WO2006119727A1 - Expansionsmedium zur in vitro kultivierung von stammzellen, verfahren zur vermehrung von stammzellen in vitro und verwendung der nach dem verfahren vermehrten stammzellen - Google Patents

Expansionsmedium zur in vitro kultivierung von stammzellen, verfahren zur vermehrung von stammzellen in vitro und verwendung der nach dem verfahren vermehrten stammzellen Download PDF

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WO2006119727A1
WO2006119727A1 PCT/DE2006/000737 DE2006000737W WO2006119727A1 WO 2006119727 A1 WO2006119727 A1 WO 2006119727A1 DE 2006000737 W DE2006000737 W DE 2006000737W WO 2006119727 A1 WO2006119727 A1 WO 2006119727A1
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WO
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stem cells
pdgf
expansion medium
prp
medium
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PCT/DE2006/000737
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Markus Tonak
Philip Kasten
Julia Vogel
Wiltrud Richter
Original Assignee
Stiftung Orthopädische Universitätsklinik
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
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    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]

Definitions

  • the present invention relates to an expansion medium for in vitro cultivation of stem cells in a composition comprising all the components required for growth of the stem cells, excluding xenogenic additives, and a method of propagating stem cells in vitro, and to the use of the stem cells propagated by the method for transplantation or reimplantation into a recipient organism.
  • stem cells of different donors can be cultured for different periods before they lose their pluripotency.
  • no media are known without xenogenic additives, ie media with purely allogenic or autogenous additives in which the stem cells can be expanded quickly and in a sufficiently large number for each application.
  • the MSCs are obtained from the bone marrow aspirate of a donor organism which, for example, is from the iliac crest, sternum, or occasionally from the long bones, if opened in the course of surgery. After removal of the bone marrow aspirate, follow Purification and selection steps to isolate the MSC.
  • the purified and isolated MSC are then contains, in a culture medium containing xenogeneic additives, under suitable standard culture conditions, usually with 6% CO 2 air saturation at 37 0 C and 98% humidity in an incubator in bottles, Petri dishes or other culture containers up to one for the planned clinical application expands sufficient cell count.
  • a xenogenic additive found in the expansion media used by many research groups is, for example, a fetal bovine serum (FCS).
  • FCS fetal bovine serum
  • the improvement of bone healing and bone production using the expanded mesenchymal stem cells in combination with a suitable carrier material is considered.
  • Another approach for obtaining a sufficient number of MSCs is the mixing ("pooling") of MSCs from different donors, a problem that arises from the fact that the recipient organism not only owns (as in the case of a reimplantation or autologous transplant) but also transplantation (allograft), which may lead to infections or immunological reactions in the recipient organism, as a result of which a healing process of the bone or cartilage defect to be treated is worsened or even in the case of an immunological reaction of the recipient organism to the alien MSC the transplanted tissue is repelled, healing of the bone or cartilage defect to be treated is thereby prevented and, overall, the overall condition of the recipient deteriorates.
  • the transplantation of stem cells that have been expanded in a medium containing bovine serum products under a significant health hazard, namely with the risk that the recipient of mad cow disease (BSE) takes place.
  • BSE mad cow disease
  • immunological reactions of human recipients to bovine serum products have become known.
  • the present invention is based on the object, an expansion medium and a method for rapid propagation of stem cells in vitro in a sufficient number for clinical applications, excluding infections or immunological reactions of the recipient organism, which are caused by xenogeneic components, and the use of the increased To provide stem cells for clinical applications.
  • the above object is achieved with respect to the expansion medium by a composition for an expansion medium having the features of claim 1.
  • the composition of the aforementioned type is designed such that the composition contains platelet-rich plasma (PRP) and at least one growth factor.
  • PRP platelet-rich plasma
  • the above object is to provide a method for rapidly increasing stem cells in vitro in a sufficient number for clinical applications, excluding infections or immunological reactions of the recipient organism caused by xenogeneic components, by a method having the features of the claim 10 solved. Thereafter, a method for propagating stem cells in vitro of the type mentioned is designed such that the stem cells are propagated in an expansion medium without xenogeneic additives containing the components required for the growth of stem cells, platelet-rich plasma (PRP) and at least one growth factor.
  • PRP platelet-rich plasma
  • the addition of PRP for example, in place of fetal bovine serum (FCS)
  • FCS fetal bovine serum
  • the use of the PRP can effectively prevent immunological reactions or human recipient infections to xenogenic additives in the medium, such as reactions to bovine serum products.
  • expansion of the stem cells can be accelerated by the addition of growth factors.
  • the stem cells propagated by the method according to the invention in the expansion medium according to the invention can be used for transplantation and / or reimplantation into a recipient organism.
  • the expansion medium composition for in vitro cultivation of stem cells may contain platelet-rich plasma (PRP) having a 0.5 to 2.5-fold increased concentration of platelets compared to whole blood. More preferably, the PRP has a 2.5 to 4.5-fold increased concentration of platelets compared to whole blood, and most preferably, the PRP has a 3 to 6.5-fold increased concentration of platelets compared to whole blood.
  • PRP platelet-rich plasma
  • the PRP can be enriched so much that a concentration of platelets of more than 6.5 times in comparison to whole blood can be achieved.
  • the enriched PRP can be used in a final concentration of 0.5 to 10% (v / v) in the expansion medium for culturing the stem cells. Depending on the type and nature of the stem cells, however, a final concentration of the PRP in the expansion medium of more than 10% (v / v) can also be used.
  • the PRP has its origin in the type of the recipient. Concretely, the PRP has a human origin ("allogeneic transplantation") for the expansion of human stem cells. "Avoiding immunological reactions to foreign platelet-rich plasma of the same species is achievable by using the recipient's own plasma to propagate their own stem cells (“ autologous Transplantation"). As additional ingredients, the composition for the expansion medium contains at least two different growth factors.
  • a platelet-dependent growth factor (PDGF) with an epidermal growth factor (EGF) proves to be particularly advantageous in combination with the PRP in order to achieve rapid expansion of the stem cells, in particular of mesenchymal stem cells.
  • PDGF platelet-dependent growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • recombinant human growth factors such as, for example, rh EGF and rh PDGF are preferred for multiplying human mesenchymal stem cells.
  • the composition preferably contains this in combination with the recombinant human Growth factor rh EGF the recombinant human growth factor rh PDGF-AA, more preferably the recombinant human growth factor rh PDFG-AB, and most preferably the recombinant human growth factor rh PDGF-BB.
  • a final concentration in the expansion medium of the respective growth factors of 2 to 5 ng / ml is considered to be preferred. More preferably, the final concentration is from 6 to 8 ng / ml, and most preferably, the expansion medium has a final concentration of the respective growth factors of 8 to 10 ng / ml.
  • final concentrations of the respective growth factors of more than 10 ng / ml can also be used in the expansion medium, in particular for rapid expansion of the cells in the shortest possible time . It is conceivable that when using different growth factors, these are added to the medium in a ratio of 1: 1 or in a ratio that is not equal to 1: 1 in order to be able to control the expansion time and the expansion of the stem cells in a targeted manner.
  • stem cells in particular of human mesenchymal stem cells, proves to be a composition containing the following components per one liter of medium in the stated amount or final concentration:
  • Glucose content (eg Dulbecco ' s Modified
  • Trace elements e.g., MCDB 201 (Sigma) 400 ml
  • Dexamethasone (20 ⁇ g / ml in 1 ml of ethanol and 45 ml of H 2 O) 400 ⁇ l 0.02 ⁇ M
  • Ascorbic acid 2-phosphate 1 5 mg 580 ul 0.1 mM
  • EGF freshness 250 ⁇ l 10 ng / ml rh PDGF-BB, rh PDGF-AA or rh PDGF-AB (fresh) 250 ⁇ l 10 ng / ml,
  • the medium components can be sterile-filtered at -2O 0 C store for up to 8 weeks and the PRP and the growth factors are added fresh to the medium components.
  • Particularly advantageous is the standing and cooling of the medium and the subsequent processing of the medium, for example the pipetting up or down or stirring the medium, on the ability to divide the stem cells, since by letting at cooling temperatures, the platelets in the medium clumping and By processing the medium, the PRP forms "clots" that have a positive effect on the ability of the stem cells to divide.
  • the cells do not differentiate into bone, cartilage, fat or tendon cells and beyond that, retain their ability to divide. This makes it possible to expand primary mesenchymal stem cells from the bone marrow aspirate of a donor to a number of more than 10 6 cells (up to more than 10 8 cells). It is advantageous that repeated bone marrow aspiration on a donor is superfluous and that bone marrow aspirate can be used by almost any donor, regardless of age or health.
  • the stem cells which have been propagated in said expansion medium by the said process can be used for transplantation or reimplantation into a recipient organism.
  • expanded stem cells derived from a donor different from the recipient but of the same species may be used for allogeneic transplantation.
  • endogenous stem cells of the recipient such as mesenchymal stem cells for reimplantation or autologous transplantation, are used to treat and cure a bone or cartilage defect of the recipient. More specifically, at the time of reimplantation, the donor of the bone marrow and the MSC expanded therefrom and the recipient of the expanded MSC are the same person, thus precluding an immunological response to exogenous antigens.
  • mesenchymal stem cells of a primary culture of a donor can be used in conjunction with the carrier material for the treatment and healing of bone defects having a size of 0.5 cm to 10 cm and 0.5 cm to 5 cm in diameter.
  • hydroxyapatite preferably hydroxyapatite (HA), a dimineralized bone matrix (DBM), a polyactide matrix or polyglycol matrix is used as the carrier material, in particular in the field of tissue engineering
  • a ⁇ -tricalcium phosphate ⁇ -TCP
  • CDHA calcium-deficient hydroxyapatite
  • support materials such as a collagen matrix, a gelatin matrix, a chitosan matrix or decellularized tissue, such as mucosa, or combinations of the materials enumerated hereinabove are also useful.
  • the increased root lines according to said method for the regeneration, treatment and healing of tissue defects other than the bone or cartilage defects are used.
  • tissue defects other than the bone or cartilage defects
  • connective tissue, nerve, vascular or tendon defects could be treated and regenerated.
  • stem cells which are the progenitor cells of the skin are propagated and used.
  • Suitable carrier materials are, for example, absorbable materials which can be applied to the body parts with the ingrown cells as a "second" skin.
  • Human mesenchymal cells were obtained from the bone marrow aspirate, which was removed from the iliac crest of a donor by bone marrow puncture.
  • the bone marrow aspirate was purified and selected, and the secreted mesenchymal stem cells in an expansion medium (see below) under standard culture conditions (6% CO 2 , 37 0 C and 98% humidity) increased.
  • D-MEM Dulbecco 's Modified Eagle Liquid Medium
  • MCDB 201 Sigma, Cat # l-1884
  • 20 ml supplement [10 mg / l final conc .] human insulin (Sigma, Cat # l-9278), [10 mg / l final conc.] human transferrin, Cat # T-8158) and [10 ⁇ g / l final conc.] sodium selenite (Sigma, Cat # S-9133))
  • Dexamethasone Sigma, Cat # D-8893
  • the solution thus prepared was at -2O 0 C to max. Frozen for 8 weeks.
  • To prepare the fresh medium the required amount of medium was thawed and 30 ml [3% final conc.]
  • Concentrated fresh PRP (3 to 6.5-fold concentration of thrombocytes compared to whole blood) and 250 .mu.l [10 ng / ml final conc.
  • Rh PDGF-BB (Strathmann Biotec hEGF-500 and hPDGF-BB-10, respectively) were added and no longer sterile-filtered. After that, the standing of the medium followed for at least 2 hours at -4 0 C to allow the platelets clumped. After standing, the medium was made ready for use by pipetting up and down to form a "clot".
  • the ready-to-use fresh PRP expansion medium without xenogenic additives was compared to a conventional expansion medium with xenogeneic addition of FCS (fetal bovine serum) for the rate of proliferation of media-cultured human mesenchymal stem cells.
  • FCS fetal bovine serum
  • the use of the PRP expansion medium without xenogenic additives for the expansion of mesenchymal stem cells has been used in the animal model for so-called "tissue engineering", namely in conjunction with excipients, for example in conjunction with a dimineralized bone matrix (DBM), a ⁇ -tricalcium phosphate ( ⁇ -TCP) and a calcium-deficient hydroxyapatite (CDHA) ceramic body of 84% porosity with an average pore diameter in the macroscopic range of 0.2 to 0.6 mm (55 vol%) and a pore diameter in the microscopic range of ⁇ 5 ⁇ m and a specific surface tested on average 0.5 m 2 / g.
  • DBM dimineralized bone matrix
  • ⁇ -TCP ⁇ -tricalcium phosphate
  • CDHA calcium-deficient hydroxyapatite
  • the ability of the MSC produced in the PRP expansion medium to evolve bone in vivo has also been demonstrated.
  • the MSC retain their desired properties to differentiate into bone and cartilage.
  • the desired surface markers of the cells are retained in the expansion process.

Abstract

Ein Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen in einer Zu sammensetzung, die unter Ausschluss von xenogenen Zusatzstoffen alle für ein Wachstum der Stammzellen erforderlichen Komponenten aufweist, ist derart aus gestaltet, dass die Zusammensetzung plättchenreiches Plasma (PRP) und mindestens einen Wachstumsfaktor enthält.

Description

EXPANSIONSMEDIUM ZUR IN VITRO KULTIVIERUNG VON STAMMZELLEN,
VERFAHREN ZUR VERMEHRUNG VON STAMMZELLEN IN VITRO UND VERWENDUNG DER NACH DEM VERFAHREN VERMEHRTEN STAMMZELLEN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen in einer Zusammensetzung, die unter Ausschluss von xenogenen Zusatzstoffen alle für ein Wachstum der Stammzellen erforderlichen Komponenten aufweist, und ein Verfahren zur Vermehrung von Stammzellen in vitro sowie die Verwendung der nach dem Verfahren vermehrten Stammzellen zur Transplantation oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus.
Bisher gestaltete sich die in vitro Kultivierung von adulten Stammzellen, wie zum Beispiel von mesenchymalen Stammzellen (MSC) aus dem Knochenmarkaspirat eines Spenders, als sehr anspruchsvoll und schwierig. Dies ist dadurch begründet, dass die zum Zeitpunkt der Entnahme pluripotenten Zellen einem natürlichen Alterungsprozess unterliegen, wodurch die Zellen neben ihrer Teilungsfähigkeit ihren pluripotenten Charakter, also ihre Pluripotenz verlieren. Eine gesteuerte Differenzierung der Stammzellen, z.B. in Knochen oder Knorpel, ist spätestens zu diesem Zeitpunkt nicht mehr möglich. Deshalb ist eine Expansion von mesenchymalen Stammzellen in den bekannten Kulturmedien nur über einen sehr kurzen Zeitraum möglich, nämlich bis zu dem Zeitpunkt der Kultur, an dem die Zellen ihren pluripotenten Charakter verlieren würden. Dieser Zeitraum ist dabei in erheblichem Maß vom Ursprung der Stammzellen abhängig, d.h., dass Stammzellen verschiedener Spender über unterschiedliche Zeiträume kultivierbar sind, bevor sie ihre Pluripotenz verlieren. Zudem sind bisher keine Medien ohne xenogene Zusatzstoffe bekannt, also Medien mit rein allogenen oder autogenen Zusätzen, in denen sich die Stammzellen schnell und in einer für die jeweilige Anwendung ausreichend großen Anzahl expandieren lassen.
Im Allgemeinen werden die MSC aus dem Knochenmarkaspirat eines Spenderorganismus, welches zum Beispiel aus dem Beckenkamm, dem Sternum oder gelegentlich aus den Röhrenknochen, falls diese im Rahmen einer Operation eröffnet werden, gewonnen. Nach der Entnahme des Knochenmarkaspirats folgen Auf- reinigungs- und Selektierungsschritte, um die MSC zu isolieren. Die aufgereinigten und isolierten MSC werden dann in einem Kulturmedium, das xenogene Zusatzstoffe enthält, unter geeigneten Standardkulturbedingungen, üblicherweise mit 6% CO2 Luftsättigung bei 370C und 98% Luftfeuchtigkeit in einem Brutschrank in Flaschen, Petrischalen oder anderen Kulturgefäßen bis zu einer für die geplante klinische Anwendung ausreichenden Zellzahl expandiert. Ein xenogener Zusatzstoff, der in den von vielen Forschungsgruppen verwendeten Expansionsmedien vorkommt, ist hierbei zum Beispiel ein fötales Rinderserum (FCS).
Als ein Ziel einer klinischen Anwendung wird auf dem Gebiet der rekonstruktiven Medizin die Verbesserung einer Knochenheilung und Knochenherstellung unter Verwendung der expandierten mesenchymalen Stammzellen in Kombination mit einem geeigneten Trägermaterial (z.B. eine Keramik) angesehen.
Häufig scheitern diese klinischen Anwendungen jedoch schon in ihren Ansätzen, da eine ausreichend große Anzahl an Stammzellen, die benötigt wird, um zum Beispiel einen Knochen- oder Knorpeldefekt eines Empfängerorganismus zu heilen, nicht erreicht werden kann, und da die Zellen aufgrund des beschriebenen Alterungsprozesses im Verlauf der Kultivierung ihre Teilungsfähigkeit (Pluripotenz) verlieren und differenzieren. So ist zum Beispiel für einen Knochendefekt von einer Länge von 1 ,5 cm und einem Durchmesser von 4 mm eine Anzahl von 106 MSC notwendig, um eine befriedigende Heilung des Knochens zu erzielen. Eine Expansion mit einer Zellzahl von mehr als 106 MSC aus dem Knochenmarkaspirat eines Spenderorganismus ist aber mit den bekannten Kulturmedien fast oder gar nicht möglich (variiert je nach Allgemeinzustand und Alter des Spenders) oder benötigt einen zu langen Zeitraum bis zur klinischen Anwendung.
Um dennoch eine ausreichende Anzahl MSC in kürzester Zeit zu gewinnen, wird daher der Ansatz verfolgt, der eine wiederholte Isolierung von MSC aus nacheinander entnommenem Knochenmarksaspiraten desselben Spenders vorsieht, um die so gewonnen Zellen miteinander zu vermischen. Ein Nachteil dabei ist, dass der Spender wiederholt einer Knochenmarkspunktion unterzogen wird, was einen schmerzhaften und belastenden Eingriff darstellt. Ein anderer Ansatz zur Gewinnung einer ausreichenden Anzahl MSC ist die Vermischung (das „Poolen") von MSC verschiedener Spender. Ein Problem dabei stellt sich aufgrund der Tatsache, dass der Empfängerorganismus nicht nur eigene (wie im Fall einer Reimplantation oder autologen Transplantation) sondern auch körperfremde Zellen bei der Transplantation (allogene Transplantation) erhält, was zu Infektionen oder zu immunologischen Reaktionen im Empfängerorganismus führen kann. Dies hat zur Folge, dass ein Heilungsprozess des zu behandelnden Knochenbzw. Knorpeldefekts verschlechtert wird oder sogar bei einer immunologischen Reaktion des Empfängerorganismus auf die körperfremden MSC das transplantierte Gewebe abgestoßen wird. Eine Heilung des zu behandelnden Knochen- bzw. Knorpeldefekts wird dadurch verhindert und insgesamt verschlechtert sich der Gesamtzustand des Empfängers.
Ein noch anderer Ansatz erfolgt durch den Einsatz mit für die Anwendung suboptimalen Zellzahlen. Nachteil dabei ist, dass der Erfolg einer Defektheilung des Knochens oder des Knorpels durch die zu geringe Dichte der transplantierten Stammzellen gefährdet wird.
Ein weiterer Nachteil der Kultivierung von MSC in Expansionsmedien mit xenogenen Zusatzstoffen, wie zum Beispiel Rinderserumprodukten, ist die Gefahr einer Kontamination mit Prionen, die die MSC infizieren und an den Empfängerorganismus bei der Transplantation weitergegeben werden können. Insofern erfolgt die Transplantation von Stammzellen, die in einem Medium expandiert wurden, das Rinderserumprodukte enthält, unter einem erheblichen gesundheitsgefährdenden Potential, nämlich mit der Gefahr, dass der Empfänger an Rinderwahnsinn (BSE) erkrankt. Zudem sind immunologische Reaktionen von humanen Empfängern auf Rinderserumprodukte bekannt geworden.
Der vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Expansionsmedium und ein Verfahren zur schnellen Vermehrung von Stammzellen in vitro in einer für klinische Anwendungen ausreichenden Anzahl unter Ausschluss von Infektionen oder immunologischen Reaktionen des Empfängerorganismus, die durch xenogene Komponenten verursacht werden, sowie die Verwendung der vermehrten Stammzellen für klinische Anwendungen zur Verfügung zu stellen. Erfindungsgemäß wird die voranstehende Aufgabe hinsichtlich des Expansionsmediums durch eine Zusammensetzung für ein Expansionsmedium mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Danach ist die Zusammensetzung der eingangs genannten Art derart ausgestaltet, dass die Zusammensetzung plättchenreiches Plasma (PRP) und mindestens einen Wachstumsfaktor enthält.
Des Weiteren ist die obige Aufgabe im Hinblick auf ein Verfahren zur schnellen Vermehrung von Stammzellen in vitro in einer für klinische Anwendungen ausreichenden Anzahl unter Ausschluss von Infektionen oder immunologischen Reaktionen des Empfängerorganismus, die durch xenogene Komponenten verursacht werden, durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 10 gelöst. Danach ist ein Verfahren zur Vermehrung von Stammzellen in vitro der eingangs genannten Art derart ausgestaltet, dass die Stammzellen in einem Expansionsmedium ohne xenogene Zusatzstoffe vermehrt werden, welches die für das Wachstum der Stammzellen erforderlichen Komponenten, plättchenreiches Plasma (PRP) und mindestens einen Wachstumsfaktor enthält.
Schließlich ist die obige Aufgabe hinsichtlich der Verwendung der MSC durch die Merkmale des Anspruchs 18 gelöst. Danach ist eine Verwendung der nach dem beanspruchten Verfahren vermehrten Stammzellen zur Transplantation oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus vorgesehen.
In erfindungsgemäßer Weise ist erkannt worden, dass durch den Zusatz von PRP, das zum Beispiel anstelle von fötalem Rinderserum (FCS) eingesetzt wird, ein Expansionsmedium zur Expansion von humanen Stammzellen bereitgestellt werden kann. Mit anderen Worten ist hierdurch das Risiko des Empfängers nach einer Transplantation oder Reimplantation der expandierten Stammzellen, an BSE zu erkranken, vollkommen ausgeschlossen. Durch den Einsatz des PRP können zudem immunologische Reaktionen oder Infektionen eines humanen Empfängers auf xenogene Zusatzstoffe im Medium, wie zum Beispiel Reaktionen auf Rinderserumprodukte, wirksam vermieden werden. Darüber hinaus ist in erfindungsgemäßer Weise erkannt worden, dass durch die Zugabe von Wachstumsfaktoren eine Expansion der Stammzellen beschleunigt werden kann. Zudem ist in erfindungsge- mäßer Weise erkannt worden, dass sich die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in dem erfindungsgemäßen Expansionsmedium vermehrten Stammzellen für eine Transplantation und/oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus verwenden lassen.
Folglich ist ein Expansionsmedium und ein Verfahren zur schnellen Vermehrung von Stammzellen in vitro in einer für klinische Anwendungen ausreichenden Anzahl unter Ausschluss von Infektionen oder immunologischen Reaktionen des Empfängerorganismus, welche durch xenogene Komponenten verursacht werden, sowie die Verwendung der vermehrten Stammzellen für klinische Anwendungen realisiert. ~
Vorzugsweise kann die Zusammensetzung für das Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen plättchenreiches Plasma (PRP) enthalten, dass eine 0,5 bis 2,5-fach erhöhte Konzentration an Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut aufweist. Noch bevorzugter weist das PRP eine 2,5 bis 4,5-fach erhöhte Konzentration an Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut auf und am meisten bevorzugt weist das PRP eine 3 bis 6,5-fach erhöhte Konzentration an Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut auf. Es ist aber auch denkbar, dass das PRP so stark anreicherbar ist, dass eine Konzentration an Thrombocyten von mehr als 6,5-fach im Vergleich zu Vollblut erreichbar ist. In besonders vorteilhafter Weise ist das angereicherte PRP in einer Endkonzentration von 0,5 bis 10 % (v/v) im Expansionsmedium zur Kultivierung der Stammzellen einsetzbar. Je nach Art und Beschaffenheit der Stammzellen ist aber auch eine Endkonzentration des PRP im Expansionsmedium von mehr als 10 % (v/v) verwendbar.
Damit ein speziell auf den Empfängerorganismus abgestimmtes Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung der Stammzellen zur Verfügung gestellt werden kann, welches keine xenogenen Zusatzstoffe enthält, hat das PRP seinen Ursprung in der Art der Empfängers. Im Konkreten hat das PRP zur Expansion von humanen Stammzellen einen humanen Ursprung („allogene Transplantation"). Eine Vermeidung immunologischer Reaktionen auf fremdes plättchenreiches Plasma aus der gleichen Art ist durch die Verwendung des körpereigenen Plasmas des Empfängers zur Vermehrung der eigenen Stammzellen erzielbar („autologe Transplantation"). Als zusätzliche Bestandteile enthält die Zusammensetzung für das Expansionsmedium mindestens zwei unterschiedliche Wachstumsfaktoren. Als besonders vorteilhaft erweist sich dabei in Kombination mit dem PRP ein Plättchen abhängiger Wachstumsfaktor (PDGF) mit einem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), um eine schnelle Expansion der Stammzellen, insbesondere von mesenchymalen Stammzellen, zu erreichen. Zur Vermehrung von humanen mesenchymalen Stammzellen bieten sich in Anbetracht der angesprochenen Infektionsproblematik und der Vermeidung der immunologischen Reaktion des Empfängerorganismus auf xenogene Zusatzstoffe besonders rekombinante humane Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel rh EGF und rh PDGF anr ln bevorzugter Weise enthält die Zusammensetzung dabei in Kombination mit dem rekombinanten humanen Wachstumsfaktor rh EGF den rekombinanten humanen Wachstumsfaktor rh PDGF-AA, in noch bevorzugter Weise den rekombinanten humanen Wachstumsfaktor rh PDFG-AB und in besonders bevorzugter Weise den rekombinanten humanen Wachstumsfaktor rh PDGF-BB. Dabei wird eine Endkonzentration im Expansionsmedium der jeweiligen Wachstumsfaktoren von 2 bis 5 ng/ml als bevorzugt angesehen. Noch bevorzugter erweist sich eine Endkonzentration von 6 bis 8 ng/ml und am meisten bevorzugt weist das Expansionsmedium eine Endkonzentration der jeweiligen Wachstumsfaktoren von 8 bis 10 ng/ml auf. Je nach Art der Stammzellen und dem zur Verfügung stehenden Zeitraum (bis zur klinischen Anwendung) zur Vermehrung der Stammzellen sind auch, insbesondere zur schnellen Expansion der Zellen in einem möglichst kurzem Zeitraum, Endkonzentrationen der jeweiligen Wachstumsfaktoren von mehr als 10 ng/ml im Expansionsmedium einsetzbar. Dabei ist denkbar, dass bei Verwendung unterschiedlicher Wachstumsfaktoren diese in einem Verhältnis 1 :1 oder in einem Verhältnis, das ungleich 1 :1 ist, dem Medium hinzugegeben werden, um die Expansionszeit und die Expansion der Stammzellen gezielt steuern zu können.
Als besonders vorteilhaft zur Anzucht von Stammzellen, insbesondere von humanen mesenchymalen Stammzellen, erweist sich eine Zusammensetzung, die die folgenden Komponenten pro einem Liter Medium in der angegebenen Menge bzw. Endkonzentration enthält: Komponente UJVlfidJium EodkojQzanJratLoii
Fertigkulturmeclium mit hohem
Glucoseanteil (z.B. Dulbecco's Modified
Eagle Medium (D-MEM) (1x) liquid (high
Glucose) (Invitrogen)) 567,5 ml
Fertigkulturmedium mit Zusatz von
Spurenelementen (z.B. MCDB 201 (Sigma)) 400 ml
Supplement 20 ml
- humanes Insulin 10 mg
- humanes Transferrin 10 mg
- Natriumselenit 10 μg Penicillin/Streptomycin 10 ml 1 % (v/v)
Dexamethason (20 μg/ml in 1 ml Ethanol und 45 ml H2O) 400 μl 0,02 μM
Ascorbinsäure-2-phophat 1 ,5 mg 580 μl 0,1 mM
PRP (3 bis 6,5-fach erhöhte Konzentration)(frisch) 30 ml 3 % (v/v)
EGF (frisch) 250 μl 10 ng/ml rh PDGF-BB, rh PDGF-AA oder rh PDGF-AB (frisch) 250 μl 10 ng/ml,
wobei sich die Mediumkomponenten steril filtriert bei -2O0C bis zu 8 Wochen lagern lassen und das PRP und die Wachstumsfaktoren frisch zu den Mediumkomponenten hinzugegeben werden. Als besonders vorteilhaft wirkt sich das Stehenlassen und Abkühlen des Mediums und die anschließende Bearbeitung des Mediums, zum Beispiel das Auf- und Abpipettieren oder das Umrühren des Mediums, auf die Teilungsfähigkeit der Stammzellen aus, da durch das Stehenlassen bei Kühltemperaturen die Thrombocyten im Medium Verklumpen und durch die Bearbeitung des Mediums das PRP „Clots" bildet, die positiv auf die Teilungsfähigkeit der Stammzellen wirken.
In vorteilhafter Weise ist eine Kultivierung der Stammzellen über einen langen Zeitraum, nämlich bis zu 8 Wochen, mit dem Expansionsmedium in der oben genannten Zusammensetzung und/oder eine schnelle Expansion der Stammzellen, insbesondere der humanen mesenchymalen Stammzellen innerhalb eines Zeitraumes von wenigen Wochen (2 bis 3 Wochen) erzielbar. Dabei ist von Vorteil, dass die Zellen nicht in Knochen-, Knorpel-, Fett- oder Sehnenzellen differenzieren und darüber hinaus ihre Teilungsfähigkeit beibehalten. Dies ermöglicht es, primäre mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmarkaspirat eines Spenders bis zu einer Anzahl von mehr als 106 Zellen (bis über 108 Zellen) zu expandieren. Dabei ist vorteilhaft, dass eine wiederholte Knochenmarkpunktion an einem Spender überflüssig ist und dass das Knochenmarkaspirat fast jeden Spenders, unabhängig von dessen Alter oder Gesundheitszustand, verwendbar ist.
Bezüglich des beanspruchten Verfahrens wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf die Ausführungen und die Vorteilsangaben zu dem beanspruchten Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen verwiesen.
In besonders vorteilhafter Weise lassen sich die nach dem genannten Verfahren in dem genannten Expansionsmedium vermehrten Stammzellen zur Transplantation oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus verwenden. So können zum Beispiel expandierte Stammzellen, die von einem Spender stammen, der unterschiedlich zu dem Empfänger ist, aber der gleichen Art entstammt, für die allogene Transplantation verwendet werden. In bevorzugter Weise werden körpereigene Stammzellen des Empfängers, wie zum Beispiel mesenchymale Stammzellen für eine Reimplantation oder autologe Transplantation zur Behandlung und Heilung eines Knochen- oder Knorpeldefekts des Empfängers verwendet. Genauer gesagt, sind bei der Reimplantation der Spender des Knochenmarks und der daraus expandierten MSC und der Empfänger der expandierten MSC die gleiche Person, womit eine immunologische Reaktion auf körperfremde Antigene ausgeschlossen ist.
Als ganz besonders vorteilhaft erweist sich bei der Transplantation oder Reimplantation, insbesondere bei der Behandlung von größeren Knochen- oder Knorpeldefekten, die Verwendung eines Trägermaterials, auf das und/oder in das sich die Zellen bei der Kultivierung ansiedeln. So können beispielsweise mesenchymale Stammzellen einer Primärkultur eines Spenders in Verbindung mit dem Trägermaterial zur Behandlung und Heilung von Knochendefekten mit einer Größe von 0,5 cm bis 10 cm und 0,5 cm bis 5 cm Durchmesser eingesetzt werden. Als Trägermaterial wird dabei, insbesondere auf dem Gebiet des „Tissue Engineering", bevorzugt Hydroxylapatit (HA), eine dimineralisierte Knochenmatrix (DBM), eine Polyactidmatrix oder Polyglycolmatrix verwendet. Noch bevorzugter wird als Trägermaterial ein ß-Trikalziumphosphat (ß-TCP) und am meisten bevorzugt Kalzium-defizientes Hydroxylapatit (CDHA) verwendet. Es sind aber auch andere Trägermaterialien, wie zum Beispiel eine Kollagenmatrix, eine Gelatinematrix, eine Chitosanmatrix oder dezellularisiertes Gewebe, wie zum Beispiel Mukosa, oder Kombinationen der hier insgesamt aufgezählten Materialien verwendbar.
Es ist darüber hinaus auch denkbar, dass die nach dem genannten Verfahren vermehrten Stammzeilen zur Regeneration, Behandlung und Heilung von anderen Gewebedefekten als den Knochen- oder Knorpeldefekten verwendet werden. So könnten zum Beispiel Bindegewebs-, Nerven-, Gefäß- oder Sehnendefekte behandelt und regeneriert werden. Es ist aber auch denkbar, dass bei Defekten der Haut, die durch Verbrennungen, Infektionen, Erkrankungen und/oder Abschürfungen entstanden sind, Stammzellen vermehrt und verwendet werden, die die Vorläuferzellen der Haut sind. Als Trägermaterialien kommen dabei zum Beispiel resorbierbare Materialien in Betracht, die sich mit den eingewachsenen Zellen wie eine „zweite" Haut auf die Körperpartien auflegen lassen.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Beispiels zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Beispiels werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert, ohne die Lehre darauf einzuschränken.
Beispiel
Humane mesenchymale Zellen wurden aus dem Knochenmarkaspirat gewonnen, das mittels einer Knochenmarkpunktion aus dem Beckenkamm eines Spenders entnommen wurde. Das Knochenmarkaspirat wurde aufgereinigt und selektiert, und die abgesonderten mesenchymalen Stammzellen in einem Expansionsmedium (s.u.) unter Standardkulturbedingungen (6% CO2, 37 0C und 98% Luftfeuchtigkeit) vermehrt. 1 Liter Expansionsmedium wurde wie folgt hergestellt: jeweils 567, 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Flüssigmedium (D-MEM) (1x) (high giucose) (Invitrogen, Cat#41966), 400 ml MCDB 201 (Sigma, Cat#l-1884), 20 ml Supplement ([10 mg/l Endkonz.] humanes Insulin (Sigma, Cat#l-9278), [10 mg/l Endkonz.] humanes Transferrin, Cat#T-8158) und [10 μg/l Endkonz] Natriumselenit (Sigma, Cat#S- 9133)), 10 ml [1% Endkonz.] Penicillin/Streptomycin (Biochrom AG, Cat#A-2213), 400 μl [0,02 μM Endkonz.] Dexamethason (Sigma, Cat#D-8893) 20 μg/ml in 1 ml Ethanol zum Lösen in 45 ml sterilem MiIIi-Q-H2O) und 580 μl [0,1 mM Endkonz.] Ascorbinsäure-2-phosphat 1 ,5 mg (Sigma, Cat#A-8960) wurden zusammengegeben und sterilfiltriert. Die so hergestellte Lösung wurde bei -2O0C bis max. 8 Wochen eingefroren. Zur Herstellung des frischen Mediums wurde die benötigte Menge Medium aufgetaut und 30 ml [3% Endkonz.] aufkonzentriertes frisches PRP (3 bis 6,5-fache Konzentration der Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut) sowie jeweils 250 μl [10 ng/ml Endkonz.] Wachstumsfaktor rh EGF und 250 μl [10 ng/ml Endkonz.] rh PDGF- BB (Strathmann Biotec hEGF-500 bzw. hPDGF-BB-10) wurden dazugegeben und nicht mehr sterilfiltriert. Danach folgte das Stehenlassen des Mediums für mindestens 2 Stunden bei -4 0C, damit sich die Thrombocyten verklumpten. Nach dem Stehenlassen wurde zur Bildung eines „Clots" das Medium durch Auf- und Abpippettieren verwendungsfertig gemacht.
Das verwendungsfertige frische PRP-Expansionsmedium ohne xenogene Zusatzstoffe wurde mit einem üblichen Expansionsmedium mit xenogenem Zusatz von FCS (fötales Rinderserum) bezüglich der Proliferationsrate der in den Medien kultivierten humanen mesenchymalen Stammzellen verglichen. Dabei wurde eine Proliferationsrate der MSC im PRP-Expansionsmedium gemessen, die signifikant höher als die Proliferationsrate der MSC im FCS-Expansionsmedium lag (p<0,05).
Die Verwendung des PRP-Expansionsmediums ohne xenogene Zusatzstoffe zur Expansion von mesenchymalen Stammzellen wurde im Tiermodell für das sogenannte „Tissue-Engineering", nämlich in Verbindung mit Trägerstoffen, wie zum Beispiel in Verbindung mit einer dimineralisierten Knochenmatrix (DBM), einem ß- Trikalziumphosphat- (ß-TCP) und einem Kalzium-defizienten Hydroxylapatit- (CDHA) Keramikkörper mit 84 % Porosität mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser im makroskopischen Bereich von 0,2 bis 0,6 mm (55 vol %) und einem Porendurchmesser im mikroskopischen Bereich von < 5 μm und einer spezifischen Oberfläche von durchschnittlich 0.5 m2/g erprobt. Dabei konnte eine ektope Knochenbiidung nach 8 Wochen in 4 von 16 MSC behandelten CDHA-Keramikkörpem und in 2 von 16 behandelten ß-TCP-Keramikkörpern in immundefizienten Mäusen festgestellt werden.
Neben der Eigenschaft des Mediums MSC schneller und zuverlässiger im Vergleich zu den bekannten Medien zu expandieren, wurde zudem die Fähigkeit der in dem PRP-Expansionsmedium hergestellten MSC in vivo ektop Knochen bilden zu können, bewiesen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die MSC ihre gewünschten Eigenschaften behalten, in Knochen und Knorpel zu differenzieren. Zudem konnte festgestellt werden, dass die gewünschten Oberflächenmarker der Zellen im Expansionsprozess erhalten bleiben.
Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass das voranstehend beschriebene Beispiel lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dient, diese jedoch nicht auf das Beispiel einschränkt.

Claims

Patentansprüche
1. Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen in einer Zusammensetzung, die unter Ausschluss von xenogenen Zusatzstoffen alle für ein Wachstum der Stammzellen erforderlichen Komponenten aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung plättchen- reiches Plasma (PRP) und mindestens einen Wachstumsfaktor enthält.
2. Expansionsmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das PRP eine 3 bis 6,5-fach erhöhte Konzentration an Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut aufweist.
3. Expansionsmedium nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung humanes PRP enthält.
4. Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung mindestens zwei unterschiedliche Wachstumsfaktoren enthält.
5. Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung rekombinante humane Wachstumsfaktoren enthält.
6. Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung die Wachstumsfaktoren EGF und PDGF- BB, PDGF-AA oder PDGF-AB enthält.
7. Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 6, enthaltend: Komponente 1 L Medium Endkonzentration
Fertigkulturmedium mit hohem
Glucoseanteil (z.B. Dulbecco's Modified
Eagle Medium (D-MEM) (1x) liquid (high
Glucose) (Invitrogen)) 567,5 ml
Fertigkulturmedium mit Zusatz von
Spurenelementen (z.B. MCDB 201 (Sigma)) 400 ml
Supp\ßmenh 20 ml
- humanes Insulin 10 mg
- humanes Transferrin 10 mg
- Natriumselenit 10 μg
Pen ici 11 i n/Streptomyci n 10 ml 1 % (v/v)
Dexamethason (20 μg/ml in 1 ml Ethanol und 45 ml H2O) 400 μl 0,02 μM
Ascorbinsäure-2-phophat 1 ,5 mg 580 μl 0,1 mM
PRP (3 bis 6,5-fach erhöhte Konzentration) 30 ml 3 % (v/v) rh EGF 250 μl 10 ng/ml rh PDGF-BB, rh PDGF-AA oder rh PDGF-AB 250 μl 10 ng/ml
8. Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen unter geeigneten Kultivierungsbedingungen über einen langen Zeitraum kultivierbar sind und/oder deren schnelle Expansion ohne Differenzierung und unter Beibehaltung der Teilungsfähigkeit erzielbar ist.
9. Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur in vitro Kultivierung von mesenychmalen Stammzellen.
10. Verfahren zur Vermehrung von Stammzellen in vitro, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Stammzellen in einem Expansionsmedium ohne xenogene Zusatzstoffe vermehrt werden, welches die für das Wachstum der Stammzellen erforderlichen Komponenten, plättchenreiches Plasma (PRP) und mindestens einen Wachstumsfaktor enthält.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass PRP mit einer 3 bis 6,5-fach erhöhten Konzentration an Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut verwendet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 unter Verwendung von humanem PRP.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12 unter Verwendung von unterschiedlichen Wachstumsfaktoren.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13 unter Verwendung von rekombinanten humaneni/Vachstumsfaktoren.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14 unter Verwendung der Wachstumsfaktoren EGF und PDGF-BB, PDGF-AA oder PDGF-AB.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Expansionsmedium die folgende Formulierung enthält:
Komponente 1 L Medium Endkonzentration
Fertigkulturmedium mit hohem
Glucoseanteil (z.B. Dulbecco's Modified
Eagle Medium (D-MEM) (1x) liquid (high
Glucose) (Invitrogen)) 567,5 ml
Fertigkulturmedium mit Zusatz von
Spurenelementen (z.B. MCDB 201 (Sigma)) 400 ml
Supplement 20 ml
- humanes Insulin 10 mg
- humanes Transferrin 10 mg
- Natriumselenit 10 μg Penicillin/Streptomycin 10 ml 1 % (v/v)
Dexamethason (20 μg/ml in 1 ml Ethanol und 45 ml H2O) 4 40000 μμll 0,02 μM Ascorbinsäure-2-phophat 1 ,5 mg 580 μl 0,1 mM PRP (3 bis 6,5-fach erhöhte Konzentration) 30 ml 3 ' % (v/v) rh EGF 250 μl 10 ng/ml rh PDGF-BB, rh PDGF-AA oder rh PDGF-AB 250 μl 10 ng/ml
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmarkaspirat von Spendern vermehrt werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17 zur Vermehrung humaner mesenchymaler Stammzellen aus einer Primärkultur eines Spenders bis zu einer Anzahl von > 106 Zellen.
19. Verwendung der nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18 in dem Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 9 vermehrten Stammzellen zur Transplantation oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus.
20. Verwendung nach Anspruch 19 zur Transplantation oder Reimplantation an und/oder in einem Trägermaterial.
21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20 der nach dem Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18 vermehrten mesenchymalen Stammzellen zur Behandlung eines Knochen-, Knorpel-, Bindegewebs-, Nerven-, Gefäß- oder Sehnendefekts.
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