zu steuern, in dem sich die Zellen zum Zeitpunkt der Implantation befinden. Dies bedeutet im Hinblick auf den Knorpel, dass das Stadium der Zellen bei der Implantation den letztendlich gebildeten Gewebetyp kontrollieren kann.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „chondro-induzierendes Mittel" oder „chondro-induzierender Faktor" auf jedwede natürliche oder synthetische, organische oder anorganische, chemische oder biochemische Verbindung oder Kombination oder Gemisch von solchen Verbindungen, oder auf jedwede mechanische oder andere physikalische Vorrichtung, Behälter, Einfluss oder Kraft, die auf humane mesenchymale Stammzellen angewendet werden kann, die sich in einem dreidimensionalen Format befinden, um so deren in vitro erfolgende, chondrogene Induktion oder die Produktion von Chondrozyten zu bewirken. Das chondro-induzierende Mittel wird vorzugsweise, einzeln oder in Kombination, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (i) einem Glucokortikoid, wie etwa Dexamethason, (ii) einem Mitglied der transformierenden Wachstumsfaktor-β-Superfamilie, wie etwa einem Bone morphogenetic Protein (bevorzugt BMP-2 oder BMP-4), TGF-β1, Inhibin A oder chondrogenem stimulierenden Aktivitäts-Faktor (CSA); (iii) einem Bestandteil der collagenösen extrazellulären Matrix, wie etwa Collagen I (insbesondere in Form eines Gels); und (iv) einem Vitamin A-Analogon, wie etwa Retinsäure.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „chemisch-definiertes Medium" auf ein Erhaltungs-, Wachstums- oder Kulturmedium, in dem die Zusammensetzung der Erfindung die in vitro-Chondrogenese durchlaufen kann, insbesondere in Übereinstimmung mit den Verfahren der Erfindung, und beinhaltet als Medium ein minimal-essentielles Medium, Ascorbat oder ein Analoges hiervon, eine Eisenquelle und Insulin oder einen insulinartigen Wachstumsfaktor.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „minimal-essentielles Medium" auf jedwede serumfreie Tierzellkultur-Präparation oder jedwedes Medium bekannter Zusammensetzung, das die Lebensfähigkeit humaner mesenchymaler Stammzellen in vitro unterstützt. Beispiele sind sämtliche Medien, die auf Eagle's Medium basieren, d.h. Dulbeccos Modifiziertes Eagle's Medium (DMEM), Iscoves Modifiziertes Eagle's Medium, alpha Modifiziertes Eagle's Medium, und außerdem McCoy's 5A und BGJb (Fitton-Jackson-Modifikation).
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Eisenquelle" auf jede Art Stoff, der die reduzierte Eisen(III)-Form von Eisen in das Medium abgibt, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Transferrin, FeSO4 oder Ferritin.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Insulin" auf sämtliche der verschiedenen bekannten Insuline. Insuline werden gemäß ihrer Wirkungsschnelligkeit, Wirkungsdauer und der Stärke ihrer Wirkung nach der subkutanen Verabreichung in drei Kategorien unterteilt, d.h., wie oben erwähnt, schnell, intermediär oder lange wirkend. Kristallines reguläres Insulin wird durch Präzipitation in Gegenwart von Zinkchlorid gewonnen, und es sind modifizierte Formen entwickelt worden, um das Aktivitätsmuster zu verändern. Protamin-Zink-Insulin (PZI) ist das Ergebnis der Reaktion von Insulin und Zink mit dem basischen Protein Protamin, um einen Proteinkomplex zu bilden, der sich langsamer löst und langsamer absorbiert wird als das kristalline reguläre Insulin, jedoch hochgradig verlässlich für eine Absorption bei einer gleich bleibenden Rate ist. Isophan ist ein modifiziertes, kristallines Protamin-Zink-Insulin, dessen Wirkungen einem Gemisch vergleichbar sind, das hauptsächlich aus regulärem Insulin mit einem geringeren Anteil an Protamin-Zink-Insulin besteht. Die verlängerten und die direkten Insulin-Zink-Suspensionen sind ebenfalls für die Verwendung bei der Erfindung vorgesehen. Das Insulin kann z.B. vom Menschen, Rind, Schaf oder aus einer anderen tierischen Quelle stammen, oder es kann ein rekombinantes Produkt sein.
  • Humanes Insulin ist nun als Ergebnis seiner Produktion durch rekombinante DNA-Techniken in breitem Umfang verfügbar; theoretisch sollte es geringfügig weniger immunogen sein als gereinigtes Schweine-Insulin, welches wiederum weniger immunogen sein sollte als Rinder-Insulin. Rinder-Insulin unterscheidet sich von humanem Insulin durch drei Aminosäurereste, wogegen sich Schweine-Insulin von humanem Insulin nur durch eine Aminosäure am Carboxy-Terminus der β-Kette unterscheidet. Bei hoher Reinheit besitzen jedoch alle drei Insuline eine relativ geringe, jedoch messbare Befähigung, die Immunantwort zu stimulieren.
  • Kurz oder schnell wirkende Insuline sind einfache Lösungen von kristallinem regulärem Zink-Insulin (Insulininjektion), gelöst in einem Puffer mit neutralem pH. Diese besitzen den schnellsten Wirkungseintritt, jedoch die kürzeste Wirkungsdauer, d.h. die Glukosespiegel erreichen innerhalb von 20–30 Minuten einen Tiefpunkt und kehren in etwa 2–3 Stunden zum Basiswert zurück.
  • Intermediär wirkende Insuline sind so formuliert, dass sie bei subkutaner Verabreichung gradueller in Lösung gehen; ihre Wirkungsdauern sind daher länger. Die beiden am häufigsten verwendeten Zubereitungen sind neutrales Protamin Hagedorn (NPH) Insulin (Isophan Insulinsuspension) und Lente-Insulin (Insulin-Zink-Suspension). NPH-Insulin ist eine Suspension von Insulin in einem Komplex mit Zink und Protamin in einem Phosphatpuffer. Lente-Insulin ist ein Gemisch von kristallisierten (Ultralente) und amorphen (Semilente) Insulinen in einem Acetatpuffer, der die Löslichkeit von Insulin minimiert. Diese Zubereitungen besitzen ähnliche pharmakokinetische Profile.
  • Ultralente-Insulin (zeitlich verlängerte Insulin-Zink-Suspension) und die Protamin-Zink-Insulin-Suspension sind lange wirkende Insuline; sie besitzen jeweils einen sehr langsamen Wirkungseintritt und eine verlängerte („flache") Wirkungsspitze. Diese Insuline werden verabreicht, um einen niedrige basale Konzentration an Insulin über den Tag bereitzustellen.
  • Wie hier verwendet, ist es beabsichtigt, dass der Begriff „Insulin" auch Insulin-Analoga einschließt. Die kürzliche Entwicklung von Insulin mit veränderten Absorptionsraten hat Interesse ausgelöst. Insulin, bei dem Aspartat und Glutamat an den Positionen B9 bzw. B27 substituiert sind, kristallisiert schwach und ist als „monomeres Insulin" bezeichnet worden. Dieses Insulin wird schneller aus subkutanen Depots absorbiert und kann somit hilfreich sein, die Erfordernisse nach einer Mahlzeit zu erfüllen. Im Gegensatz dazu zeigen andere Insulin-Analoga die Neigung, an der Injektionsstelle zu kristallisieren und werden langsamer absorbiert. Es sind Insuline mit erhöhter Wirkungsstärke durch einen Austausch von Aspartat anstelle von Histidin an Position B10 und durch Modifikation der carboxy-terminalen Reste der B-Kette erzeugt worden.
  • Isolierung, Reinigung und Kulturvermehrung humaner mesenchymaler Stammzellen
  • Die humanen mesenchymalen Stammzellen, die gemäß der vorliegenden Beschreibung isoliert und gereinigt werden, können z.B. aus dem Knochenmark, dem Blut, der Dermis oder dem Periosteum erhalten werden. Bei der Gewinnung aus Knochenmark kann dies Knochenmark aus einer Anzahl verschiedener Quellen sein, einschließlich Pfropfen poriger Knochenstücke aus dem Oberschenkelkopf, erhalten von Patienten mit degenerativer Gelenkerkrankung bei ersetzenden Operationen am Knie oder der Hüfte, oder abgesogenes Knochenmark von normalen Spendern oder Krebspatienten, bei denen Knochenmark für zukünftige Knochenmarkstransplantationen gewonnen wird. Das gewonnene Knochenmark wird dann für die Zellkultur vorbereitet. Der Prozess der Isolierung beinhaltet die Verwendung eines speziell hergestellten Mediums, das Mittel beinhaltet, die nicht nur das Wachstum mesenchymaler Stammzellen ohne Differenzierung erlauben, sondern auch die direkte Anheftung nur der mesenchymalen Stammzellen an die Kunststoff- oder Glasoberfläche des Kulturgefäßes. Durch die Erstellung eines Mediums, das die selektive Anheftung der gewünschten mesenchymalen Stammzellen, die in den mesenchymalen Gewebeproben in ausgesprochen winzigen Mengen vorhanden waren, erlaubt, wurde es dann möglich, die mesenchymalen Stammzellen von den anderen Zellen (d.h. roten und weißen Blutzellen, anderen, differenzierten mesenchymalen Zellen, etc.), die in dem mesenchymalen Ursprungsgewebe vorhanden waren, zu trennen.
  • Knochenmark ist das weiche Gewebe, das die Markhöhlen der langen Knochen, einige Haversian-Kanäle, sowie die Räume zwischen den Balken des porigen bzw. spongiösen Knochens einnimmt. Knochenmark kommt in zwei Typen vor: rotes, das sich in der frühen Lebensphase in allen Knochen und im adulten Zustand an begrenzten Stellen (d.h. im spongiösen Knochen) befindet und die Aufgabe hat, Blutzellen (Hämatopoese) und Hämoglobin (den roten Blutfarbstoff) zu bilden; und gelbes, das großenteils aus Fettzellen (daher die gelbe Farbe) und Bindegewebe besteht.
  • Insgesamt ist Knochenmark ein komplexes Gewebe, das sich aus hämatopoetischen Zellen, einschließlich der hämatopoetischen Stammzellen und roten und weißen Blutzellen und deren Vorläufern, sowie einer Gruppe von Zellen, einschließlich mesenchymaler Stammzellen, Fibroblasten, Retikulozyten, Adipozyten und endothelialer Zellen, die zum Bindegewebenetzwerk, bezeichnet als „Stroma", beitragen, zusammensetzt. Zellen aus dem Stroma regulieren die Differenzierung hämatopoetischer Zellen mittels einer direkten Wechselwirkung über Zelloberflächenproteine und die Sekretion von Wachstumsfaktoren, und sie sind an der Begründung und Unterstützung der Knochenstruktur beteiligt. Studien unter Verwendung von Tiermodellen haben nahegelegt, dass Knochenmark „prä-stromale" Zellen enthält, die die Befähigung haben, sich zu Knorpel-, Knochen- und anderen Bindegewebszellen zu differenzieren (Beresford, J. N.: Osteogenic Stem Cells and the Stromal System of Bone and Marrow, Clin. Orthop., 240: 270; 1989). Kürzlich erhaltene Ergebnisse zeigen, dass diese Zellen, bezeichnet als plunipotente stromale Stammzellen oder mesenchymale Stammzellen, bei Aktivierung und in Abhängigkeit von dem Einfluss einer Anzahl bioaktiver Faktoren die Fähigkeit besitzen, mehrere verschiedene Typen von Zelllinien hervorzubringen (d.h. Osteozyten, Chondrozyten, Adipozyten, etc.). Jedoch sind die mesenchymalen Stammzellen in dem Gewebe in äußerst niedrigen Mengen vorhanden und liegen zusammen mit einer großen Vielfalt an anderen Zellen (d.h. Erythrozyten, Blutplättchen, Neutrophile, Lymphozyten, Monozyten, Eosinophile, Basophile, Adipozyten, etc.) vor.
  • Folglich ist ein Verfahren entwickelt worden, um die humanen mesenchymalen Stammzellen vor der Differenzierung aus Gewebe zu isolieren und zu reinigen und sie dann in Kultur zu vermehren, um ein wertvolles Werkzeug für die Muskel/Skelett-bezogene Therapie herzustellen. Die Zielsetzung einer solchen Behandlung besteht darin, die Anzahl an mesenchymalen Stammzellen stark zu erhöhen und diese Zellen dazu zu verwenden, die normale Reparaturfähigkeit des Körpers neu auszurichten und/oder zu verstärken. Die mesenchymalen Stammzellen werden auf eine große Anzahl vermehrt und bei Regionen mit Bindegewebsschäden appliziert, um das in vivo-Wachstum für die Regeneration und/oder Reparatur zu verstärken oder zu stimulieren, um die Adhäsion des Implantats an verschiedenen prothetischen Vorrichtungen durch nachfolgende Aktivierung und Differenzierung zu verbessern, oder, um die Produktion hämatopoetischer Zellen zu verstärken, etc.
  • Es sind verschiedene Medien hergestellt worden, die besonders gut für die gewünschte selektive Anheftung geeignet sind und hier als „Vollmedien" bezeichnet werden, wenn sie, wie unten beschrieben, mit Serum supplementiert werden. Ein solches Medium ist eine verstärkte Version von Dulbeccos Modifiziertem Eagle's Medium mit niedriger Glukosekonzentration (DMEM-LG), das wohlbekannt und problemlos kommerziell erhältlich ist.
  • Die kommerzielle Formulierung wird supplementiert mit 3700 mg/l an Natriumbicarbonat und 10 ml/l an 100 × Antibiotikum/Antimykotikum, enthaltend 10.000 Einheiten Penizillin (Base), 10.000 μg an Streptomycin (Base) und 25 μg an Amphotericin B/ml, wobei hierfür Penicillin G (Natriumsalz), Streptomycin-Sulfat und Amphotericin B als FUNGIZONE® in 0,85% Saline verwendet werden.
  • Das oben beschriebene Medium wird hergestellt und in 90 ml bis 100 ml- oder in 450 ml bis 500 ml-Flaschen bei 4°C bis zur Benutzung gelagert. Zur Verwendung werden 10 ml oder 50 ml fetales Rinderserum (aus ausgewählten Ansätzen) zu den Flaschen mit Medium hinzugegeben, um ein Endvolumen mit 10% Serum zu ergeben. Das Medium wird vor der Verwendung auf 37°C erwärmt.
  • In diesem Zusammenhang wurde auch herausgefunden, dass BGJb-Medium (Gibco, Grand Island, NY) zusammen mit getesteten und ausgewählten Ansätzen mit 10% fetalem Rinderserum (J. R. Scientific, Woodland, CA oder andere Anbieter) zur Anwendung bei der Erfindung gut geeignet war. Dieses Medium, das auch ein „Vollmedium" darstellt, enthält Faktoren, die ebenfalls das Wachstum der mesenchymalen Stammzellen ohne Differenzierung stimulieren und die selektive Anheftung ausschließlich der mesenchymalen Stammzellen an die Kunststoffoberflächen von Petrischalen über spezifische Proteinbindungsstellen, etc., erlauben.
  • Zusätzlich wurde auch herausgefunden, dass das Medium F-12 Nährstoffgemisch (Ham)(Gibco, Grand Island, NY) die gewünschten Eigenschaften für die selektive Abtrennung mesenchymaler Stammzellen aufweist.
  • Wie oben angezeigt, kann das Vollmedium bei einer Anzahl verschiedener Isolierungsprozesse in Abhängigkeit von dem spezifischen Typ des anfänglichen Gewinnungsprozesses, der verwendet wurde, um das geerntete Knochenmark auf die Zellkultur-Trennung vorzubereiten, eingesetzt werden. In diesem Zusammenhang wurde, wenn Mark aus Pfropfen poriger Knochen verwendet wurde, das Mark zu dem Vollmedium hinzu gegeben und gevortext, um eine Dispersion zu bilden, die dann zentrifugiert wurde, um die Knochenmarkzellen von Knochenstücken, etc, abzutrennen. Die Knochenmarkzellen (bestehend hauptsächlich aus roten und weißen Blutzellen und einer sehr geringen Menge an mesenchymalen Stammzellen, etc.) wurden dann in einzelne Zellen dissoziiert, indem man das Vollmedium, das die Markzellen enthielt, nacheinander durch Spritzen leitete, die mit einer Serie aus Nadeln der Kaliber 16, 18 und 20 versehen waren. Man nimmt an, dass der Vorteil, der durch die Verwendung des mechanischen Trennungsprozesses erhalten wird, gegenüber jedem enzymatischen Trennungsprozess, dadurch begründet ist, dass der mechanische Prozess nur eine geringe zelluläre Veränderung hervorruft, während ein enzymatischer Prozess zellulären Schaden hervorrufen kann, insbesondere an den Protein-Bindungsstellen, die für die Kulturanheftung und selektive Trennung benötigt werden, und/oder an den Proteinstellen, die für die Produktion monoklonaler Antikörper, die für die mesenchymalen Stammzellen spezifisch sind, benötigt werden. Die Einzelzellsuspension (die aus etwa 50–100 × 106 kernhaltigen Zellen bestand) wurde dann nachfolgend zum Zwecke der selektiven Trennung und/oder zur Isolierung der mesenchymalen Stammzellen von den übrigen Zellen in der Suspension in 100 mm-Schalen ausplattiert.
  • Wenn abgesogenes Knochenmark als Quelle der humanen mesenchymalen Stammzellen verwendet wurde, so wurden die Mark-Stammzellen (die wenig oder keine Knochenabsplitterungen enthielten, jedoch eine größere Menge Blut) zu dem Vollmedium hinzu gegeben und mit Percoll (Sigma, St. Louis, MO)-Gradienten fraktioniert. Die Percoll-Gradienten trennten einen hohen Prozentanteil der roten Blutzellen und der einkernigen hämatopoetischen Zellen von der Blutplättchen-Fraktion niedriger Dichte ab, die die aus dem Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen enthielt. Die diesbezügliche Blutplättchen-Fraktion, die etwa 30–50 × 106 Zellen enthielt, setzte sich aus einer nicht bestimmten Menge von Blutplättchen, 30–50 × 106 kernhaltigen Zellen und – in Abhängigkeit vom Alter des Knochenmarkspenders – nur etwa 50–500 mesenchymalen Stammzellen zusammen. Die Blutplättchen-Fraktion niedriger Dichte wurde dann für die auf Zelladhäsion basierende selektive Abtrennung in der Petrischale ausplattiert.
  • In diesem Zusammenhang wurden die Knochenmarkzellen, die entweder von dem porigen Knochen oder aus der aus dem Darmbein abgesogenen Fraktion (d.h. den Primärkulturen) erhalten worden waren, in Vollmedium herangezogen, und es wurde gemäß den für Beispiel 1 unten dargestellten Bedingungen für ein bis sieben Tage eine Anheftung an die Oberfläche der Petrischalen ermöglicht. Da nach dem dritten Tag eine minimale Zellanheftung beobachtet wurde, wurden drei Tage als die Standard-Zeitlänge ausgewählt, bei der die nicht anhaftenden Zellen aus den Kulturen entfernt wurden, indem das ursprüngliche Vollmedium durch frisches Vollmedium ersetzt wurde. Es wurden dann alle vier Tage aufeinander folgende Mediumaustausche durchgeführt, bis die Kulturschalen konfluent wurden, was normalerweise 14–21 Tage erforderte. Dies stellte einen 103–104-fachen Anstieg der Anzahl undifferenzierter humaner mesenchymaler Stammzellen dar.
  • Die Zellen wurden dann unter Verwendung eines Ablösungsmittels, wie etwa Trypsin mit EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) (0,25% Trypsin, 1 mM EDTA (1 ×); Gibco, Grand Island, NY), von den Kulturschalen gelöst. Das Ablösungsmittel wurde dann inaktiviert, und die abgelösten, kultivierten undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen wurden für die nachfolgende Verwendung mit Vollmedium gewaschen.
  • Isolierung von nicht-kultivierten, humanen mesenchymalen Stammzellen
  • Es ist auch möglich, eine isolierte, nicht-kultivierte inhomogene humane mesenchymale Stammzellpräparation für die Zusammensetzung und die Verfahren der Erfindung zu verwenden. MSCs können als nicht-kultivierte, inhomogene Präparationen, z.B. durch Dichtegradienten-Fraktionierung, aus Geweben wie Knochenmark, Blut (einschließlich peripherem Blut), dem Periosteum und der Dermis, sowie aus anderen Geweben mit mesodermalen Ursprüngen isoliert werden. Diesbezüglich ist herausgefunden worden, dass diese mesenchymalen Stammzellen, obwohl sie normaler Weise, beispielsweise im Knochenmark, in sehr geringen Mengen vorkommen, und mengenmäßig stark mit dem Alter abnehmen (d.h. von etwa 1/10.000 Zellen bei einem relativ jungen Patienten bis zu lediglich 1/2.000.000 bei einem älteren Patienten), als humane mesenchymale Stammzellpräparationen aus Gewebe, insbesondere aus Knochenmark, isoliert werden können, um so weitgehend frei von anderen Zelltypen des Knochenmarks zu sein. Dies ist so zu verstehen, dass die isolierte Fraktionierungs-Präparation Zellen umfassen wird, von denen wenigstens etwa 90% und bevorzugt wenigstens etwa 95% humane mesenchymale Stammzellen sind.
  • Knochenmark aus porigen Knochenstücken aus dem Oberschenkelkopf wird von Patienten mit degenerativer Gelenkerkrankung bei Gelenk-ersetzenden Operationen am Knie oder an der Hüfte erhalten. Zusätzlich wird Knochenmark auch als Absaugung aus dem Darmbein bei normalen Spendern oder Krebspatienten erhalten, bei denen Knochenmark für zukünftige Knochenmarkstransplantationen gewonnen wird. Alle diese Krebspatienten haben Maligne Erkrankungen, die mit den Stromazellen nicht in Zusammenhang stehen, und deren Stromazellen exprimieren den normalen Karyotyp.
  • Das Knochenmark wird an verschiedenen Stellen aus dem Brustbein, der Rippe oder dem Darmbeinkamm unter sterilen Arbeitsbedingungen abgesogen. Das Absaugen erfolgt langsam, um eine Gerinnselbildung in der Spritze zu vermeiden. Mehrfache Absaugstellen am Knochen mit einer oder zwei Stellen der Hautdurchstoßung stellen eine hohe Anzahl kernhaltiger Zellen, die mit einem relativ geringen Volumen an verdünnendem peripherem Blut verunreinigt sind, bereit. Die Spritze wird mit einer konventionellen Sternal-Absaugnadel, einer Kaliber 12 Trokar-Nadel zum Absaugen von Knochenmark oder mit einer Trepanationsnadel zur Verwendung für die Knochenmarkgewinnung ausgestattet. Es werden 25 ml an Knochenmark in heparinisierten Spritzen mit 91000 Units/Liter an steriler Saline geerntet.
  • Das humane Knochenmark wird dann in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, um ein Zellpellet zu erhalten. Fett und Plasma werden durch Absaugen aus dem Zentrifugenröhrchen entfernt. Das Zellpellet wird in einer sterilen Lösung, enthaltend 20 mM Tris-Base und 0,7% Ammoniumchlorid, resuspendiert. Der pH wird auf 7,2 eingestellt und die Suspension dann bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, um ein Zellpellet zu erhalten. Die Tris-NH4Cl-Lösung wird von dem Zellpellet abgesogen und das Pellet in 10 ml DMEM-Medium resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wird vorsichtig auf einem 50 ml-Röhrchen mit 35 ml an 70% PercollTM aufgeschichtet. Das Röhrchen wird dann für 15 Minuten bei 460 × g zentrifugiert. Die oberen 25% des Gradienten bzw. 12,5 ml des Percoll-Gradienten, enthaltend mesenchymale Stammzellen, Blutplättchen und andere Zellen, werden mit einer Pipette geerntet. Diese Fraktion wird in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt, zu dem 25 ml an Medium hinzu gegeben worden sind. Das Röhrchen wird mehrere Male umgedreht, um die Zellen zu suspendieren, gefolgt von einer erneuten Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, um ein Zellpellet zu erhalten. Dieser Vorgang wird zweimal mit frischem Medium wiederholt.
  • Die humane Knochenmarkprobe wird dann konzentriert, um Plasma zu entfernen, und von roten Blutzellen gereinigt, was entweder gemäß obiger Beschreibung durch NH4Cl-Behandlung oder mittels Durchleiten der Proben durch einen LeukosorbTM-Filter erfolgt, der in der Filterkartusche einer Spritze enthalten ist, wobei Fett, rote Blutzellen und Plasma entfernt werden. Die von dem Filter zurückgehaltene Zellfraktion wird ausgehend von dem Filter unter Verwendung eines Natriumcitrat enthaltenden Puffers verdünnt. Die im Hinblick auf MSCs angereicherten Zellen, die aus dem Filter eluieren, werden dann durch die Passage über eine Hydroxyapatit-Säule, die bevorzugt MSCs bindet, weiter angereichert. Das Spritzenfilter-Eluat, das das von roten Blutzellen teilgereinigte Knochenmark enthält, wird durch eine Spritze geleitet, die mit Hydroxyapatit gefüllt ist. Das in diesem Beispiel verwendete Hydroxyapatit wird von der Interpore Corp. (IP200) bezogen. Es werden poröse Hydroxyapatit-Körnchen, die eine minimale Porengröße von 200 Mikrometern und eine maximale Porengröße von bis zu 500 Mikrometern besitzen, verwendet. Die Zellen werden in einem sterilen Transferschritt in die Spritze geladen, die das Hydroxyapatit enthält. Man lässt die Zellen für 15 Minuten binden und lässt den noch in den Zellen vorhandenen Puffer durchlaufen. Die Spritze wird dann einmal mit 15 ml Medium (DMEM) gewaschen. Die Basis der Spritze, die mit einem Gewinde versehen ist, wird abgeschraubt, und das Implantatmaterial wird mittels des Kolbens für eine weitere Bearbeitung oder für die direkte intraoperative Applikation an einer Empfängerstelle aus der Spritze heraus gedrückt.
  • Es wird dann wie folgt eine Trennung mittels monoklonaler Antikörper durchgeführt. Dynabeads M-450 (Dynal (r) Inc. Lake Success, NY) werden mit monoklonalen anti-MSC-Antikörpern gekoppelt, die die ATCC-Zugangsnummern HB 10743, HB 10744 bzw. HB 10745 besitzen, indem die Antikörper mit mit sekundärem Antikörper beschichteten Dynabeads (2,0 μg anti-MSC-Antikörper/mg Dynabead) für 30 Minuten bei 4°C in PBS inkubiert werden. Es wird eine Bead-Lösung verwendet, die 1 × 107 Dynabeads/ml enthält. Der Antikörper wird inkubiert. Die Dynabeads werden gesammelt, indem man die Lösung, die Beads und Antikörper enthält, in einen Magnetpartikel-Konzentrator (Dynal MPC) einsetzt. Der Überstand wird entfernt, während die Dynabeads mittels des Magneten an der Wand des Teströhrchens gehalten werden. Die Dynabeads werden von dem freien Antikörper gereinigt, indem 5mal mit PBS gewaschen wird. Nach dem letzten Waschschritt werden die Dynabeads gesammelt und der Überstand wird entfernt. Zu den 80 ml an Dynabeads werden 35 ml heparinisiertes Knochenmark hinzu gegeben. Die Zellen werden für 15 Minuten unter Schütteln mit den Dynabeads inkubiert. Die Dynabeads mit daran anheftenden MSCs werden dann unter Verwendung des Dynal MPC gesammelt. Der Überstand wird entfernt, und die magnetischen Partikel intensiv mit PBS gewaschen. Es werden etwa 200 × 106 Zellen auf den Dynabeads gesammelt. Die Zellen werden durch Inkubieren der Beads in 50 ml einer Lösung mit 1% EDTA von den Beads abgelöst. Die EDTA-Lösung wird durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit von den Zellen entfernt, was in einem Zellpellet resultiert, das für die Verwendung bei der Erfindung geeignet ist.
  • Beispiel 1
  • In vitro-Chondrogenese unter Verwendung von Dexamethason
  • In unseren vorab durchgeführten Untersuchungen haben wir herausgefunden, dass aus Kaninchen-Knochenmark stammende mesenchymale Vorläuferzellen, die für 14 Tage kultiviert und dann entweder in Keramikwürfel oder Collagenschwämme eingesät und subkutan in Nacktmäuse implantiert wurden, innerhalb von 3 Wochen Knochen und Knorpel bilden (1).
  • Die vorliegende Erfindung geht davon aus, dass die Erzeugung einer Knorpelvorläufer-Verdichtung in vitro die Chondrogenese bei mesenchymalen Vorläuferzellen, die aus postnatalem Knochenmark stammen, unterstützt, wobei derartige Populationen entweder Stammzellen oder Vorläuferzellen für Chondrozyten enthalten. Dies wurde umgesetzt unter Verwendung des Pellet-Kultursystems, das für die Verwendung bei isolierten Wachstumsplattenzellen entwickelt worden war (Kato et al., PNAS, 85: 9552–9556, 1988; Ballock und Reddi, J Cell Biol, 126: 1311–1318, 1994), und das außerdem dazu verwendet worden war, um die Expression des Knorpelphänotyps von in Kultur eingesetzten Chondrozyten aufrecht zu erhalten (Solursh, J Cell Biochem, 45: 258–260, 1991).
  • Es wurden sowohl aus Kaninchen-Knochenmark als auch aus humanem Knochenmark stammende Zellen verwendet. Aus Knochenmark stammende mesenchymale Vorläuferzellen wurden durch Absaugen in eine Spritze, enthaltend 3.000 U Heparin, aus dem Schienbein oder dem Darmbeinkamm von weißen Neuseeland-Kaninchen geerntet. Diese Zellen wurden mit 20 Millionen/100 mm-Schale in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum ausplattiert und für 14 Tage bei 37°C unter 5% CO2 herangezogen, wobei das Medium alle vier Tage gewechselt wurde. Es wurde zunächst ein Serumtest durchgeführt, um Serumansätze zu identifizieren, die das Wachstum dieser Zellen unterstützen und das Meiste an Knochen und Knorpel bei den Zellen der ersten Passage bei dem oben dargestellten in vivo-Test mit dem Keramikwürfel hervorzubringen. Nachdem sich Kolonien anhaftender Zellen auf den Kulturschalen gebildet hatten (etwa nach 10–14 Tagen) wurden die Zellen durch Trypsin-Behandlung von den Schalen abgelöst und gezählt. Aliquots von 200.000 Zellen wurden bei 500 × g für 10 Minuten in sterilen, konischen 15 ml Polypropylen-Röhrchen in DMEM mit 10% Serum, 50 ng/ml Ascorbat-2-Phosphat +/–10–7 M Dexamethason (DEX) zentrifugiert, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C in einem 5% CO2-Inkubator für bis zu 3 Wochen. Nach 24 Stunden hatte ein gewisser Anteil der Zellen Pellets in den Röhrchen gebildet, wobei einige Zellen in einem Monolayer an den Seiten des Röhrchens verblieben. Nach 3 Wochen waren viele der Pellets auseinander gefallen. Von den verbliebenen Pellets enthielt keines Zellen mit dem Aussehen von Chondrozyten, und es wurde keine Typ II-Collagenfärbung gefunden. Als Alternative zu Serum wurde ein definierter Medien-Zusatz (ITS + PremixTM, Collaborative Biomedical Products) getestet. Dieser Zusatz war zuvor für die Pellet-Kultur von Chondrozyten der Wachstumsplatte verwendet worden (Ballock und Reddi, J Cell Biol, 126: 1311–1318, 1994). Dieser Zusatz besteht aus DMEM mit Insulin (6,25 μg/ml), Transferrin (6,25 μg/ml), seleniger Säure (6,25 μg/ml) Linolsäure (1,25 μg/ml) und Rinderserum-Albumin (5,35 μg/ml) (angegeben als Endkonzentrationen). Hierzu wurden Pyruvat (1 mM), Ascorbat-2-Phosphat (50 μg/ml) mit oder ohne 10–7 M Dexamethason (DEX) hinzugegeben. Bei einigen Experimenten wurde das 10% FBS enthaltende Medium nicht ersetzt. Die abzentrifugierten Zellen wurden bei 37°C unter 5% CO2 inkubiert. Humane Markzellen wurden von gesunden Spendern durch Absaugen am Darmbeinkamm erhalten. Die Kulturbedingungen entsprachen denjenigen, die für die Kaninchenzellen verwendet wurden. Innerhalb einer 24-stündigen Inkubation bildeten die Zellen ein Pellet. Ein Mediumwechsel erfolgte alle 2 Tage. Wenn Pellets an Zeitpunkten bis zu 21 Tagen geerntet wurden, so wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität jedes Pellets durch eine Inkubation mit p-Nitrophenylphosphat und die Ermittlung der Extinktion bei 405 nm bestimmt. Die in einem typischen Experiment für die Pellets bei Inkubation +/–DEX erhaltenen Extinktionswerte stiegen 3- bis 5-fach während der ersten 14 Tage der Kultur und blieben bis Tag 21 auf dem erhöhten Niveau. Für histologische und immunhistochemische Analysen wurden die Pellets in OCT eingefroren, und es wurden 5 μm-Schnitte hergestellt. Es erfolgten eine Toluidinblau-Färbung und Immunhistochemie, letztgenannte mit Antikörpern gegen Bestandteile der extrazellulären Matrix (2 und 3), einschließlich: anti-Collagen Typ I, II und X-Antikörper und anti-Glycosaminoglycan-Antikörper 3B-3, 7-D-4 (Chondroitinsulfat) und 5-D-4 (Keratansulfat). Die Reaktivität wurde entweder mittels FITC-gekoppelten sekundären Antikörpern und Fluoreszenzmikroskopie oder mittels mit alkalischer Phosphatase gekoppelten Antikörpern und Substrat detektiert. Die Pellets wurden auch in 4 M Guanidin, 20 mM Natriumacetat mit Protease-Inhibitoren extrahiert und nach der Auftrennung durch SDS-PAGE und Western Blot einer Immunlokalisierung unterzogen.
  • Um Tag 7 der Kultur konnte eine gewisse metachromatische Färbung von Teilen der Pellets aus +DEX definiertem Medium mit Toluidinblau beobachtet werden. Um Tag 14 zeigten die +DEX-Pellets offenkundige metachromatische Färbung um eine Region im Inneren lokalisierter Zellen, die die Erscheinung von hypertrophen Chondrozyten besaßen. Die Zellen an der Peripherie der Pellets blieben flach und zeigten keine Metachromasie. Um Tag 21 ähnelten die +DEX-Pellets einem Ball aus hypertrophen Chondrozyten. Im Gegensatz dazu schrumpften alle Pellets aus –DEX-definiertem Medium in ihrer Größe und fielen in vielen Fällen nach etwa 21 Tagen in Kultur auseinander. In keinem der –DEX-Pellets waren offenkundig hypertrophe Zellen erkennbar.
  • Die Immunhistochemie unter Verwendung von Antikörper gegen Typ II-Collagen war bei den mittleren +DEX-definierten Pellets bei einigen Proben bereits nach 7 Tagen positiv (3A). Um Tag 14 färbte sich die Matrix der Region der hypertrophartigen Zellen positiv für Typ II-Collagen (3B). Bei einigen Versuchen färbte sich das gesamte Pellet positiv für Typ II-Collagen, wenn es an Tag 21 analysiert wurde (3C). In anderen Fällen war eine dünne äußere Region nach wie vor negativ für Typ II-Collagen. Eine positive Färbung für Typ X-Collagen war ebenfalls um Tag 14 zu erkennen (3D). Die Matrix der hypertrophen Zellen färbte sich auch positiv für Chondroitinsulfat (7-D-4 in 3E; 3-B-3(+) in 3F) und Keratansulfat (5-D-4 in 3G), mit einigen Unterschieden bei der Verteilung der Färbung. Keines der Pellets, das in Abwesenheit von DEX herangewachsen war, zeigte eine positive Färbung für Typ II-Collagen. Die Immunanfärbung der durch SDS-PAGE aufgetrennten, durch Western Blot übertragenen Pellet-Extrakte mit anti-Typ II-Antikörper ergab eine positive Bande mit der Migration der α(II)-Ketten (4). In nachfolgenden Experimenten haben wir herausgefunden, dass dieses gleiche definierte Medium, +DEX, weder bei einem Monolayer noch in Mikromasse-Kulturen Chondrogenese erzeugte. Diese Beobachtungen sind wichtig und zeigen an, dass frühe Zell-Zell-Interaktionen für die Chondrogenese benötigt werden. Somit waren wir über eine Kombination der Erzeugung einer in vitro stattfindenden Zellverdichtung und der Zugabe der geeigneten permissiven Faktoren in der Lage, Chondrogenese bei Zellen zu bewirken, die aus einer Quelle von postnatalem Säuger-Knochenmark stammen.
  • Die obigen Ausführungen zeigen ein Kultursystem, bei dem aus Kaninchen-Knochenmark und humanem Knochenmark stammende mesenchymale Vorläuferzellen sich in hypertrophe Chondrozyten differenzieren. Die Abfolge der Ereignisse ähnelt derjenigen, der Chondrogenese bei der Ausbildung der embryonalen Gliedmaßen. Da alle Bestandteile definiert sind, kann das System für Studien über die Wirkungen von Wachstumsfaktoren etc. auf das Fortschreiten der Chondrogenese verwendet werden. Es ist auch anwendbar bei Studien der molekularen Kontrolle der Säuger-Chondrogenese aus Vorläuferzellen.
  • Dieses System verwendet eine postnatale Quelle und trägt zu den Daten hinsichtlich aus Knochenmark stammender Vorläuferzellen bei. In vitro-Systeme sind von anderen verwendet worden, um zu zeigen, dass diese Zellpopulationen ein osteogenes und adipozytäres Potential besitzen; wir zeigen hier, dass wenigstens eine Untergruppe dieser Population chondrogenes Potential besitzt. Dieses System wird die Ausnutzung der Kontrolle der Chondrogenese erleichtern und könnte zu einem Verständnis darüber führen, welche Faktoren benötigt werden, um diesen Prozess in vivo zu fördern. Dies besitzt eine klinische Anwendbarkeit für die Knorpelreparatur.
  • Beispiel 2
  • In vitro-Chondrogenese unter Verwendung von Dexamethason und TGF-β1
  • Es wurden aus Kaninchen-Knochenmark und humanem Knochenmark stammende mesenchymale Zellen gewonnen und gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 pelletiert. Die Kulturmedien wurden wie folgt modifiziert.
  • Aus Kaninchen-Knochenmark stammende mesenchymale Zellen wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 kultiviert, und zwar entweder mit (i) der Zugabe von TGF-β1 (10 ng/ml) oder (ii) der Zugabe von TGF-β1 (10 ng/ml) bei Weglassen von Dexamethason. Aus humanem Knochenmark stammende mesenchymale Zellen wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 kultiviert, und zwar entweder mit (i) der Zugabe von TGF-β1 (10 ng/ml) oder (ii) der Zugabe von TGF-β1 (10 ng/ml) bei Weglassen von Dexamethason.
  • Bei den Kaninchen-Zellkulturen wurde die Differenzierung der MSCs zu Chondrozyten in Gegenwart von TGF-β1 beobachtet, und zwar sowohl mit als auch ohne Dexamethason. Bei den humanen Zellkulturen wurde die Differenzierung der MSCs zu Chondrozyten in Gegenwart von TGF-β1 in Kombination mit Dexamethason, jedoch nicht in Abwesenheit von letzterem beobachtet.
  • Beispiel 3
  • In vitro-Chondrogenese unter Verwendung von Dexamethason und BMP-2
  • Es wurden aus Ratten-Knochenmark stammende mesenchymale Zellen gewonnen und gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 pelletiert. Die Kulturmedien wurden wie folgt modifiziert. Aus Ratten-Knochenmark stammende mesenchymale Zellen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, kultiviert, wobei BMP-2 mit 10 ng/ml bzw. 100 ng/ml in Anwesenheit oder Abwesenheit von Dexamethason (10–7 M) zugegeben wurde. Die Differenzierung der MSCs zu Chondrozyten wurde in Gegenwart von TGF-β1 in Kombination mit Dexamethason, nicht jedoch in Abwesenheit von letzterem beobachtet.

Claims (20)

  1. Zusammensetzung zur in vitro-Chondrogenese von menschlichen mesenchymalen Vorläuferzellen und in vitro-Bildung von menschlichen Condrozyten davon, wobei die Zusammensetzung isolierte menschliche mesenchymale Stammzellen, die zu enger Nähe als Zellkonzentrat verdichtet sind und mindestens mit einem chondro-induzierendem Mittel in Kontakt sind, umfasst, wobei es sich bei dem chondro-induzierenden Mittel um eine Kombination von Dexamethason und TGF-β1 handelt.
  2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei den mesenchymalen Stammzellen um isolierte, in Kultur vermehrte menschliche mesenchymale Stammzellen handelt.
  3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei sich die mesenchymalen Stammzellen in einer chemisch-definierten serumfreien Umgebung befinden.
  4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Zellkonzentrat um ein Zentrifugations-Zellpellet handelt.
  5. Verfahren zum Herstellen von Chondrozyten aus mesenchymalen Stammzellen durch Kontaktieren von mesenchymalen Stammzellen mit einem chondro-induzierenden Mittel in vitro, wobei die Stammzellen zu enger Nähe als Zellkonzentrat verdichtet werden, wobei es sich bei dem chondro-induzierenden Mittel um eine Kombination von Dexamethason und TGF-β1 handelt.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei es sich bei den mesenchymalen Stammzellen um isolierte, in Kultur vermehrte menschliche mesenchymale Stammzellen handelt.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei sich die mesenchymalen Stammzellen in einer chemisch-definierten serumfreien Umgebung befinden.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei es sich bei dem Zellkonzentrat um ein Zentrifugations-Zellpellet handelt.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Kontakierungsschritt das Kultivieren eines Pellets von menschlichen mesenchymalen Stammzellen in einem chemisch-definierten serumfreien Medium umfasst.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das chemisch-definierte serumfreie Medium (1) ein chemisch-definiertes minimal-essentielles Medium; (2) Ascorbat oder ein Analoges davon; (3) eine Eisenquelle; (4) Insulin oder einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor umfasst.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Zellen mit der chondro-induzierenden Zusammensetzung kultiviert werden und danach in einem starren, porösen Gefäß angeordnet werden.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei es sich bei dem starren, porösen Gefäß um einen Keramikwürfel handelt.
  13. Verfahren zum Induzieren von Chondrogenese in mesenchymalen Stammzellen durch Kontaktieren von mesenchymalen Stammzellen mit einem chondro-induzierenden Mittel in vitro, wobei die Stammzellen zu enger Nähe als Zellkonzentrat verdichtet sind, wobei es sich bei dem chondro-induzierenden Mittel um eine Kombination von Dexamethason und TGF-β1 handelt.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei es sich bei den mesenchymalen Stammzellen um isolierte, in einer Kultur vermehrte menschliche mesenchymale Stammzellen handelt.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei sich die mesenchymalen Stammzellen in einer chemisch-definierten serumfreien Umgebung befinden.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei es sich bei dem Zellkonzentrat um ein Zentrifugations-Zellpellet handelt.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei der Kontakierungsschritt das Kultivieren eines Pellets von menschlichen mesenchymalen Stammzellen in einer chemisch-definierten serumfreien Medium umfasst.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das chemisch-definierte serumfreie Medium (1) ein chemisch-definiertes minimal-essentielles Medium; (2) Ascorbat oder ein Analoges davon; (3) eine Eisenquelle; (4) Insulin oder einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor umfasst.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Zellen mit der chondro-induzierenden Zusammensetzung kultiviert werden und danach in einem starren, porösen Gefäß angeordnet werden.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei es sich bei dem starren, porösen Gefäß um einen Keramikwürfel handelt.
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