DE60302820T2

DE60302820T2 - Autologes knochenersatzmaterial

Info

Publication number: DE60302820T2
Application number: DE60302820T
Authority: DE
Inventors: Sudhakar Kadiyala; Scott P. Bruder
Original assignee: DePuy Spine LLC
Current assignee: DePuy Spine LLC
Priority date: 2002-03-29
Filing date: 2003-03-29
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2023-03-30
Also published as: US8313742B2; CA2423994A1; EP1621218A1; EP1348453B1; CA2423994C; JP2003325164A; AU2003203652A1; AU2003203652B8; US20080103605A1; DE60302820D1; ES2383753T3; US20030185803A1; ATE554803T1; EP1621218B1; ATE313346T1; AU2003203652B2; US8137408B2; EP1348453A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Knochenmark wird als eine Quelle von muskuloskeletogenen („MSG") Komponenten zur Herstellung von autologen Transplantatgraftmaterialien, die nützlich in der Reparatur/Regeneration von muskuloskeletalen Geweben wie zum Beispiel Knochen, Knorpel und Sehne sind, angesehen. Knochenmarksaspirat („BMA") wird üblicherweise vom Patienten während der Operation mit Hilfe gut bekannter Techniken gewonnen und beinhaltet die folgenden Komponenten, dargelegt in Tabelle I unten:
Tabelle I
BCF umfaßt alle kernhaltigen Knochenmarkszellen („NBMC"), Blutplättchen, Proteine und Moleküle, die sich innerhalb des Dichtebands der zwischen dem Serum und den roten Blutzellenanteilen des BMA anwesenden Materialien befinden, wie durch konventionelle Zentrifugation des Gesamt-BMA ermittelt wird. Die NBMC-Komponente des BCF umfaßt typischerweise das folgende Komplement von Zelltypen und die ungefähren Konzentrationen, wie in Tabelle II dargelegt:
Tabelle II
In einem ersten konventionellen Verfahren unter Verwendung von Knochenmark wegen seiner osteogenen (knochenbildenden) Eigenschaft, wird Gesamt- oder „frisches" Knochenmark entweder direkt als ein Transplantatmaterial verwendet oder mit einem Matrixmaterial kombiniert, um eine Knochentransplantatzusammensetzung herzustellen. Harada, Bone 9 (1988) 177-183, zum Beispiel, legte eine Zusammensetzung offen, die Gesamt-BMA innerhalb einer porösen Matrix einer demineralisierten Knochenmatrix (DBM) umfaßt, die sich innerhalb einer Diffusionskammer befindet. Die Diffusionskammer hat jedoch eine semi-permeable Membran, die die Passage von Näherstoffen erlaubt, und daher verhindert sie den Zufluss von zellulären Komponenten und die für die Osteogenese kritische Gefäßversorgung. Da außerdem der Erfolg dieses Verfahrens zum Teil von den nativen Mengen des MSPCs in dem Knochenmark abhängt und solche nativen Mengen von MSPCs in dem Knochenmark des Patienten manchmal aufgebraucht sein können, ist die weit verbreitete Brauchbarkeit dieses Verfahrens begrenzt. Darüberhinaus sind diese Zellen selbst bei relativ normalen nativen Mengen von MSPCs relativ knapp an frischem Knochenmark und daher ist das osteogene Potential des gesamten Knochenmarks per se dadurch limitiert.
In einem zweiten konventionellen Verfahren wird Plasma vom gesamten Knochenmark entfernt und das zurückbleibende Gemisch, das BCF und rote Blutzellen umfaßt, wird entweder direkt als ein Transplantatmaterial verwendet oder mit einem Matrixmaterial kombiniert, um eine Knochentransplantatzusammensetzung herzustellen. Ogushi, J. Biomed. Mat. Res. (1990), 24:1563-70, zum Beispiel, offenbarte das Zentrifugieren von BMA, und die Verwendung der zurückbleibenden roten Zell-/BCF-Fraktion als eine interstitielle Flüssigkeit innerhalb einer porösen Matrix von HA oder TCP. Da Plasma ungefähr 45 Volumenprozent („Vol%") von Knochenmarkaspirat umfaßt, ergibt dieses Verfahren nur leicht erhöhte Mengen von MSPCs (d. h. weniger als einen 2-fachen Zuwachs) relativ zu der nativen Menge von MSPCs in frischem Knochenmark. Zusätzlich fehlen der Suspension im wesentlichen die löslichen oder unlöslichen Faktoren, die im Plasma gefunden werden, wie zum Beispiel Albumin. Schließlich kann die Gegenwart von roten Blutzellen („RBCs" = „red blood cells") in dieser Zusammensetzung auch die Inhibierung der MSPC-Aktivität durch sterische Behinderung der Oberflächenzugänglichkeit und durch hohe örtliche Eisenkonzentrationen in Folge einer RBC-Lyse bewirken.
In einem dritten konventionellen Verfahren wird der Buffy Coat des BMA vom Plasma und den roten Blutzellenfraktionen isoliert. Connolly et al., JBJS (1989) S. 684-691, zum Beispiel, versuchten das osteogene Potential des BMA zu „optimieren" und offenbarten das Isolieren von Fraktionen des BMA und dann die Verwendung dieser Fraktionen als Transplantatmaterial in Diffusionskammern. Connolly benutzte die folgenden Isolierungsverfahren:

a) Einfache Zentrifugation, gefolgt von der Entfernung der Überstand- (d. h. Serum-) Fraktion,
b) isopyknische Zentrifugation, gefolgt von einer getrennten Entfernung der leichten Zell-(Buffy Coat) und roten Zellfraktionen, und
c) Einheitsgravitationszentrifugation, gefolgt von einer getrennten Entfernung der leichten Zell-(Buffy Coat) und roten Zellfraktionen.

Obgleich Connolly berichtete, daß die konzentrierte leichte Zell-(Buffy Coat) Fraktion, die durch die isopyknische Zentrifugation hergestellt wurde, die größte Menge an Calciumproduktion innerhalb der Diffusionskammer ergab, wählte Connolly die kombinierte rote Zell-/leichte Zellfraktion, hergestellt durch einfache Zentrifugation, (d. h. leichte Zell- und rote Zellfraktion) für die weitere Studie. Außerdem stellte Connolly kein poröses Substratträgermaterial innerhalb der Diffusionskammer zur Verfügung. Connolly's Beispiele, die das BCF verwendeten, beseitigten schließlich auch die Faktoren, die in der Plasmafraktion des BMA anwesend sind.
In einem vierten konventionellen Verfahren wird der isolierte Buffy Coat weiter fraktioniert. Budenz et al., Am.J.Anat. 159 (1980), S. 455-474, zum Beispiel, offenbaren das Isolieren von Fraktionen des BCF von Knochenmarkaspirat in hohen Konzentrationen und das Einfügen dieser konzentrierten Fraktion in einen Diffusionsbehälter, der dann in Ratten implantiert wird. Die Einschränkungen, die mit Diffusionskammern verbunden sind, wurden oben diskutiert. Budenz offenbart nicht das Verwenden der Gesamt-BCF-Fraktion in toto. Schließlich offenbart Budenz kein poröses Substratträgermaterial innerhalb der Diffusionskammer.
In einem fünften konventionellen Verfahren wird eine angereicherte Fraktion von MSPCs (relativ zu allen anderen NBMCs) mit einem Matrixmaterial kombiniert, um ein Knochentransplantat herzustellen. MSPCs können durch eine Vielzahl von gut bekannten Verfahren angereichert werden. Zum Beispiel offenbart US-Patent Nr. 6,049,026 („Muschler '026") das Passieren von Knochenmarkaspirat durch eine Matrix, die fähig ist, MSPCs selektiv zurückzuhalten. Dieser Prozeß stellt eine Zusammensetzung mit angereicherten Mengen von MSPCs her (d. h., bis zu 2,8-fach höher als die native MSPC-Menge, die in dem gleichen Volumen von autologem Knochenmark gefunden wird). Jedoch ist diese Zusammensetzung auch frei von Zellen, Molekülen und Proteinen, die in BMA anwesend sind, die nicht von dem Substrat zurückbehalten werden, und ist arm an anderen Komponenten, die in BMA gefunden werden, die keine hohe Affinität für das Substrat haben. Zusätzlich ist das Verfahren, offenbart in Muschler '026, zum Anreichern der MSPCs ineffizient und verfehlt routinemäßig dabei zwischen ungefähr 32% und 56% der in dem BMA-anwesenden MSPCs einzufangen. Darüberhinaus offenbart Muschler wahlweise das Waschen des MSPC-beladenen Substrats, um jegliche Zellen, die nur lose zurückgeblieben waren, zu entfernen und entfernt dadurch noch mehr die Anwesenheit von Zellen, die keine hohe Affinität für das Substrat haben. Muschler offenbart wahlweise das Hinzufügen von verschiedenen diskreten bioaktiven Komponenten zu der Zusammensetzung, wie Blutplättchen, Zelladhäsionsmolekülen (wie Collagen), Wachstumsfaktoren (wie BMPs), Antikörpern (wie STRO-1).
Einige Forscher offenbarten das in vitro Kultivieren von gesamten oder fraktionierten BMA, in einem Bemühen, eine reichliche und reine Population von MSPCs zu erhalten. Majors, J. Orthop. Res. (1997) 15:546-557, zum Beispiel, offenbarten das Isolieren der BCF von BMA durch Zentrifugation, das Kultivieren der BCF, um eine angereicherte MSPC-Population herzustellen, und das Anfärben der MSPCs als ein Mittel, um die osteoplastische Vorläuferpopulation innerhalb der BMA zu testen. PCT publizierte Patentamneldungsnr. 97/40137 („Kadiyala") offenbart Zusammensetzungen und Verfahren zum Anreichern der Knochenbildung durch Verabreichen isolierter menschlicher mesenchymaler Stammzellen mit einem keramischen Material oder Matrix oder durch Verabreichen von humanen mesenchymalen Stammzellen; frisches, gesamtes Mark oder Kombinationen davon in einem resorbierbaren Biopolymer, das ihre Differenzierung in ihre osteogene Linie unterstützt. Kadiyala zieht die Zuführung in Erwägung von (i) isolierten, Kultur-adaptierten, menschlichen, mesenchymalen Stammzellen; (ii) frisch abgesaugtem Knochenmark; oder (iii) ihre Kombination in einem Trägermaterial oder Matrix, um eine verbesserte Knochenfusionsfläche und Fusionsmasse, wenn verglichen zu der Matrix alleine, zur Verfügung zu stellen. Beispiel V offenbart eine Zusammensetzung, die eine Collagen-/keramische Zusammensetzung umfaßt, die in einem Verhältnis von 50:50 mit frischen Knochenmarks-kernhaltigen Zellen, die durch Zentrifugation zehnfach konzentriert wurden, und Buffy Coat Isolierung (BMC) gemischt ist. Das Verfahren, das für die Herstellung der Kultur-adaptierten aufgereinigten MSPCs erforderlich ist, ist ein langes und anstrengendes Verfahren (das oft etwa 21 bis 56 Tage beansprucht) und das daher nicht intraoperativ durchgeführt werden kann. US-Patent Nr. 5,914,121 („Robey") offenbart eine Zusammensetzung, die kultivierte MSPCs und HA/TCP-Pulver umfaßt und wahlweise, kommerziell hergestelltes Fibrinogen und Thrombin zu der Zusammensetzung hinzufügt, zum Zweck der Herstellung von Fibrinkleber.
Einige wenige Forscher haben über das Ergänzen von porösen Matrices berichtet, die konzentrierte MSG-Fraktionen mit Gesamt-BMA enthalten. Walsh „Autologous Growth Factor Gel (AGF) and Spinal Fusion" 47 jährliches Meeting, ORS, Februar 2001 offenbart zum Beispiel ein Transplantatmaterial, das eine HAP-poröse Matrix, PRP und Gesamt-BMA umfaßt. Walsh offenbart jedoch nicht eine konzentrierte, physiologische Fraktion von fraktionierten Knochenmarkaspirat-BMA, nur Gesamt-BMA.
Matsukara „Concentration of Bone Marrow Derived Osteoprogenitors for Spinal Fusion", Am. Soc. Bone. Min. Res. 22. jährliche Meetingzusammenfassung, Sept. 2000, offenbart ein Transplantatmaterial, das eine angereicherte Fraktion von MSPCs, gesamtes Knochenmark und eine poröse Matrix umfaßt. Matsukara offenbart nicht eine konzentrierte, physiologische Fraktion von fraktionierten Knochenmarkaspirat-BMA. Die angereicherte Fraktion von MSPCs, wie in Matsukara gelehrt, ist keine Suspension und ist daher arm an löslichen Komponenten, die in der korrespondierenden physiologischen Fraktion von BMA anwesend sind, das große Mengen an MSPCs aufweist.
Eine US-Patentamneldung, mit dem Titel „Composite Bone Marrow Graft Material With Method and Kit" („Muschler II") offenbart ein zusammengesetztes Knochenmarkstransplantatmaterial, das eine poröse, biokompatible, implantierbare Matrix umfaßt, eine angereicherte Population von Vorläuferzellen (MSPCs) und ein Gerinnungsmaterial. Das Gerinnungsmaterial kann ein Blutgerinnsel, gebildet aus Blut, ein Knochenmarksgerinnsel, ein Blutplättchengel, ein Blutplättchenkonzentrat, ein Fibringerinnsel oder ein Fibrinkleber sein. Da die angereicherte Population von MSPCs durch das Verfahren gebildet wird, das in Muschler I gelehrt wird, und daher (nach Matsukara) arm an löslichen Komponenten ist, die in der korrespondierenden physiologischen Fraktion des BMA anwesend sind und große Mengen an MSPCs haben, offenbart Muschler II keine konzentrierte, physiologische Fraktion des fraktionierten Knochenmarkapirat-BMA.
Zusammengefaßt, die konventionellen Technologien entweder:

a) verwenden Gesamtmark als eine Quelle von MSPCs und leiden daher an niedrigen MSPCs-Konzentrationen (wie Walsh),
b) versuchen MSPCs durch gänzliches Eliminieren anderer MSG-Komponenten, die in BMA gefunden werden, anzureichern und haben so keine der ergänzenden MSG-Komponenten, die in BMA anwesend sind (wie Muschler I),
c) führen isolierte ergänzende MSG-Komponenten in Zusammensetzungen ein, die angereicherte Mengen von MSPCs haben und haben daher nur teilweise die ergänzenden MSG-Komponenten, die in BMA (wie Muschler I) anwesend sind, zur Verfügung gestellt, oder
d) fügen bloß Gesamt-BMA zu den Zusammensetzungen, die angereicherte Mengen von MSPCs haben, hinzu, und haben daher nur nicht-verstärkte Mengen an ergänzenden MSG-Komponenten (wie Muschler II und Matsukara).

Außerdem gibt es nur eine vereinzelte Würdigung im Stand der Technik über die Vorteile im Kombinieren von MSG-Fraktionen mit einer porösen Matrix. Zum Beispiel gibt es keine Offenbarung im Stand der Technik über eine Kombination einer physiologischen Fraktion von BMA in Kombination mit einer Matrix und ergänzt mit Gesamt-BMA.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegenden Erfinder glauben, daß zusammengesetzte Gewebereparatur-Transplantatmaterialien, die verbesserte muskuloskeletogene Fähigkeiten haben, nicht nur verstärkte MSPC-Mengen umfassen sollten, sondern auch geeignete Mengen von anderen in BMA gefundenen MSG-Komponenten umfassen sollten, von denen man glaubt, daß sie eine Rolle in dem Gewebsreparatur-Reaktionsweg spielen. Die vorliegenden Erfinder haben jedoch bemerkt, daß die konventionellen Verfahren des Konzentrierens von MSPCs viele der muskuloskeletogenen MSG-Komponenten in BMA, von denen angenommen wird, daß sie eine signifikante Rolle in der Muskuloskeletogenese spielen, vermindern oder vollständig eliminieren. Daher sind die vorliegenden Erfinder zum Schluß gekommen, daß, obgleich der konventionelle Schritt des Konzentrierens der MSPCs aus BMA die Osteogenese in einer Hinsicht verstärken kann (durch Verstärken der MSPC-Mengen), es aber auch die Gewebereparatur in einer zweiten Hinsicht einschränken kann (Vermindern und manchmal gänzliches Eliminieren wichtiger, unterstützender MSG-Komponenten aus BMA). Dementsprechend besitzen die resultierenden, konventionellen, hoch angereicherten MSPC-Produkte signifikante Nachteile.
Um diese Unzulänglichkeit in konventionellen Knochentransplantatmaterialien zu lösen, haben die vorliegenden Erfinder dementsprechend eine Anzahl von Vorgehensweisen entwickelt, die die oben notierten Mängel des Stands der Technik kurieren.
Im ersten Ansatz wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus autologen Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA gemacht wurde und die eine native Menge an muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs und eine native Menge an roten Blutzellen RBCs aufweist, umfassend

a) eine physiologische Fraktion des BMA, umfassend: i) MSPCs, anwesend in der physiologischen Fraktion in einem Spiegel größer als ihr nativer Spiegel in Gesamt-BMA und ii) RBCs, abgeleitet von BMA, anwesend in der physiologischen Fraktion in einem Spiegel, geringer als ihr nativer Spiegel in Gesamt-BMA, und
b) eine poröse sterile Matrix, die eine Durchschnitts-Porengröße von mindestens 20 μm hat.

Da die MSPC-Quelle dieses Ansatzes eine Fraktion des BMA ist, kann sie höhere Mengen an MSPCs enthalten, als in konventionellen Transplantaten (wie Harada und Walsh) anwesend sind, die Gesamt-BMA als eine MSPC-Quelle verwenden. Da die Fraktion eine abgereicherte Menge von RBCs hat, können seine MSPCs konzentrierter als die MSPCs in der Zusammensetzung von Ogushi sein. Da die Fraktion des BMA dieser Zusammensetzung eine physiologische Fraktion ist, enthält sie erhöhte Mengen des nativen Zellenkomplementes und andere lösliche Faktoren, die möglicherweise eine Rolle in der Muskuloskeletogenese spielen, und daher enthält sie höhere Mengen der unterstützenden Komponenten als in Zusammensetzungen gefunden wurde, die hauptsächlich isolierte MSPCs besitzen, ergänzt nur durch Gesamt-BMA (wie Muschler und Matsukara). Dementsprechend löst dieses Transplantat die oben erwähnten Mängel des Stands der Technik.
Außerdem kann diese Zusammensetzung leicht durch einfaches Konzentrieren der MSPCs aus Gesamt-BMA (zum Beispiel durch Zurückhalten nur des Buffy Coats aus zentrifugiertem BMA) und anschließendes Kontaktieren der zurückbehaltenen MSPC-reichen physiologischen Fraktion mit der porösen Matrix gemacht werden.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist eine „physiologische Fraktion von Knochenmarkaspirat-BMA" jegliche durch Zentrifugation von Gesamt-BMA gewonnene Fraktion des BMA, wobei die Fraktion nicht weiter prozessiert wird, um die verschiedenen in dieser Fraktion vorliegenden Komponenten zu separieren. Zur Illustration, eine solche physiologische Fraktion des Knochenmarkaspirat BMA ist der Buffy Coat Anteil. Obgleich bevorzugte Ausführungsformen die Zentrifugation als ein Mittel zur Gewinnung der „physiologischen Fraktion des Knochenmarkaspirat BMA" verwenden, werden andere Verfahren, die die Isolierung einer physiologischen Fraktion des Knochenmarkaspirats BMA, gewonnen durch Zentrifugation, erlauben, auch angesehen, daß sie innerhalb der Abgrenzung dieser Erfindung liegen. Zum Beispiel stellt die Lyse von roten Blutzellen eine „physiologische Fraktion des Knochenmarkaspirats BMA" her, die die NBMCs umfaßt, und daher zellulär äquivalent zu der Buffy Coat Fraktion ist. Eine „physiologische Fraktion des Knochenmarkaspirats BMA" beinhaltet nicht Gesamtknochenmarkaspirat, sondern beinhaltet entwässertes BMA. Die Konzentrationen der MSG-Komponente in einer „physiologischen Fraktion des Knochenmarkaspirats BMA" sind größer als diese, die in Gesamt-BMA gefunden werden (d. h. sie sind nicht konzentriert). In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hat eine „physiologische Fraktion des Knochenmarkaspirats BMA" eine Vielzahl von in relativen Mengen anwesenden MSG-Komponenten, die gleich sind zu den relativen Mengen, die in jedem kontinuierlichen Segment des zentrifugierten BMA gefunden wurden. Es hat das native Komplement der MSG-Komponenten, die innerhalb einer gegebenen Dichtebande des zentrifugierten BMA enthalten sind. Da das native Komplement beibehalten wird, enthält die „physiologische Fraktion des Knochenmarkaspirats BMA" nicht eine, sondern viele Komponenten, die als hilfreich bei der MSG angesehen werden, und in relativen Proportionen im wesentlichen gleich zu denen sind, die durch Zentrifugation erhältlich sind. Zur Verdeutlichung, wenn die „physiologische Fraktion des Knochenmarkaspirat BMA" der Buffy Coat Anteil des BMA ist, enthält sie alle der in Tabelle II anwesenden verschiedenen Komponenten, und diese Komponenten haben die relativen Konzentrationen derer, die in Tabelle II verkörpert sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird Wasser nicht als eine Komponente des BMA angesehen und daher ändert das Entfernen von nur Wasser aus einer „konzentrierten physiologischen Fraktion des Knochenmarkaspirat BMA" nicht die Beschaffenheit dieser Fraktion als eine „physiologische Fraktion von Knochenmarkaspirat BMA".
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist „frisches" Knochenmark Knochenmark, das unfraktioniert oder „gesamt" ist. Eine „D₅₀ durchschnittliche Porengröße" wird durch Quecksilberporosimetrie bestimmt. „Kernhaltige Knochenmarkszellen" („NBMCs") beinhalten MSPCs, kernhaltige hematopoetische Zellen (HCs), Prä-Osteoblasten (POs), Reticulozyten (RCs) und Endothelzellen (ECs), aber beinhalten keine roten Blutzellen oder Blutplättchen. „Konzentrierende" und „isolierende" Schritte beziehen sich auf solche Verfahren, die die Konzentration einer Komponente in einem Volumen durch Eliminieren von Wasser oder anderen nicht ausgewählten Komponenten vergrößern. Zum Beispiel können MSPCs durch Entfernen des Plasmaanteils eines zentrifugierten Knochenmarkaspirats konzentriert werden. Eine „Menge" einer Komponente ist seine Konzentration bezogen auf mg/ml oder Zellen/ml.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet eine „angereicherte Menge" einer Komponente, daß die Komponente in einer Menge anwesend ist, die geringer als ihre korrespondierende native Menge in autologem BMA ist. Eine Zusammensetzung, die eine abgereicherte Menge einer Komponente hat, beinhaltet Ausführungsformen in denen die Komponente vollständig abwesend ist.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist eine „verstärkte" Population der MSPCs eine, die eine größere Menge von MSPCs hat als die, die in dem ursprünglichen autologen Knochenmarkaspirat von diesem Individuum gefunden wurde. Das heißt, eine verstärkte Population der MSPCs wird der Bedingung gerecht:
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet eine „angereicherte" Population von MSPCs, daß die Menge von MSPCs, im Vergleich zu HCs, größer in dem zusammengesetzten Knochenmarkstransplantat ist, als in dem ursprünglichen autologen Knochenmarkaspirat. Das bedeutet, eine angereicherte Population von MSPCs wird der Bedingung gerecht:
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfaßt „muskuloskeletales Gewebe" Knochen, Sehne. Knorpel, Ligament, Muskel und Periodontium. „Muskuloskeletogene Transplantate" beinhalten osteogene Transplantate, chondrogene Transplantate und tenogene Transplantate.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein „anhaftendes" Material ein Material, das an das poröse Matrixmaterial anhaften kann, wenn es durch das poröse Matrixmaterial passiert.
In einigen Ausführungsformen wird die physiologische Fraktion des BMA innerhalb der Poren der Matrix suspendiert. Da die MSPCs dieser Ausführungsform nicht an der Oberfläche der Matrix anhaften, sondern eher einfach innerhalb der Poren suspendiert sind, können sie aktiver und näher an ihrem physiologischen Entwicklungsstadium sein. Sie können auch Zellaggregate bilden.
In einigen Ausführungsformen sind die MSPCs in der physiologischen Fraktion in einer Menge anwesend, die 2-mal größer als ihre native Menge in Gesamt-BMA ist, vorzugsweise in einer Menge 5-mal größer als ihre native Menge in Gesamt-BMA. Diese Ausführungsformen stellen eine noch größere Konzentration dieser kritischen Komponente des MSG zur Verfügung.
In einigen Ausführungsformen sind die von BMA-abstammenden RBCs in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden, die weniger als 30% ihrer nativen Menge in Gesamt-BMA ist, dadurch ermöglichen sie, daß der MSPC-reiche Buffy Coat einen großen Anteil des Volumens der zurückgehaltenen BMA-Fraktion repräsentiert, und daher ermöglichen sie sogar größere Mengen an zellulären MSG-Komponenten wie die MSPCs.
In einigen Ausführungsformen umfaßt das fraktionierte BMA weiterhin Fibrinogen, anwesend in der physiologischen Fraktion in einer Menge weniger als 20% ihrer nativen Menge in Gesamt-BMA. Da die überwältigende Mehrheit des Fibrinogens in dem Plasmavolumen von fraktioniertem BMA enthalten ist, ermöglicht das Niedrighalten der Fibrinogemnenge (durch zum Beispiel substantielles Entfernen der PPP-Fraktion), daß der MSPC-reiche Buffy Coat einen großen Anteil des Volumens der zurückbehaltenen BMA-Fraktion repräsentiert und erlaubt dadurch sogar höhere Mengen an zellulären MSG-Komponenten wie die MSPCs.
In einigen Ausführungsformen umfaßt das Gesamt-BMA hematopoetische Zellen HCs in einer nativen Menge, die physiologische Fraktion des BMA umfaßt weiterhin hematopoetische Zellen HCs und die in der physiologischen Fraktion anwesenden MSPCs sind angereichert. Diese Ausführungsform kann durch Auswählen nur eines relativen MSPCs-reichen Anteiles des Buffy Coats hergestellt werden und ermöglicht dadurch eine sehr große Menge an MSPCs in der Zusammensetzung. Vorzugsweise jedoch sind die HCs in der physiologischen Fraktion in einer Menge von mindestens 25% ihrer nativen Menge in Gesamt-BMA anwesend, und versorgen dadurch die Zusammensetzung mit einer nahezu nativen Menge an HCs, die sich betätigen, die Muskuloskeletogenese zu unterstützen.
In einigen Ausführungsformen umfaßt das Gesamt-BMA Blutplättchen in nativer Menge, und das fraktionierte BMA umfaßt weiterhin Blutplättchen, die in der physiologischen Fraktion in einer Menge größer als ihre native Menge anwesend sind. Wenn ein Blutplättchen-Freisetzungsagens (wie Thrombin) zu der Zusammensetzung hinzugegeben wird, kann Thrombin die Freisetzung der MSG-Wachstumsfaktoren (wie TGF-β, die innerhalb der Blutplättchen enthalten sind, bewirken. Die konzentrierte Menge an Blutplättchen dieser Ausführungsform ist vorteilhaft, weil sie mehr von diesen erwünschten Wachstumsfaktoren zur Verfügung stellt. In einigen Ausführungsformen sind die Blutplättchen in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden, die zweimal größer als ihre native Menge ist, (zum Beispiel erhältlich aus einer physiologischen Fraktion wie PRP).
In einigen Ausführungsformen besteht die physiologische Fraktion im Wesentlichen aus dem BMA Buffy Coat. Diese Ausführungsform maximiert hauptsächlich die Mengen von erwünschten NBMCs und Blutplättchen in der Fraktion, die durch einfache Gravitationsfraktionierung von Gesamt-BMA durch im Wesentlichen Entfernen der RBC und PPP-Fraktion des BMA erhältlich ist.
In einigen Ausführungsformen umfaßt das Gesamt-BMA weiterhin Blutplättchen in einer nativen Menge, und das fraktionierte BMA umfaßt weiterhin Blutplättchen, die in der physiologischen Fraktion in einer Menge geringer als ihre native Menge, anwesend sind. Solch eine Ausführungsform kann wünschenswert sein, wenn Wachstumsfaktoren zu der Zusammensetzung aus einer anderen Quelle hinzugefügt wurden, wie PRP aus Gesamtblut. In solchen Ausführungsformen können die Blutplättchen in der physiologischen Fraktion in einer Menge nicht geringer als 50% ihrer nativen Menge anwesend sein.
In einigen Ausführungsformen besteht die physiologische Fraktion im wesentlichen aus der NBMC-Fraktion des BMA Buffy Coat. Diese Ausführungsform maximiert hauptsächlich die Mengen der erwünschten NBMCs in der Fraktion, erhältlich durch einfache Gravitationsfraktionierung von Gesamt-BMA durch substantielles Entfernen der RBC, PPP und Blutplättchenfraktionen des BMA.
In einigen Ausführungsformen sind die HCs in der physiologischen Fraktion in einer Menge anwesend, die größer ist als ihre native Menge. Diese Ausführungsform stellt eine größere Menge von diesen wichtigen MSG-Zelltyp zur Verfügung, ohne notwendigerweise eine MSPC-Anreicherung zu erfordern.
In einigen Ausführungsformen sind die MSPCs und HCs beide in der physiologischen Fraktion in einer Menge, die zweimal größer als ihre native Menge ist, anwesend. Diese Ausführungsform stellt eine große Menge von dem zur Verfügung, was wahrscheinlich die beiden wichtigsten Zelltypen für die MSG sind.
In einigen Ausführungsformen umfaßt die physiologische Fraktion weiterhin Wachstumsfaktoren, die von BMA-abgeleiteten Blutplättchen freigelassen wurden. Solche Wachstumsfaktoren helfen in der MSG. In einigen Ausführungsformen umfaßt die physiologische Fraktion Fibrin.
In einigen Ausführungsformen hat die poröse Matrix eine Porengröße von mindestens 50 μm.
Diese größere durchschnittliche Porengröße stellt einen einfacheren Weg für die MSG-Zellen zur Verfügung, als es eine Porengröße von 20 μm tut. Die poröse Matrix hat vorzugsweise eine Porengröße von mindestens 100 μm.
In einigen Ausführungsformen haben die poröse Matrix und die physiologische Fraktion jeweils ein nicht-poröses Volumen, wobei das volumetrische Verhältnis der physiologischen Fraktion zu der der Matrix zwischen 1:1 und 120 liegt. Wenn das Verhältnis mindestens 1:1 ist, ist die physiologische Fraktion in ausreichend großen Mengen vorhanden, um in der MSG mitzuwirken. Wenn das Verhältnis nicht mehr als 1:20 ist, ist die poröse Matrix in ausreichend großen Mengen vorhanden, um ein Gerüst zu bilden.
In einigen Ausführungsformen umfaßt das Gesamt-BMA eine erste unterstützende Komponente in nativer Menge, die physiologische Fraktion umfaßt weiterhin eine abgereicherte Menge der ersten unterstützenden Komponente und die Zusammensetzung umfaßt weiterhin c) eine MSG-Ergänzung, die die erste unterstützende Komponente umfaßt, wobei die erste unterstützende Komponente in der Ergänzung in einer Menge anwesend ist, die größer ist als die abgereicherte Menge der ersten unterstützenden Komponente der physiologischen Fraktion.
In einigen Ausführungsformen ist die physiologische Fraktion des BMA eine Suspension und das MSG-Supplement umfaßt ein Gemisch, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Gesamtblut und Gesamt-BMA besteht. Diese Ausführungsform erlaubt, daß das MSG-Supplement während der Operation autolog ohne jegliche weitere Manipulationen gewonnen werden kann.
In einigen Ausführungsformen ist die physiologische Fraktion des BMA eine Suspension und das MSG-Supplement umfaßt eine physiologische Fraktion eines Gemisches, ausgewählt von der Gruppe, die aus Gesamtblut und Gesamt-BMA besteht.
In einigen Ausführungsformen umfaßt das MSG-Supplement eine physiologische Fraktion von Gesamtblut. Ein Gesamtblutsupplement ist vorteilhaft, weil es von dem Patienten zum Zeitpunkt der Operation gewonnen werden kann. Die physiologische Fraktion des Gesamtblutes umfaßt vorzugsweise das Blutplättchen-reiche Plasma PRP. Konzentrierte Wachstumsfaktoren können von diesen PRP mit minimaler Manipulation gewonnen werden.
In einigen Ausführungsformen umfaßt das MSG-Supplement eine physiologische Fraktion von Gesamt-BMA. Diese Fraktion kann von dem gleichen Trennungsschritt gewonnen werden, der die erste physiologische Fraktion herstellt.
In einigen Ausführungsformen umfaßt die physiologische Fraktion eine physiologische Buffy Coat Fraktion, die in der physiologischen Fraktion in einer Menge, mindestens zweimal größer als ihre native Menge, anwesend ist.
Jedes konventionelles Verfahren zur Gewinnung von Knochenmarkaspirat kann verwendet werden. In einem Verfahren wird der perkutane Zugang zu dem vorderen oder hinteren Beckenbeinkamm durch eine großkalibrige Kanüle (d. h. Jamshidi) und Spritze erreicht. Absaugen der Knochenmarksinhalte in eine Spritze, die mit einem Anticoagulans, wie zum Beispiel Heparinnatrium, vorweggefüllt ist, wird durchgeführt, in dem die Kanüle rückwärts und aus ihrem tiefsten Insertionspunkt herausgezogen wird. Zahlreiche Punktionen in den Knochen können durchgeführt werden, um Aspirate mit der geringsten Menge an peripherer Blutkontamination zu erlangen.
In einigen Ausführungsformen wird eine physiologische Fraktion des BMA, die konzentrierte MSPCs hat, durch erstes Fraktionieren von Gesamt-BMA erhalten, um ein fraktioniertes BMA zu gewinnen und dann die unerwünschten Fraktionen zu entfernen, um die physiologische Fraktion, die verstärkte MSPCs hat, übrig zu lassen. Fraktionierung des Knochenmarkaspirats kann durch jedes konventionelle Verfahren zur Isolation kernhaltiger Zellen durchgeführt werden, einschließlich Dichtegradienten-Zentrifugation, osmotische Lyse von bestimmten Zellen (wie Wasser um rote Blutzellen zu lysieren) und andere Verfahren zur Konzentration des aktiven osteogenen Anteils von Knochenmark. In einem bevorzugten Verfahren wird das Aspirat zuerst bei 500 g für 5-10 Minuten zentrifugiert, was in einem fraktionierten Aspirat resultiert, das eine Plasmafraktion hat, einen Gesamt Buffy Coat Anteil, der einen NMBC-reichen Anteil und einen Blutplättchen-reichen Anteil umfaßt und eine RBC-Fraktion. Innerhalb des NMBC-reichen Anteils ist eine Fraktion, die eine angereicherte Menge von MSPCs hat. Das Plasma, PRP und die RBC-Fraktionen werden dann im wesentlichen durch Absaugen entfernt, wodurch hauptsächlich der NMBC-reiche Anteil isoliert wird. Wahlweise können auch eine ausgewählte Fraktion oder Fraktion der Gesamt Buffy Coat Fraktion entfernt werden, um eine Fraktion, die eine angereicherte Menge von MSCPs hat, zurückzubehalten.
Die MSPCs in der physiologischen Fraktion des BMA sind vorzugsweise in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden, die mindestens 2-mal ihre native Menge ist. Diese angereicherte Menge kann durch Entfernen von mindestens etwa 90% des Plasmas oder der roten Blutzellen von dem fraktionierten Knochenmarkaspirat erreicht werden. Noch mehr vorzugsweise sind die MSPCs in einer Menge von mindestens 5-mal ihrer nativen Menge vorhanden. Diese erhöhte Menge kann durch entfernen von mindestens etwa 90% des Plasmas und der roten Blutzellenfraktion von dem fraktionierten Knochenmarkaspirat erreicht werden. Weiter vorzugsweise sind die MSPCs in der physiologischen Fraktion in einer Menge von mindestens 10-mal ihrer nativen Menge vorhanden. Diese erhöhte Menge kann durch Entfernen von mindestens etwa 99% des Plasmas und der roten Blutzellen vom fraktionierten Knochenmarkaspirat erreicht werden.
Vorzugsweise ist das HC der physiologischen Fraktion in der physiologischen Fraktion in einer Menge von mindestens 2-mal seiner nativen Menge vorhanden. Diese Menge kann durch Entfernen von mindestens etwa 90% des Plasmas oder der roten Blutzellen von dem fraktionierten Knochenmarkaspirat erreicht werden. Weiter vorzugsweise ist das HC in der physiologischen Fraktion in einer Menge von mindestens 5-mal seiner nativen Menge vorhanden. Diese Menge kann durch Entfernen von mindestens 90% des Serums und der roten Blutzellen von dem fraktionierten Knochenmarkaspirat erreicht werden. Weiter vorzugsweise ist das HC in einer Menge von mindestens 15-mal seiner nativen Menge vorhanden. Diese Menge kann durch Entfernen von mindestens etwa 99% des Serums und der roten Blutzellen von dem fraktionierten Knochenmarkaspirat erreicht werden.
Ohne zu wünschen an eine Theorie gebunden zu sein, wird vermutet, daß die HCs eine wichtige Unterstützungsrolle für die MSPCs in der Osteoblastenbildung spielen, durch Sekretion einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Cytokinen sowie durch Stimulation der Differenzierung durch direkten Zell-zu-Zell-Kontakt und deshalb sind sie wünschenswerterweise in erhöhten Mengen in den CTCPC-reichen Suspensionen anwesend. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform eine autologe Transplantatzusammensetzung zum Einpflanzen in einen Patienten, der native Mengen an MSPCs und HCs hat, zur Verfügung, die Transplantatzusammensetzung umfassend:

a) eine Suspension, die MSPC- und HC-Zelltypen umfaßt, wobei jeder der MSPC- und HC-Zelltypen in einer Konzentration, die mindestens 2-mal größer als ihre native Menge ist, anwesend ist und die Suspension mindestens einen Teil der kernhaltigen Zellen, die im Knochenmark gefunden wurden, ausgrenzt,
b) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat.

Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform eine autologe Transplantatzusammensetzung zum Einpflanzen in einem Patienten zur Verfügung, die Transplantatzusammensetzung umfassend:

a) einen Gesamt Buffy Coat Anteil des gesamten Knochenmarks,
b) midestens einen Anteil des Plasma-Anteils des gesamten Knochenmarks, und
c) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat.

Dadurch, daß die poröse Matrixkomponente der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine D₅₀ durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat, wie durch Quecksilberporosimitrie bestimmt, ist ihre Durchlässigkeit ausreichend, um zu gewährleisten, daß kernhaltige Knochenmarkszellen dort hindurchfließen (d. h. es ist ein Gerüst). Die Fähigkeit dieser kernhaltigen Zellen aus der Matrix herauszugehen (und für native kernhaltige Zellen in die Matrix hineinzugehen) erlaubt es, daß die MSG reibungslos und nahtlos sowohl in und um das Substrat stattfindet. Im Gegensatz dazu stellt die Diffusionscontainertechnologie von Harada keine nahtlose Osteogenese zur Verfügung. Die Matrix ist vorzugsweise aus einem biokompatiblen, implantierbaren Transplantatmaterial gemacht. Vorzugsweise ist sie auch resorbierbar. In einigen Ausführungsformen hat das Material eine geladene Oberfläche. Vorzugsweise umfaßt die Zusammensetzung etwa zwischen 5-50 Vol% Matrix und etwa zwischen 50-95 Vol% Suspension, die innerhalb der von der Matrix gebildeten Poren verteilt sind. Wenn die Volumenfraktion der Matrix weniger als etwa 5% ist (ausschließlich ihrer Durchlässigkeit), dann ist der Effekt der Matrix als ein Gerüst nicht signifikant. Beispiele für biokompatible, implantierbare Transplantatmaterialien, die eine geladene Oberfläche haben, beinhalten Keramik, umfassend Calciumphosphat, wie zum Beispiel Hydroxyapatit oder Tricalciumphosphat; sowie demineralisierte Knochenmatrix; oder mineralisierte Knochenmatrix. Andere geeignete Transplantatmaterialien beinhalten Polymilchsäure, Polyglycolsäure, polygalaktische Säure, Polycaprolacton, Polyethylenoxid, Polypropylenoxid, Polysulfon, Polyethylen und Polypropylen. Andere geeignete Transplantatmaterialien sind Hyaluronsäure, die mit oder ohne „crosslinking" aufgereinigt sein kann, Bioglas, Gelatine und Collagen. Besonders geeignete Transplantatmaterialien beinhalten zum Beispiel isolierte, mineralisierte, spongiöse oder schwammige Knochenschnitte, Pulver oder Granulate von mineralisierten Knochen, demineralisierte schwammige oder spongiöse Knochenschnitte, Puder oder Granulate von demineralisierten Knochen, Guanidin-HCl-extrahierte demineralisierte Knochenmatrix, gesinterter kortikaler oder spongiöser Knochen, Korallenhydroxyapatit, verkauft von Interpore unter dem Handelsnamen Interpore 500^TM oder Interpore 200^TM , ProOsteon 500R^TM und granulierte Keramik wie die, die in dem Knochentransplantatersatz Collagraft^TM, verkauft von Zimmer^TM, inkooperiert sind, oder faserartiges Collagen oder Gelatin-Schwämme wie Gelfoam^TM oder Helistat^TM.
In einigen Ausführungsformen sind Zelladhäsionsmoleküle an die Oberfläche der Matrix gebunden. Der Begriff „Zelladhäsionsmoleküle" bezieht sich gesammelt auf Laminine, Fibronectin, Vitronectin, vaskuläre Zelladhäsionsmoleküle (V-CAM), interzelluläre Adhäsionsmoleküle (I-CAM), Tenascin, Thrombospondin, Osteonectin, Osteopontin, Knochensialoprotein und Kollagene.
Die Matrix hat wahlweise Wachstumsfaktoren an ihre Oberfläche gebunden. Wie hier verwendet umfaßt der Begriff „Wachstumsfaktoren" jedes zelluläre Produkt, das das Wachstum oder die Differenzierung von anderen Zellen moduliert, insbesondere die Bindegewebsvorläuferzellen. Wachstumsfaktoren beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf Isoformen von Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktoren (PDGF), Fibroblastenwachstumsfaktoren, epitheliale Wachstumsfaktoren, Isoformen von TGF-α, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren und knochenmorphogene Proteine.
Die Matrix hat wahlweise Antikörper, die Affinität zu Bindegewebsvorläuferstammzellen haben, die an die Oberfläche davon gebunden sind. Geeignete Antikörper beinhalten zum Beispiel STRO-1, SH-2, SH-3, SH-4, SB-10, SB-20 und Antikörper gegen alkalische Phosphatase. Diese Antikörper sind in Haynesworth et al., Bone 13:69-80, 1992a; Bruder, S. et al. Trans Ortho Res Soc 21:574; 1996; Haynesworth, S. E., et al. Bone 13:69-80, 1992; Stewart, K., et al, J Bone Miner Res 11(Suppl.): S 142; 1996; Flemming J E, et al., in „Embryonic Human Skin. Developmental Dynamics" 212:119-132, 1998 und Bruder S P, et al., Bone 21(3): 225-235, 1997, beschrieben.
In einigen Ausführungsformen hat die Matrix eine ausreichende Anzahl von Poren oder Durchgängen, so daß der gesamte zugängliche Oberflächenbereich des Substrates mindestens fünf mal größer ist als der eines festen Objektes, das die gleichen äußeren Dimensionen hat.
So kann der bevorzugte gesamte Oberflächenbereich unter Verwendung eines Substrates, das eine Pulvermenge, eine Körnchenmenge, eine Fasernmenge oder einen hochporösen Block von Substratmaterial umfaßt, erreicht werden. Vorzugsweise ist die durchschnittliche Porengröße in der Matrix größer als 20 μm, noch mehr vorzuziehen größer als 50 μm, am meisten vorzuziehen größer als 100 μm.
Auch in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, wobei Gesamtknochenmarkaspirat zentrifugiert wird, um ein fraktioniertes Aspirat zur Verfügung zu stellen; die roten Blutzellen und Plasma werden im wesentlichen von dem Aspirat entfernt, um eine physiologische Fraktion von BMA zu gewinnen, das eine Gesamt Buffy Coat Suspension umfaßt, die kernhaltige Knochenmarkszellen (NBMC) hat, die in der physiologischen Fraktion in einer Konzentration, die zweiml (und bevorzugt mindestens fünfmal) die ihrer nativen Menge ist, anwesend ist; und diese Gesamt Buffy Coat Suspension wird dann in eine geeignete poröse Matrix gebracht. In diesem Fall (Anspruch A) stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Verfügung, umfassend:

a) eine physiologische Fraktion, die eine Gesamt-kernhaltige Knochenmarkszell NBMC-Suspension umfaßt, in der beide Zelltypen, MSPC und HC, in einer Zellpopulation anwesend sind, die zwischen 2- und 9-mal größer ist als die ihrer nativen Mengen, und
b) eine poröse Matrix, wobei die Matrix eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfaßt eine „gesamte NBMC-Suspension" eine Suspension, in der das Verhältnis der MSPC's zu den HC's innerhalb 50 Prozentpunkte des nativen Verhältnisses von MSPC:HC, anwesend in dem autologen Gesamtknochenmarkaspirat, liegt. In anderen Worten, die Gesamt Buffy Coat Suspension genügt der folgenden Relation:
Vorzugsweise liegt das Verhältnis von MSPC:HC in der Suspension innerhalb 25% von dem in dem nativen Aspirat, mehr vorzugsweise innerhalb 5%.
Eine Gesamt NBMC-Suspension ist vorteilhaft, weil sie konzentrierte Mengen von zwei der wichtigen BMA-abgeleiteten Zelltypen, von denen man glaubt, daß sie eine Rolle in MSG spielen, enthält.
Die Blutplättchenkomponente des fraktionierten BMA wird wahlweise auch während des oben beschriebenen Verfahrens entfernt, um eine im wesentlichen isolierte Gesamt-NBMC-Suspension zu liefern. Wem diese isolierte NBMC-Suspension mit einer geeigneten Matrix kombiniert wird, umfaßt die resultierende Zusammensetzung:

a) eine im wesentlichen isolierte Gesamt-NBMC-Suspensionbeschichtungsfraktion, in der beide MSPC- und HC-Zelltypen in einer Zellpopulation zwischen 2- und 9-mal größer als ihre nativen Mengen anwesend sind, und
b) eine poröse, steril implantierbare Matrix, wobei die Matrix eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat.

Die resultierende Zusammensetzung zur Verwendung beim Einpflanzen von autologem Knochen umfaßt:

a) eine physiologische Fraktion des BMA umfassend: (i) eine angereicherte Menge von Bindegewebsvorläuferzellen MSPCs, und (ii) hematopoetische Zellen (HCs) in einer Menge, die mindestens 25% ihrer nativen Menge ist, und
b) eine poröse, biokompatible, implantierbare Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat.

Die obige Zusammensetzung umfaßt vorzugsweise weiterhin ein gelierendes Mittel, das nützlich ist, um die Zusammensetzung zusammenzuhalten. In einigen Ausführungsformen ist das gelierende Mittel ein Gerinnungsmittel, das eine Menge Fibrinogen umfaßt, die, wenn sie zu der Zusammensetzung hinzugefügt worden ist, in der Zusammensetzung bei einer Konzentration von mindestens 0,1 mg/cc der Zusammensetzung vorhanden ist, mehr vorzugsweise mindestens 0,5 mg/cc. Das Gerinnungsmittel wird vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Blutplättchen-armen Plasma, Blutplättchen-reichen Plasma und Gesamt-Knochenmarkaspirat besteht. Das Gerinnungsmittel wird üblicherweise durch einen Aktivator wie Thrombin aktiviert. Der Aktivator kann in die Zusammensetzung vor ihrer Plazierung an eine Wundstelle hineingemischt werden oder kann gleichzeitig mit der Zusammensetzung an die Wundstelle gebracht werden. In einigen Ausführungsformen ist Fibrinogen in der physiologischen Fraktion des BMA vorhanden. In anderen wird es als eine separate Komponente hinzugefügt. In einigen Ausführungsformen ist das gelierende Mittel Kollagen.
Wie oben berichtet, wird angenommen, daß die konventionelle Konzentration der NBMC-Fraktion (zum Beispiel durch Zentrifugation mit nachfolgender Separation) innerhalb des BMA, die zu erhöhten MSPCs führt, auch zu einer unerwünschten Entleerung in der resultierenden konzentrierten Komponente von mindestens einigen der folgenden nativen Komponenten innerhalb des BMA führen kann, von denen mindestens einige eine unterstützende Rolle in der Muskuloskeletogenese spielen können. Von einigen dieser nativen unterstützten Komponentenglaubt man, daß es sind:

a) Plasma-basierte Komponenten, wie: i) Plasmaproteine (sowohl anhaftende wie nicht-anhaftende) wie VCAM; und ii) lösliche Wachstumsfaktoren wie EGF und TGF-α,
b) Buffy Coat basierte Komponenten, wie: i) Zellen, anders als MSPC, wie HCs und OBs; ii) Proteine und Moleküle, die entweder nicht anhaftend sind (wie RDGF) oder die sich nicht in der MSPC-reichen Fraktion des durch Zentrifugation erhältlichen Buffy Coats befinden, wie solche Interleukine, die von den HCs sekretiert werden; iii) Blutplättchen, iv) Wachstumsfaktoren, die von Blutplättchen freigelassen werden, wie TGF-α und PDGF, und
c) rote Blutzellen-basierte Komponenten, wie Sauerstoff-bindendes Hämoglobin.

Daher wird in einem zweiten Ansatz ein muskuloskeletogenes MSG-Transplantatgemisch zur Verfügung gestellt, das von Gesamtknochenmarkaspirat gemacht wurde, das native Mengen an muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs und eine erste unterstützende Komponente hat, wobei das Gemisch umfaßt:

a) eine physiologische Fraktion von BMA, umfassend: i) MSPCs, anwesend in der physiologischen Fraktion in einer Menge größer als ihre native Menge in Gesamt-BMA, und ii) eine abgereicherte Menge der ersten unterstützenden Komponente, und
b) ein MSG-Supplement, das die erste unterstützende Komponente umfaßt, wobei die erste unterstützende Komponente in dem Supplement in einer Menge anwesend ist, die größer ist als die abgereicherte Menge der ersten unterstützenden Komponente in der physiologischen Fraktion.

Da dieser Ansatz die physiologische Fraktion mit einer MSG-Ergänzung aufstockt, besitzt es sogar größere MSG-Fähigkeiten als die bloß konzentrierten Fraktionen, die von Ogushi verwendet werden. Da das durch diesen Ansatz hergestellte Gemisch eine physiologische Fraktion des BMA besitzt, das erhöhte MSPC-Mengen hat, ist es von Vorteil gegenüber den anderen Zusammensetzungen des Stands der Technik aufgrund aller vorher diskutierter Gründe.
Außerdem kann dieses Gemisch leicht hergestellt werden, durch einfaches Konzentrieren der MSPCs aus Gesamt-BMA (durch zum Beispiel Zurückbehalten nur des Buffy Coats aus zentrifugiertem BMA) und Addieren der MSG-Ergänzung zu der zurückbehaltenen MSPC-reichen physiologischen Fraktion. Die MSG-Ergänzung kann von einer beliebigen Anzahl von Quellen gewonnen werden und kann in einer beliebigen Anzahl von Formen vorliegen. Zum Beispiel kann die MSG-Ergänzung von einer allogenen Quelle, von dem Gesamtblut des Patienten oder von dem Patienten BMA gewonnen werden.
Abhängig von dem verwendeten Verfahren, das verwendet wird, um die MSPC zu konzentrieren, können jede der oben erwähnten nativen unterstützenden Komponenten des BMA die abgereicherte Komponente der vorliegenden Erfindung repräsentieren. Da die Anwesenheit von diesen nativen abgereicherten Komponenten normalerweise erachtet wird, daß sie für die MSG wünschenswert ist, werden in einigen Ausführungsformen die volumetrischen Mengen der ersten und zweiten Komponente so ausgewählt, daß, wem die erste und zweite Komponente kombiniert wird, die Gesamtmenge der abgereicherten Komponente in der resultierenden Zusammensetzung mindestens 25% ihrer nativen Menge ist, wie anhand einer volumetrischen Basis bestimmt. Wenn die gesamte Menge der abgereicherten Komponente in der resultierenden Zusammensetzung mindestens 25% ihrer nativen Menge ist, liegt für die Zwecke der vorliegenden Erfindung die abgereicherte Komponente in einer „nahezu nativen" Menge vor. Die Gesamtmenge der abgereicherten Komponente in der Zusammensetzung ist vorzugsweise mindestens 33% ihrer nativen Menge, mehr vorzugsweise mindestens 50%.
Dieses MSG-Gemisch wird vorzugsweise in eine Trägermatrix geladen, um eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA gemacht wurde, und die native Mengen von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs und eine erste unterstützende Komponente hat, wobei die Zusammensetzung umfaßt:

a) eine physiologische Fraktion von BMA, umfassend: i) MSPCs, anwesend in der physiologischen Fraktion in einer Menge größer als ihre native Menge im Gesamt BMA, und ii) eine abgereicherte Menge der ersten unterstützenden Komponente, und
b) ein MSG-Supplement, umfassend die erste unterstützende Komponente, die erste unterstützende Komponente, die in dem Supplement in einer Menge vorhanden ist, die größer ist als die abgereicherte Menge der ersten unterstützenden Komponente in der physiologischen Fraktion, und
c) eine poröse, biokompatible, implantierbare Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat.

In einer ersten bevorzugten Ausführungsform, die darauf ausgerichtet ist, abgereicherte native Komponenten aufzufüllen, wird Gesamt-BMA manipuliert (vorzugsweise durch hohe rpm-Zentrifugation) um ein fraktioniertes BMA zu bilden, und die RBC-Fraktion, die Plasma-Fraktion und der Blutplättchenknopf werden von dem fraktionierten BMA entfernt, um eine erste Komponente zurückzulassen, die im wesentlichen aus kernhaltigen Knochenmarkszell-NBMC-Fraktion der gesamten Buffy Coat Fraktion (die große Mengen an MSPCs umfaßt), besteht. Da die RBC, Plasma und Blutplättchenbanden 90-95 Volumenprozent („Vol%") von BMA umfassen, ist die MSPC-Menge in der ersten Komponente auf ungefähr 9-19-fach über ihre native Menge in dem BMA angewachsen. Die erste Komponente ist jedoch auch frei von wichtigen Komponenten, die typischerweise in dem Plasma und der Blutplättchenfraktion des Gesamt-BMA anwesend sind, und sie kann eine Rolle in MSG spielen, einschließlich aber nicht begrenzt auf Fibrinogen (in der Plasma-Fraktion gefunden), Plasma-basierte lösliche Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktoren, die von Blutplättchen während der Blutplättchen-Freisetzungsreaktion freigelassen wurden, wie PDGF. Man glaubt, daß jede dieser Komponenten eine Rolle in der MSG spielt.
Dementsprechend umfaßt in einer Ausführungsform die zweite Komponente der Zusammensetzung Blutplättchen in einer Menge, die größer ist als die, die in der ersten Komponente anwesend ist. Wenn diese Komponenten gemischt werden, ist die Menge an Blutplättchen in der Zusammensetzung größer als die, die anfänglich in der ersten Komponente gefunden wurde.
Alternativ umfaßt die zweite Komponente der Zusammensetzung einen freien, Blutplättchenabstammenden Wachstumsfaktor in einer Menge, die größer ist als die, die in ersten Komponente anwesend ist. Wenn diese Komponenten gemischt werden, ist die Menge des freien, von Blutplättchen abstammenden Faktors, in der Zusammensetzung größer als die, die anfänglich in der ersten Komponente gefunden wurde.
Vorzugsweise hat die zweite Komponente dieser Ausführungsform eine Menge an Blutplättchen oder Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor, die mindestens gleich zu dem ihrer nativen Menge ist. In einem ersten Fall besteht die zweite Komponente im wesentlichen aus Gesamt-Knochenmarkaspirat, das sowohl Blutplättchen als auch Blutplättchenabstammende Faktoren im wesentlichen in ihrer nativen Menge enthält. Wenn diese zweite Komponente mit der Buffy Coat Komponente gemischt wird, kann die Menge der Blutplättchen und des Blutplättchen-abstammenden Faktors in der Zusammensetzung in nahezu nativen Mengen vorliegen. In einem zweiten Fall ist die zweite Komponente Blutplättchen-reiches Plasma (PRP). Wenn diese Komponente mit der Buffy Coat Komponente gemischt wird, kann die Menge der Blutplättchen oder Blutplättchen-abhängigen Faktoren in der Zusammensetzung gleich oder größer sein als die von nativen BMA.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das volumetrische Verhältnis der ersten Komponente zur zweiten Komponente zwischen 1:1 und 1:20, weiter vorzugsweise zwischen 1:3 und 1:10. Wenn Blutplättchen als die MSG-Ergänzung ausgewählt worden sind, können sie wahlweise, bevor sie mit der isolierten Buffy Coat Fraktion gemischt werden, in Volumen von Plasma (um PRP zu bilden) resuspendiert werden.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wird BMA manipuliert (vorzugsweise durch Zentrifugation), um ein fraktioniertes BMA zu bilden. Danach werden nicht nur die RBC und Plasma-Fraktionen, aber auch eine MSPC-arme Fraktion des Buffy Coat von dem fraktionierten BMA (wie nach Budenz) entfernt, um eine erste Komponente, die angereicherte MSPCs umfaßt, zu bilden. Da die RBC, Plasma und die entfernten Buffy Coat Fraktionen mindestens 95-99 Volumenprozent („Vol%") des BMA umfassen können, kann die MSP-Menge in der ersten Komponente mindestens 20-fach (und oft soviel wie 50-fach) über ihre native Menge in dem BMA erhöht werden, und ist relativ zu den anderen NBMCs wie HC angereichert worden. Diese erste Komponente ist jedoch auch abgereichert an wichtigen Komponenten, die üblicherweise in der Gesamt Buffy Coat Fraktion anwesend sind und eine Rolle in MSG spielen, einschließlich aber nicht begrenzt auf gewisse NBMCs und Buffy Coat Proteine und Moleküle, die hauptsächlich in dem entfernten Buffy Coat Anteil anwesend sind. Zum Beispiel ist ein NBMC, das abgereichert während der MSPC-Anreicherung sein kann, HC. Diese abgereicherten Buffy Coat Proteine, Moleküle und HCs können eine Rolle in MSG spielen.
Dementsprechend umfaßt in einer Ausführungsform die zweite Komponente der Zusammensetzung HCs, die in der zweiten Komponente in einer Menge vorhanden sind, die größer ist als die, die in der ersten Komponente anwesend ist. Wenn diese Komponenten gemischt werden, ist die Menge an HCs in der Zusammensetzung größer als die, die in der ersten Komponente gefunden wurde.
Alternativ umfaßt die zweite Komponente der Zusammensetzung eine physiologische Fraktion von BMA, die Buffy Coat abgeleitete Proteine in einer Menge größer als die, die in der ersten Komponente anwesend ist, umfaßt. Wenn diese Komponenten gemischt werden, ist die Menge an Buffy Coat abgeleiteten Proteinen größer als die, die in der ersten Komponente gefunden wurde.
Vorzugsweise hat die zweite Komponente dieser Ausführungsform eine HC- oder eine Buffy Coat Proteinmenge, die mindestens gleich zu der ihrer nativen Menge ist. In einem ersten Fall ist die zweite Komponente vorzugsweise Gesamt-Knochenmarkaspirat, das sowohl HC als auch Buffy Coat Proteine im wesentlichen in ihrer nativen Menge enthält. Wenn diese zweite Komponente mit der Buffy Coat Komponente vermischt wird, können die HC- und Buffy Coat Proteinmengen in der Zusammensetzung nahezu native Mengen sein. In einem zweiten Fall ist die zweite Komponente eine physiologische Buffy Coat Fraktion, die üblicherweise Buffy Coat Protein und HC-Mengen hat, die diese des nativen Gesamt-BMA mit einem Faktor von ungefähr 9-19 übersteigt. Wenn diese zweite Komponente mit der MSPC angereicherten ersten Komponente vermischt wird, können die Mengen an Buffy Coat Protein und HC in der Zusammensetzung gleich oder größer sein als diese in nativem BMA.
Dieser bevorzugte Prozeß resultiert in einer Suspension, die Gesamt-Knochenmarkaspirat oder Gesamt Buffy Coat (der von Natur aus seine nativen Mengen an nicht-MSPC NBMCs enthält, von denen man annimmt, daß sie notwendig für das adäquate Unterstützen der osteogenen Aktivität von MSPC sind) umfaßt, und eine angereicherte Menge an MSPCs hat.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das volumetrische Verhältnis der ersten Komponente zu der zweiten Komponente zwischen 1:1 und 1:20, vorzugsweise zwischen 1:3 und 1:10.
In bevorzugten Ausführungsformen, in denen die physiologische Fraktion des BMA angereicherte MSPC-Mengen hat, wird die angereicherte MSPC-Fraktion durch Zentrifugation des Knochenmarkaspirates gewonnen und anschließend durch Isolieren der MSPC-reichen Fraktion innerhalb der NBMC-Fraktion. In einigen Ausführungsformen kann eine MSPC-reiche Fraktion durch Isolation des Anteils des zentrifugierten BMA, das eine Dichte zwischen 1,06 g/cc und 1,09 g/cc, mehr vorzugsweise zwischen 1,07 g/cc und 1,08 g/cc, hat, gewonnen werden. Die resultierende Suspension umfaßt eine physiologische Fraktion von BMA, die im wesentlichen aus Komponenten besteht, die eine minimale Dichte von ungefähr 1,06 g/cc und eine maximale Dichte von ungefähr 1,09 g/cc hat.
In solchen isolierten Fraktionen ist die MSPC-Konzentration üblicherweise zwischen 1.000 und 1.000.000 Zellen pro Milliliter (ml). Diese angereicherte MSPC-Fraktion kann dann mit MSG-Ergänzungen vermischt werden, die größere und vorzugsweise (native) Mengen von HCs haben (wie frisches Knochenmarkaspirat), um eine Suspension herzustellen, die angereicherte Mengen von MSPCs hat, und nahezu native Mengen von HCs. In einer bevorzugten Ausführungsform wird etwa 1-5 Teile pro Volumen einer ersten physiologischen Fraktion, die eine hoch angereicherte MSPC-Fraktion enthält, zu ungefähr 5-9 Volumenteilen einer Suspension, die native Mengen von HCs hat, hinzugefügt, um eine Suspension herzustellen, die sowohl angereicherte Mengen von MSPCs als auch nahezu native Menge von HCs hat. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die erste physiologische Fraktion durch Dichtegradientenzentrifugation gewonnen, und daher enthält sie ungefähr eine MSPC-Menge, die etwa 10-fach höher als die MSPC-Menge in nativen BMA ist, und die Suspension ist Gesamt-Knochenmarkaspirat. Diese beiden Suspensionen werden in einem ungefähren 1:9 Verhältnis pro Volumen gemischt, um eine neue Suspension zu erhalten, die a) ungefähr 0,1% MSPC, vorhanden in 110-400% ihrer nativen Menge, und b) ungefähr 95% HC, vorhanden in etwa 90% ihrer nativen Menge, enthält.
In einer dritten bevorzugten Ausführungsform wird Gesamt-BMA manipuliert, um ein fraktioniertes BMA zu bilden und mindestens ein Teil der Plasmafraktion wird von dem fraktionierten BMA entfernt, um eine erste Komponente zu bilden, die eine konzentrierte Buffy Coat Fraktion (die MSPCs enthält) umfaßt. Da gesamtes Plasma ungefähr 50 Volumenprozent („Vol%") des BMA umfaßt, ist die MSPC-Menge in der ersten Komponente auf bis zu dem ungefähr 2-fachen ihrer nativen Menge in dem BMA angewachsen. Jedoch ist diese erste Komponente auch abgereichert an wichtigen Komponenten, die üblicherweise in der Plasmafraktion anwesend sind und eine Rolle in der MSG spielen, einschließlich aber nicht begrenzt auf Fibrinogen und andere Plasmaproteine wie lösliche Wachstumsfaktoren.
Dementsprechend umfaßt in einer Ausführungsform die zweite Komponente der Zusammensetzung Fibrinogen in einer Menge, die größer ist als die, die in der ersten Komponente anwesend ist. Wenn diese Komponenten vermischt werden, ist die Menge an Fibrinogen in der Zusammensetzung größer als die, die anfänglich in der ersten Komponente gefunden wurde. Vorzugsweise ist die zweite Komponente, die Fibrinogen umfaßt, eine physiologische Fraktion des BMA oder Gesamtblut.
Alternativ umfaßt die zweite Komponente der Zusammensetzung eine physiologische Fraktion des BMA, die einen Plasma-abgeleiteten löslichen Wachstumsfaktor umfaßt in einer Menge enthält, die größer ist als die, die in der ersten Komponente anwesend ist. Wenn diese Komponenten gemischt werden, ist die Menge des Plasma-abgeleiteten löslichen Wachstumsfaktor in der Zusammensetzung größer als die, die anfänglich in der ersten Komponente gefunden wurde.
Die zweite Komponente dieser Ausführungsform hat vorzugsweise eine Menge an Fibrinogen- oder Plasma-abgeleitetem löslichen Wachstumsfaktor, die mindestens gleich zu der ihrer nativen Menge ist. In einem ersten Fall umfaßt die zweite Komponente Gesamt-Knochenmarkaspirat, das sowohl Fibrinogen als auch lösliche Wachstumsfaktoren in etwa ihren nativen Mengen (aufgrund der Addition von Anti-Koagulantien) enthält. Wenn diese zweite Komponente mit der Buffy Coat ersten Komponente gemischt wird, können sich die Mengen an Fibrinogen und löslichem Wachstumfaktor in der Zusammensetzung denen annähern, die in nativem BMA vorhanden sind. In einem zweiten Fall, ist die zweite Komponente Gesamtplasma, von dem Wasser extrahiert wurde, und enthält daher konzentriertes Fibrinogen und konzentrierten, löslichen Wachstumsfaktor. Wenn diese Komponente mit dem konzentrierten Buffy Coat der ersten Komponente gemischt wird, kann die Menge an Fibrinogen oder Plasma-abgeleiteten löslichen Wachstumsfaktor in der Zusammensetzung gleich oder größer sein als die von nativen BMA.
In einem besonders bevorzugten Fall dieser Ausführungsform wird BMA zentrifugiert, um ein fraktioniertes BMA zu bilden und nicht nur die Plasmafraktion, sondern auch die RBC-Fraktion werden im wesentlichen von dem fraktionierten BMA entfernt, um eine erste Komponente zurückzulassen, die hauptsächlich aus einem Gesamt Buffy Coat Anteil (der hohe Mengen an MSPCs enthält und Blutplättchen beinhaltet) besteht. Da die RBC- und Plasmafraktionen 90-95 Volumenprozent („Vol%") des BMA umfassen, ist die MSPC-Menge in der ersten Komponente ungefähr 9-19-fach über der ihrer nativen Menge in dem BMA angewachsen.
Dementsprechend wird ein bevorzugtes Verfahren, auch in Einklang mit der vorliegenden Erfindung, zum Herstellen von autologen Knochentransplantatmaterialien aus Gesamt-BMA zur Verfügung gestellt, das eine native Menge von Kern-Knochemarkszellen NBMC hat, umfassend die Schritte:

a) zur Verfügung stellen einer Suspension, die eine konzentrierte Buffy Coat Fraktion umfaßt, die eine NBMC-Menge mindestens 2-fach größer (vorzugsweise zwischen ungefähr 9 und ungefähr 19-fach größer) als ihre native Menge hat, und
b) mixen der ersten Komponente mit einer zweiten Komponente, die Gesamt-BMA umfaßt (und vorzugsweise im wesentlichen daraus besteht).

Dieses Verfahren resultiert in einer Suspension von Gesamt-BMA (das von Natur aus seine nativen Mengen von Fibrinogen und Wachstumsfaktoren enthält, von denen man glaubt, daß sie notwendig sind um die osteogene Aktivität des MSPC zu unterstützen), die eine angereicherte Menge von MSPCs hat. In bevorzugten Ausführungsformen ist das volumetrische Verhältnis der ersten Komponente zu der zweiten Komponente zwischen 1:1 und 1:20, mehr vorzugsweise zwischen 1:3 und 1:10.
Dementsprechend wird eine osteogene Zusammensetzung zur Herstellung von autologen Knochentransplantatmaterialien von Gesamt-BMA zur Verfügung gestellt, die eine native Menge von Kern-Knochenmarkszellen NBMC hat, umfassend:

a) eine erste Komponente, die eine konzentrierte Buffy Coat Suspension umfaßt, die eine NBMC-Menge mindestens 2-fach größer (vorzugsweise mindestens 9-19-fach größer) als ihre native Menge hat, und
b) eine zweite Komponente, die Gesamt-BMA umfaßt (und vorzugsweise im wesentlichen daraus besteht).

Diese osteogene Zusammensetzung wird vorzugsweise in eine Trägermatrix geladen, um eine Zusammensetzung zur Verwendung beim Einpflanzen von autologen Knochen zur Verfügung zu stellen, umfassend:

a) eine Suspension, umfassend: i) eine konzentrierte Buffy Coat Suspension, die eine NMBC-Menge hat, mindestens 2-fach größer (vorzugsweise mindestens 9-19-fach größer) als ihre native Menge, und ii) Gesamt-BMA, und
b) eine poröse, biokompatible, implantierbare Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat.

In einem dritten Ansatz werden zwei konzentrierte Fraktionen des BMA gemischt. Dementsprechend wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA gemacht wurde, und native Mengen von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs und eine unterstützende Komponente hat, umfassend:

a) eine erste Fraktion von BMA, umfassend: i) MSPCs anwesend in der ersten Fraktion in einer Menge größer als die native Menge in Gesamt-BMA, und ii) eine abgereicherte Menge der unterstützenden Komponente, und
b) eine zweite Fraktion von BMA, die zweite Fraktion ist physiologisch und umfaßt die unterstützende Komponente, die in der zweiten Fraktion in einer Menge größer als ihre native Menge im Gesamt-BMA anwesend ist, wobei die ersten und zweiten Fraktionen von BMA weniger als das Gesamt-BMA umfassen.

Da die erste Fraktion in diesem dritten Ansatz erhöhte Mengen an MSPCs besitzt, hat es höhere Mengen dieser kritischen MSG-Komponente als die Zusammensetzung, die bloß Gesamt-BMA als eine MSPC-Quelle verwendet (wie Harada und Walsh). Da dieser dritte Ansatz eine zweite Fraktion von BMA zur Verfügung stellt, besitzt er sogar mehr MSG-Komponenten als die lediglich konzentrierte Zusammensetzung von Ogushi. Da die zweite Komponente dieses Ansatzes eine Fraktion von BMA ist, kann dieses Transplantat erhöhte Menge der unterstützenden Komponenten enthalten. Solche erhöhten Mengen würden größer sein als diese, die in anderen konventionellen MSPC-reichen Transplantaten gefunden wurden, die Ergänzungen unter Verwendung von nur Gesamt-BMA zur Verfügung stellten (wie Matsukara und Muschler II).
Obgleich Muschler I und Robey das Supplementieren von konzentrierten MSPC-Komponenten mit ausgewählten, während des MSPC-Konzentrationsprozesses entfernten Komponenten lehren, scheint jede dieser Referenzen nur eine unsystematische Wiedereinführung von BMA-Komponenten bereitzustellen (d. h. das Wiedereinführen von nur gewissen ausgewählten einzelnen Komponenten wie Wachstumsfaktoren oder Fibrinogen in die konzentrierte MSPC-Zusammensetzung). Wegen dieses unsystematischen Ansatzes, kann das Material der Zusammensetzung immer noch wirksame Mengen von anderen Komponenten, die auch innerhalb des BMA anwesend sind, benötigen, die auch wichtige Rollen in der Gewebereparatur spielen können.
Diese Zusammensetzung kann leicht durch einfaches Herstellen einer MSPC-reichen Fraktion aus Gesamt-BMA hergestellt werden (durch zum Beispiel Herstellen des MSPC-reichen Produktes nach Muschler I) und dann Kontaktieren dieses Produktes mit einer physiologischen Fraktion von BMA (hergestellt zum Beispiel durch Zentrifugation der eluierten Fraktion des ersten Schrittes um PRP zu gewinnen).
In dem dritten Ansatz ist die erste Fraktion von BMA, die erhöhte MSPC-Mengen hat, vorzugsweise eine physiologische Fraktion und umfaßt noch mehr vorzugsweise die Gesamt Buffy Coat Fraktion. In einigen Ausführungsformen jedoch muß die erste Fraktion nicht physiologisch sein. Zum Beispiel wird in einigen Ausführungsformen BMA über eine poröse Matrix passiert, die fähig ist, selektiv MSPCs zurückzuhalten, wie nach Muschler I, um eine erste Komponente zu bilden, die angereichert MSPCs umfaßt. Gemäß Muschler kann dieses Verfahren die MSPC-Menge in der ersten Komponente (die das Substrat einschließt) bis zu 19-mal über ihre native Menge in dem BMA verstärken (wenn das Volumen des Matrixmaterials 10% des behandelten. BMA-Volumens ist). Jedoch kann diese erste Komponente auch wichtige Komponenten benötigen, die üblicherweise in der Buffy Coat Fraktion anwesend sind und eine Rolle in der MSG spielen, einschließlich aber nicht begrenzt auf gewisse nicht-anhaftende NBMCs und nicht-anhaftende Buffy Coat Proteine, die normalerweise in dem Buffy Coat anwesend sind, und nicht-anhaftende Proteine, normalerweise anwesend im Plasma. Zum Beispiel ist ein nicht-anhaftendes NBMC das während des Muschler MSPC-Anreicherungsverfahrens angereichert wurde, der polymorphkernige Leukozyt. Ein nicht-anhaftendes Plasmaprotein, das während dieses MSPC-Anreicherungsverfahrens abgereichert wurde, ist Interleukin-1. Diese abgereicherten nicht-anhaftenden Buffy Coat und Plasmaproteine und nicht-anhaftenden NBMCs können eine Rolle in der MSG spielen.
Dementsprechend umfaßt in einer Ausführungsform die zweite Komponente der Zusammensetzung eine physiologische Fraktion von BMA, die ein nicht-anhaftendes NBMC in einer Menge größer als die, die in der ersten Komponente anwesend ist, umfaßt. Wenn diese Komponenten gemischt werden, ist die Menge der nicht-anhaftenden NBMCs in der Zusammensetzung größer als die, die anfänglich in der ersten Komponente gefunden wurde.
Alternativ umfaßt die zweite Komponente der Zusammensetzung eine physiologische Fraktion von BMA, die ein nicht-anhaftendes Buffy Coat Protein in einer Menge größer als die, die in der ersten Komponente anwesend ist, umfaßt. Wenn diese Komponenten gemischt werden, ist die Menge des nicht-anhaftenden Buffy Coat Proteins in der Zusammensetzung größer als die, die anfänglich in der ersten Komponente gefunden wurde. Alternativ umfaßt die zweite Komponente der Zusammensetzung eine physiologische Fraktion von BMA, die ein nicht-anhaftendes Plasmaprotein in einer Menge größer als die, die in der ersten Komponente anwesend ist, umfaßt. Wenn diese Komponenten gemischt werden, ist die Menge des nicht-anhaftenden Plasmaproteins in der Zusammensetzung größer als die, die anfänglich in der ersten Komponente gefunden wurde.
Vorzugsweise hat die zweite Komponente dieser Ausführungsform eine Menge an nicht-anhaftendem NBMC, nicht-anhaftendem Plasmaprotein oder nicht-anhaftenden Buffy Coat Protein mindestens gleich zu der ihrer nativen Menge. In einem ersten Fall ist die zweite Komponente vorzugsweise Gesamt-Knochenmarkaspirat, das nicht-anhaftendes HC und nicht-anhaftendes Buffy Coat und Plasmaproteine im wesentlichen in ihren nativen Mengen enthält. Wenn diese zweite Komponente mit der angereicherten MSPC ersten Komponente gemischt wird, kann die Menge der nicht-anhaftenden Komponente in der Zusammensetzung nahe der nativen Menge sein. In einem zweiten Fall umfaßt die zweite Komponente eine Gesamt Buffy Coat Fraktion, die nicht-anhaftende NBMC und nicht-anhaftende Buffy Coat Proteinmengen hat, die die in den nativen BMA mit einem Faktor von ungefähr 9-19 übertrifft. Wenn diese Komponente mit der angereicherten MSPC ersten Komponente gemischt wird, kann die Menge der nicht-anhaftenden Buffy Coat Proteine oder die nicht-anhaftende NBMC-Menge in der Zusammensetzung gleich sein oder die der nativen BMA übersteigen.
Es wird weiterhin angenommen, daß das Ausmaß, mit dem beide MSPCs und andere MSG-Materialien innerhalb einer muskuloskeletogenen Zusammensetzung an die poröse Matrix gebunden sind, die Wirkung beeinflussen kann, die diese Materialien in der Kette von Ereignissen spielen, die zur Muskuloskeletogenese führen. Insbesondere kann die Wirkung und/oder Rolle, die von einem bioaktiven Material gespielt wird davon abhängen, ob das bioaktive Material a) vorwiegend an die Oberfläche der porösen Matrix gebunden ist, b) vorwiegend innerhalb der Zwischenräume der porösen Matrix suspendiert ist, oder c) beides sowohl präsent auf der Oberfläche der porösen Matrix ist, als auch innerhalb ihrer Zwischenräume suspendiert ist.
Es wird angenommen, daß die vorliegenden Erfinder die ersten sind, die die Mikrostruktur der muskuloskeletogenen Zusammensetzungen so Maßschneidern, daß nicht nur lösliche Wachstumsfaktoren, sondern auch die MSG-zellulären Komponenten, wie MSPCs in einem vorbestimmten freien, gebundenen oder partiell gebundenen Zustand zur Verfügung stellen, abhängig von ihrer erwünschten Verfügbarkeit beim Herstellen von spezifischen muskuloskeletogenen Reaktionen.
Im allgemeinen, wenn ein bioaktives Material frei innerhalb der Matrixzwischenräume suspendiert ist, ist es im wesentlichen sofort für die MSG-Aktivität innerhalb der porösen Matrix verfügbar. Eine freie Suspension von diesem Material kann wünschenswert sein, wenn dieses bioaktive Material eine Rolle in den anfänglichen Stadien der Muskuloskeletogenese spielt. Zum Beispiel spielen gewisse bioaktive Materialien eine erwünschte Rolle in dem Mechanismus eines frühen Stadiums (wie der Chemotaxis) und so kann es wünschenswert sein, für mindestens einen Teil dieses Materials, frei innerhalb der Matrixzwischenräume suspendiert zu sein. Wenn das Material in diesem freien suspendierten Zustand ist, ist es im wesentlichen sofort verfügbar, um als ein chemotaktisches Mittel zu wirken. Eine Zusammensetzung, die eine poröse Matrix und ein darin frei suspendiertes bioaktives Material hat, kann zum Beispiel durch Mixen des bioaktiven Materials mit einem aktivierten Gerinnungsmittel vor seiner Exposition zu der Matrix hergestellt werden. Der Gerinnungsprozess wird im wesentlichen das bioaktive Material innerhalb des Gerinnsels abfangen, wobei es verhindert, daß das bioaktive Material an die poröse Matrix gebunden wird.
In einigen Ausführungsformen sind die MSPCs innerhalb der Zwischenräume der porösen Matrix suspendiert. In einigen Ausführungsformen ist daher eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA, das eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs hat, gemacht wurde, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die Zwischenräume hat, und
b) MSPCs, die in einer Menge größer als ihre native Menge im Gesamt-BMA anwesend sind,

Wenn die freie Suspension einer MSG-Komponente innerhalb der Zwischenräume der porösen Matrix erwünscht ist, kann die Komponente zuerst mit einem Gel-bildenden Material (wie eine Fibrinogen-enthaltende Lösung oder eine Kollagenlösung) gemischt werden und das Gemisch kann gelieren. Dieses vorgelierte Gemisch, das ein Gelmaterial umfaßt, mit einer MSG-Komponente, die frei darin suspendierend ist, kann dann mit einem porösen Matrixmaterial gemischt werden.
Ebenso, wenn es erwünscht ist, daß ein bioaktives Material eine Rolle in einem Mechanismus eines späteren Stadiums spielt, dann kann es für dieses Material wünschenswert sein, an die Matrixoberfläche gebunden zu sein. Wenn das Material in diesem gebundenen Zustand ist, ist es nicht sofort verfügbar und wird nur verfügbar nach Freilassung von der Oberfläche der porösen Matrix.
Wenn eine Zusammensetzung, die eine poröse Matrix und ein daran gebundenes bioaktives Material hat, erwünscht ist, kann es zum Beispiel durch Durchsickern einer MSG-Komponente durch die poröse Matrix gemacht werden, vorausgesetzt, daß die MSG-Komponente eine Oberflächenchemie hat, die es empfänglich macht, an die Oberfläche der porösen Matrix gebunden zu werden.
Komponenten die „im wesentlichen gebunden" an die poröse Matrix sind, beinhalten für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Komponenten, die entweder direkt oder indirekt an die Oberfläche der porösen Matrix gebunden sind. Beispiele für indirektes Binden beinhalten das Binden von homologen oder heterologen Molekülen.
In noch anderen Umständen kann es erwünscht sein, daß ein Teil des bioaktiven Materials frei suspendiert ist und ein anderer Teil von dem gleichen bioaktiven Material gebunden ist. Solch ein Gemisch von gebundenen und frei suspendierten Zuständen kann wünschenswert sein, wenn das bioaktive Material Rollen sowohl in den frühen als auch in den späten Stadien der Muskuloskeletogenese spielt. Wenn zwischen 20% und 80% eines bioaktiven Materials an die poröse Matrix gebunden ist, wird zum Zwecke der vorliegenden Erfindung es als „partiell gebunden" an die Matrix betrachtet.
Wenn eine Zusammensetzung erwünscht ist, die eine poröse Matrix und ein partiell gebundenes bioaktives Material hat, kann sie zum Beispiel durch Formulierung einer Niedrigviskositätssuspension, die sowohl das bioaktive Material als auch ein gelierendes Mittel aufweist, durch Aussetzen der Suspension gegenüber der porösen Matrix und durch Maßschneidern des Ausmaßes der Bindung mittels Anpassen der Gelierzeit hergestellt werden. Das Ausmaß der Bindung in solch einem System wird von der Menge der Zeit abhängen, die es braucht, das Mobilitäts-reduzierende Gel zu bilden. Zum Beispiel, wenn für das Gel ein Fibrinkleber gewählt wird, kann die Zeit zu Gelieren leicht durch Anpassen der Thrombinmenge, die in der Gerinnungsreaktion verwendet wird, angepaßt werden. Wenn eine Zusammensetzung gewünscht ist, die einen größeren Grad an gebundenem bioaktiven Material aufweist, wird dann eine kleine Menge von Thrombin verwendet, wodurch sich die Gerinnungszeit üblicherweise bis zu mindestens 2,1 Minuten verlängert. Wenn eine Zusammensetzung erwünscht ist, die einen geringeren Grad von gebundenem bioaktiven Material hat, dann wird eine größere Menge von Thrombin verwendet, wodurch sich die Gerinnungszeit üblicherweise auf nicht mehr als 1,9 Minuten reduziert.
Daher ist in einigen Ausführungsformen mehr als 80% der MSPC-Komponente an die poröse Matrix gebunden. In anderen Ausführungsformen ist mehr als 80% der MSPC-Komponente der physiologischen Fraktion, die erhöhte MSPC-Mengen hat, an die poröse Matrix angeheftet, und der Rest ist im wesentlichen frei in den Zwischenräumen der Matrix suspendiert. In anderen Ausführungsformen ist zwischen 20 und 80% der MSPC-Komponente der physiologischen Fraktion, die erhöhte MSPC-Mengen hat, an die poröse Matrix angeheftet, und der Rest ist im wesentlichen frei in den Zwischenräumen der Matrix suspendiert.
Daher ist in einigen Ausführungsformen eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die von Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und die eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von ungefähr 20 μm hat,
b) MSPCs, die innerhalb eines ersten vorgeronnen Gerinnungsmaterial anwesend sind, wobei das Material innerhalb der Zwischenräume der Matrixporen anwesend ist.

Dieses umfaßt vorzugsweise weiterhin c) eine physiologische Fraktion von BMA, die die MSPCs im wesentlichen davon entfernt hat, wobei die Fraktion innerhalb der Zwischenräume der porösen Matrix anwesend ist. In einigen Ausführungsformen umfaßt die Fraktion ein in-situ gebildetes Gerinnsel, wobei die in-situ Bildung des Gerinnsels in nicht weniger als 1,9 oder mindestens 2,1 Minuten beendet ist. In einigen Ausführungsformen umfaßt die Fraktion ein zweites vorgeronnenes Gerinnungsmaterial. In anderen umfaßt die Zusammensetzung weiterhin c) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die Fraktion innerhalb der Zwischenräume der porösen Matrix vorhanden ist, wobei die MSPCs als eine Komponente der Fraktion anwesend sind.
In einigen Ausführungsformen ist eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und die eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein erstes in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren, und
c) MSPCs, anwesend innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials, wobei das Gerinnen des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials mindestens 2,1 Minuten dauert.

Vorzugsweise umfaßt die Zusammensetzung weiterhin d) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die MSPCs im wesentlichen davon entfernt sind. Die Zusammensetzung kann weiterhin d) eine physiologische Fraktion von BMA umfassen, bei der die Fraktion innerhalb des ersten in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials vorhanden ist, wobei die MSPCs als eine Komponente der physiologischen Fraktion anwesend sind.
In einigen Ausführungsformen ist eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt ist und die eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein erstes in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren, und
c) MSPCs, anwesend innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials, wobei die Gelierung des in-situ Gelmaterials nicht mehr als 1,9 Minuten dauert.

Vorzugsweise umfaßt die Zusammensetzung weiterhin d) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die MSPCs im wesentlichen davon entfernt sind. Es kann auch weiterhin d) eine physiologische Fraktion von BMA umfassen, bei der die Fraktion innerhalb des ersten in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials vorhanden ist, wobei die MSPCs als eine Komponente der Fraktion anwesend sind.
In einigen Ausführungsformen ist eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und die eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren, und
c) MSPCs, die vorwiegend an die Oberfläche der Matrix gebunden sind,

In einigen Ausführungsformen ist eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein vorgeronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren, und
c) MSPCs, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,

Vorzugsweise sind die MSPCs überwiegend an die Oberfläche der porösen Matrix gebunden. In einigen Ausführungsformen sind die MSPCs überwiegend innerhalb des vorgeronnenen Gerinnungsmaterials anwesend oder überwiegend in einem in-situ gebildeten Klumpen anwesend, wobei das Gerinnen des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials mindestens 2,1 Minuten, aber nicht mehr als 1,9 Minuten gedauert hat.
In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein vorgeronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) MSPCs, überwiegend innerhalb des Gerinnungsmaterials anwesend, und
d) ein MSG-Supplement, überwiegend an die Oberfläche der Matrix gebunden.

Die Zusammensetzung umfaßt vorzugsweise weiterhin e) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden. Vorzugsweise umfaßt die Zusammensetzung weiterhin f) ein erstes in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, wobei die physiologische Fraktion innerhalb des ersten in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials anwesend ist.
In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt. die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein vorgeronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) MSPCs, überwiegend anwesend innerhalb des Gerinnungsmaterials, und
d) ein MSG-Supplement, überwiegend an die Oberfläche der Matrix gebunden.

Die Zusammensetzung umfaßt weiterhin vorzugsweise e) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die MSPCs im wesentlichen davon entfernt wurden. In anderen Ausführungsformen umfaßt die Zusammensetzung weiterhin e) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die physiologische Fraktion innerhalb des ersten in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials vorhanden ist, wobei die MSPCs als eine Komponente der physiologischen Fraktion anwesend sind.
In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) MSPCs, die überwiegend an die Oberfläche der Matrix gebunden sind, und
c) Blutplättchen-reiches Plasma PRP-Supplement, überwiegend gebunden an die Oberfläche der Matrix.

Die Zusammensetzung umfaßt weiterhin vorzugsweise d) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden.
In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) ein MSG-Supplement, überwiegend an die Oberfläche der Matrix gebunden,
d) eine physiologische Fraktion des BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden,

Die Zusammensetzung umfaßt weiterhin vorzugsweise e) MSPCs, wobei die MSPCs überwiegend auf die Oberfläche der porösen Matrix gebunden sind. In anderen Ausführungsformen umfaßt die Zusammensetzung weiterhin e) MSPCs und f) ein vorgeronnenes Gerinnungsmaterial, wobei die MSPCs überwiegend innerhalb des vorgeronnenen Gerinnungsmaterial anwesend sind.
In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein vorgeronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) ein MSG-Supplement, überwiegend an die Oberfläche der Matrix gebunden,
d) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden,

Vorzugsweise umfaßt die Zusammensetzung weiterhin e) MSPCs, wobei die MSPCs überwiegend auf die Oberfläche der porösen Matrix gebunden sind. In anderen Ausführungsformen umfaßt die Zusammensetzung weiterhin e) MSPCs und f) ein in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, wobei die MSPCs überwiegend innerhalb des in-situ gelierten Gelmaterials anwesend sind. In anderen Ausführungsformen umfaßt die Zusammensetzung weiterhin e) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die Fraktion innerhalb des vorgeronnenen Gerinnungsmaterials vorhanden ist, wobei die MSPCs als eine Komponente der Fraktion anwesend sind.
In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein vorgeronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) MSPCs, die überwiegend innerhalb des Gerinnungsmaterials anwesend sind,
d) ein in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren und
e) ein MSG-Supplement, anwesend innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials.

Vorzugsweise umfaßt die Zusammensetzung weiterhin e) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden. Vorzugsweise umfaßt die Zusammensetzung weiterhin f) ein erstes in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, wobei die Fraktion innerhalb des ersten in-situ geronnen Gerinnungsmaterials anwesend ist.
In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein erstes in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) ein MSG-Supplement, anwesend innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials, und
d) MSPCs, anwesend innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials, wobei die Gerinnung des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials nicht mehr als 1,9 Minuten dauerte.

Vorzugsweise umfaßt die Zusammensetzung weiterhin e) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden. In anderen Ausführungsformen umfaßt die Zusammensetzung von Anspruch C11 weiterhin e) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die Fraktion innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials vorhanden ist, wobei die MSPCs als eine Komponente der Fraktion anwesend sind.
In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein erstes in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) ein MSG-Supplement, anwesend innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials, und
d) MSPCs, anwesend innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials,

Vorzugsweise umfaßt die Zusammensetzung nach Anspruch C21 weiterhin e) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden. In einigen Ausführungsformen umfaßt die Zusammensetzung weiterhin e) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die Fraktion innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials vorhanden ist, wobei die MSPCs als eine Komponente der Fraktion anwesend sind.
In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) ein MSG-Supplement, anwesend innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials,
d) ein vorgeronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren, und
e) eine physiologische Fraktion des BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden,

Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung weiterhin e) MSPCs, wobei die MSPCs überwiegend auf die Oberfläche der porösen Matrix gebunden sind. In anderen Ausführungsformen umfaßt die Zusammensetzung weiterhin e) MSPCs, wobei die MSPCs als eine Komponente der Fraktion anwesend sind. In anderen Ausführungsformen umfaßt die Zusammensetzung weiterhin e) MSPCs, wobei die MSPCs innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials anwesend sind.
In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) ein MSG-Supplement, anwesend innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials, und
d) eine physiologische Fraktion des BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden,

In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs hat, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) ein MSG-Supplement, das eine physiologische Fraktion von BMA umfaßt, wobei das MSG-Supplement innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials anwesend ist, und
e) MSPCs, überwiegend an die Oberfläche der porösen Matrix gebunden.

In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) ein MSG-Supplement, frei von BMA-abgeleiteten Komponenten, und
d) MSPCs, überwiegend an die Oberfläche der porösen Matrix gebunden.

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein vorgeronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) MSPCs, vorwiegend anwesend innerhalb des Gerinnungsmaterials, und
d) ein MSG-Supplement, anwesend innerhalb des Gerinnungsmaterials.

Die Zusammensetzung umfaßt weiterhin vorzugsweise e) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden. Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung weiterhin f) ein erstes in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, wobei die Fraktion innerhalb des ersten in-situ gelierten Materials anwesend ist. In anderen Ausführungsformen umfaßt die Zusammensetzung weiterhin e) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die Fraktion innerhalb des vorgeronnenen Gerinnungsmaterials vorhanden ist, wobei die MSPCs als eine Komponente der Fraktion anwesend sind.
In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein vorgeronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) ein MSG-Supplement, anwesend innerhalb des Gerinnungsmaterials,
d) ein in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren, und
f) MSPCs, anwesend innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterial.

Die Zusammensetzung umfaßt weiterhin vorzugsweise f) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden. Vorzugsweise ist die Fraktion innerhalb des ersten in-situ geronnenes Gerinnungsmateriales anwesend. In einigen Ausführungsformen umfaßt die Zusammensetzung weiterhin f) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die Fraktion innerhalb des vorgeronnenen Gerinnungsmaterials vorhanden ist, wobei die MSPCs als eine Komponente der Fraktion anwesend sind.
In einigen Ausführungsformen wird eine muskuloskeletogene MSG-Transplantatzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die aus Gesamt-Knochenmarkaspirat BMA hergestellt wurde und eine native Menge von muskuloskeletalen Vorläuferzellen MSPCs aufweist, umfassend:

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein vorgeronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) ein MSG-Supplement, anwesend innerhalb des Gerinnungsmaterials,
d) ein in-situ geronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
e) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden, und das innerhalb des in-situ geronnenen Gerinnungsmaterials anwesend ist, und
f) MSPCs, überwiegend an die Oberfläche der Matrix gebunden.

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein vorgeronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) ein MSG-Supplement, das eine physiologische Fraktion von BMA umfaßt, wobei das MSG-Supplement innerhalb des vorgeronnenen Gerinnungsmaterials anwesend ist, und
d) MSPCs, überwiegend an die Oberfläche der porösen Matrix gebunden.

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein vorgeronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) ein MSG-Supplement, überwiegend an die Oberfläche der Matrix gebunden,
d) eine physiologische Fraktion des BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden,

a) eine poröse Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm hat,
b) ein vorgeronnenes Gerinnungsmaterial, anwesend innerhalb der Zwischenräume der Poren,
c) ein MSG-Supplement, anwesend innerhalb des vorgeronnenen Gerinnungsmaterials, und
d) eine physiologische Fraktion von BMA, bei der die MSPCs davon entfernt wurden,

BEISPIELE
Sechs exemplarische Verfahren zum Bereitstellen einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung sind unten dargestellt. Jede dieser Beispiele verwenden als ein Startmaterial eine Suspension, die einen Gesamt Buffy Coat umfaßt. Jedoch können andere NBMC-reichen Suspensionen, wie jede Suspension, die kernhaltige Knochenmarkszellen NBMCs haben, in einer Zellproliferation die mindestens 3-mal größer als ihre native Menge ist, auch verwendet werden.
Beispiel 1
In dieser Ausführungsform sind die MSPCs selektiv an die poröse Matrix gebunden, während ein Anteil der nicht-anhaftenden Komponenten des BMA (d. h. das Zentrifugat) innerhalb der Zwischenräume der Matrix suspendiert sind.
Eine konzentrierte Gesamt Buffy Coat Suspension wird über ein Gefäß, das die poröse Matrix enthält, passiert oder filtriert, um Zellen, die an die poröse Matrix anhaften, zurückzuhalten. Die eluierten nicht-anhaftenden Zellen der Resuspension (z. B. HCs, POs und RCs) können dann gesammelt werden und über das Gefäß wieder filtriert werden, oder ein Teil davon kann zu dem an die poröse Matrix anhaftenden Zellgemisch hinzugefügt werden, um so in Suspension zurückzubleiben. Die ungebundenen Komponenten der Suspensionen können innerhalb der Suspension abgefangen werden, durch Hinzufügen von gelierenden Mitteln wie Fibrinogen und gelierenden Aktivatoren wie Thrombin zu dem Gemisch.
Die resultierende Zusammensetzung enthält gebundene MSG-Zellen (wie angereicherte MSPCs), gebundene Blutplättchen, frei suspendierte MSG-Zellen (wie ECs) und frei suspendierte unterstützende Komponenten (wie Fibrinogen).
Dementsprechend wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von:

a) Bereitstellen einer Suspension, die kernhaltige Knochenmarkszellen NBMCs umfaßt, die in einer Zellpopulation mindestens 3-mal größer als ihre native Menge (vorzugsweise substantiell frei von roten Blutzellen und Plasma) anwesend sind, und wahlweise Fibrinogen und wahlweise eine Gesamt-BMA-Komponente,
b) Kombinieren der Suspension mit einer porösen Matrix und wahlweise
c) Hinzufügen eines Gerinnungsaktivators zu der Suspension, um ein Gerinnsel unterhalb der Zwischenräume der porösen Matrix zu bilden.

In anderen Ausführungsformen wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von:

a) Bereitstellen einer Suspension, die kernhaltige Knochenmarkszellen NBMCs umfaßt, die in einer Zellpopulation mindestens 3-mal größer als ihre native Menge anwesend sind, die NBMCs, die MSPCs und nicht-anhaftende Zellen umfassen (und wahlweise Fibrinogen und wahlweise eine Gesamt-BMA-Komponente),
b) Passieren der Suspension durch eine poröse Matrix, um eine Zusammensetzung herzustellen, umfassend: i) eine poröse Matrix und ii) MSPCs, gebunden zu der porösen Matrix und iii) ein Zentrifugat, umfassend die nicht-anhaftenden Zellen,
c) Suspendieren des Zentrifugats innerhalb der porösen Matrix, so daß die Zusammensetzung weiterhin umfaßt iv) frei suspendierte nicht-anhaftende Zellen, und wahlweise
d) Hinzufügen eines Gerinnungsaktivators zu der Suspension, um ein Gerinnsel zu bilden.

Beispiel 2
In dieser Ausführungsform sind konzentrierte MSPCs frei innerhalb der Zwischenräume der porösen Matrix suspendiert.
Eine konzentrierte Gesamt Buffy Coat Suspension wird mit einem Blutplättchen-reichen Plasmamaterial vereinigt und in ein Reaktionsgefäß hineingegeben, das das Gerinnen der Zellsuspension mit einem Blutplättchen-reichen Plasma ermöglicht.
Dementsprechend wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von:

a) Bereitstellen einer Suspension, die kernhaltige Knochenmarkszellen NBMCs umfaßt, die in einer Zellpopulation mindestens 2-mal größer als ihre native Menge anwesend sind (vorzugsweise im wesentlichen frei von roten Blutzellen und Plasma), die NBMCs umfassend MSPCs,
b) Vermischen der Suspension mit einer Zusammensetzung, die eine effektive Menge von Fibrinogen umfaßt, um ein Gerinnsel zu bilden, das fähig ist, die NBMCs frei zu suspendieren (Zusammensetzung vorzugsweise weiterhin umfassend Wachstumsfaktoren (vorzugsweise PRP) um ein Gemisch herzustellen).

Das Zell- und Blutplättchen-reiche Plasmagemisch dieser Ausführungsform kann auch mit einer porösen Matrix in einem Reaktionsgefäß vereinigt werden. Diese Kombination würde den Effekt haben, angereicherte MSPCs in der geronnenen Suspension einzufangen, aber nicht notwendigerweise in einer anhaftendenen Art an die Oberfläche des porösen Substrats. Abhängig von der Gerinnungszeit kann dementsprechend die Zusammensetzung frei suspendierte oder partiell gebundene MSPC-Komponenten haben.
Daher umfaßt dieses Verfahren vorzugsweise weiterhin die Schritte von:

c) Kombinieren des Gemisches mit einer porösen Matrix, um eine Zusammensetzung herzustellen, umfassend: i) eine poröse Matrix, ii) ein Gerinnselmaterial, das die Zwischenräume der porösen Matrix besetzt, und iii) MSPCs, die innerhalb des Gerinnselmaterials frei suspendiert sind.

Daher ist eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, umfassend:

i) eine poröse Matrix,
ii) ein Gerinnselmaterial, das die Zwischenräume der porösen Matrix besetzt, und
iii) MSPCs, die innerhalb des Gerinnselmaterials frei suspendiert sind.

Dieses Verfahren umfaßt weiterhin auch vorzugsweise die Schritte von:

c) Kombinieren des Gemisches mit einer porösen Matrix, um eine Zusammensetzung herzustellen, umfassend: i) eine poröse Matrix, ii) ein Gerinnselmaterial, das die Zwischenräume der porösen Matrix besetzt, und iii) MSPCs, die partiell an die poröse Matrix gebunden sind.

Beispiel 3
In dieser Ausführungsform sind die MSPCs an die poröse Matrix gebunden, während die Supplemente innerhalb eines Gerinnsels innerhalb der Zwischenräume der porösen Matrix frei suspendiert sind.
Die konzentrierte Gesamt Buffy Coat Suspension wird über ein Gefäß, das die poröse Matrix enthält, passiert oder gefiltert, in solch einer Weise, um das Anhaften der MSPCs an die poröse Matrix zu berücksichtigen, und die nicht-anhaftende Population der Zellen und löslichen Komponenten werden nachfolgend mit PRP kombiniert. Diese Kombination wird dann mit dem porösen Substrat-NBMC-Gemisch vereinigt und ein Gerinnungsaktivator wird hinzugefügt, um ein Gerinnsel zu schaffen, das sowohl das Substrat-NBMC-Gemisch, als auch die von Blutplättchen abgeleiteten bioaktiven Mittel enthält.
Dementsprechend wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von:

a) Bereitstellen einer Suspension, die kernhaltige Knochenmarkszellen NBMCs umfaßt, die in einer Zellpopulation mindestens 3-mal größer als ihre native Menge anwesend sind, die NBMCs umfassend MSPCs und nicht-anhaftende Zellen, (und wahlweise Fibrinogen und wahlweise eine Gesamt-BMA-Komponente),
b) Passieren der Suspension durch eine poröse Matrix, um eine erste Zusammensetzung herzustellen, umfassend: i) eine poröse Matrix, ii) MSPCs, gebunden an die poröse Matrix, und iii) ein Zentrifugat, das die nicht-anhaftenden Zellen umfaßt,
c) Kombinieren des Zentrifugates mit einer Zusammensetzung, die eine Lösung umfaßt, die Fibrinogen (und vorzugsweise Blutplättchen) beinhaltet, um ein Gemisch herzustellen.

Vorzugsweise umfaßt dieses Verfahren weiterhin die Schritte von:

d) Suspendieren des Gemisches innerhalb der Zwischenräume der porösen Matrix der ersten Komponente und wahlweise,
e) Hinzufügen eines Gerinnungsaktivators zu dem Gemisch, um eine zweite Zusammensetzung zu bilden, umfassend: i) eine poröse Matrix, und ii) MSPCs, gebunden an die poröse Matrix, iii) ein Fibringerinnsel innerhalb der Zwischenräume der porösen Matrix, (und wahlweise) iv) Wachstumsfaktoren, die innerhalb des Fibringerinnsels suspendiert sind.

Daher wird eine zweite Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, umfassend:

i) eine poröse Matrix, und
ii) MSPCs, gebunden zu der porösen Matrix,
iii) ein Fibringerinnsel innerhalb der Zwischenräume der porösen Matrix, (und wahlweise)
iv) Wachstumsfaktoren, die innerhalb des Fibringerinnsels frei suspendiert sind.

Beispiel 4
Die konzentrierte Gesamt Buffy Coat Komponente wird über die poröse Matrix passiert. Die anhaftende MSPC-poröse Matrixzusammensetzung wird dann mit einem Aliquot von Gesamt BMA oder einer physiologischen Fraktion davon (wie PPP oder PRP) kombiniert, um die anhaftende NMBC-Substratzusammensetzung in einem partiellen Gerinnsel, das wünschenswerte Elemente von frischen, unfraktionierten Gesamt-Knochenmarkaspirat enthält, einzufangen. Die nicht-anhaftende Fraktion der NBMCs von dem originalen Knochenmarkisolat kann auch zu der NBMC-porösen-Substrat-frischen Knochenmarkszusammensetzung hinzugegegen werden.
Dementsprechend wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von:

a) Bereitstellen einer Suspension, die kernhaltige Knochenmarkszellen NBMCs umfaßt, die in einer Zellpopulation mindestens 3-mal größer als ihre native Menge anwesend ist, die NBMCs umfassend MSPCs und nicht-anhaftende Zellen, (vorzugsweise frei von roten Blutzellen und Plasma) und wahlweise Fibrinogen,
b) Passieren der Suspension durch eine poröse Matrix, um eine erste Zusammensetzung herzustellen (i) eine erste Zusammensetzung, umfassend die Matrix und anhaftende NBMCs-Zellen und (ii) ein Zentrifugat, umfassend nicht-anhaftende Zellen,
c) Hinzufügen von Gesamt BMA zu der ersten Zusammensetzung, um eine zweite Zusammensetzung herzustellen, und wahlweise
d) Hinzufügen des Zentrifugats zu der zweiten Zusammensetzung.

Dieses Verfahren umfaßt weiterhin vorzugsweise die Schritte von:

e) Hinzufügen eines Gerinnungsaktivators zu der zweiten Zusammensetzung, um ein Gerinnsel zu bilden.

Beispiel 5
In Muschler II wird ein Verfahren beschrieben, das als einen ersten Schritt das Passieren von Gesamt BMA durch eine poröse Matrix umfaßt, um die MSPCs darauf zurückzubehalten und zu konzentrieren, und als einen zweiten Schritt das mechanische Vermischen der MSPC-porösen Matrixkombination mit geronnenem Knochenmark. Es wurde jedoch gefunden, daß der mechanische Vermessungsschritt die Integrität der MSPC-poröse Matrixzusammensetzung nachteilig beeinflußt.
Daher wird nun ein Verfahren zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von:

a) Mixen einer porösen Matrix mit Gerinnungspartikeln, die von BMA oder Blut abgeleitet sind, um ein Gemisch herzustellen und
b) Passieren von BMA durch das Gemisch.

Die resultierende Zusammensetzung umfaßt:

a) eine poröse Matrix,
b) eine Vielzahl von Gerinnungspartikeln, und
c) MSPCs, die sowohl an die Oberfläche der porösen Matrix als auch an die Oberflächen der Gerinnungspartikel gebunden sind.

Da die poröse Matrix und die Gerinnungspartikel vorgemischt sind, bleiben die MSPCs an die Matrix und die Gerinnungspartikeloberflächen gebunden.
Tabelle III unten gibt eine Zusammenfassung der Anordnung der unterschiedlichen bioaktiven Elemente der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die von den fünf Beispielen direkt oben hergestellt wurden.
Beispiel 6
Das Ziel dieses prophetischen Beispiels ist es ein Knochenmarkszell-abgeleitetes Transplantatmaterial zu schaffen, das besser als die in vivo Knochen-formenden Eigenschaften von frischem Knochenmarkaspirat ist.
Zuerst wird eine 20 ml Probe von menschlichem Knochenmark durch konventionelle Absaugetechniken gewonnen. Zweitens wird das Aspirat in zwei Anteile geteilt. Anteil #1 enthält 16 ml Knochenmarkaspirat und wird verwendet, um einen Buffy Coat zu schaffen (d. h. der isolierte NBMC-Anteil des Aspirats). Anteil #2 enthält 4 ml Aspirat und wird anfänglich unfraktioniert zurückgehalten. Drittens, ein Buffy Coat wird durch ein geeignetes Dichtegradientenmedium, wie die Zentrifugation, geschaffen. Nach Isolation der Buffy Coat Zellen von Anteil #1 (zum Beispiel durch Wegnehmen der nicht ausgesuchten Fraktion mit Hilfe einer Pipette), wird Kochsalzlösung zu dem Buffy Coat Anteil hinzugefügt, um den Buffy Coat zu resuspendieren und ein Volumen von 16 ml zusammenzustellen. Diese Resuspension sollte eine native Menge von NBMC enthalten. Viertens, wird der resuspendierte Buffy Coat und die gesamten BMA-Suspension vermischt, gemäß den Volumen, die in Tabelle I aufgelistet sind und die Gemische werden zentrifugiert, um Fraktionen des Buffy Coat/Gesamt-Knochemarkzellgemisches herzustellen. Der Überstand dieses zentrifugierten Gemisches wird dann entfernt, um eine konzentrierte Fraktion des Buffy Coat/Gesamt-Knochemarkzellgemisches zu bekommen. Fünftens wird das Pellet mit entweder Kochsalzlösung oder PRP resuspendiert, gemäß Tabelle I. Unter der Annahme, daß das Entfernen der Plasma und RBC-Anteile eine 19 x Verstärkung der Buffy Coat Menge bewirkt, sollte diese Resuspension konzentrierte Mengen von NBMC (d. h. in der Nachbarschaft von 7-16 mal der nativen Mengen von NBMCs) enthalten. Sechstens werden die resuspendierten Pelletformulierungen in Zulieferungsvehikel zugeführt, und ein Vakuum wird an die beladenen Vehikel angelegt, um Luft, die innerhalb des Vehikels eingefangen ist, hinauszuziehen. Siebtens, in den PRP-enthaltenden Vehikeln, wird Thrombin zu den Vehikeln hinzugefügt, um Gerinnsel zu bilden. Achtens, die Implantate werden operativ eingepflanzt.
Tabelle 3
In einigen Ausführungsformen wird ein bevorzugtes System von Einwegartikeln zur Verwendung beim Zusammenfassen der erwünschten Kombination von oben beschriebenen bioaktiven Komponenten zur Verfügung gestellt. Ein Gefäß, das eine erste Öffnung an einem ersten Ende enthält, das einen Durchmesser hat, ausreichend um die Bewegung der flüssigen Zusammensetzung dadurch zu erlauben, und an einem zweiten Ende ein normal geschlossenes Ventil, das geöffnet werden kann, um Druck innerhalb des Gefäßes freizulassen, wenn eine flüssige Komponente sich durch das Gefäß und die Porosität der darin enthaltenen Matrix bewegt. Dieses Ventil kann einen Standard-Dreiwegsabsperrhahn umfassen. Alternativ kann ein Filter, der eine genügend enge Porosität hat, um die Passage von Luft, aber nicht von zellulären Material zu erlauben (z. B. ein 0,22 Mikronfilter), verwendet werden, anstatt eines Ventils als ein Mittel zur Beibehaltung einer sterilen Umgebung innerhalb des Gefäßes. Zusätzlich garantiert die Verwendung des Filters, daß der Durchfluß von Zellen dort hindurch verhindert wird. Dementsprechend ermöglicht diese Ausführungsform die Einführung einer Lösung in das Gefäß, daß das poröse Substrat enthält und die Freisetzung von atmosphärischem Druck innerhalb des Gefäßes, während Sterilität beibehalten wird.
Das ultimative Produkt umfaßt ein poröses Substrat-NBMC-Gemisch, das wahlweise innerhalb eines Knochenmarkgerinnsels oder Blutplättchengels eingebettet sein kann. Dieses Transplantatmaterial kann dann aus dem Gefäß extrudiert werden und direkt in die Stelle, die eine Zunahme an knochigen Gewebe erfordert, eingepflanzt werden.

Claims

Muskuloskeletogene (MSG = „musculoskeletogenic") Transplantatzusammensetzung aus autologem Gesamt-Knochenmarkaspirat (BMA = „bone marrow aspirate") mit einer nativen Menge muskuloskeletaler Vorläuferzellen (MSPCs = „musculoskeletal progenitor cells") und einer nativen Menge roter Blutkörperchen (RBCs = „red blood cells") umfassend: a) eine physiologische Fraktion aus BMA umfassend: i) MSPCs, die in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden sind, die größer ist als ihre native Menge in Gesamt-BMA, und ii) aus BMA abgeleitete RBCs, die in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden sind, die geringer ist als ihre native Menge in Gesamt-BMA, und b) eine poröse sterile Matrix, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 20 μm aufweist.
Zusammnensetzung nach Anspruch 1, wobei MSPCs in der physiologischen Fraktion innerhalb der Poren der Matrix gelöst sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die MSPCs in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden sind, die zweifach größer ist als ihre native Menge in Gesamt-BMA.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die MSPCs in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden sind, die fünffach größer ist als ihre native Menge in Gesamt-BMA.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die aus BMA abgeleiteten RBCs in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden sind, die weniger als 20% ihrer nativen Menge in Gesamt-BMA beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das fraktionierte BMA weiterhin Fibrinogen umfaßt, das in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden ist, die weniger als 20% seiner nativen Menge in Gesamt-BMA beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Gesamt-BMA weiterhin hämatopoetische Zellen (HCs = „hematopoetic cells") in einer nativen Menge umfaßt, die physiologische Fraktion aus BMA weiterhin hämatopoetische Zellen (HCs) umfaßt und die MSPCs, die in der physiologischen Fraktion vorhanden sind, angereichert sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die HCs in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden sind, die mindestens 25% ihrer nativen Menge in Gesamt-BMA beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Gesamt-BMA weiterhin Blutplättchen in einer nativen Menge umfaßt, und das fraktionierte BMA weiterhin Blutplättchen umfaßt, die in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden sind, die größer ist als ihre native Menge.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Blutplättchen in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden sind, die zweifach größer ist als ihre native Menge.
Zusammnensetzung nach Anspruch 10, wobei die physiologische Fraktion im wesentlichen aus dem BMA-Buffy-Coat besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Gesamt-BMA weiterhin Blutplättchen in einer nativen Menge umfaßt, und das fraktionierte BMA weiterhin Blutplättchen umfaßt, die in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden sind, die geringer ist als ihre native Menge.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Blutplättchen in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden sind, die nicht mehr als 50% ihrer nativen Menge beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die physiologische Fraktion im wesentlichen aus der zellulären physiologischen Fraktion des BMA-Buffy-Coat besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Gesamt-BMA weiterhin hämatopoetische Zellen (HCs) in einer nativen Menge umfaßt, und das fraktionierte BMA weiterhin HCs umfaßt, die in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden sind, die größer ist als ihre native Menge.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei sowohl die MSPCs als auch HCs in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden sind, die zweifach größer ist als ihre native Menge.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die physiologische Fraktion weiterhin Wachstumsfafaktoren umfaßt, die von Blutplättchen freigesetzt werden, die aus BMA abgeleitet sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, die weiterhin ein Gerinnungsagens umfaßt, das eine Menge an Fibrinogen umfaßt, welches, wenn es der Zusammensetzung hinzugefügt wird, in der Zusammensetzung in einer Konzentration von mindestens 0,1 mg Fibrinogen/cc der Zusammensetzung vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die poröse Matrix eine Porengröße von mindestens 50 μm aufweist, vorzugsweise mindestens 100 μm.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die poröse Matrix und die physiologische Fraktion jeweils ein nicht-poröses Volumen aufweisen, wobei der volumetrische Quotient aus physiologischer Fraktion und Matrix zwischen 1:1 und 1:20 liegt.
Zusamnensetzung nach Anspruch 1, wobei das Gesamt-BMA weiterhin einen ersten unterstützenden Bestandteil in einer nativen Menge umfaßt, wobei der unterstützende Bestandteil ein beliebiger Bestandteil ist, der fähig ist, als eine Unterstützung der Muskuloskeletogenese zu fungieren, die physiologische Fraktion weiterhin eine verbrauchte Menge des ersten unterstützenden Bestandteils umfaßt, und die Zusammensetzung weiterhin c) eine MSG-Ergänzung, die den ersten unterstützenden Bestandteil umfaßt, und der erste unterstützende Bestandteil in der Ergänzung in einer Menge vorhanden ist, die größer ist als die verbrauchte Menge des ersten unterstützenden Bestandteils in der physiologischen Fraktion, umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei die physiologische Fraktion aus BMA eine Suspension ist, und die MSG-Ergänzung eine Mischung umfaßt, die aus einer Gruppe selektiert wird, die aus Vollblut und Gesamt-BMA besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei die physiologische Fraktion aus BMA eine Suspension ist, und die MSG-Ergänzung eine physiologische Fraktion einer Mischung umfaßt, die aus einer Gruppe selektiert wird, die aus Vollblut und Gesamt-BMA besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei die MSG-Ergänzung eine physiologischen Fraktion aus Vollblut umfaßt.
Zusammensetzuug nach Anspruch 23, wobei die physiologische Fraktion aus Vollblut Blutplättchen-reiches Plasma (PRP = „platelet rich plasma") umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei die MSG-Ergänzung eine physiologische Fraktion aus Gesamt-BMA umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei die physiologische Fraktion eine physiologische Buffy-Coat-Fraktion umfaßt, die in der physiologischen Fraktion in einer Menge vorhanden ist, die mindestens zweifach größer ist als ihre native Menge.